diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(4): 339-344

Praca poglądowa • Review Article

PLGF i sFlt-1 w diagnostyce klinicznej stanu przedrzucawkowego PLGF and sFlt-1 in clinical diagnosis of preeclampsia Agnieszka Grafka1, Maciej Łopucki2, Barbara Pęksa1, Agata Surdacka1,3, Ewelina Grywalska1,3, Jacek Roliński1,3, Elżbieta Starosławska1 1 Centrum Onkologii Ziemi Lubelskiej w Lublinie I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 3 Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie

2

Streszczenie Choroby układu krążenia są jedną z przyczyn powikłań ciężarnych oraz płodu. Położnicy oraz kardiolodzy starają się opracować nowe strategie diagnostyczno-terapeutyczne stanu przedrzucawkowego. Nadal poszukuje się nowych czynników biorących udział w patogenezie tego schorzenia, które jako biomarkery mogłyby zostać wykorzystane do wczesnego rozpoznania ciężarnych zagrożonych wystąpieniem stanu przedrzucawkowego, wdrożenia wczesnego leczenia i zmniejszenia częstości powikłań. W ostatnim czasie szczególną uwagę klinicystów zwróciła rola łożyskowego czynnika wzrostu (PLGF) oraz rozpuszczalnej fms-podobnej kinazy tyrozynowej 1 (sFlt-1) w patofizjologii stanu przedrzucawkowego. Na podstawie piśmiennictwa można stwierdzić, że PLGF indukuje angiogenezę oraz wykazuje właściwości prozapalne, natomiast sFlt-1 działa antagonistycznie do PLGF, poprzez blokowanie jego działania na komórki docelowe. Ponadto można przypuszczać, że PLGF oraz sFlt-1 są czynnikami prognostycznymi stanu przedrzucawkowego ciężarnych. Summary Cardiovascular diseases may increase a woman’s risk for complications during pregnancy. Obstetricians and cardiologists are trying to develop new therapeutic and diagnostic strategies to prevent and treat preeclampsia. Researchers are still looking for new factors involved in the pathogenesis of this disease, which may serve as biomarkers and could be used for early diagnosis of pregnant women at high risk of preeclampsia, for implementation of early treatment and reduce the incidence of complications. Recently clinicians are focused on the role of placental growth factor (PLGF) and soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFLT-1) in the pathophysiology of preeclampsia. On the basis of the literature it can be concluded that PLGF induces angiogenesis and has pro-inflammatory properties, whereas sFLT-1 acts antagonistically to PLGF, by blocking its action on target cells. Moreover, it can be assumed that PLGF and sFLT-1 are predictors of preeclampsia in pregnant women. Słowa kluczowe: stan przedrzucawkowy, łożyskowy czynnik wzrostu, rozpuszczalna fms-podobna kinaza tyrozynowa 1 Key words: preeclampsia, placental growth factor, soluble fms-like tyrosine kinase 1

Wstęp Układ krwionośny jest jednym z elementów organizmu człowieka łączącym tkanki i narządy. U ciężarnych krążenie matki od krążenia płodu oddzielone jest tkankami zwanymi „barierą łożyskową”. Pełni ona m.in. funkcje ochronną i wewnątrzwydzielniczą oraz uczestniczy w transporcie tlenu, substancji pokarmowych, wydalaniu szkodliwych produktów przemiany materii. Szybkość wymiany substancji w łożysku zależy m.in. od przepływu krwi w macicy, dlatego też prawidłowa angiogeneza łożyskowa jest jednym z warunków rozwoju płodu [1]. Ponadto rola układu krwionośnego jest szczególnie istotna w licznych patologiach m.in. stanie przedrzucawkowym [2, 3, 4, 5].

Angiogeneza jest procesem, w wyniku, którego tworzone są nowe naczynia krwionośne. Na podstawie piśmiennictwa stwierdzono, że jest m.in. istotną częścią fizjologicznego miesiączkowania, implantacji zarodka, tworzenia się kosmówki i łożyska oraz porodu. Waskulogeneza to także proces tworzenia się naczyń krwionośnych, ale u zarodka oraz płodu [6, 7]. Angiogeneza zachodzi, gdy utrzymana jest dynamiczna równowaga pomiędzy czynnikami stymulującymi oraz hamującymi. W aktywacji procesów angiogenezy uczestniczy na różnym poziomie wiele cytokin, a m.in.: łożyskowy czynnik wzrostu (PLGF; Placental Growth Factor), naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF; Vascular Endothelial Growth Factor), zasadowy i kwasowy czynnik wzrostu fibroblastów 339

www.diagnostykalaboratoryjna.eu (bFGF/aFGF; basic, acidic Fibroblast Growth Factor), transformujący czynnik wzrostu α i β (TGF-α/β; Transforming Growth Factor α i β), czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α; Tumor Necrosis Factor α), interleukina 8 (IL-8; Interleukin-8), czynnik wzrostu hepatocytów (HGF; Hepatocyte Growth Factor), płytkowy czynnik wzrostu (PDGF; Platelet-Derived Growth Factor), czynnik wzrostu kolonii granulocytów (GCSF; Granulocyte Colony Stimulating Factor) a także, lektyna, folistatyna. Natomiast inhibitorami tych procesów są m.in.: czynnik płytkowy 4 (PF-4; Platelet Factor-4), inhibitor naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGI; Vascular Endothelial Growth Inhibitor), 16 kd fragment prolaktyny, fragment 1 i 2 protrombiny, interleukina-12 i interleukina-18 (IL-12 i IL-18), endostatyna oraz angiostatyna [8, 9]. Zaburzenie w ciążach patologicznych równowagi w działaniach tych czynników uznawane jest za jedną z istotnych przyczyn zarówno nieprawidłowego rozwoju płodu jak i stanu przedrzucawkowego [10, 11]. Stan przedrzucawkowy (preeklampsja) Stan przedrzucawkowy to wieloukładowa choroba będąca jedną z głównych przyczyn śmiertelności płodów i ciężarnych [5, 12, 13, 14, 15]. Dotyczy 2-8% ciężarnych; w Europie 0,4-2,8% ciąż, z czego 15-20% charakteryzuje ciężki przebieg [12, 13]. Definiuje się go jako nadciśnienie indukowane ciążą (>140/90 mmHg stwierdzone dwoma niezależnymi pomiarami) z równocześnie występującym białkomoczem (>300 mg/l lub >500 mg/24godziny lub ≥++ w teście paskowym) [3, 13]. Wyróżnia się stan przedrzucawkowy wczesny, który rozwija się przed 34 tygodniem ciąży oraz późny po 34 tygodniu [13, 16]. Rozwój stanu przerzucawkowego prowadzi do groźnych powikłań zarówno dla ciężarnych (m.in. odklejenie łożyska, „epizody” mózgowo-naczyniowe, rzucawka, niewydolność narządowa, rozsiane wykrzepianie śródnaczyniowe ) jak i dla płodu (m.in. opóźnienie rozwoju śródmacicznego, wcześniactwo, zgon śródmaciczny) [2, 3, 4, 5]. Mimo intensywnych badań etiopatogeneza stanu przedrzucawkowego nie jest do końca poznana. Za jedną z współczesnych hipotez uważa się zaburzenia w krążeniu matczyno-płodowym spowodowane brakiem przebudowy tętnic spiralnych w maciczno-łożyskowe. W początkowym etapie ciąży fizjologicznej komórki rozwijającego się cytotrofoblastu wnikają w ścianę macicy niszcząc śródbłonek tętnic spiralnych. Ściany tętnic spiralnych ulegają przebudowie z naczyń niskoprzepływowych i wysokooporowych w wysokoprzepływowe oraz niskooporowe. Umożliwia to prawidłowy rozwój łożyska. W rozwoju stanu przedrzucawkowego wnikanie cytotrofoblastu w błonę mięśniowa jest upośledzone. Tętnice spiralne pozostają wąskie co istotnie ogranicza dopływ krwi do płodu. Wraz z rozwojem ciąży oraz rosnącym zapotrzebowaniem na substancje odżywcze wzrasta niekorzystny efekt niedokrwienia dla płodu [15]. Niedokrwienie łożyska prowadzi do uwolnienia czynników łożyskowych oraz zaburzeń funkcji czynników angiogennych. Skutkuje to dysfunkcją śródbłonka naczyniowego, którą uważa się za kolejną przyczynę stanu przedrzucawkowego [16]. Śródbłonek w stanie fizjologicznym stanowi barierę między krwią, a pozostałymi warstwami naczynia krwionośnego. Jego prawidłowe funkcjonowanie zapewnia odpowiednią regulację wazomotyryki, 340

hemostazy, angiogenezy, procesów zapalnych i immunologicznych. Komórki śródbłonka wytwarzają liczne czynniki wzrostowe regulujące napięcie mięśni gładkich, wpływające na metabolizm, migrację, proliferację oraz apoptozę komórek [17]. Zaburzenie funkcjonowania śródbłonka definiowane jest jako szereg zmian fizjologicznych oraz morfologicznych prowadzących do upośledzonej dylatacji naczyń, przepływu krwi oraz nasilenia procesów zapalnych. Przejawia się zaburzeniem wytwarzania oraz aktywności biologicznej tlenku azotu (NO) z równoczesnym zmniejszonym uwalnianiem prostacykliny (PGI2), zwiększonym wytwarzaniem czynników naczyniozwężających takich jak endotelina-1 (ET-1), angiotensyna II (ATII), tromboksan A2 (TXA2). Prowadzi to do upośledzenia relaksacji mięśniówki gładkiej, aktywacji zapalnej oraz procesów zakrzepowych. Dysfunkcje śródbłonka charakteryzuje również nasilony stres oksydacyjny przejawiający się zwiększoną ilością reaktywnych form tlenu oraz nadmierna peroksydacja lipidów [18, 19]. W chwili obecnej poziom opieki położniczej i neonatologicznej znacznie wzrósł co ma wpływ na zmniejszenie śmiertelności okołoporodowej matek i noworodków. Jednak możliwości predykcyjne stanu przedrzucawkowego nie uległy zmianie. W tym celu poszukuje się nieinwazyjnych, bezpiecznych dla matki oraz płodu metod diagnostycznych, które ocenią ryzyko wystąpienia choroby [16]. PLGF oraz sFlt-1 Diagnostyka laboratoryjna kobiet w ciąży koncentruje się na postawieniu prawidłowego rozpoznania oraz późniejszej ocenie klinicznej stanu ciężarnej i płodu. Nasilenie stanu przedrzucawkowego opiera się na badaniach biofizycznych (m.in. doppler, ultrasonografia) oraz biochemicznych (m.in. utrata białka z moczem, morfologia krwi, poziom kreatyniny, kwasu moczowego, bilirubiny, aminotransferaz, dehydrogenazy mleczanowej, PLGF oraz rozpuszczalnego receptora dla naczyniowo-śródbłokowego czynnika wzrostu typu 1 (sFlt-1, sVEGFR1) [2, 3, 4, 5]. W procesie prawidłowej implantacji trofoblastu i przemiany kosmówki w łożysko niezbędne są naczyniowe czynniki wzrostu takie jak śródbłonkowy czynnik wzrostu (oraz łożyskowy czynnik wzrostu. Na podstawie badań klinicznych wysunięto hipotezę według której uważa się, że nieprawidłowe stężenia ww. czynników mogą być przyczyną stanu przedrzucawkowego [20, 15]. PLGF należy do rodziny naczyniowych czynników wzrostu śródbłonka [15, 21]. Pierwotnie został wyizolowany z ludzkiego łożyska w 1991 roku przez Persico [22]. Występują cztery izoformy PLGF: PLGF-1 (PLGF131), PLGF-2 (PLGF152), PLGF-3 (PLGF203), PLGF-4 (PLGF224) różniące się właściwościami oraz długością łańcucha aminokwasowego [23, 24]. Jest białkiem o masie cząsteczkowej 38 kDa, dla którego gen znajduje się na 14 chromosomie i składa się z 7 egzonów [23]. Obecność PLGF wykazano w mięśniach szkieletowych, sercu, płucach, tarczycy, komórkach śródbłonka oraz komórkach trofoblastu łożyska. Wzrasta ona w stanach niedokrwienia [21, 25]. Receptorem dla PLGF jest VEGFR-1 znajdujący się m.in. na komórkach śródbłonka, mięśni gładkich oraz monocytów. PLGF odgrywa kluczową rolę w patologicznej angiogenezie rozwijającej się w przebiegu niedokrwienia, różnych

Diagn Lab 2014; 50(4): 339-344 stanów zapalnych, nowotworów. Ten czynnik wzrostu uczestniczy w większości angiogennych i proliferacyjnych efektów VEGF, indukując dojrzewanie oraz stabilizację nowopowstałych naczyń krwionośnych. Dodatkowo mobilizuje komórki zapalne oraz progenitorowe naczyniowe i hematopoetyczne ze szpiku kostnego uczestniczące w tworzeniu naczyń pobocznych [26]. Flt-1 (VEGFR-1) to błonowy receptor dla VEGF-A, VEGF-B oraz PLGF [15, 27]. Posiada cytoplazmatyczną domenę o aktywności kinazy tyrozynowej przedzieloną, istotnym dla rozpoznawania liganda fragmentem niekatalitycznym, krótką domenę błonową oraz składający się z siedmiu domen homologicznych do immunoglobuliny region zewnątrzkomórkowy. Za wiązanie liganda jest odpowiedzialna druga i trzecia domena zewnątrzkomórkowa [27, 28]. Ekspresję Flt-1 zwiększa hipoksja poprzez wzrost poziomu czynnika indukowanego hipoksją (HIF; Hypoxia-Inducible Factor). Flt-1 może funkcjonować jako receptor-pułapka, który wiąże VEGF i uniemożliwia jego połączenie z innymi receptorami np. z VEGFR-2 [15]. Flt-1 odgrywa kluczową rolę w przenoszeniu sygnału mitogennego do komórek śródbłonka naczyniowego i jednocześnie chroni VEGF przed działaniem proteaz [6]. Flt-1 pośredniczy w tworzeniu naczyń w fizjologicznej oraz patologicznej angiogenezie oraz waskulogenezie [6, 29]. Obecność Flt-1 ale również i Flk-1 (VEGFR-2) u zarodków jest kluczowe, ponieważ wykazano, że niedobór tych receptorów u zarodków heterozygotycznych (brak jednego allelu VEGF, VEGF +/-) prowadzi do obumarcia w późniejszym okresie ciąży [30]. Flt-1 występuje na komórkach śródbłonka naczyń, monocytach, makrofagach, eozynofilach [31, 32]. Reguluje on uwalnianie czynnika tkankowego z monocytów oraz eozynofilowego białka kationowego (ECP– Eosinophil Cationic Protein) z eozynofili [32]. sFlt-1 (Soluble fms-like Tyrosine Kinase 1, sVEGFR-1) to rozpuszczalna fms-podobna kinaza tyrozynowa 1, rozpuszczalny receptor typu 1 dla VEGF [16]. Zawiera jedynie domeny homologiczne do immunoglobuliny, przez co nie posiada aktywności kinazowej [33]. Jest wydzielany przez trofoblast. Uczestniczy w hamowaniu proangiogennego czynnika PLGF oraz VEGF co skutkuje hamowaniem rozwoju ciałka żółtego [16, 34]. Powstaje w wyniku alternatywnego splicingu mRNA i jest uwalniany przez komórki śródbłonka naczyń oraz monocyty [15, 16]. Wykazano, że sFlt-1 wiąże PLGF, VEGF-B oraz VEGF z bardzo dużym powinowactwem [33, 35]. Może pełnić rolę naturalnego antagonisty VEGF [5, 15]. Odbywa się to na dwa sposoby: poprzez wiązanie VEGF blokując jego dostęp do swoistych receptorów błonowych lub poprzez tworzenie heterodimerów z receptorami VEGFR-1 i VEGRF-2 [33, 35]. Badania in vitro wykazały, że sFlt-1 w 82% blokuje proliferację oraz migrację komórek śródbłonka indukowaną VEGF [36]. To antagonista PLGF, którego poziom w surowicy kobiet ciężarnych powikłanych stanem przedrzucawkowym pozostaje wysoki [14, 15, 33]. PLGF oraz sFlt-1 były badane pod kątem ich wartości predykcyjnej w diagnozowaniu wystąpienia stanu przedrzucawkowego. Stwierdzono, że oba czynniki mogą być wykorzystywane jako markery wczesnej diagnostyki stanu przedrzucawkowego. W ciąży o przebiegu fizjologicznym PLGF i sFlt-1 warunkują prawidłowy rozwój łożyska [12, 14, 16, 37]. Natomiast w stanie przedrzucaw-

kowym od drugiego trymestru zaczyna wzrastać stężenie sFlt-1 oraz od końca pierwszego trymestru zaczyna się obniżać stężenie PLGF [16]. Niezwykle istotny jest fakt, że te zmiany pojawiają się w początkowej jeszcze bezobjawowej fazie rozwoju choroby. Uchwycenie ich na tak wczesnym etapie pozwala na obniżenie częstości występowania tego schorzenia w grupie wysokiego ryzyka [12, 14, 16, 37]. Na podstawie piśmiennictwa można stwierdzić, że stężenie PLGF w 11-13 tygodniu ciąży w surowicy ciężarnych powikłanych stanem przedrzucawkowym jest niższe w porównaniu do grupy kontrolnej (p