PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO - FUNDAP

THAÍS ANTUNES FERNANDES DE OLIVEIRA

Avaliação de sinergismo entre Ceftazidima e Fosfomicina, e entre Ceftazidima e Amicacina perante cepas de Klebsiella pneumoniae com perfis sensíveis e resistentes aos carbapenêmicos pelo método de “checkerboard”

RIBEIRÃO PRETO 2012

PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO - FUNDAP

THAÍS ANTUNES FERNANDES DE OLIVEIRA

Avaliação de sinergismo entre Ceftazidima e Fosfomicina, e entre Ceftazidima e Amicacina perante cepas de Klebsiella pneumoniae com perfis sensíveis e resistentes aos carbapenêmicos pelo método de “checkerboard” Monografia

apresentada

Aprimoramento

ao

Programa

de

Profissional/CRH/SES-SP

e

FUNDAP, elaborada no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – USP/ Departamento de Microbiologia, sob a orientação do Prof. Dr. Roberto Martinez. Área: Microbiologia/ Controle de Infecção Hospitalar Orientador: Prof. Dr. Roberto Martinez Supervisora Titular: Rosa Helena A. R. Gironi

RIBEIRÂO PRETO 2012

FICHA CATALOGRÁFICA

Oliveira, Thaís Antunes Fernandes Avaliação de sinergismo entre Ceftazidima e Fosfomicina, e entre Ceftazidima e Amicacina perante cepas de Klebsiella pneumoniae

com

perfis

sensíveis

e

resistentes

aos

carbapenêmicos pelo método de “checkerboard”. Ribeirão Preto, 2012.

31 p.

Trabalho de Conclusão do Programa de Aprimoramento Profissional/ SES, área de Microbiologia Clínica e de Infecção Hospitalar, Hospital das Clínicas da FMRP – USP.

Orientador: Martinez, Roberto.

1. Klebsiella pneumoniae. 2. KPC. 3. Ceftazidima 4. Fosfomicina. 5. Amicacina. 6. Checkerboard

“A excelência pode ser obtida se você se importa mais do que os outros julgam ser necessário; se arrisca mais do que os outros julgam ser seguro; sonha mais do que os outros julgam ser prático e espera mais do que os outros julgam ser possível.”

Vince Lombardi

Agradecimentos À Deus, que através da força do teu espírito, me fez superar as dificuldades encontradas pelo caminho, e me fez conseguir mais uma conquista ao concluir este trabalho, Obrigada. Aos meus pais Noel e Vera pelo amor, compreensão, carinho, apoio incondicional, confiança e especialmente por serem parte fundamental da minha vida, Obrigada. Ao Fabiano Araújo, pela paciência e dedicação e, sobretudo por ser alguém que torna minha vida muito melhor, Obrigada. Ao Professor Doutor Roberto Martinez pela dedicação a este trabalho, pela paciência com minhas questões e dúvidas, pela confiança e carinho, Obrigada. À Lucia Vitali, Erica Nascimento e Leticia Schiave, pela ajuda na realização deste trabalho, por terem me ensinado o que eu não sabia, pelo companheirismo e palavras de incentivo, e principalmente por serem pessoas que admiro muito, Obrigada. Aos profissionais dos laboratórios de Microbiologia e Sorologia pelo companheirismo, carinho, amizade, pelos ensinamentos passados, Obrigada. Aos colegas aprimorandos Helen Oliveira, Larissa Prado, Carol Gomes, Mariele de Freitas, Deise Scheeren, Natália Augusta, Alessandro Ueta, Fernanda Maciel, pelos momentos bons, de companheirismo, amizade, incentivo, Obrigada.

Resumo Neste trabalho foram analisadas cepas de Klebsiella pneumoniae sensíveis e resistentes aos carbapenêmicos, provenientes de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP). As bactérias foram identificadas através de um processo de automação pelo Vitek2®, por onde também foi realizado antibiograma. As cepas foram submetidas a testes de sinergismo pelo método de “checkerboard” utilizando as drogas ceftazidima e fosfomicina, e ceftazidima e amicacina em variadas concentrações. Os resultados demonstram potencial atividade sinérgica tanto nos isolados sensíveis quanto nos resistentes as carbapenêmicos. Este estudo, portanto soma-se aos já existentes podendo orientar as estratégias no tratamento de infecções por Klebsiella pneumoniae inclusive nas cepas KPC.

Palavras-chave: Klebsiella pneumoniae, KPC, Ceftazidima, Fosfomicina, Amicacina, Checkerboard.

Sumário 1. Introdução..........................................................................01 1.1. Klebsiella pneumoniae...................................................01 1.2. Resistência bacteriana...................................................02 1.3. A enzima KPC................................................................04 1.4. Os antibióticos amicacina, ceftazidima e fosfomicina ...05 1.4.1. Amicacina.......................................................................05 1.4.2. Ceftazidima.....................................................................05 1.4.3. Fosfomicina....................................................................06 1.5. Interações medicamentosas...........................................07 1.6. Método de Checkerboard...............................................08 2. Objetivo..............................................................................09 3. Materiais e Métodos..........................................................10 4. Resultados e Discussão...................................................13 5. Conclusões........................................................................20 6. Referências........................................................................21

1

1. Introdução 1.1 Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae é um bacilo Gram-negativo, sem motilidade, anaeróbio facultativo e em forma de bastonete, membro da família Enterobacteriaceae, encontrado em locais como água, solo, plantas e esgoto. Saprofiticamente habita as mucosas de animais e seres humanos. Essa bactéria geralmente é isolada em casos de infecção hospitalar como pneumonia, infecção urinária e septicemia. A colonização provavelmente ocorre por contato com as diversas fontes ambientais citadas acima (PODSCHUM; ULLMANN, 1998). Essa bactéria tem se tornado um dos maiores problemas de saúde pública nas últimas décadas, dada à emergência de resistência antimicrobiana devido à pressão seletiva proporcionada pelo aumento expressivo do uso de antimicrobianos tanto em unidades de terapia intensiva (UTI), como também de outros setores hospitalares (FONTANA et al., 2002). Vários fatores estão envolvidos na disseminação desses patógenos multirresistentes, incluindo o uso abusivo de antibióticos, procedimentos invasivos (cirurgias, implantação de próteses médicas e outros) e a capacidade das bactérias de transmitir seu material genético com a informação de resistência a antibióticos (FONTANA et al., 2002). Os carbapenêmicos são uma classe de antibióticos normalmente utilizados para tratar infecções por Klebsiella pneumoniae multirresistentes. Porém, por um meio de resistência que se tornou comum surgiu a Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase - KPC (BRADFORD et al, 2004), que

2

é resistente a carbapenêmicos, como o imipenem e meropenem, e a vários outros grupos de antimicrobianos. Geralmente a Klebsiella pneumoniae – KPC mostra sensibilidade apenas a amicacina e às polimixinas B e E (colistina). Isto dificulta o tratamento de pacientes infectados pela bactéria, que é cada vez mais isolada em hospitais. A dificuldade de encontrar antimicrobianos para combater essas infecções hospitalares fez surgir o interesse no uso de combinações de antimicrobianos, tanto no sentido de evitar seleção de clones bacterianos ainda mais resistentes, como para obter sinergismo entre as drogas, aumentando a eficácia clínica de cada uma delas. É

conhecido

que

betalactâmicos

apresentam

sinergia

com

aminoglicosídeos, tendo sido recomendada esta associação de antibióticos no tratamento de pacientes com infecções por Pseudomonas aeruginosa. O sinergismo e a rápida expansão de Klebsiella pneumoniae-KPC estimula a busca de combinações de antimicrobianos

potencialmente

sinérgicos

contra

esse

microrganismo em testes feito no laboratório.

1.2 Resistência bacteriana

A resistência microbiana refere-se a cepas de microrganismos que são capazes de se multiplicar na presença de concentrações de antimicrobianos encontradas no sangue e nos tecidos de pacientes (AVORN; SOLOMON, 2000). Os mecanismos de resistência foram se tornando comuns com a prática da antibioticoterapia, eles incluem: alteração na permeabilidade da membrana celular, impedindo a entrada do antibiótico na célula; mecanismo de efluxo, que bombeia o

3

antibiótico para fora da célula; e desenvolvimento da capacidade de degradar ou inativar o antibiótico. Além

do

único cromossomo

de

DNA

(cadeia dupla)

encontrado no citoplasma, as bactérias também possuem uma segunda

estrutura

codificadora

de

proteínas

denominada

plasmídeos. Estes se replicam independentemente do cromossomo e carregam genes não essenciais para as bactérias. Entre as bactérias

a

transferência

de

plasmídeos

e

fragmentos

cromossômicos é altamente disseminada, conferindo-lhes uma diversidade genética. E é nos plasmídeos que muitas vezes localizam-se os genes de resistência bacteriana aos antibióticos, sendo que a transferência dos mesmos pode acontecer até mesmo entre bactérias de gêneros diferentes (TORTORA et al, 2010). Assim que recebe o gene de resistência, o microrganismo receptor pela pressão seletiva de antimicrobianos passa a prevalecer no ambiente (TAVARES, 1996). A Klebsiella pneumoniae apresenta três principais proteínas de membrana externa (OMP 35, OMP 36 e OMP 37) que desempenham papel importante na susceptibilidade a antibióticos β-lactâmicos, incluindo os carbapenêmicos (meropenem, ertapenem e imipenem). Entre as bactérias KPC é comum a perda de OMP, o que leva a resistência a antibióticos (ENDIMIAMI et al., 200). A perda de OMP 36 leva à redução da susceptibilidade à cefoxitina e carbapenêmicos, o ertapenem é afetado pela perda juntamente da OMP 35 e 36 (LANDMAN; BRATU; QUALE, 2009).

4

1.3 A enzima KPC

A enzima KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) é a serinocarbapenemase de maior importância. Ela foi detectada pela primeira vez na Carolina do norte, Estados Unidos, em 1996, e rapidamente se disseminou para outras

regiões, causando

preocupações em termos de saúde pública. Esta bactéria foi isolada no Brasil pela primeira vez em 2005 (TSAKRIS et al, 2009). Esta enzima é codificada por um gene (blaKPC) que é um plasmídeo transmissível entre as Enterobacteriacea. Devido ao plasmídeo ser móvel, pode ser facilmente transferido entre bactérias da mesma espécie ou entre espécies diferentes (DEL PELOSO; BARROS; SANTOS, 2010). Ela possui ainda capacidade de quebrar moléculas de carbapenêmicos, conferindo resistência aos mesmos, além de apresentar resistência a todos os agentes βlactâmicos incluindo penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos (ALBA et al, 2005). A KPC ocorre normalmente em Klebsiella pneumoniae, porém, atualmente já foi encontrada em outras espécies de Enterobacteriaceae, como por exemplo: Enterobacter spp., Escherichia coli, Salmonella entérica, Citrobacter freundii e Serratia spp; já sendo relatada até mesmo em Pseudomonas aeruginosa (BULIK et al, 2010). Focalização isoelétrica, disco-difusão, E-teste e teste de Hodge modificado são alguns testes fenotípicos utilizados para rastrear KPC. Também pode-se pesquisar o gene blaKPC por PCR (Reação

em

Cadeia

(BRADFORD et al, 2004).

da

Polimerase),

ou

por

ribotipagem

5

1.4 Os antibióticos amicacina, ceftazidima e fosfomicina

1.4.1 Amicacina

É um antibiótico do grupo dos aminoglicosídeos, que age sobre bactérias gram-negativas. Sendo um aminoglicosídeo, é bactericida, atua inibindo a síntese proteica das bactérias sensíveis. Ao penetrar na célula, o antibiótico liga-se à subunidade 30S do ribossomo bacteriano (esta subunidade tem papel de evitar traduções incorretas do material genético), impedindo a leitura correta do RNA mensageiro e síntese proteica correspondente, ocasionando a incorporação de um aminoácido incorreto no peptídeo, causando alteração no funcionamento da membrana celular com a saída de constituintes essenciais ao funcionamento da célula, provocando morte celular (OLIVEIRA et al, 2006). A amicacina apresenta potencial ototóxico e nefrotóxico e pode se acumular em pacientes com comprometimento renal. Existem três mecanismos de resistência bacterina aos aminoglicosídeos: alteração dos sítios de ligação no ribossomo; alteração na permeabilidade; modificação enzimática da droga. Porém, o desenvolvimento de resistência durante o tratamento é raro (ROUGIER et al, 2003).

1.4.2 Ceftazidima

A ceftazidima é um antibiótico que pertence à classe das cefalosporinas. A primeira cefalosporinas foi descoberta em 1945, a partir do fungo Cephalosporium acremonium. As cefalosporinas são classificadas de acordo com sua ordem cronológica de produção,

6

ou seja, em primeira, segunda, terceira e quarta gerações, sendo que a ceftazidima pertence à terceira geração, além também de serem classificadas com base no espectro de atividade contra bacilos gram-negativos, que vai aumentando da primeira para a quarta geração (CAPRILE, 1988). Alguns exemplos de classificação das cefalosporinas:  1ª geração: cefadroxil, cefapirina, cefalotina, cefazolina  2ª geração: cefaclor, cefuroxima, cefoxitina, cefonicida  3ª geração: ceftriaxona, ceftazidima, cefotaxima  4ª geração: cefepima, cefpiroma Este tipo de antibiótico estimula a produção de autolisinas bacterianas, e interferem na síntese da parede celular do peptideoglicano via inibição de enzimas envolvidas no processo de transpeptidação. Assim, a bactéria não é capaz de manter sua morfologia nem o equilíbrio osmótico com o meio externo. Como agem sobre a formação de parede bacteriana, as cefalosporinas são especificamente ativas em bactérias em fase de multiplicação (KOROIKOVAS; BURCKHALTER, 1988).

1.4.3 Fosfomicina

A fosfomicina foi descoberta em 1969, sendo um metabólito secundário de várias espécies de Streptomyces sp. É um antibiótico bacteriostático de amplo espectro, altamente sensível e de boa tolerância. É de baixa toxicidade, e demonstra sinergismo com outros antimicrobianos no tratamento de infecções por bactérias gram-negativas e positivas (POPOVIC et al, 2010). Seu mecanismo de ação é realizado sobre a parede celular bacteriana, inibindo a síntese do N-acetilmurâmico, um amino-

7

açúcar que faz parte da formação do peptideoglicano, interferindo assim na primeira etapa da formação da parede celular. A sua associação com o sal de trometamol é eficaz no tratamento de infecções urinárias, devido a suas características farmacocinéticas e farmacodinâmicas. Existe também a fosfomicina intravenosa, sob a forma de sal disódico, que apresenta boa penetração e atividade antimicrobiana em biofilmes, além de ser relevante no tratamento de infecções sistêmicas causadas por microrganismos multirresistentes (ROUSSOS et al, 2009).

1.5 Interações Medicamentosas

As interações medicamentosas (IMs) ocorrem quando um medicamento é alterado por outro, podendo resulta em benefícios ou prejuízos à terapia (RANG; DALE; RITTER, 2001). São

benéficas

quando

ocorre

diminuição

dos

efeitos

indesejados, ampliação da eficácia e redução da dosagem dos medicamentos

relacionados.

E

são

prejudiciais

quando

potencializam a toxicidade dos fármacos associados, acarretando ineficácia terapêutica ou causando reações adversas, podendo colocar em risco a vida do paciente. A gravidade vai depender da dose e das características do fármaco e do modo de administração (KATZUNG, 2003). As interações medicamentosas podem ser classificadas em dois tipos: interações físico-químicas e interações terapêuticas. As interações físico-químicas ocorrem fora do paciente, pois entre diferentes drogas podem ocorrer várias incompatibilidades, que levam a reações quando misturadas em infusão intravenosa,

8

frascos ou seringas, podendo até mesmo ocasionar a inativação dos fármacos em questão. As interações terapêuticas ocorrem após a administração do medicamento dentro do paciente, e podem ser farmacocinéticas e farmacodinâmicas.

A

primeira

ocorre

durante

a

absorção,

distribuição, biotransformação e excreção dos fármacos. A segunda ocorre nos sítios de ação dos fármacos, e envolve os mecanismos pelos quais se processam os efeitos farmacológicos, podendo ser sinérgicas (quando um medicamento intensifica o efeito do outro) ou antagônicas (quando um medicamento diminui o efeito do outro) (HANSTEN, 1981).

1.6 Método de Checkerboard

Neste método de avaliação in vitro da interação entre drogas utilizam-se tubos ou placas de microtitulação para testar dois agentes antimicrobianos em várias concentrações de diluições para o microrganismo a ser testado. O Índice de Concentração Inibitória Fracionária (ICIF) é utilizado para relatar os resultados do método checkerboard, ele representa a concentração mais baixa da droga que é capaz de inibir o crescimento do microrganismo.

Pelo ICIF podemos

demonstrar quando a combinação de dois agentes resulta em efeitos inibitórios maiores (sinergismo) ou menores (antagonismo) do que a soma de seus efeitos individuais. Assim pode-se interpretar as interações como sinérgicas (IFIC ≤ 0,5), indiferentes (0,5 < IFIC ≤ 4,0) ou antagônicas (IFIC > 4,0) (JOHNSON, 2004).

9

2. Objetivo Determinar a susceptibilidade da Klebsiella pneumoniae frente às combinações dos antibióticos ceftazidima X fosfomicina, e ceftazidima X amicacina em diferentes concentrações.

10

3. Materiais e Métodos Realizou-se estudo de culturas microbiológicas positivas para Klebsiella

pneumoniae,

que

foram

isoladas

de

pacientes

ambulatoriais e internados do Hospital das Clínicas da Faculdade de

Medicina

de

Ribeirão

Preto

–

HCFMRP-USP.

Foram

pesquisadas 50 culturas de materiais entre urina (25 amostras) e sangue (25 amostras), procedentes de diversas unidades do hospital no período de fevereiro de 2011 a fevereiro de 2012, utilizando-se

tanto

cepas

sensíveis

quanto

resistentes

aos

carbapenêmicos, para posterior critério de comparação. Sendo que foi incluída no estudo apenas uma amostra de cada paciente. A identificação e o antibiograma com o perfil de resistência das amostras de Klebsiella pneumoniae foram realizados por automação, através do sistema Vitek2®. Os isolados de Klebsiella pneumoniae que apresentaram um antibiograma de elevada resistência aos antibióticos foram analisados novamente para confirmar sua resistência através do método de disco-difusão (Kirby-Bauer) realizado numa placa de ágar Müeller- Hinton. Utilizou-se o Teste de Hodge modificado para verificação e confirmação da produção da enzima carbapenemase, sendo que o disco de antibiótico empregado para este testa foi de ertapenem. Após identificação as bactérias foram congeladas no meio TSB + 20% de glicerol a -20ºC. Para execução dos testes de sinergismo de drogas as amostras foram descongeladas e semeadas em ágar sangue, incubada em estufa microbiológica a 35ºC por 24 horas. Posteriormente; foi realizado um segundo repique a partir do primeiro em outra placa de ágar sangue e incubado por mais 24 horas na estufa a 35ºC. E este crescimento

11

secundário foi utilizado na realização dos testes, mediante uma suspensão preparada com salina e correspondente à escala 0,5 de McFarland. A avaliação de interação “in vitro” entre os antibióticos ceftazidima e fosfomicina; e ceftazidima e amicacina foram feitas pela técnica de “checkerboard” em meio de cultura Müeller-Hinton. Foram utilizadas placas de microtitulação de 96 orifícios e o teste com cada combinação de droga foi realizado em duplicata. Foram estabelecidas faixas de concentrações diferentes para cada droga mediante a sensibilidade ou não da Klebsiella pneumoniae

frente

aos

antibióticos.

Para

a

ceftazidima

a

concentração usada para bactérias sensíveis foi de 8µg/ml a 0,015µ/ml e para resistentes ficou entre 1024µg/ml a 2µg/ml. Para a fosfomicina

ficou

determinado

que

fossem

as

mesmas

concentrações tanto para bactérias sensíveis como resistentes, sendo de 256µg/ml a 4µg/ml. Enquanto a amicacina para as bactérias sensíveis foi usada na concentração entre 8µg/ml a 0,13µg/ml e entre as resistentes entre 64µg/ml a 1µg/ml (em meio ao trabalho esta concentração passou a ficar entre 16µg/ml a 0,25µg/ml para melhor evidenciar sinergismo entre as drogas). Os antibióticos foram diluídos em água destilada estéril e armazenados a -20ºC e descongelados somente no momento do uso no experimento. Além de colocar 25µl de cada droga nos orifícios da placa que eram destinados a elas também foi posto 100µl de meio de cultura Müeller-Hinton em todos os orifícios da placa e 5µl da turvação da bactéria nos orifícios também já prédeterminado, de forma que cada pocinho da placa totalizasse 155µl. Nas placas também havia os orifícios destinados aos controles

12

positivos e negativos e o do blank para realização da leitura e posterior comparação dos poços a olho nú. As placas foram armazenadas em estufa bacteriológica por 24 horas e então depois foi feita sua leitura no Fotômetro Multiskan MS.

13

4. Resultados e Discussão

Das 50 amostras testadas de Klebsiella pneumoniae no presente trabalho 25 tinham um perfil de sensibilidade aos antimicrobianos carbapenêmicos e 25 amostras tinham perfil de resistência aos mesmos. Nestas, foi realizado o Teste de Hodge modificado e o mesmo se mostrou positivo para as 25 amostras, confirmando a resistência. As seguintes concentrações inibitórias mínimas (CIMs) dos antibióticos foram utilizadas na interpretação dos testes: a CIM da droga isolada era dividida pelo menor valor da CIM daquela droga combinada com a segunda droga, resultando em uma concentração inibitória fracionada (FICa) e vice-versa para a segunda droga (FICb). Para cada cepa de Klebsiella pneumoniae testada foram duas combinações de antibióticos. A primeira era entre a ceftazidima e fosfomicina, portanto somando-se o FICa da ceftazidima com o FICb da fosfomicina resultava em um índice de concentração

inibitória

fracionada

(IFIC),

Este

índice

era

interpretado para classificação dos testes de acordo com alguns critérios existentes em literatura: IFIC ≤ 0,5 resulta em sinergismo; IFIC > 0,5 ≤ 4,0 resulta em indiferença; IFIC > 4,0 resulta em antagonismo.

A

mesma

coisa

acontecia

para

a

segunda

combinação de drogas que era entre ceftazidima e amicacina. Os resultados podem ser observados na s Tabelas 1, 2, 3 e 4.

14 Tabela1. Avaliação da interação entre ceftazidima e fosfomicina nos isolados resistentes

Isolados

CIM (µg/ml)

CIM (µg/ml)

CAZ / FOS

CAZ / FOS

IFIC

Interpretação do IFIC

combinadas

1R

>1024 / 256

64 / 64

0,156

S

5R

1024 / 256

2/8

0,03

S

6R

128 / 256

32 / 64

0,5

S

7R

512 / >256

4/8

0,039

S

9R

64 / >256

1024 / >256

8 / 32

0,13

S

15R

>1024 / >256

16 / 8

0,04

S

16R

>1024 / >256

256

32 / 16

0,09

S

21R

1024 / >256

32 / 256

32 / 256

16 / 64

0,37

S

30R

1024 / >256

32 / 4

0,04

S

31R

1024 / >256

64 / 8

0,1

S

32R

512 / >256

64 / 8

0,16

S

33R

128 / >256

16 / 64

0,37

S

34R

512 / 128

8 / 16

0,14

S

37R

128 / >256

32 / 64

0,5

S

38R

>1024 / 256

64 / 32

0,19

S

39R

>1024 / >256

32 / 16

0,1

S

40R

1024 / >256

256 / 128

0,75

I

41R

1 / >256

0,25 / 64

0,5

S

42R

>1024 / >256

32 / 32

0,16

S

43R

512 / 256

16 / 1024 / 8

128 / 1

0,25

S

5R

512 / 16