NEW LAV BLOT I 18 Bestimmungen

72251

IMMUNOBLOT ZUR BESTÄTIGUNG VON ANTI-HIV-1-ANTIKÖRPERN IN HUMANSERUM ODER-PLASMA

IVD Qualitätskontrolle des Herstellers Alle von der Firma Bio-Rad hergestellten und verkauften Produkte unterliegen einem Qualitätssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung der Fertigprodukte. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolle unterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Abnahmekriterien entspricht. Die Unterlagen bezüglich der Herstellung und Kontrolle der einzelnen Chargen werden vom Hersteller aufbewahrt.

INHALT

1-

VERWENDUNGSZWECK

2-

KLINISCHE BEDEUTUNG

3-

TESTPRINZIP

4-

ZUSAMMENSETZUNG DES KITS

5-

VORSICHTSMASSNAHMEN

6-

SICHERHEITSVORSCHRIFTEN

7-

ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL

8-

VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN

9-

PROBENENTNAHME UND HANDHABUNG

10 - TESTDURCHFÜHRUNG 11 - VALIDIERUNG, ABLESUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE 12 - LEISTUNGSFÄHIGKEIT 13 - GRENZEN DES TESTS 14 - LITERATUR

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1 - VERWENDUNGSZWECK Der Immunoblot NEW LAV-BLOT I dient zum Nachweis von Anti-HIV-1-Antikörpern in Humanserum oder -Plasma, um ein positives Anti-HIV-1-Screeningergebnis zu bestätigen. 2 - KLINISCHE BEDEUTUNG Das Immunschwächesyndrom AIDS (Acquired immunodeficiency syndrome) wurde 1981 als ein eigenständiges Krankheitsbild beschrieben und identifiziert. Aus den Lymphozyten von Patienten mit AIDS oder AIDS-Frühsymptomen wurden drei Retroviren (LAV, HTLV III und ARV) isoliert, die mit der Gruppe der Lentiviren in Zusammenhang stehen und nicht durch herkömmliche serologische Tests unterschieden werden können. 1986 wurde entschieden, diese drei Viren unter der gleichen Bezeichnung (HIV) einzugruppieren. Die Übertragung des Virus erfolgt hauptsächlich durch Blut- oder Sexualkontakt. Von den Gesundheitsbehörden wurden verschiedene Maßnahmen ergriffen, um die Ausbreitung des Virus einzuschränken; die Untersuchung von Blutspendern wurde obligatorisch, um potentiell infektiöse Spenden zu eliminieren. Die Untersuchung basiert auf dem Nachweis von Antikörpern in Serum oder Plasma durch die Technik des Enzymimmunoassays. Aufgrund der Beschaffenheit der verwendeten Antigene in Screeningtests können unspezifische Ergebnisse nicht gänzlich ausgeschlossen werden. In Anbetracht der ernsten Folgen einer positiven Diagnose muss das Ergebnis eines Screening-Tests durch eine andere Methode bestätigt oder validiert werden. WHO-Experten empfehlen Immunoblotting (Western Blot). Durch diese Technik können die Antikörper, die sich gegen Virusproteine richten, charakterisiert werden und dadurch ein positives Serum bestätigt oder mögliche nicht spezifische Reaktionen identifiziert werden. Der Testkit NEW LAV BLOT I enthält alle für die Durchführung des Bestätigungstests erforderlichen Reagenzien. 3 - TESTPRINZIP Der Test beruht auf der indirekten ELISA-Technik auf einem Nitrocellulose-Teststreifen, der alle HIV-1-Proteine und eine interne anti-IgG-Kontrolle enthält. Die der internen Kontrolle entsprechende Bande befindet sich am unteren Rand des Teststreifens unterhalb der P 18-Bande und ermöglicht eine Validierung der Zugabe der Probe und der Reagenzien sowie der korrekten Testdurchführung. Durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese werden die Proteine des lysierten und inaktivierten HIV-1-Virus entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt und anschließend elektrisch auf eine Nitrocellulosemembran übertragen . Der Test besteht aus folgenden Reaktionsschritten: 1. Rehydratisierung des Teststreifens 2. Inkubation der zu bestätigenden Proben oder der Kontrollseren. Sind anti-HIV-1-Antikörper vorhanden, binden diese an die korrespondierenden Virusproteine auf dem Teststreifen. 3. Nach einem Waschschritt werden die mit alkalischer Phosphatase markierten anti-human-IgG-Antikörper zugegeben. Das Konjugat bindet an die auf der Festphase gebundenen anti-HIV-1-Antikörper. 4. Nach einem weiteren Waschgang und dem Entfernen von überschüssigem Konjugat wird durch die Farbentwicklungslösung die Enzymaktivität der an die Nitrocellulose gebundenen Komplexe aufgezeigt. 5. Erscheinen spezifische Banden, deutet dies auf das Vorhandensein von anti-HIV-1-Antikörpern im Serum hin.

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4 - ZUSAMMENSETZUNG DES KITS Alle Reagenzien sind ausschließlich für die In-vitro-Diagnostik bestimmt. Jedes Kit enthält ausreichend Reagenzien für 18 Bestimmungen. Die Bestimmungen können in mehreren unabhängigen Messreihen durchgeführt werden. ETIKETT

ZUSAMMENSETZUNG DES REAGENZ

DARREICHUNGS FORM 18 Teststreifen in 3 Blotwannen a 6 Zellen

R1

HIV-1 Nitrocellulose Strip

HIV-1-Nitrocellulose-Teststreifen Mit aufgeblotteten HIV-1-Virusproteinen und interner anti-IgG-Kontrolle Teststreifen in Einwegblotwannen

R2

Buffer Solution/Diluent (5X)

Waschlösung/Verdünnungsmittel (X5 konzentriert) Enthält Chloroform (0,5%)

1 Fläschchen 100 ml

Negative Kontrolle Humanserum, negativ für HBsAg, Antikörper gegen anti-HIV-1, anti-HIV-2 und anti-HCV Konservierungsmittel: Natriumazid (< 0,1%)

1 Fläschchen 0,2 ml

1 Fläschchen 0,2 ml

R3

Negative Control

R4

Anti-HIV-1 Positive Control

Anti-HIV-1-Positive Kontrolle Humanserum, positiv für Antikörper gegen anti-HIV-1, negativ für Antikörper gegen anti-HCV und HBsAg, hitzeinaktiviert Konservierungsmittel: Natriumazid (< 0,1%)

R5

Conjugate

Konjugat Anti-human-IgG-Antikörper (Ziege), mit alkalischer Phosphatase markiert Konservierungsmittel: Natriumazid (< 0,1%)

1 Fläschchen 40 ml

R6

Color Development Solution (BCIP/NBT)

Farbentwicklungslösung (BCIP/NBT) 5 Bromo-4 Chloro-3 Indolylphosphat (BCIP) und Nitroblau-Tetrazolium (NBT) als Entwicklungspuffer

1 Fläschchen 40 ml

5 - VORSICHTSMASSNAHMEN Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt von der korrekten Anwendung folgender GLP-Richtlinien ab: • Keine Reagenzien nach deren Verfallsdatum verwenden. • Reagenzien unterschiedlicher Chargen nicht innerhalb einer Messreihe miteinander kombinieren. Hinweis : Es können auch andere Chargen der Pufferlösung (Identifikation auf dem Etikett: R2 in blau) und der Farbentwicklungslösung (R6) verwendet werden, solange immer die gleiche Charge innerhalb einer Messreihe verwendet wird. • Vor der Verwendung 30 Minuten warten, damit sich die Reagenzien bei Zimmertemperatur (18 30°C) stabilisieren. • Reagenzien vorsichtig auflösen und jegliche Kontamination vermeiden. • Sorgfältig gewaschene und mit destilliertem Wasser gespülte Glasgefäße oder vorzugsweise Einwegmaterial verwenden. • Für jede Probe eine neue Pipettenspitze verwenden. • Nie das gleiche Gefäß zum Pipettieren des Konjugates und der Farbentwicklungslösung verwenden. • Die Pipetten auf Genauigkeit, Präzision und Funktionstüchtigkeit überprüfen. • Das Testverfahren darf nicht geändert werden. • Die Kontrollseren sollten mit jeder Messreihe parallel mit den Patientenproben eingesetzt werden. • Während des Tests die Teststreifen nie länger als 10 Minuten unbenetzt lassen. • Falls aufgeschwemmte Partikel in der Farbentwicklungslösung vorhanden sind, sollte vor dem Pipettieren abgewartet werden, bis diese sich auf dem Boden abgesetzt haben. (Diese Partikel beeinträchtigen den Test nicht.) 16

6 - SICHERHEITSVORSCHRIFTEN Alle Reagenzien sind ausschließlich für die In-vitro-Diagnostik bestimmt. • Die Teststreifen nicht mit bloßen Händen anfassen. Kunststoffpinzette verwenden. • Beim Umgang mit Reagenzien Einweghandschuhe tragen. • Nicht mit dem Mund pipettieren. • Das Humanmaterial zur Herstellung der Negativkontrolle (R3) wurde getestet und war nicht reaktiv für Hepatitis-B-Surface-Antigen (HBs Ag) und Antikörper gegen HIV-1, HIV-2 und HCV. • Das Humanmaterial zur Herstellung der Positivkontrolle (R4) wurde getestet und war nicht reaktiv für Hepatitis-B-Surface-Antigen (HBs Ag) und Antikörper gegen HCV. Es wurde hitzeinaktiviert. • Da mit keiner heute bekannten Testmethode mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden kann, dass HIV-, Hepatitis B- oder Hepatitis C Viren oder andere infektiöse Erreger vorhanden sind, sollten alle Reagenzien und Patientenproben als potentiell infektiös angesehen und mit entsprechender Sorgfalt gehandhabt werden. • Alle Materialien, die mit Proben und Reagenzien, die Humanmaterial enthalten, in Berührung kommen, einschließlich der Pufferlösungen, sollten als infektiös betrachtet und entsprechend behandelt werden. • Verschütten von Proben oder probenhaltigen Lösungen vermeiden. • Kontaminierte Oberflächen sollten mit 10%iger verdünnter Natriumhypochloridlösung gereinigt werden. Wenn es sich bei der kontaminierten Flüssigkeit um eine Säure handelt, muss die kontaminierte Oberfläche zunächst mit Natriumbicarbonat neutralisiert und anschließend mit Natriumhypochloridlösung gereinigt und mit Papiertüchern getrocknet werden. Das zum Reinigen verwendete Material muss in einem Behälter für infektiösen Abfall entsorgt werden. • Proben und Reagenzien, die Material humanen Ursprungs enthalten, sowie kontaminierte Materialien und Produkte sollten nach einer Dekontaminierung entsorgt werden, und zwar - entweder durch Eintauchen in eine Natriumhypochloritlösung mit einer Endkonzentration von 5% (1 Teil Nartiumhypochloridlösung auf 10 Teile kontaminierte Flüssigkeit oder Wasser) für die Dauer von 30 Minuten - oder durch Autoklavieren bei 121°C für mindestens 2 Stunden. Autoklavieren ist die beste Methode zum Inaktivieren von HIV und HBV. VORSICHT: natriumhypochlorithaltige lösungen nicht in den autoklaven stellen. • Waschabfälle oder Flüssigkeiten, die biologische Proben enthalten, müssen vor dem Ausgießen in den Abfluss neutralisiert und/oder autoklaviert werden. • Chemikalien müssen gemäß den GLP-Richtlinien gehandhabt und entsorgt werden. • Einige Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann zur Bildung von Blei- oder Kupferaziden in Rohrleitungen führen. Solche Azide können explosiv sein. Um die Azidbildung zu vermeiden, Leitungen mit reichlich Wasser nachspülen, wenn die azidhaltigen Lösungen nach Inaktivierung in den Abfluss entsorgt werden. 7 - ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL • Destilliertes oder entionisiertes Wasser. • Zylinder mit Maßeinteilung für 100 ml, 250 ml und 500 ml. • Pipetten mit Maßeinteilung für 2 ml. • Automatische oder halbautomatische, einstellbare oder feste Pipetten für 20 µl. • Einweghandschuhe. • Wasserstrahl oder Vakuumpumpe mit Sicherheitsflasche. • Natriumhypochloritlösung • Saugfähige Papiertücher. • Pinzette. • 1, 2 oder 3-dimensionale Schüttler (Schütteln für eine homogene Durchmischung und vollständiges Eintauchen der Teststreifen während der Schüttelvorgänge). • Behälter für infektiösen Abfall. • Schutzbrille.

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8 - VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN Jedes Kit enthält ausreichend Reagenzien für 18 Bestimmungen. Die Bestimmungen können in mehreren unabhängigen Messreihen durchgeführt werden. Gebrauchsfertige Reagenzien R1: HIV-1-Nitrocellulose-Teststreifen R3: Negativkontrollserum R4: HIV-1 Positivkontrollserum R5: Konjugat R6: Farbentwicklungslösung (BCIP/NBT) Aufzulösende Reagenzien R2 : Pufferlösung/Verdünnungsmittel (5X) Vorbereitung: Die Fläschchen vor der Verwendung schütteln. Puffer/Verdünnungsmittel im Verhältnis 1:5 in destilliertem Wasser (d. h. für einen kompletten Einsatz 30 ml Pufferlösung + 120 ml destilliertes Wasser) verdünnen. Homogenisieren. Lagerung Kit bei +2 - 8°C lagern. Alle Reagenzien des Kits sind nach dem Öffnen bei einer Lagerung bei +2 8°C bis zum auf der Packung angegebenen Verfallsdatum haltbar . Die verdünnte Pufferlösung (R2) ist bei einer Lagerung bei +2 -8°C bis zu einem Monat haltbar. Jegliche mikrobielle Kontamination der Reagenzien vermeiden. 9 - PROBENENTNAHME UND HANDHABUNG Die Entnahme der Blutprobe erfolgt gemäß der üblichen Vorgehensweise. Der Test sollte mit unverdünntem Serum oder Plasma durchgeführt werden (EDTA, Heparin oder Citrat). Das Serum bzw. das Plasma vom Blutkuchen bzw. den Erythrozyten so schnell wie möglich trennen, um eine Hämolyse zu vermeiden. Eine starke Hämolyse kann die Testleistung beeinträchtigen. Proben, die Gerinnsel enthalten, müssen vor dem Test durch Zentrifugation geklärt werden. Aufgeschwemmte Fibrinaggregate oder -partikel können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Die Proben sollten bei +2 - 8°C gelagert werden, sofern die Analyse innerhalb von 7 Tagen erfolgt, andernfalls sollten sie bei -20°C tiefgefroren aufbewahrt werden. Plasmaproben sollten rasch aufgetaut werden, indem sie wenige Minuten auf 40°C erwärmt werden (um die Fibrinausfällung auf ein Minimum zu reduzieren). Proben, die mehr als dreimal eingefroren und wieder aufgetaut wurden, sollten nicht verwendet werden. Zum Transport sind die Proben gemäß den Bestimmungen für den Transport infektiöser Stoffe zu verpacken. KEINE KONTAMINIERTEN, HYPERLIPÄMISCHEN ODER STARK HÄMOLYTISCHEN SEREN - ODER PLASMEN VERWENDEN. Hinweis: Proben mit einer Albuminkonzentration bis 90 g/l, einer Bilirubinkonzentration bis 100 mg/l, lipämische Proben mit einer Trioleinkonzentration bis 36 g/l sowie hämolytische Proben mit einer Hämoglobinkonzentration bis 10 g/l beeinträchtigen die Ergebnisse nicht. 10 - TESTDURCHFÜHRUNG 1. Vor der Verwendung 30 Minuten warten, damit sich die Reagenzien bei Zimmertemperatur (18 30°C) stabilisieren. Die durchsichtigen Deckel von den verwendeten Einsätzen abnehmen. Stellen Sie sicher, dass die Teststreifenseite mit der Nummerierung sichtbar ist, so dass die Virusproteine auf dieser Seite mit den verschiedenen Reaktionsmedien während der gesamten Testdauer bedeckt sind. Die Teststreifen sollten vorsichtig mit einer Kunststoffpinzette gehandhabt werden. Während des Tests die Teststreifen nicht länger als 10 Minuten unbenetzt lassen. Die Kontrollseren sollten mit jeder Messreihe parallel mit den Patientenproben mitgeführt werden. Die Positivkontrolle wird zur Testinterpretation benötigt. 2. 2 ml des aufgelösten Puffers/Verdünnungsmittels in jede Zelle geben. Unter Schütteln 5 ± 1 Minuten bei Raumtemperatur (18-30°C) inkubieren. 18

3. 20 µl jeder Probe oder jedes Kontrollserums in die entsprechende Zelle geben. Unter Schütteln 2 Stunden ± 5 Minuten bei Raumtemperatur (18-30°C) inkubieren. 4. Den Inhalt jeder Zelle mit einer mit einer Auffangvorrichtung mit Desinfektionsmittel (25%ige Natriumhypochloridlösung) ausgestatteten Vakuumpumpe vollständig absaugen. Darauf achten, dass die Teststreifen während des Absaugens nicht bewegt werden. Dafür die vorgesehenen Absaugwannen verwenden. Jeden Teststreifen mit 2 ml des angesetzten Puffers/Verdünnungsmittels waschen und diesen unverzüglich vorsichtig durch Ansaugen entfernen. Anschließend noch zweimal mit 2 ml des angesetzten Puffers/Verdünnungsmittels unter Schütteln 5 Minuten lang inkubieren und anschließend absaugen (d. h. insgesamt 3 Waschgänge). Nach dem letzten Waschschritt den Puffer durch Absaugen vollständig entfernen. 5. 2 ml Konjugat in jede Zelle pipettieren. Die Konjugatlösung sollte sich zuvor bei Raumtemperatur stabilisiert haben. Unter Schütteln 1 Stunde ± 5 Minuten bei Raumtemperatur (18-30°C) inkubieren. 6. WASCHEN: wie in Schritt 4 beschrieben vorgehen. 7. 2 ml der Farbentwicklungslösung in jede Zelle geben. Falls aufgeschwemmte Partikel in der Farbentwicklungslösung vorhanden sind, sollte vor dem Pipettieren abgewartet werden, bis diese sich auf dem Boden abgesetzt haben. (Diese Partikel beeinträchtigen den Test nicht.) Unter Schütteln inkubieren und das Sichtbarwerden der Virusbanden der Positivkontrolle beobachten, Wenn alle Banden der Positivkontrolle sichtbar sind, Reaktion abstoppen. (Entwicklungszeit: ungefähr 5 Minuten). 8. Reaktion durch Entfernen der Entwicklungslösung und 3maliges Spülen der Teststreifen mit destilliertem Wasser stoppen. 9. Teststreifen zwischen zwei saugfähigen Papiertüchern bei Raumtemperatur (18-30°C) trocknen. Die Teststreifen sortieren und anhand der Referenzmarkierung ausrichten. Die Banden anhand der Positivkontrolle zuordnen und anschließend interpretieren. VORSICHT: Den Bereich der die Virusbanden enthält nicht mit Klebeband in Berührung kommen lassen. 11 - VALIDIERUNG, ABLESUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Validierung der Ergebnisse Eine anti-IgG-Kontrollbande muß am unteren Ende des Blotstreifens deutlich sichtbar sein. Hiermit kann die Zugabe der Probe und der Reagenzien sowie ein korrekter Testablauf validiert werden. Ein Fehlen oder eine schwache Anfärbung der Kontrollbande deutet auf fehlerhaftes Pipettieren der Probe oder der Reagenzien oder eine fehlerhafte Testdurchführung hin. Positive Kontrolle: alle Banden der Virusproteine und Kontrollbande vorhanden. Negative Kontrolle: kein Virusprotein sollte vorhanden sein, Kontrollbande ist vorhanden. Ablesung der Ergebnisse Das Vorhandensein von anti-HIV-1- Antikörpern wird durch Erscheinen von spezifischen Banden (blau-purpur) nachgewiesen. Ihre Position entspricht den Molekulargewichten der in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Virusproteine. WICHTIGER HINWEIS Verwenden Sie die positive Kontrolle (Siehe Abbildung auf Seite 24) zur Lokalisierung und Identifikation der vorhandenen Antikörper-Banden und überprüfen Sie, ob die interne Kontrollbande auf jedem Teststreifen vorhanden ist. Jede spezifische und lesbare Bande muss interpretiert werden.

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BEZEICHNUNG

GENOM

ERSCHEINUNG IM WESTERN BLOT

ART

GP 160

ENV

Glykoproteinvorläufer von GP 110/120 und GP 41

Breite, diffuse Bande

GP 110/120

ENV

Hüllglykoprotein

Breite, diffuse Bande

P 68/66

POL

Reverse Transkriptase

Scharfe Bande

P 55

GAG

Vorläufer des Core-Proteins

Doppelbande

P 52/51

POL

Reverse Transkriptase

Scharfe Bande

GP 41

ENV

Transmembranglykoprotein

Diffuse Bande

P 40

GAG

Vorläufer des Core-Proteins

Scharfe Bande

P 34/31

POL

Endonuklease

Scharfe Bande

P 24/25

GAG

Core-Protein

Scharfe Bande

P 18/17

GAG

Core-Protein

Manchmal Doppelbande

Interpretation der Ergebnisse INTERPRETATION

WHO-KRITERIEN*

CRSS-KRITERIEN**

Positiv

2 ENV ± GAG ± POL

1 ENV + (1 GAG oder 1 POL)

Nicht eindeutig

1 ENV ± GAG ± POL GAG + POL GAG POL

GAG + POL GAG POL ENV

Negativ

Keine Banden Nicht klassifizierbare Banden

Keine Banden Nicht klassifizierbare Banden

* WHO-Kriterien: Weltgesundheitsorganisation. **CRSS-Kriterien: Consortium for Retrovirus Serology Standardization. Inweiss: • Nicht eindeutige Ergebnisse können Folgendes bedeuten: Serokonversion, HIV-2 Infektion oder Kreuzreaktionen aufgrund vorhandener anderer Retroviren. • Kontamination mit positivem Serum kann zu positiven oder nicht eindeutigen Profilen führen. 12 - LEISTUNGSFÄHIGKEIT Spezifizität bei Blutspendern und Klinikpatienten Eine Population von 419 Elisa HIV negativen Proben (214 Proben von Blutspendern und 205 Proben von Klinikpatienten) wurden mit NEW LAV BLOT I getestet. Unabhängig von den verwendeten Interpretationskriterien (WHO oder CRSS) wurden dieselben Ergebnisse ermittelt. ERGEBNISSE

20

Proben

Anzahl der Proben

Negativ

Nicht eindeutig

Positiv

Blutspender

214

180

34

0

Klinikpatienten

205

186

19

0

Insgesamt

419

366

53

0

87%

13%

0%

Spezifität bei Proben mit möglichen Kreuzreaktivitäten Es wurden 57 Elisa HIV negative Proben und positive für folgende Viren wie HBV, HCV, HTLV, HSV, EBV, VZV, CMV oder mit folgenden Pathologien: HAMA, RF, ANA, Toxoplasmose und 5 Proben von Schwangeren mit NEW LAV BLOT I getestet. PROBEN

ERGEBNISSE

5 Myelom, 4 HBV, % HSV IgG

Alle negativ

5 HAMA

1 nicht eindeutig (p25)

5 RF

2 nicht eindeutig (schwach p18)

5 ANA

3 nicht eindeutig (schwach p68, p55, p34)

5 Schwangere

1 nicht eindeutig (p52)

4 HTLV

1 nicht eindeutig (p55)

4 HCV

1 nicht eindeutig (p55, p18)

5 CMV IgG

1 nicht eindeutig (p25)

5 EBV IgG

2 nicht eindeutig (p55, p25)

5 VZV IgG

1 nicht eindeutig (schwach p55)

5 Toxo IgG

1 nicht eindeutig (p18)

48 Proben waren negativ, 14 nicht eindeutig: 3 p25, 3 p18, 5 p55, 1 p52, 1 p34, 1 p52. Keine positive Probe. Unabhängig von den verwendeten Interpretationskriterien (WHO oder CRSS) wurden dieselben Ergebnisse ermittelt. Sensitivität bei HIV-1 positiven Proben 203 Elisa HIV-1 positive Proben wurden mit NEW LAV BLOT I getestet: 5 HIV Gruppe O, 8 mit beginnender Infektion (positives Antigen oder Viruslast) und 84 Proben aus verschiedenen Ländern wie China, Niger und Indien. Je nach verwendeten Kriterien wurden folgende Ergebnisse ermittelt: WHO-KRITERIEN* 2 ENV ± GAG ± POL Proben

Anzahl der Proben

HIV Positiv

203

Nicht eindeutig

Positiv

CRSS-KRITERIEN** 1 ENV + (1 GAG oder 1 POL) Nicht eindeutig

Positiv

8

195

1

202

4%

96%

0,5%

99,5%

* WHO-Kriterien: Weltgesundheitsorganisation. **CRSS-Kriterien: Consortium for Retrovirus Serology Standardization. Sensitivität bei HIV-2 positiven Proben 101 HIV-2 positive Proben, von denen 6 mit PEPTI-LAV HIV-1 und HIV-2 positiv waren, wurden mit NEW LAV BLOT I getestet. WHO-KRITERIEN* 2 ENV ± GAG ± POL Proben

Anzahl der Proben

HIV Positiv

101

Nicht eindeutig

Positiv

CRSS-KRITERIEN** 1 ENV + (1 GAG oder 1 POL) Nicht eindeutig

Positiv

56

45

23

78

56%

45%

23%

78%

* WHO-Kriterien: Weltgesundheitsorganisation. **CRSS-Kriterien: Consortium for Retrovirus Serology Standardization.

21

Sensitivität bei Serokonversions-Panels 55 Proben aus 17 Serokonversionspanel (BBI, NABI et BCP) und 10 Proben von 4 Klinikpatienten, d. h. insgesamt 21 Serokonversionspanel, wurden mit NEW LAV BLOT I getestet. WHO-KRITERIEN* 2 ENV ± GAG ± POL Proben 65

Positiv

Nicht eindeutig

CRSS-KRITERIEN** 1 ENV + (1 GAG oder 1 POL) Negativ

Positiv

Nicht eindeutig

Negativ

2

46

17

37

11

17

3%

71%

26%

57%

17%

26%

* WHO-Kriterien: Weltgesundheitsorganisation. **CRSS-Kriterien: Consortium for Retrovirus Serology Standardization. Schlussfolgerung: Die Anwendung der CRRS-Kriterien führt zu einer erhöhten Sensitivität des Tests und einer signifikanten Verringerung der Anzahl der nicht eindeutigen Ergebnisse zugunsten positiver Ergebnisse. Reproduzierbarkeit • Testintern Eine HIV-negative Probe und 3 verdünnte positive Proben (2 schwach und 1 mittel) wurden 6 Mal innerhalb desselben Tests getestet. Die Interpretationen wurden mit beiden Kriterien vorgenommen. Es wurden unabhängig von den verwendeten Interpretationskriterien (WHO oder CRSS) dieselben Ergebnisse ermittelt. • Testübergreifend Eine HIV-negative Probe und 6 verdünnte positive Proben (3 schwach, 3 mittel) und 3 stark positive Proben wurden über 5 Tage getestet. Die Interpretationen wurden mit beiden Kriterien vorgenommen. Es wurden unabhängig von den verwendeten Interpretationskriterien (WHO oder CRSS) dieselben Ergebnisse ermittelt. 13 - GRENZEN DES TESTS • Aufgrund der Varianz von HIV-1 (Gruppe M und Gruppe O) und HIV-2 kann die Möglichkeit von falsch negativen Reaktionen nicht gänzlich ausgeschlossen werden. Mit keiner heute bekannten Testmethode kann mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden, dass kein HIV-Virus vorhanden ist. • Während der frühen Phase der Infektion kann es zu einem positiven Ergebnis im Screening-Test und einem negativen Ergebnis im Bestätigungstest kommen. Ein negatives Ergebnis deutet in diesem Fall lediglich darauf hin, dass die Testprobe keine im NEW LAV BLOT I nachweisbaren anti-HIV-Antikörper enthält. Aufgrund eines solchen Ergebnisses darf jedoch die Möglichkeit einer Exposition gegenüber einer HIV-1/HIV-2-Infektion nicht ausgeschlossen werden. Es wird empfohlen, zu einem späteren Zeitpunkt eine weitere Probe zu entnehmen. • Das Vorhandensein einer einzigen ENV-Bande für eine Probe, die nach den CRSS-Kriterien mit NEW LAV BLOT I positiv bestätigt wurde, schließt die Möglichkeit einer HIV-2 Infektion nicht aus. • Bei „nicht eindeutigen" Ergebnissen sollten folgende Situationen nicht ausgeschlossen werden: Serokonversion, HIV-2 Infektion, oder Kreuzreaktionen aufgrund anderer Retroviren. • Bei einem atypischen Profil mit schwacher Reaktivität der Hüllproteine (GP 120/GP 160) im Gegensatz zu einem deutlich positiven Ergebnis von GAG- und POL-Proteinen liegt womöglich eine HIV-2 oder HIV-1-Infektion der Gruppe O vor. In diesem Fall sind weitere Untersuchungen erforderlich.

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14 - LITERATUR 1. CLAVEL F., BRUN-VEZINET F., GUETARD D. et al. : LAV II - un second rétrovirus associé au SIDA en Afrique de l'Ouest. C.R. Acad. Sc. Paris, 1986, 13, 485-488. 2. CLAVEL F., GUYADER M., GUETARD D. et al. : Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature, 1986, 324, 691 - 695. 3. NEWMARK P. : AIDS in an African context. Nature, 1986, 324, 611. 4. POPOVIC M., SARNGADHARAN M.G., READ E., GALLO R.C. : Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV III) from patients with AIDS and pre – AIDS Science, 1984, 224, 497 - 500. 5. KANKI P.J., BARIN F., M’BOUP S. et al. : New human T-lymphotropic retrovirus related to Simian T - lymphotropic virus type III. (STLV III Agm). Science, 1986, 232, 238 - 243. 6. BRUN-VEZINET F., REY M.A., KATLAMA et al. : HIV/LAV2 in AIDS and ARC patients : Clinical and virological studies. Lancet. 7. REY F., SALAUN D. LESBORDES J.L. et al. : Evidence for HIV-1 and HIV-2 double infection in Central African Republic. Lancet, II, 1986, 1391 - 1392. 8. MOLBAK K., LAURITZEN E., FERNANDES D. et al. : Antibodies to HTLV IV associated with chronic, fatal illness ressembling “ slim ” disease. Lancet, II, 1986, 1214 - 1215. 9. BIBERFELD G., BOTTIGER B., BREDBERG - RADEN U. et al. : Findings in fowe HTLV-IV seropositive women from West Africa. Lancet, II, 1986 - 1330. 10. ESTEBAN J.I., CHANG - CHIN T., KAY J.W.D. et al. : Importance of Western Blot analysis in predicting infectivity of anti-HTLV III/LAV positive blood. Lancet, II, 1985, 1083 - 1086. 11. LAURITZEN E., LINDHARDT B.O. : Antibodies against human immuno-deficiency (HIV) detected by immunobloting. In BJERRUM O.J., HEEGAARD N.H., eds. : Handbock of immunobloting of proteins CRC Press. 12. TOWBIN H., STAEHLIN T., GORDON J. : Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications. Proc. Nat. Acad. Scien., USA, 1979, 76, 4350 - 4353. 13. SOUTHERN E.M. et al. : Detection of specific sequences among DNS fragments separated gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 1975, 98, 503. 14. ARNHEIM N., SOUTHERN E.M. et al. : Heterogeneity of the ribosomal genes in mice and men. Cell. 1977, 11, 363. 15. KHYSE - ANDERSEN J. : Electroblotting of multiple gels : a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins. J. Biochem. Biophys. Meth., 1984, 10, 203 - 209. 16. JOHNSON D.A., GAUTSCH J.W., SPORTMAN J.R., ELDER J.H.T.: Improved technic utilizing non - fat dry milk for analysis of proteins and nucleic acids transfer to nitrocellulose.Gene. Annals. Tech., 1984, 1, 3 - 8. 17. DESJARLIS DC, MARMOR M, COHEN H, et al :Antibodies to a retrovirus etiologically associated with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) in populations with increased incidence of the syndrome. Morbidity Mortality Weekly Rep 1984, 33 : 377-379. 18. BARRE-SINOUSSI F. CHERMANN J.C., REY F., et al :Isolation of T-lymphotropic retroviruses from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS), Science 1983, 220:868-871. 19. GALLO R.C., SALAHUDDIN S.Z., POPOVIC M. et al. :Frequent detection and isolation of cytopathic retrovirus (HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS; Science 1984, 224:500-503. 20. CLAVEL F. GUETARD D., BRUN-VEZINET F. : Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science 1986, 233:343-346. 21. CENTERS FOR DISEASE CONTROL :AIDS due to HIV-2 infection - New Jersey. Morbidity Mortality Weekly Rep 1988, 37:33-35. 22. VALKIRS G.E., BARTON R. : Immunoconcentration® - A new format for solid phase immunoassays Clin. Chem. 1985, 31 : 1427-1431, 1985. 23. RESNICK L., VEREN K., SALAHUDDIN S.Z., et al. :Stability and inactivation of HTLV-III/LAV under clinical and laboratory environments. JAMA 1986, 255 : 1887-1891. 24. BOND W.W., FAVERO M.S., PETERSEN N.J., et al. :Inactivation of hepatitis B virus by intermediate to high level disinfectant chemicals. J. Clin. Micro. 1983, 18 : 535-538. 25. WHO (World Health Organisation) weekly epidemiological record 1990, 37 Page 281-283. 23

Beispiel eines Profils mit einer Positive Kontrolle R4

Achtung : Die Banden können sich in Wirklichkeit von denjenigen auf dem oben stehenden Bild unterscheiden: Das Bild sollte nicht für die Schlussauswertung verwendet werden. Die Schlussauswertung muss anhand des positiven Kontrollstreifens erfolgen um die Antikörper des Patienten identifizieren zu können. Die interne Kontrollbande muss auf jedem Streifen sichtbar sein.

Positive Control R4

GP 160 GP 110/120

P 68/66 P 55 P 52/51 GP 41 P 40

P 34/31

P 24/25

P 18/17

Internal Control

24

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) -   CE (   98/79/CE   in vitro       ) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro)

(NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия)

IVD

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- For in vitro diagnostic use - Pour diagnostic in vitro - Para diagnóstico in vitro - Per uso diagnostico in vitro - In-vitro-Diagnostikum - Para uso em diagnóstico in vitro - In vitro-diagnostik - In vitro diagnose -  in vitro     - Do stosowania in vitro - in vitro diagnostikai - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks - Na diagnostiku in vitro - Pro diagnostiku in vitro

(NO) - Til in vitro-diagnostikk (RO) - Pentru diagnostic in vitro (BG) - За ин витро диагностика

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- Manufacturer - Fabricant - Fabricante - Produttore - Hersteller - Fabricante - Tillverkad av - Fremstillet af -     - Producent - Gamintojas - Gyártó - Tootja - Výrobca - Výrobce

(NO) - Produsent (RO) - Producător (BG) - Производител

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- Batch code - Code du lot - Código de lote - Codice del lotto - Chargen-Bezeichnung - Código do lote - Batchnr - Batchkoden -   - Numer serii - Serijos numeris - Gyártási szám - Partii kood - Číslo šarže - Číslo šarže

(NO) - Partikode (RO) - Număr de lot (BG) - Партиден номер

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- Catalogue number - Référence catalogue - Número de catálogo - Numero di catalogo - Bestellnummer - Número de catálogo - Katalognummer - Katalognummer -    - Numer katalogu - Katalogo numeris - Cikkszám - Katalooginumber - Katalógové číslo - Katalogové číslo

(NO) - Katalognummer (RO) - Număr de catalog (BG) - Каталожен номер

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- Authorised Representative - Représentant agréé - Representante autorizado - Distributore autorizzato - Bevollmächtigter - Representante Autorizado - Auktoriserad representant - Autoriseret repræsentant -  

   - Upoważniony Przedstawiciel - Įgaliotasis atstovas - Meghatalmazott Képviselő - Volitatud esindaja - Autorizovaný zástupca - Zplnomocněný zástupce

(NO) - Autorisert representant (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Упълномощен представител

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- Expiry date YYYY/MM/DD - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Estable hasta AAAA/MM/DD - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Data de expiração AAAA/MM/DD - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD - 

   YYYY/MM/DD - Data ważności YYYY/MM/DD - Galioja iki YYYY/MM/DD - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP - Použiteľné do RRRR/MM/DD - Datum exspirace RRRR/MM/DD

(NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Срок на годност година/месец/ден

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- Storage temperature limitation - Limites de températures de stockage - Temperatura límite - Limiti di temperatura di conservazione - Lagertemperatur - Limites de temperatura de armazenamento - Temperaturbegränsning - Temperaturbegrænsning -           - Temperatura przechowywania - Saugojimo temperatūriniai apribojimai - Tárolási hőmérsékleti határok - Piirangud säilitustemperatuurile - Skladovacia teplota od do - Teplotní rozmezí od do

(NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- Consult Instruction for use - Consulter le mode d'emploi - Consulte las instrucciones de uso - Consultare le istruzioni per uso - Siehe Gebrauchsanweisung - Consulte o folheto informativo - Se bruksanvisningen - Se instruktion før brug -         - Sprawdź instrukcję - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje - Olvassa el a használati utasítást - Kasutamisel vaata instruktsiooni - Katalógové číslo - Viz návod k použití

(NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

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01/2009 Code: 883572