Genetischer Modellorganismus
 S. cerevisiae

Literatur

•  An Introduction to the Genetics and Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, by Fred Sherman.# http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/yeast/ index.html# •  Saccharomyces Genome Database (SGD): # http://www.yeastgenome.org/# •  Overview of diverse genome-wide technologies: Yeastbased functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. B. Suter, D. Auerbach and I. Stagler, Biotechniques 40: 625-642 (2006).

Teil I: 
 Grundlagen der Hefegenetik & -molekularbiologie

Hefe: Grösse & Zellform

# # Haploid cell #Diploid cell# Volume (mm3) # #70 # 120# Diameter (mm) # #4 # 5-6#

Wieso benutzen wir Hefe als Modellorganismus?

•  nicht pathogen # •  schnelles Wachstum# •  wachsen als Einzelzellen; erleichtert Replika-Plattierung und Isolation von Mutanten# •  hochflexibles DNA Transformationssystem# •  stabile haploide & diploide Zellen; erleichtern genetische Analyse# •  kleines Genom (1.2 x 107 base pairs), nur ~3.5x > E.coli! •  sehr aktive homologe Rekombination# •  2-Hybrid, YACs machen Hefe zu einem wertvollen Werkzeug, um Gene/Proteine/Funktionen aus anderen Organismen zu untersuchen

einfache Kultivierung - wie Bakterien!

Hefe-Lebenszyklus

Haploide Hefen existieren in zwei Mating-Typen: # MATa oder MATα. # Wilde Hefen (aus der Natur) sind homothallisch, d.h. sie wechseln in der haploiden Phase schnell den Mating-Typ und verschmelzen zu Diploiden.# D.h. nur die diploide Phase im natürlichen Lebenszyklus ist stabil.#

Hefelebenszyklus (cont.)# Laborstämme sind heterothallisch durch eine Mutation im Gen für HO Recombinase. # Diese Stämme sind sowohl als Haploide als auch als Diploide stabil. # Der stabile haploide Zustand ist essentiell dafür, dass Hefe als Modellorganismus für Genetikexperimente dienen kann.

Änderung des Mating-Typs in Hefe

α

HMLα

(Silent)

Mating Type (MAT) Locus

Cassette

Replaced

HMLα

(Silent)

HMRa

(Silent)

Transposition mediated by HO recombinase

a

HMRa

(Silent)

• 

Rapid mating type switching is possible in homothallic wild type yeast, leading to rapid mating and diploid cell formation (this is BAD for genetics!)#

• 

In heterothallic cells the HO recombinase gene is defective. This makes mating type switching impossible, so cells are locked in one haploid mating type or the other (this is GOOD for genetics!)#

Hefe Wachstum & Mating

Isolation von temperatur-sensitiven (ts) Mutanten um Funktion essentieller Gene zu untersuchen#

Beispiel: # Genetische Analyse des sekretorischen Weges in Hefe

Beispiel: # Genetische Analyse des sekretorischen Weges in Hefe

Nobelpreis Randy Schekman, 2013

Klonierung durch Komplementation#

Nomenklatur in Hefe

•  •  •  •  •  •  • 

gene name: YFG1 (Your Favorite Gene 1)# dominant allele: YFG1-1! recessive allele: yfg1-2! insertion: yfg1::LEU2! deletion: yfg1∆1# protein: Yfg1 or Yfg1p# systematic name: YBR142W

DNA Transformation & Rekombination

•  extrem effizient in Hefe (>104 Transformants/µg DNA) # •  sowohl lineare als auch circuläre DNA kann eingeführt und ins Genom rekombiniert werden# •  selbstreplizierende Plasmide können ebenfalls eingeführt werden# •  es gibt mehrere Transformationsmöglichkeiten:# # #Transformation von Spheroplasten# # #Transformation mit Lithiumsalzen# # #Transformation durch Elektroporation#

Gen knock out & Deletion (non-essentielle Gene)# knock out: Transformation mit auxotrophem Markergen mit flankierendenRegionen homolog zum Zielgen

Selektion gegen das URA3 Gen leads führt zur Deletion

5-FOA Selektion von Ura3- Zellen# •  Das URA3 Gen ist ein häufig benutzter selektierbarer Marker auf Hefe-Plasmiden# •  Das URA3 Gen kodiert für Orotidine 5´- Phosphat Decarboxylase (für Uracilbiosynthese).# •  5-fluoroorotic acid (5-FOA) wird in das toxische 5fluorouracil umgesetzt durch URA3 Genprodukt.# •  Deshalb werden Ura+ Zellen durch 5-FOA getötet, während Ura- Zellen 5-FOA resistent sind. # Ura+

Dead :-(

5-FOA

Ura-

Alive :-)

Hefe-Plasmide

Components of common yeast plasmid vectors

YIp

YEp

Plasmid features

E. coli genes or segments

     ori, bla; tet

Yeast genes or segments

     URA3; HIS3; LEU2; TRP1; etc.

2 µm-ori

ARS1; ARS2; ARS3; etc.

CEN3; CEN4; CEN11; etc.

YCp

+

+

+

+

-

-

-

+

+

-

-

+

-

+

+

+

+

+

++

+

+

Host (yeast) markers



     ura3-52; his3-Δ1; leu2-Δ1; etc.

Stability

Funktion von ARS & Centromer Sequenzen

Identifikation von Autonomous Replicating Sequences (ARS)#

Identifikation von Telomeren

Yeast Artificial Chromosomes (YACs)# ARS, CEN, und TEL Elemente ermöglichen die stabile Gegenwart extrem langer, linearer DNA Fragmente in Hefe. Diese Konstrukte heissen Yeast Artificial Chromosomes (YACs). DNA Fragmente bis 1 Million Basenpaare können als YACs propagiert werden.# Maximum Capacity of Vectors# Vector Type # #Length of DNA (kb)# Plasmid # # #20# Phage λ # # #25# Cosmid # # #45# P1 vector # # #100# BAC # # # #200# YAC # # # #1000#

Teil II: 
 Hefe-basierte funktionelle Genomik und Proteomik

Das Hefe-Genomprojekt# Hefegenom sequenziert in 1996 (1.2 x 107 bp)# 16 Chromosomen (von 230k bp bis 2,352k bp)# ~6,400 ORFs # nur ~4% der Hefegene hat Introns (wenn, meist nur ein kleines Intron zu Beginn der kodierenden Sequenz) # •  kompaktes Genom, Gene repräsentieren ~70% der Gesamtsequenz# •  kaum repetitive DNA# •  •  •  • 

Hefe-Proteinfunktion

(as of the year 2000)

Fortschritt in der Charakterisierung des Hefegenoms

Genomweite Analyse von Hefe-Genfunktion

•  Deletionsanalyse: # # #Knock out jedes nicht-essentiellen Hefegens# # #Analyse der phänotypischen Konsequencen jedes # k.o.s unter verschiedenen Wachstumsbedingungen# # #komplettes k.o-Set (4800 for haploid set) # # käuflich für $1500# •  Protein-Überexpression:# # #Analyse der Überexpression jedes einzelnen Gens im Hefegenom.# •  Genomweite Analyse der Genexpression:# # #Microarrays ('Gen-Chips') um Transkriptionsregulation # jedes Gens unter spezifischen Bedingungen zu # analysieren# # #ß-galactosidase-Fusionen um Genexpression zu # detektieren#

Genomweite Analyse von Hefe-Genfunktion

#Proteinlokalisierung:# #Epitop-Markierungen und GFP-Fusionen zu jedem Hefeprotein im Genom um subzelluläre Lokalisation zu untersuchen # # Hefeprotein-Interaktionen: # # 2-Hybrid-Analyse und Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionen um die Interaktionspartner jedes einzelnen Proteins zu identifizieren# ##

Genomweite # GFPFusionen # "Transposon hopping" in eine genomische Library von Hefe in E. coli

GFP-markierte Proteine in Hefe!

Genomeweite LacZ-Fusionen & EpitopMarkierungen

durch Transposon - Mutagenese#

Synthetische Lethalität Inaktivierung oder Deletion zweier Gene (rot und blau) in redundanten Funktionen führt zum Zelltod, Inaktivierung eines einzelnen Genes (rot oder blau) ist ohne Effekt.

Synthetisch lethaler# Screen # Ein haploider Stamm mit einer spezifischen Mutation (rot) wird kombiniert mit der DeletionsKollektion mit dem passenden Mating Typ (blau). Nach dem Mating werden die Diploiden sporuliert und die haploiden Nachkommen analysiert.# # Im Falle einer synthetisch lethalen Interaktion ist die Doppelmutante nicht lebensfähig.

Resultate eines Synthetic Genetic Array (SGA)

Genetisches Interaktionsnetzwerk, das synthetisch lethale Interaktionen zeigt, gefunden durch SGA analysis. 291 interactions & 204 genes shown [Science 294: 2364 (2001)].

Hefe 2-Hybrid System

(A) Fänger: Fängerprotein X fusioniert an DNA Bindedomäne (DBD) eines Transkriptionsfaktors. When allein exprimiert, aktiviert der Fänger keine Transkription, denn ihm fehlt die TranskriptionsAktivatordomäne (AD) (B) Beute: ein zweites Protein Y fusioniert an die Transkriptions-Aktivatordomäne (AD). Die AD-Y Fusion alleine aktiviert keine Transkription, denn es fehlt die DNA Bindedomäne (DBD). (C) Co-Expression der interagierenden DBD-X und AD-Y Fusionsproteine rekonstituiert einen funktionierenden Transkriptionsaktivator. Das Reportergen wird aktiviert, und Protein-Protein Interaktion zwischen X und Y wird gemessen an Aktivität des Reporters. Reportergene: auxotrophe Marker(HIS3, ADE2), Farbmarker lacZ.

Anwendungen des 2-Hybrid Assays#

•  Test der Assoziation zweier Proteine, deren Interaktion aufgrund anderer Daten vermutet wird. # •  Definition der Domänen oder Aminosäuren die kritisch sind für die Interaktion zweier Proteine. # •  Screening von Libraries für Proteine, die mit einem spezifischen Protein interagieren.#

Grosse 2-Hybrid Screens in Hefe mit Proteinen anderer Organismen#

Variation1: 2-Hybrid Screen mit kleinen Molekülen# (A)  Fänger: DNA-Bindedomäne fusioniert an ein Protein, das ein kleines Molekül binden kann, z. B. Dihyrofolat-Reductase (DHFR). Zusätzlich exprimiert jede Zelle ein BeuteProtein einer DNA Library fusioniert an eine Aktivatordomäne (AD). (B)  Ein Hybrid aus einem chemischen Molekül und Methotrexat wird zugegeben, welches die Plasmamembran durchdring und an DBD-DHFR über Methotrexat bindet. Der zweite Teil des Hybrids bleibt zugänglich.# (C)  Wenn AD-Beuteprotein an den zweiten Teil des Hybrids binden kann, wird ein funktioneller Transkriptionsfaktor rekonstituiert, und das Reportergen aktiviert.

Das 2-Hybridsystem für Membranproteine# (A) Fänger: Integrales Membranprotein X als Fusion zur C-terminalen Hälfte von Ubiquitin (C), gefolgt von einem Transkriptionsfaktor (L). Fusion des Transkriptionsfaktor an das Membranprotein verhindert dessen Transport in den Zellkern und Aktivierung des Reportergens. Beute: Interagierendes Protein Y fusioniert an die N-terminale Hälfte von Ubiquitin (N). # (B) Wenn Beute & Fänger interagieren, reassoziieren die N- und C-terminalen Ubiquitinhälften und bilden Ubiquitin. Dieses wird von Ubiquitin-spezifischen Proteasen (UBP) im Zytosol erkannt und abgeschnitten. Dies setzt den Transkriptionsfaktor frei, der nun in den Zellkern wandern kann, und dort das Reportergen aktiviert.

Teil III: 
 Schlussbemerkungen

Erbmaterial, das nicht den Mendelschen Regeln folgt:# •  Mitochondrien-Genom# –  Mitochondriale DNA ~76kbp# –  vererbt als zytoplasmatisches Element# –  Hefe Mito-Genom enthält 9 Gene#

•  Prionen# –  infektiöse Proteine, die als zytoplasmatische, infektöse Elemente weitergegeben werden# –  In Hefe [PSI+] Faktor, eine veränderte Form des Sup35 Proteins.# –  Prionen in Säugern: Mad Cow Disease, CreutzfeldJacob disease, Kuru.

Hefe als Modellorganismus für fundamentale eukaryotische Prozesse

•  Zellzyklus # #Lee Hartwell, 2001 Nobelpreis für Physiologie & Medizin# Zusammenbau der mitotischen Spindel hängt ab von beendeter DNA Synthese# –  START Konzept# –  Identifizierung von Cdc28, der ersten cyclin-abhängigen Kinase# –  weitere wesentliche Zellzykluskonzepte, Krebsentstehung, etc.#

•  Sekretorischer Weg für Proteine # #Randy Schekman, 2013 Nobelpreis# –  Identifikation & Charakterisierung von Dutzenden von Genen involviert in Proteintransport durch den sekretorischen Weg#

•  DNA Synthese, Transkription, Translation, Splicing, Signaltransduktion, Autophagy, etc.#

Beispiele für Prozess, die man nicht in Hefe untersuchen kann

•  MicroRNAs gibt es nicht in Hefe (auch keinen RISC Komplex), d.h. microRNA Funktion kann nicht in Hefe untersucht werden, und silencing RNAs (siRNAs) können in Hefe nicht benutzt werden.# •  Hefe haben keine komplexen entwicklungsbiologischen Programme, und bilden keine komplexen Strukturen wie Organe