INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Instituto Politécnico Nacional CICATA-Querétaro

INFORME FINAL PROYECTO SIP 20070222

REMOCION DE METALES POR MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE BIOPOLIMEROS

RESPONSABLE: DRA NORMA GABRIELA ROJAS AVELIZAPA

Febrero 2008

CONTENIDO

1.

Introducción ________________________________________________3

1.1

Antecedentes directos _________________________________________6

1.2

Objetivo General _____________________________________________6

2.

Metodología ________________________________________________6

2.1

Caracterización, conservación e identificación de los microorganismos en estudio _6

2.2

Estudios de la tolerancia/remoción de metales por microorganismos _________7

2.3

Estudios de bioabsorción de metales en cultivo líquido ___________________8

3.

Resultados ________________________________________________10

3.1

Caracterización morfológica de los microorganismos ___________________10

3.2

Conservación de microorganismos ________________________________10

3.3

Identificación molecular de microorganismos ________________________12

3.4

Selección de microorganismos por su capacidad de remoción de metales _____15 3.4.1 En discos de inhibición ____________________________________15 3.4.2 En medio agar-metal _____________________________________17 3.4.2.1 Revelado con H2S para determinar la remoción de metal en medio agarmetal ______________________________________________21 3.4.3 Evaluación de la absorción/remoción de metales por biomasa _________23 3.4.3.1 Curvas de crecimiento ___________________________________23 3.4.3.2 Evaluación de la absorción/remoción/bioabsorción de metales por los microorganismos____________________________________________24

4.

Conclusiones ______________________________________________26

5.

Bibliografía ________________________________________________27

2

1. Introducción

La contaminación por metales de suelos, aguas superficiales y subterráneas así

como sedimentos se ha incrementado en forma paralela a la actividad industrial, principalmente debido a la falta de normatividad en la materia y a la inadecuada disposición y manejo de desechos industriales y municipales. Los metales se encuentran en el subsuelo en forma de minerales, por lo que durante su extracción, beneficio y purificación se generan gran cantidad de desechos potencialmente tóxicos, los cuales son liberados al ambiente contaminando aire, suelo y cuerpos de agua, ocasionando un serio daño al ecosistema. Además de esto, durante los procesos de fundición y refinación se generan partículas que son depositadas en distintos lugares por la acción del viento, así también por la descarga de aguas residuales con altos contenidos de metales. La contaminación del suelo por metales produce diversos efectos en los ecosistemas (Razo et al., 2004; Carrizales et al., 2006; Castro-Larragoitia et al., 1997: Ongley et al., 2003; INE-SEMARNAT, 2005) encontrándose entre las principales: ♣ transporte de contaminantes hacia aguas superficiales y subterráneas ♣ absorción y acumulación de contaminantes por plantas y animales ♣ intoxicación por contacto directo en los sitios contaminados El tratamiento inadecuado de efluentes residuales tiene como consecuencia el transporte de los contaminantes hacia el agua de ríos, lagos y presas, y dependiendo de la naturaleza del contaminante, éste puede precipitar y aumentar los contenidos presentes en los sedimentos, los cuales entran en contacto con los organismos base de la cadena alimenticia (INE-SEMARNAT, 2002; Acuagranjas, 2005). Además, cuando se realiza el tratamiento de aguas residuales se generan lodos de desecho, los cuales son utilizados como aditivos para suelos de cultivo. La toxicidad de los metales depende principalmente de tres factores: (1) la concentración en que se encuentra, muchos metales se consideran necesarios para el funcionamiento adecuado de los organismos en cantidades traza pero al aumentar su concentración, pueden llegar a ser tóxicos; (2) tipo de especie que forman en un medio específico, sólo ciertas especies de metales con determinadas cargas son tóxicas, es decir, presentan características físicas o químicas que los hacen biodisponibles (Kiely, 1999).

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La remoción de un contaminante de un sitio puede realizarse utilizando diversos tipos de tecnologías, las cuales se clasifican dependiendo de los principios utilizados, la elección dependerá de las características del sitio y del contaminante. En México se ha evaluado la factibilidad de aplicación de diversas tecnologías para la remediación de suelos contaminados con metales, entre estas se encuentran: separación física, lavado de suelos, remediación electrocinética, solidificación/estabilización y biorremediación utilizando bacterias sulfato-reductoras (Velasco et al., 2004). El tratamiento biológico para la remoción de contaminantes tiene dos grandes divisiones: la fitorremediación y la biorremediación, las cuales consisten en la utilización de organismos vivos o productos derivados de ellos, para contener o remover compuestos tóxicos como los metales. Las ventajas del uso de estos tratamientos consisten en que pueden ser selectivos en cuanto al contaminante a tratar, efectivos en cuanto a costos y se consideran tecnologías más benéficas para el ambiente (Volke y Velasco, 2002). Las desventajas, se refieren principalmente a los largos periodos de tratamiento y la necesidad de equipos específicos (reactores, etc.) así como la generación de cantidades importantes de biomasa microbiana. Una característica determinante en la elección del método a emplear es que los metales no son susceptibles de ser degradados por lo que únicamente se disminuye su toxicidad o su movilidad por medio de distintos procesos. A pesar de lo anterior, se tienen reportes que señalan que la remoción de metales utilizando sistemas de remediación con microorganismos puede ser eficiente y rentable en el tratamiento de sedimentos contaminados mediante el uso de reactores de lecho fluidizado utilizando bacterias sulfatoreductoras (Seidel et al., 2004) así como mediante el empleo de biopolímeros modificados, los cuales son sensibles a la temperatura y reutilizables (Kostal et al., 2005). En el tratamiento de suelos contaminados con metales se ha evaluado la precipitación de los mismos haciendo uso de consorcios de bacterias sulfato-reductoras en reactor anaerobio de flujo ascendente con una eficiencia de remoción de plomo del 99.8% (Volke et al., 2005). La interacción entre la biomasa, ya sea viva o muerta, con metales puede llevarse a cabo tanto en el interior, en el exterior o en la superficie de la célula (Suárez y Reyes, 2002).

De acuerdo con el trabajo de Gadd y White (1993) la localización de algunos

procesos de captación de metales puede darse en el espacio intracelular, periplásmico,

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pared celular, materiales asociados a células y reacciones extracelulares. Sin embargo, en el tratamiento de residuos que contienen metales tóxicos, los procesos que se utilizan se basan en la bioabsorción, precipitación extracelular y captación a través de biopolímeros purificados y de moléculas especializadas (Cañizares-Villanueva, 2000). Diversos mecanismos tienen lugar en el interior, exterior y alrededores del microorganismo, dependiendo del tipo de interacción que se presenta entre el metal y el microorganismo. A nivel extracelular pueden presentarse mecanismos de movilización e inmovilización; pueden secretarse compuestos orgánicos de bajo peso molecular con alta afinidad por el hierro (sideróforos). La interacción con la superficie celular depende de la composición estructural

característica del microorganismo, las bacterias Gram positivas presentan

mayor capacidad de unión con especies metálicas con respecto a las Gram negativas (Suárez y Reyes, 2002). A nivel intracelular, el metal acumulado desencadena transformaciones enzimáticas o síntesis de proteínas específicas (metalotioninas). De acuerdo con diversos estudios (Hernández et al., 1998; Roane, 1999; Taniguchi

et al., 2000; Richards et al., 2002; Yilmaz, 2003; Hetzer et al., 2006) la capacidad de acumulación o remoción de metales varía ampliamente dependiendo del metal o metales en cuestión, el microorganismo involucrado y las condiciones de cultivo en que se realice el experimento.

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1.1 Antecedentes directos Los microorganismos utilizados en el presente proyecto provienen de un lago de brea denominado “Pitch Lake” localizado en Trinidad y Tobago, donde se lograron aislar 22 microorganismos de los cuales se estudiaron 7 en este trabajo. La preselección de los aislados se basó en la producción de exo-polisacáridos (EPS) y su capacidad para retener metales como Ni, Mn, Se y V (datos no publicados). 1.2 Objetivo General Evaluar la capacidad de remoción de metales que presentan microorganismos productores de biopolímeros aislados de un lago de brea.

2. Metodología En seguida se describen los métodos utilizados durante el desarrollo del proyecto.

2.1 Caracterización, conservación e identificación de los microorganismos en

estudio La morfología colonial de los aislados se evaluó por siembra por estría cruzada

utilizando placas de agar nutritivo. En forma paralela se realizaron diferentes tinciones: tinción de Gram, tinción de esporas por el método de Wirtz-Conklin, tinción negativa con tinta china para evidenciar presencia de cápsula (Wilkinson, 1958), tinción de cristales paraesporales (Ammonds, 2002), tinción de polisacáridos por retención del colorante rojo congo (Ruijssenaars y Hartmans, 2001). Una vez que se estableció que los aislados se encontraban puros se evaluó la efectividad de conservación a corto plazo (30, 90 y 180 días) en tres distintos medios: suelo, papel filtro, agar nutritivo/glicerol para lo cual se utilizó una asada del microorganismo en estudio, la cual fue depositada en el medio a evaluar. La metodología empleada para la identificación por secuenciación parcial de 16S rADN se realizó de acuerdo a lo reportado por Cervantes-González (2006). La amplificación por PCR (Polimerase Chain Reaction) de un fragmento de aproximadamente 1361 bp se realizó utilizando los primers CG0R605 5’-CCCGGGAACGTATTCACCG-3’ y FBac349 5’- ATCCTGGCTCAGRAYGAACGC-3’, termociclador

Gene

Amp

PCR

System

la reacción se llevó a cabo en un

2400

bajo

las

siguientes

condiciones:

precalentamiento a 94ºC durante 5 min., desnaturalización a 94ºC durante 30 seg, alineamiento a 59.7ºC durante 30 seg, alargamiento a 72ºC durante 30 seg y un tiempo

6

de permanencia final de 7 min a 72ºC, este ciclo se repitió 25 veces, el producto obtenido fue purificado, caracterizado en gel de agarosa al 1% contrastando con bromuro de etidio y cuantificado a 260 nm (1U A260 = 50 µg / ml). El secuenciamiento de aproximadamente 350 bp se realizó utilizando el kit de Big Dye Terminador v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems cat. 4636917) y fue realizado en ABI-PRISM.

Las secuencias obtenidas fueron analizadas mediante análisis BLAST

v2.2.14 de NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/) y comparadas con las almacenadas en el Gen Bank. Las secuencias de los aislados y las obtenidas del Gen Bank fueron cortadas y alineadas, el análisis filogenético se realizó utilizando el programa Mega4 (Tamura et al., 2007), la historia evolutiva se infirió utilizando el método Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) con un bootstrap de 500 réplicas, las distancias evolutivas fueron calculadas utilizando el método Maximum Composite Likelihood (Tamura et al., 2004).

2.2 Estudios de la tolerancia/remoción de metales por microorganismos Se realizaron dos series experimentales con el fin de evaluar la tolerancia de los aislados hacia los metales utilizando dos métodos distintos: i) inhibición de crecimiento en presencia de discos impregnados con metal, y ii) crecimiento en medio agar metal y revelado con H2S. Estos experimentos fueron realizados en cajas de petri conteniendo metales y/o discos en distintas concentraciones (ver Tabla 1). Diversas sales metálicas se utilizaron para preparar una solución patrón de concentración 0.1 M, excepto para ZnCl2 cuya concentración patrón fue de 0.5 M, éstas soluciones fueron esterilizadas por filtración, utilizando filtros de celulosa de 0.2 μm. Tabla 1

Sales metálicas y concentraciones evaluadas

Sal Cd(NO3)2.4H2O K2Cr2O7 Ni(NO3)2.6H2O Pb(NO3)2 Na2SeO3 NaVO3 ZnSO4.7H2O (Znb) ZnCl2 (Zna)

Concentración (mM) 4 5 7 6 6 5 9 15

2.5 3 5 4 3 3 6 10

1 1 3 2 1 1 3 5

7

La evaluación de la inhibición de crecimiento por discos conteniendo las sales metálicas (Leigh-Emma, 2000), se realizó inoculando placas de agar nutritivo con 0.1 ml de cultivos frescos de cada uno de los aislados (OD620=0.8-1.0). Posteriormente se colocaron, sobre el agar, los discos (7 mm de diámetro) impregnados con las soluciones del metal (ver Tabla 1) y se incubaron por 72 h a 30°C. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se midieron los halos de inhibición formados. Para la evaluación de crecimiento y revelado en agar-metal, los aislados en estudio se inocularon por picadura en placas de agar nutritivo adicionado con la cantidad necesaria de solución metálica para obtener la concentración requerida (ver Tabla 1) y se incubaron por 24-48 hr a 30oC, transcurrido este tiempo se midió el diámetro de colonia desarrollada. La remoción del metal del medio se evidenció luego de exponer cada placa a H2S generado in situ durante 15 min (Pümpel

et al., 1995) mediante la precipitación del sulfuro metálico correspondiente, la formación de un halo alrededor de la colonia se consideró como prueba positiva de remoción. La prueba positiva de acumulación de selenio se evidenció cuando los aislados crecidos en el medio adicionado con Se, en las distintas concentraciones evaluadas, presentaron una coloración rojo ladrillo (Roux et al., 2001). El crecimiento de los microorganismos en estudio en medio agar-metal se comparó con un control (agar nutritivo) y, con el fin de establecer diferencias significativas, se realizó el tratamiento de los datos por el método Holm-Sidak utilizando SIGMA-STAT 3.5.

2.3 Estudios de bioabsorción de metales en cultivo líquido Con el fin de establecer el punto en que cada aislado se encuentra en la fase estacionaria temprana, fue necesario conocer la cinética de crecimiento de los microorganismos en medio líquido libre de metales. Por lo cual se realizó el monitoreo de crecimiento en caldo nutritivo a 30oC y 180 rpm en baño con temperatura controlada y agitación recíproca. Se agregó una asada de cada aislado en 40 ml de caldo nutritivo y se monitoreó el crecimiento en el tiempo cero y cada 2 hr. durante las primeras 12 hr. y luego a las 24, 36 y 48 hr, valorando la densidad óptica de una muestra del cultivo (con la dilución apropiada cuando fue necesario) medida a 620 nm en espectrofotómetro Lambda 40 (Perkin Elmer), y también determinando la cantidad de proteína presente en el cultivo por el método de Bradford (1976) utilizando BSA como estándar, para lo cual se separaron alícuotas de 100 µl del cultivo y se dejaron en congelación hasta la determinación.

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Los valores de OD620 y proteína se graficaron con respecto al tiempo y, a partir de la gráfica, se estableció el lapso de crecimiento exponencial. Los valores de crecimiento al inicio y final de la fase exponencial se utilizaron para los cálculos de tasa de crecimiento, tiempo de generación y número de generaciones para cada uno de los aislados. Como prueba confirmatoria de bioabsorción o remoción, se realizó un ensayo utilizando el método reportado por Pümpel et al., (1995). Donde cada uno de los aislados en estudio se cultivó en caldo nutritivo hasta la fase estacionaria temprana (información obtenida en la sección 2.4.2) a 30oC y 150 rpm. En seguida se tomaron alícuotas del cultivo anterior (100 µL por cada 40 ml de caldo) y se inocularon nuevamente en caldo nutritivo hasta la fase estacionaria temprana a 30oC y 180 rpm. Con el fin de determinar la cantidad de peso seco de biomasa por unidad de volumen se tomó un volumen medido de cada cultivo, se centrifugó a 8000 rpm, se dejó secar a 40oC durante 24 hr y se llevó a peso constante. Para el experimento de remoción, se separaron alícuotas de 3 ml de cada cultivo, se centrifugaron a 8000 rpm, se lavaron con agua desmineralizada y centrifugaron nuevamente a 8000 rpm para separar la biomasa en forma de pellet. Cada pellet de biomasa fue resuspendido en un volumen de 3 ml de solución metálica de diferente concentración (ver tabla 7), los tubos fueron incubados a 30oC y 180 rpm durante 24 hr. después de este tiempo se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min y se realizaron dos lavados con agua desmineralizada. El sobrenadante y el agua recuperada de los lavados se someten a digestión con HNO3 utilizando el método EPA 3010 A (1990) para determinar la cantidad de metal presente por ICP-OES. También se realizó la digestión de cantidades medidas de las soluciones metálicas utilizadas, de concentración conocida, con el fin de evaluar la eficiencia de digestión del método empleado. La cantidad de metal removida por cada tratamiento se determinó por la diferencia entre la cantidad determinada en la solución metálica y la cantidad determinada en el sobrenadante, este valor se relacionó con la cantidad de biomasa (peso seco) en cada tratamiento al final del experimento.

Los

resultados se reportan en mg de metal removido por mg de biomasa.

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3. Resultados En el siguiente apartado se describen los resultados de la caracterización e identificación de los microorganismos en estudio, así como la evaluación de la tolerancia que presentaron los aislados hacia diversos metales en cultivo sólido. Posteriormente se presentan los resultados de remoción de metales en cultivo líquido, a partir de los cuales se estableció la afinidad y la capacidad de remoción de los distintos metales por los microorganismos.

3.1 Caracterización morfológica de los microorganismos En las tablas 2 y 3 se presentan los resultados de la caracterización de los microorganismos en estudio. Como puede observarse seis de los siete aislados (PL3, PL4, PL7, PL13, PL14 y WTFI) son bacilos Gram (+) formadores de esporas y positivos en la tinción de EPS, de los cuales únicamente PL14 tiene cápsula y forma cristales paraesporales; el séptimo (PL18) es un bacilo corto Gram (-), al cual no fue posible determinar si produce EPS.

3.2 Conservación de microorganismos La evaluación de la conservación de los aislados en distintos medios indicó que, durante 180 días, la conservación para la mayoría de los microorganismos fue efectiva ya que se obtuvo un crecimiento abundante y no se detectó contaminación. Las células se mantuvieron viables en los periodos de tiempo evaluados y la morfología de los aislados fue conservada. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 4. Sin embargo, a pesar de lo anterior, se observaron diversos inconvenientes en el caso de la conservación en medio de agar nutritivo/glicerol pues las colonias se desprenden fácilmente del agar lo cual dificultó el muestreo. Además el aislado PL18, conservado en este medio durante 30 días, presentó un cambio en su morfología colonial, lo cual no es deseable. Después de 60 días de conservación, PL18 ya no fue capaz de crecer.

.

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Tabla 2 Aislado

Morfología colonial de los microorganismos en estudio provenientes del lago de brea

Tamaño

Forma

Elevación

Borde

Color

Superficie

Aspecto

Consistencia

(mm) PL-3

2

puntiforme

plano

ondulado

blanco

rugoso

húmedo

suave

PL-4

2

irregular

plano

entero

blanco

liso

húmedo

suave

PL-7

5

circular

plano

ondulado

blanco

rugoso

seco

suave

PL-13

4

irregular

plano

entero

blanco

liso

seco

suave

PL-14

4

irregular

plano

ondulado

blanco

rugoso

húmedo

viscoso

PL-18

1

puntiforme

plano

entero

translucido

liso

húmedo

suave

WTFI

4

irregular

plano

ondulado

blanco

rugoso

seco

suave

Tabla 3

Morfología microscópica de los microorganismos en estudio provenientes del Pitch Lake

Aislado PL3

Forma bacilo

Gram +

Espora +

Cápsula -

Cristales -

PL4

bacilo

+

+

-

-

PL7

bacilo

+

+

-

-

PL13

bacilo

+

+

-

-

PL14

Bacilo

+

+

+

+

PL18

bacilo corto

-

-

-

-

WTFI

bacilo

+

+

-

-

Codificación: + positivo, - negativo

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Tabla 4

Conservación de los microorganismos productores de EPS provenientes del lago de brea Suelo

Aislado

15 d

30 d

Papel filtro 90 d

15 d

30 d

90 d

Agar nutritivo/glicerol 15 d

30 d

PL 3

++++

++++

++++

PL 4

++++

++++

+++

PL 7

++++

++++

+++

PL 13

+++

+++

+++

PL 14

+++++

++++

++++

PL 18

++++

++++

-

WTFI

++++

++++

++++

90 d

d= días, ++++ crecimiento abundante, +++ buen crecimiento, - sin crecimiento

3.3 Identificación molecular de microorganismos Las secuencias depuradas obtenidas presentaron diferencias en tamaño entre los distintos aislados estudiados, debido a que se obtuvieron como resultado de la secuenciación de los segmentos forward y reverse y del alineamiento entre ellos. La secuencia depurada de PL18 se obtuvo utilizando la secuenciación forward ya que la reacción de secuenciación reverse no dio resultados coherentes. La tabla 5 presenta las secuencias depuradas obtenidas del análisis realizado. Cabe indicar que no fue posible identificar los iniciadores utilizados para el secuenciamiento dentro de las secuencias debido a que éstas proceden de productos de PCR de mayor tamaño. El procesamiento de los resultados por análisis Blast para cada una de las secuencias anteriores, dio como resultado la generación del árbol filogenético (dendograma) de los microorganismos en estudio (Fig. 1). La Figura 1 muestra el árbol óptimo con la suma de la longitud de ramas = 147.39471928. El porcentaje de árboles replicados en los cuales se agrupan los aislados en la prueba bootstrap (500 replicas) se muestra próximo a las bifurcaciones (Felsenstein, 1985). El árbol se encuentra a escala, la longitud de las ramas se encuentra en las mismas unidades de las distancias evolutivas utilizadas para inferir el árbol filogenético. Todas las posiciones con gaps fueron eliminados de la hoja de datos final, la cual presentó un total de 369 posiciones.

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Resultados

Tabla 5 Aislado

PL3

PL4

PL7

PL13

Secuencias depuradas de los aislados evaluados Secuencia

CACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTGAACTGCATGGTCGAA ATGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACG ATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGCAGCAGTAGGGAATCTT CCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAA CAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACAGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC GTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTC AACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAG AGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCT CTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGTTG AACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT ACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGC TCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCGGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGT AGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACA GGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGTTTCCGCCTTTAGTGCTGAGTAACGCATTA CTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAA GAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACG GCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGC GTAGAGATATGGAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACT CTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAA GAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACG GCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGC GTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTA

13

Resultados

PL14

PL18

WTFI

ACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGC TACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACAT CAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGC ACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGT TTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCC CGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGATCTCGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGG AGGAAGGTGGTGAACTTAATACGTTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCG GGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGC GTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGGGCTCAGGTGCGAAAGCG TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGA AGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCAC GGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACT

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A partir del dendograma (Fig. 1) se estableció que los aislados PL3, PL4, PL7, PL13, PL14 y WTFI pertenecen al género Bacillus, específicamente al grupo cereus-

thuringiensis. Con base en los resultados de formación de cristales, es posible descartar a los aislados PL3, PL4, PL7, PL13 y WTFI como B. thuringiensis ya que estos no forman cristales paraesporales, mientras que el aislado PL14 fue positivo a la formación de cristales. Sin embargo, es interesante resaltar que el aislado PL14 identificado como B.

thuringiensis presentó cápsula, lo cual es novedoso para una bacteria de este tipo, haciendo necesario realizar estudios adicionales para identificar completamente a esta bacteria. Por otro lado, el análisis filogenético indicó que el aislado PL18 presenta un 98% de similitud con Serratia marcescens aunque este resultado no puede considerarse concluyente ya que no fue posible obtener la secuencia revés de este aislado por el método empleado.

3.4 Selección de microorganismos por su capacidad de remoción de metales La selección de los microorganismos por su capacidad de remoción de metales consistió en la evaluación de su tolerancia/remoción de metales tanto en cultivo sólido como en cultivo líquido. La evaluación de tolerancia hacia metales en cultivo sólido se realizó por dos métodos distintos:

3.4.1 En discos de inhibición Los resultados indicaron que, con excepción de Cd y Zna, todos los aislados crecieron en presencia de los discos impregnados del metal. La Gráfica 1 muestra los resultados obtenidos para las sales de Cd y Zna, en mm, entendiéndose que a mayor diámetro mayor es la inhibición del crecimiento. Cabe señalar que el diámetro reportado no es neto, esto es, al valor en mm graficado deberá restarse el diámetro del filtro (7 mm). En la Grafica 1 se observa también, que el Cd inhibe el crecimiento de los aislados PL3 y PL4 en las tres concentraciones evaluadas, siendo ésta inhibición de mayor magnitud para PL4, mientras que para los aislados PL7, PL13, PL14, WTFI y PL18 solo se presentó inhibición en las concentraciones de 2.5 y 4 mM. Los aislados con un mayor halo de inhibición del crecimiento fueron PL4 y PL13 a una concentración de 4 mM y WTFI en concentraciones de 2.5 y 4 mM; el menor efecto de Cd sobre el crecimiento se observó para el aislado PL18.

15

PL4 PL13 Bacillus cereus CICCHLJ Q62 Bacillus sp. JDM-2-1 EF584539 Bacillus thuringiensis IS5056 Bacillus thuringiensis TSA2 EF638801 Bacillus cereus NBRC 15305 16S ribosomal Bacillus thuringiensis DiSz8 EF195084 Bacillus cereus V12 AM765995.1 PL14 Bacillus sp. FN31 DQ462190 Bacillus sp. M16-1 EF690408 Bacillus sp. TBM353 EF612721 Bacillus sp. H-12 Bacillus cereus NH12-2 EF690431 Bacillus sp. NS73 EF633172 PL3 Bacillus sp. NH14-1 EF690432 WTFI Bacillus thuringiensis RT EF638795 Bacillus cereus BRL02-55 DQ339680 Bacillus cereus 2810-S4 AM504128 Bacillus cereus N2-4 EF690419 PL7 B. thuringiensis F1-02a 16S ribosomal Bacillus cereus HDYM-5 EF428235.2 Bacillus sp. PG1-2/34 AM397435 Bacillus thuringiensis LQ EF638798 Bacillus thuringiensis N17 AM712183 Bacillus cereus LWL1 AM419197 Bacillus sp. K6-03 EF612330 Bacillus cereus 213 EF593043 Bacillus thuringiensis S32 AB116122

0.1

Serratia marcescens A3 EF208030 PL18 Serratia sp. FLGB17 EF195339 100 Serratia marcescens QL-01 AY485680 Serratia sp. PSGB07 EF195347 No cultivable Serratia sp. H1C22 AY963523

Figura 1 Dendograma de los aislados provenientes del lago de brea

16

La presencia del cloruro de zinc (Zna) inhibió el crecimiento de los aislados PL4 y PL13 en las tres concentraciones evaluadas, los mayores halos de inhibición del crecimiento se presentaron para los aislados PL4 en la concentración de 10 mM y PL3, PL14, PL7 para la concentración de 15 mM. El aislado PL18 fue el único que no presentó halo de inhibición del crecimiento en presencia del cloruro de zinc en ninguna de las

Diámetro inhibición de crecimiento (mm)

concentraciones evaluadas. 25

Bacillus (WTFI)

20

Serratia (PL18)

15

Bacillus (PL14) Bacillus (PL13)

10

Bacillus (PL7) 5

Bacillus (PL4) 0

Bacillus (PL3) 1

2.5

4

5

Cd

10

15

Zn a

Metal y concentración (mM)

Gráfica 1 Evaluación de la inhibición del crecimiento mediante la técnica de discos impregnados con metal. El diámetro del filtro corresponde a 7 mm, el cual deberá ser restado al valor reportado.

3.4.2 En medio agar-metal La tolerancia de los microorganismos en estudio hacia los distintos metales se evaluó en placas de agar nutritivo, el cual fue adicionado con cada una de las sales metálicas. El resultado de esta evaluación fue el crecimiento, en mm, de cada uno de los aislados. Adicionalmente, los aislados fueron inoculados en placas conteniendo el agar nutritivo sin metal, los cuales fueron considerados como controles. Las Gráficas 2-6 presentan los resultados obtenidos. De acuerdo a la Gráfica 2, solo el aislado PL7 presentó capacidad de tolerar Cd a una concentración 1

mM, aunque el tamaño de la colonia desarrollada fue

significativamente menor (2.66±1.63 mm) a la obtenida en el control (8±1 mm).

17

20

Bacillus (WTFI) Serratia (PL18)

Crecimiento (mm)

16

Bacillus (PL14) Bacillus (PL13)

12

Bacillus (PL7) Bacillus (PL4)

8

Bacillus (PL3)

4

0 0

1 Cd

1

3

Cr

5 Ni

Metal y concentración (mM)

Gráfica 2 Evaluación del crecimiento de los aislados en medio agar metal (Cd, Cr y Ni). El valor de 0 corresponde a los controles. El Cr en concentración 1 mM permitió que se desarrollaran los aislados PL3, PL4, PL13 y WTFI, observando diferencias significativas positivas con respecto al control; una observación importante fue que la morfología colonial de los aislados fue transparente independientemente del aislado del que se tratase. El aislado PL18 no fue capaz de crecer en ninguna de las concentraciones de Cr evaluadas. En el caso de Ni, los aislados PL3, PL4, PL7, PL13 y PL18 presentaron crecimiento a la concentración 3 mM, las colonias capaces de crecer en Ni de los aislados PL3, PL4, PL7 y PL18 fueron pequeñas, presentando diferencias significativas negativas con respecto al control. El aislado PL18 fue capaz de crecer en las concentraciones de 3 y 5 mM sin que se presentaran diferencias significativas con respecto al control. El aislado WTFI no creció en presencia de Ni en ninguna de las concentraciones evaluadas. El crecimiento de los aislados en presencia de Pb se favoreció en la concentración 2 mM pues el diámetro de las colonias desarrolladas por los aislados PL3, PL4, PL7, PL13, PL14 y WTFI presentó diferencias positivas estadísticamente significativas con respecto al control, además se presentó un cambio en la morfología colonial de los aislados, de circular a arborescente; mientras el crecimiento de PL18 no presentó diferencias significativas respecto al control en concentraciones 2 y 4 mM aunque si presentó cambio en la coloración de la colonia de translucida (presencia de metal) a café rojizo (control).

18

30

Bacillus (WTFI) Serratia (PL18)

25 Crecimiento (mm)

Bacillus (PL14) 20

Bacillus (PL13) Bacillus (PL7)

15

Bacillus (PL4) 10

Bacillus (PL3)

5 0 0

2

4

6

Pb (mM)

Gráfica 3 Evaluación del crecimiento de los aislados en medio agar-plomo. El valor de 0 corresponde a los controles. En el caso de la sal de Se, su presencia solo afectó de manera significativa y negativa el crecimiento de los aislados PL4 en concentraciones de 1 y 3 mM, y a PL13 en concentración 3 mM (Gráfica 4). Es importante mencionar que todas las colonias desarrollaron una coloración roja, indicativo de la reducción del metaloide (Roux et al., 2001). 20

Bacillus (WTFI)

Crecimiento (mm)

16

Serratia (PL18)

12

Bacillus (PL14) Bacillus (PL13)

8

Bacillus (PL7) Bacillus (PL4)

4

Bacillus (PL3) 0 0

1

Se (mM)

3

6

Gráfica 4 Evaluación del crecimiento de los aislados en medio agar-selenio. El valor de 0 corresponde a los controles.

19

El crecimiento de los aislados PL7 y WTFI en presencia de V, fue positivo y significativo respecto al control en concentraciones 1 y 3 mM. El crecimiento de los aislados PL3, PL4, PL13 y PL14, en las tres concentraciones evaluadas, presenta diferencia significativa positiva respecto al control. Únicamente el aislado PL18 no presentó diferencias significativas en crecimiento respecto al control. 20

Bacillus (WTFI) Serratia (PL18)

Crecimiento (mm)

15

Bacillus (PL14) Bacillus (PL13)

10

Bacillus (PL7) 5

Bacillus (PL4) Bacillus (PL3)

0 0

1

3

5

V (m M)

Gráfica 5 Evaluación del crecimiento de los aislados en medio agar-vanadio. El valor de 0 corresponde a los controles.

20

Crecimiento (mm)

16

12

8

4

0 0

5

3

Zn a

6 Zn b

9

Bacillus (WTFI) Serratia (PL18) Bacillus (PL14) Bacillus (PL13) Bacillus (PL7) Bacillus (PL4) Bacillus (PL3)

Zn (m M)

Gráfica 6 Evaluación del crecimiento de los aislados en medio agar-zinc. El valor de 0 corresponde a los controles.

20

El empleo de diferentes sales de zinc produjo resultados de crecimiento distintos, mientras el Zna (cloruro) solo permitió el desarrollo del aislado PL3 en la concentración 5 mM; la presencia del Znb (sulfato) permitió el crecimiento de PL3, PL7 y PL13 con diferencias significativas positivas con respecto al control, en las concentraciones 3 y 6 mM y con diferencias significativas negativas en la concentración 9 mM. El aislado PL14 creció en las concentraciones 3 y 6 mM, no así en la concentración 9 mM. Los aislados PL4 y WTFI presentan tolerancia al Znb (sulfato) en el rango de concentración evaluada, pero únicamente en la concentración de 9 mM se observó una diferencia significativa negativa del crecimiento respecto al control. Por su parte, PL18 fue capaz de tolerar las distintas concentraciones de zinc, aunque únicamente en la concentración 6 mM se observó una diferencia significativa positiva respecto al control. Los resultados de la evaluación del crecimiento permitieron evidenciar que los microorganismos son capaces de tolerar o no la presencia del metal, pero no arrojan información sobre su capacidad de absorberlo o removerlo del medio. Para evidenciar esta capacidad se realizó, sobre las mismas placas, el revelado con H2S, para formar el sulfuro metálico. La formación de un halo claro alrededor de la colonia fue indicativa de la remoción del metal del medio.

3.4.2.1. Revelado con H2S para determinar la remoción de metal en medio

agar-metal Con el fin de evaluar la remoción del metal del medio por los distintos

microorganismos, las cajas de Petri conteniendo el medio agar-metal y el microorganismo en estudio, se expusieron a vapores de H2S. La tabla 6 muestra los resultados de formación de halo, así como la evaluación del aspecto del halo luego de la exposición a H2S. El halo formado se evaluó y clasificó como opaco, oscuro, claro ó transparente. La formación del halo transparente alrededor de la colonia puede considerarse como prueba preliminar de que el metal fue removido del medio, pues al no encontrar metal en esta zona, no se formó el sulfuro correspondiente. Así, y con base en los resultados reportados en la tabla 6, se tiene que no hubo formación de halo en presencia de Cd, Cr y Zna para ninguno de los aislados. Los aislados PL4, PL7, PL13 formaron halo en presencia de Ni en la concentración 3 mM, mientras que PL18 desarrolló halo en las concentraciones de 3 y 6 mM. En presencia de Pb, los aislados PL3, PL4, PL7 y PL18 presentaron halo en las concentraciones 2 y 4 mM, mientras que

21

para los aislados PL13, PL14 y WTFI sólo se presentó halo alrededor de las colonias que crecieron en la concentración de 2 mM. Tabla 6

Características del halo formado en presencia de metales

Cd

Conc (mM) 1

Cr

1

-

-

-

-

-

-

-

7

-

-

-

-

-

-

-

5

-

-

-

-

-

+ claro

-

3

-

+ claro

+ claro

+ claro

-

+ claro

-

Metal

Ni

Pb

V Zna Znb

PL3

PL4

PL7

PL13

PL14

PL18

WTFI

-

-

-

-

-

-

-

6

-

-

-

-

-

-

-

4

+ opaco

+ opaco

+ opaco

-

-

+ oscuro

-

2

+ opaco

+ opaco

+ opaco

+ opaco

+ opaco

+ oscuro

+ opaco

5

-

-

-

-

-

+ transp

-

3

+ claro

-

-

-

-

+ transp

-

1

+claro

-

-

+ opaco

-

+ transp

+ opaco

5

-

-

-

-

-

-

-

9

-

-

-

-

-

+ transp

-

6

-

-

-

-

-

-

-

3

-

-

-

+ transp

-

+ transp

-

- no halo, + halo, conc= concentración. transp= transparente

En presencia de la sal de vanadio únicamente, las cepas PL3, PL13, WTFI y PL18 formaron halo. Para PL3 se observó halo en concentraciones de 1 y 3 mM, mientras que para los aislados PL13 y WTFI solo se formó halo en la concentración 1 mM, en el caso de PL18 se formó halo transparente en las tres concentraciones evaluadas. De acuerdo con la información obtenida y después de exponer las colonias en medio agar- Znb, únicamente se formó halo alrededor de las colonias de PL13 en concentración 3 mM y PL18 en las concentraciones 3 y 6 mM. Con la finalidad de comparar la magnitud del halo desarrollado (en mm) con respecto al diámetro de la colonia (en mm) se estableció la relación (cociente) entre estos dos valores para cada sal metálica y concentración evaluada, así como para cada aislado en particular, los resultados obtenidos se muestran en la Gráfica 7. En la Gráfica 7 puede observarse los valores de la relación halo/colonia para los metales Ni, Pb, V y Znb.

La relación halo/colonia en concentración 3 mM de Ni fue

PL7=PL18=PL13>PL4>PL14, mientras en la concentración 5 mM el valor de la relación para el aislado PL18 es de igual magnitud que la que presenta en la menor concentración evaluada. La magnitud de la relación halo/colonia en vanadio fue muy pequeña (V>Zn>Ni>Pb, lo cual tiene una correlación con la toxicidad de dichos metales. 26

La cantidad removida de metal indicó q los aislados con mayor potencial de aplicación son PL18 para Ni, PL7 para Pb, PL3 para Se, WTFI para V y PL13 para Zn. Los resultados de este proyecto permiten sugerir un potencial de aplicación de los microorganismos estudiados.

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