UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR Decanato de Estudios de Postgrado Doctorado en Ciencias Biológicas

TESIS DOCTORAL

CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS SERINA/TREONINA QUINASAS DE Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis BCG

Por

Jacqueline Pérez Pazos

Enero, 2006

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR Decanato de Estudios de Postgrado Doctorado en Ciencias Biológicas

CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS SERINA/TREONINA QUINASAS DE Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis BCG

Trabajo de Grado Presentado a la Universidad Simón Bolívar por Jacqueline Pérez Pazos

Como Requisito Parcial para Optar al Título de Doctor en Ciencias Biológicas

Realizado con la asesoría de Dr. Howard Takiff (Tutor) Dr. José Bubis (Co-tutor)

Enero, 2006

i

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR Decanato de Estudios de Postgrado Doctorado en Ciencias Biológicas

Caracterización de proteínas Serina/Treonina Quinasas de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis BCG

Trabajo de Grado Presentado a la Universidad Simón Bolívar por Jacqueline Pérez Pazos

Como Requisito Parcial para Optar al Título de Doctor en Ciencias Biológicas

Realizado con la asesoría de Dr. Howard Takiff (Tutor) Dr. José Bubis (Co-tutor)

Enero, 2006

ii

A todas aquellas mujeres que, como la Fantina de Víctor Hugo, tuvieron que entregarse a la miseria, en nombre del más puro amor.

iii

AGRADECIMIENTOS

A mis tutores Dr. Howard Takiff y Dr. José Bubis por todo su apoyo durante la realización de esta tesis y que, gracias a sus comentarios oportunos, pudo culminar felizmente. A Maritza Calabokis, por ofrecerme no sólo su asesoría académica, sino su incondicional amistad que me dio fortaleza en los momentos más difíciles. A Marisabel Gonzatti, quien orientó varios de los experimentos preliminares en los ensayos quinasas. A Rósula García, quien colaboró dedicamente en la construcción de KO y otros experimentos. Siempre atenta, sincera y buena amiga. A mi querido Profesor Omar Arenas por enseñarme todos aquellos principios que debe tener un “buen científico”. Profe: Mi ética científica tiene la base en sus enseñanzas, Gracias!. A mis padres, por ser incondicionales en todo momento. Definitivamente son únicos. A mis tres mosqueteros: Selene, Aquiles y Aramis. TERMINÓ LA TESIS!

Gracias por su paciencia: MAMI

A mis queridas e inolvidabes amigas: Sofía, Mauxi y Zobeida, porque sin sus sabios consejos y su cariño, yo no habría terminado aún. Al personal (todas las chicas y chicos) del Laboratorio de Genética Molecular del IVIC, que siempre me dieron motivos alegres en situaciones complicadas. Al Dr. Yossef Av-Gay, Dr. Horacio Bach y todo el personal del Laboratorio de Enfermedades Infecciosas en UBC (Vancouver), por su colaboración en la realización de la espectometría de masas. Siempre estarán en mi memoria sus ambables atenciones Al Dr. Horacio Bach y su familia, por su cariñosa hospitalidad durante mi estadía en Canadá A la Dra. Mercedes Schnell, porque gracias a sus consejos y ayuda profesional pude mantener la tranquilidad y la paciencia en la última fase, quizás la más difícil, de esta tesis. A Julio, por las buenas acciones e intenciones.

iv

RESUMEN Mycobacterium tuberculosis posee 11 genes que codifican para proteínas Ser/Thr quinasas (STPQ). Ocho de estas proteínas se han caracterizado parcialmente a partir de la expresión de sus genes (PknA PknB PknD PknE ,PknF y PknG, PknH, PknI). No obstante, existen pocas evidencias experimentales sobre sus posibles funciones. En este estudio se caracterizaron e identificaron parcialmente algunas actividades STPQ, y sus sustratos en M. tuberculosis, y la cepa no patógena BCG. Para ello, se aislaron distintas fracciones de proteínas y se determinó la presencia de algunas STPQ, así como de residuos fosforilados en Ser y Thr, mediante el reconocimiento por anticuerpos específicos. Analizando las condiciones óptimas reportadas para actividades STPQ, se pudo determinar que las actividades quinasas mostraron una preferencia por el Mn+2 sobre el Mg+2 , independiente de la temperatura. En ciertas condiciones, el ortovanadato de sodio, el Ca+2 , el Mg+2 , el AMPc y la estaurosporina inhibieron la fosforilación de algunos sustratos. Adicionalmente, en ambas cepas, las actividades quinasas estuvieron localizadas principalmente en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular. Se construyeron 4 cepas mutantes, por interrupción de un gen (pknD y pknI en ambas cepas) a través del intercambio alélico utilizando un micobacteriófago de transducción especializada. Al comparar las actividades STPQ de las cepas mutantes con las cepas parentales, se obtuvieron resultados concluyentes para PknD, debido a la ausencia de un polipéptido fosforilado (p83-93) en la cepa mutante de M. tuberculosis. Este sustrato fue identificado, por espectrometría de masas, como MmpL7, proteína requerida para el transporte del lípido phtiocerol dimicocerosato de M. tuberculosis, postulado como factor de virulencia en otros estudios. Considerando que PknD está truncada en BCG, y que p83-93 está débilmente fosforilado tanto en el mutante de esta cepa como en la cepa parental, se sugiere que PknD podría relacionarse con la virulencia de M. tuberculosis.

Palabras clave: Ser/Thr Quinasas, PknD, PknI, PknK, MmpL7

v

INDICE GENERAL Página APROBACIÓN DEL JURADO

i

DEDICATORIA

ii

AGRADECIMIENTOS

iii

RESUMEN

iv

INDICE GENERAL

v

INDICE DE FIGURAS

ix

LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS

xv 1

INTRODUCCIÓN CAPITULO I. MONITOREO DE LAS ACTIVIDADES SERINA/TREONINA QUINASAS Y SUS POSIBLES SUTRATOS EN LAS CEPAS SILVESTRES DE Mycobacterium tuberculosis Y Mycobacterium bovis BCG.

5

MARCO TEÓRICO

5

-La pared celular de M. tuberculosis: El blindaje de un patógeno.

5

-Las Proteínas Quinasas en el principal mecanismo de señalización intracelular -La fosforilación de proteínas de M. tuberculosis:

12

En atención especial, las

proteínas Ser/Thr quinasas

15

OBJETIVOS

29

-Objetivos generales

29

-Objetivos específicos

29

MATERIALES Y MÉTODOS

31

1. Cepas de Estudio y condiciones de cultivo

31

2. Lisis y fraccionamiento celular

32

3. Ensayos de actividad proteína quinasa.

33

4. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) e Inmunotinción (Western blotting-WB)

34

RESULTADOS

37

vi 1. Presencia de residuos de Ser y Thr

fosforilados en fracciones de proteínas

provenientes de las cepas silvestres BCG y MT2D3

37

2. Presencia de Serina/Treonina quinasas en las cepas BCG y MT2D3

40

2.1. PknB y PknD

40

2.2. PknE

44

2.3. PknF

45

3. Ensayos de actividad proteína quinasa

47

3.1. Fosforilación de sustratos endógenos y exógenos en las fracciones de proteínas de la cepa BCG

47

3.2. Fosforilación de sustratos endógenos y exógenos en las fracciones de proteínas de M. tuberculosis

60

3.3. Efecto de inhibidores de la actividad proteína quinasas en las fracciones de proteínas de las cepas BCG y MT2D3

76

3.3.1. Efecto de la Estaurosporina

76

3.3.2. Efecto de la Genisteína

78

DISCUSIÓN

80

CAPÍTULO

II.

CONSTRUCCION

DE

CEPAS

MUTANTES

DEFICIENTES EN PROTEÍNAS SER/THR QUINASAS ESPECÌFICAS DE Mycobacterium tuberculosis Y M. bovis BCG Y COMPARACIÓN DEL EFECTO SOBRE LA FOSFORILACIÒN DE LOS SUSTRATOS ENTRE LOS MUTANTES Y LAS CEPAS PARENTALES.

100

MARCO TEÓRICO

100

-Métodos de análisis de la función genética en M. tuberculosis: La inactivación de genes

100

-Las funciones de las proteínas Ser/Thr quinasas de M. tuberculosis

109

OBJETIVOS

113

-Objetivo general

113

-Objetivos específicos

113

MATERIALES Y MÉTODOS

114

1. Construcción de cepas mutantes.

114

1.1. Cepas bacterianas, medios y condiciones de cultivo.

114

1.2. Técnicas de manipulación de ADN.

115

1.3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

116

vii 1.3.1. Amplificación de fragmentos menores de 3000 pb.

116

1.3.2. Amplificación de fragmentos de ADN mayores de 3000 pb.

117

1.3.3. Modificación de fragmentos de PCR

118

1.4. Southern Blotting

118

1.5. Construcción de cepas mutantes

118

1.5.1. Construcción de

cósmidos recombinantes que poseen

el sustrato del

intercambio alélico.

119

1.5.2. Incorporación de la construcción de intercambio alélico en un fásmido.

120

1.5.3. Conversión del fásmido recombinante en micobacteriófago.

121

1.5.4.

Transducción

especializada

del

micobacteriófago:

Incorporación

del

sustrato de intercambio alélico en M. tuberculosis y BCG

123

1.5.5. Detección y verificación de mutantes.

124

2. Lisis y fraccionamiento celular.

124

3. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) e Inmunotinción (Western blotting-WB)

125

4. Ensayos de actividad quinasa: determinación de sustratos fosforilados endógenos y exógenos

125

4.1. Electroforesis unidimensional

125

4.2. Electroforesis Bidimensional (2D-SDS- PAGE)

125

4.2.1. Primera dimensión

126

4.2.2. Segunda Dimensión

126

5. Espectrometría de masas e identificación de sustratos fosforilados

126

RESULTADOS

128

1. Construcción de cepas mutantes

128

1.1.Construcción

de

cósmidos

recombinantes

con

el

sustrato

de

intercambio alélico

128

1.2. Introducción del sustrato de intercambio alélico en un fásmido

136

1.2.1. Fásmido EFI1

138

1.2.2. Fásmido EFD24

139

1.2.3. Fásmido EFK13

139

1.3. Conversión del fásmido recombinante en micobacteriófago.

141

1.4. Transducción especializada, selección y confirmación de mutantes.

146

1.4.1.Transducción especializada.

146

viii 1.4.2. Selección y confirmación de mutantes KO

149

1.4.2.1. PknD: Selección y confirmación de las cepas mutantes BD2 y KOD5

151

1.4.2.2. PknI: Selección y confirmación de las cepas mutantes BI9 y KOI35

157

1.4.2.3. PknK: Análisis de transductantes.

163

2. Fosforilación de sustratos endógenos y exógenos en las cepas mutantes (KO).

165

2.1. Cepas mutantes de BCG.

165

2.2. Cepas mutantes de M. tuberculosis.

167

2.2.1. Cepa KOD5

167

2.2.2 Cepa KOI35.

173

DISCUSION

176

CONCLUSIONES

184

BIBLIOGRAFÍA

187

ix

INDICE DE FIGURAS

Página Fig. 1. Representación esquemática de la envoltura celular de M. tuberculosis

7

Fig. 2. Modelo de la pared celular de M. tuberculosis

7

Fig. 3. Colonias de bacilos de M. tuberculosis.

10

Fig. 4. Alineamiento de los dominios de Hank VI-IX de las proteinas S/T quinasas de Mycobacterium tuberculosis.

19

Fig. 5. Análisis estructural de las proteínas Ser/Thr quinasas de Mycobacterium tuberculosis.

21

Fig. 6. Dominios estructurales presentes en la proteína PknB de M. tuberculosis.

22

Fig. 7. Estructura completa del dominio catalítico de PknB

23

Fig. 8. Dominio sensor de PknD.

24

Fig. 9. Mecanismo propuesto para las interacciones entre PknB y GarA

28

Fig. 10.

Detección de residuos fosforilados en Serina y Treonina en las

fracciones de proteínas de la cepa BCG.

39

Fig. 11. Detección de residuos fosforilados en Serina y Treonina en las fracciones de proteínas de la cepa MT2D3 de M. tuberculosis

39

Fig 12. Reacción del anticuerpo anti- PknB en las fracciones de proteínas de las cepas BCG (A) y MT2D3 (B)

41

Fig. 13. Reacción del anticuerpo anti-PknD en fracciones de proteínas de las cepas BCG (A) y MT2D3 (B)

42

Fig. 14. Reacción de los anticuerpos anti-PknB y anti-PknD en las fracciones de proteínas de las cepas MT2D3 y BCG.

43

Fig. 15. Reacción del anticuerpo anti-PknE en las fracciones de proteínas de las cepas BCG (A) y MT2D3 (B).

45

Fig. 16. Reacción del anticuerpo anti- PknF en las fracciones de proteínas de las cepas BCG (A) y MT2D3 (B).

46

Fig. 17. Comparación de los perfiles de fosforilación de sustratos endógenos y exógenos en las fracciones proteicas de BCG en presencia de iones divalentes

47

x Fig. 18. Efecto de la temperatura sobre la fosforilación de sustratos endógenos de BCG

48

Fig. 19. Efecto de la temperatura sobre la fosforilación de sustratos endógenos de BCG en presencia de Mg+2 .

49

Fig. 20. Fosforilación de Histona IIA por las fracciones de proteinas de la cepa silvestre BCG. Fig. 21.

50

Efecto de la temperatura sobre la fosforilación de Histona IIA por

lasfracciones de proteinas de la cepa silvestre BCG.

51 +2

Fig. 22. Fosforilación de sustratos endógenos, en presencia de 15 mM Mg de las fracciones proteicas de cultivos de BCG lisados con ultrasonido

52

Fig. 23. Perfiles de sustratos fosforilados de las fracciones de BCG en presencia de Caseína y Mg+2 . Fig. 24.

53

Fosforilación de sustratos endógenos, en presencia de Mn+2 , de las

fracciones proteicas de cultivos de BCG lisados con ultrasonido.

55

Fig. 25. Comparación de los perfiles de sustratos endógenos fosforilados del Extracto de proteínas totales de BCG en presencia de Mg+2 ó Mn+2 .

56

Fig. 26. Perfiles de sustratos fosforilados del extracto de proteínas total de BCG en presencia de Caseína ó Histona IIA y Mn+2 .

57

Fig. 27. Fosforilación de Caseína por las actividades quinasas de las fracciones insolubles de BCG en presencia de Mn+2 . Fig. 28.

58

Fosforilación de Histona IIA por las actividades quinasas de las

fracciones insolubles de BCG en presencia de Mn+2 . Fig. 29. Fosforilación de sustratos endógenos

59

en la fracción de proteínas del

extracto total y proteínas asociadas a la pared celular de la cepa MT2D3 en presencia de iones divalentes.

60

Fig. 30. Efecto de la temperatura sobre la fosforilación de sustratos endógenos de MT2D3 en presencia Mn+2 .

61

Fig. 31. Efecto de la temperatura y Mg+2 ó Mn+2 sobre la fosforilación de sustratos endógenos en la fracción de proteínas asociada a la pared celular de MT2D3.

62

Fig. 32. Fosforilación de Histona IIA por la fracción de proteínas del extracto total y proteínas asociadas a la pared celular de la cepa MT2D3.

63

Fig. 33. Fosforilación de sustratos endógenos, en presencia de Mn+2 , de las

64

xi fracciones de proteínas de la cepa MT2D3 con 6 semanas de cultivo Fig. 34. Fosforilación de sustratos endógenos, de Histona IIA y Caseína por las actividades quinasas del extracto total de la cepa silvestre MT2D3. Fig. 35. Fosforilación de sustratos endógenos en el extracto total

66 de la cepa

silvestre MT2D3 en presencia de iones divalentes

67

Fig. 36. Efecto de 15 mM Mg+2 sobre la actividad quinasa de extractos totales de la cepa MT14323.

68

Fig. 37. Efecto del AMPc sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA en homogenatos totales de la cepa MT14323.

69

Fig. 38. Efecto del 3´,5´ AMPc sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA en la fracción de proteínas del extracto total y su relación con el tiempo del cultivo de la cepa MT14323.

70

Fig. 39. Fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA por la actividad quinasa de las fracciones de proteínas asociadas a la pared celular (P) y proteínas de membrana (M) de la cepa MT2D3.

71

Fig. 40. Fosforilación de sustratos endógenos de la fracción de proteínas asociada a la pared celular de la cepa MT2D3 en presencia de Mn+2 o Mg+2 .

72

Fig. 41. Efecto del Ca+2 y Mg+2 sobre la fosforilación de sustratos endógenos de la fracción de proteínas asociada a la pared celular de la cepa MT2D3

73

Fig. 42. Fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA en las fracciones de proteínas de

un cultivo de la cepa MT2D3 en condiciones de saturación

bacteriana.

75

Fig. 43. Efecto del inhibidor Estaurosporina sobre la fosforilación de sustratos endógenos

y de histona IIA en la fracción de proteínas asociadas a la pared

celular de BCG y MT2D3

76

Fig. 44. Efecto del inhibidor Estaurosporina sobre la fosforilación de sustratos endógenos en la fracción del extracto de proteínas totales de BCG y MT2D3.

77

Fig. 45. Efecto del inhibidor genisteína sobre sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de histona IIA en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular de BCG y MT2D3 Fig. 46.

78

Efecto del inhibidor Genisteína sobre la fosforilación de sustratos

endógenos de las cepas BCG y MT2D3 en ensayos quinasas a temperatura ambiente.

79

xii Fig. 47. Esquema del reemplazamiento génico, de un solo paso, en las micobacterias utilizando fagos de transducción especializada construidos in vitro

108

Fig. 48. Mapa del cósmido pYUB854

120

Fig. 49. Esquema general de la construcción de las cepas mutantes (KO).

130

Fig.

50.

Esquema de las regiones genómicas de las quinasas PknD, PknI y

PknK seleccionadas para las construcciones genómicas para producir la deleción cromosómica en el intercambio alélico.

132

Fig. 51. Estandarización de las condiciones de PCR (temperatura de alineamiento) para la amplificación de los fragmentos genómicos de las quinasas PknD, PknI y PknK utilizados para la construcción del sustrato de intercambio alélico.

133

Fig. 52. Esquema representativo de la construcción de cósmidos recombinantes con el sustrato para el intercambio alélico.

134

Fig.53. Modificación de fragmentos de PCR con el sitio de corte para StuI utilizados en la construcción del sustrato de intercambio alélico. Fig. 54.

135

Digestión enzimática de los cósmidos recombinantes con los sustratos

para el intercambio alélico de las quinasas PknD, PknI y PknK

136

Fig. 55. Esquema representativo de la generación de fásmidos recombinantes.

137

Fig. 56. Selección y verificación del fásmido recombinante EFI1

138

Fig. 57. Selección y verificación del fásmido recombinante EFD24.

139

Fig. 58. Selección y verificación del fásmido recombinante EFK13.

140

Fig. 59.

Representación

esquemática de la conversión del fásmido en

micobacteriófago.

141

Fig. 60. Preparación del micobacteriófago con título alto (FTA)

142

Fig. 61. Determinación del título del Micobacteriófago recombinante FD32 y el título del micobacteriófago no termosensible.

143

Fig. 62. Determinación del título del micobacteriófago recombinante FI24 (30ºC) y el título del micobacteriófago no termosensible (37ºC).

143

Fig. 63. Determinación del título del micobacteriófago recombinante FK13 (30ºC) y el título de la población no termosensible (37ºC)

144

Fig. 64. Presencia del sustrato de intercambio alélico en los micobacteriófagos FD32, FI24 y FK13.

145

Fig. 65. Esquema respresentativo de los posibles eventos de recombinación entre

148

xiii el cromosoma de BCG / MT2D3 y los sustratos de intercambio alélico presentes en el fásmido recombinante durante el proceso de transducción. Fig. 66. Detección por PCR de las cepas mutantes obtenidas en el proceso del intercambio alélico de pknD en MT2D3

152

Fig. 67. Detección por PCR de cepas mutantes obtenidas en el proceso del intercambio alélico de pknDa en BCG

154

Fig. 68. Análisis de Southern Blot de los mutantes de BCG y MT2D3 para la quinasa PknD. Fig. 69. Reacción del anticuerpo anti-PknD

155 en fracciones de proteínas de las

cepas KO de PknD y las cepas silvestres de BCG y MT2D3

156

Fig. 70. Detección por PCR de cepas mutantes obtenidas en el proceso del intercambio alélico de pknI en BCG.

158

Fig. 71. Análisis de Southern Blot de los mutantes de BCG para la quinasa PknI

159

Fig. 72. Detección por PCR de cepas mutantes obtenidas en el proceso del intercambio alélico de pknI en MT2D3.

161

Fig. 73. Análisis de Southern Blot de los mutantes de MT2D3 para la quinasa PknI.

162

Fig. 74. Detección por PCR de cepas mutantes obtenidas en el proceso del intercambio alélico de pknK en BCG y MT2D3.

164

Fig. 75. Comparación de la fosforilación de sustratos endógenos de la cepa silvestre BCG y de las cepas mutantes BD2 y BI9.

165

Fig. 76. Comparación entre la Fosforilación de Histona IIA por la cepa silvestre de BCG y las cepas mutantes BD2 y BI9

166

Fig. 77. Comparación de la fosforilación de sustratos endógenos de la cepa silvestre MT2D3 y de la cepa mutante KOD5.

167

Fig. 78. Comparación entre la Fosforilación de Histona IIA por la cepa silvestre MT2D3 y la cepa mutante KOD5 de M. tuberculosis.

168

Fig. 79. Comparación de los Perfiles de la fosforilación de sustratos endógenos de la fracción de proteínas asociadas a la pared celular de MT2D3 y KOD5.

170

Fig. 80. Identificación de los péptidos del sustrato p83-90 en la secuencia aminoacídica de la proteína MmpL7 .

172

Fig. 81. Comparación de la fosforilación de sustratos endógenos de la cepa silvestre MT2D3 y de la cepa mutante KOI35.

173

xiv Fig. 82. Comparación de los perfiles de fosforilación de sustratos endógenos de la fracción de proteínas asociada a la pared celular de MT2D3 y KOI35.

175

xv

LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS

A. A/ aa

Aminoácido

ADN

Acido Desoxirribonucleico

ATP (γ 32 P )

Adenosina-5’-trifosfato con 32 P en el fosfato γ

BCG

M. bovis Atenuado (Bacilo Calmette-Guérin)

BD2

Cepa mutante de PknD en BCG

BI9

Cepa mutante de PknI en M. tuberculosis (MT2D3)

Cm

Centímetro

col.

Colaboradores

D.O

Densidad Optica

h

Hora

Hig

Higromicina

Kb

Kilopares de base

kDa

Kilodaltons

KOD5

Cepa mutante de PknD en M. tuberculosis (MT2D3)

KOI35

Cepa mutante de PknI en M. tuberculosis (MT2D3)

L

Litros

LB

Luria-Bertani

M

Molar

Mg

Miligramos

min

Minuto

Ml

Mililitros

MM

Milimolar

MmpL7

Proteína

transportadora

de

tuberculosis

M. bovis

Mycobacterium bovis

M. tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis

Ng

Nanogramos

Pb

Pares de base

membrana

(familia

MmpL)

en

M.

xvi PBS

Buffer Fosfato Salino

PCR

Reacción en Cadena de la Polimerasa

PDIM

Pthiocerol Dimicocerosato

PknA

Proteína Quinasa A

PknB

Proteína Quinasa B

PknD

Proteína Quinasa D

PknE

Proteína Quinasa E

PknF

Proteína Quinasa F

PknG

Proteína Quinasa G

PknH

Proteína Quinasa H

PknI

Proteína Quinasa I

PknK

Proteína Quinasa K

SDS

Dodecil Sulfato de Sodio

SDS-PAGE

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida en condiciones disociantes

TBE

Buffer tris-borato 0.089 M; EDTA 0.025 M

TE

Buffer tris-HCl 10 mM, pH 8.0/1mM EDTA

U.F.C

Unidades Formadoras de Colonias

U.F.P

Unidades Formadoras de Placas

μl

Microlitro

μg

Microgramo

μJ

MicroJoules

μM

Micromolar

U.V.

Ultravioleta

V

Voltios

1

INTRODUCCIÓN La tuberculosis pulmonar humana es una enfermedad contagiosa, crónica y severa de los pulmones, que a menudo tiene consecuencias mortales sino es tratada. Sus manifestaciones dependen de factores como: exposición previa, nutrición, presencia de otras infecciones y competencia inmunológica (Spitznagel, 1998).

Pero, comúnmente es

asociada con manifestaciones clínicas como el cansancio, fiebre, pérdida de peso y tos con sangre en los esputos que presenta el paciente en los últimos estadíos de la enfermedad (Glickman y Jacobs, 2001; Smith, 2003).

La tuberculosis es una de las enfermedades más conocidas en el mundo y aunque su agente etiológico, el Mycobacterium tuberculosis, fue descubierto por R. Koch en 1882 (Koch, 1882), los registros fósiles de huesos humanos indican que la relación de este patógeno con su único hospedador (el humano) tiene, al menos, 4000 años de existencia. Históricamente, esta enfermedad es recordada porque logró diezmar a un cuarto de la población europea, aproximadamente, durante el siglo XIX (Smith, 2003).

Fue durante la

primera mitad del siglo XX, que se logró contener el avance de esta enfermedad, gracias al control sanitario sobre las condiciones ambientales de las áreas afectadas y al desarrollo científico-técnico que permitió la introducción de la vacuna BCG (Bacilo CalmetteGuérin) en 1936 y la utilización de los primeros antibióticos específicos: la estreptomicina en 1945 y la isoniazida en 1952 (Young y Cole, 1993).

Después del éxito obtenido, se

pensó que esta enfermedad podía ser erradicada, pero en la década de los años 1980 surgió una alarma por el incremento de los casos de tuberculosis, principalmente por el impacto de la epidemia del SIDA (cuya destrucción de la inmunidad celular permite el desarrollo de patógenos oportunistas como M. tuberculosis), paralelo a las condiciones sociales de empobrecimiento e insalubridad en ciertas áreas del planeta (Bloom y col., 1992; Young y Cole, 1993). A pesar de la extensa utilización de la vacuna BCG, ésta no ha logrado ser un mecanismo efectivo para la protección contra la infección, especialmente en adultos (Orme y col., 2001).

Adicionalmente, la emergencia de cepas patógenas de

tuberculosis resistentes a las drogas en uso se ha constituido en un agravante de la

2 situación (Cole y col., 1998; Chow y col., 1994; Clemens, 1996; Harth y Horwitz 1999; Lagier y col, 1998; Urquhart y col., 1998;

WHO, 2003).

Así, todavía la tuberculosis

continúa siendo un problema de salud pública en el mundo y

se estima que,

aproximadamente, un tercio de la población mundial está infectado con M. tuberculosis (Chow y col., 1994; Deretic y Fratti, 1999; Urquhart y col., 1998; Pelicic y col., 1998; Flynn y Chan, 2001) y aunque el reporte de la Organización Mundial de la Salud señala que en el año 2003 las tasas de prevalencia (245/100000) y mortalidad (28/100000) de la enfermedad están descendiendo, la tasa de incidencia (140/100000) sigue aumentando en todo el mundo. En el 2003 se presentaron 8.8 millones de nuevos casos de tuberculosis y se estimó que 1.7 millones de habitantes murieron por la enfermedad durante ese año [World Health Organization (WHO), 2005]. En la actualidad, las causas que determinan la presencia de esta enfermedad en el mundo residen, principalmente, en la falta de controles sanitarios y seguimiento de la enfermedad a través de adecuados programas de salud en las zonas afectadas, así como la pobreza y la incidencia del Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) (especialmente en Africa) y la presencia de cepas resistentes a las drogas convencionales (fármacoresistencia) (WHO, 2005).

No obstante, no pueden descartarse las singulares características

estructurales y fisiológicas que presenta el M. tuberculosis, los cuales le han permitido tener una larga interrelación con su hospedador.

La infección con el M. tuberculosis ocurre, principalmente, por las vías respiratorias, por donde el patógeno entra en pequeños cúmulos contenidos en forma de aerosoles y llega a los espacios alveolares donde tiene contacto con los macrófagos que son las células hospedadoras (Smith, 2003; Flynn y Chang, 2001). Dentro de los macrófagos, el patógeno reside inicialmente en el fagosoma, que es una vacuola endocítica donde normalmente ocurre la destrucción

de patógenos bacterianos después que este organelo

pasa por un proceso de maduración (fusión fagosoma-lisosoma).

Sin embargo, en

presencia de M. tuberculosis, la maduración de este organelo es inhibida y el patógeno persiste en los macrófagos (Clemens, 1996).

Usualmente, la consecuencia directa, una

vez que este proceso ocurre, no es el padecimiento de la enfermedad y en la mayoría de los casos la infección con la bacteria es asintomática y no infecciosa,

pues la respuesta

inmune que se establece generalmente es capaz de contener, aunque no de eliminar, al patógeno. Esta respuesta consiste en una serie de eventos inmunológicos que culminan en

3 la formación de un granuloma alrededor del foco infeccioso deteniendo el progreso hacia la enfermedad. El granuloma, donde el patógeno reside sin multiplicarse, está conformado por macrófagos, células gigantes, célula T, células B y fibroblastos. (Flynn y Chan, 2001; Smith, 2003).

Se estima que sólo 3-5 % de los infectados desarrollarán tuberculosis en el primer año y otro porcentaje igual la desarrollará en el transcurso de su vida (Smith, 2003). En el primer caso, el desarrollo de la enfermedad se debe, probablemente, a una inadecuada respuesta inmune al inicio de la infección, incapaz de contener al bacilo dentro de los granulomas y conlleva a una enfermedad diseminada, constituyéndose en la forma más agresiva de la tuberculosis (Barnes y col., 1994).

En general, las manifestaciones severas

de la tuberculosis están vinculadas con las reacciones del hospedador frente al patógeno. El daño es causado por una inflamación crónica, progresiva no controlada y por la toxicidad propia de los bacilos que viven dentro del macrófago (Spitznagel, 1998; Glickman y Jacobs, 2001).

En el segundo caso, la infección latente puede reactivarse y

aunque ésta ocurre principamente en el pulmón, podría involucrar cualquier órgano.

Esta

reactivación, a menudo, se origina en respuesta a las perturbaciones del sistema inmune como las que ocurren debidas a la infección con el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH), la edad, el alcohol o las drogas (Flynn y Chan, 2001; Glickman y Jacobs, 2001). En el caso

del VIH, este virus es el causante del Síndrome de Inmunodeficiencia Humana

(SIDA) que está caracterizado por una destrucción selectiva de componentes del sistema inmune, principalmente los T-CD4 +.

Esta destrucción conduce a la inmunosupresión del

paciente y favorece la infección de otros patógenos oportunistas como el M. tuberculosis. (Levy, 1993; Kuby, 1997).

Se estima que las personas VIH-positivo, infectadas con M.

tuberculosis, tienen un 50 % de probabilidad de desarrollar tuberculosis en su vida, debido a la reactivación de la infección primaria con la micobacteria (Smith, 2003).

Así, y tal como lo señala Tyagi y Sharma (2004), el proceso que lleva de la infección con M. tuberculosis a la tuberculosis es un “continuum” que va desde un proceso que incluye la adhesión, la invasión, la supervivencia intracelular y la replicación a través de la diseminación del patógeno hacia otros órganos, hasta la persistencia en formas no replicativas y finalmente la reactivación del patógeno.

4 En la actualidad, uno de los mayores objetivos que se plantea, en la lucha contra la tuberculosis, es el desarrollo de nuevas drogas.

Es cierto que existe una terapia con

antibióticos específicos y que junto a un adecuado seguimiento del paciente y el extricto cumplimiento del régimen terapéutico, esta enfermedad puede contenerse. Pero, el tratamiento de la tuberculosis se encuentra con varios obstáculos importantes como el tiempo prolongado del mismo (~ 6 meses) que determina en muchas ocasiones el abandono de la terapia, la presencia de cepas multiresistentes a las drogas actuales y persistencia de la infección.

la

Así, la investigación científica en el área tiene como uno de

los objetivos fundamentales el desarrollo de nuevas drogas, basado en la detección de nuevos blancos micobacterianos (Duncan y Sacchettini, 2000). hay

que

enfrentar,

al

menos,

dos

planteamientos

Para ello, sin embargo,

importantes:

¿cuáles son las

características fisiológicas que posee el M. tuberculosis, las cuales le permiten sensar el medio ambiente del hospedador y en consecuencia establecer diferentes estrategias de supervivencia frente a la respuesta inmunológica? y

¿cuáles son y cómo funcionan los

mecanismos de regulación celular de M. tuberculosis, responsables de la acción del patógeno

frente

a

la

respuesta

inmunológica?

Entre

los

mecanismos

celulares,

recientemente visualizados en el patógeno, se encuentra la fosforilación de proteínas, específicamente la realizada por proteínas Serina/Treonina Quinasas de Mycobacterium tuberculosis (PSTQ), ya que éstas pueden constituir blancos para el desarrollo de drogas. Prueba de esto es el reporte del inhibidor H7.

Este inhibidor es capaz de inhibir la

actividad de la proteína quinasa PknB y paralelamente también es capaz de inhibir el crecimiento de BCG y la cepa M. smegmatis (cepa saprófita no patógena) (Drews y col., 2001).

Es así, que el estudio de las actividades Ser/Thr de M. tuberculosis, así como la

comprensión de los mecanismos que regulan la misma, los efectos intracelulares y extracelulares que puede ejercer, pueden constituirse en un área de vital importancia para el desarrollo de novedosos agentes antimicobacterianos.

Con esta orientación, el presente trabajo se centró en el estudio de algunas de estas quinasas en M. tuberculosis y la cepa atenuada BCG, considerando la construcción de cepas mutantes. Para la comprensión del lector, el manuscrito contiene dos capítulos. El capítulo I contempla un monitoreo de las actividades Ser/Thr quinasas en las cepas silvestres. Esta sección constituyó un requisito para la posterior evaluación de estas actividades en las cepas mutantes de algunas de estas quinasas. Esta evaluación, junto a la construcción de las cepas mutantes, es abordada en el capítulo II.

5

CAPITULO I. MONITOREO DE LAS ACTIVIDADES SERINA/TREONINA QUINASAS Y SUS POSIBLES SUSTRATOS EN LAS CEPAS SILVESTRES DE Mycobacterium tuberculosis Y Mycobacterium bovis BCG.

MARCO TEÓRICO La pared celular de M. tuberculosis: El blindaje de un patógeno. M. tuberculosis es un miembro del grupo de las micobacterias con crecimiento lento (en medio rico de cultivo el tiempo de duplicación es aproximadamente 12 hr). Son bacterias de forma bacilar (2-4 μ de largo y 0.2-0.5 μ de ancho aproximadamente), pertenecientes al orden Actinomycete (familia Mycobacteriaceae) que se caracterizan por tener una particular envoltura celular, la cual es responsable de la tinción ácido-resistente (tinción Zielh Nielsen), propiedad utilizada para identificar a estos organismos (Davis y col, 1973).

La envoltura micobacteriana posee tres principales motivos estructurales:

la

membrana celular, la pared celular y una capa externa compuesta por lípidos y principalmente polisacáridos unidos no covalentemente a la pared (similar a una cápsula) (Daffé y Draper, 1998). (Fig. 1).

Aunque las micobacterias han sido, tradicionalmente,

clasificadas como bacterias Gram-positivas,

los estudios realizados sobre la envoltura

celular han mostrado que estas bacterias tienen una pared celular más compleja, única en su género, e inclusive comparte ciertas características similares con las bacterias Gramnegativas (McNeil y Brennan, 1991; Rastogi, 1991; Brennan y Nikaido, 1995; Daffé y Etienne, 1999). La pared celular de M. tuberculosis está caracterizada por una baja permeabilidad y es potencialmente responsable de la resistencia a la sequedad, sustancias alcalinas y varias sustancias desinfectantes y quimioterapeúticas, constituyéndose en una formidable barrera que protege al patógeno (Brennan y Nikaido, 1995; Parish, y Stocker,

1998; Daffé y

6 Etienne, 1999). formado

por

Estructuralmente, está constituida por un esqueleto o núcleo central los

ácidos

micólicos-arabinogalactano-peptidoglicano

(MAP),

un

hetereopoliscárido específico (Lipoarabinomano), diversos lípidos extraíbles (glicolípidos, grasas, trehalosas aciladas, sulfolípidos, glicerofosfolípidos) y proteínas (Brennan y Nikaido, 1995; Kremer y col., 2000). (Fig. 2)

7

Fig. 1. Representación esquemática de la envoltura celular de M. tuberculosis. El modelo resalta el complejo ácidos micólicos- arabinogalactano-peptidoglicano (MAP). No se muestran los lípidos unidos no-covalentemente, como las trehalosas micólicas, los lípidos con tiocerol, o el lipoarabinomano, que están anclados en la membrana celular y se extienden (probablemente) en la capa del arabinogalactano. La capa con características similares a una cápsula posee una variedad de lípidos, glicanos, péptidos y proteínas que no están unidos covalentemente al MAP. Fuente: Daffé y Draper, (1998).

Glicolípidos de superficie Ácidos micólicos proteínas

Ácidos micólicos

Lipoarabinoman

Arabinogalactano

Peptidoglica no

Membrana citoplasmática

.

Fig. 2. Modelo de la pared celular de M. tuberculosis Fuente: Kremer, L. Baulard, A. y Besra, G. (2000) con modificaciones.

arabinogalactano

Fosfatidilinositol manósidos

8 EL MAP está constituido por el peptidoglicano unido covalentemente a las cadenas de arabinogalactano por un enlace fosfodiéster. A su vez, el arabinogalactano está unido a los ácidos micólicos, por enlaces tipo éster (McNeil y col., 1990; McNeil y col., 1991; McNeil y Brennan, 1991). están

En la mayoría de las bacterias, las cadenas del peptidoglicano

compuestas por los residuos ácido N-acetil murámico y N-acetilglucosamina. Pero

en el género Mycobacterium, el residuo del ácido murámico es N-glicolado en vez de Nacetilado.

Adicionalmente,

el

peptidoglicano

diaminopimélico (DAP) como ácido diamino

micobacteriano

posee

ácido

meso-

(McNeil y Brennan, 1991; Brennan y

Nikaido, 1995) donde los residuos glutaminilos y diaminopimélicos están amidados en el péptido (Lederer, 1975).

Finalmente, el peptidoglicano micobacteriano presenta un alto

grado de entrecruzamiento interpeptídico debido a los enlaces DAP:DAP, además de los enlaces convencionales DAP:Ala (Wietzerbin y col., 1974)

El Arabinogalactano de la pared celular de M. tuberculosis es un polisacárido que posee características muy particulares. Contiene una unidad de galactano que contiene motivos 5- β- D-galactofuranosyl (Galf) y 6- β- D-Galf que se alternan.

En esta unidad, las

cadenas arabino están unidas al carbono 5 de algunos de los residuos 6-Galf. La parte arabino del arabinogalactano está constituida por tres dominios principales: residuos lineal 5- α - D-arabinofuranosyl (Araf), unidades ramificadas de 3,5- α - D-Araf, sustituidas con residuos 5- α - D- Araf en las dos posiciones ramificadas. Por último, la parte terminal no reducida (motivo pentaarabinosilo) está caracterizada por la sustitución del residuo 3,5- α D-Araf

con el disacárido β- D-Araf- (1→2)- α - D-Araf.

En el terminal reducido del

galactano se encuentran residuos ramnosilos que parecen unir el arabinogalactano al peptidoglicano (Daffé y col., 1990).

Los ácidos micólicos constituyen los lípidos característicos de las bacterias pertenecientes a la rama de los actinomicetes (a la cual pertenecen las micobacterias) Son ácidos grasos α-alkyl, β-hidroxi unidos por enlaces ésteres con el arabinogalactano, en una estructura química de tetramycolylhexaarabinosyl.

Sin embargo, los ácidos micólicos

también se encuentran en la forma de lípidos extraíbles por solventes orgánicos, principalmente como la trehalosa 6,6´dimicolato (Brennan y Nikaido, 1995).

El lipoaraminomano (LAM) es otro de los principales motivos estructurales de la pared celular. Es una unidad compleja que posee un esqueleto “mano” constituido por la

9 unión α1-6 de residuos D-Manp.

A lo largo de este esqueleto se encuentran diversas

sustituciones en la posición 2 con residuos simples de α-Man .

Este centro principal se

encuentra unido a la posición 6 del myo-inositol del anclaje fosfatidil inositol. anclaje

se

encuentra

tuberculosteárico (C19),

acilado

principalmente,

con

(Chatterjee y Khoo, 1998).

ácido

palmítico

En este

(C16:O)

y

La estructura de anclaje es mejor

conocida como los fosfolípidos manosilados o PIM. Son los componentes mayoritarios de la membrana plasmática y constituye la base lípídica del LAM. (Brennan y Nikaido, 1995). La parte arabina está constituida por los motivos: Ara4 y el motivo ramificado Ara6. En M. tuberculosis, estos motivos están cubiertos, en alto porcentaje, por residuos de manosas (ManLAM) (≈ 70 %) (Chatterjee y Khoo, 1998).

Los lípidos extraíbles constituyen aquellos lípidos unidos, no covalentemente, a la pared celular que pueden ser extraídos por solventes orgánicos. Principalmente son los glicolípidos,

glicolípidos

sulfolípidos

y

fenólicos,

glicerofosfolípidos.

glicopeptidolípidos, Entre

ellos

se

trehalosas

aciladas,

encuentran

el

grasas,

phtiocerol

y

fenolphtiocerol, que son lípidos (grasas) constituidos de cadenas largas de β-diol, los cuales se encuentran esterificados por ácidos grasos multimetil-ramificados (ácidos micocerósicos). Esta estructura se conoce como Phtiocerol

Dimicocerosato (DIM ó

PDIM) (Brennan y Nikaido, 1995; Kolattukudy y col., 1997; Camacho y col., 2001). También son muy conocidos los miembros de la familia de las trehalosas aciladas, entre los cuales se encuentra la trehalosas 6,6´-dimicolato. Este lípido es responsable de una de las características morfológicas más conocidas de M. tuberculosis, el “cording”, (Besra y Chatterjee, 1994; Brennan y Nikaido, 1995), representada por primera vez en los dibujos de R. Koch a finales del siglo XIX, como colonias con un crecimiento paralelo de cuerdas (Davis y col., 1973) (Fig.3).

10

Fig. 3. Colonias de bacilos de M. tuberculosis. Dibujo original de R. Koch. Fuente: Davis y colaboradores (1973) con modificaciones.

Se ha postulado que la pared celular, además de mostrarse como una estructura compleja que sirve de protección al patógeno, tiene una relación importante en la virulencia del mismo (Daffé y Etienne, 1999; Glickman y Jacobs, 2001; Rhoades y Ullrich, 2000). Prueba de ello es la identificación de un grupo de genes que codifican para ciertos elementos importantes de la pared celular,

dentro de los genes esenciales para el

crecimiento in vivo en ratones (Camacho y col., 1999). En estos estudios, se detectaron cepas de M. tuberculosis (atenuadas in vivo) que presentaban mutaciones en regiones cromosómicas relacionadas con la síntesis o degradación de lípidos micobacterianos, especial con los lípidos pthiocerol

y derivados de fenolthiocerol.

en

Dichas mutaciones se

ubicaron en una región del cromosoma micobacteriano (50 Kpb) que codifica proteínas relacionadas con la síntesis de los lípidos mencionados.

Estos mutantes, sin embargo,

mostraron un crecimiento en medio de cultivo análogo a la cepa salvaje. Este hecho señala que dichas mutaciones para el crecimiento atenuado in vivo, no interfieren con el metabolismo esencial bacteriano.

Más allá, parecen relacionarse con el establecimiento

inicial de la infección, pues su replicación en macrófagos murinos, después de ocho días de la infección, se encuentra notablemente disminuída (Camacho y col., 1999).

11 El trabajo de Cox y colaboradores (1999) produjo resultados similares a los explicados en el trabajo de Camacho y colaboradores (1999). Pero en este caso se llegó a demostrar que los mutantes obtenidos no eran capaces de producir PDIM o de localizarlo. También mostraron que las mutaciones señaladas parecían importantes en la replicación de los pulmones, más no en el hígado o el bazo.

Posteriormente, Camacho y col (2001)

analizaron el fragmento de 50 kb involucrado en la atenuación de M. tuberculosis y encontraron que los genes fad26 y fad28 están relacionados directamente en la biosíntesis del PDIM y que los genes drrC y mmpL7 son necesarios para su adecuada localización. Más recientemente, Sirakova y colaboradores (2003) han determinado que otros genes, msl7 y pks10 son necesarios para la biosíntesis de DIM, y que los mutantes de los mismos están atenuados en el modelo murino.

Otro ejemplo de elementos de la pared celular como posibles factores de virulencia es el LAM.

Este lipopolisacárido es capaz de inhibir la actividad la proteína quinasa C

(PKC) in vitro. Además parece que la remoción de grupos acilos en LAM (d- LAM) son esenciales en dicha inhibición (Chan y col.,1991).

La PKC tiene una función importante

en la señalización celular que conlleva a la activación transcripcional de los genes regulados por IFN-γ en los macrófagos. Esta citoquina es una de la citoquinas claves en el control de la infección de M. tuberculosis (Murray, 1999; Flyn y Chan, 2001). Así, la inhibición de PKC por LAM

podría desencadenar una cascada de eventos que pueden

contribuir al establecimiento y supervivencia del patógeno en el macrófago. Estos resultados junto a otras evidencias, sugieren que este componente podría postularse como un posible factor de virulencia (Chan y col., 1991). Adicionalmente, se ha propuesto que las unidades manosyl terminales en el LAM de M. tuberculosis (ManLAM) están relacionadas directamente con la adherencia a macrófagos humanos. En consecuencia, este glicolípido, pudiese representar un ligando para los receptores en el macrófago que permiten la entrada de la micobacteria (Schlesinger y col., 1994). Múltiples estudios se han realizado con AraLAM y ManLAM demostrando el amplio espectro de sus funciones inmunomoduladoras, pero las consecuencias biológicas de los datos obtenidos in vitro todavía no están totalmente esclarecidas (Chatterjee y Khoo, 1998).

En relación con las proteínas presentes en la pared celular y su vínculo con la virulencia de M. tuberculosis, es poco lo que se ha concluido en el área. Recientemente, se encontró que la interrupción del gen erp determina un fenotipo avirulento. Este gen

12 codifica para una proteína de 36 kDa que se encuentra asociada a la pared celular y en el medio de cultivo y aunque se ha encontrado en el compartimento fagosomal, su función aún es desconocida (Berthet y col., 1998).

Por otra parte, la detección de la proteasa

Mycosina-1(presente tanto en la pared celular como en la membrana de M. tuberculosis) en macrófagos infectados (Dave y col., 2002), representa el inicio de nuevas investigaciones en los posibles factores proteicos presentes en la pared celular que están relacionados en la virulencia del patógeno.

Las Proteínas Quinasas en el principal mecanismo de señalización intracelular. La incógnita sobre los mecanismos micobacterianos que dirigen la interrelación de M. tuberculosis con el humano, así cómo éstos se encuentran regulados es uno de los grandes retos a los que se han enfrentado los investigadores científicos del área. Una de las respuestas apunta hacia las rutas de señalización intracelular del patógeno y específicamente la fosforilación de proteínas. La razón es, que en pleno siglo XXI y a más de 60 años de la primera descripción de una actividad proteína quinasa (la fosforilación de la caseína por una enzima del hígado) por Burnett y Kennedy en 1954, es difícil encontrar algún investigador científico que no reconozca que el mecanismo de fosforilacióndefosforilación de las proteínas por las proteínas quinasas y las proteínas fosfatasas, respectivamente, es capaz de regular casi cualquier aspecto del metabolismo celular, constituyéndose en la principal vía de señalización intracelular, tal y como lo señala Philip Cohen en un excelente resumen sobre la historia científica de la fosforilación de proteínas (Cohen, 2002).

Las proteínas quinasas se definen como enzimas que transfieren un grupo fosfato de un donante de fosfatos a un aminoácido aceptor en una proteína sustrato. Generalmente, el fosfato-γ del ATP u otro nucleósido trifosfato es el donante, pero existen enzimas que pueden tener otros donantes de fosfatos (Hunter, 1991)

Con base en la similitud de las secuencias aminoacídicas y la especificidad enzimática, las proteínas quinasas se pueden clasificar en dos grandes superfamilias: la familia de las Ser, Thr y Tyr quinasas, y la familia de las histidina quinasas 1996; Stock y col., 2000).

(Hunter, 1995;

Zhang,

Pero, en concordancia con la nomenclatura del Comité de la

13 Unión Internacional de Bioquímicos, las proteínas quinasas deben clasificarse según

la

especificidad del aminoácido aceptor: 1) Fosfotransferasas con un grupo alcohol como aceptor, generando ésteres de fosfato, denominadas proteínas serina/treonina quinasas. 2) Fosfotransferasas con un grupo fenólico como aceptor, generando ésteres de fosfato, denominadas proteínas tirosina quinasas. 3) Fosfotransferasas con una histidina, arginina o lisina como aminoácido aceptor, generando fosfoamidas en las posiciones 1 ó 3 de la histidina, en el grupo guanido de la arginina o en el grupo ε-NH2 de la lisina; denominadas proteínas histidina quinasas, arginina quinasas ó lisina quinasas. 4) Fosfotransferasas con un grupo cisteina como aceptor, generando tioesteres de fosfato, denominadas proteínas cisteina quinasas 5) Fosfotransferasas con un grupo acilo como aceptor, denominadas proteínas aspartil o glutamil quinasas. (Hunter, 1991).

Los primeros estudios sobre la fosforilación de proteínas, todos en proteínas derivadas de organismos eucariotas, tuvieron como protagonista a la fosforilasa quinasa (proteína Ser/Thr quinasa). En aquel entonces, Fischer y Krebs (1955) mostraron que la conversión de la forma B, de la glicógeno fosforilasa, a la forma A se debía a la acción de una enzima en presencia de Mg+2 - ATP, que denominaron fosforilasa quinasa. Más tarde Fischer y colaboradores (1959) mostraron que el grupo γ-P del ATP era transferido a un residuo específico de serina en la forma B de la fosforilasa.

Pero, uno de los grandes descubrimientos fue el de la proteína quinasa dependiente del AMPc (PKA) no sólo por su regulación por dicho nucleótido, sino porque constituyó el primer ejemplo de una cáscada de señalización al demostrarse que la PKA podía activar a la fosforilasa quinasa (Walsh, 1968).

El AMPc (3´, 5´ Adenosina Monofosfato cíclico)

pertenece a la familia de nucleótidos cíclicos que son segundos mensajeros. Su nivel, en las células eucariotas, es determinado por las actividades de las adenilil ciclasa correspondiente

fosfodiesterasa,

las

cuales

catalizan

su

síntesis

y

y la

degradación

respectivamente. La PKA es el efector más conocido de la señalización mediada por el AMPc, sin embargo también se han descrito otros efectores como ciertos canales iónicos y los factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs) (Taskén y Aandahl, 2004). Con respecto a la PKA de mamíferos, esta quinasa es un tretámero compuesto por un

14 dímero de subunidades reguladoras (R) y dos monómeros de subunidades catalíticas (C) en ausencia del AMPc. En esta conformación la PKA es inactiva, pero cuando el AMPc se une al dímero R, en su dominio específico de interacción, la quinasa se disocia en el dímero R y dos monómeros activos de C. En su forma activa, la PKA fosforila en residuos de Ser y Thr

a múltiples sustratos y actúa sobre diversas funciones celulares (Francis y

Corbin, 1996; Lodish y col., 2000).

El descubrimiento de otro importante grupo de proteínas quinasas, las tirosina quinasas, ocurrió a principios de 1980, cuando se determinó que la proteína v-Src, inicialmente reportada como una quinasa por Collett y Erikson (1978), era capaz de fosforilar residuos de tirosina (Hunter y Sefton, 1980).

La gran información de datos sobre proteínas quinasas presentes en organismos eucariotas, fue recogida por Steve Hanks y Anne Marie Quinn para realizar una base de datos de las secuencias aminoacídicas de los dominios catalíticos de las proteínas Serina/Treonina quinasas y Tirosina quinasas conocidas (Hanks y Quinn, 1991) que ha permitido tener una guía para la clasificación inicial de nuevas proteínas quinasas, aunque no de manera extricta y definitiva, pues también se ha determinado que algunas quinasas pueden tener actividad dual.

Es decir, son capaces de fosforilar tanto residuos Ser/Thr,

como Tyr (Linderberg y col., 1992; Dhanasekaran y Premkumar, 1998). En contraste con la intensa investigación realizada en los organismos eucariotas desde 1950, la fosforilación de proteínas en los organismos procariotas es de fecha reciente. Los primeros estudios datan de finales de 1970 y todas las descripciones mostraban, al sistema de dos componentes consistente en sensores de histidina quinasa y sus reguladores de respuesta asociados, como responsables de la fosforilación de proteínas (Stock, 1989; Kennelly y Potts, 1996). El sistema de dos componentes es un mecanismo acoplado de estímulo-respuesta que permite a las bacterias sensar y responder a diferentes condiciones ambientales y actúan en una variedad de mecanismos celulares como la quimiotaxis, regulación de nitrógeno, fósforo y oxígeno, osmoregulación, esporulación, síntesis de exoproteínas, virulencia, entre otros

(Stock y col., 1989; Cozzone, 1993).

Consiste en una proteína histidina quinasa (HQ), que posee un núcleo quinasa conservado, y una proteína reguladora de la respuesta (RR), que a su vez también tiene un dominio regulador conservado.

En este sistema la HQ es el elemento sensor de los estímulos

extracelulares, mientras la RR es el elemento respuesta, del cual se deriva la activación

15 posterior de otros elementos efectores específicos. El funcionamiento del sistema involucra tres pasos principales: Primero el grupo γ-P

del ATP es transferido a una histidina

conservada en la HQ. Segundo la RR cataliza la transferencia de este grupo (P) desde el residuo fosforilado de His a un residuo de conservado de Asp en el dominio regulador de la RR. Finalmente, el grupo fosfato es transferido del residuo fosforilado de Asp, al agua en una reacción hidrolítica (defosforilación).

Las características termodinámicas de la

histidina fosforilada señalan que es una mólecula de alta energía, por lo tanto puede perder rápidamente el grupo fosfato, lo cual contrasta con la estabilidad de los fosfoésteres formados en la fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina (Stock y col., 2000).

Contrario a la creencia de una exclusividad de los organismos eucariotas, sobre la presencia de proteínas Ser/Thr y Tyr quinasas,

Muñoz-Dorado y colaboradores (1991)

encontraron por primera vez, una proteína Ser/Thr quinasa (Pkn1) en la bacteria Myxococcus xanthus.

Desde entonces, también se han reportado Tyr quinasas, Ser/Thr

fosfatas y Tyr fosfatasas, además de otras Ser/Thr quinasas, en varios organismos procariotas y se ha señalado que, además de los sistemas de dos componentes, dichos sistemas están involucrados en una variedad de funciones celulares que incluyen la regulación del desarrollo, respuestas al estrés y patogenicidad (Kennelly y Potts, 1996; Zhang y col., 1996).

Por otra parte, también se han encontrado sistemas de dos

componentes en organismos eucariotas (Kennelly y Potts, 1996; Stock, y col., 2000). En conclusión, en la actualidad la fosforilación de proteínas ya no puede ser simplemente clasificada en proteinas quinasas eucariotas o procariotas y más bien este mecanismo abre un abanico de posibilidades a los mecanismos de señalización intracelular en ambos organismos.

La fosforilación de proteínas de M. tuberculosis: En atención especial, las proteínas Ser/Thr quinasas. M. tuberculosis está incluida entre las bacterias que poseen tanto sistemas de dos componentes, como sistemas de señalización dirigidos por proteínas Ser/Thr quinasas (PSTQ) y proteínas fosfatasas.

La secuencia del genoma de M. tuberculosis reveló la

existencia de 11 secuencias que codifican para sistemas pareados de dos componentes (HQ-RR), 8 secuencias que codifican para proteínas huérfanas de dicho sistema (sin el par correspondiente; seis proteínas reguladoras y dos histidina quinasas), 11 secuencias que

16 codifican para proteínas Ser/Thr quinasas, una proteína Ser/Thr fosfatasa y dos proteínas Tyr fosfatasas (Cole y col., 1998).

Los análisis realizados sobre las secuencias de las histidinas quinasas predicen que estas proteínas tienen una asociación con la membrana y poseen de 1 a 5 segmentos transmembrana que varían entre 3 a 380 aminoácidos y están orientadas a ambos lados de la membrana citoplasmática (Tyagi y Sharma, 2004).

Hasta el presente, se han producido

mutaciones deletéreas (KO) en 9 de los 11 sistemas pareados.

Sólo los sistemas tcrA-

Rv601c-Rv600c y mtrA-mtrB no han sido inactivados por este tipo de mutaciones (Av-Gay y

Deretic,

2005).

Pero,

sólo

3 los sistemas pareados ha sido caracterizado

bioquímicamente: TrcR-TrcS (Haydel y col., 1999) SenX3-RegX3 (Himpens y col., 2000), y

DevR-DevS (Saini y col., 2004),

aunque algunos miembros han sido estudiados

individualmente, como la proteína reguladora MtrA perteneciente al sistema MtrA-MtrB (Via y col., 1996).

Recientemente, la caracterización de dos proteínas huérfanas, la

proteína reguladora Rv1626 (PdtaR) y la proteína histidina quinasa Rv3220c, indican que conforman un nuevo sistema de dos componentes (Morth y col., 2005).

A pesar de toda esta información, las funciones exactas de estos sistemas es muy limitada y los estudios se han dirigido a los patrones de expresión, las características bioquímicas de la reacción de fosforilación y la unión al ADN.

Una excepción es la

inducción de la expresión, bajo condiciones hipóxicas, del gen acr por el sistema DevSDevR (Tyagi y Sharma, 2004; Av-Gay y Deretic, 2005). El gen acr codifica para una proteína de estrés térmico (α-cristalina) con actividad chaperona in vitro, y se piensa que confiere protección al patógeno bajo condiciones adversas incluyendo la hipoxia (Yuan y col., 1998). En una cepa mutante de M. tuberculosis donde el gen devR (dosR) ha sido escindido, la inducción de acr, entre otros genes, estuvo ausente bajo condiciones limitadas de oxígeno (Park y col., 2003).

La importancia de los sistemas de dos componentes en el crecimiento del patógeno y su virulencia ha quedado de manifiesto en estudios de alta densidad de mutagénesis en M. tuberculosis:

Los genes que codifican para las proteínas reguladoras

PhoP, KdpE,

Rv1626 y MtrA; y las histidina quinasas MprB, DevS y MtrB son esenciales para el crecimiento in vitro (Sassetti y col., 2003); y los genes que codifican para la histidinas quinasas SenX3 y KdpD y el gen de la proteína reguladora MtrA son necesarios para la

17 supervivencia en ratones (Sassetti y col., 2003 (b)). Por otra parte, Haydel y Clark-Curtiss (2004) han señalado que de los 17 genes que codifican para las proteínas reguladoras, tres se

expresan

constitutivamente

en

macrófagos

humanos

y

nueve

se

expresan

diferencialmente.

Las proteínas Ser/Thr quinasas de M. tuberculosis han recibido especial atención después de su descubrimiento en el genoma del patógeno. La primera descripción global de todas las PSTQ de M. tuberculosis la realizaron Av-Gay y Everett

(2000), en un

excelente trabajo que permitió tener una visión general de las características estructurales y funcionales predichas a través del análisis de las secuencias genómicas. A partir de este trabajo y las posteriores caracterizaciones de algunas de las quinasas se tiene un resumen de las mismas en la tabla 1.

18 Tabla 1. Propiedades generales de las proteínas Serina/treonina Quinasas de M. tuberculosisa Nombre MLAb

PM c

Genes adyacentes

TM d Características Auto- Función particulares Pe propuesta evidencias experimentales

y

PknA

Rv0015c 45598

OriC/pbp

+

-

+

PknB

Rv0014c 66511

OriC/pbp

+

+

PknD

Rv0931c 69514

+

Transporte de fosfato

PknE

Rv1743

60513

-

+

PknF

Rv1746

50669

Operon de + incorporación de fosfato Transportador + ABC Transportador + ABC

Dominio PonA Dominios PASTAg DominioBpropela, PQQ

-

+

PknG

Rv0410c 81579

GlnH

-

Motivos Trx y + TPR

PknH

Rv1266c 66755

EmbR

+

Similar a Afsk

PknI

Rv2914c 61806

ffh, ftsY

+

PknJ

Rv2088

Transposon

+

Asn en el sitio + activo +

Transporte de membrana Transporte de Membrana Transporte de glucosa y división celularh Incorporación de aminoácidos, metabolismo de fase estacionaria. Metabolismo del glutamato/glutaminai Metabolismo del Arabino. División celular.

PknK

Rv3080c 119420 Similar a luxA -

Dominios PDZ y AAA

PknL

Rv2176

-

61564

42803

Regulador + transcripcional

+

-

Crecimiento celular/división División celularf Crecimiento celular/división

? Transcripción metabolitos secundarios ¿Transcripción?

a

y

Abreviaturas: ABC, ATP-binding cassette transporter; MLA, marco de lectura abierto (“ORF= open reading frame”); PQQ, pirroloquinolina quinona; TPR, tetratricopéptido; Trx, tioredoxina b Designación de los MLA de M.tuberculosis H37Rv c El peso molecular se expresa en Daltons d Predicción de una región de transmembrana e Evidencia experimental de auto-fosforilación f Evidencia experimental de posible función: Chaba y colaboradores (2002) g PASTA: dominio asociado a proteínas que unen penicilina y proteínas serina /treonina quinasa (Yeast y col., 2002; Young y col., 2003) h Evidencia experimental de posible función: Deol y colaboradores (2005) i Evidencia experimental de posible función: Cowley y colaboradores (2004).

Fuente: Av Gay y Everett, 2000 con modificaciones. Los datos de autofosforilación fueron modificados tomando en cuenta las referencias más recientes de PknA (Chaba y col., 2002); PknE (Molle y col., 2003); PknG (Koul y col., 2001) y PknI (Gopalaswamy y col., 2004); PknH (Sharma y col., 2004)

19 En este capítulo se hará referencia a las características bioquímicas y estructurales, mientras las características funcionales serán analizadas en el capítulo II.

El alineamiento de los dominios quinasa de las PSTQ de M. tuberculosis (Av-Gay y Everett, 2000) muestra que todos los 11 dominios característicos de las proteínas Serina /Treonina quinasas (Hanks y Quinn, 1991) están presentes en las mismas (Fig. 4; sólo dominios VI-IX). Muchos residuos se encuentran altamente conservados.

De manera

resaltante, PknI es la única quinasa que posee una asparagina en lugar de una lisina en el dominio VIb de su sitio activo (Av-Gay y Everett, 2000). Este último aminoácido es característico de dicho dominio en las PSTQ de eucariotas (Hanks y Quinn, 1991).

Fig. 4. Alineamiento de los dominios de Hank VI-IX de las proteinas S/T quinasas de Mycobacterium tuberculosis. El alineamiento se realizó utilizando el programa ClustalW (intervalo de apertura 10.0; intervalo de extensión 0.2) y los programas Shadybox del paquete Seqlab GCG10.0 Winsconsin. El color rojo representa 100 % de identidad, el amarillo 75-99 % de identidad y el azul 50-75 % de identidad. Fuente: Av-Gay y Everett (2000).

Los análisis filogenéticos muestran que las PSTQ de M. tuberculosis son muy similares a otras PSTQ de organismos procariotas, especialmente Mycobacterium leprae y Streptomyces coelicolor. Las quinasas PknA, PknB, PknG y PknL tienen una alta homología (74-87 %) con las correspondientes proteínas quinasas en M. leprae. Sólo las quinasas PknG y PknK no están agrupadas con las otras PSTQ y parecen más similares a sus proteínas homólogas en organismos eucariotas (Av-Gay Everett, 2000).

20 Todos los genes que codifican para las PSTQ, al parecer, están presentes en el cromosoma de la cepa BCG (Av-Gay y Everett, 2000). Sin embargo, algunas diferencias se han encontrado con respecto a la quinasa PknD, la cual se encuentra truncada tanto en la cepa M. bovis como BCG (Peirs y col., 2000). Otra diferencia también se ha encontrado en el gen que codifica para la quinasa PknH en M. bovis. Este gen presenta una deleción interna y el análisis del mismo revela una variación en la secuencia de la proteína que podría afectar la especificidad por el sustrato aunque los sitios activos predichos parecen conservarse (Garnier y col., 2003).

Por otra parte, el analisis realizado a las distintas secuencias aminoacídicas, predichas para cada proteína, reveló la presencia de distintos motivos estructurales (Fig.5). Todas las quinasas presentan un motivo quinasa.

Nueve quinasas poseen un motivo

transmembrana, así que sólo dos quinasas parecen ser solubles (PknG y PknK).

La

predicción topológica realizada a las proteínas quinasas con motivos transmembrana indica que el extremo amino-terminal se encuentra en el citoplasma, mientras que el carboxiloterminal en la parte extracelular (Av-Gay y Everett, 2000).

Pero, esta disposición sólo ha

sido experimentalmente demostrada para la quinasa PknE (Molle y col., 2003).

El análisis inicial de los motivos estructurales de la proteína PknB mostró en el extremo carboxilo- terminal una secuencia con alta homología a PonA (Av-Gay y Everett, 2000).

Esta última, es una proteína de M. tuberculosis que une benzilpenicilina y

pertenece al tipo I de las PBP (penicilin binding protein) (Bhakta y Basu, 2002). En E. coli, las proteínas que unen penicilina (PBPs) son las responsables del último paso (entrecruzamiento de las cadenas de glicano) en la formación y ensamblaje del peptidoglicano (Ghuysen, 1991). Sin embargo, en M. tuberculosis, no se ha demostrado la actividad transglicosilasa o transpeptidasa de PonA (actividades responsables de la fase final en la biosíntesis del peptidoglicano).

21

Fig. 5. Análisis estructural de las proteínas Ser/Thr quinasas de Mycobacterium tuberculosis. Para buscar las secuencias peptídicas de motivos estructurales o funcionales conocidos se utilizaron los programas Profile Scan (http:://www.isrec.isb.ch/software/PFSCAN_form.html), Easymotif (Glaxo Wellcome in-house package incorporating PFAM, BLOCKS y PRINTS) y la base de datos Pedant. (http.//pedant.mips.biochem.mpg.de/mtb/). Los motivos se dibujaron sobre una representación esquemática de la secuencia lineal peptídica. Abreviaturas: PQQ, pirroloquinolina quinona; TPR, tetratricopeptido; Trx, Tiorexdosina . Fuente: Av-Gay y Everett. (2000)

Posteriormente, Yeast y colaboradores (2002) identificaron que la región de homología entre PonA y PknB está constituida por el dominio PASTA (dominio asociado a proteínas que unen penicilina y proteínas serina/treonina quinasa). Este dominio es una región conservada que puede presentarse en una o varias copias.

Es

una estructura

globular que posee tres hojas ß y una hélice alfa, con una hendidura de tamaño variable entre la primera y la segunda hoja ß. después del motivo transmembrana

PknB posee 4 dominios PASTA inmediatamente

(Fig. 6).

Debido a que los dominios PASTA en la

quinasa PknB están en la región extracelular de la proteína, y dada la cercanía del gen pknB a genes que pueden estar relacionados con la biosíntesis de la pared celular (por ejemplo, rodA y pbpA), se ha postulado que estos dominios podrían constituir una región sensora de estímulos, como la presencia del peptidoglicano libre, y en consecuencia a esta

22 detección, se podrían activar otras proteínas que intervienen en la biosíntesis de la pared celular incluyendo las PBP (Yeast y col., 2002).

Fig. 6. Dominios estructurales presentes en la proteína PknB de M. tuberculosis. Dominio quinasa (pkinase); dominio transmembrana (TM); dominio PASTA (P). Fuente: Yeast y colaboradores (2002)

Continuando con los motivos estructurales de PknB, el dominio quinasa de PknB es el único dominio catalítico de las 11 Ser/Thr quinasas que ha sido cristalizado (Fig. 7). Su análisis ha mostrado que el dominio presenta en su forma activa una conformación similar a otras proteínas Ser/Thr quinasas eucariotas (conformación cerrada), como la PKA, aunque con ciertas particularidades como la presencia de una región desordenada (Young y col., 2003; Ortiz-Lombardía y col., 2003). La estructura del dominio catalítico en su forma activa adopta una conformación cerrada con el nucleótido fuertemente unido en una profunda hendidura ubicada entre los lóbulos N-terminal y C-terminal.

Esta

conformación es similar a la adoptada por la proteína PhK, pero contrasta con la conformación cerrada de la PKA donde existe un complejo enzima- sustrato-nucleótido (Ortiz-Lombardía y col., 2003). En el dominio catalítico de PknB también fueron identificados 4 residuos fosforilados, dos treoninas y dos serinas (Young y col., 2003). Al respecto, Boitel y colaboradores (2003) mostraron que la fosforilación de los dos residuos de treonina (Thr 171 y Thr173) es realizada por la actividad catalítica del propio dominio y que, dicha fosforilación, es necesaria para la completa activación de la quinasa PknB. Adicionalmente, dichos residuos fosforilados son sustratos de la Ser/Thr fosfatasa de M. tuberculosis PstP.

Estos resultados indican que la fosforilación-defosforilacion en el loop

catalítico de PknB representa un posible micobacterianas (Boitel y col., 2003).

mecanismo de regulación de las quinasas

23 A

B

Fig. 7. Estructura completa del dominio catalítico de PknB. A. Estructura terciaria de PknB. Los residuos esenciales están representados sobre la estructura secundaria de PknB. Se indican la región N-terminal (violeta), región de bisagra (verde oscuro), región C-terminal (rojo). El lazo ó loop catalítico está representado en color azul-verdoso y el loop de ubicación del magnesio en verde claro. La parte no vista de loop de activación está dibujada por una línea negra punteada. B. Superposición de la estructura de PknB (rojo) sobre la conformación cerrada de PKA en el complejo ternario (verde) y PhK en el complejo binario nucleótido-enzima (amarillo). El dominio quinasa completo fue utilizado para realizar la superposición. Fuene: Ortiz-Lombardía y coaboradores (2003)

Cuando el dominio quinasa de PknB fue comparado con otras 22 proteínas bacterianas, el sitio de unión al ATP, los extremos de los loops adyacentes al γ-fosfato y la superficie de unión (análoga al dominio de unión del sustrato en la PKA), son al s regiones más conservadas. Esto sugiere que la conformación del estado activo de las Ser/Thr quinasas presenta características universales tanto en eucariotas como en procariotas (Young y col., 2003).

La proteína PknD presenta en su región carboxilo- terminal seis regiones, ubicadas en tándem,

homólogas a las estructuras β-propela (Av-Gay y Everett, 2000).

Estas

estructuras están presentes en varias proteínas, entre las que se encuentran las tirosinas quinasas (Springer, 1998) y las subunidades β de las proteínas G (Sondek y col., 1996), entre otras.

En el dominio β-propela de PknD se encuentra contenido un dominio

pirroloquinolino quinona (PQQ) (Av-Gay y Everett, 2000). La PQQ es una coenzima que

24 funciona como cofactor para algunas deshidrogenasas bacterianas, conocidas como quinoproteínas (Cozier y col., 1995; Kay y col., 2004). Posterior a este análisis, el estudio realizado sobre la cristalización del extremo carboxilo-terminal de PknD, reveló que la estructura β propela contiene seis hojas, cada una con 4 cadenas antiparalelas tipo β, arregladas cíclicamente alrededor de un poro o núcleo central (Fig. 8). Aunque, según en el perfil de la secuencia repetitiva del motivo β-propela (YVTD) esta estructura pertenece a la clase NHL-β propela, la secuencia repetitiva de este motivo se encuentra, estrictamente, entre las proteínas de tipo NHL y las proteínas repetidas YWTD

y

YVTN.

con secuencias consenso

De esta manera, el dominio sensor conformado en el

carboxilo terminal representa una nueva clase de dominio NHL-β-propela (Good y col., 2004).

Fig. 8. Dominio sensor de PknD. El dominio β propela en la región carboxilo terminal de PknD está conformado por seis hojas, cada una con cuatro cadenas. Los números indican el número de la hoja. La hoja Nº 1. es la más cercana al amino- terminal. La unión formada por el N-terminal y el C-terminal está enmarcada en una caja. La hendidura o “loop” 3-4 en la hoja 1 está desordenada. El dominio β propela forma, aproximadamente, un cilindro con un radio de 40 Å y un peso de 35 Å. Fuente: Good y colaboradores (2004), con modificaciones.

El dominio antes mencionado se encuentra ausente en la proteína PknD de M. bovis y la cepa atenuada M. bovis BCG.

En estas cepas, el gen que codifica para esta proteína

posee una adenina adicional después de la posición 829, que determina un cambio en el marco de lectura abierto y la consecuente expresión de una proteína truncada, de 30 kDa, que carece de los dominios transmembrana y carboxilo terminal observados en la quinasa PknD de M. tuberculosis (Peirs y col., 2000).

25 PknG es la única de las 11 quinasas que posee en la región amino- terminal un dominio estructural diferente al dominio quinasa. Este dominio es homólogo al sitio activo de las tioredoxinas (dominio TRX) (Av-Gay y Everett, 2000). El dominio TRX consiste en una secuencia corta (-Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys-) que poseen las tioredoxinas en su sitio activo, en el cual las cisteínas se encuentran unidas por un enlace disulfuro. Las tioredoxinas están involucradas en la oxidación-reducción de los puentes disulfuro de las proteínas y actúan en condiciones de estrés celular con funciones antioxidantes y de reparación celular tanto en organismos procariotas como eucariotas (Watson y col., 2004). Después del dominio quinasa, se encuentra el dominio TPR ó

tetratricopéptido (ubicado

en la región carboxilo terminal). Se ha descrito que, en organismos eucariotas, este dominio consta de una a 16 repeticiones de 34 residuos básicos colocadas en tándem, y funcionan como secuencias de reconocimiento entre proteínas en las vías de señalización intracelular (D´Andrea y Regan, 2003; Cliff y col., 2004).

PknK tiene un dominio AAA (“ATPases Associated Activities”).

Este dominio

(PROSITE: PDOC00572) es descrito como una región conservada que posee un sitio de unión al ATP y que en la mayoría de las proteínas donde se encuentra presente actúa como un

sujetador

o

abrazadera

tuebingen.de/AAA/Description.html).

de

dicho

nucleótido.

(www.yeamob.pci.chemie.uni-

En el dominio AAA, se encuentra contenido un

dominio PDZ (PROSITE: PDOC50106). Este tipo de dominio está presente en proteínas eucariotas

y

tuebingen.de/PDZ/Description.html).

procariotas

((www.yeamob.pci.chemie.uni-

En las proteínas eucariotas, los dominios PDZ

funcionan como módulos de interacción de proteínas y están involucrados en la organización y localización de las redes de proteínas en las membranas. En varios casos este dominio se une a una secuencia consenso presente en el carboxilo terminal de la proteína con la cual interactúa (Ponting y col., 1997). Este tipo de interacción también ha sido propuesta para los dominios PDZ presentes en las proteínas bacterianas (Ponting, 1997).

La región carboxilo terminal de PknK muestra una alta homología con reguladores transcripcionales de la familia LuxR, como AcoK (Pen y col., 1997) y MalT (Richet y Raibaud, 1987) que regulan la expresión de proteínas deshidrogenasas de la acetoina en Klebsiella pneumoniae y la expresión del regulón de Maltosa en E. coli, respectivamente. Aunque PknK no muestra homología con estas proteínas en la región de la unión al ADN,

26 se cree que la quinasa podría regular la producción de metabolitos secundarios como los producidos por los miembros de la familia LuxA (p.ej. el antibiótico lincomicina en Streptomyces sp.) debido a que el gen de la quinasa se encuentra cercano a genes con homología a esta familia (Av-Gay y Everett, 2000).

De las 11 proteínas Ser/Thr quinasas de M. tuberculosis, 8 se han expresado in vitro y la caracterización parcial bioquímica verifica que todas ellas pertenecen a la familia de las Ser/Thr quinasas: PknA (Chaba y col., 2002), PknB (Av-Gay y col., 1999), PknD (Peirs y col., 1997), PknE (Molle y col., 2003), PknF y PknG (Koul y col., 2001), PknH (Sharma y col., 2004), PknI (Gopalaswamy y col., 2004).

La actividad catalítica ha sido

mostrada a través de la autofosforilación de la propia quinasa y/o sustratos exógenos como la proteína básica de mielina MBP ó la Histona. residuos fosforilados de Ser y Thr.

En ambos casos se han registrado

Con respecto al modo de activación,

regulación y

especificidad, se ha propuesto que los dominios FHA juegan un papel importante en la unión de las proteínas quinasas a sus sustratos. El dominio FHA (“forhead-associated” ) es una secuencia conservada de ~75 aminoácidos que reconocen proteínas fosforiladas principalmente en residuos de treonina y se encuentran tanto en eucariotas como procariotas.

En M. tuberculosis se han encontrado 6 proteínas con estos dominios:

Rv0019c, Rv0020c, Rv1267c (EmbR), Rv1747 (transportador ABC), RV1827 (GarA) y Rv3360 (Pallen y col., 2002).

Los dos primeros se encuentran en el mismo operon donde

se ubican los genes pknA, pknB y el gen de la Ser/Thr fosfatasa PPP (ppp) (Av-Gay y Everrett, 2000; Pallen y col., 2002). Rv1747 se encuentra en el mismo operon que pknF; y embR está adyacente al gen pknH (Av-Gay y Everrett, 2000).

Se ha demostrado que

EmbR es un sustrato in vitro de PknH y que los dominios FHA de EmbR son necesarios para su fosforilación (Molle y col., 2003 (b)). Lo mismo ocurre con RV1747 y la quinasa PKnF (Molle y col., 2004).

Estos primeros resultados han sugerido un posible mecanismo general de interacción de las PSTQ de M. tuberculosis con sus sustratos a través de los dominios FHA, lo cual ha sido apoyado por las interacciones de las quinasas PknB, PknD, PknF, PknE con los dominios FHA de Rv1747 y Rv0020c (Grunder y col., 2005).

En este

estudio, se determinó que además de PknF, las quinasas PknB, PknD y PknE son capaces de fosforilar in vitro los dominios FHA de RV1747 (PknD y PknE sólo uno de los dos). De manera similar la quinasa PknF es capaz de fosforilar el dominio FHA de RV0020c y la

27 quinasa PknB requiere de este dominio para la fosforilación de esta proteína en su forma completa. Esto sugiere que no sólo los FHA pueden intervenir en el reconocimiento quinasa-sustrato, sino en la fosforilación del sustrato y que una misma proteína (o al menos un dominio de la misma) puede ser sustrato de varias quinasas (Grunder y col., 2005). Apoyando el número de evidencias sobre los dominios FHA en los sustratos de la PSTQ, se encontró que GarA es un sustrato de PknB in vitro, y que el dominio FHA es necesario para su fosforilación en el N-terminal de la proteína (residuo Thr22) (Villarino y col., 2005).

Por otra parte, PknB, PknD, PknF, PknE también fueron evaluadas en sus patrones de fosforilación en el dominio catalítico, encontrándose que en todas las quinasas éste dominio está fosforilado en múltiples residuos, pero con preferencia los residuos de Thr, los cuales a su vez son sustratos de la Ser/thr fosfatasa PstP (PPP) y se corroboró que los dos residuos de Thr en el dominio catalítico de

PknB son necesarios para su completa

activacion (Durán y col., 2005). No obstante, de manera general la autofosforilación de las quinasas podría no estar limitada únicamente a su dominio catalítico, prueba de ello es la autofosforilación de PknG en su porción C- terminal, donde se ubica el motivo estructural TPR, además de la autofosforilación de su dominio catalítico (Cowley y col., 2004).

Una

diferencia importante de la actividad de esta quinasa, con respecto a los patrones generales mencionados anteriormente, es que su autofosforilación es en residuos de serina (Koul y col., 2001). Adicionalmente y de manera interesante, se propone que esta quinasa tienen una actividad proteolítica intrínseca, ya que es sobreexpresada como dos polipéptidos, uno correspondiente a la forma completa 86 kDa y otro de 30 kDa (correspondiente al Cterminal) ambos fosforilados por la actividad catalítica de la quinasa (Cowley y col., 2004).

PknB ha sido la quinasa más estudiada y los resultados obtenidos pueden ser utilizados para proponer un mecanismo general de activación e interacción para las PSTQ de M. tuberculosis: Previamente se hizo mención al análisis de la estructura de su dominio catalítico (Young y col., 2003; Ortiz-Lombardía y col., 2003)

y el requerimiento de la

fosforilación de dos residuos de Thr en el mismo, para la activación de la quinasa (Boitel y col., 2003).

Junto a estos resultados, el descubrimiento de que la proteína GarA es

sustrato de PknB (Villarino y col., 2005), ha conducido a la formulación de un modelo de activación e interacción de las PSTQ quinasas utilizando a la proteína GarA como sustrato de PknB. En el modelo (Fig. 9), se sugiere que la activación de la quinasa, a través de la

28 autofosforilación del dominio catalítico en residuos de Thr, es requerida para el reclutamiento del sustrato hacia el dominio catalítico de la enzima.

Este reclutamiento

ocurre mediante la interacción de los residuos fosforilados de treonina en el dominio catalítico y los dominios FHA en el sustrato. Finalmente el sustrato es fosforilado en un sitio específico (en este caso la Thr22 del amino-terminal de GarA) (Villarino y col., 2005).

Fig. 9. Mecanismo propuesto para las interacciones entre PknB y GarA. En este mecanismo la fosforilación en el loop catalítico es requerida tanto para la activación de la quinasa como para el reclutamiento del sustrato. Fuente: Villarino y colaboradores (2005)

29 OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS. Al inicio de este estudio ya se conocía la secuencia completa del genoma de M. tuberculosis y de la existencia de 11 genes que codificaban para Ser/Thr quinasas.

Sin

embargo, sólo se habían caracterizado parcialmente dos quinasas de M. tuberculosis. PknB (Av-Gay y col., 1999) y PknD (Peirs y col., 1997). Adicionalemnte, PknD también había sido estudiada en M. bovis (Peirs y col., 2000), previo a la secuenciación del genoma de esta cepa (Garnier y col., 2003).

No obstante, sólo un estudio había mostrado los

sustratos fosforilados por actividades quinasas de tipo eucariota en extractos totales de proteínas de M. tuberculosis (Av-Gay y Davies, 1997). Con el transcurso del tiempo, otras Ser/Thr quinasas de M. tuberculosis fueron expresadas y caracterizadas parcialmente in vitro, pero el análisis de estas proteínas o sus actividades en fracciones de proteínas no continuó siendo abordado. En tal sentido, este estudio persigue los siguientes objetivos:

Objetivo general. Caracterizar parcialmente, la fosforilación de sustratos endógenos y exógenos, por las actividades quinasas, específicamente del tipo de las proteínas Ser/Thr quinasas, presentes en fracciones de proteínas de las cepas M. tuberculosis y M. bovis BCG e identificar los posibles sustratos de dichas quinasas.

Objetivos específicos. Determinar la presencia de proteínas Ser/Thr quinasas y sus sustratos en las cepas M .tuberculosis y M. bovis BCG, a través de la utilización de anticuerpos dirigidos contra residuos fosforilados en Ser y Thr;

y anticuerpos específicos dirigidos contra algunas

Ser/Thr quinasas del patógeno.

Evaluar diferentes condiciones para las actividades Ser/Thr quinasas en las cepas M. tuberculosis y M. bovis BCG, a través del monitoreo de los perfiles de sustratos endógenos fosforilados in vitro en fracciones de proteínas bajo distintas condiciones de temperatura y en presencia de iones divalentes, activadores e inhibidores de dichas actividades

30 Identificar parcialmente los sustratos endógenos fosforilados por las actividades Ser/Thr quinasas presentes en las fracciones de proteínas de las cepas M. tuberculosis y M. bovis BCG. Evaluar las actividades Ser/Thr quinasas sobre sustratos exógenos en las cepas M. tuberculosis y M. bovis BCG bajo las mismas condiciones empleadas para los sustratos endógenos.

31

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Cepas de Estudio y condiciones de cultivo Se utilizó la cepa M. bovis BCG var Pasteur (BCG) (ATCC 35734, colección de cepas Trudeau) obtenida del Laboratorio de W.R. Jacobs, (Albert Einstein College of Medicine. Bronx, N.Y) como cepa no patógena en el estudio.

Las cepas MT14323 y

MT2D3 constituyeron las cepas patógenas de M. tuberculosis. La cepa MT14323 es una cepa de referencia, originaria de Copenhague que fue facilitada por el Dr. Jacobus de Waard (Jefe del Laboratorio de Tuberculosis en el Instituto de Biomedicina-UCV).

La cepa MT2D3 representó el aislado clínico más común obtenido en un estudio sobre la Transmisión de Tuberculosis en Catia (Parroquia Sucre de Caracas) entre 19992001; y fue caracterizada por R. Jaspe, Y. Rojas y H. Takiff (resultados no publicados) utilizando la técnica de espoligotipaje, la cual consiste en la presencia y ausencia de espaciadores (secuencias únicas) entre repetidos directos (secuencias idénticas) presentes en el locus DR del genoma de las especies que pertenecen al complejo de M. tuberculosis (Kamerbeek y col., 1.997). La comparación del espoligotipo de MT2D3 con la base de datos ESPOLDB3 (Filliol y col., 2.002) indica que esta cepa pertence a la familia Latino Americana del Mediterráneo (LAM) (Abadía, comunicación personal).

Para los cultivos crecidos en medio líquido (10 ml - 200 ml, según el caso), se utilizó el medio Middlebrook 7H9 (Himedia) suplementado con OAD al 10 % (ácido oleico- albúmina-glucosa-NaCl), glicerol (0.2 %). Los frascos de cultivo (NunclonR , NuncT M Service Life Science; Roskilde, Dinamarca)

se mantuvieron herméticamente

cerrados a 36-37 ºC por períodos entre 2-7 semanas. Para corroborar la identidad y pureza de los cultivos de micobacterias, se realizó la tinción de Ziehl Nielsen (entre las bacterias esta tinción es específica para las micobacterias) y controles en placas de medio LuriaBertani (LB)-agar (para detectar contaminación con bacterias de crecimiento rápido). Para los cultivos en medio sólido, se utilizó 7H11 (Himedia)+OAD (10 %).

Las cepas no patógenas fueron cultivadas en el Laboratorio de Genética del Centro de Microbiología del IVIC, mientras que las cepas patógenas fueron cultivadas en

el

32 Laboratorio de Tuberculosis del Instituto de Biomedicina (UCV), a cargo del Dr. Jacobus de Waard. 2. Lisis y fraccionamiento celular La homogenización o lisis

de las micobacterias con el fin de aislar las diferentes

fracciones de proteínas solubles e insolubles fue realizado por ultrasonido o por lisis con perlas de vidrio o zirconium siguiendo algunas recomendaciones de Parish y Wheeler (1998). En el caso de la cepa no patógena la lisis fue realizada utilizando ambos métodos, mientras que la ruptura de las micobacterias patógenas sólo se realizó con la utilización de perlas de vidrio o zirconium.

Las bacterias de los cultivos correspondientes se cosecharon por centrifugación a 2500 g por 15 min. Posteriormente se lavaron (3 veces x 15 min) en buffer fosfato salino pH 7.5 (PBS), estéril y frío. Las bacterias así obtenidas se resuspendieron (2 ml/gr) en una solución amortiguadora o “buffer de lisis” [20-50 mM Tris pH 7.6 conteniendo 1 mM PMSF y 2.5 μg/ml pepstatina ó el coctel de inhibidores de proteasas Complete (Roche)]. En algunos casos fueron añadidos 100 mM NaF y 2 mM ortovanadato de sodio (Na3 VO4 ) como inhibidores de fosfatasas (Heffetz y col.., 1991) y 20 % glicerol al buffer de lisis. La lisis por ultrasonido se realizó con 10 pulsos de 50 W (c/u) con 1 min de duración e intervalos de 1min en frío.

Para la lisis con perlas, se colocaron en viales de 2 ml, perlas de Zirconium o vidrio de 0.1 mm estériles, con la suspensión bacteriana en una proporción 1:1 aproximadamente.

La muestra, cerrada herméticamente, se sometió a 3 ciclos de

congelamiento–descongelamiento en nitrógeno líquído-agua tibia. A continuación, se colocaron en vórtex (velocidad máxima) a T.A, por 3-4 períodos de 3 min, con intervalos en hielo de 1 min.

Finalmente todo el extracto fue esterilizado por filtros estériles de 0.45

μm, o en su defecto las bacterias no lisadas y el detritus fueron eliminados por sucesivas centrifugaciones de 3 min

a baja velocidad (2000 x g –3000 x g) para evitar que la

fracción de pared celular pudiera perderse en las mismas.

La centrifugación entre 15000 x g y 27000 x g de los extractos de proteínas totales de las micobacterias por 20-30 min conlleva a la separación de una fracción insoluble que contiene los principales componentes de la pared celular, mientras deja en el sobrenadante

33 las fracciones de proteínas citosólicas y membranosas (Hirschfield y col. 1990; Lee y col., 1992; Camacho y col., 2001; Pethe y col., 2002). En este estudio dicha fracción insoluble fue obtenida del Extracto crudo o proteinas totales (fracción Et) por centrifugación a 20000 x g por 20 min. y se denominó la fracción de proteínas asociadas a la pared celular (fracción P).

A continuación el sobrenadante de este proceso (Extracto clarificado ó

fracción Ec) fue sometido a 100.000 x g por 1 h, para obtener proteínas solubles o citosólicas en el nuevo sobrenadante (fracción S) y proteínas de membrana en la fracción insoluble del sedimento o “pellet” (fracción M). Todas las fracciones se guardaron a –70 °C hasta su análisis.

La concentración de proteínas fue determinada por el método de

Bradford (1976) utilizando la proteína albúmina sérica bovina (BSA) como estándar.

3. Ensayos de actividad proteína quinasa. Partiendo de la premisa que existen dos tipos de proteínas quinasas (Sistemas de dos componentes y Ser/Thr quinasas) según los resultados de la secuenciación del genoma de M. tuberculosis (Cole y col., 1998), se diseñó un protocolo para poder estudiar las actividades Ser/Thr, discriminando las actividades quinasas de los sistemas de dos componentes.

Para ello se tomaron algunas consideraciones técnicas que favorecieron la

presencia de sustratos fosforilados en Ser y Thr, específicamente, tomando todas aquellas variables que van en detrimento de la presencia de sustratos fosforilados por las actividades quinasas de los sistemas de dos componentes. Las reacciones de fosforilación en los sistemas de dos componentes

involucra la presencia de dos tipos de residuos

fosforilados (pHis y pAsp) y la evidencia de uno de ellos o ambos presenta dificultades técnicas debido a variables como las tasas de fosforilación-defosforilación de la proteína quinasa y la proteína reguladora, las proporciones de cada componente presente en la reacción, y la estabilidad de dichos residuos (Hess y col., 1991). ebullición

incrementa la

Se ha reportado que la

la hidrólisis de pHis y en especial de pAsp en el el sistema

CheA-CheY de E. coli. Adicionalmente, los residuos fosforilados de His son sensibles al tratamiento con ácido mientras que los residuos fosforilados de Asp son sensibles tanto a los ácidos como a las bases. De esta manera se indica que todos los tratamientos rutinarios que utilizan ácido (como el ácido acético en la tinción de geles) conducen a una pérdida importante de señal, y que sólo deben usarse con un tiempo muy limitado (Hess y col., 1991).

En el presente estudio todas las muestras fosforiladas fueron hervidas,

las

soluciones de tinción de geles contenían 10 % ácido acético y los geles fueron desteñidos, previo al proceso de secado, por 1-2 días como mínimo.

34 Teniendo presente las consideraciones previas, los ensayos para estudiar la actividades Ser /Thr quinasas de BCG protocolo de Favre y Ohja (1991),

y

M. tuberculosis fueron diseñados según el

con ciertas modificaciones. El ensayo estándar (50-60

μl final) contenía: 40-50 μl de las fracciones aisladas (a menos que se indique lo contrario) con 10 μl de una mezcla de reacción que contenía: 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, MgCl2 y/o MnCl2 (en concentraciones a determinar), 50 μM ATP (γ- 32 P) (3000 cpm/pmol) (3000 Ci/mmol, Amersham o New England Nuclear).

La selección del ión requerido como cofactor de la actividad quinasa se llevó a cabo a través de la estandarización con 2.5 mM MnCl2 y 2.5 mM ó 15 mM de MgCl2. La concentración de 2.5 mM Mn+2 fue establecida considerando los resultados óptimos de actividad quinasa alrededor de 2 mM de dicho ión en la quinasa PknD (Peirs y col., 1997). Para evaluar el efecto del calcio y el AMPc se utilizaron concentraciones de 2.5 mM y 0.1 mM, respectivamente. La histona IIA (90-120 μg) y la caseína defosforilada (25-60 μg) (Sigma) fueron utilizadas como sustratos exógenos en los ensayos quinasa.

La reacción

[20-30 min. a temperatura ambiente (T.A.) ó 36 ºC] se detuvo con buffer muestra 4(X) [0.25 M Tris/HCl pH 6.8, 4 % SDS (p/v), 40 % glicerol (p/v), 4 % 2-mercaptoetanol (v/v) y 0.008 % azul de bromofenol (p/v)] e incubación a 100 °C por 5-10 min. Luego, las proteínas fueron separadas en geles SDS- PAGE (Laemmli, 1970) al 12 % o gradiente (815 %) de poliacrilamida (1.5 mm de espesor). La electroforesis se realizó entre 100-150 voltios ó 40 voltios (toda la noche) y los geles fueron teñidos con azul de Coomasie. Finalmente, los geles se deshidrataron (secador de geles Biorad modelo 543) y fueron expuestos (autoradiografía) por tiempo variable a –70 °C, según la radiación contenida en el gel. El peso de las bandas de interés fue determinado por comparación con estándares de peso molecular presentes en el mismo gel. (BlueRangerT M–Pierce y estándares de bajo peso-Gibco, o de Amplio rango de New England Biolabs)

4. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) e Inmunotinción (Western blotting-WB). Las distintas fracciones de proteínas obtenidas de la lisis de los cultivos de las cepas BCG y MT2D3 se sometieron al análisis de electrotransferencia e inmunotinción. Brevemente, las fracciones diluidas en buffer muestra (40 μl c/u) fueron sometidas a electroforesis en geles al 12 % de poliacrilamida, en condiciones desnaturalizantes y de

35 reducción (SDS-PAGE), utilizando un voltaje constante de 100 voltios. electroforesis, las proteínas fueron

Después de la

transferidas, en cámara seca (Biorad) (35 min a 15

voltios), a las membranas de nitrocelulosa (0.45 μM) (Amershan ó Biorad). Finalizada la transferencia, las membranas se bloquearon durante toda la noche a 4 °C, con 5 % de leche descremada (“Karla”) diluida en PBS conteniendo 0.1 % Tween-20 (PBST).

Para la detección de residuos de Ser y Thr fosforilados,

las membranas se

incubaron (2 h. a T.A ó 24 h. a 4 ºC) con el anticuerpo policlonal anti-pThr (New England Biolabs; Nº 9381) o el anticuerpo monoclonal anti-pSer (Biomeda; Nº V3156). El antipThr fue diluido (1:1000) en PBST conteniendo 1 % de leche descremada (“Karla”) mientras que el anti-pSer se diluyó (1:500 ó 1:250) en PBST conteniendo 1-2 % de leche descremada. Se realizaron 3 lavados (15 min. c/u) con PBST, seguidos de una incubación por 1hr. con el anticuerpo anti-IgG de conejo ó ratón conjugado a Peroxidasa de rábano (Pierce), diluidos 1:2000 en PBST. Posteriormente, las membranas se lavaron 3 veces (15 min c/u) con PBST, una vez con agua destilada

por 5 min, y finalmente se añadió el

sustrato 3,3´,5,5´-tetrametil benzidina (1-Step-TMB-blotting; Pierce) para la peroxidasa. La reacción con el sustrato prosiguió hasta la aparición de bandas en las membranas y fue detenida por sucesivos lavados con agua destilada. El peso de las bandas de interés fue determinado por la comparación con estándares de peso molecular preteñidos de amplio rango (Invitrogen) presentes en el mismo WB.

Para la detección de Ser /Thr quinasas de M.tuberculosis,

el Dr. Pedro Alzari

(Instituto Pasteur; París), gentilmente, facilitó los anticuerpos policlonales que reconocen a las proteínas PknB, PknD, PknE y PknF (proteínas Ser/Thr quinasas de M.tuberculosis). Según las especificaciones del Doctor Alzari, estos anticuerpos presentan las siguientes reacciones cruzadas: Anti-PknB reconoce a PknD Anti-PknD reconoce a PknB Anti PknF reconoce a PknE Anti-PknE reconoce a PknB, PknD, PknF (Alzari, comunicación personal).

Por la recomendación de la Dra. Brigitte Saint-Joanis (Instituto Pasteur),

los

anticuerpos fueron utilizados en las diluciones 1:2000 (anti-PknB, anti-PknD, anti-PknE) y 1:500 (anti-PknF). Todos fueron diluidos en PBST conteniendo 1 % de leche descremada

36 e incubados por (1.5-2) h. Se realizaron 3 lavados de (15 min. c/u) con PBST, seguidos de una incubación por 1h. con el anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado a Peroxidasa de rábano (Pierce), diluido 1:2000 en PBST. Posteriomente, el lavado y el revelado de las membranas siguió las mismas indicaciones señaladas en la detección de fosfoproteínas. De igual manera, el peso de las bandas de interés fue determinado por comparación con estándares de peso molecular preteñidos mencionados anteriormente.

37 RESULTADOS 1.

Presencia de residuos de Ser y Thr

fosforilados en fracciones de proteínas

provenientes de las cepas silvestres BCG y MT2D3. En las distintas fracciones de proteinas obtenidas de las cepas BCG y MT2D3 se evaluó la presencia de residuos fosforilados en Ser y Thr a través del uso de anticuerpos específicos dirigidos contra dichos aminoácidos fosforilados.

Los resultados obtenidos en la cepa BCG (Fig. 10) mostraron que ambos anticuerpos detectaron polipéptidos fosforilados, principalmente, en el extracto total (Et) y la fracción asociada a la pared celular (P). La reacción en la fracción soluble (S) fue muy débil aunque la cantidad de proteína (35 μg) fue mayor que la utilizada en la fracción asociada a la pared celular (20 μg).

El anticuerpo anti-pSer

reaccionó, en ambas

fracciones, con una banda de 35 kDa y dos bandas muy cercanas a los 26-27 kDa.

El anticuerpo anti-pThr, de forma similar que el anticuerpo anti-pSer, muestra reacción con dos bandas muy cercanas a los 26-27 kDa, pero la reacción fue más intensa con la banda superior. También se registró una débil reacción con una banda cercana a los 37 kDa.

Los anticuerpos no detectaron bandas fosforiladas en la fracción membranosa

(M).

Los resultados obtenidos en la cepa MT2D3 se presentan en la Fig.11. La reacción del anticuerpo anti-pSer con las fracciones de la cepa MT2D3, de forma similar que en la cepa BCG, mostró una reacción con un polipéptido de 35 kDa y otro de 27 kDa aproximadamente. A diferencia de lo observado en BCG, sólo se observó una banda gruesa alrededor de los 27 kDa y no una doble banda (26-27 kDa).

La banda de 27 kDa fue

observada en la fracción insoluble asociada a la pared (P),

pero la banda de 35 kDa

estuvo localizada en la fracción soluble (S), en contraste a la localización de esta última banda observada en la fracción asociada a pared de la cepa BCG. El anticuerpo anti-pThr mostró un fondo inespecífico en el extracto total (Et) y la fracción asociada a la pared (P). Sin embargo, se destacó una fuerte reacción con dos bandas alrededor a los 26 kDa (más intensa en la banda superior). Nótese que esta doble banda es muy similar (aunque con una migración relativa ligeramente inferior) a la detectada por el mismo anticuerpo en las fracciones de BCG.

La reacción con esta doble banda se registró muy intensamente en la

38 fracción membranosa (M) y débilmente en la fracción soluble (S).

En la fracción de

proteínas asociadas a la pared celular también se observó claramente una banda de 55 kDa aproximadamente. Otras bandas de menor intensidad fueron detectadas por el anticuerpo anti-pThr: en las fracciones insolubles (P y M) se observaron dos polipéptidos entre 30-35 kDa y otro cercano a los 100 kDa; y en la fracción soluble se observaron dos polipéptidos de 63 kDa y 78 kDa aproximadamente.

39

B

A ES

Et

P

Ec

S

M

ES

kDa

kDa

Et

P

Ec

S

M

113.7-

182.9113.7-

80.9-

80.963.8-

63.8 -

49.5-

49.5-

37.4-

37.4 -

37 kDa

35 kDa 26,27 kDa

26,27 kDa

26.0-

26.0 -

20.5-

20.5 -

14.9-

14.9-

Fig. 10. Detección de residuos fosforilados en Serina y Treonina en las fracciones de proteínas de la cepa BCG. Se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-pSer (1:250) (A) y el anticuerpo policlonal anti-pThr (1:1000) (B) en 40 μl de las fracciones de proteínas del Extracto total (Et), proteínas asociadas a la pared celular (P), extracto clarificado (Ec), fracción soluble (S) y fracción membranosa (M) Cantidad de proteína (μg) presente en cada fracción de BCG: Et: 39.2, P: 20.0, Ec: 36.8, S:35.6, M: 0.2.

B

A St

Et

P

Ec

S

St

M

kDa

Et

P

Ec

S

M

kDa

113.7-

113.7-

100 kDa

80.9-

80.9-

78 kDa

63.8-

63.8-

63 kDa

49.5-

49.5-

55 kDa

37.435 kDa

37.430, 35 kDa

27 kDa

26.0-

26.0-

20.5-

20.5-

14.9-

14.9-

26 kDa

Fig. 11. Detección de residuos fosforilados en Serina y Treonina en las fracciones de proteínas de la cepa MT2D3. Se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-pSer (1:250) (A) y el anticuerpo policlonal anti-pThr (1:1000) (B) en 40 μl de las fracciones de proteínas del Extracto total (Et) proteínas asociadas a la pared celular (P), extracto clarificado (Ec), fracción soluble (S) y fracción membranosa (M). Cantidad de proteína (μg) presente en cada fracción de MT2D3: Et: 41.6, P: 6.8, Ec: 37.6, S: 34.4, M: 1.0.

40 2. Presencia de Serina/Treonina quinasas en las cepas BCG y MT2D3. Los anticuerpos específicos que reconocen las quinasas PknB, PknD, PknE y PknF fueron utilizados para evaluar la presencia de éstas en las mismas fracciones de proteínas utilizadas para la detección de residuos fosforilados en Ser y Thr de la cepa MT2D3 de M.tuberculosis y la cepa BCG.

Todos los anticuerpos utilizados mostraron diversas

reacciones inespecíficas, debido a la presencia de diversas bandas en los WB, y la posible presencia de las quinasas fue sugerida (←) por comparación con el peso molecular teórico obtenido

a

partir

de

(http://www.genolist.pasteur.fr/tuberculist/)

la

base

de

datos

TubercuList

y

BoviList

(http://www.genolist.pasteur.fr/BoviList/) 2.1 PknB y PknD. En los ensayos realizados con el anticuerpo anti-PknB (Fig. 12.) se observó, en los extractos totales (Et) y en las fracciones asociadas a la pared celular (P) de BCG y MT2D3, una banda relativamente más intensa a las demás con una migración relativa (Mr), cercana a los 80 kDa, superior al peso molecular teórico estimado para la quinasa (66.5 kDa). Esta banda se observó débilmente en la fracción membranosa (M). El anticuerpo también mostró una reacción importante con una proteína de 49 kDa en ambas cepas. Esta banda, después de la correspondiente a los 80 kDa, fue la más resaltante en todas las fracciones de BCG, excepto la fracción membranosa donde no se detectó ninguna reacción con el anticuerpo.

41

B

A kDa

St

Et

P

Ec

S

kDa

M

182.9-

St

Et

P

Ec

S

M

182.9-

113.7-

113.7-

80.9-

80 kDa

80.9-

63.8-

63.8-

49.5-

49.5-

37.4-

37.4-

26.0-

26.0-

20.5-

20.5-

80 kDa

Fig 12. Reacción del anticuerpo anti- PknB en las fracciones de proteínas de las cepas BCG (A) y MT2D3 (B). Se utilizó un anticuerpo policlonal anti-PknB (1:2000) en 40 μl de las fracciones de proteínas del Extracto total (Et) proteínas asociadas a la pared celular (P), extracto clarificado (Ec), fracción soluble (S) y fracción membranosa (M). Cantidad de proteína (μg) presente en cada fracción de BCG: Et: 39.2, P: 20.0, Ec: 36.8, S:35.6, M: 0.2. Cantidad de proteína (μg) presente en cada fracción de MT2D3: Et: 41.6, P: 6.8, Ec: 37.6, S: 34.4, M: 1.0.

El peso molecular teórico estimado para PknD es 69.5 en M. tuberculosis y 31.4 kDa en M. bovis. En el extracto total y la fracción de proteínas asociada a la pared celular de

MT2D3, el anticuerpo anti- PknD reaccionó intensamente con un polipéptido que

migra con una masa molecular aproximada de 69.2 kDa. Mientras que en la cepa BCG, el anticuerpo reconoce una proteína con una Mr de 33 kDa en todas las fracciones, excepto la fracción membranosa (Fig. 13).

42 A kDa

St

B Et

P

Ec

S

M

kDa

182.9 -

182.9-

113.7 -

113.7-

80.9-

80.9-

St

Et

P

Ec

S

M

69.2 kDa

63.863.849.5-

49.5-

37.4-

37.4-

33 kDa

26.0-

26.0-

20.5-

20.5-

Fig. 13. Reaccion del anticuerpo anti-PknD en fracciones de proteínas de las cepas BCG (A) y MT2D3 (B). Se utilizó un anticuerpo policlonal anti-PknD (1:2000) en 40 μl de las fracciones de proteínas del Extracto total (Et), proteínas asociadas a la pared celular (P), extracto clarificado (Ec), fracción soluble (S) y fracción membranosa (M). Cantidad de proteína (μg) presente en cada fracción de BCG: Et: 39.2, P: 20.0, Ec: 36.8, S: 35.6, M: 0.2. Cantidad de proteína (μg) presente en cada fracción de MT2D3: Et: 41.6, P: 6.8, Ec: 37.6, S: 34.4, M: 1.0.

Varios polipéptidos de menor intensidad son observados en común en los Western Blots (WB) realizados utilizando los anticuerpos contra las quinasas PknB y PknD. Esto es debido, a que los respectivos anticuerpos poseen reacciones cruzadas (Alzari, P. comunicación personal).

Según los pesos teóricos estimados para PknB y PknD en M. tuberculosis (66.5 kDa y 69.5 kDa respectivamente), el peso de la quinasa PknD es ligeramente superior. Pero, el anticuerpo anti-PknB mostró una fuerte reacción con una proteína cercana a los 80 kDa, superior no sólo al peso teórico estimado para PknB, sino al observado en el polipéptido reconocido (69.2 kDa) por el anticuerpo contra PknD en las fracciones de la cepa patógena MT2D3. Al realizar “Inmunoblots” para probar estos anticuerpos, quedó la duda de que las

corridas electroforéticas de geles distintos podrían generar un artefacto

que determinase que el anticuerpo anti-PknB pudiese estar reconociendo la quinasa PknB con un peso molecular mayor al esperado para ella y para la quinasa PknD (el cual es muy similar al observado en el WB correspondiente).

Además, la irregularidad de la

corrida electroforética en el caso del WB anti-PknB (BCG) ocasionó dudas sobre la verdadera migración de esta banda. Se decidió, entonces, utilizar ambos anticuerpos en el

43 mismo WB (Fig.14).

Para ello, se incubó primero con el anticuerpo anti-PknB, se reveló,

y posteriormente se incubó con el anticuerpo anti-PknD, para revelarse una segunda vez. De esta manera, se evidenció que la banda reconocida por el anticuerpo anti-PknB en ambas cepas (Mr =75.2 kDa) era superior a la reconocida con anti-PknD (Mr = 69.2 kDa), aunque menor a la Mr de 80 kDa observada inicialmente (Fig. 12). Por otro lado, y al igual que en la figura 13, el anticuerpo anti-PknD reconoció una proteína con una Mr de 33 kDa en las fracciones de BCG, en lugar de la correspondiente a 69.2 kDa en MT2D3.

MT2D3 Et

P

BCG Et

P

kDa

113.780.963.8-

α-PKnB (~75 kDa) α-PKnD (~69 kDa)

49.537.4α-PKnD (~33 kDa)

26.0-

20.5-

Fig. 14. Reacción de los anticuerpos anti-PknB y anti-PknD en las fracciones de proteínas de las cepas MT2D3 y BCG. Se utilizaron los anticuerpos policlonales anti-PknB (α-PknB; 1:2000) y anti-PknD (α-PknD; 1:2000) en en 40 μl de las fracciones de proteínas del Extracto total (Et) y proteínas asociadas a la pared celular (P). Cantidad de proteína presente en cada fracción (μg): (Et) MT2D3: 41.6, (Et) BCG: 39.2, (P) MT2D3: 6.8, (P) BCG: 20.0. Las reacciones con los anticuerpos respectivos están señaladas (→)

44 2.2.PknE.

El peso molecular teórico estimado para PknE es 60.5 kDa (M.

tuberculosis y M. bovis). La reacción del anticuerpo anti-PknE con las distintas fracciones de proteínas de la cepa MT2D3 presentó mucha inespecificidad (a juzgar por las múltiples bandas en el WB) (Fig.15). Sin embargo, el anticuerpo mostró una fuerte reacción con una proteína alrededor de los 64 kDa (cercana al peso teórico estimado).

Esta banda,

observada en el extrato total, estuvo localizada principalmente en las fracciones insolubles (P y M) de MT2D3.

En BCG (donde la inespecificidad del anticuerpo fue menor), la

reacción sólo se visualizó en la fracción P y fue más débil de lo observado en la cepa MT2D3, aunque la cantidad de proteína utilizada en BCG (20 μg) fue mayor que la empleada en la fracción de la cepa patógena (6.8 μg). De todos los anticuerpos utilizados, anti-PknE es el único que reconoció, de una manera clara y muy bien definida, en la fracción membranosa (M) de la cepa patógena un polipéptido con una masa molecular cercana al esperado para la quinasa. Además de esta banda de 64 kDa, el anticuerpo reconoció, pero con menor intensidad, una proteína por debajo de los 63 kDa.

La intensidad de la banda de 64 kDa en la fracción membranosa

(M) fue ligeramente menor a la observada en el extracto total (Et) a pesar de que la cantidad de proteína presente (1.0 μg) es mucho menor que la que presentó el extracto total (41 μg).

El anticuerpo también mostró una clara reacción con una doble banda,

alrededor de los 50 kDa, en MT2D3 y una sóla banda del mismo peso en BCG. Esta proteína detectada en los extractos, al parecer estuvo localizada, principalmente, en la fracción soluble (especialmente en la cepa MT2D3).

Probablemente, esta reacción se

debió al reconocimiento de la quinasa PknF puesto que el anticuerpo anti-PknE también reconoce a la quinasa PknF (Alzari, P. Comunicación personal). En la cepa BCG el anticuerpo reaccionó fuertemente con un polipéptido que migró junto al estándar de 113.7 kDa en la fracción soluble, lo cual no fue observado en la cepa MT2D3.

45

A kDa

St

B Et

P

Et

S

M

kDa

182.9-

182.9-

113.7-

113.7-

St

Et

P

Ec

S

M

80.9-

80.964 kDa

63.8-

63.8-

64 kDa

49.5-

49.537.4-

37.4-

26.0-

26.0-

20.5-

20.5-

Fig. 15. Reacción del anticuerpo anti-PknE en fracciones de proteínas de las cepas BCG (A) y MT2D3 (B). Se utilizó un anticuerpo policlonal anti-PknE (1:2000) en 40 (μl) de fracciones proteicas de Extracto total (Et), de pared celular o asociadas a la misma (P), extracto clarificado (Ec), fracción soluble (S) y fracción membranosa (M). Cantidad de proteína (μg) presente en cada fracción de BCG: Et: 39.2, P: 20.0, Ec: 36.8, S:35.6, M: 0.2. Cantidad de proteína (μg) presente en cada fracción de MT2D3: Et: 41.6, P: 6.8, Ec: 37.6, S: 34.4, M: 1.0.

2.3. PknF.

El peso molecular teórico estimado para PknF es 50.6 kDa (M.

tuberculosis y M. bovis). La reacción del anticuerpo anti-PknF (Fig.16) con las fracciones de la cepa MT2D3 mostró una doble banda muy cercana alrededor de este mismo peso en la fracción soluble (S), la cual no fue observada en la fracción de proteínas asociada a la pared celular (P). Esta doble banda, sin embargo, no se distinguió en intensidad de otras proteínas reconocidas por el anticuerpo en las mismas fracciones.

Por otra parte, en BCG se pudo visualizar una banda alrededor de los 50 kDa en todas las fracciones (excepto la fracción membranosa; M). Al igual que el anticuerpo antiPknE, el anticuerpo anti-PknF presentó más reacciones inespecíficas en la cepa MT2D3 que en la cepa BCG.

46

A kDa

St

B Et

P

Ec

S

M

113.7-

St

Et

P

Ec

S

M

113.7-

80.9-

80.963.8-

63.850 kDa

49.5-

kDa

49.5-

50 kDa

37.437.4-

26.026.020.5-

20.5-

Fig. 16. Reacción del anticuerpo anti- PknF en las fracciones de proteínas de las cepas BCG (A) y MT2D3 (B). Se utilizó un anticuerpo policlonal anti-PknF (1:500) en 40 μl de las fracciones de proteínas del Extracto total (Et), proteínas asociadas a la pared celular (P), extracto clarificado (Ec), fracción soluble (S) y fracción membranosa (M). Cantidad de proteína (μg) presente en cada fracción de BCG: Et: 39.2, P: 20.0, Ec: 36.8, S:35.6, M: 0.2. Cantidad de proteína (μg) presente en cada fracción de MT2D3: Et: 41.6, P: 6.8, Ec: 37.6, S: 34.4, M: 1.0.

47 3. Ensayos de actividad proteína quinasa. 3.1. Fosforilación de sustratos endógenos y exógenos en las fracciones de proteínas de la cepa BCG. Las fracciones de proteínas provenientes de cultivos de BCG, homogenizados por lisis con perlas, fueron analizadas en ensayos radioactivos seis días después de su obtención (Fig. 17-21). El ensayo referido en la Fig. 17 fue realizado a temperatura ambiente (T.A.) y representa

los perfiles de sustratos fosforilados endógenamente por las actividades

quinasas presentes en las fracciones de proteínas del Extracto total (Et), proteínas asociadas a la pared celular (P) y proteínas solubles (S) en presencia de iones divalentes (Mn+2 / Mg+2 ).

A

B 2.5mM Mn+2 St

kDa 212 -

Et

P

S

2.5mM Mg+2 Et

P

S

2.5mM Mn +2 kDa

Et

P

S

2.5mM Mg+2 Et

P

S

212 -

158 -

158 -

116 97.4 -

116 97.4 -

66.4 -

66.4 -

92 kDa

55.6 42. 736.5-

66 kDa

55.6 42.736.5-

26.9-

26.9-

20.0-

20.0-

14.36.5-

14.3-

40-50 kDa

34 kDa

23 kDa

6.5-

Fig. 17. Comparación de los perfiles de fosforilación de sustratos endógenos de las fracciones proteicas de BCG en presencia de iones divalentes. Se determinó el perfil de sustratos endógenos fosforilados en ensayos radioactivos con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) de las fracciones de proteínas (40 μl) del extracto total (Et) asociada a la pared celular (P) y soluble (S) de la cepa silvestre de BCG en presencia de iones divalentes (2.5 mM MnCl2 ó 2.5 mM MgCl2 ). Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradie nte (8-15 % de poliacrilamida) teñido con azul de coomasie (A), secado y expuesto a autoradiografía (B). Et (7.6 μg). P (2.51 μg). S (5.73 μg). St: estándares de peso molecular.

De las fracciones analizadas en presencia de 2.5 mM Mn+2 , la fracción P, que contenía la menor cantidad de proteínas (2.51 μg), mostró el perfil de sustratos más

48 intensamente fosforilados,

seguida de la fracción Et y por último la fracción S que no

mostró ningún sustrato fosforilado. En la fracción P se observaron, nítidamente, 4 sustratos fosforilados que migran con un peso molecular aparente de 92 kDa, 66 kDa, 34 kDa y 23 kDa. También se observaron un grupo (3-4 bandas) entre los 40–50 kDa. Muy débilmente, se apreció un sustrato entre 56-58 kDa (no indicado). Estos sustratos son los mismos que se aprecian en el Et, aunque su fosforilación fue mucho menor en esta última fracción. Cuando el ensayo de actividad quinasa fue realizado en presencia de 2.5 mM Mg+2 , la fosforilación de dichos sustratos, señalada en las fracciones Et y P, estuvo muy disminuida. Por otra parte, el perfil de sustratos endógenos fosforilados no mostró ninguna modificación importante por el aumento de la temperatura a 36 ºC en presencia de Mn+2 (Fig.18)

B

A T. A St kDa 212 -

Et

P

36ºC S

Et

P

36ºC

T. A S

kDa

Et P

S

Et

P

S

212 -

158 -

158 -

116 97.4 -

116 97.4 -

66.4 -

66.4 -

55.6 55.6 42. 742.736.536.526.920.014.36.5-

26.920.014.36.5-

Fig. 18. Efecto de la temperatura sobre la fosforilación de sustratos endógenos de BCG. Se determinó el perfil de sustratos endógenos fosforilados a T.A. ó 36 ºC en ensayos radioactivos con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) de las fracciones de proteínas (40 μl) del extracto total (Et) asociada a la pared celular (P) y soluble (S) de la cepa silvestre de BCG en presencia de 2.5 mM MnCl2 . Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo fueron separadas en un gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñido con azul de coomasie (A), secado y expuesto a autoradiografía (B). Et (7.6 μg). P (2.51 μg). S (5.73 μg). St: estándares de peso molecular.

49

El efecto de la temperatura sobre la fosforilación de sustratos endógenos en presencia de 2.5 mM Mg+2 fue evaluado en las fracciones Et y P (Fig. 19). A diferencia de lo observado con el Mn+2 en la figura anterior, la fosforilación de sustratos en presencia de 2.5 mM Mg+2 disminuyen cuando la temperatura fue elevada a 36 ºC en el ensayo quinasa. En especial, es notoria la disminución del sustrato de 92 kDa en la fracción P.

B

A T. A Et kDa

T. A

36ºC P

Et

Et

P

36ºC P

Et

P

kDa

116 97.4 -

116 97.4 -

66.4 -

66.4 -

55.6 -

55.6 -

Fig. 19. Efecto de la temperatura sobre la fosforilación de sustratos endógenos de BCG en presencia de Mg+2 . Se determinó el perfil de sustratos endógenos fosforilados a T.A. ó 36 ºC en ensayos radioactivos con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) de las fracciones de proteínas (40 μl) del extracto total (Et) asociada a la pared celular (P) de la cepa silvestre de BCG en presencia de 2.5 mM MgCl2 . Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo fueron separadas en un gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñido con azul de Coomasie (A), secado y expuesto a autoradiografía (B). Et (7.6 μg). P (2.51 μg) Los estándares de peso molecular son señalados a la izquierda de la figura.

Las actividades quinasas presentes en la fracción P, analizadas en

presencia de

Mn+2 y a T.A, fueron capaces de fosforilar Histona IIA añadida exógenamente al ensayo. Pero, la actividades quinasas del extracto total y de la fracción soluble, analizadas en las mismas condiciones, fosforilan débilmente dicho sustrato (Fig. 20). Por otro lado, se apreció un ligero incremento en la fosforilación de los sutratos comprendidos entre 55-32 kDa cuando la Histona IIA estuvo presente en el ensayo.

50

H2A St kDa 212 -

Et

P

S

Et

P

S

H2A

-

kDa

Et

P

S

Et

P

S

-

212 -

158 -

158 -

116 97.4 -

116 97.4 -

66.4 -

66.4 -

55.6 -

55.6 -

42. 7-

42.7-

36.5-

36.5-

26.9-

26.9-

20.0-

20.0-

H2A

14.36.5-

14.36.5-

H2A

Fig. 20. Fosforilación de Histona IIA por las fracciones de proteinas de la cepa silvestre BCG. Se determinó la fosforilación de Histona IIA (H2A; 100 μg) añadida exógenamente, por las actividades quinasas de las fracciones de proteínas (40 μl) del extracto total (Et) asociada a la pared celular (P) y soluble (S) de la cepa silvestre de BCG en presencia de 2.5 mM MnCl2 y 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol). Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñido con azul de Coomasie (A), secado y expuesto a autoradiografía (B). Et (7.6 μg). P (2.51 μg). S (5.73 μg). (-): control de H2A sóla; St: estándares de peso molecular.

La fosforilación de Histona IIA no se modificó por el aumento de la temperatura a 36ºC en el ensayo quinasa, aunque se pudo observar una disminución del sustrato endógeno de 66 kDa y en menor grado el de 23 kDa (Fig. 21). Por otro lado, se mantuvo el ligero incremento observado a T. A. en los sustratos endógenos entre 55-32 kDa Fig. 20).

(ver

51

A

B T. A Et

kDa 212 -

36ºC P

Et

T. A

P

Et

116 97.4 -

116 97.4 -

66.4 -

66.4 -

36.5-

Et

P

212 158 -

42. 7-

P

kDa

158 -

55.6 -

36ºC

55.6 42.736.5-

26.9-

26.9-

20.0-

20.0-

14.36.5-

14.36.5-

H2A

Fig 21. Efecto de la temperatura sobre la fosforilación de Histona IIA por las fracciones de proteinas de la cepa silvestre BCG. Se determinó la fosforilación de Histona IIA (H2A; 100 μg) añadida exógenamente, a T.A. ó 36 ºC, por las actividades quinasas de las fracciones de proteínas (40 μl) del extracto total (Et) asociada a la pared celular (P) y soluble (S) de la cepa silvestre de BCG en presencia de 2.5 mM MnCl2 y 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol). Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñido con azul de Coomasie (A), secado y expuesto a autoradiografía (B). Et (7.6 μg). P (2.51 μg). S (5.73 μg).

Los cultivos de BCG también fueron lisados por ultrasonido.

En este caso, el

buffer de lisis contenía adicionalmente 2mM ortovanadato de sodio (Na3 VO4 ), 100 mM NaF y 20 % glicerol. Los ensayos se realizaron dos días después en presencia de 15 mM Mg+2 a T.A. y la concentración en el mismo de Na3 VO4 y NaF fue de 1.6 mM y 80 mM respectivamente (Fig. 22).

En este caso se analizaron dos fracciones más de proteínas,

además de las señaladas en la Fig. 17: la fracción Ec (Extracto clarificado) que contenía a las fracciones soluble (S) y membranosa, y la fracción membranosa (M).

52

A

B Et kDa

120-

P

Ec

S

M

Et

P

Ec

S

M

kDa 12093 kDa

84-

8468-70 kDa

60-

60-

39.2-

39.2-

28-

60 kDa

35 kDa

2824 kDa

18.3-

18.3-

Fig. 22. Fosforilación de sustratos endógenos, en presencia de 15 mM Mg+2 de las fracciones proteicas de cultivos de BCG lisados con ultrasonido. Cada fracción (50 μl) se analizó en un ensayo quinasa con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) a T.A. El ensayo contenía ∼1.6 mM de Na3 VO4 y ∼80 mM de NaF. Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida). Teñido con azul de coomasie (A) y expuesto a autoradiografia (B). Et (fracción extracto total, 245 μg); P (fracción de proteínas asociadas a la pared celular, 100 μg); FB (fracción extracto clarificado, 165 μg); S (fracción soluble, 155 μg); M (fracción membranosa, 15 μg)

Los resultados mostraron que el extracto total contenía varios sustratos endógenos fosforilados, pero 4 de ellos se destacaron por la intensidad de las bandas (93, 68-70, 60, 35 y 24 kDa), cuyas migraciones relativas (Mr) fueron muy similares a las señaladas en la figura 17 para los principales sustratos endógenos fosforilados.

La fracción de pared

mostró una mayor fosforilación de dichos sustratos (excepto el de 24 kDa). También se observaron, nítidamente aunque menos fosforiladas, dos bandas por encima de los 40 kDa. Finalmente y aunque las bandas fueron difusas, pareciera que se encontraron otros dos sutratos fosforilados por debajo de los 60 kDa. En las fracciones Ec y S la fosforilación fue muy pobre a pesar de la gran cantidad de proteína presente. Sólo se apreció, ligeramente por debajo de los 68 kDa aproximadamente, un sustrato débilmente fosforilado en ambas fracciones. La fracción membranosa no presentó ningún sustrato fosforilado.

53 Estas fracciones fueron analizadas, además, en presencia de caseína defosforilada en las mismas condiciones, utilizando igual cantidad de proteína por fracción concentraciones de Na3 VO4 y NaF respectivamente (Fig. 23).

y con

que variaron entre 0.6-0.9 mM y 32-92 mM

Las actividades quinasas presentes en dichas fracciones en

presencia de 15 mM Mg+2 y T.A no fosforilaron la caseína. Adicionalmente, el perfil de sustratos endógenos no fue alterado por la adición de dicho sustrato.

+ Cas

A kDa

St

Et

P

Ec S

M Et

P Ec S

+ Cas

B M

-

kDa

215-

215-

120-

120-

84-

Et

P

Ec

S

M Et P

Ec S

M

-

84-

60-

60-

39.2-

39.2-

Cas 28-

28-

18.3-

18.3-

Fig. 23. Perfiles de sustratos fosforilados de las fracciones de BCG en presencia de Caseína y Mg+2 . Cada fracción (80 μg¸ excepto fracción membranosa: 18 μg) se analizó en un ensayo quinasa, con o sin caseína defosforilada (Cas, 60 μg) ) con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) y 15 mM MgCl2 . Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida). Teñido con azul de coomasie (A) y expuesto a autoradiografia (B). Et (fracción extracto total); P (fracción de proteínas asociadas a la pared celular); Ec (fracción extracto clarificado); S (fracción soluble); M (fracción membranosa). (-): control de Cas sóla; St: estándares de peso molecular.

54 Estas fracciones fueron analizadas, 9 meses después, en diversas condiciones. La Fig. 24 representa el análisis realizado para determinar la fosforilación de sustratos endógenos, a T.A.y en presencia de 2.5 mM Mn+2 utilizando igual volumen por fracción (50 μl) (del mismo modo que en los ensayos de la Fig. 22). Al igual que en las figuras anteriores, la fracción P mostró el perfil de sustratos con mayor intensidad en la fosforilación, pero de manera resaltante también se pudo apreciar el mismo perfil de sustratos endógenos en la fracción membranosa, lo cual no fue observado con 15 mM Mg+2 cuando las fracciones estaban frescas.

El extracto total (Et), muestra una débil

fosforilación de sustratos endógenos cuando se compara con las fracciones insolubles, aunque tenía una mayor cantidad de proteína (245 μg en Et vs. 100 μg y 15 μg de la fracción P y M respectivamente).

Los sustratos fosforilados estuvieron comprendidos

entre 110 kDa y 24 kDa. Entre éstos se destacaron, nuevamente por su intensidad, los cuatro principales sustratos fosforilados señalados en la Fig. 17, aunque con ciertas variaciones en las Mr (90, 70, 35 y 23 kDa).

En estos perfiles, se apreció una banda de 84 kDa muy cercana al sustrato de 90 kDa.

Pero, esta banda fue observada, en la mayoría de las electroforesis mucho más

cercana a la banda de 90 kDa y ambas probablemente representaron la gruesa banda alrededor de los 92 kDa señalada en la Fig. 17.

El sustrato de aproximadamente 56-58

kDa (Fig. 17) se aprecia claramente en la figura 24 con una Mr alrededor de los 60 kDa. En la región entre los 40-55 kDa, se divisan más nitidamente dos bandas entre 42 y 44 kDa, aunque también por encima de estas dos bandas una región entre 45-50 kDa con bandas difusas fosforiladas. También se observaron

otras dos

bandas de alto peso

alrededor de los 110 y 200 kDa y posiblemente existen sustratos de bajo peso altamente fosforilados alrededor de los 6 kDa. Por otra parte, y de manera similar a lo mostrado en las figuras anteriores, la fracción soluble mostró una débil fosforilación de sustratos endógenos, destacándose un sustrato de 24 kDa (que también estuvo presente en todas las fracciones).

55

A

B Et

P

Ec

S M

Et

kDa 215-

kDa 215-

120-

120-

P

Ec

S M 190-200 kDa

110 kDa 84-90 kDa

84-

84-

70 kDa 60 kDa

60-

60-

39.2-

39.2-

34 kDa

28-

28-

18.3-

18.3-

14.3-

14.3-

24 kDa

Fig. 24. Fosforilación de sustratos endógenos, en presencia de Mn+2 , de las fracciones proteicas de cultivos de BCG lisados por ultrasonido. Cada fracción (50 μl) se analizó en un ensayo quinasa con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) y 2.5 mM MnCl2 . El ensayo contenía ∼1.6 mM de Na3 VO4 y ∼80 mM de NaF. Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida), teñido con azul de coomasie (A) y expuesto a autoradiografia (B). Et (fracción extracto total, 245 μg); P (fracción de proteínas asociadas a la pared celular, 100μg); Ec (fracción extracto clarificado, 165 μg); S (fracción soluble, 155 μg); M (fracción membranosa, 15 μg)

La fracción del extracto total de BCG fue analizada, adicionalmente, en dos concentraciones (2.5 mM y 15 mM), de Mn+2 y Mg+2 a T.A. (Fig. 25). El ensayo contenía 0.8 mM

de Na3 VO4 y 40 mM de NaF.

Este análisis mostró que en general la

fosforilación de los sustratos endógenos se encontraban favorecidas por el Mn+2 . +2

respecto al Mg

se observó, sin embargo, un ligero incremento de la fosforilación en 15

mM cuando se compara con la concentración de 2.5 mM del mismo ión. .

Con

56

A

Mn+2

Mg+2

2.5mM 15mM

2.5 mM 15mM

kDa

B

Mn+2 2.5mM 15mM

Mg+2 2.5 mM 15mM

kDa

215-

215-

120-

12084 -

84 -

60 -

60 -

39.2-

39.228 -

28 -

18 -

18 14.36.2-

14.36.2-

Fig. 25. Comparación de los perfiles de sustratos endógenos fosforilados del Extracto de proteínas totales de BCG en presencia de Mg+2 ó Mn+2 . La fracción del extracto total (76.4 μg) fue analizada en presencia de 2.5 mM ó 15 mM de MnCl2 ó MgCl2 en un ensayo quinasa con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol). El ensayo contenía 0.8 mM de Na3 VO4 y 40 mM de NaF. Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida). Teñido con azul de coomasie (A) y expuesto a la autoradiografia (B).

La posible fosforilación de la Caseína (Cas) y la Histona IIA (H2A) por las actividades quinasas de este extracto de BCG (Et), en presencia de 2.5 mM Mn+2 , también fue evaluada.

Los resultados mostraron (Fig. 26) que las actividades quinasas del Et, en

las condiciones señaladas, no fosforilaron dichos sustratos y en cualquiera de los casos el perfil de sustratos endógenos permaneció inalterado.

57

A

B Et

Et +H2A +Cas

+H2A +Cas kDa

kDa 215-

215-

120-

120-

84-

84-

60-

60-

39.2-

Cas

28-

28-

1814.3-

39.2-

H2A

1814.3-

Fig. 26. Perfiles de sustratos fosforilados del extracto de proteínas total de BCG en presencia de Caseína ó Histona IIA y Mn+2 . La actividad quinasa del extracto total de BCG (76.4 μg) fue comparada con la actividad de la misma fracción en presencia de caseína defosforilada (Cas, 50 μg) ó Histona IIA (H2A; 100 μg) añadidas exógenamente, en un ensayo con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) y 2.5 mM MnCl2 . El ensayo contenía 0.8 mM de Na3 VO4 y 40 mM de NaF. Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida). Teñido con azul de coomasie (A) y expuesto a autoradiografia (B)

Las fracciones de proteínas insolubles (P y M), también fueron analizadas en presencia de Caseína en las mismas condiciones indicadas para el extracto total. El ensayo contenía 1.6 mM

de Na3 VO4 y 80 mM de NaF. A pesar de los 9 meses de

almacenamiento, las actividades quinasas de estas fracciones fosforilaron la Caseína en presencia de 2.5 mM Mn+2 (Fig. 27), en contraste con la ausencia de dicha actividad, en los días siguientes a su preparación, en presencia de 15 mM Mg+2 (Ver Fig. 23).

58

Fracción P A

Fracción M A

B

kDa

kDa

kDa

120-

120-

84-

84-

39.2 -

kDa

120-

120-

8 4-

60-

60-

B

84-

60-

6 0-

39.2-

39.2 -

Cas

Cas

Cas 28-

Cas

2 8-

28-

28-

Cas

39.2-

-

+

Cas

-

+

Cas

-

+

Cas

-

+

Fig. 27. Fosforilación de Caseína por las actividades quinasas de las fracciones insolubles de BCG en presencia de Mn+2 . Las fracciones de proteínas asociadas a la pared celular (P, 78 μg) y membranosa (M, 12 μg) fueron analizadas, con o sin caseína desfosforilada (Cas; 25μg), en presencia de 2.5 mM MnCl2 y 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol). El ensayo contenía ∼1.6 mM de Na3 VO4 y ∼80 mM de NaF. Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida). Teñidos con azul de coomasie (A) y expuestos a autoradiografia (B).

Una nueva preparación de proteínas de BCG se realizó utilizando perlas para la lisis, en presencia de 2 mM ortovanadato de sodio (Na3 VO4 ) y 100 mM NaF, pero sin glicerol. Las muestras fueron analizadas, entre dos a tres meses después, a 36 ºC. Lamentablemente, el extracto total perdió la actividad rápidamente y no se pudieron tener resultados confiables con dicha fracción.

Las fracciones insolubles también perdieron

actividad (en menor grado la fracción M), sin embargo cuando dichas fracciones fueron evaluadas en presencia de 2.5 mM Mn+2 (Fig. 28), se pudieron observar, con pequeñas variaciones, varios de los sustratos endógenos fosforilados señalados en figuras anteriores (92 kDa, 65-66 kDa, 32-34 kDa). En la región entre los 40 y 55 kDa se observaron claramente en la fracción membranosa dos sustratos fosforilados (∼ 40 kDa y 50 kDa) (en menor grado en la fracción P). también fosforilaron la Histona

Las actividades quinasas presentes en dichas fracciones IIA

(H2A) añadida exógenamente al ensayo. Las

59 concentraciones del Na3 VO4 y NaF en el ensayo quinasa fue de ∼1.6 mM y ∼80 mM, respectivamente

FRACCIÓN P

A

FRACCIÓN M

B

A

B kDa

kDa

-116-97.4-

-116-97.4-84-66-55-45-

92 kDa

-84-66-

65-66 kDa

-55-45-

~50 y 40 kDa

-36-

-36-

32-34 kDa

-29-

-29-

-20.1H2A

-20.1-14.2-

H2A

-14.2-

H2A -

+

-

+

Fig. 28. Fosforilación de Histona IIA por las actividades quinasas de las fracciones insolubles de BCG en presencia de Mn+2 . Las fracciones de proteínas asociadas a la pared celular (P, 7.5 μg) y membranosa (M, 0.2 μg) fueron analizadas, con o sin Histona IIA (H2A; 90 μg), a 36 ºC (30 min.) en presencia de 2.5 mM MnCl2 y 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol). El ensayo contenía ∼1.6 mM de Na3 VO4 y ∼80 mM de NaF. Las proteínas presentes en cada muestra fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida). Teñidos con azul de coomasie (A) y expuestos a autoradiografia (B).

60 3.2.

Fosforilación de sustratos endógenos y exógenos en las fracciones de

proteínas de M. tuberculosis. La fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA (añadida exógenamente al ensayo), en las fracciones de proteínas del extracto total (Et) y proteínas asociadas a la pared celular (P), provenientes de un cultivo de la cepa MT2D3 (∼ 3 semanas) fueron evaluadas en presencia de Mn+2 ó Mg+2 , 3 días después de su preparación (Fig.29-32). En la Fig. 29 se muestra la fosforilación de sustratos endógenos en presencia de

Mn+2 ó Mg+2 a T.A.

Ambas fracciones presentaron una disminución

importante de la fosforilación de sustratos endógenos en presencia de 2.5 mM Mg+2 en lugar de 2.5 mM de Mn+2 .

A

B 2.5mM Mn+2

kDa 212 158 -

St Et

P

2.5mM Mg+2

Et

P

2.5mM Mn+2

kDa 212 -

116 -

116 97.4 -

55.6 42. 7-

P

Et

P

158 -

97.4 66.4 -

Et

2.5mM Mg+2

66.4 55.6 -

-92 kDa -83 kDa -66 kDa

42. 7-

36.5-

36.5-

26.9-

26.9-

20.0-

20.0-

14.36.5-

14.36.5-

Fig. 29. Fosforilación de sustratos endógenos en la fracción de proteínas del extracto total y proteínas asociadas a la pared celular de la cepa MT2D3 en presencia de iones divalentes. Se determinó la fosforilación de sustratos endógenos, en ensayos radioactivos con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol), de las fracciones de proteínas (40 μl) del extracto total (Et) y asociada a la pared celular (P) de la cepa silvestre de MT2D3 en presencia de iones divalentes (2.5 mM MnCl2 ó 2.5 mM MgCl2 ). Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñido con azul de Coomasie (A), secado y expuesto a la autoradiografía (B). Et (1.72 μg). P (0.20 μg). St: estándares de peso molecular.

61 En cuanto al perfil de sustratos endógenos fosforilados, ambas fracciones presentaron el mismo perfil y se observaron claramente 3 sustratos fosforilados que migraron con masas moleculares aproximadas de 92 kDa, 84 kDa y 66 kDa. De estos sustratos,

el primero y último parecieron más intensamente fosforilados que la banda

intermedia. También se apreciaron sustratos fosforilados (en menor intensidad) en la región comprendida entre los 56-30 kDa, pero debido a que las proteínas migraron como bandas difusas, confundiéndose unas entre otras, no se pudo determinar el peso molecular aproximado de cada una de ellas.

Cuando el ensayo quinasa, utilizando las fracciones Et y P, se realizó en presencia de Mn+2 a 36 ºC (Fig. 30), se pudo notar, cualitativamente, una disminución en la fosforilación de los tres principales sustratos observados en estas dos fracciones, especialmente la fosforilación del sustrato de 83 kDa.

T. A Et

36ºC P

Et

T. A

P

Et

kDa

kDa

97.2-

97.2-

66.4-

66.4-

55.6-

55.6-

42.7-

42.7-

P

36ºC Et

P

83 kDa

Fig. 30. Efecto de la temperatura sobre la fosforilación de sustratos endógenos de MT2D3 en presencia Mn+2 . Se determinó la fosforilación de sustratos endógenos a T.A. ó 36 ºC en ensayos radioactivos con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) de las fracciones de proteínas (40 μl) del extracto total (Et) y proteínas asociadas a la pared celular (P) de la cepa silvestre de MT2D3 en presencia de 2.5 mM MnCl2 . Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo fueron separadas en un gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñido con azul de coomasie (A), secado y expuesto a la autoradiografía (B). Et (1.72 μg). P (0.20 μg).

La disminución observada, en presencia de Mg+2 , de la fosforilación de los sustratos endógenos de la fracción de proteínas asociadas a la pared celular, se hizo más

62 notoria cuando el ensayo fue realizado a 36 ºC. Para evidenciar este efecto, en la figura 31 se estableció una comparación entre los resultados mostrados en las figuras 29 y 30 con la fosforilación en presencia de 2.5 mM Mg+2 a 36 ºC. En este ensayo, se apreció que la fosforilación del sustrato de 92 kDa (indicado en la figura) fue la más afectada por el cambio de temperatura.

Mn +2 T.A. 36ºC

Mg+2 T.A. 36ºC

kDa

116 97.4 -

92 kDa

66.4 55.6 42. 736.5-

Fig. 31. Efecto de la temperatura y Mg+2 ó Mn+2 sobre la fosforilación de sustratos endógenos en la fracción de proteínas asociada a la pared celular de MT2D3. Se comparó la fosforilación de los sustratos endógenos de la fracción de proteínas asociadas a la pared celular (0.20 μg), en presencia de 2.5 mM Mg+2 a 36 ºC, con la fosforilación de los mismos sustratos endógenosen presencia del mismo ión a T.A y con el Mn+2 en ambas temperaturas (resultados mostrados en las fig. 29 y 30).

Aunque las fracciones de proteínas del extracto total (Et) y proteínas asociadas a la pared celular (P) poseían, relativamente, poca cantidad de proteína (2.1 μg y 0.22 μg, respectivamente), fueron capaces de fosforilar la Histona IIA cuando fue añadida al ensayo (Fig. 32), especialmente la fracción P.

63

B

A H2A

kDa 212 -

St

Et

P

Et

H2A

P

kDa 212 -

158 -

158 -

116 97.4 -

97.4 -

P

Et

P

116 -

66.4 -

66.4 -

55.6 42. 7-

55.6 42. 7-

36.5-

36.5-

26.9-

26.9-

20.0-

H2A 14.36.5-

Et

20.0-

H2A

14.36.5-

Fig. 32. Fosforilación de Histona IIA por la fracción de proteínas del extracto total y proteínas asociadas a la pared celular de la cepa MT2D3. Se determinó la fosforilación de Histona IIA (H2A, 100 μg), añadida exógenamente, por la actividad quinasa de las fracciones de proteínas (40 μl) del extracto total (Et) y asociada a la pared celular (P) de la cepa silvestre de MT2D3 en presencia de 2.5 mM MnCl2 y 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol). Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñido con azul de Coomasie (A), secado y expuesto a la autoradiografía (B). Et (1.72 μg). P (0.20 μg). St: estándares de peso molecular.

Las fracciones de proteínas del extracto total (Et) y proteínas asociadas a la pared celular (P) de MT2D3 también fueron obtenidas a partir de un cultivo con 6 semanas en crecimiento y fueron analizadas en un ensayo quinasa a T.A con Mn+2 , 2 días después de su obtención (Fig. 33). En esta oportunidad fue analizada, además, la fracción soluble. Las fracciones Et y P mostraron un perfil de sustratos endógenos fosforilados muy similar

a

las mismas fracciones aisladas de un cultivo más joven (Fig. 29-32), en especial se observan nuevamente las tres principales bandas polipeptídicas (92, 83 y 66 kDa) de la figura 29.

Sin embargo, la intensidad de estas bandas fue menor, pero no se pueden

establecer comparaciones pues el gel la figura 33 tuvo un corto tiempo de exposición. También se observaron otros dos sustratos (30 kDa y 35 kDa) mejor definidos que los ensayos anteriores donde se observaban unas bandas difusas en ese rango (ver Fig. 29).

64 Por otra parte, la fracción soluble (S) mostró un sólo sustrato fosforilado de aproximadamente 30 kDa, a pesar que la cantidad de proteína presente (3.1 μg) fue similar a la fracción Et (3.6 μg) y mayor que la fracción P (0.8 μg).

Et

P

S

Et

P

S

kDa

kDa

97.4 -

97.4 -

66.4 -

66.4 -

55.6 -

55.6 -

42. 7-

42. 7-

36.5-

36.5-

26.9-

26.9-

30 kDa

Fig. 33. Fosforilación de sustratos endógenos, en presencia de Mn+2 , de las fracciones de proteínas de la cepa MT2D3 con 6 semanas de cultivo. Se determinó la fosforilación de sustratos endógenos en ensayos radioactivos con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) de las fracciones de proteínas (30 μl) del extracto total (Et), proteínas asociadas a la pared celular (P) y proteínas solubles (S) de la cepa silvestre de MT2D3 en presencia de 2.5 mM MnCl2 . Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñido con azul de Coomasie (A), secado y expuesto a la autoradiografía (B). Et (3.6 μg). P (0.8 μg); S (3.1 μg)

La fracción de proteínas del extracto total (Et) de MT2D3 también fue obtenida en presencia de 2 mM ortovanadato de sodio (Na3 VO4 ), 100 mM NaF y 20 % glicerol añadidos al buffer de lisis.

Las figuras 34 y 35 corresponden a ensayos quinasas,

realizados con dicha fracción a T.A., un día después de la lisis y el fraccionamiento celular. En estos ensayos la concentración del ortovanadato de sodio y el NaF fue 1.3 mM y 67 mM respectivamente.

65 La Fig. 34 muestra la fosforilación de sustratos endógenos en la fracción Et, así como la fosforilación de Histona IIA (H2A) y Caseína (Cas) añadidas exógenamente al ensayo, en presencia de 2.5 mM Mn+2 a T.A. Entre los sustratos endógenos fosforilados, las proteínas de 92 kDa y 66 kDa, mostradas en figuras anteriores (aquí se visualizaron con Mr de 100 y 69 kDa aproximadamente), se encontraron débilmente fosforiladas, mientras se mantuvo una fuerte fosforilación de la proteína de 83 kDa.

Con respecto a la fosforilación de los sustratos endógenos en el extracto total en presencia de H2A y caseína, se observó un

incremento en la fosforilación de algunos

sustratos endógenos, además de la fosforilación de dichos sustratos exógenos. Con H2A se mostró más fosforilado un sustrato alrededor de los 60 kDa, otros dos entre 40-45 kDa y posiblemente uno más entre 20 y 22 kDa. Con la caseína, pareciera que se incrementó la fosforilación de un sustrato entre 68-69 kDa;

pero la identidad de este sustrato, como

sustrato endógeno, estuvo en duda ya que cuando se realizó la fosforilación de la muestra de caseína en presencia de la subunidad catalítica de la PKA (resultados no mostrados), se visualizó que esta quinasa era capaz de fosforilar, en la muestra de caseína, un sustrato cercano al peso referido.

66

B

A Et

+H2A +Cas

Et

+H2A +Cas

kDa

kDa 215-

215-

120-

120-

84-

84-

83 kDa

60-

60-

39.2-

39.228-

28-

18.414.3-

18.414.3-

Fig. 34. Fosforilación de sustratos endógenos, de Histona IIA y Caseína por las actividades quinasas del extracto total de la cepa silvestre MT2D3. El extracto total (Et; 3.1 μg) de MT2D3 fue analizado en un ensayo quinasa para determinar la fosforilación de sustratos endógenos y la fosforilación de Histona IIA (+H2A; 120 μg) y Caseína defosforilada (+Cas; 60 μg), añadidas exógenamente, en presencia de 2.5 mM MnCl2 y 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol). El ensayo fue realizado con 1.3 mM ortovanadato de sodio y 67 mM NaF provenientes del buffer de lisis. Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en geles de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñidos con azul de Coomasie (A), secados y expuestos a autoradiografía (B).

Cuando el extracto total de proteínas de MT2D3 fue analizado en un ensayo quinasa conteniendo Mg+2 observar

una

completa

(2.5 mM y 15 mM), en lugar de 2.5 mM Mn+2 , se pudo ausencia +2

Adicionalmente, con 15 mM Mg teñido con azul de coomasie (A)

de

sustratos

endógenos

fosforilados

(Fig.

35).

se evidenció una disminución de proteínas en el gel

67

Mn+ 2

A

B

Mg+2

Mn+2

2.5mM 2.5mM 15mM

Mg+2

2.5mM 2.5mM 15mM

kDa

kDa

215-

215-

120-

120-

84-

84-

60-

60-

39.2-

39.2-

28-

28-

18.414.3-

18.4 14.3-

Fig. 35. Fosforilación de sustratos endógenos en el extracto total de la cepa silvestre MT2D3 en presencia de iones divalentes. Se determinó la fosforilación de sustratos endógenos en ensayos radioactivos con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) del extracto total (Et; 3.1 μg) en presencia de MnCl2 (2.5 mM) ó MgCl2 (2.5 mM ó 15 mM). El ensayo fue realizado con 1.3 mM ortovanadato de sodio y 67 mM NaF provenientes del buffer de lisis. Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en geles de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñidos con azul de coomasie (A), secados y expuestos a autoradiografía (B)

El efecto de 15 mM Mg+2 sobre la presencia de proteínas en el gel fue también observado en dos ensayos independientes con un extracto de la cepa de referencia MT14323 (obtenido en las mismas condiciones que la fracción correspondiente en la cepa MT2D3). La figura 36 representa los resultados de uno de estos dos ensayos, realizado 15 días después de la lisis y fraccionamiento celular. En presencia de ATP y 2.5 mM Mn+2 fue fosforilado un sustrato alrededor de los 83 kDa. +2

fosforilado en presencia de 15mM Mg

Sin embargo, este sustrato no fue

(ni otro sustrato). Esta situación se mantuvo aún

cuando en el ensayo se encontraba, además del Mg+2 , el Mn+2 (2.5 mM).

La ausencia de fosforilación estuvo acompañada de la desaparición de las bandas en el gel de coomassie (A) (de manera similar que lo señalado en la Fig. 35).

Esta

desparición se mantuvo aún cuando fue retirado el ATP del análisis. Por otra parte, en el

68 extremo superior del gel se encontraron lo que pareció un cúmulo de péptidos de alto peso molecular que no corrieron uniformemente en la electroforesis cuando el ensayo fue realizado en presencia del Mg+2 . A

B

-

-

+ ATP

ATP

KDa

KDa

120.0 -

120.0 -

84.0-

84.0-

60.0-

60.0-

43.0-

43.0-

29.0-

29.0-

18.4-

18.4-

Mn+2 Mg

+2

-

+

+ -

+ +

+ -

+ +

+

+ ATP

ATP

Mn+2

-

-

+

+

+

+

-

+2

-

+

-

+

-

+

+

Mg

Fig. 36. Efecto de 15 mM Mg+2 sobre la actividad quinasa de extractos totales de la cepa MT14323. La fracción de extracto total (∼3 μg) de la cepa MT14323 fue analizada en presencia de 2.5 mM Mn+2 y/o 15 mM Mg+2 con o sin 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) en el ensayo quinasa(+ATP/-ATP). El ensayo fue realizado con 1.6 mM ortovanadato de sodio y 80 mM NaF provenientes del buffer de lisis. Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.) fueron separadas en un gel SDS-12 %PAGE, teñido con azul de coomasie (A), secado y expuesto a la autoradiografía (B).

Los extractos de proteína total de la cepa de referencia MT14323, obtenidos con de 2mM Na3 VO4 y 100 mM NaF (añadidos al buffer de lisis), también fueron utilizados para evaluar el efecto del 3´,5´AMPc sobre la actividad quinasa de M.tuberculosis en presencia de 2.5 mM Mn+2 (Fig. 37).

69

(1)

3´, 5´ AMPc

A

(2)

B

kDa

A

*

*

2´, 3´ AMPc B

kDa

120-

120-

84-

84-

60-

60-

39.2-

39.2-

28-

28-

18-

H2A

14.3-

H2A 3´, 5´ AMPc -

-92 kDa -83 kDa -66 kDa

18-

H2A

14.3-

+

+ +

+ -

+ -

-

+

+ +

+ -

+ -

H2A 2´, 3´ AMPc -

+

+ +

-

+

+ +

Fig. 37. Efecto del AMPc sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA en homogenatos totales de la cepa MT14323. Se evaluó el efecto del 3´,5´ AMPc (1) ó 2´,3´ AMPc (2) en concentración de 0.1mM sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA (H2A; 120 μg), añadida exógenamente, en el extracto total de proteínas de la cepa MT14323 [∼14 μg]. El ensayo contenía 1.4 μM Na3 VO4 y 70 mM NaF provenientes del buffer de lisis. Para el ensayo se utilizó 2.5 mM Mn+2 y 50 μM ATP(γ-32 P) (3000 cpm/pmol). (A): Gel teñido con azul de Coomasie. (B): Autoradiografía del gel. (*): Control de Histona en ausencia del extracto.

El 3´,5´ AMPc tiene un efecto inhibitorio sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA de la cepa MT14323 (Fig. 37-1), mientras que en presencia del 2´,3´AMPc, utilizado como control, esto no ocurre (Fig. 37-2)

Por otro lado y con relación al perfil de sustratos endógenos, éste fue muy similar al mostrado en el extracto de la cepa clínica MT2D3, bajo las mismas condiciones (ver fig. 34-35).

De manera similar, los sustratos de 92 kDa y 66 kDa continuan débilmente

fosforilados cuando se comparan con el sustrato de 83 kDa, aunque el extracto total de la cepa MT14323 tiene más cantidad de proteínas (14 μg) que el extracto de la cepa MT2D3 (3.1 μg).

70 El efecto del 3´,5´AMPc también fue analizado sobre la actividad quinasa de dos extractos de proteína total procedentes de cultivos de la cepa MT14323, iniciados al mismo tiempo y en las mismas condiciones pero con una semana de diferencia en el tiempo de incubación del cultivo (Fig. 38) 3´,5´ AMPc

+

-

+

-

kDa

+

-

+

-

kDa

120-

120-

84-

84-

60-

60-

39.2-

39.2-

28-

28-

18-

1814.3-

14.3-

A

B

MT14323 (3 semanas)

A

B

MT14323 (4 semanas)

Fig. 38. Efecto del 3´, 5´ AMPc sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA en la fracción de proteínas del extracto total y su relación con el tiempo del cultivo de la cepa MT14323. Se evaluó el efecto del 3´,5´ AMPc (0.1 mM) sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA (H2A; 120 μg), añadida exógenamente, en dos extractos de proteínas totales de MT14323 (∼ 12 μg) provenientes de cultivos con una semana de diferencia en su crecimiento (3 semanas vs 4 semanas). Para el ensayo se utilizó 2.5 mM Mn+2 y 50 μM ATP(γ-32 P) (3000 cpm/pmol). El ensayo contenía 1.4 μM Na3 VO4 y 70 mM NaF provenientes del buffer de lisis. (A): Gel teñido con azul de Coomasie. (B): Autoradiografía del gel

El 3´,5´AMPc tiene un efecto inhibitorio sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de histona IIA (como sustrato exógeno) en el extracto proteico procedente de un cultivo de 3 semanas, pero no muestra ningún efecto apreciable en la fosforilación de los mencionados sustratos en el extracto de proteínas del cultivo de 4 semanas.

Una nueva preparación de proteínas de la cepa MT2D3 fue realizada en presencia de 2mM ortovanadato de sodio y 100 mM NaF (∼1.4 mM y 70 mM, respectivamente en el

71 ensayo quinasa), pero sin glicerol. En esta oportunidad,

todas las muestras fueron

analizadas a 36 ºC, 1-2 meses después de su obtención. Al igual que lo referido para las fracciones de proteínas de la cepa BCG (obtenidas en las mismas condiciones y analizadas a 36 ºC), el extracto total de la cepa MT2D3 perdió rápidamente la actividad quinasa y no pudo ser evaluado. Además de la fracción de proteínas asociadas a la pared, también se obtuvo la fracción de proteínas de membranas. Estas fracciones mantuvieron la actividad (más que las fracciones insolubles de BCG), lo que permitió que el efecto de iones divalentes y la fosforilación de Histona IIA pudiesen ser analizados (Fig. 39-41). Cuando las fracciones de proteínas asociadas a la pared celular (P) y proteínas de membrana (M) fueron evaluadas en presencia de 2.5 mM Mn+2 (Fig.39), ambas mostraron el mismo perfil de sustratos endógenos fosforilados.

De igual manera, ambas fosforilaron la Histona IIA

(H2A) añadida exógenamente al ensayo. Fracción P A

B

Fracción M A

B

kDa 205 -

11697.4-

92 kDa 83 kDa

6655-

65 kDa 50 kDa

453632 kDa 29-

20.1-

H2A 14.2-

Fig. 39. Fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA por la actividad quinasa de las fracciones de proteínas asociadas a la pared celular (P) y proteínas de membrana (M) de la cepa MT2D3. Se realizó un ensayo quinasa en presencia de 2.5 mM MnCl2 y 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol), 30 min a 36 ºC, para evaluar la fosforilación sustratos endógenos (A) y la fosforilación de Histona IIA (H2A; 90 μg) añadida exógenamente (B) de las fracciones (40 μl) de proteínas asociadas a la pared celular (P; 1 μg); y de proteínas de membrana (M; 0.4 μg). El ensayo contenía 1.4 μM Na3 VO4 y 70 mM NaF provenientes del buffer de lisis.

72 El requerimiento de Mn+2 ó Mg+2 como iones divalentes en el ensayo quinasa fue analizado en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular (Fig. 40).

Aunque la

alicuota de proteínas utilizada en este ensayo mostró una pérdida de las actividades quinasas, los resultados obtenidos con las concentraciones consideradas para ambos iones (2.5 mM y 15 mM),

señalaron que el Mn+2 favoreció la fosforilación de sustratos

endógenos presentes en dicha fracción, en contraste con la ausencia de sustratos fosforilados en presencia de Mg+2 utilizando las mismas concentraciones.

Por otro lado,

no se registraron diferencias importantes en la intensidad de las bandas fosforiladas a una u otra concentración de Mn+2 .

2.5mM

15mM

Mn+2 Mg+2 Mn+2 Mg +2

kDa

97.4-

66-

36-

29-

Fig. 40. Fosforilación de sustratos endógenos de la fracción de proteínas asociada a la pared celular de la cepa MT2D3 en presencia de Mn+2 o Mg +2 . Se determinó el requerimiento de Mn+2 o Mg+2 (2.5 mM ó 15 mM) para la fosforilación de sustratos endógenos de la fracción de proteínas asociadas a la pared celular (0.5-1 μg) en presencia de 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) durante 30 min a 36 ºC. El ensayo contenía 1.4 μM Na3 VO4 y 70 mM NaF provenientes del buffer de lisis.

73 Por otra parte, también fueron estudiados los efectos del calcio y magnesio sobre la fosforilación de sustratos endógenos, en presencia de 2.5 mM Mn+2 , de la fracción de proteínas asociadas a la pared celular (Fig. 41).

Mn+2 Ca +2 Ca +2

Mn+2

+

Mg+2

2.5 mM 2.5mM

Mg+2 15mM

kDa 205 -

11697.492 kDa

665545-

36-

29-

Fig. 41. Efecto del Ca +2 y Mg+2 sobre la fosforilación de sustratos endógenos de la fracción de proteínas asociada a la pared celular de la cepa MT2D3. Se determinó el

efecto del Ca+2 (2.5 mM) y el Mg+2 (2.5 mM ó 15 mM) sobre la fosforilación de sutratos endógenos de la fracción de proteínas asociadas a la pared celular (1μg) en presencia de 2.5 mM MnCl2 y 50 μM ATP (γ-32 P) (3000cpm/pmol) durante 30 min a 36 ºC. El ensayo contenía 1.4 μM Na3 VO4 y 70 mM NaF provenientes del buffer de lisis.

Los resultados mostraron que el calcio por sí solo (Ca+2 ), en una concentración de 2.5 mM, no favoreció la fosforilación de sustratos endógenos en la fracción P, pero fue capaz de inhibir la actividad dependiente de 2.5 mM Mn+2 cuando ambos iones están

74 presentes. En el caso del Mg+2 , utilizado en conjunto con el Mn+2 en la misma concentración (2.5 mM), no pareció alterar fosforilación de sustratos endógenos registrada en presencia de Mn+2 solamente (Mn+2 ).

Sólo cuando el Mg+2

fue añadido en una

concentración de 15 mM, a la reacción con 2.5 mM Mn+2 , la fosforilación de sustratos endógenos disminuyó.

Especialmente, destaca la disminución de la fosforilación de una

doble banda alrededor de los 92 kDa. Nótese que la disminución de la fosforilación de una proteína de ese peso también fue registrada en los ensayos realizados a la misma temperatura, pero utilizando Mg+2 solamente como cofactor, y sin la presencia de NaF/ Na3 VO4 en el ensayo (Fig. 31).

Bajo ciertas condiciones extraordinarias de cultivo de la cepa MT2D3 fue posible detectar un cambio en el perfil de sustratos endógenos de la fracción de proteínas del extracto total.

La cepa MT2D3 fue mantenida en cultivo a 36-37 ºC por 7 semanas,

período durante el cual fue permitido, además, el intercambio gaseoso a través de filtros en la tapa del envase (caso único en el estudio). El resultado fue una reducción importante del volumen del cultivo, acompañada de una saturación bacteriana (a juzgar por los numerosos cúmulos bacterianos observados a simple vista). Este cultivo fue lisado bajo las mismas condiciones que los cultivos hasta ahora mencionados y las fracciones de proteínas del extracto total (Et), proteínas asociadas a la pared celular (P) y proteínas solubles (S) fueron evaluadas a través de ensayos quinasa en presencia de 2.5 mM Mn+2 a T.A. El perfil de proteínas de la fracción (Et), mostrado en los geles teñidos con azul de coomasie (Fig. 42), presentó una gruesa banda alrededor de los 64-66 kDa, la cual no había sido observada en otros perfiles de la misma fracción.

Además, esta proteína se presentó en la fracción

soluble (S), más no en la fracción (P).

Los ensayos quinasas (Fig. 42-A), mostraron que este polipéptido estuvo fuertemente fosforilado en el extracto total, acompañado de una débil fosforilación de un sustrato de 30 kDa, aproximadamente. Adicionalmente, la actividad quinasa presente en la fracción de proteínas del extracto total (Et) fosforiló la Histona IIA añadida exógenamente al ensayo. La fosforilación de este sustrato exógeno estuvo acompañada de la fosforilación del sustrato endógeno de 30 kDa, pero la fosforilación del sustrato de 64-66 kDa desapareció por completo. La fracción P también fosforiló la Histona IIA aunque no se visualizó la fosforilación del polipéptido de 64-66 kDa.

75 Cuando la fosforilación de sustratos endógenos de la fracción de proteínas solubles (S), fue analizada y comparada con la correspondiente en el Et (Fig. 42-B), se pudo observar que el sustrato de 64-66 kDa tuvo una ligera fosforilación en esta fracción. Los resultados también mostraron que la fracción Et había perdido actividad, aunque todavía se observó la fosforilación (muy débil) de los sustratos de 64-66 kDa y 30 kDa. Es factible que esta pérdida de actividad

se deba al tiempo de almacenamiento (2 meses)

y los

descongelamientos previos de la fracción.

B

A Et

Et

P

Et

Et

Et

P

kDa 212158-

S

Et

S

kDa

11697.264-66 kDa

66.4-

64-66 kDa

66.4-

55.642.736.526.9-

30 kDa

36.5-

30 kDa

26.9-

20.014.36.5-

Fig. 42. Fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA en las fracciones de proteínas de un cultivo de la cepa MT2D3 en condiciones de saturación bacteriana. (A) La fosforilación de sustratos endógenos de la fracción de proteínas del extracto total (Et; 40 μl: ∼13 μg), y se comparó la fosforilación de Histona II-A (H2A; 100 μg), añadida exógenamente al ensayo, por la actividad quinasa presente en esta fracción, con la correspondiente fosforilación del sustrato exógeno en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular (P; 40 μl: 0.4 μg). (B) Se compararon los perfiles de sustratos endógenos fosforilados en las fracciones Et (Et; 40 μl: 10-13 μg) y fracción de proteínas solubles (S; 40 μl: 14.4 μg). Una vez realizado el ensayo con 50 μM ATP (γ-32 P) (3000 cpm/pmol) y 2.5 mMMn+2 (30 min. a T.A.), las proteínas presentes en cada muestra fueron separadas en geles de gradiente (8-15 % de poliacrilamida), teñidos con azul de

Coomasie (lado izquierdo de las figuras), secados y expuestos a autoradiografía (lado derecho de las figuras).

76 3.3. Efecto de inhibidores de las actividades proteínas quinasas en las fracciones de proteínas de las cepas BCG y MT2D3. Las fracciones de proteínas asociadas a la

3.3.1. Efecto de la Estaurosporina.

pared celular (P) de las cepas BCG y MT2D3, aisladas en presencia de 2 mM Na3 VO4 y 100 mM NaF (∼1.4-1.6 mM y 80-70 mM, respectivamente en el ensayo quinasa), se analizaron a 36ºC utilizando distintas concentraciones del inhibidor Estaurospina (Fig. 43).

A

BCG

St

kDa

*

B

MT2D3

*

kDa

205-

E

BCG

MT2D3

*

*

205-

11697.484665545-

11697.484665545-

362924-

36-

20.1-

20.1-

14.26.5-

14.26.5-

2924-

H2A EST(μM ) -

+ + + + + - + - - 1 10 100 - -

* FA+H2A+metanol

+ + + + -

1 10 100

H2A EST(μM) -

+ + + + + - + + + + + - - 1 10 100 - - - 1 10 100

* FA+H2A+metanol

Fig. 43. Efecto del inhibidor Estaurosporina sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de histona IIA en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular de BCG y MT2D3. Las fracciones de proteínas asociadas a la pared celular (P) de BCG (7.5 μg) y MT2D3 (1 μg), fueron analizadas en presencia de concentraciones crecientes de Estaurosporina (EST) y 2.5 mM Mn+2 a 36 ºC por 30 min. La histona IIA (H2A; 90 μg) fue añadida exógenamente al ensayo. Se incluyó un control para el solvente del inhibidor (metanol) (*), con el mayor volumen utilizado en el ensayo (6 μl). Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a T.A.), fueron separadas en geles de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñidos con azul de coomasie (A), secados y expuestos a autoradiografía (B). El ensayo contenía 1.4-1.6 μM Na3 VO4 y 70-80 mM NaF provenientes del buffer de lisis. St: estándares de peso molecular (kDa).

En este análisis, se registró una disminución importante de la fosforilación de los sustratos endógenos y de histona IIA con 10 μM de estaurosporina en la cepa MT2D3. Sólo una banda de aproximadamente 32 kDa parece relativamente menos afectada. Aunque la fracción P de BCG parece haber perdido actividad (tiene 2 semanas más de almacenamiento), se puede registrar el mismo efecto del inhibidor a la concentración

77 señalada.

El efecto observado con 10 μM de Estaurosporina se incrementó con una

concentración 10 veces mayor (100 μM). Los extractos de proteínas totales de ambas cepas, aisladas también en presencia de 2mM Na3 VO4 y 100 mM NaF, pero analizadas en ensayos quinasas a T.A., también mostraron una completa inhibición a 100 μM del inhibidor (Fig. 44). En el caso de BCG se utilizaron, además, las mismas concentraciones indicadas en la fig 43, y se detectó que la fosforilación de los sustratos endógenos disminuyó drásticamente con 10 μM de estaurosporina.

BCG EST

0

1

10 100

MT2D3 EST 0 100

kDa

kDa

120-

120-

84-

84-

606039.239.228281818-

Fig. 44. Efecto del inhibidor Estaurosporina sobre la fosforilación de sustratos endógenos en la fracción del extracto de proteínas totales de BCG y MT2D3. La fosforilación de sustratos endógenos del extracto de proteínas totales de BCG (76.4 μg) y MT2D3 (3.1 μg), fue analizada en presencia de Estaurosporina (EST): 0, 1,100 μM en BCG y 100 μM en MT2D3, en ensayos quinasas conteniendo 2.5 mM Mn+2 a T.A por 30 min. El ensayo contenía ∼0.8-1.4 μM Na3 VO4 y ∼40-70 mM NaF provenientes del buffer de lisis.

78 3.3.2. Efecto de la Genisteína. Las fracciones de proteínas asociadas a la pared celular (P) de las cepas BCG y MT2D3 aisladas en presencia de 2mM Na3 VO4 y 100 mM NaF se analizaron en distintas concentraciones del inhibidor Genisteína

en ensayos

quinasas a 36 ºC (Fig. 45). En ambas cepas no se registró una clara inhibición. Solamente en la cepa patógena se observó un ligero descenso en la fosforilación de los sustratos con 100 μM del inhibidor, pero este resultado pudo ser un artefacto, ya que el gel de coomasie (fig. 45-A) mostró una menor cantidad de proteínas en esta muestra (de izquierda a derecha, ver último carril del gel).

También se evidenció una pérdida de las actividades

quinasas en la fracción de la cepa BCG, pues se observó una débil fosforilación de todos los sustratos presentes, incluyendo la histona IIA

A

B BCG

St

MT2D3

*

kDa

*

kDa

205-

205-

11697.4 8466-

11697.4 8466-

5545-

5545-

36-

36-

29-

29-

20.1 -

20.1 -

14.2 -

14.2 -

H2A GEN(μM ) -

+ -

* FA+H2A+DMSO

+ -

+

+

1

10

+

-

100 -

+ -

+

+

+ +

-

1

10 100

H2A GEN(μM ) -

+ -

BCG

MT2D3

*

*

+ -

+

+

+

-

1 10 100 -

+ -

+

+

-

1

+

+

10 100

* FA+H2A+DMSO

Fig. 45. Efecto del inhibidor genisteína sobre la fosforilación de sustratos endógenos y de histona IIA en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular de BCG y MT2D3. Las fracciones de proteínas asociadas a la pared celular (P) de BCG (7.5 μg) y MT2D3 (1 μg), fueron analizadas en presencia de concentraciones crecientes de Genisteína (Gen) y 2.5 mM Mn+2 a 36 ºC por 30 min. La histona IIA (HIIA; 90 μg) fue añadida exógenamente al ensayo. Se incluyó un control para el solvente del inhibidor (DMSO) (*), con el mayor volumen utilizado en el ensayo (6 μl). El ensayo contenía 1.4-1.6 μM Na3 VO4 y 70-80 mM NaF provenientes del buffer de lisis. Las proteínas presentes en cada muestra, una vez realizado el ensayo (30 min. a 36 ºC.), fueron separadas en geles de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñidos con azul de coomasie (A) secados y expuestos a autoradiografía (B). St: estándares de peso molecular (kDa).

79 La fracción de proteínas asociadas a la pared celular de la cepa BCG y el extracto total de la cepa patógena MT14323, aislados en presencia de Na3 VO4 y NaF, pero analizada en ensayos quinasas a T.A., tampoco mostraron una inhibición de los sustratos fosforilados

endógenos

por

el

inhibidor

Genisteína

(fig.

46),

aún

utilizando

concentraciones superiores (350 µM) a las presentes en el ensayo anterior (fig. 45). Nótese que en este caso, la fracción de BCG tiene una importante actividad quinasa, así que la ausencia de inhibición en la figura anterior, no puede ser atribuida simplemente a una pérdida de la actividad de la fracción.

BCG GEN(μM) 2.6

kDa

25.9 350

MT14323 - DMSO

GEN(μM)

kDa

120-

120-

84-

84-

60-

60-

39.2-

39.2-

2818-

- DMSO 25.9 350

2818-

Fig. 46. Efecto del inhibidor Genisteína sobre la fosforilación de sustratos endógenos de las cepas BCG y MT2D3 en ensayos quinasas a temperatura ambiente. La fracción de proteínas asociadas a pared celula r (79.2 μg) de BCG y el extracto de proteínas totales (∼11 μg) de la cepa MT14323 se analizó en presencia de distintas concentraciones del inhibidor genisteína (GEN). Las fracciones sólas (-) fue además comparada con la adición solvente del inhibidor (DMSO). El ensayo (30 min. a T.A.) contenía ∼1.6 mM de Na3 VO4 y ∼80 mM de NaF.

80 DISCUSIÓN

La detección de residuos fosforilados en Ser y Thr por anticuerpos anti-pSer y antipThr en las fracciones de proteínas de las cepas BCG y MT2D3, sugirió la presencia de sustratos de las proteínas Ser/Thr quinasas en las mismas fracciones. Entre las fracciones de proteínas, se destacó el reconocimiento de dichos aminoácidos fosforilados en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular, especialmente en BCG donde ambos anticuerpos no reconocieron ningún residuo fosforilado en la fracción soluble.

Este

reconocimiento también fue observado en la misma fracción de la cepa patógena, especialmente con el anticuerpo anti-pThr aunque, a diferencia de BCG, si se observaron residuos fosforilados en la fracción soluble.

Aún cuando en BCG no se detectaron

residuos fosforilados en la fracción membranosa, quizás por la poca cantidad presente en el ensayo, estos resultados condujeron a la idea que las proteínas insolubles podían contener un número importante de sustratos de las STPQ en las fracciones proteicas estudiadas. El hecho que, cuantitativamente, el anticuerpo anti-pThr reconoció más sustratos fosforilados en la cepa MT2D3 que el anticuerpo anti-pSer, pudo originarse en la preferencia que por este residuo podrían tener un número importante de STPQ, tal y como lo indican los estudios recientes sobre la autofosforilación de las quinasas PknD, PknB, PknF y PknE de M. tuberculosis en las regiones catalíticas y yuxtamembrana de las quinasas, que señalan una mayor cantidad de residuos fosforilados en Thr, proponiéndose una

posible especificidad de las actividades quinasas por estos residuos (Durán y col.,

2005). Esta preferencia también ha sido señalada para PknA (Chaba y col. 2002; Kang y col., 2005) y para la fosforilación de los sustratos EmbR y GarA por las quinasas PknH (Molle y col., 2003 (b)) y PknB (Villarino y col., 2005), respectivamente.

Si existe dicha

especificidad, es probable que sea característica de la cepa patógena dada la similitud observada en el número de sustratos reconocidos por ambos anticuerpos en la cepa BCG.

A pesar de que en los WB realizados con los anticuerpos específicos dirigidos contra algunas STPQ (PknB, PknD, PknE y PknF) no se dispuso de las proteínas puras como control positivo en el ensayo, todos los resultados con los anticuerpos reconocieron bandas polipeptídicas con pesos moleculares similares a las reportados teóricamente para las mismas. La certeza de dicho reconocimiento fue más confiable con el anticuerpo antiPknB y especialmente el anticuerpo anti-PknD, porque además de la similitud con el peso esperado, hubo una intensa reacción con la banda correspondiente, en contraste con las

81 otras bandas reconocidas en el mismo WB. Es importante señalar que la ausencia de reconocimiento en la fracción

de proteínas de membrana en la cepa BCG, no debe ser

interpretado de forma estricta como una posible ausencia de las quinasas, porque al igual que en la ausencia del reconocimiento de residuos pSer y pThr, este efecto pudo originarse por la poca cantidad de proteína presente en la fracción. En el caso de PknB los resultados sugirieron un peso mayor al teóricamente esperado.

La diferencia entre el peso estimado (66.5 kDa) y el observado de PknB (∼75

kDa) pudo originarse por un posible estado fosforilado de la proteína presente en las fracciones de proteínas.

De manera similar, Av-Gay y colaboradores (1999) reportaron

un peso superior (68 kDa) al esperado en la purificación de PknB, el cual fue atribuido a su forma fosforilada. La diferencia observada en el peso molecular de la principal banda polipetídica reconocida por el anticuerpo anti-PknD en la cepa BCG y la principal banda reconocida en MT2D3, coincide con el estudio de Peirs y colaboradores (2000), donde se identifica una banda de 70 kDa que corresponde a la proteína quinasa PknD en la cepa de referencia M. tuberculosis (Erdman), mientras que en M. bovis BCG dicho anticuerpo reconoció una proteína de 30 kDa correspondiente a la forma truncada de la quinasa que carece de la región transmembrana y carboxilo terminal presentes en la forma completa. En cuanto a la localización de dicha proteína, los resultados en la cepa MT2D3 mostraron que esta quinasa se localizó principalmente en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular, lo que también encuentra correspondencia en el mencionado estudio. Con respecto a BCG, Peirs y colaboradores (2000) sólo mencionan la presencia de la proteína PknD truncada en un extracto total de proteínas y postulan una posible proteína soluble en esta cepa.

En los resultados de los WB en BCG ( Fig.13-B), se demostró que el

polipéptido reconocido por el anticuerpo anti-PknD con tamaño similar a la PknD truncada, estaba presente en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular, además de las fracciones de proteínas totales y solubles.

En consecuencia, una localización

estrictamente soluble de esta proteína en la cepa BCG es cuestionable, y sugiere además una fuerte asociación del dominio quinasa de la forma completa de PknD con la fracción de proteínas asociadas a la pared celular.

Otra quinasa que pudo haber sido reconocida en su forma fosforilada es PknE, debido a la diferencia observada en el polipéptido reconocido (64 kDa) y el peso teórico estimado (60.5 kDa) (Fig. 15). Al igual que lo discutido previamente para PknB, Molle y

82 colaboradores (2003) atribuyeron la fosforilación de PknE al hecho que la quinasa tuvo un peso molecular superior (∼68 kDa) al esperado (60.5 kDa) cuando esta fue expresada in vitro.

El reconocimiento del polipéptido de 64 kDa en los WB, tuvo una caraterística

particular y diferente al resto de los otros polipéptidos reconocidos por el resto de los anticuerpos anti-quinasas y que sugirieron la presencia de la proteína correspondiente. Este polipéptido fue reconocido en la fracción de proteínas de membrana, además de la fracción de proteínas asociadas a la pared celular. En tal sentido, se había pensado que la ausencia de PknB ó PknD en las fracciones membranosas se debía, además de la poca proteína presente en la fracción del ensayo, al proceso de fraccionamiento que pudo ocasionar un desprendimiento de proteínas de las membranas donde se presume están localizadas éstas quinasas en M. tuberculosis. Sin embargo, la posible presencia de PknE en la fracción membranosa supone que dicho fraccionamiento no es tal, que todas las proteínas de membrana sean liberadas de esta fracción.

Al comparar los WB de anti-PknB y anti-PknE con los WB anti-pSer y anti-pThr, la posible fosforilación de estas quinasas no encuentra apoyo en estos últimos análisis, especialmente en la cepa BCG (sólo con respecto a PknB), ya que no hay péptidos similares detectados por ambos anticuerpos.

Con respecto a la cepa patógena,

dudosamente se pueden ver péptidos similares reconocidos con el anti-pThr, sin embargo no es concluyente. Pero, aún asumiendo que estos polipéptidos no fueron detectados por los anticuerpos anti-pThr ó anti-pSer, la posibilidad de una fosforilación puede mantenerse, porque es factible que una relativa menor sensibilidad de estos anticuerpos con respecto a los correspondientes anti-quinasas, ocasionasen la ausencia de péptidos similares en los WB anti- pSer y/o anti-pThr.

De todos los WB realizados, los correspondientes a las reacciones con el anti-PknF, mostraron los resultados más dudosos en cuanto a la identificación de la quinasa en las fracciones de proteínas utilizadas.

La caracterización bioquímica reportada para esta

quinasa, indica que ésta se ubica en la envoltura celular (pared y membranas) como una doble banda de 67-70 kDa debido a la fosforilación de la misma, mientras que en la fracción citoplasmática se presenta como un polipéptido de 50 kDa correspondiente a la forma no fosforilada de la quinasa (Koul y col., 2001). Pero en los WB realizados en las fracciones insolubles con el anticuerpo anti-PknF en las cepas MT2D3 y BCG (Fig. 16) no se detectaron bandas similares al peso de la quinasa en su estado probablemente

83 fosforilado. En cuanto a su localización, en BCG al parecer la quinasa se encuentra tanto en las fracciones solubles como insolubles (excepto la de membranas) con un peso aproximado de 50 kDa (forma defosforilada). Por otra parte, en la cepa MT2D3 la quinasa parece localizarse únicamente en el citosol, puesto que el anticuerpo sólo reconoció bandas similares a las reportadas para esta quinasa, en la fracción soluble.

Las diferencias entre los resultados reportados por Koul y colaboradores (2001) en la cepa

H37 Rv de M. tuberculosis y los presentados en este estudio en la cepa clínica

MT2D3, en cuanto a la localización de PknF, pueden ser el reflejo de diferencias entre la cepas utilizadas, además de las condiciones bajo las cuales se aislaron las fracciones en cada caso, lo cual no puede discutirse pues en la referencia señalada no se mencionan las mismas. Por otra parte, Koul y colaboradores (2001) no señalan algún razonamiento sobre la localización simultánea de la quinasa en dos compartimentos celulares distintos en una forma fosforilada o defosforilada,

pero tal vez la fosforilación de la quinasa sea un

requisito para su localización en la envoltura celular y de esta forma se podría explicar la ausencia de polipéptidos de 50 kDa, además de 67-70 kDa, en las fracciones insolubles de la cepa MT2D3.

De manera general,

los análisis de WB sugirieron

una importante presencia de

sustratos de Ser/Thr quinasas en las fracciones insolubles, especialmente la

de proteínas

asociadas a la pared celular. Pero, también sugirieron la presencia de quinasas en dichas fracciones.

En conjunto estos dos hechos apuntaron a que estas fracciones eran

protagonistas de importantes actividades Ser/Thr quinasas.

Este hecho fue confirmado

cuando se evaluó la fosforilación de sustratos endógenos en los ensayos radioactivos correspondientes tanto en la cepa BCG como la cepa MT2D3.

La detección de los

sustratos fosforilados principalmente en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular y membranas en los ensayos quinasas, implica la presencia de Ser/Thr quinasas en las mismas fracciones.

Evidentemente, no se excluye la posibilidad de que los sustratos

fosforilados en pSer y pThr en fracciones insolubles, mostrados en los WB, fuesen fosforilados por actividades quinasas citoplasmáticas, previo al fraccionamiento celular. Pero, de cualquier modo, estos resultados y los correspondientes a ensayos quinasas indican que las fracciones insolubles son blancos importantes de las STPQ en ambas cepas.

84 En cuanto al perfil de sustratos endógenos fosforilados mostrado por las fracciones de proteínas, casi todos los sustratos detectados en los extractos totales se localizan en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular y la fracción de proteínas de membrana y dada la similitud encontrada entre los perfiles de fosforilación de ambas fracciones, se infiere que en el fraccionamiento celular ocurrió muy probablemente una contaminación de una u otra fracción.

Es posible que algunos fragmentos de detritus con secciones de

membrana no fueron, efectivamente, eliminados previo a la separación de la fracción de proteínas asociadas a la pared celular y sedimentaron luego en esta fracción, pero también es factible que las proteínas efectivamente asociadas a la pared celular y no de membrana, quedaran en el sobrenadante después de

la centrifugación a 20000 x g, siendo luego

recuperadas en la fracción membranosa.

En futuros análisis es recomendable considerar

marcadores de presencia de proteínas de membrana y pared celular para establecer la contaminación de una u otra fracción. Pero, de cualquier forma y bajo las condiciones analizadas en este estudio, las fracciones insolubles mostraron el mayor número de sustratos endógenos fosforilados, en contraste con el pequeño número de sustratos fosforilados en la fracción soluble de ambas cepas en la mayoría de los ensayos realizados.

Dependiendo de la cantidad de proteína utilizada en cada ensayo y las condiciones empleadas, el número de polipéptidos (p) fosforilados fue variable, pero se lograron detectar 5 principales sustratos endógenos fosforilados en la cepa BCG con ligeras variaciones en las migraciones relativas (Mr) entre los ensayos (p90-93 kDa, p66-70 kDa, p56-60, p32-36 y p23-24 kDa) (Fig.17, 22, 23, 24, 28). El mismo número de sustratos también fue detectado en la cepa MT2D3 (p92 kDa, p83 kDa, p65-66 kDa, p50 kDa, p3032 kDa) (Fig. 29-33 y 39).

Comparando los perfiles de fosforilación de las fracciones

insolubles de MT2D3 con el perfil de las fracciones correpondientes en la cepa BCG, obtenidos en las mismas condiciones de ensayo se pudo observar que varios polipéptidos tienen Mr similares, lo que podría sugerir la misma identidad. En este punto es prematuro establecer conclusiones, sin embargo algunos indicios discutidos más adelante señalan que al menos el sustrato de 92 kDa podría tener la misma identidad en ambas cepas. Por otra parte, al comparar el perfil de la fracción membranosa de BCG (Fig. 28) con el perfil de las fracciones insolubles de la cepa patógena (Fig. 39), se pudo observar que una banda fosforilada alrededor de los 40 kDa en el perfil de BCG, parece ausente en MT2D3. Sin embargo, la zona entre los 40-50 kDa ha mostrado en varios casos ciertas bandas difusas en la cepa patógena a lo largo del estudio, así que en algunas circunstancias no ha sido fácil

85 discriminar cuáles son las diferencias reales en la misma. Más notoria y constante, ha sido la ausencia o muy débil fosforilación, en la cepa BCG, del polipéptido p83 kDa

(Por

ejemplo ver fig. 17, 20, 23 y 28), el cual sí fue fosforilado en las fracciones de MT2D3. La identidad de este sustrato será discutida en el capítulo II.

En la literatura sólo se encuentra un estudio de fosforilación de proteínas en extractos totales y proteínas del medio de cultivo de M. tuberculosis y BCG, en el cual de detectaron 4 principales sustratos fosforilados en el extracto de M. tuberculosis con pesos de 66, 55, 38 y 18 kDa y cuyas migraciones relativas variaron en la cepa BCG, excepto el polipéptido de 55 kDa. Av-Gay y Davies (1997).

Estos polipéptidos tienen Mr muy

similares a los mencionadas previamente, aunque en la cepa patógena no se menciona un polipéptido análogo al de 18 kDa, tampoco se excluye su ausencia, pues un polipéptido de 22-23 kDa (equivalente al p23-24 de BCG) ha sido observado en algunas fracciones y cuya fosforilación parece incrementarse en presencia de la histona IIA (Fig. 34, 37, 38 y 43).

La fosforilación de sustratos añadidos exógenamente, como la histona y la caseína, es una característica común entre varias Ser/Thr quinasas estudiadas en otros organismos (Pearson y Kemp, 1991;

Akiyama y Ogawara, 1991).

La fosforilación de sustratos

exógenos también ha sido demostrada en siete de las STPQ caracterizadas hasta el momento (PknA, PknB, PknD, PknE, PknF, PknG, PknH) utilizando la histona y/o la Proteína Básica de Mielina (MBP) (Chaba y col, 2002; Av-Gay y col., 1999; Peirs y col., 1997; Koul y col, 2001; Sharma y col., 2004; Grunder y col., 2005).

Igualmente, en este estudio, se mostró que las fracciones que mostraron mayor actividad quinasa en ambas cepas, también fosforilaron la histona IIA (Fig. 20, 28, 32, 34, 39).

Adicionalmente, la fosforilación de caseína también fue observada en algunas

oportunidades en las mismas fracciones que fueron capaces de fosforilar la histona (Fig. 27 y 34) y dado que este sustrato no ha sido utilizado previamente en alguna caracterización de STPQ de M. tuberculosis, la fosforilación del mismo añade otro sustrato más que estas quinasas son capaces de fosforilar.

Pero la adición de histona IIA en los ensayos produjo

además otros efectos sobre la fosforilación de los sustratos endógenos. En algunos casos se observó el incremento de la fosforilación de otros sustratos endógenos presentes en las mismas fracciones (ver Fig. 20, 28, 32 y 34). Este efecto ha sido observado en la quinasa PknG de M. tuberculosis donde en presencia de otra proteína básica, la MBP, la

86 autofosforilación de la quinasa PknG se vio incrementada (Koul y col., 2001). De igual manera, Cowley y colaboradores (2004) observaron el incremento en la autofosforilación de la porción C-terminal de esta quinasa en presencia de MBP.

El incremento en la

fosforilación de sustratos endógenos puede ser explicado por las características de alcalinidad de la histona que, al igual que otras proteínas básicas, puede generar un efecto estimulatorio en proteínas quinasas como Ser/Thr y Tyr quinasas (Hubler y col. 1992).

Al contrario, también se observó que utilizando la histona, la fosforilación de algunos sustratos estuvo disminuída (Fig. 21, 42). Esta observación no es un caso extraño entre las STPQ de M. tuberculosis, pues la autofosforilación de la quinasa PknF está disminuida en presencia de MBP (Koul y col., 2001); y sugiere, en ambas cepas, la presencia de quinasas con alta afinidad por la histona y la posible competencia de sustratos por la quinasa correspondiente.

Para caracterizar la fosforilación de sustratos endógenos y exógenos en las fracciones de proteínas de las cepas de estudios, se consideraron, inicialmente, el requerimiento de iones divalentes (Mg+2 , Mn+2 o Ca+2 ) y la temperatura como los principales parámetros a

evaluar en los ensayos quinasa.

No obstante, la inclusión del

ortovanadato de sodio y el NaF en el buffer de lisis, como inhibidores de fosfatasas, produjo una sorpresiva disminución de la fosforilación de algunos sustratos endógenos en las cepas patógenas. En consecuencia y después de la evaluación de los resultados, estos compuestos fueron finalmente considerados también como parámetros que influenciaron la fosforilación de sustratos, aunque no se establecieron experimentos dirigidos para evaluar su efecto.

De manera general, la fosforilación de los sustratos endógenos y exógenos por las actividades quinasas presentes en diferentes fracciones fue favorecida por el Mn+2 , en lugar del Mg+2 . Tanto en BCG como en MT2D3, el Mg+2 tuvo una pobre estimulación sobre la fosforilación de sustratos, aunque dependiendo de la cantidad de proteína presente y la calidad de la muestra, se pudo registrar la fosforilación de algunos sutratos comunes a la fosforilación con el Mn+2 .

Pero, en la cepa patógena, este catión también fue capaz de

inhibir parcialmente la fosforilación en presencia de Mn+2 , como un efecto dependiente de la concentración de Mg+2 utilizada (especialmente con 15 mM Mg+2 ). El Ca+2 también fue capaz de inhibir dicha fosforilación, pero contrastó la inhibición casi total en

87 concentraciones menores (2.5 mM) (Fig. 41).

Pero los efectos del Mn+2 y el Mg+2

estuvieron también influenciados por la temperatura. En ambos casos, se pudo determinar que a 36ºC la fosforilación de algunos sustratos endógenos disminuía, tanto en la cepa patógena (ver Fig. 30 y 31) como en la cepa BCG (Fig. 19 y 21), aunque este efecto no pareció observarse, al menos con el Mn+2 , en las fracciones extraídas con un buffer conteniendo ortovanadato de sodio y NaF (Fig. 39). La preferencia por el Mn+2 , ha sido reportada en 4 de las ocho quinasas caracterizadas hasta el momento: PknA (Chaba y col., 2002), PknB (Av-Gay y col., 1999; Boitel y col., 2003), PknD (Peirs y col., 1997) y PknI (Gopalaswamy y col., 2004), que demostraron una actividad Mn+2 dependiente para estas quinasas en concentraciones comparables (1-10 mM) a las de este estudio (2.5-15 mM).

Para tres de las restantes quinasas caracterizadas (PknH, PknE, PknF) y de los estudios resportados (Sharma y col., 2004; Molle y col., 2004; Molle y col., 2003; Durán y col., 2005; Grunder y col., 2005) se deduce que el Mn+2 y el Mg+2 pueden ser utilizados indistintamente. Por último en PknG no se puede discriminar pues ambos han sido utilizados en conjunto (Koul y col., 2001; Cowley y col., 2004). Pero, en estas últimas 4 quinasas no se establecen comparaciones entre ambos iones.

Así que la afirmación

definitiva de una preferencia del Mn+2 sobre el Mg+2 en todas las STPQ, esperá los análisis comparativos entre ambos cationes, en las quinasas donde no se ha evaluado este requerimiento específico.

Sin embargo, los resultados obtenidos en este estudio sobre

fracciones intactas de proteínas apuntan hacia una preferencia del Mn+2 como una característica en la mayoría de las actividades Ser/Thr quinasas tanto en la cepa patógena, como en la cepa BCG.

Las quinasas PknB (Av-Gay y col., 1999) y PknI (Gopalaswamy y col., 2004), han mostrado autofosforilación en un buffer quinasa con ambos iones en una concentración de 10 mM.

La actividad quinasa también ha sido registrada en +2

presencia simultánea de Mn 2001).

+2

Cuando el Mg

+2

y Mg

PKnF y PknG con la

(2 mM y 5 mM, respectivamente) (Koul y col.,

fue utilizado a una concentración de 2.5 mM, no tuvo ningún

efecto sobre la fosforilación de sustratos endógenos dependiente de 2.5 mM Mn+2 ; pero, cuando el Mg+2 fue añadido en una concentración mayor (15 mM), definitivamente se observó una inhibición de dicha fosforilación (Fig. 41). En primera instancia, estos

88 resultados sugieren un efecto gradual inhibitorio del Mg+2 sobre la fosforilación dependiente del Mn+2 .

La primera explicación que surge a la inhibición del Mg+2 es un

efecto directo del catión sobre las actividades quinasas.

Los estudios con PknA indican

que el Mg+2 por sí sólo inhibe la actividad quinasa de esta proteína (Chaba y col., 2002), pero la concentración a la cual ocurre (100 mM) es mucho mayor a la utilizada en este estudio (15 mM). Evidentemente, se podría especular que, en fracciones de proteínas, un efecto inhibitorio directo sobre las quinasas se registra

a 15 mM de Mg+2 , pero una

respuesta más satisfactoria es que el Mg+2 esté ejerciendo su efecto de, modo indirecto, a través de otras enzimas como las proteasas. Esta hipótesis se deriva de la evaluación de los factores responsables de la desaparición conjunta de bandas en el gel y la fosforilación de sustratos en los ensayos con extractos de proteínas de las cepas patógenas MT14323 y MT2D3 en presencia de Mg+2 . En estos análisis, se reprodujeron, sin premeditación y de manera similar, las condiciones en las que la proteasa Lon (La) de M. smegmatis

se

oligomeriza y activa a T.A. en presencia de 10 mM Mg+2 , en una forma independiente del ATP (Rudyak y col., 2001).

Los resultados obtenidos (Fig. 34-35) demostraron que la

ausencia de la fosforilación, paralela a la pérdida de proteínas y acumulación de polipéptidos con Mr por encima de los 200 kDa, estaba influenciada, de la misma manera, por los mismos factores señalados para Lon (Fig. 35).

Aunque a 37 ºC, y debido a la poca

proteína presente en el ensayo, no se pudo asociar una pérdida de proteínas en el gel con la inhibición por el Mg+2 (Fig. 41), la actividad proteolítica podría también estar presente, ya que la actividad peptidasa de Lon también se encuentra presente a 37ºC (Rudyak y col., 2001). El efecto inhibitorio del Mg+2 fue más notorio en la fosforilación de la banda de 92 kDa (Fig 41), la cual desapareció por completo. La desaparición de esta banda fosforilada también estuvo influenciada, además del Mg+2 , por la temperatura,

pues previamente se

demostró que la disminución de la fosforilación con este catión se acentuó con el incremento de la temperatura (Fig. 31).

Si la actividad proteolítica es la causa directa de

este efecto, es posible que exista una preferencia o especificidad, por este sustrato o por la quinasa que lo fosforila, que se incrementa con ambos factores.

Aunque el efecto

proteolítico mediado por el Mg+2 , como explicación a la inhibición observada, no es una conclusión

definitiva, los resultados sugieren que el estudio de las proteasas en estas

fracciones puede ser un tema con implicaciones importantes para la comprensión de las actividades Ser/Thr quinasas dentro del patógeno.

89 Por otra parte, en la cepa BCG no se pudo asociar una pérdida de proteínas en el gel con el efecto de 15 mM Mg+2 a T.A. (Fig. 25). Pero, probablemente, la gran cantidad de proteína presente en la fracciones analizadas (76.4 μg), pudo enmascarar el efecto del Mg+2 .

Al respecto un extracto de MT14323 con 5 veces más proteína que el extracto

mostrado en la figura 35 y analizado en presencia de 15 mM Mg+2 , sólo mostró una ligera disminución de proteínas en el gel teñido con azul de coomasie (resultados no mostrados). Para establecer si dicho efecto se presenta en la cepa BCG, se requieren cantidades de proteínas comparables a las utilizadas con la cepa patógena. No obstante, la disminución de la fosforilación del sustrato de 92kDa en presencia de Mg+2 y a 36ºC (Fig. 17 y 19), de la misma forma que lo señalado para la cepa MT2D3, hace suponer no sólo que puede ser el mismo sustrato, sino que además el efecto de las proteasas discutido previamente, también puede estar presente en la cepa no patógena. La inhibición del Mg+2 en fracciones de proteínas totales podría no estar respaldada por el único reporte conocido de actividades quinasas en fracciones de proteínas (Av-Gay y Davies 1997).

Este estudio fue

realizado en presencia de ambos iones (10

mM), y se observó un perfil de 4 sustratos fuertemente fosforilados mencionados previamente, pero este ensayo contenía diez veces más proteína (20 μg) que los ensayos mostrados en la figura 41, así que el efecto inhibitorio, al igual que en el caso de BCG, pudiese estar enmascarado por la cantidad de proteína presente. De forma notoria en dicho estudio no fueron reportados polipéptidos similares a 92 kDa, lo cual coincide con la fuerte inhibición de esta banda con 15 mM de Mg+2 , descrita anteriormente.

El efecto del calcio fue sólo evaluado puntualmente en la cepa patógena, donde además de no estimular la fosforilación de sustratos endógenos fue capaz de inhibir la fosforilación en presencia de Mn+2 (Fig. 41), al igual que lo señalado para la quinasa PknD a la misma concentración del Mn+2 (2.5 mM) (Peirs y col.,1997), pero diferente a PknA donde, aunque no ocurre estimulación de la actividad quinasa, tampoco la inhibe (Chaba y col., 2002). Considerando que el calcio no inhibe la actividad quinasa de PknA, es posible que los sustratos de la quinasa, o la misma PknA, estuviesen ausentes en estas fracciones, si se establece que el efecto inhibitorio del calcio es ejercido directamente sobre las quinasas, ya que la inhibición de la fosforilación, dependiente de Mn+2 , fue observada, por igual, en todos los sustratos endógenos.

90 Pero,

además de un efecto directo sobre la actividad quinasa, es probable que

existan otros factores que expliquen la inhibición de la fosforilación de los sustratos endógenos por el calcio, porque los resultados de la fosforilación de los sustratos endógenos de la cepa patógena MT2D3 a T.A. y en presencia de ortovanadato de sodio, establecen la posible existencia de la quinasa PknA en las fracciones de proteínas estudiadas (Fig. 34-35). Koul y colaboradore (2001) mostraron que en un ensayo quinasa a T.A. la actividad quinasa de PknA fue inhibida, previa incubación a la misma temperatura con ortovanadato de sodio (0.5 mM -2.5 mM). Análogamente, los extractos de proteinas totales de MT2D3 extraidos en un buffer de lisis que contenía NaF y ortovanadato de sodio, mostraron una disminución de sustratos fosforilados (Fig. 34-35) cuando fueron comparados con extractos que carecían de dichos compuestos (Fig. 29-33) en las mismas condiciones de temperatura. sustratos fosforilados

Entre ellos, la fosforilación de 2 de los tres principales

(92 y 66 kDa) fue casi indetectable en presencia de dichos

compuestos, a pesar que el extracto MT2D3 obtenido en estas condiciones contenía una cantidad ligeramente mayor que los extractos de las figuras 29-33. Más aún, la ausencia de estos sustratos, también se hizo notoria en la cepa de referencia MT14323 con ∼7 veces más proteína que los ensayos en la cepa MT2D3 en ausencia de los mencionados compuestos (comparar figuras 29 y 37).

En consecuencia, los resultados obtenidos

sugieren que alguno de los sustratos afectados pudiese haber sido un sustrato de PknA o de otra quinasa que también puede ser inhibida por el ortovanadato de sodio.

Por otro lado, pareciera que este efecto está regulado por la temperatura, pues en los ensayos a 36 ºC y en presencia de los mencionados inhibidores, la fosforilación de los polipéptidos mencionados es bastante apreciable, considerando que en este caso la cantidad de proteína es menor (1μg) que en los correspondientes ensayos a T.A (3.1 μg (comparar Fig. 39 vs Fig. 34-35).

En este punto es conveniente mencionar que ninguna

caracterización de las STPQ de M. tuberculosis ha considerado la temperatura como variable en el ensayo quinasa. Sólo para PknD se menciona que la actividad de la quinasa a 7ºC fue comparable a la correspondiente a 37ºC cuando se trató de evaluar el tiempo requerido para la autofosforilación de la quinasa (Peirs y col., 1997).

Sin embargo, al

igual que la preferencia por el Mn+2 vs Mg+2 , de los diferentes estudios realizados con las quinasas caracterizadas, se infiere que las quinasas PknD, PknE y PknF pueden utilizar ambas temperaturas (Peirs y col., 1997; Molle y col., 2003; Koul y col., 2001; Grunder y col., 2005).

Los ensayos con PknB han utilizado T.A (Av-Gay y col., 1999; Ortiz-

91 Lombardía y col., 2003; Young y col., 2003; Chopra y col., 2003; Kang y col., 2005; Grunder y col., 2005) ó 30 ºC (Boitel y col., 2003; Villarino y col, 2005; Durán y col., 2005).

PknG y PknH tienen actividad quinasa a 37 ºC (Koul y col., 2001; Molle y

col.,2003b; Sharma y col., 2004) y PknA sólo ha sido analizada a T.A (Chaba y col., 2002; Chopra y col., 2003; Kang y col., 2005).

En el presente estudio, la fosforilación de sustratos endógenos evaluada en dos condiciones de temperatura (T.A. ó 36ºC) no mostró resultados uniformes, pues los perfiles de fosforilación, a una u otra temperatura,

variaron dependiendo de la presencia del

ortovanadato de sodio y NaF en los ensayos quinasas, tal y como se explicó anteriormente. En términos generales, pareciera que la T.A. es una buena condición para evaluar la fosforilación de sustratos, aunque a 36ºC se puede mejorar dicha fosforilación, siempre que estén los inhibidores de fosfatasas presentes, pues en ausencia de ellos se registró una disminución de la fosforilación de sustratos endógenos, especialmente del polipéptido p83 (comparar Fig. 30 y 39). Esta variación en la fosforilación de sustratos endógenos a 36ºC, vinculada a la presencia de inhibidores de fosfatasas, podría ser explicada por la actividad de la Ser/Thr fosfatasa PstP, cuya actividad ha sido evaluada, satisfactoriamente, a 37ºC y además es dependiente de Mn+2 ; pero, también puede ser inhibida por el NaF en un 25 % (Chopra y col., 2003).

Si la inhibición de la fosfatasa PstP por el NaF, es la causa del incremento en la fosforilación de algunos sustratos endógenos a 36ºC, también es factible que a T.A la adición del NaF, en ausencia del ortovanadato de sodio, pudiese incrementar la fosforilación de todos los sustratos endógenos. Pero, en definitiva, sería conveniente evaluar estos dos compuestos por separado en ambas temperaturas, antes de establecer afirmaciones definitivas.

Así mismo, se deben evaluar nuevamente las fracciones de

proteínas que perdieron actividad en los ensayos a 36ºC en presencia de dichos inhibidores (como los extractos totales) para determinar si el efecto es reproducible en estas fracciones.

En BCG, sin embargo, no se ha podido concluir claramente cual es el efecto del ortovanadato de sodio y NaF y su relación con la temperatura. Entre otras causas, porque las fracciones extraidas con el buffer conteniendo estos compuestos y ensayadas a T.A. tenían una cantidad de proteínas hasta 10 veces más (y en ocasiones superior) que las fracciones extraidas con perlas y analizadas a la misma temperatura, de forma que la gran

92 cantidad de proteína presente en el primer caso, pudo enmascarar cualquier disminución en la fosforilación (comparar figuras 17 y 25).

Por otra parte, a 36 ºC y en cantidades

similares de proteína, la fracción de proteínas asociadas a la pared celular con o sin los inhibidores, parecieron mostraron un perfil similar de sustratos endógenos fosforilados (comparar figuras 17 y 28). No obstante, debido a que la fracción extraída en presencia de ortovanadato de sodio y NaF (Fig. 28) presentó una pérdida de actividad, no se pudieron tomar conclusiones definitivas. En tal sentido, teniendo presente que estos resultados preliminares, utilizando concentraciones de iones divalentes y valores de temperatura puntuales, indican que ambos factores tiene una influencia en las actividades quinasas, se recomienda realizar ensayos con el fin de conocer las concentraciones óptimas de iones divalentes y valores de temperatura para las actividades Ser/Thr quinasas en las fracciones de proteínas de las cepas BCG y MT2D3, considerando que, además, no existe una caracterización completa de estos parámetros en todas las Ser/Thr quinasas de M. tuberculosis. Otra inhibición importante en las fracciones fue registrada en presencia del AMPc. En este estudio se mostró que el AMPc producía una disminución de sustratos fosforilados en el extracto de proteínas totales de la cepa patógena MT14323 y que dicha inhibición incluyó la fosforilación de los sustratos exógenos como la Histona IIA (Fig. 37) y la caseína (resultados no mostrados). Esta actividad fue específica del 3´,5´AMPc, pues con un compuesto análogo (2´,3´AMPc) el efecto no fue registrado. Aunque este ensayo requiere una futura comprobación, una hipótesis que surge para explicar esta inhibición es, nuevamente, la acción de las proteínas fosfatasas del patógeno y que dicha actividad pudiese estar relacionada con la fase de crecimiento en que se encuentra el cultivo. activación de la PKA

La

por el 3´,5´AMPc ha sido ampliamente estudiada (Taylor y col.

1990, Cho-Chung y Clair, 1993; Francis y Corbin, 1994; Taskén y Aandahl, 2004), y aunque éste es el efecto más conocido del segundo mensajero, no es el único y su acción se extiende a otros sistemas de señalización intracelular incluyendo las fosfatasas. Feschenko y colaboradores (2000) encontraron que el aumento del AMPc en células eucariotas se traducía en una disminución de proteínas fosforiladas en residuos de Serina, y posteriormente se mostró que dicha reducción estaba relacionada con la activación de la Ser/Thr fosfatasa PP2A en un mecanismo independiente de la PKA (Feschenko 2002). El genoma de M. tuberculosis codifica para dos Tyr fosfatasas y una única Ser/Thr fosfatasa (PstP) (Cole y col., 1998). Si el efecto es mediado por alguna de ellas, es muy probable que sea ésta última porque el genoma de M. tuberculosis carece de genes que codifiquen

93 para Tyr quinasas, por lo tanto tampoco ocurren, endógenamente, sustratos de Tyr fosfatasas. Por otra parte, la presencia de NaF (70 mM) y el ortovanadato de sodio (1.4 mM), como inhibidores de fosfatasas, en los ensayos con el AMPc (Fig. 37-38),

no

contradice la hipótesis de una posible acción de PstP en los ensayos, pues esta fosfatasa sólo es inhibida por el NaF en un 25 % en concentraciones entre 5 y 500 mM (Chopra y col., 2003).

Adicionalmente, se ha demostrado que varias quinasas fosforiladas (PknA,

PknB, PknD, PknE, PknF) son sustratos de la fosfatasa PstP (Boitel y col., 2003; Chopra y col., 2003; Durán y col, 2005), entre ellas, la defosforilación de PknB en su loop catalítico ocasiona la pérdida de actividad de la quinasa (Boitel y col., 2003). Al presente, no se han publicado estudios sobre la regulación del AMPc sobre la actividad fosfatasa y/o quinasa de M. tuberculosis. Pero, en conjunto, todos los razonamientos expuestos anteriormente, sugieren que el estudio detallado del efecto del AMPc sobre las actividades Ser/Thr quinasas del patógeno puede ser importante para la comprensión de los mecanismos de fosforilación de proteínas en el patógeno.

El escaso número de sustratos endógenos fosforilados en las fracciones solubles de las cepas BCG y MT2D3, que además se corresponde con el escaso reconocimiento de residuos fosforilados en Ser y Thr mostrados en el WB, puede ser el reflejo de la ausencia de blancos específicos y/o de

actividades quinasas en dicha fracción.

Además de los

escasos y débilmente fosforilados sustratos endógenos, los cuales en la cepa BCG sólo fueron observados utilizando grandes cantidades de proteína (Fig. 22 y 24), los resultados en la fracción soluble de esta cepa y utilizando la histona como sustrato exógeno, indican que las actividades Ser/Thr quinasas podrían tener, relativamente, una presencia menor en esta fracción (Fig. 17 y 20).

En la cepa patógena, también se observó una débil fosforilación de sustratos endógenos en la fracción soluble, pero al contrario de BCG, un sustrato fosforilado de 30 kDa fue observado con una menor cantidad de proteínas (comparar Fig. 22 y 24 vs Fig. 33), comparable a la correspondiente fracción soluble de BCG, donde no se observó ningún sustrato fosforilado (Fig. 17).

De manera interesante, Av-Gay y Davies (1997)

detectaron un sustrato del mismo peso en el medio del cultivo de la cepa patógena, pero no en BCG.

Este sustrato soluble, secretado al medio fue reportado como una proteína

fosforilada en residuos de Ser (Av-Gay y Davies, 1997). También de manera similar, los WB indican la presencia de un polipéptido soluble con un peso similar aparentemente sólo

94 fosforilado en residuos de Ser (Fig. 11). Las similitudes son tentadoras para proponer que el sustrato de 30 kDa observado en este estudio, como el principal sustrato fosforilado en la fracción soluble de MT2D3, es el mismo reportado por Av-Gay y colaboradores (1997). Pero habría que determinar, primero, si esta proteína es fosforilada in vitro en residuos de serina y además puede ser secretada. La fosforilación de la histona como sustrato exógeno en la fracción soluble de la cepa MT2D3, fue registrada de forma dudosa, presentándose irregular entre los ensayos (resultados no mostrados), y llegando a establecerse dudas sobre una actividad confiable en esta fracción para determinar esta fosforilación. A lo largo del estudio, se pudo observar que tanto el extracto de proteínas totales, como la fracción soluble constituyeron fracciones muy suceptibles a la pérdida de la actividad quinasa. Como recomendación, se debería evaluar esta fracción inmediatamente después de su obtención sin un congelamiento previo y cumplir extrictamente con el requerimiento del frío en todos los pasos, incluyendo la centrifugación a 4ºC para la cosecha bacteriana antes de la lisis, para

tener una mejor aproximación

de la actividad en la fracción soluble,

especialmente en la cepa patógena.

Las predicciones teóricas señalan que la mayoría de las quinasas, excepto PknG y PknK, son proteínas de membrana (Fig. 5, pág. 21), entonces es lógico pensar en una menor presencia de sustratos fosforilados en la fracción soluble, aún cuando en esta fracción estuviesen presentes sustratos de las mismas. Sin embargo, por sí sólo, este hecho podría no explicar la menor presencia de sustratos fosforilados porque, entre otras razones, se ha revelado que algunas quinasas con motivos transmembrana, como PknF (Koul y col., 2001) y PknI (Singh y col., 2005), pueden localizarse en el citoplasma, así que el número de quinasas en esta fracción subcelular podría ser mayor al esperado.

Una respuesta

complementaria es que en la forma soluble, varias quinasas pueden estar en un estado inactivo.

Por ejemplo, se postula que un requisito para la fosforilación del sustrato

RV1747 por la quinasa PknF es que la misma esté previamente fosforilada para que pueda interactuar a través de sus residuos fosforilados en Thr con los dominios FHA del mencionado sustrato (Molle y col., 2004). Pero dicha quinasa sólo parece localizarse en su forma fosforilada en la envoltura celular y no en el citoplasma (Koul y col., 2001). El requisito de la autofosforilación para la activación de STPQ fue efectivamente demostrado en PknB y ha sido propuesto como un posible mecanismo de activación de las Ser/Thr quinasas de M. tuberculosis (Boitel y col. 2003). No obstante, estos hechos aún no pueden explicar satisfactoriamente los resultados en las fracciones solubles obtenidos a partir de

95 los ensayos quinasas, porque en éstos la autofosforilación de las quinasas, previa a la fosforilación de otros sustratos, es posible.

Otra alternativa que permita explicar un

posible estado inactivo de algunas quinasas, es la presencia de algún tipo de inhibidor soluble.

Esta idea deriva de la fosforilación similar (en cuanto a la intensidad de las

bandas fosforiladas), observada en el extracto total vs la fracción de proteínas asociadas a la pared celular, a pesar que ésta última contiene ∼10 veces menos proteína que el extracto en MT2D3 (Fig 29).

Pareciera que la liberación de algún factor soluble promovió la

fosforilación de dichos sustratos en las fracciones insolubles.

En este caso no puede

atribuirse un efecto de concentración de proteínas en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular, porque todas las fracciones extraidas en este estudio, fueron resuspendidas en el mismo volumen de partida que el

extracto total.

Esta inhibición soluble también

podría estar presente en BCG, pues en general el extracto de proteínas totales de esta cepa mostró siempre menor fosforilación que la correspondiente fracción de proteínas asociadas a la pared celular, aún cuando la cantidad de proteínas fue mayor (Fig. 17, 22 y 24). Al comparar la fosforilación de histona añadida exógenamente al extracto de BCG (Fig. 20) con el correspondiente ensayo en MT2D3 (Fig. 32), podría ser que esta inhibición sea mayor en la cepa no patógena, considerando que el extracto de BCG tenía mayor cantidad de proteínas (7.6 μg) que la cepa patógena (1.72 μg) y que ambas fracciones tenían un tiempo reciente y similar desde su obtención (3-6 días) y el mismo tiempo de cultivo (∼3 semanas).

Entre otros factores, también es posible que la fosforilación de sustratos endógenos en la fracción soluble esté determinada por la expresión de quinasas en una condición específica del crecimiento bacteriano, a juzgar por la sugerente fosforilación de un sustrato de 66-64 kDa en la fracción soluble proveniente de un cultivo en de la cepa patógena crecida en condiciones particulares (Fig.42).

En este estudio no se tuvo por objetivo

establecer diferencias en las fases de crecimiento o condición de estrés alguna, y se trató de limitar los resultados a cultivos con crecimiento entre 3-6 semanas (con un promedio de 4 semanas) en las mismas condiciones.

No obstante, el cultivo de la cepa MT2D3 en

condiciones de saturación bacteriana (denominado así por los numerosos cúmulos de bacterias observadas), pudo reproducir alguna condición particular de crecimiento no presentada por los otros cultivos, pues el perfil de fosforilación de sustratos endógenos fue totalmente diferente al observado en el resto de los ensayos en condiciones similares (Fig.

96 42-A). Entre las condiciones que pudo haber reproducido este cultivo, quizás, la condición sea la de estrés metabólico por una limitada disposición de nutrientes, debido al acentuado crecimiento bacteriano en un medio de cultivo reducido en su volumen original, unido al tiempo prolongado del mismo (7 semanas). Los modelos para establecer condiciones de estrés nutricional establecen un crecimiento de las micobacterias en PBS por 6 semanas (Betts y col. 2002). Por otra parte, se pudo determinar que el principal sustrato fosforilado (p66-64 kDa) tenía un carácter soluble, pues fue detectado visualizado en el gel teñido con coomasie en la fracción correspondiente. Pero, desdichadamente, cuando se realizaron los ensayos quinasa para comparar la fosforilación en las fracciones del extracto total y soluble, la actividad en el extracto total había caído significativamente (Fig. 42-B). En consecuencia, la débil fosforilación de p64-66 observada en la fracción soluble, sólo puede considerarse como un indicio que sugirió la fosforilación de este polipéptido en la fracción soluble.

Un resultado definitivo, requerirá un ensayo con fracciones de preparación

reciente, a partir de un cultivo que reproduzca las mismas condiciones.

Con respecto al tipo de actividades quinasas, se pudo determinar que al menos dos tipos diferentes de actividades quinasas son responsables de la fosforilación de sustratos en esta condición ya que, mientras la fosforilación del sustrato de 64-66 kDa es Mn+2 dependiente (Fig. 42-A), la fosforilación del sustrato de 30 kDa no se vió afectada cuando el Mn+2 fue sustituido por el Mg+2 (resultados no mostrados). Este resultado sugiere que el polipéptido de 64-66 kDa es un sustrato de Ser/Thr quinasas con preferencia por el Mn+2 y que, además, tienen una alta afinidad por la histona IIA puesto que en presencia de ésta la fosforilación del mencionado sustrato está ausente.

Si el sustrato es fosforilado en la

fracción soluble en condiciones limitadas por la expresión diferencial de una quinasa, PknI (que posee preferencia por el Mn+2 ) puede ser un candidato a la quinasa que fosforiló este sustrato, porque un estudio reciente indica que esta quinasa se ubica en el citosol de M. tuberculosis y su expresión al menos no es constitutiva, pues está disminuída durante la infección en macrófagos (Singh y col., 2005). En contraste, el polipéptido de 30 kDa fue fosforilado en presencia de Mn+2 ó Mg+2 , y al parecer no compite con la histona, pues está fosforilado aún en presencia de la misma. La existencia de Ser/Thr quinasas que puedan tener actividad en presencia

del Mg+2 ,

además del Mn+2 , como cofactor es un hecho experimentalmente demostrado para ciertas Ser/Thr quinasas, como se mencionó previamente en la discusión del requerimiento de

97 iones divalentes. Si la condición de estrés nutricional es verdadera, una candidata para la quinasa responsable puede ser PknH, porque esta quinasa muestra actividad en ensayos quinasas con 2-10 mM de Mg+2 y su expresión no está limitada por la escasez de nutrientes (Molle y col., 2003; Sharma y col., 2004).

Pero, antes de establecer una conclusión

definitiva sobre las propuestas realizadas, se deberían analizar los patrones de fosforilación bajo una condición controlada de estrés nutricional para determinar, en primer lugar, si ésta fue la condición que se originó en el cultivo mencionado, para luego tratar de identificar las quinasas y sustratos involucrados.

El análisis de WB en las fracciones mencionadas

utilizando los anticuerpos anti-PknD y anti-PknB también podría contribuir a definir si la condición establecida es un estrés metabólico por escasez de nutrientes, porque en estas condiciones la expresión de las quinasas PknD y PknB está disminuida (Betts y col., 2002). En otro sentido, otra condición de estrés como la hipoxia es factible porque, aunque el cultivo estuvo en presencia de oxígeno todo el tiempo, no se descarta que éste no se encuentre disponible por igual en todo el cultivo.

La estauroporina es el inhibidor general más potente de las proteínas quinasas. La concentración inhibitoria del 50 % de la actividad enzimática (IC

50 )

para algunas Ser/Thr

quinasas es: 2.7 nM (Proteína quinasa C; PKC), 1.3 nM(quinasa de la cadena

liviana de

Miosina), 8.2 nM (Proteína quinasa A; PKA), 8.5 nM (Proteína quinasa G; PKG), 20 nM (CaM-quinasa).

Entre las tirosin quinasas La IC50 de PTK de p60

(Tamaoki, T, 1991).

v-src

es 6.4 nM.

La utilización de la estaurosporina en dichas concentraciones no

produjo ningún efecto inhibitorio sobre las actividades quinasas en los extractos de proteínas totales de BCG y MT2D3 (resultados no mostrados).

Se decidió, entonces,

considerar concentraciones mayores (1, 10, 100 μM), las cuales fueron utilizadas en la fracción asociada a la pared celular, considerando que era la fracción con mayor actividad quinasa (Fig. 43) En la cepa BCG se obtuvieron también los mismos resultados utilizando el extracto total y en MT2D3 se evidenció una inhibición completa utilizando 100 μM (Fig. 44). Estos resultados se corresponden con lo reportado por Peirs y colaboradores (1997), Ortiz-Lombardía y colaboradores (2003) y Sharma y colaboradores (2004) para las quinasa PknD, PknB y PknH, respectivamente, donde se evidenció una inhibición importante de las quinasas señaladas con 10μM de estaurosporina e inhibición completa a 100μM.

Este similitud apoya la afirmación de que el perfil de péptidos fosforilados

mostrados en todos los ensayos de este estudio corresponden

a sustratos de STPQ

98 presentes en dichas cepas.

Sin embargo, un péptido de, aproximadamente, 32 kDa,

todavía presenta una apreciable fosforilación a 100 μM y comparable con la concentración de 10 μM en las dos cepas (obviando la pérdida de actividad en la cepa BCG). Estos resultados sugieren que este sustrato es fosforilado por al menos una Ser/Thr quinasa distinta a las mencionadas previamene (PknB, PknD y PknH).

Alternativamente, las

actividades de los sistemas de dos componentes pudiesen ser responsables de esta fosforilación. En general, se ha señalado que la determinación de los sustratos fosforilados por el sistema de dos componentes es técnicamente difícil, debido a que las velocidades de reacción (en unos pocos minutos)

conllevan a las formas desfosforiladas

cuando la

quinasa y la proteína reguladora están presentes, simultáneamente, en la reacción (Hess y col., 199; Morth y col., 2005).

Así mismo, se ha señalado que los ensayos quinasas en

este estudio fueron diseñados con el objeto de discriminar estas actividades (ver metodología).

Pero la posibilidad existe, considerando que estos sistemas, aunque tienen

como ión preferido el Mg+2 , pueden alternar con otros iones divalentes como el Mn+2 (Stock y col., 2000). Cuando se analizó en detalle la presencia del sustrato de 32 kDa en otras fracciones, extraidas y analizadas en las mismas condiciones, se pudo concluir que este péptido estaba presente también en los extractos totales (resultados no mostrados) y aunque la figura 41 muestra una ausencia total de sustratos fosforilados en esta fracción en presencia de 2.5 mM Mg+2 , este resultado no es definitivo, pues el análisis de una alicuota de esta fracción con mayor actividad, mostró que en presencia de la misma concentración de Mg+2 esta banda estaba relativamente más fosforilada que los otros sustratos presentes (resultados no mostrados)

A diferencia de la estaurosporina, genisteína es un inhibidor específico de las tirosina quinasas, con muy poco efecto sobre las Ser/Thr quinasas. Por ejemplo la IC

50

de

una Tyr quinasa como la quinasa del receptor del factor de crecimiento epidermal (EGF) es 2.6- 25.9μM (Akiyama y Ogawara, 1991). superiores a éstas e iguales

La genisteína utilizada en concentraciones

a la estaurosporina, no produjo una inhibición clara y

significativa en fracciones de proteínas de BCG y MT2D3 (Fig. 45).

Esta situación se

mantuvo aún incrementando la concentración de la genisteína (350 μM) (Fig. 46) a un valor similar en el cual el inhibidor (370 μM) sólo logra el 40 % de la actividad de la Ser/Thr quinasa PKC (Akiyama y Ogawara, 1991). Estos resultados señalan una ausencia de actividades tirosina quinasas en las fracciones de proteínas de las cepas del estudio,

99 coincidiendo con la ausencia de genes que codifiquen para estas proteínas en M. tuberculosis (Cole y col., 1998); y en su lugar apoya la presencia de Ser/Thr quinasas en las fracciones de proteínas de este estudio.

En resumen,

los resultados mostrados en este capítulo representaron la primera

caracterización de las actividades Ser/Thr quinasas en diversas condiciones y en distintas fracciones de proteínas de M. tuberculosis y BCG que demostró no sólo la presencia de actividades Ser/Thr quinasas sino que la envoltura celular es una ubicación importante para estas actividades. También sugirió que las actividades Ser/Thr quinasas en fracciones intactas de proteínas, no son sólo la suma de las actividades individuales de las STPQ caracterizadas hasta el momento, sino que podrían estar influenciadas por otros componentes celulares como las proteasas y las fosfatasas y que en conjunto indican la complejidad que la señalización celular mediada por la fosforilación de proteínas puede tener en M. tuberculosis. Así mismo, estableció las bases para la comparación de perfiles de fosforilación entre cepas mutantes de algunas STPQ y las cepas silvestres de este estudio en la búsqueda de los posibles sustratos de estas enzimas, tema que será abordado, más detalladamente, en el segundo capítulo de este trabajo.

100

CAPITULO II CONSTRUCCION DE CEPAS MUTANTES DEFICIENTES EN PROTEÍNAS SER/THR QUINASAS ESPECÌFICAS DE Mycobacterium tuberculosis Y M. bovis BCG Y COMPARACIÓN DEL EFECTO SOBRE LA FOSFORILACIÒN DE LOS SUSTRATOS ENTRE LOS MUTANTES Y LAS CEPAS PARENTALES. MARCO TEÓRICO Métodos de análisis de la función genética en M. tuberculosis: la inactivación de genes La determinación de la función genética ha llevado a los investigadores a realizar diversas estrategias de biología molecular que permitan lograr este fin.

La comprensión

del genoma de M. tuberculosis no escapa a este hecho, pero este patógeno no es una bacteria fácil de manipular genéticamente. Prueba de esto es que las técnicas modernas de génetica molecular no fueron aplicadas a las micobacterias hasta hace aproximadamente 20 años, cuando Young y colaboradores (1985) y Clark-Curtiss y colaboradores (1985) construyeron las primeras bibliotecas de ADN micobacteriano en E. coli, lo cual representaba un retardo respecto a los estudios realizados en otras bacterias patógenas (Pelicic y col., 1998). Existen tres razones principales por las cuales se afirma que, entre todas las bacterias, el género Mycobacterium constituye el grupo bacteriano que posee mayores dificultades para ser manipulado experimentalmente y más aún si dicha manipulación conlleva técnicas de biología molecular. Una de las dificultades está relacionada con la transmisión de M. tuberculosis. Debido a que los aerosoles pueden transmitir partículas infecciosas, M. tuberculosis sólo debe manipularse en

laboratorios

con bioseguridad de nivel 3 que eviten la infección de este patógeno (Kent y Kubica, 1985). El tiempo de duplicación en los grupos de crecimiento lento es otra dificultad. M. tuberculosis se encuentra en este grupo, con un tiempo de duplicación de 22 hr. (Balasubramanian y col., 1996) y un requerimiento de 3-4 semanas para la formación de una colonia de la cepa silvestre y hasta 9 semanas para el crecimiento de cepas mutantes (Jacobs, 2000).

Finalmente, la envoltura de M. tuberculosis representa una formidable

101 barrera que contiene una particular pared celular caracterizada por una baja permeabilidad, que es potencialmente responsable de la resistencia a la deshidratación, sustancias alcalinas, varias sustancias desinfectantes y quimioterapeúticas (Brennan y Nikaido, 1995; Daffé y Etienne, 1999), pero

también representa un obstáculo

para la introducción de

ADN exógeno que es un requisito en la mayoría de las estrategias de biología molecular conducentes a evaluar la función génica.

La inactivación de genes y el análisis de los mutantes obtenidos, es una de las estrategias más utilizadas para evaluar la función génica en cualquier organismo,

pero

requiere de forma inevitable que el gen sea dispensable (no esencial). Aunque no serán discutidas aquí, sin embargo existen técnicas para abordar este problema como son los métodos para medir la actividad enzimática a través de genes reporteros, la determinación del nivel de expresión de las proteínas correspondientes a través de la determinación de los niveles de ARNm, la hibridización sustractiva y la selección de los genes de interés a través de un fenotipo conocido que pueda ser seleccionado, entre otras (Pelicic y col., 1998; Smith y col., 2003).

Las técnicas descritas hasta ahora en las micobacteria para la inactivación génica consideran dos métodos: métodos globales y métodos directos.

Los métodos globales

consisten en la inactivación de genes a través de la inserción aleatoria de un ADN exógeno en muchos sitios del genoma bacteriano. Este ADN es un elemento transponible ó transposon contenido en un vector, el cual, usualmente, contiene un marcador de resistencia a un antibiótico específico que permite la selección del fenotipo deseado (Smith, 2003).

La inactivación directa de un gen involucra la sustitución o

reemplazamiento alélico, explotando las propiedades de la recombinación homóloga de las células, del gen cromosomal por una copia inactivada del mismo (Ruvkun y Ausubel, 1981). Al igual que en la inactivación global, el gen puede ser inactivado por la inserción de un marcador de resistencia a un antibiótico específico.

En lo que se refiere a la inactivación global, en las micobacterias inicialmente se desarrollaron dos sistemas de transposición

basados en vectores termosensibles (no

pueden replicarse a una temperatura determinada) para construir bibliotecas de mutantes por inserción.

Uno de ellos utiliza un plásmido que contiene el transposon Tn1096

(IS1096) y un marcador de contra-selección para el plásmido (sacB) (Pelicic y col., 1997).

102 El otro sistema utiliza un bacteriófago termosensible que contiene el transposon Tn5367 ó Tn5370. Esencialmente la diferencia entre estos dos métodos reside en el vector utilizado para introducir el ADN en la micobacteria.

La transposición ha sido utilizada

para diseñar la técnica STM (“Signature tagged mutagenesis”) y seleccionar mutantes atenuados in vivo. La STM es una variación de la mutagénesis por transposición, desarrollada inicialmente para S. typhimurium por Hensel y colaboradores (1995), que permite la selección negativa de mutantes atenuados para el crecimiento in vivo. En esta técnica, los mutantes pueden identificarse por una etiqueta única que consiste en una secuencia corta de ADN añadida al elemento transponible, lo cual permite identificar los mutantes atenuados a partir de un gran número de clones bacterianos mutagenizados (Hensel y col., 1995).

La STM fue utilizada en M. tuberculosis para detectar genes esenciales para el crecimiento en ratones y que están relacionados con la síntesis de elementos de la pared celular (Camacho y col., 1999; Cox

y colaboradores 1999) (ver capítulo I).

Específicamente, Camacho y colaboradores (1999) utilizaron el sistema de transposición con el elemento de inserción IS1096 (Pelicic y col., 1997) para construir el plasmido pCG113 que posee un derivado de IS1096 (IS1096 con un gen de resistencia a Kanamicina: Km).

Utilizando este plásmido se constituyeron 51 bibliotecas de mutantes,

diferenciadas cada una con etiquetas “tag” específicas y se seleccionaron aleatoriamente 1927 mutantes organizados en 41 grupos de 47 clones.

La búsqueda de mutantes

atenuados comenzó con el inoculo de cada grupo o “pool” introducido intravenosamente en ratones.

Las bacterias fueron recuperadas de los pulmones un día y tres semanas

después de la infección. Luego, se procedió a la amplificación de las tags que fueron utilizadas, posteriormente, como sondas sobre las librerías construidas, organizadas y transferidas a membranas. transposones Tn1096 y

El problema con los sistema de mutagénesis utilizando los Tn5367 es que

los eventos de transposición no son

completamente aleatorios y los transposones parecen integrarse con preferencia en ciertas áreas (“hot spots”) (Camacho y col., 1999; Smith, 2003; Lamichhane y col., 2005). Recientemente se ha utilizado el transposon Himar-1 que ha superado esta dificultad, ya que sólo requiere de la secuencia TA para su inserción y así casi todos los 4250 genes del genoma de M. tuberculosis son susceptibles a su acción y sólo en 16 genes el Himar-1 no puede insertarse (Lamichhane y col., 2005).

103 Este transposon ha sido utilizado éxitosamente para determinar genes esenciales para el crecimiento in vitro (Sassetti y col., 2003) e in vivo (Sassetti y Rubin, 2003), utilizando la técnica TraSH (“Transposon site hybridization”) que combina la mutagenesis por inserción de alta densidad con un mapeo o detección de mutantes por hibiridización con microarreglos (“microarrays”) (Sassetti y col., 2001), que a diferencia de la STM, permite la detección simultánea de un mayor número de mutantes en el análisis global del genoma bacteriano.

La

inactivación

directa

de

un

gen

en

las

micobacterias,

involucrando

la

recombinación homóloga para dar origen a una cepa Knock Out (KO) fue realizado por primera vez con éxito en M. smegmatis inactivando el gen pyrF con un casete de resistencia a Kanamicina (Husson y col., 1990).

Sin embargo, cuando Kalpana y

colaboradores (1991) trataron de reemplazar el gen de metionina por el gen NEO (marcador de resistencia a kanamicina y neomicina) utilizando fragmentos lineales de ADN, como sustratos para la doble recombinación homóloga, en las micobacterias de crecimiento lento como BCG y M. tuberculosis, se encontraron con dificultades.

Los

resultados obtenidos en este trabajo mostraron una incorporación de dichos fragmentos en sitios inespecíficos del cromosoma de la bacteria (recombinación ilegítima).

Una mejor

aproximación al reemplazamiento génico en BCG, la obtuvo Aldovini y colaboradores (1993) cuando logró la integración de un fragmento lineal, constituido por el gen uraA interrumpido por el gen que confiere resistencia a Kanamicina, en el locus uraA del cromosoma de esta cepa. Pero todos los transformantes poseían el vector y se concluyó que sólo había ocurrido una recombinación homóloga simple, por lo tanto no había reemplazamiento génico.

No fue sino hasta 1995 que se obtuvo un reemplazamiento génico en BCG utilizando el gen accBC como blanco utilizando un plásmido conteniendo el alelo mutado (Norman y col., 1995).

Pero se reporta un solo caso de cepa KO, el cual resulta inestable pues

observan reversión al fenotipo silvestre. Reyrat y colaboradores (1995) obtienen un éxito mayor con la interrumpción del gen ureC

de BCG, a través de la introducción del

plásmido linearizado, con el alelo mutado correspondiente, en lugar del plásmido completo. Pero aún así la eficiencia fue muy baja (sólo 4 % de los transformantes son KO).

104 Balasubramanian y colaboradores (1996) obtienen el primer reemplazamiento génico en las cepas de referencia H37Rv y Erdman de M.tuberculosis. Para ello utilizaron los sustratos lineales largos (40-50 kb) para la recombinación homóloga, como una nueva estrategia. Pero, tampoco en este caso la eficiencia mejoró mucho pues sólo se obtuvieron 6 % de KO. En este momento, y dadas las dificultades presentadas en el intercambio alélico de M. tuberculosis, se postula que los obstáculos obtenidos en este procedimiento se deben probablemente a una baja frecuencia de la

recombinación homóloga y altos

niveles de recombinación ilegítima en el patógeno, ocasionados tal vez por un sistema de recombinación homóloga menos eficiente que en otras micobacterias como M. smegmatis (Mc Fadden y col., 1996).

Sin embargo, Pavelka y Jacobs (1999) reportaron que las

frecuencias de recombinación homóloga en M.smegmatis, BCG y M. tuberculosis eran muy similares. Así que, las causas se orientaron hacia la eficiencia de la electroporación en el proceso de transformación de las micobacterias de crecimiento lento: Braunstein y colaboradores (2002) han reportado una baja eficiencia de transformación en M. tuberculosis con rango entre 102 -105 transformantes por μg/ADN. Si a esto se suma que un sólo evento de recombinación en micobacterias tiene una frecuencia entre 10–4 -10-5 , (Pavelka y Jacobs., 1999), entonces la construcción de una cepa KO se convierte en un proceso bastante complicado, considerando que la probabilidad de ver un evento raro como la doble recombinación homóloga estaría entre 10 –8 -10-10 .

Una forma de optimizar el reemplazamiento génico por recombinación homóloga en las micobacterias de crecimiento lento ha sido la utilización de la estrategia en dos pasos. Esta estrategia se basa en la selección de un evento de recombinación homóloga a la vez, con lo cual la eficiencia de transformación y la frecuencia del simple entrecruzamiento tienen frecuencias cercanas. Es decir, en un primer paso se seleccionan los recombinantes producto de un sólo entrecruzamiento, y en el segundo paso se selecciona los recombinantes producto del segundo entrecruzamiento, a través de la contra-selección del plásmido (Pelicic y col., 1996 (b)).

La estrategia fue utilizada, por primera vez, en M.

smegmatis empleando el gen silvestre rpsL como marcador de contra-selección del plásmido.

Este gen, cuyo fenotipo silvestre es dominante, confiere sensibilidad a la

estreptomicina, pero en la cepa parental, escogida para la construcción del KO, este gen está mutado, ocasionando así la resistencia a la estreptomicina en la misma.

En este

sistema, el primer evento de recombinación homóloga es seleccionado por la resistencia a la kanamicina (conferida por el mismo vector) y el segundo evento de recombinación

105 (doble entrecruzamiento) es seleccionado por el gen silvestre rpsL (presente en el plásmido) como marcador de contra-selección, así que todos los KO son resistentes a la estreptomicina (Sander y col., 1995).

La desventaja de marcadores como rpsL en la

estrategia de dos pasos, es que se requiere una cepa parental resistente al antibiótico, lo cual no siempre está disponible.

En BCG y

M. tuberculosis, generalmente se utiliza,

como marcador de contra- selección, el gen SacB de Bacillus subtilis, el cual codifica para una enzima que confiere sensibilidad a la sacarosa (Pelicic y col., 1996). Este marcador ha sido combinado también con un origen de replicación termosensible para crear vectores de contra-selección termosensibles (ts-sacB) que permiten la eliminación eficiente a 39 ºC en presencia de sacarosa de las colonias que, después de la selección del segundo evento de recombinación homóloga, aún contienen el vector (Pelicic y col., 1997).

Por otra parte, el marcador SacB tiene, además, la ventaja de introducir mutaciones alélicas sin la utilización de marcadores de resistencia

y fue empleado con este fin por

primera vez en M. smegmatis (Pelicic y col., 1996( b)) y posteriormente en BCG y M. tuberculosis (Pavelka y col., 1999). Pero la limitación que tiene esta metodología es que se requiere de un fenotipo conocido para evaluar los mutantes en ausencia de un marcador de resistencia.

Al respecto, Parish y Stocker (2000) diseñaron una estrategia para el

intercambio alélico en dos pasos, donde no se requiere el conocimiento de la función del gen previo a su inactivación, gracias a la utilización de dos sistemas independientes para el clonamiento del alelo mutado del gen por una parte,

y el casete de marcadores de

resistencia en combinación con el marcador sacB por otra, los cuales son integrados posteriormente en un solo vector.

En este diseño metodológico, el primer evento de

recombinación es seleccionado por el marcador de resistencia del casete, mientras que en el segundo evento, la selección es contra el vector, a través del marcador sacB, y con él los marcadores de resistencia también son eliminados, obteniéndose mutantes KO por intercambio alélico sin marcadores de resistencia en el gen cromosomal.

Recientemente, también se ha

desarrollado una nueva estrategia en M. smegmatis,

con base en la incompatibilidad plasmídica para produccir el reemplazamiento génico. Este sistema consiste en el uso de un par de plásmidos replicativos que son incompatibles, es decir, que compiten uno con otro porque comparten elementos de la misma maquinaria de replicación, así su permanencia es establecida en presencia de los antibióticos correspondientes, pero cuando la selección es removida uno o ambos plásmidos se pierden.

106 Esta técnica posee la ventaja de usar plásmidos replicativos que permite un tiempo de vida prolongado en la célula para que el proceso de recombinación homóloga pueda realizarse (Pashley y col., 2003).

A pesar de las dificultades que implica la inactivación de un gen, por intercambio alélico en un sólo paso, en las cepas BCG y M. tuberculosis, esta forma de producir mutantes KO no fue desechada, pues el abordaje del problema desde la transducción como vía de introducción de ADN exógeno, en lugar de la electrotransformación, ha mostrado que este mecanismo es posible.

En un sentido amplio, la transducción genética es la

transferencia, mediada por virus (bacteriófagos), de información genética no viral a una célula receptora, lo cual ocurre cuando los genes exógenos o no virales se empaquetan en una cubierta viral y se introduce en la célula receptora por infección (Weisber, 1996). Fue descubierta por Zinder y Lederberg en 1952 (Masters, 1996). generalizada o especializada.

La transducción puede ser

En la primera, los fagos contienen extensiones del ADN

bacteriano, tomadas aleatoriamente, exclusivamente de la célula donante, que luego son transferidas a la célula receptora.

La transducción especializada es la transferencia

altamente eficiente de una parte especíica de ADN bacteriano, como parte del genoma del fago (Derbyshire y Bardarov, 2000).

Jacobs y colaboradores (1987) fueron los primeros en mostrar la introducción de ADN exógeno en M. smegmatis y BCG a través de la transducción con vectores fasmídicos (shuttle phasmids).

Estos vectores son quimeras que consisten en ADN de

micobacteriófagos (fagos que infectan micobacterias) en el cual se ha insertado un cósmido de E. coli. Tienen la versatilidad de replicarse como plásmidos en E. coli y como fagos en las micobacterias y pueden transferir ADN entre ambos géneros bacterianos (Jacobs y col., 1987). Posteriormente, Snapper y colaboradores (1988) muestran la transformación de M. smegmatis y BCG, así como la transducción con fásmidos lisogénicos o temperados que permitan no sólo la introducción del ADN exógeno sino además la integración del mismo en el cromosoma bacteriano, permitiendo la expresión estable de genes exógenos como los que codifican para la resistencia de ciertos antibióticos.

Por

último

Bardarov

y

colaboradores

(1997)

ofrecieron

el

sistema

de

micobacteriófagos (fásmidos) de replicación condicionada como vectores para la introducción de ADN en M. tuberculosis. Este tipo de vectores tienen como característica

107 que son fásmidos termosensibles, es decir,

sólo pueden replicarse a una temperatura

determinada (30 ºC) En consecuencia pueden ser vehículos del transporte del ADN deseado a una temperatura donde sólo el fago es capaz de infectar a la micobacteria más no lisarla (37 ºC - 38.5 ºC). Este trabajo abrió las puertas a la posibilidad de la inactivación directa de genes y su marcaje, empleando una vía diferente a la transformación bacteriana para la introducción de ADN exógeno, a través de la construcción in vitro de micobacteriófagos termosensibles de transducción especializada (Bardarov y col., 2002). Entre otras ventajas, esta vía evita el riesgo de la contaminación por aerosoles producidos en el proceso de electroporación durante la transformación de la micobacterias.

Pero,

además, establece la probabilidad de que cada fago presente en la infección pueda infectar una célula bacteriana (Bardarov y col., 1997), y si se considera que un título elevado del fago (1010 -1011 ) puede acercarse a la frecuencia del evento de doble recombinación homóloga en un sólo paso (108 -1010 ), entonces este metodología ofrece la posibilidad de obtener un gran número de mutantes.

El método de intercambio alélico en un sólo paso, utilizando micobacteriófagos de transducción especializada, para la construcción de mutantes KO, posee 5 pasos principales (Fig. 47). El paso 1, consiste en la construcción de un sustrato alélico, el cual contiene un casete de resistencia a la higromicina entre dos fragmentos homólogos a las regiones que limitan la parte del gen que va a ser sustituida, por el marcador de resistencia, en el cromosoma micobacteriano.

Este sustrato es construido en un cósmido que,

posteriomente, es linealizado por el corte en dos sitios únicos para la enzima de restricción PacI [la cual no tiene sitios de restricción en M. tuberculosis (Cole y col., 1998)] e incorporado en el ADN de un fásmido termosensible, obteniéndose un fásmido recombinante. Este fásmido es empaquetado, in vitro, en cabezas de fago λ, y utilizado para transducir a E. coli

donde se replica como cósmido (paso 2).

El

cósmido es

convertido después, en un micobacteriófago en M. smegmatis, a la temperatura a la cual éste se replica (30 ºC) (paso 3).

Posteriormente, el fago es utilizado para introducir el

sustrato de intercambio alélico, por transducción especializada, gracias a la infección en la temperatura no permisiva de 37 ºC (el fago no se replica), que permite el intercambio alélico en un sólo paso, sin que ocura la lisis de la micobacteria (paso 4). Finalmente, si se desea, se puede eliminar el marcador de resistencia en los KO, utilizando un plásmido que exprese la resolvasa sitio específico γδTnpR, la cual actúa, directamente, sobre las

108 repeticiones directas res que se ubican a cada lado del casete de resistencia a la hygromicina (Paso 5) (Bardarov y col., 2002)

Fig.47. Esquema del reemplazamiento génico, en un sólo paso, en las micobacterias utilizando fagos de transducción especializada construidos in vitro. Fuente: Bardarov y coaboradores (2002)

109 Las funciones de las proteínas Ser/Thr Quinasas de M.tuberculosis. Inicilamente, Av-Gay y Everett (2000) asignaron posibles funciones a las Ser/Thr quinasas de M. tuberculosis con base en la homología de sus secuencias y los dominios funcionales, con otras PSTQ, además de la información que se tenía sobre la posible función de los genes adyacentes a cada quinasa (Ver tabla 1, capítulo I). Esta descripción ha sido enriquecida con la investigación que se ha realizado los últimos tres años en las quinasas PknA, PknB, PknF, PknG y PknH.

A las quinasas PknA y PknB les fue asignada una posible función en el crecimiento y división celular, debido a que los correspondientes genes residen en un operón con PbpA y RodA, cuyos homólogos en otros sistemas bacterianos intervienen en la formación del peptidoglicano y la formación del septum (Av-Gay y Everett, 2000). La primera evidencia experimental sobre dicha función se obtuvo de PknA, la cual al ser expresada en E. coli, modificaba la morfología de esta bacteria (Chaba y col., 2002). Posteriormente, Kang y colaboradores (2005), considerando que los genes pknA y pknB son esenciales para el crecimiento in vitro (Sassetti y col., 2003), decidieron expresar dichos genes en M. smegmatis y BCG para evaluar la posible función de estas quinasas.

Los resultados

mostraron que estas bacterias transformadas con los mencionados genes, crecían lentamente y que su viabilidad celular estaba disminuida. Dicho efecto fue más severo con la sobreexpresión de PknB. Además, la disminución parcial de dichas quinasas, utilizando un sistema inducido de antisentido, determinó la presencia de células muy alargadas que contrastó con las células anchas e hinchadas producidas por la sobre expresión de dichas quinasas. En este trabajo también se identificaron 2 sustratos de las quinasas: Rv1422 y Wag 31, siendo el último un sustrato específico de PknA.

Mientras se desconoce la

función de Rv1422, el sustrato Wag31 es homólogo a la proteína DivIVA que está involucrada en la morfología y división celular de bacterias gram–positivas (Flardh, 2003). En conjunto, todos estos resultados han conducido a proponer que las quinasas PknA y PknB son componentes claves de la transmisión de señales, por el mecanismo de fosforilación de proteínas, que regula la morfología celular y posiblemente la división celular en M. tuberculosis (Kang y col., 2005).

PknG es la única quinasa de la cual se han mostrado estudios

tanto en cepas

mutantes de BCG y como cepas mutantes de M. tuberculosis. Walburger y colaboradores (2004) lograron la interrupción del gen pknG en Mycobacterium bovis BCG. Este mutante

110 no mostró ninguna diferencia en el crecimiento in vitro cuando fue comparado con la cepa silvestre. Sin embargo, los macrófagos infectados con este mutante conducen a una maduración acelerada del fagosoma, lo que hizo suponer que dicha quinasa interviene en la supervivencia intracelular del patógeno dentro del macrófago. Sumado a esto, la infección de los macrófagos con una cepa de M. smegmatis que expresa PknG,

mostró que la

transferencia de esta bacteria al compartimiento lisosomal estaba inhibida, a diferencia de la cepa silvestre que estuvo localizada en dicho compartimiento, y que la actividad de la quinasa era esencial para este efecto.

Además se observó que PknG era secretada al

citosol de los macrófagos infectados. A partir de todos estos resultados se sugiere que esta quinasa promueve la supervivencia intracelular del patógeno inhibiendo la fusión fagosoma-lisosoma en el macrófago (Walburger y col., 2004).

Pero, estos tentadores resultados que indican un papel importante de PknG en la patogénesis de M. tuberculosis, no encontraron correspondencia en el mutante de PknG construido en M. tuberculosis por Cowley y colaboradores (2004). En este caso, el mutante mostró un fenotipo atenuado in vitro e in vivo, y los estudios señalaron que PknG interviene en la regulación del metabolismo de la glutamina-glutamato, y que puede tener vital importancia en el metabolismo y crecimiento en general (Cowley y col., 2004).

La

controversia con PknG aún continúa porque, recientemente, el grupo de investigadores que analizó el mutante de PknG en BCG, señalaron que este mutante no tiene alterado el metabolismo de los aminoácidos glutamina-glutámico y señalan que al menos en BCG, la quinasa no está involucrada en esta ruta (Nguyen y col., 2005). Así que nuevos estudios determinaran cuál es verdadera función de esta quinasa y sus blancos específicos aunque, la misma podría tener funciones diferentes en ambas cepas.

La quinasa PknH ha sido estudiada también desde un punto de vista funcional, y en este caso se ha logrado identificar un sustrato específico y también se tienen resultados sobre el fenotipo de una cepa mutante en M. tuberculosis.

La posibilidad de que la

proteína EmbR fuese un sustrato de PknH fue sugerida por la presencia de dominios FHA en la misma (Pallen y col., 2002), junto al hecho que ambos genes se encuentran en el mismo operón (Cole y col., 1998). Esta hipótesis fue comprobada por

Molle y

colaboradores (2003), quienes además demostraron que los dominios FHA de EmbR eran requeridos para mediar la fosforilación de esta proteína por la quinasa PknH.

111 Debido a que el gen embR en M. avium fue propuesto por Belanger y colaboradores (1996) como un regulador de la expresión de los embA y embB en M. avium, la identificación de EmbR como sustrato de PknH sugirió que esta quinasa podría tener un papel importante en la regulación transcripcional del operón embCAB de M. tuberculosis. Estos genes son responsables de la actividad arabinosyltransferasa, en la formación del arabinogalactano y lipoarabinomano de la pared celular (Belanger y col., 1996; Zhang y col., 2003) la cual es inhibida por la droga etambutol (EMB). Al respecto, el mutante KO de PknH en M. tuberculosis muestra una disminución de la transcripción de los genes embA y embB en presencia de EMB, en contraste con la inducción de los mismos genes en la cepa parental, mostrando que esta quinasa está mediando la transcripción de estos genes (Papavinasasundaram y col., 2005).

Por otra parte, y a diferencia del fenotipo atenuado del mutante de PknG en M. tuberculosis, el mutante de PknH no tiene ningún defecto en el crecimiento in vitro o in vivo, mostrando, además, una sobrevivencia en ratones con una mayor carga bacteriana que la cepa parental. Este mutante también tiene una mayor tolerancia en condiciones de acidificación por la presencia de intermediarios reactivos de nitrógeno.

En conclusión,

estos resultados sugirieron que PknH regula directa o indirectamente el perfil de crecimiento requerido para una adecuada

supervivencia del patógeno en el hospedador,

señalando que un incontrolado crecimiento del mismo podría no ser ideal, si éste contribuye a una rápida muerte del hospedador (Papavinasasundaram y col., 2005).

Al igual que EmbR y PknH, la proteína Rv1747 fue considerada un posible sustrato de PknF, por la presencia de dominios FHA en su secuencia y su localización en el mismo operón de la quinasa. dominios FHA para

La fosforilación de Rv1747 por PknF y la dependencia de los esta reacción, fue demostrada por Molle y colaboradores (2004).

Rv1747 pertenece a la familia de los transportadores ABC (Braibant y col., 2000), los cuales son capaces de exportar una variedad de sustratos a través de las membranas, incluyendo azúcares y drogas (Curry y col., 2005). Recientemente, se ha determinado que en M. tuberculosis una cepa KO de Rv1747 tiene un fenotipo atenuado in vivo pero no in vitro, lo cual sugiere no sólo el requerimiento de este transportador en la infección, sino un posible papel funcional de PknF en la regulación del transportador en este proceso (Curry y col., 2005). Por otra parte, y a través de estudios donde la quinasa PknF fue expresada en M. smegmatis o su expresión fue reducida en M. tuberculosis (utilizando una estrategia

112 antisentido), se ha sugerido que esta quinasa pude tener un papel clave en la regulación del transporte de glucosa, crecimiento celular y la formación del septum en M. tuberculosis (Deol y col., 2005).

Existen 2 quinasas más en las que se ha reportado la existencia de mutantes KO: PknD (Peirs y col., 2005) y PknE (Papavinasasundaram y col., 2005). Pero en ningún caso se ha demostrado la construcción del mutante.

En lo que se refiere al fenotipo de los

mismos, para PknD sólo se mencionan resultados preliminares que indican que el mutante no parece tener un fenotipo atenuado en ratones (Peirs y col., 2005),

Por otro lado, el

mutante de PknE fue utilizado para comparar algunos resultados del mutante de PknH,

y

se conoce que al menos esta quinasa parece tener funciones diferentes a las de PknH, ya que su crecimiento en ratones fue muy similar a la cepa parental (Papavinasasundaram y col., 2005). Todas las evidencias experimentales que han conducido a proponer funciones de las Ser/Thr quinasas de M. tuberculosis, abren un excitante camino hacia la investigación científica en la señalización intracelular, mediada por la fosforilación de proteínas, dentro y fuera del patógeno, donde la inactivación directa de los genes correspondientes, en el caso que sean dispensables, puede tener una especial importancia para el conocimiento y comprensión de los mecanismos en los cuáles están involucradas estas quinasas.

113 OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS

Las evidencias experimentales realizadas hasta el momento para determinar las posibles funciones de las Ser/Thr quinasas, a través de la identificación de sustratos, análisis de fenotipos en cepas bacterianas transformadas con los genes de algunas de las Ser/Thr quinasas o mutantes de las mismas, han mostrado algunos resultados sobre las quinasas PknA, PknB, PknF, PknG y PknH. Sin embargo, aún es poco lo que se conoce sobre las funciones de las Ser/Thr quinasas en general, menos aún en las quinasas PknD y PknI, de las cuales no se han mostrado análisis de cepas mutantes y/o blancos específicos, y en el caso de PknK y PknL, ni siquiera se han caracterizado bioquímicamente. En tal sentido y con el fin de orientar la determinación de las posibles funciones de algunas de estas quinasas, este estudio persigue los siguientes objetivos.

Objetivo general

Evaluar la influencia que las quinasas PknD, PknI y PknK, tienen sobre los perfiles de fosforilación de los sustratos endógenos en las cepas BCG y MT2D3, a través del análisis de cepas mutantes.

Objetivos específicos.

Construir cepas mutantes KO de las Ser/Thr quinasas PknD, PknI y PknK en M.tuberculosis y BCG, a través de la interrupción génica, por intercambio alélico en un sólo paso, de los genes correspondientes.

Comparar los perfiles de sustratos fosforilados de las cepas KO de M. tuberculosis y BCG con sus correspondientes cepas parentales, considerando los resultados obtenidos en la caracterización de las Ser/Thr quinasas en fracciones intactas de proteínas (capítulo I)

Identificar los posibles sustratos de las Ser/Thr quinasas escogidas para la construcción de las cepas KO, a través de la detección de diferencias en los perfiles de los sustratos endógenos fosforilados en las cepas mutantes vs las cepas parentales.

114 MATERIALES Y MÉTODOS

1. Construcción de cepas mutantes. 1.1. Cepas bacterianas, medios y condiciones de cultivo. Se utilizó la cepa Escherichia coli XL1-Blue

(recA1, endA1, gyrA96, thi-1.

hsdR17, Δ (lacproAB) F’ [ proAB laclqZ ΔM15] Tn10(tetr) (Stratagene) transformación de ADN plasmídico. La cepa E. coli HB101 [F

-

para la

Δ (gpt-proA)62 leuB6

glnV44 ara-14 galk2 lacY1 Δ(mcrc-mrr) rpsL20 (Strr ) xyl-5 mtl-1 recA13] (ATCC 33694) fue utilizada para la transducción con fásmidos –ensamblados en cabezas de fago λ. Para las transformaciones, amplificación de clones recombinantes y aislamiento de ADN plasmídico las cepas de E. coli fueron crecidas en medio líquido Luria-Bertani (LB) o sobre LB agar (Sigma).

Las células de Mycobacterium smegmatis mc2 155 (cepa

mutante derivada de la cepa silvestre, mc 2 6) (Snapper y col., 1990) preparadas para electrotransformación, se crecieron en LB con 0.5 % (p/v) Tween 80 (Pavelka, resultados no publicados).

Se utilizó la cepa Mycobacterium bovis BCG var Pasteur (ATCC 35734, colección de cepas Trudeau) para la construcción de cepas mutantes a partir de una cepa atenuada. Como cepa patógena se utilizó Mycobacterium tuberculosis 2D3 (MT2D3) (descrita en el capítulo I)

Todas las cepas de MT2D3 y BCG se crecieron en medio Middlebrook 7H9 y Middlebrook 7H11 (Himedia) + 10 % OAD (al igual que el cultivo para las cepas silvestres descrito en el capítulo I) sin tween 80, excepto

para el protocolo de

transducción; o medio Lowenstein Jensen (LJ). Cuando fue requerido se utilizaron, los siguientes

antibiótiocos:

Tetraciclina

(12.5

μg/ml),

Streptomicina

(100

μg/ml)

e

Higromicina B (50-75 μg/ml para micobacterias y 150 μg/ml para E. coli) (Calbiochem, Sigma).

115 1.2. Técnicas de manipulación de ADN. Todas las técnicas básicas de manipulación de ADN, como visualización en geles de agarosa, digestiones, ligaciones, transformaciones, aislamiento de plásmidos (minipreps) se realizaron utilizando las indicaciones de Sambrook (1989).

Los geles de agarosa fueron preparados al 0.7 % - 1 % en TBE (0.089 M trisborato, 0.089 M ácido bórico, 0.002 M EDTA) más bromuro de etidio (0.5 μg/ml) y la corrida electroforética fue realizada entre 80-100 voltios en TBE. Los pesos moleculares fueron comparados con estándares de peso molecular para ADN (1kb ladder, 1kb Plus DNA ladder , λBSTEII, λEcoRI+HindIII, λHindIII) de Promega, New England Biolabs, Invitrogen o Gibco.

Las digestiones enzimáticas del ADN se realizaron utilizando las enzimas de restricción apropiadas (BamHI, KpnI, XbaI, PacI, HindIII, NsiI) (New Englad Biolabs, Promega) siguiendo las instrucciones del proveedor. Las ligaciones se realizaron en un volumen final 15-20 μl con una cantidad mínima de ADN total de 200 ng, aproximadamente, distribuidos entre el inserto y el vector en una proporción 3:1 (inserto: vector)

y T4 ADN

ligasa (New England Biolabs) según las

instrucciones de la casa comercial.

El ADN de fragmentos de PCR se purificó utilizando el estuche comercial Wizard PCR preps. DNA Purification System de Promega ó por precipitación con etanol (Sambrook, 1989). En el caso de las muestras que fueron enviadas a secuenciar, el aislamiento de los fragmentos se produjo exclusivamente por el estuche comercial mencionado.

El ADN cromosomal micobacteriano fue aislado por el método de CTAB descrito por Braunstein y col., 2002), pero se descartó la recomendación de un paso opcional con la adición de glicina, previa a la lisis, pues el ADN de MT2D3 obtenido en estas circunstancias se degradaba fácilmente.

116 Las transformaciones para la multiplicación de plásmidos se realizaron en la cepa E. coli XL1-Blue. Las células competentes para la transformación se prepararon según el protocolo de V. Prasad (Prasad, 1991)

1.3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Los reactivos utilizados para la PCR se obtuvieron de Promega, Invitrogen y New England Biolabs como proveedores comerciales.

Adicionalmente, el Dr. Jacobus de

Waard facilitó la enzima Taq Polimerasa. La enzima Taq- Polimerasa (pfu) fue donada por Clemente Montero u obtenida de la casa comercial Promega. Todas las reacciones se realizaron en un termociclador marca Peltier (PTC-200; MJResearch).

1.3.1. Amplificación de fragmentos menores de 3000 pb. Reactivos: 0.5-0.8 μM (cebadores), 2.5 mM MgCl2 , 0.2 mM desoxinucleótidos (dNTPs), 10 % DMSO, buffer 1X, 1.25-2.5 unidades enzimáticas (u) de la polimerasa y 110 μl de ADN (de concentración variable) ó extrato de lisis bacteriano en una reacción de 25 μl. En

el caso de la amplificación de los fragmentos del genoma de M. tuberculosis,

pertenecientes a las construcciones genómicas utilizadas para el reemplazo génico, se utilizó 5-10 μl del ADN proveniente de una genoteca

de cósmidos de la cepa H37Rv

(1/100), donada por Lisa Pascopella.

Los lisados bacterianos, utilizados como moldes para la amplificación del ADN, se obtuvieron resuspendiendo en 100-200 μl de agua bidestilada, estéril (Milli-Qplus; Millipore) las colonias de interés y colocando dicha suspensión en vórtex por 2-3 min. Programa estándar en el termociclador: 1) 95.0 ºC - 5 min. (desnaturalización) 2) 95.0 ºC - 1 min. (desnaturalización) 3) t.a* -1 min (alineamiento de cebadores) 4) 72.0 ºC – 1min (extensión de cebadores) 5) Ir al paso (2) 35 veces. 6) 4 ºC indefinidamente.

117 *La temperatura de alineamiento (t.a.) para cada fragmento a

amplificar con los

cebadores apropiados se definió con la estandarización por gradiente de temperatura que varió entre 55 ºC y 67 ºC

1.3.2. Amplificación de fragmentos de ADN mayores de 3000 pb. Se consideraron las condiciones establecidas por Azad y colaboradores (1996) y las especificaciones del manual de The Expand Long Template PCR System (Boehringer Mannheim) para la

amplificación de fragmentos de ADN mayores a 3000 pb cuyas

condiciones fueron: Reactivos: 0.3 μM (cebadores), 0.25 mM desoxinucleótidos (dNTPs), 2 mM MgCl2 2 % DMSO, 8 % glicerol, buffer 1X (de la Taq- Polimerasa Pfu o Taq-polimerasa), 0.5 μl de Taq- polimerasa(4u/μl), 0.5 μl de Taq- polimerasa pfu (2 u/μl) y ADN (de concentración variable) ó extrato de lisis bacteriano en una reacción de 100 μl. Programa de amplificación en el termociclador: 1) 94 ºC - 2’ 2) 94 ºC - 30’’ 3) t.a. -30’’ * 4) 72 ºC - 4’ 5) Ir al paso (2) 10 veces 6) 94 ºC - 30’’ 7) t.a.-30’’ 8) 72 ºC - 4’ +20’’ cada/ciclo 9) Ir a paso (6) 20 veces 10) 72 ºC - 7’ 11) 4 ºC indefinidamente. * Para la amplificación de los fragmentos de interés, la t.a. de los cebadores específicos con el ADN molde se definió por la estandarización con un temperatura que varió entre 55 ºC y 70 ºC.

gradiente de

118 El diseño de los cebadores utilizados en este estudio se realizó con el programa Mac VectorTM 6.5.3 (Oxford Molecular Ltd, 1999) y fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, INC. 1.3.3. Modificación de fragmentos de PCR. Para la modificación de sitios de restricción en fragmentos amplificados de PCR se utilizó el sistema TOPO TA –cloning (vector pCR2.1-TOPO) siguiendo las instrucciones de la casa comercial (Invitrogen) para clonar estos fragmentos en éste y producir nuevos sitios de restricción

1.4 Southern Blotting El ADN genómico bacteriano (0.5-2 μg) fue transferido, previa digestión con las enzimas de restricción apropiadas, por el método de la electrotransferencia, utilizando la cámara de transferencia semi-seca trans-blot según las indicaciones del proveedor comercial (Biorad). Se usó la concentración de 1.5x del buffer TBE como óptima para la transferencia de ADN con un tiempo entre 1-2 h (máximo) de transferencia, 6-7 voltios y un grosor entre 6-7 mm de agarosa de 0.7 % (sin bromuro de etidio). membrana Hybond

+

Se utilizó la

de Amershan para la transferencia. Despúes de los lavados con 2x

SSC, se desnaturalizó el ADN colocando la membrana (con el ADN hacia arriba) sobre un papel de filtro empapado en NaOH 0.4 M por 5 min. Después de ser lavada la membrana brevemente con 2x SSC y dejarse secar muy bien, el ADN se fijó a la membrana por luz U.V. (130000 μJ/cm2 ) en un

entrecruzamiento a través de irradiación con entrecruzador (RPN 2500/2501 de Amersham).

Para la detección de los fragmentos de

interés se utilizó el sistema quimioluminiscente CDP-StarTM

de Amersham. Este sistema

fue rigurosamente empleado siguiendo las instrucciones de la casa comercial, excepto para los lavados posteriores a la hibridización (buffer primario) donde el tiempo empleado fue 15-20 min. Las incubaciones se realizaron HYBAID en movimientos rotatorios suaves.

a 55 ºC – 65 ºC (según el caso) en un horno Para la exposición a la autoradiografía (30

min-1h) se utilizaron láminas HyperfilmTM de Amersham. 1.5. Construcción de cepas mutantes La construcción de cepas deficientes en las quinasas se realizó de acuerdo al protocolo descrito por Brauntein y colaboradores (2002), con algunas modificaciones señaladas a continuación.

119

1.5.1. Construcción de intercambio alélico.

cósmidos re combinantes que poseen el sustrato de

Se utilizó el cósmido pYUB854 (donado por el Dr. W. Jacobs)

(Fig.48) para la construcción de los cósmidos recombinantes de este estudio. Este cósmido es derivado de otro cósmido, pYUB572, en el cual el gen bla fue reemplazado por el cassette res-hyg-res limitado por sitios de clonaje múltiple (Bardarov y col., 2002). Tiene un origen de replicación para E. coli (oriE); un sitio λ Cos que permite el empaquetamiento in vitro en las cabezas de fago λ.

El casete de resistencia a la Higromicina como

antibiótico de selección en M. tuberculosis, fue preferido a otros antibióticos (como Kanamicina) debido a su baja frecuencia de mutación espontánea (Smith, 2003)

Para la construcción de cada cósmido recombinante se insertaron 2 fragmentos entre 700-1000 pb a cada lado del gen de la resistencia a la Higromicina. Estos fragmentos, ubicados direccionalmente en el vector, corresponden a secuencias cercanas a la sección delecionada en el genoma. En este estudio esta sección correspondió al sitio activo de las quinasas seleccionadas.

En las cepas mutantes

(KO) el gen de resistencia a la

Higromicina ocupó el sitio activo de la quinasa.

Para establecer qué regiones debían ser escogidas para el diseño de los fragmentos, se ubicó primero el sitio activo de las quinasas en las secuencias aminoacídicas de las mismas,

obtenidas

de

la

base

(http://www.genolist.pasteur.fr/tuberculist/) o (http://www.sanger.ac.uk/).

de

datos

Tuberculist

la base de datos del Instituto Sanger

La identificación de los sitios activos de cada quinasa se

realizó a través del análisis de dichas secuencias utilizando el servicio BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)

del

Centro

Nacional

Biotecnológico

de

EEUU

(NCBI), que mostró las regiones de homología con otras proteínas serina/treonina quinasas conocidas.

Con estos resultados y

considerando los dominios catalíticos (dominios de

Hanks) presentes en PSTQ de M. tuberculosis reportados por Av-Gay y Everett (2000), se precisó en dichas secuencias los dominios catalíticos de las proteínas quinasas.

En este

análisis se consideró, especialmente, el dominio VIb que tiene una lisina como aminoácido común de las proteínas Ser/Thr quinasas, excepto para PknI (Av-Gay y Everett, 2000). El paso siguiente fue ubicar las regiones genómicas que codificaban para la secuencia de aminoácidos seleccionada.

Para esto, las secuencias genómicas que codificaban a las

quinasas de interés, de la misma base de datos

fueron traducidas y comparada con la

120 secuencia

aminoacídica

correspondiente

(previamente

analizada).

Posteriormente,

diseñaron los cebadores que se utilizarían para amplificar los fragmentos

se

que producirían

la deleción del área de interés.

-

Fig. 48. Mapa del cósmido pYUB854. Las características de este cósmido contemplan: un origen de replicación para E. coli (oriE), un sitio λ cos y dos sitios PacI para la introducción eficiente de este cósmido en el vector fasmídico de un micobacteriófago. El casete res-hig-res está limitado por sitios de clonaje múltiple utilizados para el clonaje de los fragmentos del sustrato de intercambio alélico.

1.5.2. Incorporación de la construcción de intercambio alélico en un fásmido. Se utilizó el fago phAE87 (donado por el Dr. W. Jacobs) como vector del sustrato de intercambio alélico. Este fago es un fásmido derivado del micobacteriófago de replicación condicional

(termosensible,

ts)

PH101(ts)

(Bardarov

y

col.,

1997);

y

posee,

intrínsecamente, el cósmido pYUB328 (3.7 kb) el cual tiene el gen bla, que codifica para la resistencia a ampicilina, y dos sitios únicos para el corte con la enzima PacI. El cósmido pYUB854 también posee un sitio de clonaje PacI, a través del cual se realizó el clonamiento del cósmido en el fásmido.

121 En un primer paso se aisló ADN del fásmido phAE87 a partir de un lisado del mismo que posee un título alto o elevado (∼ 1010 -1011 ). Este ADN fue ligado en sí mismo, previo a la digestión con PacI para producir los concatámeros. Luego se ligó este ADN con el cósmido recombinante, en una proporción 10 (fago) : 1(ADN-cósmido). Posteriormente, se empaquetó la mezcla de ligación usando el estuche comercial Giga Pack III XL (Stratagene), finalmente se procedió a la transducción en la cepa E. coli HB101 con esta mezcla de ligación en las condiciones expuestas en el estuche.

La preparación de las

células E. coli HB101, competentes para transducción, se realizó siguiendo las mismas instrucciones de preparación de la cepa VCS257 utilizada para la transducción con el ADN del fago Lambda (control) del estuche Giga Pack III XL.

1.5.3. Conversión del fásmido recombinante en micobacteriófago.

Las colonias

de E. coli HygR (Resistencia a la Higromicina) que mostraron, simultáneamente, amplificación de los fragmentos de la quinasa utilizados en las construcciones genómicas y liberación de la construcción clonada a través del sitio Pac I, se seleccionaron para el aislamiento del ADN fasmídico utilizando el método de lisis alcalina (Sambrook y col. 1989). Este ADN fue utilizado para electroporar M. smegmatis y permitir la transfección y el crecimiento del fago a 30 ºC. La electroporación de M. smegmatis se realizó siguiendo las indicaciones de Hatfull y Jacobs (2000) y Braunstein y col. (2000) con algunas modificaciones. Un cultivo de M. smegmatis (45 ml) crecido en 7H9 + 10 % OAD + 0.5 % tween, hasta densidad óptica A600 . entre 0.5-1.0, se incubo en hielo (30 min- 2 h.). Se cosecharon las bacterias a 1500 x g por 10 min (4 ºC). Se descartó el sobrenadante y se lavó el pellet (dos veces) resuspendiendo éste en 35 ml de 10 % glicerol (enfriado a –20 ºC). Finalmente el pellet fue resupendido en 10 % glicerol ( en 1/10 del volumen original) y se mantuvo en hielo hasta la electroporación. Esta, se realizó con 400 μl del pellet anterior en cubetas de electroporación (enfriadas previamente) con 1-10 μl del ADN de los fásmidos correspondientes (resuspendidos en H2 0 estéril grado MQ) utilizando el sistema de electroporación (Gene –Pulser II, Bio-Rad Richmond C.A) a 2.5 kV , 25 μF y 1000 Ω. Las células eletroporadas se resuspendieron en 1ml de 7H9 +10 % OAD (o en LB) sin tween y se incubaron a 30 ºC por 30 min. Se tomaron 100-500 μl de la suspensión anterior + 200 μl de bacterias electrocompetentes (ó 800 μl de la suspensión de la electroporación) y se añadieron 4 ml de Top Agar (0.6 % Agar Noble en agua destilada) (55 ºC). La mezcla

122 fue vertida en placas de LB. Una vez secas, las placas fueron incubadas, en posición invertida, a 30 ºC por 2-3 días hasta la visualización de las placas líticas

Las placas líticas obtenidas se analizaron para determinar aquellas colonias de fagos con el fenotipo termosensible (crecimento sólo a 30 ºC). Para ello se tomaron alicuotas de las mismas (tocando la colonia con un palillo estéril de madera) y fueron crecidas, por separado, a 30 ºC y 37 ºC sobre placas de medio LB agar con M. smegmatis (LB+ M. smegmatis). Estas placas (LB+M. smegmatis)

poseen una capa, solidificada en Top agar,

de 300 μl de un cultivo de M. smegmatis (D.O A600 1.0) sobre el medio LB agar. Esta capa solidificada de M. smegmatis permitió que el fago creciera y se produjera la lisis de las bacterias.

Una vez seleccionadas las colonias termosensibles, se aisló el fago de los tacos de agar correspondientes, incubando el mismo en 0.5 ml de Buffer del Fago (BF) (50 mM tris, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 mM MgSO4 .7H2 0; 2 mM CaCl2 ) toda la noche y tomando luego una alicuota de la solución. El título del fago se determinó realizando diluciones seriadas 10-2 -10-8 del fago seleccionado sobre placas de LB+M. smegmatis. El título de los fagos, expresado como Unidades Formadoras de Placas por ml (UFP/ml),

se calculó por la

siguiente fórmula: T (UFP/ml)= [(Nº de placas) x (factor de dilución)] x [(1000 μl/ml) / (VolF)]. Donde VolF = Volumen del fago (en μl) utilizado como punto de partida en la secuencia de diluciones seriadas para la determinación del título.

Una vez determinado el título, se procedió a preparar un lisado del Fago con un Título Alto (FTA) a partir de la dilución donde fue observado un patrón de malla muy cerrada o encaje en las placas líticas. smegmatis

Se prepararon, entonces, 10-15 placas de LB+ M.

con esta dilución y se les dejó crecer a 30 ºC hasta la formación en malla

cerrada de las placas líticas.

Luego se recogió el lisado de estas placas incubando las

mismas por 30 min. a T.A. con 10 ml de BF.

Este lisado fue separado del agar por

centrifugación a 23000 x g por 30 min a 4 ºC y fue filtrado por 0.45 μm. calculó nuevamente el título del lisado y se guardó a 4 ºC hasta su utilización.

Luego se

123 Cuando fue requerido, la extracción del ADN de cada fago se realizó con el buffer de lisis STE (1 % SDS, 50 mM Tris pH 8.0, 400 mM EDTA) siguiendo el protocolo de Braunstein y colaboradores (2002).

1.5.4.

Transducción especializada del micobacteriófago: Incorporación del

sustrato de intercambio alélico en M. tuberculosis y BCG. Esta última fase tuvo como principio metodológico la infección, más no la lisis del fago en las células micobacterianas. Esto permitió que el ADN del fago puediese ser introducido en las bacterias para ser sustrato en la doble recombinación homóloga y en consecuencia la ocurrencia del intercambio alélico y subsecuente interrupción del gen blanco. En este caso, se realizaron algunas modificaciones a los protocolos de referencia: 1) Los cultivos de BCG y MT2D3 se crecieron en medio 7H9+10 % OAD (ácido oleico- albúmina-dextrosa-NaCl) +Tween 80 (0.05 %) TW hasta una D.O A600 de 1.0 (aproximadamente). Dado que la D.O de MT2D3 no podía determinarse (por medidas de bioseguridad), se realizó una comparación visual entre el cultivo de BCG y el cultivo de MT2D3 para tener una aproximación de la densidad óptica de éste último. 2) Para cada infección se cosecharon 10 ml de cultivo a temperatura ambiente durante 15 minutos a 1500 x g (para MT2D3 3500 –3700 rpm en centrífuga de mesa estándar). Se descartó el sobrenadante. 3) El pellet bacteriano fue resuspendido en medio 7H9 +10 % OAD sin Tw y se incubó 24 h a 37 ºC. 4) Las bacterias se cosecharon nuevamente (igual que el paso 2) y se resuspendieron en el mismo volumen con buffer BF y se centrifugaron otra vez (esto se repitió dos veces). 5) El pellet obtenido se resuspendió en BF en un 1/10 del volumen original. 6) Se calentó entre 37 ºC – 39 ºC la cantidad del lisado de fago con un título alto (FTA) (obtenido previamente) y las células bacterianas (por separado). 7) Se mezcló, suavemente, 1ml de células (∼2x109 ) UFC/ml con 1ml del (FTA) (1010 UFP/ml).

Como control negativo se preparó una mezcla de infección que tuvo 1ml de

células más 1 ml de BF. 8) La mezcla de infección se incubó entre 37 ºC – 39 ºC por 4-6 h. 9) La mezcla, se inoculó nuevamente en medio 7H9 + 10 % OAD + 0.05 % TW por 24 h a 37 ºC . 10) Se centrifugó (microcentrífuga) la mezcla de infección a 10000 rpm por 10 min. Se descartó el sobrenadante y el pellet bacteriano se resuspendió en 1 ml – 2 ml de 7H9 +

124 10% OAD + TW. La suspensión resultante se sembró (0.2 ml de células por placa) en 7H11 + 10 % OAD + 75 μg/ml de Higromicina B. 11) Para el control negativo del fago se tomó 1 ml de células bacterianas y 1 ml del BF, y fueron procesados de igual manera que las otras muestras de infección. Se realizaron diluciones seriadas (10-2 , 10-3 , 10-5 y 10-7 ) de la suspensión final y se sembraron en medio 7H11 + 10 % OAD sin antibiótico (200 μl) para determinar la viabilidad bacteriana en la infección, paralelo a la siembra en antibiótico de 1ml de dicha suspensión, para el cálculo de la frecuencia de la resistencia espontánea

a la Higromicina: Número transductantes

HigR espóntaneos / Número de bacterias viables. Finalmente la frecuencia de transducción fue calculada como: (Nº de transductantes Hig R - Nº de transductantes espontáneos Hig R ) / Nº de bacterias viables .

1.5.5. Detección y verificación de mutantes.

La comprobación de mutantes

originados por simple recombinación homóloga ó doble recombinación homóloga (KO) se llevó a cabo por PCR y/o southern blot: Se consideró, tanto las regiones cercanas al sitio delecionado (sitio activo de la quinasa), como la inserción en las cepas mutantes (casete res-Hig-res) para el diseño de cebadores que permitieron la amplificación

por PCR y

sondas de ADN para identificar por southern blot las regiones que diferencian las cepas mutantes de las cepas silvestres (ver en detalle las estrategias en los resultados). 2. Lisis y fraccionamiento celular. Las bacterias de los cultivos se recuperaron por centrifugación a 2500 g por 15 min. Posteriormente se lavaron (3 veces x 15 min) en PBS estéril, frío.

Las bacterias así

obtenidas se resuspendieron (2 ml/gr) en buffer de lisis [20 mM Tris, pH 7.6 conteniendo el cóctel de inhibidores de proteasas “Complete” (Roche) según indicaciones del fabricante]

El rompimiento bacteriano se realizó utilizando perlas de vidrio o zirconium como se describió en el capítulo I. En algunos casos esta lisis fue realizada utilizando el agitador Mini-Beadbeater, en lugar del vórtex, por 25” (3 veces) con intervalo de 3´ en hielo. El extracto obtenido fue esterilizado por filtros de 0.45 μm o en su defecto las bacterias intactas y detritus fueron eliminados por una centrifugación de 2-5 min a 4000 rpm (en microcentrifuga estándar).

125 3. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) e Inmunotinción (Western blotting-WB): Las fracciones de proteínas del extracto total y proteínas asociadas a la pared celular de los mutantes KO de PknD y las correspondientes fracciones en las cepas parentales (BCG y MT2D3) se sometieron al análisis de electrotransferencia e inmunotinción con el anticuerpo anti-PknD siguiendo la metodología descrita en el capítulo I. Pero en este caso el anticuerpo fue utilizado con una dilución menor (1:1000).

4. Ensayos de Actividad Quinasa: determinación de sustratos fosforilados endógenos y exógenos. 4.1. Electroforesis unidimensional.

Se estudió la fosforilación de sustratos

endógenos y exógenos en las fracciones de proteínas del extracto total y la fracción de proteínas asociada a la pared celular de las cepas silvestres y mutantes de M. bovis BCG y MT2D3, siguiendo las indicaciones de la metodología para los ensayos de actividad quinasa en el capítulo I. Además, el Mn+2 (2.5 mM) fue escogido como cofactor, dada la preferencia que las actividades Ser/Thr quinasas mostraron, por este ión, en los ensayos correspondientes en ambas cepas. En relación con la temperatura del ensayo, la temperatura ambiente, sin ortovonadato de sodio y NaF, fue la condición establecida. Brevemente, el ensayo estándar (50 μl) contenía: 40 μl de las fracciones aisladas con 10 μl de una mezcla de reacción que contenía: 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 2.5 mM MnCl2 y 50 μM ATP (γ- 32 P) (3000 cpm/pmol) (3000 Ci/mmol, Amersham o New England Nuclear). Se utilizó histona IIA (100 μg) como sustrato exógeno. La reacción se realizó 30 min. a temperatura ambiente, posteriormente se detuvo con buffer muestra 4X y finalmente, realizaron geles

SDS- PAGE

de gradiente (8-15 %) de acuerdo a lo señalado en el

capítulo I.

4.2. Electroforesis Bidimensional (2D-SDS- PAGE). Se estudió la fosforilación de sustratos endógenos en la fracción de proteínas asociadas a la pared celular de las cepas silvestres y mutantes de MT2D3 a través de ensayos quinasas, utilizando 100 μl de muestra (en presencia del buffer de lisis, ver punto 2) y 2.5 mM de MnCl2 . Después de 30 min de reacción a temperatura ambiente, las muestras fueron analizadas por geles de dos dimensiones (2D):

se

126 4.2.1. Primera dimensión. ™

realizó en el sistema Ettan

La primera dimensión de la electroforesis 2D se

IPGphor Isoelectric Focusing (Pharmacia Biotech).

Las

muestras del ensayo quinasa (100 μl) y 150 μl de Buffer de Rehidratación (8 M urea, 0.5 % (p/v) CHAPS, 0.2 % (p/v) DTT, 0.5 % (v/v)

Buffer IPG 4-7, 0.002 % azul de

bromofenol) se colocaron junto a tiras de gel de poliacrilamida seca (13 cm) de gradiente inmovilizado de pH 4-7 (Immobiline™ Drystrip de Amersham Biosciences) en canales de cerámica individuales.

La rehidratación y la primera dimensión se realizaron en un sólo

paso con las siguientes condiciones: 1) Rehidratación 14:00 h a 20 °C; 50 μA/tira. 2) 150 V; 300 Vh 3) 500 V; 500 Vh 4) 1000 V; 1000 Vh 5) 8000 V; 24000 Vh. Posteriormente las tiras se equilibraron (15 min.) en 10 ml del buffer de equilibrio (2 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M urea, 30 % (v/v) glicerol, 0.002 % azul de bromofenol, 100 mg DTT)

4.2.2. Segunda Dimensión. La segunda dimensión se realizó en geles SDS-PAGE (Lammeli, 1970) 10 % de poliacrilamida (30 % Duracryl; Genomic Solutions) a 120 V durante 4-5 h ó

8 mA toda la noche. La corrida electroforética fue detenida cuando el

frente de corrida salió del gel.

Los geles se colocaron después en una solución de

equilibrio (20 % metanol, 2 % glicerol, 10 % ácido acético) por 1h (como mínimo) antes de secarse. Los geles secos fueron expuestos en casetes del sistema PhosphoImager®SI (Molecular Dynamics) entre 4h ó toda la noche (según el caso) antes de detectarse dicha actividad en el instrumento Phosphoimager.

5. Espectrometría de masas e identificación de sustratos fosforilados. Esta metodología fue realizada en colaboración con el laboratorio del Dr. Yossef Av-Gay en la Universidad de British Columbia (Vancouver, Canadá).

El sustrato

fosforilado de interés, fue aislado del gel de 2D y sometido a digestión enzimática con tripsina:

127 Los puntos fosforilados o “spots” de interés fueron cortados del gel seco y se incubaron toda la noche, a temperatura ambiente,

en 200 μl de la solución (A) (1 M

NH4 HCO3 y 20 % acetonitrilo (v/v)). Luego, esta solución fue descartada y se añadió 200 μl de solución de lavado conteniendo 50 % metanol (v/v) y 5 % de ácido acético (v/v) por 2 h. Nuevamente, la solución fue descartada y se realizaron varios lavados con la solución (A). A continuación se añadió 200 μl de acetonitrilo 100 % por 5 min, y las piezas de gel fueron completamente deshidratadas en una centrifuga de vacío (2-3 min).

Para reducir

las proteínas, se añadieron 20 μl de 10 mM DTT durante 30 min y luego se continuó con la alquilación de las proteínas utilizando 100 mM iodoacetamida en 100 mM NH4 HCO3 por 30 min.

Se repitió el proceso de deshidratación de los fragmentos de gel añadiendo 200

μl de acetonitrilo 100 % por 5 min a temperatura ambiente. Los fragmentos del gel fueron rehidratados en 50 mM NH4 HCO3

a 4 ºC por 10 min.

Luego, las proteínas fueron

sometidas a digestión enzimática utilizando 30 μl de 20 ng/μl tripsina (modificada para secuenciación, Sigma) toda la noche a 37 ºC. Finalmente, la extracción de los péptidos se realizó por microcentrifugación utilizando 30 μl de NH4 HCO3 y un lavado con 30 μl de 10 % ácido fórmico.

El volumen de la muestra de péptidos fue reducido a 20 μl por

evaporación en una centrifuga de vacío a temperatura ambiente.

La muestra de péptidos obtenidos fueron enviados al servicio de espectrometría de masas en la Universidad de Dundee (Escocia) donde fueron analizados por ESI (Electrospray Ionisation), empleando la inyección directa en un espectrómetro LC/MS/MS 4000 Q Trap® (Applied Biosistems). Los resultados obtenidos fueron comparados con la base de datos de secuencia de proteínas no idénticas MSBS, diseñada específicamente para datos derivados de espectrometría de masas de proteínas (Proteomics Department at the Hammersmith Campus of Imperial College London) utilizando el programa MASCOT (Perkins

y

col.,

matrixscience.com)

1999)

contenido

en

el

servicio

de

Matrix

science

(www.

128

Resultados 1. Construcción de cepas mutantes Basándose en el protocolo propuesto por Bardarov y colaboradores (2002) la construcción de las cepas mutantes de BCG y MT2D3 siguió el esquema general señalado en la Fig. 49

y que contiene 4 pasos principales para la obtención de la cepa mutante

(KO):

1.1. Construcción de cósmidos recombinantes con el sustrato de intercambio alélico. El primer paso en la producción de las cepas mutantes KO consistió en el diseño y construcción de un adecuado sustrato de intercambio alélico que produciría la deleción de una parte del sitio activo (SA) de las quinasas PknD, PknI y PknK en el cromosoma micobacteriano y la subsecuente sustitución de esta área por un casete de resistencia a la higromicina en la cepa mutante correspondiente.

Este sustrato consistió en un fragmento

de ADN entre 5385 pb-5530 pb que contenía dos fragmentos menores (700-1000 pb) del gen blanco, ubicados direccionalmente a los lados

del casete de higromicina del vector

pYUB854 (fragmentos 1-2 y 3-4) (Ver paso 1, Fig.49).

Los cebadores utilizados para la

amplificación de los fragmentos homólogos (1-2 y 3-4) (Tabla 2), requeridos para la construcción del sustrato de intercambio alélico, fueron diseñados a partir del análisis realizado a las secuencias aminoácidicas de la quinasas, y las secuencias nucleotídicas correspondientes, que permitió ubicar, en el cromosoma de M. tuberculosis, los sitios activos de cada una de las quinasas seleccionadas.

En el cromosoma bacteriano, dichos

fragmentos limitan la región a ser escindida en el gen de interés, en especial el dominio VIb del sitio activo de cada quinasa. Esta región tuvo una longitud de 442 pb (gen pknD), 285 pb (gen pknI) y 258 pb (gen pknK) (Fig. 50) y sería sustituida en cada caso por una sección de 1919 pb que contiene el casete res-hig-res del cósmido pYUB854.

Debido a que la región genómica que codifica para el sitio activo de las quinasas seleccionadas está muy cercana al sitio de iniciación de cada gen, el fragmento correspondiente a esta zona (1-2) contenía regiones que no codifican para dichos genes (Fig. 50, representadas por líneas punteadas: ---) En cuanto a la presencia del promotor del gen en dicha zona, sólo para el gen pknK se esperaba, en teoría, la presencia del mismo pues el fragmento se extendió más de 300 pb por encima del inicio.

En el par de

fragmentos (1-2) de los genes pknD y pknI , a pesar de tener más de 300 pb por encima

129 del inicio,

los promotores respectivos estuvieron ausentes ya que estas quinasas forman

parte de operones (Av-Gay y Everett, 2000), cuyos promotores están muy por encima de las secuencias contempladas.

130

res-hig-res

pYUB854 Recombinante

1-2

3-4

Fásmido

res--hig- res

Sustrato de Intercambio alélico

1. CONSTRUCCION DEL CÓSMIDO RECOMBINANTE CON ELSUSTRATO DE INTERCAMBIO ALÉLICO

2. INTRODUCCIÓN DEL SUSTRATO DE INTERCAMBIO ALÉLICO EN EL FÁSMIDO

3. CONVERSIÓN DEL FÁSMIDO RECOMBINANTE EN MICOBACTERIÓFAGO

Micobacteriófago

Micobacteria

res -hig-res

ADN fásmido

res-hig-res SA PSTQ

CEPA MUTANTE (KO)

Fig. 49. Esquema general de la cons trucción de las cepas mutantes (KO).

Cromosoma bacteriano

4. TRANSDUCCIÓN ESPECIALIZADA E INTERCAMBIO ALÉLICO

131 Tabla 2. Cebadores

utilizados en la amplifación de los fragmentos para la

construcción de los cósmidos recombinantes.

PROTEÍNA

CEBADORES*

FRAGMENTO AMPLIFICADO (pb)

(D1): 5’-AATTTCTAGAAAGAGGTGCCGTCGATCATGC-3’

(Xba I) (D2): 5’-TATAGGTACCTCGTTTGCGGTGGGTAAGC-3’

PknD

1-2DKO ( 691)

(Kpn I) (D3): 5’-ATTAATGCATTCGGTGTCGGTGACATAGACG-3’

(Nsi I) (D4) 5’-ATTAAAGCTTTCAGGTGATCGCCAAAGGC-3’

3-4DKO (972)

(Hind III)

(I1): 5’-TATATCTAGAGACGTAGTCCATCGCAATCCAC-3’

(Xba I) (I2): 5’ -AATTAGGCCTACGACACCATCGCCTTGATG- 3’

PknI

1-2IKO (765)

(Stu I)

(I3): 5’-TATAATGCATTCTGCTTTGAGCGTTGGATCTC-3’

(Nsi I) (I4): 5’-TTAAAAGCTTTTGGCGCTTACCGCCATACAC-3’

3-4IKO (700)

(Hind III)

(K1): 5’-TATATCTAGATCTTGGCGTGGTAGGGCATC-3’

(Xba I)

(K2): 5’-TATAAGGCCTGGAGGAACTCGAAGAAAATGCG-3’

PknK

1-2KKO (797)

(Stu I) (K3): 5’-ATATATGCATATGCCAGTCGTCGATCACCACC-3’ (Nsi I) (K4): 5’-TTAAAAGCTTTTCTCGAAGGAGCATCGCCG-3’

3-4KKO (809)

(Hind III)

* El sitio del corte para la enzima de restricción se indica en rojo, más unas bases adicionales (azul). Los cebadores con sitios de corte para StuI fueron modificados posteriormente (ver modificación fragmentos PCR)

132

(pb)

-600

-300

1

300

600

800

1100

1400

1700

2000

2300

2600

2900

3200

3500

* 1-2DKO

3-4DKO

PknD 1995 pb (664 aa) Deleción de 442 pb. aa: 100-247 (dominios VIa, VIb , VII, VIII y IX) PknI 1758pb (585 aa)

1-2IKO

3-4IKO

Deleción de 285 pb. aa: 93-187 (dominios VIa , VIb , VII, VIII y IX)

PknK 3333 pb (1110 aa)

1-2KKO

3-4KKO

Deleción de 258 pb. aa: 109-194 (dominios VIa, VIb , VII y VIII)

Fig. 50. Esquema de las regiones genómicas de las quinasas PknD, PknI y PknK seleccionadas para las construcciones genómicas para producir la deleción cromosómica en el intercambio alélico. Los fragmentos amplificados (rojo y azul) (ver tabla 1) limitan la parte eliminada del gen (flecha negra) que fue sustituida posteriormente por un casete de resistencia a la higromicina. El esquema fue considerando la base (*) que da inicio a la región codificante (línea negra). La línea punteada en verde (......) son regiones genómicas no codificantes para la quinasa. Los dominios señalados son los dominios de la región catalítica descritos para las proteínas Ser/Thr quinasas por Hanks y Quinn (1991). aa: aminoácidos; pb: pares de bases

133 La Fig. 51 muestra la estandarización de la t.a. de la PCR para la amplificación de cada fragmento señalado en la Tabla 2. En todos los casos, los cebadores utilizados amplificaron en todas las temperaturas analizadas y se escogió la temperatura de 66.9 ºC como t.a. para la amplificación de todos los fragmentos.

A

B

PknD 1-2DKO

PknI

3-4DKO

1-2IKO

3-4IKO

(pb) (pb) 1929, 2323 1264, 1371 -

2323, 19291264, 1371-

702-

T A.(ºC)

702-

60.2 60.6 62.0 65.2 66.9 60.2 62.0 65.2 66.9

C

T A.(ºC)

60.2 62.0 65.2 66.9 60.2 62.0 63.1 65.2 66.9

D

PknK

PknK

1-2KKO

3-4KKO

(pb) (pb) 1929, 23231264, 1371-

16361018-

702 -

T A.(ºC)

506-

60.2 62.0

65.2

66.5

66.9

T A.(ºC)

60.2 62.0 65.2 66.9

Fig. 51. Estandarización de las condiciones de PCR (temperatura de alineamiento) para la amplificación de los fragmentos genómicos de las quinasas PknD, PknI y PknK utilizados para la construcción del sustrato de intercambio alélico. Se utilizó un gradiente de temperatura (60 ºC – 67 ºC) para determinar la temperatura de alineamiento (t. a.) óptima de los cebadores específicos (ver tabla 1) en condiciones de la PCR estándar para la amplificación de los fragmentos 1-2DKO (~691 pb) y 3-4DKO (~972 pb). (Quinasa PknD) (A). Fragmentos 1-2IKO (~765 pb) y 34IKO (~700 pb) (Quinasa PknI) (B). Fragmentos 1-2KKO (~797 pb) y 3-4KKO(~809 pb) (Quinasa PknK) (C) y (D). Los estándares de peso molecular (pb) son señalados a la izquierda de cada figura.

Una vez que los fragmentos correspondientes a cada quinasa fueron amplificados, se clonaron en el vector pYUB854, construyéndose un cósmido recombinante en cada caso (Fig. 52).

134

PSTQ (cromosoma) sa

C-terminal C3

N-terminal C1

C4

C2

Hyg

Amplificación + Ligación

Amplificación + Ligación pYUB854 3893 pb

Hyg

(HindIII)C4

(NsiI) C3

pYUB854 Recombinante (5411pb-5556 pb)

C1 (XbaI)

C2 (KpnI)

Fig. 52. Esquema re presentativo de la construcción de cósmidos recombinantes con el sustrato para el intercambio alélico. Los extremos de la sección genómica correspondiente al sitio activo (sa) de la proteína Ser/Thr Quinasa (PSTQ), a ser sustituida por el gen que confiere resistencia a Higromicina (Hig), se amplificaron con los pares de cebadores correspondientes (C1C2, C3-C4) descritos en la Tabla 2. Estos fragmentos fueron clonados en el cósmido pYUB854, siguiendo la dirección amino-carboxi según se encuentran en el gen, para obtener el cósmido recombinante en cada caso. El extremo N-terminal y C-terminal de la proteína son señalados aquí sólo para indicar la orientación de cada fragmento en la proteína y no representan una determinada posición.: Sólo se muestran las enzimas (del sitio de clonaje múltiple) utilizadas en el clonamiento.

135 La clonación de estos fragmentos se realizó secuencialmente en dos pasos, incorporando un fragmento a la vez en el vector: Una vez que se había clonado uno de los fragmentos, el cósmido fue obtenido de la colonia correspondiente y éste fue utilizado como vector para clonar el segundo fragmento.

La clonación de los fragmentos 1-2IKO (765 pb) y 1-2KKO (797 pb) tuvo la modificación de los mismos como paso previo:

En el estudio, se escogieron el par de

enzimas XbaI- StuI para clonar los fragmentos, pero esto debió ser corregido porque el en el vector pYUB854, el sitio de corte para StuI se encuentra entre dos sitios, muy cercanos, para XbaI (lo que no había sido percibido).

Al tratar de clonar los fragmentos

mencionados, el sitio para XbaI en el vector fue eliminado por los cortes de StuI. Dado que los fragmentos habían sido amplificados,

se decidió clonar estos fragmentos en el

sistema de TOPO TA –cloning (vector pCR2.1-TOPO) para producir un nuevo sitio de restricción. En este caso StuI fue sustituido por el corte de KpnI. Como resultado de este procedimiento, los fragmentos generados poseen 53 pb, aproximadamente, más que los originales y varios sitios internos de corte para otras enzimas (Fig. 53). Así los tamaños de 1-2IKO y 1-2KKO se transformaron en 818 pb y 850 pb respectivamente KpnI

KpnI

SacI BamHI

SpeI

StuI

XbaI

BstXI

EcoRI

G GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA GTA ACG GCC GCC AGT GTG CTG GA A TTC GCC CTT C CAT GGC TCG AGC CTA GGT GAT CAT TGC CGG CGG TCA CAC GAC CTT AAG CGC GA A

Fig. 53. Modificación de fragmentos de PCR con el sitio de corte para StuI utilizados en la construcción del sustrato de intercambio alélico.

Después de la selección, por PCR, de las colonias probables de poseer el cósmido recombinante con ambos fragmentos, se hizo un aislamiento plásmídico y los cósmidos obtenidos fueron digeridos con las enzimas utilizadas en el clonamiento: el par XbaI/KpnI para los fragmentos 1-2 y el par HindIII/NsiI para los fragmentos 3-4 para comprobar la presencia, en cada caso, de los fragmentos en la construcción.

La Fig. 54, muestra el

136 análisis realizado a los cósmidos seleccionados pYD15 (5556 pb), pYI07 (5411 pb) y pYK113 (5552 pb) y que presentaron los fragmentos esperados: 1-2DKO / 3-4DKO; 12IKO / 3-4IKO y 1-2KKO / 3-4KKO respectivamente.

B

C

-

(pb)

(pb)

(pb)

6000-

6000-

6000-

30002000-

3000-

3000-

2000-

2000-

1000650-

3- 4DKO 1- 2DKO

1000650-

1-2IKO 3-4IKO

1000-

HinIII/NsiI

-

PYK113 HinIII/NsiI

HinIII/NsiI

XbaI/KpnI

-

XbaI/KpnI

PYI07

PYD15

XbaI/KpnI

A

1- 2KKO 3- 4KKO

650-

Fig. 54. Digestión enzimática de los cósmidos recombinantes con los sustratos para el intercambio alélico de las quinasas PknD, PknI y Pknk. Los plásmidos recombinantes pYD15 (A), pYI07(B) y pYK113(C) fueron digeridos con las enzimas XbaI/KpnI y HindIII /NsiI para comprobar la presencia del sustrato de intercambio alélico correspondiente a través de la liberación de los fragmentos específicos señalados con flechas(←): 1-2DKO / 3-4DKO (A), 1-2IKO / 3-4IKO (B), 1-2KKO / 3-4KKO (C). El plásmido respectivo, sin digerir, se indica con signo negativo(-). Los estándares de peso molecular (pb) son señalados a la izquierda de cada figura.

1.2. Introducción del sustrato de intercambio alélico en un fásmido. Después de la selección y confirmación de los cósmidos recombinantes, pYD15, pYI07 y pYK113, éstos fueron extraídos de las cepas correspondientes.

El siguiente paso fue colocar el

sustrato de intercambio alélico, presente en cada cósmido recombinante, en el vector fasmídico phAE87 para construir el fásmido recombinante correspondiente (Ver paso 2. Fig.49)

Los fásmidos recombinantes fueron obtenidos como resultado de la ligación entre el vector fasmídico phAE87 y el cósmido recombinante, previamente digeridos con la enzima Pac I, seguido del empaquetamiento de esta mezcla de ligación en cabezas de fago λ y la posterior transducción de la cepa HB101 de E. coli (Fig. 55)

137

ADN phAE87

PacI

PacI

(LIGACIÓN)

+ SUSTRATO DE INTERCAMBIO ALÉLICO

res-hig -res

PacI PacI

PacI

PacI

1. Empaquetamiento 2. Transducción (HB101)

HB101 (Hig R)

FÁSMIDO RECOMBINANTE res-hig -res

Fig. 55. Esquema representativo de la generación de fásmidos recombinantes. El fásmido phAE87 y el cósmido recombinante (vehículo del sustrato de intercambio alélico) digeridos previamente con PacI, fueron ligados en una proporción 10 (phAE87) :1 (ADN cósmido). La mezcla fue empaquetada en cabezas de fago λ y posteriomente usada para la transducción de E. coli HB101 (HB101), obteniéndose colonias resistentes a la higromicina (Hig R) de donde se extrajo los fásmidos recombinantes.

138 Tres fásmidos recombinantes denominados EFI1,

EFD24

y EFK13, fueron

extraídos y seleccionados como vectores fasmídicos para el intercambio alélico de las quinasas PknI, PknD y PknK, respectivamente.

1.2.1. Fásmido EFI1. De la transducción de la cepa E. coli HB101 con la mezcla de ligación-empaquetamiento de phAE87 y el cósmido pYI07 se obtuvieron sólo dos colonias transductantes resistentes a la higromicina (HigR), de las cuales se aisló el ADN fasmídico (en forma de cósmido). Estos cósmidos fueron digeridos con la enzima PacI (Fig. 56-A).

Sólo el fásmido proveniente de la colonia 1 (EFI1) liberó el fragmento

esperado (∼5385 pb) para el sustrato de intercambio alélico (SIA).

Para comprobar la

identidad de EFI1, el ADN de este cósmido se utilizó como sustrato en la amplificación por PCR de los fragmentos esperados en el SIA de PknI (1-2IKO y 3-4IKO) (Fig. 56-B). Los resultados mostraron que EFI1 efectivamente poseía los fragmentos del gen pknI

Colonia 1 (EFI1) E

-

+

B

Colonia 2 (EFI2)

-

E

+

1-2IKO

+

EFI1

3-4IKO

+

EFI1

3-4IKO

A

1-2IKO

utilizados para la construcción del sustrato de intercambio alélico.

-

-

pb

pb

2313043612322, 202712000-

SIA 5000-

564 -

2000-

Fig. 56. Selección y verificación del fásmido recombinante EFI1. A) Digestión del ADN de los fásmidos (en forma de cósmidos) provenientes de las colonias (transductantes) (1) y (2). El ADN de los fásmidos correspondientes (-) fue digerido con PacI (+) para evaluar la presencia del sustrato de intercambio alélico (SIA; ∼5385 pb) de la quinasa PknI B) Amplificación de los fragmentos 12IKO (818 pb) y 3-4IKO (700 pb) del ADN del fásmido recombinante de la colonia 1(EF1). Se utilizó el ADN de la genoteca de H37Rv como control positivo (+) en cada caso. También se muestran los controles negativos (-), sin ADN, para cada par de cebadores. E: estándar 1Kb PLUS DNA LADDER (A); λ HindIII (B).

139 1.2.2 Fásmido EFD24. A diferencia de lo observado con el cósmido pYI07, la transducción de la cepa E. coli HB101 con la mezcla de ligación-empaquetamiento de phAE87 y el cósmido pYD15 resultó en un número mayor (no contado, pero cercano a 100) de transductantes (HigR). En este caso se analizó primero el lisado de 29 colonias por PCR para determinar la presencia de uno de los fragmentos del sustrato de intercambio alélico de PknD (1-2 DKO). La Fig. 57-A muestra el análisis de nueve (20-28) de estas colonias. A continuación se escogieron tres de las colonias que resultaron positivas (24, 25 y 26) y se aisló el ADN fasmídico correspondiente, el cual fue digerido con la enzima PacI (Fig 57-B). Sólo los fásmidos EFD24 y EFD25 liberaron el fragmento esperado para el SIA (∼5530 pb). Estos fásmidos también mostraron la presencia del fragmento 3-4 DKO (resultados no mostrados). El fásmido EFD24 fue seleccionado para el siguiente paso de la

E

20

21

22

23

24 25

26

27

E

28

EFD26

B

EFD25

A

EFD24

construcción de cepas mutantes.

pb

pb

*

SIA

120005000-

1650-

2000-

1000850650-

1- 2 DKO+

Fig. 57. Selección y verificación del fásmido recombinante EFD24. (A) Amplificación, por PCR, del fragmento 1-2DKO (691 pb) del gen de la quinasa PknD a partir de los lisados de las colonias de la cepa E. coli HB101 transducidas por el cósmido pYD15. Se utilizó el ADN de la genoteca de H37Rv como control positivo de la amplificación del fragmento(*) B) Los fásmidos EFD24, EFD25 y EFD26 fueron extraidos de las colonias respectivas (24, 25 y 26) y digeridos con PacI para comprobar la presencia del sustrato de intercambio alélico (SIA) de la quinasa PknD (en las colonias 24 y 25 solamente). Se resalta la colonia 24 por contener el fásmido seleccionado (EFD24). E: estándar 1Kb PLUS DNA LADDER (pb).

1.2.3. Fásmido EFK13. La transducción de E.coli HB101 con la mezcla de ligación-empaquetamiento

phAE87

con

el

cósmido

pYK113,

arrojó

numerosos

140 transductantes HigR, (no contados).

Se analizaron por PCR los lisados de 21 colonias.

Entre las colonias positivas para la amplificación del fragmento 1-2KKO, se seleccionó aleatoriamente la colonia 13 (Fig. 58-A). El lisado de esta colonia también resultó positivo para el fragmento 3-4 KKO (resultados no mostrados).

Posteriormente, el ADN famídico

de este transductante, denominado EFK13, fue aislado y digerido con PacI. Los resultados mostraron que EFK13 contenía el SIA correspondiente (∼5526 pb) (Fig. 58-B)

A

B E

9 10 11 12 13 14 15

+

pb

pb

E

EFK13

2313094166557-

16501000850650-

1-2KKO

SIA

436123222027-

Fig. 58. Selección y verificación del fásmido recombinante EFK13. A partir de los lisados bacterianos de las colonias HygR , se amplificó el fragmento 1-2KKO (∼850 pb) (A) Se utilizó el ADN de la genoteca de H37Rv como control positivo (+) de la amplificación del fragmento. También se indica el control negativo (-) (sin ADN). La colonia 13 fue seleccionada (señalada en rojo) para el aislamiento del ADN del fásmido EFK13, el cual fue digerido con la enzima PacI (B) E: estándar 1Kb PLUS DNA LADDER (pb).

141 1.3. Conversión del fásmido recombinante en micobacteriófago.

La

transfección de M. smegmatis (Fig. 59) a través de la electroporación de esta cepa con cada uno de los fásmidos recombinantes señalados (EFD24, EFI1 y EFK13) y el crecimiento a la temperatura permisiva para la lisis del fago (30 ºC), permitió que cada fásmido, aislado de E. coli HB101 en forma de cósmido, fuese convertido en fago de transducción especializada (ver paso 3. Fig.49)

FÁSMIDO RECOMBINANTE (aislado de E. coli como cósmido)

res-hig -res

ELECTROPORACIÓN

Fásmido

Cromosoma M. smegmatis

30ºC

Replicación del fásmido como fago y empaquetamiento

LISIS

Micobacteriófagos (vector fasmídico)

Fig. 59. Representación esquemática de la conversión del fásmido en micobacteriófago.

142 En el caso de la electroporación con el fásmido EFI1 se obtuvieron numerosas placas líticas (incontables), seguido por un número relativamente alto para el fásmido EFD24 (no determinado, cercano a 100) y relativamente bajo para el fásmido EFK13 (16 colonias).

Para determinar el fenotipo termosensible, (crecimiento a 30 ºC pero no a 37 ºC) se analizaron 26 (EFI1), 34 (EFD24) y 16 (EFK13) placas. De éstas, se seleccionaron las colonias 24, 32 y 13, respectivamente, las cuales no mostraron crecimiento a 37 ºC. fagos fueron aislados del agar y

se prepararon lisados con un título alto (FTA).

Los La

denominación para cada uno de estos fagos fue FI24, FD32 y FK13. La Fig. 60 muestra, de forma demostrativa, las placas de las cuales se preparó un lisado de los fagos FD32 y FK13 con un título alto A

B

Fig. 60. Preparación del micobacteriófago con título alto (FTA). Placas demostrativas de la expansión del título de los micobacteriófagos recombinantes FD32 (A) y FK13 (B)

Los títulos (T) de los fagos FD32, FI24 y FK13 fueron calculados a partir de diluciones seriadas y crecimiento a 30 ºC (Fig 61-A, 62-A y 63-A).

Aunque en la

determinación del fenotipo termosensible de cada uno de los fagos mencionados no se visualizaron placas líticas a 37 ºC, sin embargo se realizó una titulación a esta temperatura (además de 30 ºC) para determinar la población de fagos revertantes (no-termosensibles) no detectados inicialmente en la colonia (Fig. 61-B, 62-B y 63-B).

143

A

B

0

-2 -6 -2

-4

-8 -8 -6

-4

T: 8.2x1011 UFP/ml

T: 1.2x105 UFP/ml

Fig. 61. Determinación del título del Micobacteriófago recombinante FD32 y el título del micobacteriófago revertante (no termosensible). Se utilizaron 10 μl de diluciones 10-2 , 10-4 10-6 10-8 del fago original (100 ) para determinar el título del fago por el crecimiento a 30 ºC (A) y el título de fago no termosensible por su crecimiento a 37 ºC (B).

A

B

0

0

-2 -8

-4

-2 -8

-6 -4

T: 1x1010 UFP/ml

-6

T: 6x104 UFP/ml

Fig. 62. Determinación del título del micobacteriófago recombinante FI24 (30ºC) y el título del micobacteriófago revertante (no termosensible) (37ºC). Se utilizaron 10 μl de diluciones 10-2 , 10-4 10-6 10-8 del fago original (100 ) para determinar el título del fago por el crecimiento a 30 ºC (A) y el título de fago revertante por su crecimiento a 37 ºC (B).

144

A

B

0 0

-2

-8

-2

-8

-6 -4

-4

T: 1x1010 UFP/ml

-6

T: 3x104 UFP/ml

Fig. 63. Determinación del título del micobacteriófago recombinante FK13 (30 ºC) y el título de la población revertantes (no termosensible) (37 ºC). Se utilizaron 10 μl de diluciones 10-2 , 10-4 10-6 10-8 del fago original (100 ) para determinar el título del fago por el crecimiento a 30 ºC (A) y el título de fago revertante por su crecimiento a 37 ºC (B).

Así en la determinación del título de cada lisado se calculó el título de la población termosensible (T)

y no termosensible (Tnt) y se determinó la proporción en que se

encontraba ésta última (Fnt/FTA) (Tabla 3).

Tabla. 3. Título de poblaciones termosensibles y no termosensibles de los micobacteriófagos recombinantes. FAGO FD32 FI24 FK13

TÍTULO (UFP/ml) (T) 30 ºC (Tnt) 37 ºC 8.2x1011 1.2 x105 10 1x10 0.6 x105 1x1010 0.3 x105

Frecuencia de revertantes Tnt / T 0.2 x10-6 6 x10-6 3 x 10-6

Tnt: Título de la población revertante no termosensible, determinado por el crecimiento a 37 ºC T: Título del fago determinado por el crecimiento a 30 ºC UFP/ml: Unidades formadoras de placas por ml de lisado del fago.

El fago FD32 tuvo el mayor título (T) (8x1011 ), mientras FI24 y FK13 registraron un título 80 veces menor. Sin embargo todos los valores a 30 ºC estuvieron dentro de lo requerido para la posterior infección (ver metodología: transducción especializada). Aunque en todos los fagos se registraron poblaciones no termosensibles, en ninguno de los casos se consideró este hecho como un serio obstáculo para la introducción del sustrato de intercambio alélico dentro de la micobacteria, pues estas poblaciones se encontraron en

145 una proporción muy baja con respecto a las poblaciones termosensibles. En el peor de los casos (FI24), se detectaron seis (6) fagos no termosensibles por cada millón (106 ) de fagos termosensibles (6:106 )

Por último, se aisló el ADN de cada uno de los fagos y se digirió con la enzima PacI para verificar la presencia del sustrato de intercambio alélico antes de ser utilizados en la transducción. La digestión del ADN de los fagos mostró la liberación de fragmentos en los tamaños esperados: ∼5530 pb (FD32); ∼5.385 pb (FI24) y ∼5526 pb (FK13), que en todos los casos fueron superiores al liberado por el ADN del vector phAE87 (3700 pb) (Fig. 64).

E

phAE87

FD32

FI24

FK13

pb 84546369-

SIA

48223675232319291371 1264 -

Fig. 64. Presencia del sustrato de intercambio alélico en los micobacteriófagos FD32, FI24 y FK13. El ADN de los fagos FD32, FI24 y FK13 fueron digeridos con la enzima Pac I para comprobar la presencia del sustrato de intercambio alélico (SIA). Se utilizó el ADN del fago phAE87 como control del vector fasmídico. E: estándar λ BstEII

146 1.4. Transducción especializada, selección y confirmación de mutantes. 1.4.1. Transducción especializada. El último paso para la producción de las cepas mutantes (KO) lo constituyó la transducción especializada de los fagos construidos con las cepas silvestres de BCG y MT2D3. (Ver paso 4. Fig. 49). El número de transductantes HigR (UFC/ml) obtenido en el proceso de infección de cada uno de los fagos recombinantes con las cepas silvestres BCG y MT2D3 se refleja en la Tabla 4. Es importante señalar que para la infección de los tres fagos se utilizó el mismo cultivo de BCG ó MT2D3 según el caso. En el proceso de transducción, el fago FI24 produjo el mayor número de transductantes en MT2D3 (748), mientras que el fago FK13 produjo el número menor de transductantes (1) en la misma cepa. Es de resaltar el bajo número de transductantes en MT2D3 después de la infección con el fago FK13, pues en una infección previa de la cepa con el mismo fago no arrojó ningún transductante.

En

la deteminación de transductantes HigR espontáneos sólo se obtuvo 1UFC/ml en la cepa patógena con una frecuencia de 3x10-9 . Tabla 4. Número y Frecuencia de transductantes obtenidos en el proceso de infección de las cepas BCG y MT2D3 MICOBACTERIÓFAGO

TRANSDUCTANTES BCG UFC/ml

FD32 FI24 FK13

67 44 100

MT2D3

Frecuencia -7

1.7 x10 1.1 x10-7 2.5 x10-7

UFC/ml

Frecuencia

12 748 1

4 x10-8 2.5 x10-6 < 10-8

El control de viabilidad bacteriana en la infección arrojó 3 x 108 UFC/ml para MT2D3 y 4x108 para BCG. La frecuencia de mutantes espontáneas Hig R fue 3x10-9 UFC/ml para MT2D3 y cero para BCG.

En el proceso de transducción, que permitió la introducción del sustrato de intercambio alélico para el reemplazamiento génico, se esperaron teóricamente tres (3) tipos de mutantes, dos de ellos producto de la simple recombinación homóloga y uno de la doble recombinación homóloga que daría origen al gen KO (Fig. 65)

Debido a que la sección a reemplazar se encontraba cercana al sitio de iniciación del gen, los

fragmentos utilizados en la construcción podrían producir dos eventos,

147 independientes y diferentes, de recombinación simple.

En uno de ellos (Fig. 65-A) se

obtendría una copia silvestre del gen en el cromosoma (además de la inserción del fásmido recombinante) y en la otra (Fig. 65-B) se produciría una copia truncada del gen con el sitio activo intacto, pero carente de la región carboxiterminal .

En el caso de PknD se eliminarian 283 pb; 94 aa (aminoácidos 571-663).

En PknI

habría una deleción de 1497 pb lo que representa 165 aa (aminoácidos 421-585) y por último la quinasa PknK tendría la mayor deleción con 1947 pb (646 aa) constituida por los aminoácido 465-1110.

La doble recombinación homóloga sólo tendría como resultado el reemplazo alélico del sitio activo de la quinasa por el casete res-hig-res presente en el fásmido correspondiente, originándose así el gen mutante (KO). En consecuencia ninguna copia silvestre completa o truncada está presente en una cepa KO:

A este tipo de mutante se le

denominó mutante doble (por doble recombinación) (Fig.65-C).

Los otros tipos de

mutantes visualizados en (A) y (B) se les denominó mutantes simples (simple recombinación). En este estudio no se discriminó en el tipo de mutante simple. Pero es de hacer notar que sólo en el caso de PknK se esperaría una copia silvestre funcional, pues PknI y PknD forman parte de operones (Av-Gay y Everett, 2000) y sus promotores no fueron contemplados en la zona de recombinación (rojo) propuesto en el esquema.

148

B

A

res-hig-res

res-hig-res

CROMOSOMA-FÁSMIDO

SA

SA CROMOSOMA-MICOBACTERIA

PSTQ

PSTQ

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA SIMPLE CROMOSOMA-MICOBACTERIA res- hig-res

SA

SA

res-hig-res

Copia truncada PSTQ.

Copia silvestre PSTQ

C

CROMOSOMA-FÁSMIDO

res -hig -res

CROMOSOMA-MICOBACTERIA

SA PSTQ

DOBLE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA res - hig -res

CROMOSOMA-MICOBACTERIA

Fig. 65. Esquema respresentativo de los posibles eventos de recombinación entre el cromosoma de BCG / MT2D3 y los sustratos de intercambio alélico presentes en el fásmido recombinante durante el proceso de transducción. A) Evento de recombinación homóloga simple donde participa el fragmento 1-2 de la construcción (rojo) que da lugar a una copia del gen. La sección con rayas horizontales del fragmento rojo corresponde a regiones génicas distintas al gen de la quinasa. B) Evento de recombinación homóloga simple donde participa el fragmento 3-4 (azul) de la construcción y que da origen a una copia truncada de la quinasa. C) evento de recombinación homóloga doble que da lugar al intercambio alélico y origen al mutante doble (KO). SA: sitio activo de la quinasa. PSTQ: gen que codifica para la proteina serina/treonina quinasa. res-hig-res: casete que codifica para la resistencia a la Higromicina.

149 1.4.2. Selección y confirmación de mutantes KO. El siguiente paso, después de la aparición de los transductantes HigR, consistió en buscar entre estas colonias aquéllas que resultasen cepas KO para cada quinasa, discriminando los mutantes simples. tomaron varias

Se

colonias para cada quinasa para realizar una selección rápida de los

posibles candidatos KO a través de una PCR con los lisados bacterianos provenientes de las mismas.

La selección por PCR no siempre resultó sencilla, pues en algunos casos los pares de cebadores seleccionados amplificaban en BCG y no en MT2D3 (y viceversa). En otros resultados

mostraban además de los fragmentos esperados, también reacciones

inespecíficas.

Por eso la comprobación definitiva de los mutantes KO se realizó por

Southern Blot. En cada caso se procedió primero a una primera selección por PCR de los posibles

mutantes

utilizando

los

cebadores

apropiados

y

luego

los

candidatos

seleccionados fueron confirmados por Southern blot utilizando sondas específicas (tabla 5 y 6)

150

Tabla. 5. Estrategias para la detección y verificación de mutantes de MT2D3 y BCG.

Estrategia para la Detección de Mutantes Proteína

Cepa

PCR

Quinasa

Cebadores

Southern blot

Fragmento (kb) S KO

Enzimas de

Sonda

MT2D3

PknD

BamHI D2-D3

2.105

3.584

D2-D3

2.105

3.584

1.75

3.386

1-2DKO

BCG

PknI

BamHI

MT2D3 I2-I3

1-2IKO

BamHI

3.386

MT2D3 K1g-K2g

3.896

4.553

NA

K1g-K2g

3.896

4.553

NA

NA

0.779

BCG

I2-I3

1-2DKO

1.75

BCG

PknK

Restricción

GEN DE HIGROMICINAR HR-HF

NA: No Aplica; S: cepa silvestre; KO: cepa KO

1-2IKO

XhoI

NA

Fragmento (kb) S KO 1.95 3.42 0.83

0.83

1.95

3.42

0.83

0.83

0.57

2.8

0.87

0.42

2.90

4.54

151

Tabla 6. Cebadores utilizados en la estrategia por PCR para la detección de cepas mutantes de MT2D3 y BCG.

Proteina Quinasa

PknD

PknI

PknK

GEN DE

Cebadores utilizados en la Estrategia por PCR D2: 5’-TATAGGTACCTCGTTTGCGGTGGGTAAGC-3’ (Kpn I) D3: 5’-ATTAATGCATTCGGTGTCGGTGACATAGACG-3’ (Nsi I) I2: 5’ -AATTAGGCCTACGACACCATCGCCTTGATG- 3’ (Stu I) I3: 5’-TATAATGCATTCTGCTTTGAGCGTTGGATCTC-3’ (Nsi I) I2: 5’ -AATTAGGCCTACGACACCATCGCCTTGATG- 3’ (Stu I) I3: 5’-TATAATGCATTCTGCTTTGAGCGTTGGATCTC-3’ (Nsi I) K1g: 5’-ATATTCTAGACTGCGTGTTGACGGGAATATG-3’ (Xba I) K2g: 5’-ATATTCTAGACGAGATGGTTGGCGGTTTTG-3’ (Xba I) K1g: 5’-ATATTCTAGACTGCGTGTTGACGGGAATATG-3’ (Xba I) K2g: 5’-ATATTCTAGACGAGATGGTTGGCGGTTTTG-3’ (Xba I) HR: 5’-CCCTGTTACTTCTCGACCGTATTG-3’

HIGROMICINAR HF: 5’-GAAGGCGTTGAGATGCAGTTG-3’

1.4.2.1 PknD: Selección y confirmación de las cepas mutantes BD2 y KOD5. En la Fig. 66 se muestra el análisis por PCR, realizado a varios transductantes obtenidos en la infección del fago FD32 en la cepa MT2D3. Los transductantes fueron designados con las iniciales KOD, seguidas del número de la colonia.

El diseño de la estrategia utilizada se muestra en la Fig 66-A. Utilizando el par de cebadores D2/D3, el mutante KOD5 fue seleccionado, aleatoriamente, por mostrar características de cepa KO: amplificación exclusiva del fragmento esperado en el KO (3.584 kb) y ausencia del fragmento de 2.105 kb correspondiente al gen en la cepa silvestre (S) (Fig 66-B). Para confirmar que KOD5 no era un mutante espontáneo se determinó la presencia del gen de higromicina a través de la amplificación del mismo (0.779 kb) con el par de cebadores HF/HR, la cual resultó positiva (Fig. 66-C).

152

pknD

A

2.105 Kb

S

SAD

1-2DKO

3-4DKO

D2

D3

HR

D2

KO

1-2DKO

res

HF

-hig -

D3

res

3-4DKO

0.779 Kb

3.584 Kb

B

C KOD5 2D3 KOD5 KOD7 +

2D3

kb

kb 1.00.750.5-

KOD7

0.779 kb

4.3612.322-

3.584Kb 3.584 2.105Kb

Fig. 66. Detección por PCR de las cepas mutantes obtenidas en el proceso del intercambio alélico de pknD en MT2D3. A) Estrategia utilizada para amplificar con distintos cebadores regiones del gen en la cepa silvestre(S) y del gen de la cepa KO (KO) con los cebadores apropiados (ver tabla 5 y 6). Los fragmentos utilizados en la construcción del sustrato de intercambio alélico se encuentran indicados: 1-2DKO (rojo) y 3-4DKO (azul). El Sitio Activo de la quinasa PknD (SAD; negro) en S. También se indican los cebadores utilizados para determinar la presencia del gen de la resistencia a la Higromocina (hig) en el KO. Las líneas transversales punteadas señalan la posición relativa del gen pknD en S. B) PCR con el par de cebadores D2/D3 en las cepas KOD5 y KOD7. C) Detección del gen hig por PCR en la cepa KOD5 y KOD7. El plásmido pYUB854 se utilizó como control positivo (+). Se resalta en rojo la cepa escogida como cepa KO para los análisis subsiguientes

153 Las cepas mutantes de BCG se denominaron por las iniciales BD seguidas del número de la colonia. El análisis por PCR de estos mutantes se muestra en la Fig. 67. La estrategia diseñada se encuentra representada en la Fig. 67-A. En ésta se destaca que el gen para PknD está truncado tal como lo señala la literatura (Peirs y col. (2000) y se encuentra

registrado

en

la

base

(http://www.genolist.pasteur.fr/tuberculist/) como pknDa

de

datos

Tuberculist

(291 aa). Con respecto a la

construcción genómica, el fin de la proteína se encuentra dentro del fragmento 3-4DKO. La Fig 67-B muestra la amplificación del fragmento esperado en el KO (3.584 kb) en la cepa BD2 con el par de cebadores D2/D3, mientras que en la cepa BD5, sólo se presenta el fragmento esperado en el gen de la cepa silvestre (2.105 kb). La cepa BD2 fue seleccionada como posible KO. La presencia del gen de higromicina en estas cepas fue verificada con la amplificación del fragmento correspondiente (0.779 kb) utilizando los cebadores HR/HF (Fig. 67-C). Por otra parte, BD5 parece ser un mutante simple.

El análisis por Southern blot (Fig 68), permitió la confirmación de las cepas BD2 y KOD5 como cepas KO. Así mismo se pudo comprobar la presencia de mutantes simples como el caso de BD5 donde claramente se observó la presencia simultánea del fragmento esperado en el gen de la cepa silvestre y en el gen del KO. La cepa KOD7 posiblemente también es un mutante simple (aunque el resultado por PCR no mostró claramente el fragmento del gen silvestre), porque presentó un fragmento ligeramente menor que el fragmento esperado para el gen en la cepa silvestre, además del fragmento del gen en el KO.

Con respecto al fragmento de 0.83 kb común tanto en la cepa silvestre como en el KO, la sonda tiene una zona de homología de 61 pb y se observó claramente en los mutantes de BCG, pero dudosamente en los mutantes de MT2D3.

154

A

pknDa

2.105 Kb

S

1-2DKO

3-4DKO

SAD

D2

D2 1-2DKO 1-

KO

D3

HR

res

HF

-hig-

D3

res

3-4DKO

0.779 Kb

3.584 Kb

B

C kb 10432.5-2.0-1.5--

E

BD2 BD5 BCG

kb

3.584 Kb 2.105 Kb

1.5 1.0 0.75 0.5 -

E

+

BCG BD2

BD5 0.779 Kb

Fig. 67. Detección por PCR de cepas mutantes obtenidas en el proceso del intercambio alélico de pknDa en BCG. A) Estrategia utilizada para amplificar con distintos cebadores regiones del gen en la cepa silvestre(S) y del gen de la cepa KO (KO) con los cebadores apropiados (ver tabla 5 y 6). Los fragmentos utilizados en la construcción del sustrato de intercambio alélico también se encuentran indicados 1-2DKO (rojo) y 3-4DKO (azul). También se indican los cebadores utilizados para determinar la presencia del gen de la resistencia a la Higromocina (hig) en el KO. Las líneas transversales punteadas señalan la posición relativa del gen pknDa en S. B) PCR con los pares de cebadores D2/D3 en las cepas Hig r BD2 y BD5. C) Detección del gen hig por PCR en la cepa BD2 y BD5. El plásmido pYUB854 se utilizó como control positivo (+). E: estándares de peso molecular. Se resalta en rojo la cepa BD2 por ser seleccionada como cepa KO para los análisis subsiguientes.

155

A

1-2DKO

1.95 Kb 0.83 Kb

S

SAD BamHI

BamHI

Bam HI

1-2DKO

0.83 Kb

KO

res-hig -res BamHI

BamHI

3.42 Kb

BamHI

B BCG

BD2

BD5

2D3 KOD5 KOD7

Kb 4.263.42

3.53-

2.021.95

1.90-

0.940.83

Fig. 68. Análisis de Southern Blot de los mutantes de BCG y MT2D3 para la quinasa PknD. (A) Estrategia utilizada para la detección del gen en la cepa silvestre (S) o el gen en el KO (KO). (B) ADN genómico de las cepas silvestre y mutantes digerido con BamHI e hibridizado con el fragmento 1-2DKO (691 pb) como sonda. El fragmento esperado para el gen en S es de 1.95 Kb y 3.42 Kb para el KO según se indica. Adicionalmente un fragmento de 0.83 kb es común en ambos (tabla 5). BD2y BD5: cepas mutantes de BCG; KOD5 y KOD7: cepas mutantes de MT2D3 (2D3)

156 Previamente (capítulo I) se había utilizado un anticuerpo específico dirigido contra la quinasa PknD (donado por el Dr. Pedro Alzari, Instituto Pasteur), determinándose que este anticuerpo reconoce, entre otras, una banda de aproximadamente 32 kDa en BCG y 69.2 kDa en MT2D3, principalmente en las fracciones del extracto total (Et) y proteínas asociada a la pared celular (P) (ver Fig. 13). La migración relativa de estas bandas fue muy similar al peso molecular teórico estimado para PknD en M. bovis (31.4 kDa) y M. tuberculosis (69.5 kDa). Este anticuerpo fue utilizado en las fracciones de proteínas de las cepas BD2 y KOD5

y simultáneamente en las fracciones de las cepas

silvestres

correspondientes para evaluar la presencia de dicha quinasa en las cepas mutantes (Fig, 69). Los resultados muestran la ausencia de una banda de ∼ 32 kDa en las fracciones Et y P de BD2 y ∼ 69.2 kDa en la fracción Et de KOD5 BCG kDa

St

Et

BD2 P

Et

KOD5 P

Et

MT2D3 Et

182.9113.780.963.8-

∼ 69.2 kDa

49.5-

37.4-

∼ 32 kDa

26.0-

20.5-

14.9-

Fig. 69. Reacción del anticuerpo anti-PknD en fracciones de proteínas de las cepas KO de PknD y las cepas silvestres de BCG y MT2D3. Se realizó un WB de las fracciones de proteínas del extracto total (Et) y la fracción de proteínas asociada a pared celular (P) del mutante BD2 y la cepa parental BCG; y la fracción de proteínas del extracto total (Et) del mutante KOD5 y la cepa parental MT2D3, utilizando el anticuerpo anti-PknD (1:1000). La cantidad de proteína añadida en cada fracción fue igual a la cantidad utilizada en los ensayos quinasas correspondientes: BCG (Et): 7.6 μg; BCG (P): 2.5 μg; BD2 (Et): 5.6 μg; BD2 (P): 4.6 μg; MT2D3 (Et): 1.72 μg; KOD5 (Et): 4.7 μg.

157 1.4.2.2. PknI: Selección y confirmación de las cepas mutantes BI9 y KOI35. Todos los transductantes obtenidos (44) de la infección del fago FI24 con la cepa BCG fueron analizados por PCR y todos resultaron candidatos a cepas KO. Estos transductantes fueron denominados con las iniciales BI seguidas del número asignado a la colonia.

La Fig. 70 muestra el análisis, por PCR, de dos transductantes de BCG para determinar candidatos KO de la quinasa PknI. La estrategia utilizada para la selección por PCR de los mutantes de BCG para PknI se muestra en la Fig. 70-A.

De todas las cepas

se seleccionó el mutante BI9, que además de mostrar la presencia del gen para la resistencia a la Higromicina (hig) (Fig. 70-B), también resultó positivo para la amplificación de un fragmento único de 3386 pb que corresponde al KO (Fig. 70-C).

Posteriormente,

el análisis por Southern blot (Fig. 71) del ADN de este mutante

confirmó que BI9 y también BI3 eran cepas KO, pues se observó claramente que el fragmento esperado para el KO (4.54 kb), según la estrategia mostrada en la Fig 71-A, estaba presente en esta cepa y no hubo detección del fragmento esperado para la cepa silvestre (2.90 kb) (Fig. 71-B).

158

A

pknI 1.75 Kb

S

SAI

1-2IKO

3-4IKO

I3

I2

KO

I2

HR

res

1-2IKO

-hig-

HF

I3

res

3-4IKO

0.779 Kb

3.386 Kb

B

E

BI3 BI9

kb 1.0-

0.779 Kb

0.5-

C BI3

BI9

BCG

kb 104.03.02.52.0-

3.386 Kb 1.75 Kb

1.5-

Fig, 70. Detección por PCR de cepas mutantes obtenidas en el proceso del intercambio alélico de de pknI en BCG. A) Estrategia utilizada para amplificar con distintos cebadores regiones del gen en la cepa silvestre(S) y del gen en la cepa KO (KO) con los cebadores apropiados (ver tabla 5 y 6). Los fragmentos utilizados en la construcción del sustrato de intercambio alélico también se encuentran indicados 1-2IKO (rojo) y 3-4IKO (azul). También se indican los cebadores utilizados para determinar la presencia del gen de la resistencia a la Higromocina (hig) en el KO.Las líneas transversales punteadas señalan la posición relativa del gen pknI en S. B) Detección del gen hig por PCR en algunas cepas Hig R. C) PCR con los pares de fragmentos I2/I3 en las cepas Hig R y la cepa silvestre de BCG. Se resalta en rojo la cepa escogida como cepa KO para los análisis subsiguientes. E: estándares de peso molecular

159

A

1-2IKO

2.90 Kb

S

SA I XhoI

Xho I

1-2IKO

KO

res-hig-res XhoI

4.54 Kb

XhoI

B kb

BCG

BI3

BI9

5000_ 4.54

4000-

30002.90 2500-

Fig. 71. Análisis de Southern Blot de los mutantes de BCG para la quinasa PknI. (A) Estrategia utilizada para la detección del gen en la cepa silvestre (S) y el gen en la cepa KO (KO). B) ADN genómico de las cepas silvestre y mutantes digerido con XhoI e hibridizado con el fragmento 1-2IKO (765 pb) como sonda. El fragmento esperado para S es de 2.9 Kb y 4.54 Kb para el KO según se indica en la sección (A). BI3, BI9: cepas mutantes de BCG.

160 Los tranductantes de MT2D3 fueron denominados con las iniciales KOI, seguidos del número asignado a la colonia. El análisis realizado, por PCR, a los transductantes de MT2D3 se muestra en la Fig. 72. La misma estrategia utilizada con los tranductantes de BCG fue aplicada en este caso (Fig. 72-A). Los resultados mostrados en la Fig 72-B y Fig. 72-C presentaron dudas en los posible KO, (mutantes KOI3 y KOI35) debido a que se observaron bandas muy cercanas al tamaño esperado para el gen en la cepa silvestre (1.75 kb), además del gen en el KO (3.386 kb). También se observaron mutantes en los que la amplificación del gen silvestre resultó positiva (como KOI22).

En todos los casos, la

presencia del gen hig resultó también positiva, lo cual ratificaba que los lisados provenían de cepas mutantes producto de la recombinación homóloga (Fig. 72-D). Considerando que en la PCR si un mismo par de cebadores tiene 2 sitios de unión se amplificará el tamaño más pequeño, era de esperar que el mutante simple amplificase el gen de la cepa silvestre en preferencia al gen en el KO, pues su tamaño era menor. Esto sucedió con KOI22, pero no podía excluirse la posibilidad de que KOI35 y KOI3 fuesen ambos mutantes simples. La comprobación definitiva se realizó por

el análisis de Southern blot (Fig. 73).

En la

estrategia diseñada (73-A), el gen en la cepa silvestre, después de la digestión con BamHI, debería arrojar dos fragmentos (0.57 kb y 0.87 kb), distintos a los liberados en el gen del KO, utilizando la misma enzima de restricción (2.8 kb y 0.42 kb).

Inicialmente, el

fragmento de 0.87 kb debería presentarse también en el KO, pues no corresponde al área escindida en el proceso de recombinación.

Pero en esta zona se encuentra la zona de

homología donde ocurrió la recombinación y que en el gen silvestre corresponde al fragmento 1-2IKO. Este fragmento fue modificado (ver modificación de fragmentos de PCR en sección 5.1.1) y se introdujo un sitio BamHI adicional, muy cercano a uno de los extremos del fragmento, esta modificación quedó, después de la recombinación, en el cromosoma bacteriano. En este caso el fragmento de 0.87 kb aumentó su tamaño a 0.92 kb (53 pb más por la modificación). Cuando se digirió con BamHI, se produjo un fragmento de 0.42 kb y otro de 0.50 kb. La sonda hibridó, de preferencia con el fragmento de 0.42 kb, pues la sonda fue a su vez, el mismo fragmento 1-2IKO y reconoce toda la longitud de dicho fragmento, mientras en el otro fragmento (0.50 kb) sólo existe una zona de ∼13 pb de homología. Así que un mutante simple debería mostrar los 4 fragmentos (0.57 kb, 0.87 kb, 2.8 kb y 0.42 kb) y así sucedió con KOI22, mientras que los mutantes KO sólo los dos fragmentos correspondientes, (2.8 kb y 0.42 kb) lo cual sucedió con KOI3 y KOI35 (Fig. 73-B).

161

A pknI 1.75 Kb

S

SAI

1-2IKO

3-4IKO

I3

I2 I2

KO

1-2IKO

HR

res

HF

-hig-

I3

res

3-4IKO

0.779 Kb

3.386 Kb

B

C KOI3 2D3 Kb

Kb 4.361-

3.386 Kb

2.027-

1.75 Kb

KOI22 KOI35

4.324-

3.386 Kb

1.929-

1.75 Kb

1.264-

D E

KOI22 KOI3 KOI35 2D3

0.779 Kb

Fig. 72. Detección por PCR de cepas mutantes obtenidas en el proceso del intercambio alélico de pknI en MT2D3. A) Estrategia utilizada para amplificar con distintos cebadores regiones del gen en la cepa silvestre(S) y del gen en la cepa KO (KO) con los cebadores apropiados (ver tabla 5 y 6). Los fragmentos utilizados en el sustrato de intercambio alélico se encuentran indicados: 12IKO (rojo) y 3-4IKO (azul), también el Sitio Activo de la quinasa PknI (SAI; negro) en S. También se indican los cebadores utilizados para determinar la presencia del gen de la resistencia a la Higromocina (hig) en el KO. Las líneas transversales punteadas señalan la posición relativa del gen pknI en el GS. B y C) PCR con el par de cebadores I2/I3 en cepas Hig r (KOI3, KOI22 y KOI35). D) Detección del gen hig por PCR. Se resalta (rojo) la cepa escogida como cepa KO (KOI35) para los análisis subsiguientes. E: estándares de peso molecular

162

A

1-2KOI 0.57 Kb

0.87 Kb

S

S AI Bam HI

Bam HI

Bam HI

BamHI

1-2KOI Bam HI

BamHI

BamHI

BamHI

KO

res-hig-res 0.42 Kb

2.8 Kb

0.92 Kb

B 2D3

KOI3

KOI35

KOI22

Kb 3.0-

2.8 2.52.0-

0.87

1.00.75-

0.57

0.5-

0.42

Fig. 73. Análisis de Southern Blot de los mutantes de MT2D3 para la quinasa PknI. (A) Estrategia utilizada para la detección del gen en la cepa silvestre (S) y el gen de la cepa KO (KO). B) ADN genómico de las cepas silvestre y mutantes digerido con BamHI e hibridizado con el

fragmento 1-2IKO (765 pb) como sonda. Los fragmentos esperados para S fueron 0.57 Kb y 0.87 Kb. Para el KO es 2.8 kb y 0.42 kb (en lugar de 0.87 kb; ver explicación en el texto). KOI3, KOI35, KOI22: cepas mutantes de MT2D3. 2D3: cepa silvestre MT2D3.

163 1.4.2.3. PknK: Análisis de transductantes. Los tranductantes de BCG obtenidos en la infección del fago FK13 se denominaron con las iniciales BK seguidos del número de la colonia. En MT2D3 el único transductante fue designado KOKO.

El análisis realizado, por PCR, a los mutantes seleccionados se muestra en la Fig. 74. Siguiendo la estrategia representada en la Fig. 26-A, la PCR utilizando el par de cebadores K1g/ k2g arrojó sólo la presencia del fragmento correspondiente al gen en la cepa silvestre (S) (3.896 kb) en el análisis realizado a

más del 50 % de los transductantes de BCG

(escogidos aleatoriamente) y el único mutante de MT2D3 (KOKO). En la Fig. 26-B se muestra el análisis realizado al mutante KOKO y, a manera demostrativa, en la Fig. 26-C se presenta el resultado de un mutante de BCG (BK15) como ejemplo de todos los resultados obtenido en los mutantes de esta cepa.

Estos resultados sugirieron que los

transductantes son producto de la recombinación simple debido a que la amplificación del gen hig resultó positiva. (Fig. 26-D). análisis de Southern blot.

Ante la ausencia de cepas KO no se realizó un

164

A 3.896 Kb pknK

S

SAK

1-2KKO

3-4KKO

K2g

K1g

K2g

KO

HR

res

1-2KKO

K1g

HF

-hig-

res

3-4KKO

0.779 Kb

4.553 Kb

C

B

BCG KOKO

BK15

2D3

kb

kb 21.24.268-

3.89 kb

2.02-

643-

3.89 kb

2-

D kb 1.51.00.750.5-

E

+

BCG

BK15 2D3

KOKO

0.779 kb

Fig. 74. Detección por PCR de cepas mutantes obtenidas en el proceso del intercambio alélico de pknK en BCG y MT2D3. A) Estrategia utilizada para amplificar los fragmentos del gen en la cepa silvestre (S) y el gen en la cepa KO (KO) utilizando el par de cebadores K1g/k2g (ver tabla 5 y 6) así como el gen de la resistencia a la Higromicina (hig) con el par de cebadores HF/HR. Los fragmentos utilizados en el sustrato de intercambio alélico se encuentran indicados: 1-2KKO (rojo) y 3-4KKO (azul), también el Sitio Activo de la quinasa PknK (SAK; negro) en GS. Las líneas transversales punteadas señalan la posición relativa del gen pknK en el GS. B) PCR con par de cebadores K1g/K2g en la cepa mutante (KOKO) y silvestre de M.tuberculosis (2D3). C) PCR con el par de cebadores K1g/K2g en la cepa mutante (BK15) y silvestre de BCG (BCG). D) PCR de hig en las cepas BK15 de BCG y KOKO de MT2D3 (2D3). Se utilizó el ADN de las cepas silvestres de BCG y 2D3 como control positivo del gen silvestre pknK y control negativo de la amplificación de hig. El ADN de pYUB854 fue utilizado como control positivo de hig (+).

165 2. Fosforilación de sustratos endógenos y exógenos en las cepas mutantes (KO) 2.1. Cepas mutantes de BCG. Las cepas mutantes BD2 (para el gen pknD) y BI9 (para el gen pknI) fueron escogidas, aleatoriamente, como cepas KO para realizar los ensayos de actividad quinasa.

La fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA

por las fracciones conteniendo las proteínas del extracto total y las proteínas asociadas a la pared celular, provenientes del cultivo de las cepas mutantes BD2 y BI9 comparadas con las

fueron

correspondientes de un cultivo de la cepa silvestre BCG.

fosforilación de los sustratos endógenos (Fig. 75) mostró que, cualitativamente, mutantes tenían el mismo perfil de sustratos endógenos que la cepa silvestre.

La los

De igual

manera se apreció que la fracción P tenía relativamente mayor fosforilación que el correspondiente extracto total en todas las cepas mutantes, al igual que lo observado en la cepa silvestre.

B

A BD2 St

Et

P

BI9 Et

P

BCG Et

BD2

P

Et

212-

212-

158-

158-

11697.4-

11697.4-

66.4-

66.4-

55.6-

55.6-

42.7-

42.7-

36.5-

36.5-

26.9-

26.9-

20.014.36.5-

20.0-

BI9 P

Et

P

BCG Et

P

14.3-

Fig. 75. Comparación de la fosforilación de sustratos endógenos de la cepa silvestre BCG y de las cepas mutantes BD2 y BI9. Se determinó la fosforilación de sustratos endógenos en ensayos radioactivos con ATP (γ-32 P)de las fracciones proteicas del extracto total (Et) y asociada a la pared celular (P) de la cepas mutantes BD2 y BI9; y la cepa silvestre BCG en presencia de 2.5 mM MnCl2 . Las fracciones, una vez realizado el ensayo (30´ a T.A) fueron separadas en geles de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñidos con azul de Coomassie (A), secados y expuestos a la autoradiografía (B). St: estándares de peso molecular (kDa). Los volumenes y las concentraciones respectivas de las muestras empleadas para cada cepa fueron: BCG (40 μl): 7.6 μg (Et); 2.51 μg (P); BD2 (35 μl): 5.6 μg (Et); 4.6 μg (P); BI9 (40 μl): 6.4 μg (Et); 3 μg (P).

166 Las fracciones de proteínas de las cepas mutantes de BCG también fosforilaron la histona IIA agregada como sustrato exógeno al ensayo (Fig. 76). Al igual que en la cepa silvestre, este sustrato mostró una fosforilación más intensa en la fracción P de las cepas mutantes que el extracto total correspondiente.

A

B BD2 Et P

BI9 Et

P

BD2

BCG Et

P

Et P

kDa

kDa

158 -

158 -

116 -

116 -

97.4 -

97.4 -

66.4 -

66.4 -

55.6 -

55.6 -

42. 7-

42. 7-

P

Et

P

26.9-

26.9-

14.36.5-

Et

BCG

36.5-

36.5-

20.0-

BI9

H2A

20.0-

H2A

14.36.5-

Fig. 76. Comparación entre la Fosforilación de Histona IIA por la cepa silvestre de BCG y las cepas mutantes BD2 y BI9. Se determinó la actividad quinasa de las fracciones de las proteinas del extracto total (Et) y de las proteíans asociada a la pared celular (P) provenientes de la cepas mutantes KOD5, y de la cepa silvestre de BCG en presencia de 2.5 mM MnCl2 y 100 μg de Histona IIA (H2A) como sustrato exógeno. Las fracciones, una vez realizado el ensayo (30´ a T.A), fueron separadas en un gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñido con azul de Coomassie (A), secado y expuesto a autoradiografía (B). Los estándares de peso molecular (kDa) se encuentran señalados en la figura. Los volumenes y las concentraciones respectivas de las muestras empleadas para cada cepa fueron BCG (40 μl): 7.6 μg (Et); 2.51 μg (P); BD2 (35 μl): 5.6 μg (Et); 4.6 μg (P); BI9 (40 μl): 6.4 μg (Et); 3 μg (P)

167 2.2. Cepas mutantes de M. tuberculosis.

Las cepas mutantes KOD5 y KOI35 fueron

escogidas, aleatoriamente, como cepas KO para realizar los ensayos de actividad quinasa. 2.2.1. Cepa KOD5. La fosforilación de sustratos endógenos y de Histona IIA por las fracciones conteniendo las proteínas del extracto total (Et) y las proteínas asociadas a la pared celular (P), provenientes del cultivo de la cepa KOD5 fueron comparadas con las correspondientes de un cultivo de la cepa silvestre MT2D3.

La fosforilación de los

sustratos endógenos (Fig. 77) reveló la disminución de una banda fosforilada que migró con una masa molecular aparente de 83 kDa en las fracciones de la cepa mutante. Esta banda

se vió claramente en la cepa silvestre a pesar de que la cantidad de proteína

utilizada en estas fracciones [1.72 μg (Et); 0.20 μg (P)] fue menor que en las fracciones de la cepa mutante [4.7 μg (Et); 3.9 μg (P)]

B

A 2D3 St

Et

KOD5 P

Et

2D3

P

Et

kDa

kDa

158-

158-

11697.4-

11697.4-

66.4-

66.4-

KOD5 P

Et

P

83 kDa

55.6-

55.6-

42.7-

42.7-

36.5-

36.5-

26.9-

26.9-

20.0-

20.0-

14.3-

14.3-

6.5-

6.5-

Fig. 77. Comparación de la fosforilación de sustratos endógenos de la cepa silvestre MT2D3 y de la cepa mutante KOD5. Se determinó la fosforilación de sustratos endógenos en ensayos radioactivos con ATP (γ-32 P)de las fracciones proteicas del extracto total (Et) y asociada a la pared celular (P) de la cepa mutante KOD5; y la cepa silvestre MT2D3 (2D3), en presencia de 2.5 mM MnCl2 . Las fracciones, una vez realizado el ensayo (30´ a T.A), fueron separadas en geles de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñidos con azul de Coomassie (A), secados y expuestos a la autoradiografía (B). St: estándares de peso molecular. Los volumenes y las concentraciones respectivas de las muestras empleadas para cada cepa fueron: MT2D3 (70 μl) : 1.72 μg (Et); 0.20 μg (P); KOD5 (40 μl): 4.7 μg (Et); 3.9 μg (P).

168 La disminución de esta banda, sin embargo, no alteró la fosforilación de Histona IIA agregada exógenamente, por las mismas fracciones (Fig.78.). Por otra parte, en este caso, dicha banda fosforilada desapareció por completo.

A

B 2D3 Et

P

KOD5 Et

P

kDa

2D3

KOD5

Et

Et

P

P

kDa

15811697.4-

15811697.4-

83 kDa 66.4-

66.4-

42.7-

42.7-

36.5-

36.5-

26.9-

26.9-

20.0-

20.014.3-

H2A

14.3-

6.5-

H2A

6.5-

Fig. 78. Comparación entre la Fosforilación de Histona IIA por la cepa silvestre MT2D3 y la cepa mutante KOD5 de M. tuberculosis. Se determinó la actividad quinasa de las fracciones de las proteinas del extracto total (Et) y de las proteíans asociada a la pared celular (P) provenientes de la cepa mutante KOD5, y de la cepa silvestre MT2D3 (2D3), en presencia de 2.5 mM MnCl2 y 100 μg de Histona IIA (H2A) como sustrato exógeno. Las fracciones, una vez realizado el ensayo (30´ a T.A), fueron separadas en un gel de gradiente (8-15 % de poliacrilamida) teñido conazul de Coomassie (A), secado y expuesto a autoradiografía (B). Los estándares de peso molecular (kDa) se encuentran señalados en la figura. Los volumenes y las concentraciones respectivas de las muestras empleadas para cada cepa fueron: MT2D3 (70 μl) 1.72 μg (Et); 0.20 μg (P); .KOD5 (40 μl): 4.72 μg (Et); 3.9 μg (P)

Debido a que una banda en geles de una

dimensión puede representar varios

polipéptidos, se decidió realizar un gel de dos dimensiones (2D) para determinar si la

169 diferencia encontrada en dichos geles en una banda de 83 kDa representa la desaparición y/o disminución de un solo polipéptido. Al realizar un análisis en geles 2D de los sustratos fosforilados endógenamente por la fracción P de la cepa silvestre 2D3 y de la cepa mutante KOD5, se registró en esta última, la ausencia de un conjunto de isoformas fosforiladas que, en la cepa silvestre, migraron como una banda alrededor de los 93 kDa (Fig. 79); aunque permanecen en la misma región

o ligeramente por debajo de dicho peso otras

proteínas fosforiladas (indicadas por flechas).

Este sustrato ha sido denominado p83-93

debido a su migración en ese rango.

Entre los 40 y 55 kDa se observaron proteínas fosforiladas que disminuyeron su intensidad en la fracción P de KOD5 (indicadas por círculos azules): Alrededor de los 39 kDa se apreció una proteína menos fosforilada que en la cepa silvestre, y más cercanas al pH 4, se observaron lo que pudieron ser dos isoformas fosforiladas de una proteína que migró cerca de los 37 kDa. Alrededor de los 36 kDa se apreciaron otros dos puntos más con menor grado de fosforilación en la cepa KOD5.

Sin embargo, también fueron detectadas proteínas que incrementaron su fosforilación en la cepa mutante (indicadas por un círculo amarillo): Entre los 40 y 55 kDa, hacia el extremo ácido del gel, se visualizaron un conjunto de puntos más fosforilados en KOD5 cuando se compara con la cepa silvestre.

170

2D3 1 Dimensión

170 130 100 -

70

4 (pH)

2 Dimensión

2 Dimensión

7 (kDa)

1 Dimensión 7

KOD5 4 (pH)

(kDa) 170 130

100

70

55 55

40 -

35 -

25 -

40

35

25

Fig. 79. Comparación de los Perfiles de la fosforilación de sustratos endógenos de la fracción de proteínas asociadas a la pared celular de MT2D3 y KOD5. Las fracciones de proteínas asociadas a la pared celular (5∼10 μg) de la cepa silvestre MT2D3 (2D3) y la cepa mutante (KOD5) fueron comparadas en ensayos de actividad proteína quinasa (30´ a T.A) en geles 2D (pH 4-7; 10 % SDS-PAGE) utilizando ATP(γ-32 P) (50 μ Ci) y 2.5 mM Mn +2 . Los puntos ausentes en la cepa mutante se señalan en color rojo (O). Los puntos que disminuyen en la cepa mutante se indican en color azul (O) y los puntos que se incrementan se indican en color amarillo (O)

171 El conjunto de spots fosforilados que conforman una banda de aproximadamente 90 kDa, ausente en la fracción P de la cepa KOD5, fueron extraídos del gel de 2D de la correspondiente fracción en la cepa silvestre de MT2D3 para su identificación por análisis de espectrometría de masas, previa su digestión enzimática con tripsina de acuerdo a lo referido en la metodología.

Los resultados del análisis realizado a los datos de la

espectometría de masas de la muestra peptídica, utilizando el programa MASCOT, reveló que 8 péptidos de dicho sustrato (p83-93) (tabla 7) se identifican con 5 péptidos (9 %) de la proteína mmpL7 de M. tuberculosis (número de acceso gi: 15610079; 95.405 kDa; pI calculado: 9.03) (Fig. 80), con un valor significante (p