Grundlegende mikrobiologische Arbeitsmethoden

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Themen Desinfektion, Nähragar, Sterilität Prinzip Um Verunreinigungen von Nährmedien und Kulturen durch Keime, die an den Arbeitsgeräten haften, zu vermeiden, müssen die Geräte und die Nährböden und Nährlösungen selber sterilisiert werden. Mit Nährboden ausgegossene Petrischalen heißen in der Fachsprache der Mikrobiologen Platten. Das Ausgießen des Nährbodens in die Schalen erfolgt entweder aus Reagenzgläsern, wobei ein Reagenzglas immer die für eine Petrischale erforderliche Menge des gebrauchsfertigen Nährbodens enthält, oder aus Erlenmeyerkolben, wenn eine große Anzahl von Platten auf einmal gegossen werden soll. Material 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Kompaktwaage, OHAUS TA 302, 30 Becherglas DURAN®, hohe Form, Messzylinder 100 ml, BORO 3.3 Dreibein, Ring-d = 140 mm, h = 240mm Objektträger, 50 Stück Messpipette 10 ml, Teilung 0,1 ml Reagenzglasgestell, 12 Bohrungen Erlenmeyerkolben DURAN®, Enghals, 500 ml Reagenzglas, d = 16 mm, l = 160 mm Liebigs Fleischextrakt, 10 g Pepton aus Fleisch 50 g Steristopfen für di = 15 mm, 250 Stück Steristopfen für di = 29 mm, 100 Stück Pipettierball, Flip-Modell Doppelspatel, Stahl, l = 150 Glasrührstab, Boro 3.3, l = 300 mm Drahtnetz mit Keramik 160 x 160 mm pH Teststäbchen, pH 6,5-10,0, Bunsenbrenner mit Hahn, für Erdgas

49241-93 36006-00 36629-00 33302-00 64691-00 36600-00 37686-10 36121-00 37656-10 31521-03 31708-05 39266-00 39267-00 36592-00 33460-00 40485-05 33287-01 30301-04 32167-05

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Sicherheits-Gasschlauch, DVGW Natriumhydroxid, Perlen 500 g Wasser, destilliert 5 l Agar-Agar, gepulvert 100 g Tisch-Autoklav mit Einsatz Uhrglasschale, d = 60 mm Salzsäure, ca. 5 %ig, 250 ml Pinzette, l = 130 mm, gerade, Universalschrank UNB 200, 32 l Ethanol absolut, reinst 500 ml Petrischale, d = 100 mm, Glas pH Teststäbchen, pH 4,0..7,0, Heiz- und Kochplatte, 230 V Ausstrichöse mit Halter, l = 230 mm

39281-10 30157-50 31246-81 31083-10 04431-93 34570-00 30315-25 64610-00 46959-93 30008-50 64705-00 30301-03 04025-93 64936-00

Abb1: Versuchsdurchführung www.phywe.com P4140100

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Aufgaben Üben Sie die folgenden Arbeitstechniken: 1. Das Sterilisieren von Arbeitsgeräten 2. Herstellung von Standard-Nähragar für Bakterien 3. Die Herstellung von Standard-Nähragar für Schimmelpilze und Hefen 4. Die Herstellung einer Standard-Nährlösung für Bakterien 5. Das Ansetzen von Schrägröhrchen 6. Das Überimpfen von Mikroorganismen Durchführung Das Sterilisieren von Arbeitsgeräten Um Verunreinigungen von Nährmedien und Kulturen durch Keime, die an den Arbeitsgeräten haften, zu vermeiden, müssen die Geräte sterilisiert werden. Metallgeräte werden zur Sterilisation mit der Flamme eines Gasbrenners abgeflammt. Ausstrichösen und Impfnadeln erhitzt man vor und nach jedem Gebrauch in der Flamme eines Gasbrenners (Abb. 2) bis zur hellen Rotglut und lässt abkühlen. Der Halter wird abgeflammt, soweit er mit Kulturen oder sterilen Geräten in Berührung kommen kann. Kleine Glasgeräte, wie Glasstäbe, Objektträger und Deckgläser, sterilisiert man durch Abflammen. Vorher können sie in 96%igen Ethanol getaucht werden. Objektträger und Deckgläser hält man dabei mit einer Pinzette. Abb. 2: Abflammen der Ausstrichöse. Pipetten werden sterilisiert, indem man 96%igen Ethanol zwei- bis dreimal einsaugt und jeweils wieder auslaufen lässt, den Rest des Ethanols in die Flamme eines Gasbrenners bläst und die Pipette anschließend mehrmals durch die Flamme zieht. Alle anderen Glasgeräte werden zur Sterilisation im Heißluftsterilisator (Abb. b) für 1-1'/2 Stunden auf 160 °C erhitzt. Petrischalen wickelt man dazu in Papier ein, und zwar jeweils immer etwa 5 Stück zu einer Rolle. In diesen Paketen lassen sich die Schalen einerseits bequem transportieren, andererseits können sie darin mit größerer Sicherheit auch längere Zeit steril aufbewahrt werden. Außerdem ist durch die langsamere Abkühlung die Gefahr des Zerspringens geringer. Man stellt deshalb die Glasgeräte auch grundsätzlich in den kalten Sterilisator und lässt sie nach der Sterilisation darin abkühlen. Herstellung von Standard-Nähragar für Bakterien Die Zusammensetzung dieses Nährbodens ist so gewählt, dass sie dem Nährstoffbedarf der Mehrzahl der nichtpathogenen Bakterienarten entspricht. Ein wesentlicher Bestandteil ist Bouillon. Für Schulzwecke sollte diese Bouillon jedoch nicht wie sonst oft üblich, aus magerem Rind- oder Pferdefleisch selbst gekocht werden. Einfacher in der Handhabung und weniger zeitaufwendig ist die Verwendung von LIEBIGs Fleischextrakt. Als Gelierungsmittel dient Agar-Agar, kurz Agar genannt, ein Produkt aus südostasiatischen Rotalgen, das, im Gegensatz zu Gelatine, nur von ganz wenigen Bakterienarten abgebaut werden kann. Gelatine, ein aus Sehnen Häuten und Knochen gewonnenes Gerüsteiweiß, wurde allgemein als Gelierungsmittel für Nährböden benutzt, als man Agar noch nicht kannte. Da sie jedoch von vielen Mikroorganismen abgebaut und dabei verflüssigt wird, verwendet man sie heute nur noch in Spezial-Nährböden, zum Beispiel um bei Mikroorganismen proteolytische Enzyme nachzuweisen.

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Der Nährboden soll enthalten: LIEBIGs Fleischextrakt 0,3% Pepton 0,50/0 Agar 2,0 0/0 Lösungsmittel ist destilliertes Wasser. Man wiegt alle Bestandteile in der erforderlichen Menge ab, bringt sie in ein Becherglas und kocht so lange, bis auch der Agar vollständig gelöst ist. Da Agar beim Kochen sehr stark schäumt und infolgedessen leicht überkocht, muss das Becherglas so groß sein, dass es das Drei- bis Vierfache der angesetzten Nährbodenmenge fassen kann. Man erhitzt deshalb auch, sobald die Lösung kocht, nur mit kleiner Flamme weiter und rührt mit einem Glasstab öfter um. Der Fleischextrakt wird am zweckmäßigsten auf Abb. 3: Abwiegen des Fleischextrakts. einem austarierten Objektträger abgewogen, auf den man ihn mit einem Glasstab überträgt. Man rollt den Glasstab dabei auf dem Objektträger ab (Abb. 3) und spült den Fleischextrakt mit dem Wasser, das dem Nährboden zugesetzt werden muss, in das Becherglas. Der Objektträger kann auch mitgekocht und dann hinterher herausgenommen werden. Wenn alle Bestandteile vollständig gelöst sind, wird der Nährboden durch tropfenweisen Zusatz von 1%iger Natronlauge, unter Überprüfung mit pH-Teststäbchen (pH 6,5-10,0), auf einen pH-Wert von 7,47,6 eingestellt. Bakterien entwickeln sich am besten in neutralem bis schwach alkalischem Milieu, das heißt bei einem pH-Wert von etwa 7,0 -7,2. Da die Wasserstoffionenkonzentration jedoch durch das Sterilisieren der Nährsubstrate wieder etwas absinkt, wird sie vorher etwas höher als endgültig gewünscht eingestellt. Der fertige Nährboden wird in Reagenzgläser abgefüllt, zum Plattengießen zu jeweils etwa 12 -15 ml (gut halb voll). Die Herstellung von Standard-Nähragar für Schimmelpilze und Hefen Schimmelpilze und Hefen entwickeln sich vorwiegend auf leicht sauren Substraten, was bei der Zusammenstellung von Nährböden berücksichtigt werden muss. Der Nährboden soll enthalten: Sirup (Rübensaft) 5,0% Agar 2,0% Lösungsmittel ist destilliertes Wasser. Man gibt alle Bestandteile in den erforderlichen Mengen in ein Becherglas und kocht sie so lange, bis auch der Agar vollständig gelöst ist. Da Agar beim Kochen stark schäumt und infolgedessen leicht überkocht, Muss das Becherglas so groß sein dass es das Drei- bis Vierfache der angesetzten Nährbodenmenge fassen kann. Man erhitzt deshalb auch, sobald die Lösung kocht, nur noch mit kleiner Flamme weiter und rührt mit einem Glasstab öfter um. Wenn alle Bestandteile gelöst sind, wird der pH-Wert des Nährbodens mit Teststäbchen überprüft. Er soll etwa 5,0-6,0 betragen. Abweichungen davon korrigiert man durch tropfenweisen Zusatz von 1 %iger Natronlauge beziehungsweise 1 %iger Salzsäure. Der fertige Nährboden wird in Reagenzgläser abgefüllt, zum Plattengießen zu jeweils etwa 12 -15 ml (gut halb voll) und für Schrägröhrchen zu jeweils 5-6 ml (etwa viertel voll). Größere Mengen, die später www.phywe.com P4140100

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auf einmal zum Plattengießen verwendet werden sollen, füllt man in Erlenmeyerkolben. Die Reagenzgläser und Erlenmeyerkolben werden mit Steristopfen verschlossen und im Autoklaven sterilisiert. Auf diesem Nährboden entwickeln sich die meisten Hefen und Schimmelpilze sehr gut. Bei der Herstellung von Nährböden anderer Zusammensetzung für Hefen und Schimmelpilze wird in entsprechender Weise verfahren. Die Herstellung einer Standard-Nährlösung für Bakterien Die Zusammensetzung dieser Nährlösung ist so gewählt, dass sie dem Nährstoffbedarf der Mehrzahl der nichtpathogenen Bakterienarten entspricht. Die Nährlösung soll enthalten: LIEBIGs Fleischextrakt

0,3 Gew.-%

Pepton Lösungsmittel ist destilliertes Wasser.

0,5 Gew.-%

Die abgewogenen Bestandteile werden in einem Becherglas in der erforderlichen Wassermenge unter Erwärmen gelöst. Fleischextrakt wird am zweckmäßigsten auf einem austarierten Objektträger abgewogen, auf den man ihn mit einem Glasstab überträgt. Man rollt den Glasstab dabei auf dem Objektträger ab (Abb.) und spült den Fleischextrakt mit dem für die Nährlösung erforderlichen Wasser in das Becherglas. Der Objektträger kann auch mit dem Fleischextrakt in das Wasser gegeben, mit erwärmt und nach dem Lösen des Extraktes herausgenommen werden. Wenn alle Bestandteile vollständig gelöst sind, stellt man die Nährlösung durch tropfenweisen Zusatz von 1 %iger Natronlauge, unter Überprüfung mit Teststäbchen (pH-Bereich 6,5-10,0), auf einen pH-Wert von 7,4-7,6 ein. Die fertige Nährlösung wird zu jeweils etwa 6-8 ml in Reagenzgläser abgefüllt. Man verschließt die Reagenzgläser mit Steristopfen und sterilisiert sie im Autoklaven. Nährlösungen anderer Zusammensetzung werden in entsprechender Weise hergestellt. Das Sterilisieren von Nährböden und Nährlösungen Die Bestandteile der Nährböden und Nährlösungen und die Arbeitsgeräte, die zu ihrer Herstellung verwendet werden, sind mit den verschiedensten Arten von Keimen infiziert, durch deren Entwicklung die angesetzten Nährsubstrate sehr rasch verunreinigt würden. Sie müssen deshalb sofort nach dem Ansetzen sterilisiert werden. Man benutzt dazu einen Autoklaven und sterilisiert im strömenden Wasserdampf. Im Heißluftsterilisator dürfen Nährböden und Nährlösungen nicht sterilisiert werden, da durch die Dampfentwicklung ihr Wassergehalt verringert und damit die Konzentration der Nährstoffe erhöht würde. Ein Autoklav ist ein Dampftopf, der luftdicht verschlossen werden kann (Abb. 1). Er ermöglicht das Sterilisieren bei Überdruck und Temperaturen über 100 °C, wobei auch Bakteriensporen abgetötet werden. Ihre Abtötungszeit hängt jedoch wesentlich von der Wasserdampfsättigung im Autoklaven ab (s. Tabelle). Es muss deshalb dafür gesorgt werden, dass, nachdem das Wasser im Autoklaven kocht, möglichst viel Luft entweichen kann und eine hohe Wasserdampfsättigung erreicht wird. Man füllt den Autoklaven mit der erforderlichen Wassermenge, im Allgemeinen bis knapp unter den Einsatz, und bringt das Sterilisiergut hinein. Reagenzgläser werden zu mehreren in einem Behälter zusammengestellt. Man setzt den Deckel so auf, dass die Pfeilmarke am Deckel auf die Mitte eines Topfgriffes zeigt, wobei darauf zu achten ist, dass der orangene Knopf auf dem Zeichen »Topf offen« steht und der Abdampfhahn offen ist (der Deckel lässt sich dann leichter schließen und die Dichtung wird geschont). Der Deckel wird niedergedrückt und im Uhrzeigersinn gedreht bis die Griffe übereinander kommen. Der orangene Knopf wird auf das Zeichen »Topf geschlossen« gestellt. Die Einstellung der Sterilisationsbedingung erfolgt durch Drehen des Sterilisationsventils bis zum Anschlag: entgegen dem Uhrzeigersinn für 1,4 bar, ca. 125°C

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im Uhrzeigersinn für 2,7 bar, ca. 140°C. Nachdem das Wasser im Autoklaven siedet, erkennbar am Ausströmen von Wasserdampf aus dem Abdampfhahn, bleibt dieser zur Entlüftung des Autoklaven noch 3 Minuten geöffnet und wird dann geschlossen. Nun wird durch Druckanstieg die Betriebstemperatur erreicht, am Sterilisationsventil tritt Dampf aus. Der Zeiger am Manometer soll je nach Sterilisationsbedingung nicht unter die blaue bzw. rote Marke fallen, das heißt es soll während der Sterilisation ständig etwas Dampf austreten. Nach Erreichen eines Überdruckes von 1,4 bar sterilisiert man 20 Minuten, bzw. bei 2,7 bar 15 Minuten. Nach der Sterilisation lässt man das Sterilisationsgut zunächst im Autoklaven abkühlen. Erst wenn kein Überdruck mehr vorhanden ist, dreht man den orangenen Knopf auf das Zeichen »Topf offen« und nimmt dann den Deckel ab. Bei zu raschem Druckausgleich durch Öffnen des Abdampfhahnes besteht bei flüssigem Sterilisiergut die Gefahr, dass es aus den Gefäßen herauskocht. Bei ausreichender Wasserdampfsättigung genügt eine einmalige Sterilisation von 20 Minuten bei 1,4 bar Überdruck, um auch widerstandsfähige Bakteriensporen abzutöten und damit das Sterilisiergut vollständig frei von entwicklungsfähigen Keimen zu machen. Das Gießen von Platten Mit Nährboden ausgegossene Petrischalen heißen in der Fachsprache der Mikrobiologen Platten. Das Ausgießen des Nährbodens in die Schalen erfolgt entweder aus Reagenzgläsern, wobei ein Reagenzglas immer die für eine Petrischale erforderliche Menge des gebrauchsfertigen Nährbodens enthält, oder aus Erlenmeyerkolben, wenn eine große Anzahl von Platten auf einmal gegossen werden soll. Reagenzgläser mit Nährboden (oder Nährlösung) werden von den Mikrobiologen als Röhrchen bezeichnet. Damit bei mikrobiologischen Arbeiten jederzeit Platten gegossen werden können, hält man einen Vorrat von Röhrchen (oder gegebenenfalls Erlenmeyerkolben) mit den in Frage kommenden gebrauchsfertigen Nährböden (im Kühlschrank) beAbb. 4: Abflammen des Reagenzröhrchens, reit. Röhrchen mit Nähragar werden bis zur Verflüssigung ihres Inhaltes im Wasserbad gekocht. Röhrchen mit Nährgelatine erwärmt man im Wasserbad, bis die Gelatine flüssig ist. Als Wasserbad eignet sich für diesen Zweck sehr gut ein Becherglas von 600 ml Inhalt, das etwa zur Hälfte mit Wasser gefüllt ist. Nach Verflüssigung des Nährbodens nimmt man ein Röhrchen heraus und entfernt den Wattestopfen. Die Röhrchenmündung wird zur Abtötung der daran haftenden Keime in der Flamme eines Gasbrenners kurz abgeflammt (Abb. 4). Man lüftet den Deckel einer sterilen Petrischale Abb. 5: Eingießen des Nährbodens von 100 mm Durchmesser so weit, dass die Röhrchenmündung zwischen Ober- und Unterteil passt, ohne diese zu berühren, gießt den Nährboden aus dem Röhrchen in die Petrischale aus (Abb.

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5) und legt den Deckel sofort wieder auf. Das Oberteil der Petrischale muss auch während des Ausgießens das Unterteil möglichst vollständig überdecken, damit keine Keime aus der Luft in die Schale fallen können. Es darf deshalb nur senkrecht hochgehoben werden. Man beschreibt mit der geschlossenen Petrischale einige Kreisbewegungen auf der Tischplatte, um den Nährboden über die ganze Fläche der Schale gleichmäßig zu verteilen, und lässt die Platten bis zum Erstarren des Nährbodens ruhig stehen. Beim Gießen der Platten aus Erlenmeyerkolben Abb. 6: Schrägröhrchen wird in entsprechender Weise verfahren. Platten, die nicht sofort verbraucht werden, können mit dem Deckel nach unten einige Zeit im Kühlschrank aufbewahrt werden. Das Ansetzen von Schrägröhrchen Schrägröhrchen sind Reagenzgläser, in denen Nährboden mit schräger Oberfläche erstarrt ist, wodurch zur Beimpfung eine größere Nährbodenfläche zur Verfügung steht. Sie werden wegen ihres geringen Raumbedarfes in vielen Fällen anstelle von Platten in Versuchsreihen verwendet. Außerdem hält man Reinkulturen von Mikroorganismen für Sammlungszwecke auf Schrägröhrchen, wenn die Kulturbedingungen es gestatten. Man bereitet den gewünschten Nährboden, füllt ihn zu jeweils 5-6 ml in Reagenzgläser ab (etwa viertel voll), verschließt diese mit Steristopfen und sterilisiert. Sofort danach solange der Nährboden noch flüssig ist, werden die Röhrchen mit ihrem oberen Ende auf eine etwa 12 -15 mm hohe Holzleiste gelegt. Sehr gut ist für diesen Zweck auch der Schlauch eines Gasbrenners geeignet, da er den richtigen Durchmesser besitzt (Abb. 6). Der Nährboden erstarrt dann in den Reagenzgläsern mit langgezogener, schräg liegender Oberfläche. Er soll etwa bis zum Anfang des oberen Drittels des Röhrchens hinaufreichen. Das Überimpfen von Mikroorganismen Beim Überimpfen von Mikroorganismen müssen besondere Vorsichtsmaßnahmen eingehalten werden, um eine Verunreinigung der Nährsubstrate oder Kulturen durch Fremdinfektion zu Abb. 7: Überimpfen vermeiden.

Bevor man mit dem Überimpfen beginnt, werden alle Türen und Fenster des Arbeitsraumes geschlossen. Während des Überimpfens darf im Raum nicht herumgegangen werden. Auf diese Weise ist jede vermeidbare Luftbewegung verhindert. Man glüht eine Ausstrichöse zur Säuberung und Sterilisation in der Flamme eines Gasbrenners bis zur

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hellen Rotglut aus und lässt sie wieder abkühlen. Beim Abimpfen aus einem Röhrchen (Reagenzglas mit Nährsubstrat) wird dessen Watte-stopfen von der Hand, die die Ausstrichöse hält, zwischen dem zur Handfläche hin gebogenen kleinen Finger und der Handfläche gefasst und unter leichtem Drehen aus der Mündung des Reagenzglases herausgezogen. In dieser Stellung (Abb. 7) hält man den Stopfen, bis er wieder in das Röhrchen eingesetzt wird. Die offene Röhrchenmündung wird in der Flamme eines Gasbrenners kurz abgeflammt. Man fährt mit der Ausstrichöse vorsichtig in das Röhrchen, entnimmt etwas von der Kultur, flammt die Röhrchenmündung noch ein-mal ab und setzt den Wattestopfen wieder ein. Erst dann überträgt man das Impfmaterial auf oder in das neue Nährsubstrat. Soll ein Schrägröhrchen beimpft werden, so verfährt man beim Öffnen des Röhrchens in gleicher Weise wie bei der Entnahme von Impfmaterial. Abb. 8: Ausstrich in Zick-Zack-Linien Beim Übertragen in Nährlösungen wird die Mikroorganismenmasse an der Glaswand kurz unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche vorsichtig verrieben, damit sie sich möglichst gleichmäßig in der Nährlösung verteilt. Soll auf Platten überimpft werden, so stellt man sie mit dem Deckel nach unten auf, hebt das Unterteil heraus, dreht es kurz um, streicht das Impfmaterial aus (Abb. 7) und legt das Unterteil wieder in den Deckel zurück. Beim Abimpfen von bewachsenen Platten wird in entsprechender Weise verfahren. Auf allen Nährböden wird das Impfmaterial im allgemeinen in Zick-Zack-Linien ausgestrichen (Abb. 8), um die Nährbodenfläche möglichst gut auszunutzen. Nach dem Überimpfen glüht man die Ausstrichöse zur Säuberung und Sterilisation sofort in der Flamme eines Gasbrenners bis zur hellen Rotglut aus. Ihr Heft wird so weit abgeflammt, wie es mit dem Impfmaterial in Berührung kommen konnte.

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