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Enzymatische Charakterisierung der Alkoholdehydrogenase aus Saccharomyces cerevisiae

Praktikumsvorschrift für Schülerinnen und Schüler

Name: __________________

Dr. F. Schaller Waldring 71 44789 Bochum T.: 0234/9304411 E-Mail: [email protected] Homepage: www.schiller-schule.de

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Einleitung   

1.1 Allgemeine Hinweise und Ablaufsplan des Versuchstages 

 

1.2 Gruppeneinteilung und Zuordnung zu dem jeweiligen Experiment 

 

II 

Methoden  2.1 Übung zum Gebrauch von Mikroliterpipetten   2.2 Vorarbeiten und theoretischer Hintergrund ‐ Nachweis von Fleischsorten mittels             molekularbiologischer Methoden, aber wie?  2.3 DNA‐Isolierung aus Fleisch‐ und Dönerproben      2.3.1 Hintergrundinformation zum Thema: Zenntrifugation  2.4 Die Polymerase‐Kettenreaktion (PCR) – theoretischer Hintergrund  2.5 Die Polymerase‐Kettenreaktion (PCR) – praktischer Teil  2.6 Agarose‐Gelelektrophorese 

 

III 

Ergebnisse 

 

IV 

Anhang  4.1 Aufgabenstellungen  4.2 Materialien        4.2.1 DNA‐Präparation         4.2.2 Polymerase‐Kettenreaktion        4.2.3 Agarose‐Gelelektrophorese  4.3 Exemplarische Ergebnisse 

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Inhaltsverzeichnis   

I 

Einleitung 

 

1.1 Allgemeine Hinweise und Ablaufsplan des Versuchstages 

 

1.2 Gruppeneinteilung und Zuordnung zu dem jeweiligen Experiment 

 

 

 

S. 2 

 

 

 

S. 2 

 

1.3 Grundlegendes aus der Chemie ‐ Stoffmenge und Stoffmengenkonzentration 

 

S. 3 

 

1.4 Einführung in die Grundlagen der Enzymologie am Beispiel der Alkoholdehydrogenase  

 

       aus Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) 

II 

Experimenteller Teil: Versuche und Methoden 

 

 

S. 4‐7 

2.1 Übung zum Gebrauch von Pipetten, Pipettierhilfen und Mikroliterpipetten   

 

S. 7‐8 

2.2 Gewinnung des Hefe‐Rohextraktes 

 

S.  9 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.3 Proteinbestimmung: Eichreihe und Proteinkonzentration des Hefe‐Rohextraktes und die                     Bedienung unserer Photometer und der Stoppuhr zur Zeitmessung   

 

 

S. 10 

2.4 Aktivitätsbestimmung der Alkoholdehydrogenase im Heferohextrakt /         Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Menge des eingesetzten Rohextrakts 

           S. 11‐13 

2.5 Die pH‐Abhängigkeit der Alkoholdehydrogenase‐Aktivität 

           S. 13 

 

 

 

2.6 Abhängigkeit der Alkoholdehydrogenase‐Aktivität von der Substratkonzentration             S. 14   

2.7 Berechnungen für Spezialisten   

III 

Ergebnisse / Auswertung  3.2 Gewinnung des Hefe‐Rohextraktes 

 

 

 

 

 

 

           S. 14‐16 

 

 

 

 

 

 

           S. 17 

3.3 Proteinbestimmung: Eichreihe und Proteinkonzentration des Hefe‐Rohextraktes 

           S. 17‐18 

3.4 Aktivitätsbestimmung der Alkoholdehydrogenase im Heferohextrakt /         Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Menge des eingesetzten Rohextrakts 

           S. 18‐19 

3.5 Die pH‐Abhängigkeit der Alkoholdehydrogenase‐Aktivität 

           S. 19‐20 

 

 

 

3.6 Abhängigkeit der Alkoholdehydrogenase‐Aktivität von der Substratkonzentration             S. 21‐22 

IV 

Anhang  4.1 Aufgabenstellungen        4.3 Materialien                4.3.1 Chemikalien und Lösungen        4.3.2 Glaswaren und Verbrauchsmaterialien        4.3.3 Geräte  4.4 Literaturverzeichnis        -4-

   

   

   

   

   

           S. 24‐26             S. 27‐28 

 

 

 

 

 

 

S. 28 

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I Einleitung  1.1 Allgemeine Hinweise und Ablaufsplan des Versuchstages    

Ziel des hier durchgeführten Projektes ist der Nachweis und die Quantifizierung von   Enzymaktivitäten am Beispiel der   Alkoholdehydrogenase (ADH) aus Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe)   über die Berechnung des photometrisch bestimmten Kosubstratverbrauchs.             Schematischer Ablauf des Versuchstages       I 

Begrüßung,  Einleitung in die Thematik, Sicherheitsbelehrung, Gruppeneinteilung 

     II 

Lyse der Hefezellen, Vorbesprechung zur Pipettierübung  

     III 

 Pipettierübung     

     IV 

Versuchsbesprechung Teil I: Einführung in die Photometrie am Beispiel der Chlorophyllbestimmung  

     V 

Versuche Teil I: Gewinnung des Heferohextraktes, Proteinbestimmung 

      VI  Versuchsbesprechung Teil II: Einführung in die Photometrie (kinetische Analyse) am Beispiel der Katalase       VII  Versuche Teil II: Aktivität im Rohextrakt, Abhängigkeit vom pH‐Wert   

‐ PAUSE ‐ 

     VIII  Versuche Teil III: Abhängigkeit der ADH‐Aktivität von der Substratkonzentration       IX 

Fertigstellung der Auswertungen, Bearbeitung der Aufgabenstellungen, Aufräumen 

     X 

Versuchsbesprechung Teil IV (Auswertung und Diskussion) 

 

  1.2 Gruppeneinteilung und Zuordnung zu dem jeweiligen Experiment  Je nach Kursstärke werden unterschiedlich viele Gruppen aus 4 Schülerinnen und Schülern gebildet. Inner‐ halb jeder Vierergruppe arbeiten allerdings jeweils zwei SuS zusammen. Die meisten Chemikalien und Ge‐ räte sind für je zwei SuS vorhanden. Andere, wie z. B. das Photometer aber auch die 20‐200 µl Pipetten,  müssen geteilt werden.  Die Auswertungen der Versuche (Ergebnisse) sollen immer im Anschluss an das  jeweilige Experiment er‐ stellt werden. Diese werden dann innerhalb der nächsten Versuchsvorbesprechung gegenseitig vorgestellt  bzw. ausgetauscht und besprochen. 

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      1.3 Grundlegendes aus der Chemie ‐ Stoffmenge und Stoffmengenkonzentration  Die Konzentration eines Stoffes wird als Stoffmengenkonzentration in Mol/Liter (molare Konzentration,  [M]) angegeben. Die Konzentrationsangabe erfolgt also nicht in Prozent [%], wie z. B. beim Alkohol, was im  Weitesten einem Mischungsverhältnis entspricht, sondern als Angabe der Anzahl von Teilchen pro Liter.   Denn: Ein Mol eines Stoffes entspricht einer festgelegten Teilchenanzahl und zwar: 6,022 x 1023 Teilchen.  Löse man ein Mol eines Stoffes in Wasser und füllt auf einen Liter auf, so hat man demnach eine Lösung,  die eine Stoffmengenkonzentration von 1  Mol/Liter hat und demnach 1 molar (1 M) ist.  Da man die Atome oder Moleküle eines zu lösenden Stoffes nicht abzählen kann – so gut sind unsere Au‐ gen nicht ‐, erhält man die Teilchenanzahl, die man für das Ansetzten einer Lösung einer bestimmten  Stoffmengenkonzentration braucht, indem man die entsprechende Teilchenanzahl abwiegt. Jedes Atom  bzw. Molekül hat ja ein charakteristisches Gewicht (besser: ein charakteristische Masse).   Erinnerung: Diese Masse nennt man Atom‐ bzw. Molekülmasse. Die Einheit hier ist das „u“. So hat das Was‐ serstoffatom eine Atommasse von 1u, das Sauerstoffatom eine Atommasse von 16u – das Wassermolekül  (H2O) demnach eine Molekülmasse von 18u.  Problem: Einzelne Atome oder Moleküle sind zu leicht, um sie auf normalen Wagen abwiegen zu können  (hierfür bräuchte man ein Massenspektrometer). Hat man aber eine große Anzahl der entsprechenden Ato‐ me oder Moleküle – zum Beispiel 1 Mol, d. h. 6,022 x 1023 Teilchen, funktioniert das schon, da man hier  Massen (Gewichte) erreicht, die auch mit „normalen“ Wagen zu messen sind.  Es hat sich daher der Begriff der Molaren Masse (Mr), der angegeben wird in Gramm/Mol [g/mol], in der  Chemie etabliert. Die Molare Masse sagt aus, welche Masse (Gewicht) ein Mol eines Stoffes hat.  Das Schöne: Die Molare Masse gemessen in g/mol entspricht der Atom‐ bzw. Molekülmasse. So wiegen  ein Mol Wasserstoffatome 1g, ein Mol Sauerstoffatome 16g und ein Mol Wasser 18g. Die Molaren Mas‐ sen von Wasserstoff, Sauerstoff und Wasser sind: 1 g/mol, 16 g/mol und 18 g/mol.  Soll man nun eine Lösung einer bestimmten Konzentration (z. B. eines der hier verwendeten Puffer) her‐ stellen, so benötigt man demnach folgende Angaben:   1. Die molare Masse [Mr] des zu lösenden Stoffes  2. Die molare Konzentration [M] der gewünschten Lösung  3. Das gewünschte Volumen [V] der Lösung einer bestimmten Konzentration.  Mit folgender Formel lässt sich dann die abzuwiegende Menge des Stoffes leicht errechnen:  Menge des abzuwiegenden Stoffes [g] =                                                 (Molare Masse [g/mol] x Molare Konzentration [mol/Liter]) x Volumen [Liter]  Ein Beispiel: Es sollen 500mL einer 0,15molaren Dikaliumhydrogenphosphat‐Lösung (K2HPO4‐Lsg.) herge‐ stellt werden.  Mr  (K2HPO4) = 174,18 g/mol; M = 0,15 mol/Liter; V = 0,5 Liter  Rechnung: (174,18 g/mol x 0,15 mol/L) x 0,5L = 13,06g  Vorgehen: Abwiegen der 13,06g K2HPO4, Lösen in ca. 400mL Wasser, Auffüllen auf 500mL    -6-

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      1.4 Einführung in die Grundlagen der Enzymologie am Beispiel der Alkoholdehydrogenase aus Bäcker‐         hefe (Saccharomyces cerevisiae)  Kenntnisse im Umgang mit Enzymen und deren Anwendungsmöglichkeiten sind schon lange keine Domäne  der Biochemie mehr. Auch andere naturwissenschaftliche Disziplinen, wie z. B. Biologie, Lebensmittelche‐ mie oder medizinische Diagnostik werden heute wesentlich durch die Enzymatik geprägt. Die vorliegend  Versuchsvorschrift  soll einen Einblick in einige grundlegende Aspekte dieses Gebietes vermitteln.  Enzyme sind die Katalysatoren der lebenden Zelle (Biokatalysatoren). Als solche können sie durch Verringe‐ rung der Aktivierungsenergie (E) die Gleichgewichtseinstellung metastabiler Systeme beschleunigen. So  verläuft z. B. die Spaltung von Wasserstoffperoxid nach Gleichung (1)  (1) 

H2O2 Æ H2O + ½ O2 

trotz einer exergonen Änderung der freien Energie (ΔG = ‐96kJ x s‐1), es handelt sich also um eine exergone  Reaktion, bei der Energie frei wird, nur äußerst langsam ab, da die Aktivierungsenergie sehr hoch ist. Die  Geschwindigkeitskonstant (k) als Maß für die Schnelligkeit der Reaktion liegt bei k =