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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRICOLAS MANUAL DE LABORATORIO DE FITOPATOLOGIA BIOL. MARCOS ESPADAS RESENDIZ M.C. GLORIA DE LOS ANGELES ZITA PADILLA PROLOGO Siendo la Fitopatología la ciencia que estudia las enfermedades de las plantas, los agentes causales, su interacción con los hospederos, la sintomatología, así como los medios de control de éstas, es notorio el papel que desempeña dentro de esta ciencia el trabajo de gabinete, esto es, el análisis de laboratorio, ya que es en éste lugar donde se establece el conocimiento de cada uno de los enunciados anteriores. El objetivo del laboratorio de Fitopatología es adiestrar al alumno en las principales técnicas de colecta, cultivo, identificación y control de los organismos causales de las enfermedades de las plantas. El presente manual tiene la intención de brindar la mínima información necesaria en el trabajo práctico de la Fitopatología, tratando siempre de establecer la relación hospedero-patógeno, al aportarles el conocimiento básico para que en un futuro sepan y puedan diagnosticar cuando un cultivo está enfermo o dañado y tengan noción de los métodos y técnicas de control que podrían emplear para lograr una mejor producción. No pretende ser éste un trabajo terminado, sino que se espera enriquecerse con la ayuda y crítica de profesores y alumnos. LOS PROFESORES DE FITOPATOLOGIA

OBJETIVOS GENERALES. Al terminar el curso el alumno: Adquirirá la destreza en el manejo de las principales técnicas el diagnóstico fitosanitario y podrá discriminar entre ellas cuando se aplican a determinado grupo fitopatógeno para su reconocimiento y diagnóstico (hongos, bacterias, nemátodos, virus)

DESARROLLO. El trabajo del laboratorio comprende a las prácticas generales y al seminario.

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PRACTICAS. Están contenidas en este manual. Se deberá entregar un reporte de cada una de estas prácticas, una semana después de haberlas concluido. Los reportes deben contener lo indicado en el manual, además de lo que los profesores les indiquen. NO SE ACEPTAN REPORTES DE PRACTICAS EXTEMPORANEOS. SEMINARIO DE INVESTIGACION. Es un trabajo particular que deberá desarrollar cada equipo a través del semestre. Este trabajo pretende que el alumno se familiarice con algún patógeno en particular, siguiendo los postulados de Koch, para lograr la correcta identificación del agente causal, de tal forma que pueda extrapolar sus conocimientos para un diagnóstico adecuado de cualquier enfermedad vegetal en su ejercicio profesional. En la primera sesión de laboratorio se les proponen algunos temas a escoger, aunque puede ser el mismo equipo el que lo proponga. En la segunda sesión todos los equipos deben tener su tema definido. En la tercera sesión deben entregar su proyecto de trabajo, el cual debe contener los siguientes puntos: 1. INTRODUCCION. (Justificación del trabajo, es decir, el QUE, el POR QUE y el PARA QUE). 2. OBJETIVOS. (Ante el planteamiento de un problema, se deben proponer objetivos a cumplir para poder solucionarlo). 3. HIPOTESIS. (Es la probabilidad que se supone como la solución al problema planteado, y por lo tanto, debe corresponder a los objetivos). 4. METODOLOGIA. (Es la descripción de los pasos a seguir para cumplir los objetivos). 5. BIBLIOGRAFIA. Cada equipo tiene que programar la fecha de siembra de las plantas que necesite, indicándolo en la metodología. Una vez que se terminen las prácticas, todas las sesiones subsecuentes se dedican exclusivamente al desarrollo del seminario. Al finalizar el semestre, hay una sesión para la EXPOSICION DE LOS SEMINARIOS. Cada equipo tiene 15 minutos para exponer y 5 minutos para preguntas. El mismo día de la exposición, se entrega un reporte final que contenga los siguientes puntos: 1. 2. 3. 4.

INTRODUCCION. OBJETIVOS. HIPOTESIS. REVISION BIBLIOGRAFICA. Esta debe incluir: 4.1 Historia y distribución geográfica del patógeno. 4.2 Importancia económica

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5. 6. 7.

8. 9.

4.3 Etiología 4.3.1 Clasificación 4.3.2 Morfología. 4.3.3 Patogénesis 4.4 Sintomatología 4.5 Epifitiología 4.6 Control METODOLOGIA RESULTADOS. (Se describe lo obtenido en el experimento). DISCUSION. (Es la parte más importante del trabajo, pues es donde se hace el análisis de los resultados, interrelacionándolos con los objetivos e hipótesis planteados, fundamentándose en la información obtenida en la revisión bibliográfica). CONCLUSIONES. (Conocimiento obtenido a través de todo el trabajo experimental). BIBLIOGRAFIA.

El reporte debe ser en Word y con buena presentación. A la entrega de este reporte, debe de anexarse: - la copia de por lo menos 3 artículos recientes referentes al tema del seminario. - Material didáctico de apoyo, en referencia al seminario (diapositivas, láminas, preparaciones, material de herbario). NOTA: No se reciben ningún trabajo o reporte fuera de la fecha indicada. La asistencia al laboratorio es OBLIGATORIA. EVALUACION. Reportes de prácticas...................….....….........................15% Seminario de Investigación...........…...…..........................25% Proyecto.....................................................5% Desarrollo...................................................10% Exposición..................................................5% Reporte final...............................................5% Exámenes parciales.....................…..........…......................10% TOTAL.........50% MATERIAL NECESARIO PARA LAS PRACTICAS QUE DEBEN TRAER POR EQUIPO*. 1 m. de franela 1 m. de manta de cielo 1/2 lt. de blanqueador de ropa 1 marcador indeleble Cerillos 1 caja de porta objetos 1 caja de cubre objetos 1 rollo de masking tape 1 charola de plástico tipo panera

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1 paquete de algodón 1 bolsa de detergente de 200 gr. Etiquetas engomadas de 2 x 2 cm. 1 rollo de papel aluminio 10 goteros en frascos color ámbar 1 rotulador Cepillo para lavar cristalería de laboratorio *Este material es necesario desde la primera práctica

PRACTICA 1 METODOS DE COLECTA INTRODUCCION. El diagnóstico de las enfermedades de las plantas tiene tanto de arte como de ciencia. Ciertas enfermedades pueden ser reconocidas fácilmente, mientras que otras toman años. No pueden darse normas fijas aplicables a todos los casos, cada uno requiere un enfoque diferente e individual. El diagnóstico es una de las bases indispensables para lograr el control eficaz de una enfermedad. Solo cuando se conoce el agente causal puede consultarse literatura especializada que revela la experiencia de otros fitopatologos y puede servir para planear las medidas de combate. El diagnóstico es más preciso, por lo general, si el que lo realiza ha examinado personalmente la enfermedad en el campo. Un observador cuidadoso puede obtener datos valiosos que facilitan todo el proceso por ejemplo, la distribución local de una enfermedad varía de acuerdo a las circunstancias, es decir, pueden estar afectadas todas las plantas por igual, algunas más que otras, plantas sanas alternadas con plantas enfermas, áreas bien definidas de plantas enfermas, en hileras en los bordes de la plantación, en las partes más bajas o distribuidas al azar. Es importante notar la presencia de focos de infección inicial, a partir de los cuales se extienda la enfermedad, ya que esta información da idea del patrón de diseminación y de la fuente de inóculo primario. En el desarrollo de la Fitopatología práctica, es de suma importancia la colecta del material enfermo, puesto que de esto dependerá el que se puedan realizar las técnicas conducentes a una identificación acertada del patógeno en cuestión. OBJETIVOS: Conocer y manejar las técnicas más comunes de colecta y preservación de material de estudio fitopatológico.

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MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO EN LA COLECTA DE PLANTAS ENFERMAS. Pala recta, navaja de campo, tijeras de podar, lupa de campo, serrucho, machete, cámara fotográfica, bolsas de polietileno, etiquetas, prensa, papel secante, periódico y cartón corrugado, libreta de campo, hielera portátil, ligas, engrapadora manual, frascos de boca ancha, soluciones fijadores. DESARROLLO: Los problemas fitopatológicos se pueden presentar en hojas, raíces, tallos, frutos, etc. Se pueden identificar cuando: a) Crecen anormalmente b) Se secan o se mueren c) Cuando disminuye la cosecha año con año y no se recupera aún con fertilizantes o combatiendo malezas. d) Alteraciones en el crecimiento (achaparramiento, gigantismos, etc.) e) Decoloraciones, sobre pigmentaciones, manchas, rayados, etc. Es conveniente disponer del mayor número de elementos vegetales colectados que permitan lograr la identificación del agente causal. Las partes vegetales que deben colectarse, dependen del tipo de cultivos que se trate: a) Cultivo anual. Se deberá colectar varias plantas completas que presenten síntomas iniciales y en diferentes etapas de desarrollo de la enfermedad, pero que no están en su totalidad muertas o en estado de descomposición, pues así no son útiles para el estudio en el laboratorio. Si el cultivo ya esta muy desarrollado, colecte solo proporciones de los órganos afectados. Es conveniente colectar también una planta sana para que sirva de comparación. b) Cultivo perenne. Se colectan partes representativas, como raíz, tallo, hojas, flores, frutas, igualmente con síntomas iniciales y en diferentes etapas de desarrollo de la enfermedad; así mismo, se deberán colectar partes que estén completamente muertas o en estado de descomposición. Para partes vegetales carnosas, como frutos o bulbos, se deben colectar en frascos con soluciones fijadoras. En el caso de que la planta presente nodulación en la raíz, es muy probable que se trate de infestaciones de nemátodos, por lo que se deben tomar muestras del suelo que haya estado en contacto con la raíz. En el caso de que las plantas sean pequeñas, se debe sacar la planta entera, y sin sacudir el suelo de las raíces, se debe meter en una bolsa de plástico junto con 250 gr. de suelo, (aproximadamente), y cerrarla con una liga. Para evitar que los nemátodos mueran, estas bolsas no deben exponerse al sol. Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, vayan acompañados con los siguientes datos. a) Datos generales.

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Muestra No. Localidad Fecha Cultivo (hospedero)

________________ ________________ ________________ ________________

Variedad Edad del cultivo Cultivos anteriores Predio

________________ ________________ ________________ ________________

b) Apariencia general del cultivo

Marchitez Amarillamiento Areas muertas Manchas foliares

__________________ Tizones

________________ Desarrollo anormal ________________ Otros ________________

________________ ________________ ________________

c) Partes atacadas de las plantas. Raíz Hojas Frutos

________________ ________________ ________________

Brotes o Tallos Flores

________________ ________________

d) Distribución de la enfermedad Plantas aisladas Areas grandes Bandas o franjas

________________

Manchones o grupos de plantas ________________ ________________ Areas pequeñas ________________ ________________ Bordes de cultivo ________________

e) Condiciones prevalecientes durante la aparición de los primeros síntomas y el desarrollo de la enfermedad. Precipitación Vientos Granizo

________________ ________________ ________________

Humedad relativa Heladas Otros

________________ ________________ ________________

Fertilizaciones Aclareos

________________ ________________

Otros

________________

a) Labores culturales. Frecuencia de riego Incorporación de materia orgánica Podas

________________ ________________ ________________

a) Químicos aplicados al cultivo (concentraciones y dosis). Fertilizantes Herbicidas Defoliantes

________________ Fungicidas ________________ Insecticidas ________________ Otros

________________ ________________ ________________

a) Características del suelo. Drenaje

________________

Textura

________________

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pH

________________

Otros

________________

a) Posibles diferencias y/o excesos nutricionales. Zn K P

__________ Mn __________ Mg __________ Otros _

__________ N __________ Bo __________

__________ __________

Datos del laboratorio que nos ayudarán al diagnóstico de la enfermedad y a la identificación del agente causal. a) Características de las lesiones. b) Presencia de esporas, micelio, cuerpos fructíferos o cualquier estructura (hacer esquemas). c) Exudaciones (color, consistencia etc.) d) Presencia de insectos o ácaros. e) Evidencia de daños mecánicos El material colectado puede emplearse para: a) Realizar aislamientos del agente causal. En este caso se puede prensar o preservarse en refrigeración. b) Como material de herbario, empleándose el prensado, o bien la preservación en fijadores* como alcohol al 70%, F.A.A. o solución de Hesler. En el primer caso los ejemplares deben ser montados en cartulinas blancas de 25 x 45 cm., siguiendo las técnicas de herbario acostumbradas. Todo el material preservado debe llevar su etiqueta correspondiente. *Preparación de soluciones preservadoras. F.A.A Formol al 40% ........................... 10 ml. Acido acético glacial ................ 10 ml. Alcohol al 50% ........................100 ml. SOLUCION DE HESLER Agua destilada .......................1000 ml. Cloruro de Zinc .........................50 ml Formalina ..................................25 ml. Glicerina .............................…..25 ml. NOTA: Los alumnos traerán la colecta fitopatológica BIBLIOGRAFIA. 1. Echandi, E. 1975. Manual de Laboratorio de Fitopatología General. Herrero Hnos. México. 2. Gaviño, G.G. y H. Figueroa. 1975. Técnicas Biológicas Selectas de Laboratorio y Campo. Limusa. México.

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3. González, L.C. 1977. Introducción a la Fitopatología. I.I.C.A. San Jose de Costa Rica. 4. López A.G. 1978. Técnicas de uso común en el manejo de Hongos fitopatógenos. Tesis. E.N.A. Méx. 5. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis. Marcel Dekker Inc. 518 pp. 6. Roberts, G. y C. Boothroyd. 1972. Fundamentos de Patología Vegetal. Acribia. Zaragoza. 7. Tuite, J. 1964. Plant Pathological Methods, Fungi and Bacteria. Burges Pobl. Co. Minneapolis. 8. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp.

PRACTICA 2 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y METODOS DE AISLAMIENTO. INTRODUCCION En el diagnóstico de las enfermedades vegetales, el trabajo de laboratorio de suma importancia, ya que ahí donde se efectúa la identificación del agente causal, lo que permite la posibilidad de aplicar los métodos de control más adecuados. El proceso de identificación de un patógeno requiere el aislamiento del mismo, para lo que es necesaria la elaboración de medios de cultivo que permitan el desarrollo de dicho patógeno. OBJETIVOS Adiestrar a los alumnos en la preparación de medios de cultivo y en las técnicas de aislamiento de agentes fitopatógenos más utilizadas. REVISION BIBLIOGRAFICA El diagnóstico de las enfermedades se fundamenta en los Postulados de Koch. Que revisten gran importancia dentro de la Fitopatología, ya que deben seguirse siempre que se está frente a una enfermedad de la que desconozca o se dude del agente causal. Los postulados de Koch son los siguientes. 1.- El agente causal debe estar constantemente asociado con la enfermedad. 2.- El organismo debe ser aislado y cultivado en el cultivo puro. 3.- Al inocular una planta susceptible sana, debe desarrollarse la enfermedad original.

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4.- El organismo patógeno debe ser aislado de la planta infectada bajo condiciones experimentales. Aislamiento. En la naturaleza abundan los microorganismos que se desarrollan estrechamente relacionados entre sí, de manera que encontramos bacterias, hongos y otros organismos de muy diversos tipos, tanto de vida libre como parásitos. Para poder estudiarlos y conocerlos se deben cultivar en modos adecuados y aislándolos del suelo o de partes vegetales enfermas. A partir de la primera muestra que se coloca en un medio de cultivo, se obtiene un cultivo mixto, del que se deben tomar nuevas muestras para realizar otros cultivos seleccionados de las diferentes colonias, hasta lograr que en el medio solo se desarrollen un tipo de organismo, éstos es, un CULTIVO PURO. Para realizar aislamientos a partir del suelo, existen diversas técnicas como el de Placa Directa y el de Dilución en Serie. En el caso de que el patógeno se encuentre en las partes vegetales se puede proceder a realizar aislamientos directos, utilizar cámaras húmedas, colocar partes vegetales en el medio de cultivo, a través de trampas, etc. Medios de cultivo. Los medios de cultivos son mezclas de sustancias nutritivas que se utilizan para el aislamiento, determinación, desarrollo, reproducción y diagnóstico de aquellos organismos productores de enfermedades en las plantas, que se comportan como parásitos facultativos. Para lograr el desarrollo y producción de las diferentes especies fitopatógenas, los medios de cultivos deben reunir características especiales, tomando en cuenta los factores que se mencionan a continuación. Nutrientes: en el medio de cultivo, deberán estar presentes elementos nutricionales tales como fuentes de carbono, nitrógenos, macroelementos (P, K, Mg, Ca), microelementos (Fe, Zn Mn, Cu, Mo ), vitaminas, etc. Humedad: Deberá proporcionarse una humedad relativa favorable a los fitopatógenos que se desee cultivar, generalmente requieren de 50% o más. Temperatura: Los valores óptimos de éstas son muy variables para cada especie, pero la mayoría de ellos pueden crecer en un rango de 10 a 25º C. Este es un factor determinante para el desarrollo y reproducción. pH: También en este caso, los valores óptimos son muy variables, pero en general los hongos fitopatógenos se desarrollan y reproducen mejor en pH ligeramente ácido, mientras que las bacteria en uno alcalino. Luz: Este factor afecta en algunos casos la reproducción de los fitopatógenos, pero en general no influye.

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Asepsia: Los medios de cultivo deben esterilizarse y mantenerse a salvo de cualquier contaminación. Clasificación de los medios de cultivo. Los medios de cultivo pueden ordenarse de acuerdo a su consistencia, quedando de la siguiente manera:

composición o a su

1.- Composición 1.1. Medios sintéticos: Son aquellos medios de cultivo en los que se conoce exactamente la composición de cada uno de sus componentes, por ejemplo: Agar Czapek. 1.2. Medios complejos o semisintéticos: En estos la composición de uno de los componentes no se conoce de manera exacta, o bien se componen de sustancias naturales y sustancias sintéticas, por ejemplo: harina de maíz-agar. 1.3. Medios de cultivos naturales: Se forman a partir de material vegetal natural, por ejemplo: tejidos vegetales, frutos, vainas, tubérculos, raíces, etc. 2. Consistencia 2.1 Medios sólidos. Contienen esencialmente agar. ( 2-3 % ) gelatina ( 10-15 %) albumina etc., materiales que al enfriarse quedan completamente sólidos. Muy empleados para el aislamiento y la reproducción de hongos y bacterias. 2.2 Medios semisólidos. Contienen bajas proporciones de agar y gelatina, mezclados o separados; al enfriarse permanecen en estado coloidal. Se emplean para mantener cultivos por largo tiempo. 2.3 Medios líquidos: Son preparados sin agar, gelatina u otras sustancias solidificantes, por lo que permanecen líquidos aún al enfriarse, se emplean cuando se necesita incrementar el inóculo de hongos o bacterias. Entre los medios de cultivos de uso frecuente en Fitopatología están los siguientes: 1.- PDA ( papa-dextrosa-agar) 2.- AN (agar nutritivo ) 3.- HFA ( harina de frijol-agar) 4.- V8A ( jugo V8-agar) 5.- AVA ( avena - agar ) 6.- TSA (jugo de tomate- sal- agar) 7.- MM ( medio de Martin) 8.- VFA (vaina de frijol-agar ) 9.- AA ( agua-agar) 10.- HMA ( harina de maíz-agar) 11.- JFA ( jugo de frijol agar) 12.- JTA (jugo de tomate-agar) 13.- MSA ( malta-sal-agar) 10

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14 .- BA 15.- BK

(Bonner- Addicot) (medio B de King)

Preparación de los medios de cultivo 1.- PDA (papa-dextrosa-agar) Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento, crecimiento y reproducción de varios hongos y de bacterias como Xanthomonas y Agrobacterium. Ingredientes : Papa......................................200gr Agar........................................ 15gr.

Dextrosa.............................20gr. Agua destilada....................aforar a 1000 ml

Procedimiento: Partir 200 gr. de papa sin cáscara y cubrirlo con agua destilada. Se deja hervir durante 15 min. Concluido éste tiempo se cuela la infusión o caldo de papa a través de manta de cielo. Se disuelve el agar en 500 ml. de agua destilada, calentando ligeramente, se le agrega la dextrosa y se disuelve. Se añade la solución de agar daxtrosa al caldo de papa mezclando bien y se afora con agua destilada a 1000 ml. y se esteriliza. 2.- AA (agua-agar) Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento de hongos del suelo como Phytium y algunos Actinomicetos. Ingredientes: Agar.....................................15gr.

Agua destilada.....................aforar a 1000 ml

Procedimientos: Se disuelve el agar en el agua destilada, calentando ligeramente, se afora a 1000 ml y se esteriliza. 3. AN ( agar nutritivo o extracto de carne-agar) Este medio de cultivo nos sirve para cultivar bacterias como Erwinia, Pseudomonas y Corynebacterium.

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Ingredientes: Extracto de carne de res..................................................3gr. agua destilada.................aforar a 1000ml. Peptona...............................................15gr. agar..................................5 gr. Procedimiento: Disolver el agar en 500 ml. de agua destilada calentando ligeramente, luego agregar la peptona y el extracto de carne y disolver, por último aforar con agua destilada a 1000 ml. 4.- HMA (harina de maíz-agar) Este medio de cultivo sirve para aislar hongos de los géneros Pythium y Phytophthora. Ingredientes: Harina de maíz ............................20gr. Peptona........................................20gr. Agua destilada.............aforar a 1000 ml.

agar................................................20gr. dextrosa..........................................20gr.

Procedimiento: En 500 ml. de agua destilada a 70º C se agrega la harina de maíz y se calienta por 1 hr. a 60º C se filtra la infusión a través de manta de cielo. La solución filtrada se clarifica centrifugando por 20 min. a 3000 RPM. Decantar y juntar el líquido sin sólidos producto de la centrifugación. Disolver el agar, la dextrosa y la peptona en 300 ml de agua destilada calentando ligeramente. Añadir el líquido centrifugado a la solución de agardextrosa-peptona y aforar con agua destilada a 1000 ml. Esterilizar. 5.- HFA (harina de frijol- agar) Este medio de cultivo se utiliza para cultivar algunas especies del género Phytophthora. Ingredientes: Harina de frijol ............………......30gr. agar ..........................................20gr. Agua destilada................………....aforar a1000ml. Procedimiento: En 500 ml. de agua destilada se agregan los 30 gr. de harina de frijol, se calienta la solución a 60-70 ºC. Se filtra la infusión a través de manta de cielo. La solución filtrada se clarifica centrifugando durante 20 min a 300 RPM. Se decanta y se junta el líquido sin sólidos, producto de la centrifugación.

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Disolver el agar en 300 ml de agua destilada calentando ligeramente. Añadir el líquido centrifugado a la solución de agar mezclándolo bien. Finalmente aforar con agua destilada a 1000 ml. Esterilizar. 6.- JFA ( jugo de frijol - agar) Este medio de cultivo se emplea para cultivar Colletotrichum lindemuthianum. Ingredientes: Jugo de frijol proveniente de vainas prensadas o molidas..............215 ml. Agar ..................................………………………………...............10 gr. Agua destilada .................………………………………..............aforar a 1000ml. Procedimiento: Obtener el jugo de frijol prensado o moliendo las vainas verdes. Disolver el agar en 285 ml. de agua destilada, calentando ligeramente. Añadir la solución de agar al jugo de frijol y esterilizar. 7.- V8A (jugo V8- agar ) Este medio se prepara de dos formas, según la especie de hongo que desee cultivar. Para aislar a Phytophthora infestans y Phythium. Ingredientes: Jugo V8 centrifugado*...................20ml. Agar................................................15gr.

CaCo3 ..........................4.5gr. Agua destilada..........aforar a 1000 ml

B) Para aislar a Phytophthora parasitica y Ph. palmivora. Ingredientes: Jugo V8 centrifugado*.........................100 ml. Agar......................................................15gr.

CaCo3............................2gr. Agua destilada..............aforar a 1000ml.

*En ambas fórmulas se puede sustituir el jugo V8 por jugo de tomate simple. Procedimiento: Agregar el CaCo3 al jugo V8 o de tomate. Agitar hasta disolverlo. Dejar reposar la solución durante 10 min. Centrifugar para clarificar durante 20 min a 3000 RPM. Se decanta y se junta el líquido sin sólidos, resultante de la centrifugación, hasta completar la cantidad requerida.

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Para la fórmula A) disolver el agar en agua destilada, calentando ligeramente. Añadir a la solución de agar el jugo V8 o de tomate centrifugado y aforar con agua destilada a 1000 ml. Para la fórmula B) utilizar 900 ml. de agua destilada para disolver el agar, mezclando esta solución con el jugo V8 o de tomate centrifugado. 8.- JTA ( jugo de tomate-agar) Este medio de cultivo se utiliza para aislar a Phytophthora capsici. Ingredientes: Jugo de tomate natural...................60 ml. Agar ...............................................14gr.

Ca Co3..............…….0.6gr. Agua destilada...........aforar a 1000 ml.

Procedimiento: Se muelen los tomates y se cuelan a través de una manta de cielo. El jugo se mezcla con el CaCo3, se agita bien y se deja reposar durante 10 min. Para clarificar, se centrífuga durante 20 min a 3000 RPM. Se decanta y se junta todo el líquido centrifugado hasta completar la cantidad requerida. Se disuelve el agar en otro poco de agua destilada (800ml. ) y se añade la solución centrifugada, mezclando bien. Se esteriliza. 9.- AvA (avena-agar) Este medio de cultivo se utiliza para aislar especies de los géneros Phytophthora y Pythium. Ingredientes: Avena…………… …..60 gr Extracto de levadura…. 2 gr.

Agar…………………………12 g Agua destilada………aforar a 1000 ml

Procedimieto: En 600 ml de agua remojar 60 gr de avena durante 24 hr. Después hervir durante 30 min. Filtrar la infusion a traves de una manta de cielo. Para clarificar la solución colada, centrifugar durante 20 min. a 300 RPM. Decantar y juntar el líquido sin sólidos producto de la centrifugación. Disolver el agar en 400 ml de agua destilada calentado ligeramente. Disolver el extracto de levadura en la solución de agar. Añadir a esta solución la infusión de avena centrifugada, mezclar bien y aforar con agua destilada a 1000 ml Esterilizar. MSA (malta -sal-agar). Este medio de cultivo se utiliza para aislar principalmente a los hongos que atacan granos almacenados. Ingredientes: NaCl………………….7.5 gr

Agar ………………………….7.5 gr

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Extracto de Malta ……..20 gr

Agua destilada ……………….aforar a 1000 ml

Procedimiento: En 400 ml de agua disolver el agar calentando ligeramente. Disolver el extracto de malta en la solución de agar. En 500 ml de agua destilada disolver la sal calentando ligeramente. Añadir la solución de extracto de malta-agar, la solución de sal, mezclando bien. Aforar con agua destilada a 1000 ml. Esterilizar por NO MAS de 15 min. 11. TSA (JUGO DE TOMATE-SAL-AGAR). Este medio de cultivo se utiliza para aislar hongos de granos almacenados. Ingredientes: Jugo de tomate-agar (medio deshidratado) NaCl……………………………100 gr o 90 ml de jugo de tomate de lata Agua destilada ……...aforar a1000 ml. Agar……………………………….15 gr (si se usa medio deshidratado) 30 gr (para jugo de tomate) Procedimiento: En 500 ml de agua destilada se disuelve el jugo de tomate-agar (medio deshidratado) y el agar, calentando ligeramente. Si se mezcla con el agar y 200 ml de agua, se centrifuga durante 20 min. a 3000 RPM, y se mezcla bien calentado ligeramente. En 400 ml de agua se disuelve la sal calentando ligeramente. Se añade a esta solución la de jugo de tomateagar mezclando bien y se afora a 1000 ml. Esterilizar. 12. BA (Bonner- Addicott). Este medio de cultivo sirve omnivorum.

para aislar y desarrollar a Phymatotrichum

Ingredientes: KNO3 (nitrato de potasio)…0.808 gr

MgSO4 o7H2C (sulfato de magnesio) ...0.0369 gr

Ca(NO3)H2O (nitrato de calcio)…0.236 gr

KCl (cloruro de potasio)………….0.6486 gr gr Glucosa ………………………… 20.00 gr Agua destilada………………aforar a 1000 ml.

KH2PO4 Fosfato diácido de potasio …..0.0108 gr FeCl3 (tartato férrico)……0.0010 Agar ……………………25.000gr

Procedimiento.

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En 500 ml de agua destilada disolver el agar y la glucosa calentando ligeramente. En 500 ml de agua destilada disolver todos los demás componentes uno por uno. Añadir a la solución de glucosa-agar la solución del resto de los componentes, mezclando bien. Ajustar el pH a 7.0-7.5, midiendo con papel pH y agregando HCl si se necesita acidificar o NaCl si se trata de alcalinizar. 13. MM (medio de Martin). Este medio de cultivo se utiliza para aislar a los hongos del suelo. Ingredientes: Dextrosa……………10 gr. Peptona…………….. 5 gr. KH2PO4…………….1 gr. Agar………………..20gr.

Estreptomicina…………………………………...1 gr. MgSO4.7H2O(sulfato de magnesio hidratado)…..0.5gr. Rosa de Bengala…………………………………3.5 ml. Agua destilada…………………………aforar a 1000 ml.

Procedimiento: Para preparar la solución de Rosa de Bengala se disuelve 1 gr de colorante en 100 ml de agua; de esta solución se toman los 3.5 ml para agregarlos a 1000 ml de medio de cultivo. En 500 ml de agua destilada se disuelve el agar, calentando ligeramente, y en los restantes 500 ml se disuelven uno a uno los demás componentes. Después se mezclan bien las dos soluciones. La estreptomicina se prepara separadamente, momentos antes de vaciar el medio en las cajas de Petri. Se disuelve 1 gr de estreptomicina en 150 ml de agua destilada estéril. Se agrega 0.05 ml de estreptomicina en solución a cada caja de Petri (esto es para inhibir el crecimiento de las bacterias) 14. BK (B de King). Este medio de cultivo sirve para aislar diferentes géneros de bacterias. Ingredientes: Peptona………………...20 gr. Glicerina……………….10 ml MgSO4…………………1.5 gr.

Agar…………………………….15 gr. K2HPO4………………………..1.5 gr. Agua destilada…………………aforar a 1000 ml

Procedimiento: Se disuelve el agar en 500 ml de agua calentando ligeramente y después se le añade la glicerina. En otros 300 ml de agua se disuelven los demás componentes agregándole a esta solución la de agar- glicerina. Se mezcla bien y se esteriliza. 15. VFA (vainas de frijol-agar). Este medio de cultivo sirve para aislar a Colletotrichum lindemuthianum.

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Ingredientes: Vainas de frijol……………….250 gr. Agua destilada……………….aforar a 1000 ml.

Agar………………………….15 gr.

Procedimiento: En 500 ml de agua destilada se añaden las vainas cortadas en trozos muy pequeños. Se calienta a 60º C durante 30 min. Se filtran a través de una manta de cielo y papel filtro. Se disuelve el agar en 300 ml de agua destilada calentando ligeramente, se le añade la infusión filtrada, mezclando bien y se afora a 1000 ml. Esterilizar. MATERIALES 2 Matraces de 250 ml limpios y ertériles. 2 Pinzas de disección 1 Matraz con 500ml. de agua destilada estéril 4 Recipientes de plástico p/desif. 1 Soporte universal con tela de asbesto 1 Probeta de 100ml. 1 Mechero 1 Gradilla 1 Agitador 6 Tubos de ensaye c/9 ml. de agua estéril 1 Pizeta con cloro al 50% 2 Vasos de precipitado p/calibrar * 2 Papel filtro estéril tamaño de 8 x 12 cm. 1 Balanza granataria* 12 Cajas de Petri limpias y estériles 1 Frasco de agar 2 Cjas de Petri para cámara humeda 1 Frasco de dextrosa* 2 Agujas de disección 1 Frasco de malta 1 Centrifuga 1 Frasco de carbonato de calcio NOTA: Los reactivos para la elaboración de los medios de cultivo puedes variar de acuerdo a la cantidad y diversidad de medios de cultivo que elabore el grupo. Vaciado del Medio de Cultivo a Cajas de Petri. Para llenar las cajas de Petri con el medio de cultivo de una manera aséptica, realice lo siguiente: A. Limpiar la mesa con una solución de cloro 2:1 en agua o benzal B. Colocar y encender el mechero o lampara de alcohol. Poner las cajas y recipientes con el medio sobre la mesa. C. Tomar el recipiente con el medio de cultivo y destaparlo con la mano izquierda; pasar la boca del recipiente sobre la llama del mechero. Conservar el tapón en la misma mano con que sostiene el recipiente del medio. D. Tomar con la mano derecha una caja y levantar la tapa lo suficiente para vertir el medio; vaciar en cada caja de 10 a 12 ml. del medio. E. Colocar la tapa de la caja de Petri suavemente en su sitio y tapar el recipiente con el medio de cultivo. F. Distribuir uniformemente el medio con movimientos de rotación de la caja sobre una superficie horizontal. G. Deje solidificar. H. Una vez solidificado el medio, realizar pruebas de esterilidad por incubación a 35 ºC durante 48 hrs.

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TÉCNICAS DE AISLAMIENTO 1. Aislamiento a partir del suelo. 1.1. Placas directas. En cajas de petri con medio de cultivo solidificado, agregue

pequeñas porciones de suelo son una espátula. Incube a 24 ºC Cuando hayan crecido colonias de hongos o bacterias, transfiera pequeñas placas por separado a nuevas cajas o tubos con medio estéril, con ayuda de una aguja de disección. Se recomienda usar agua-agar. 1.2. Dilución en serie. Se mezcla 1gr de suelo en 10 ml de agua destilada estéril. Se deja reposar de 1 a 2 min. Se transfiere 1 ml del sobrenadante a otro tubo con 9 ml de agua destilada estéril y se repite así tres veces mas. Posteriormente de cada tubo se toma 1 ml y se coloca en una caja de Petri, usando una para cada dilución. Agregue a las cajas, previamente, agua-agar o medio de Martin, a temperatura soportable por el dorso de la mano. Incube a 24 ºC. Las colonias de microorganismos se observan de 2 a 3 días después . 2. Aislamientos a partir de vegetales enfermos. 2.1. Aislamiento directo. Observe al microscopio de disección el ejemplar enfermo; si

encuentra fructificaciones, micelio, etc., tome una muestra de este material con una aguja de disección estéril y colóquelo directamente sobre el medio de cultivo solidificado. Incube a 24ºC y observe a los 7 días. 2.2. Cámara húmeda. Cuando la planta presenta micelio y no hay fructificaciones o cuando no se aprecia el crecimiento del patógeno, se recurre al uso de la cámara húmeda. Se toma una porción de tejido enfermo y se desinfecta en una solución 2:1de cloro (NaOCl). En una caja de Petri estéril, que contenga papel filtro esterilizado, se humedece con agua destilada estéril. Sobre el papel se colocan pequeños trozos del vegetal enfermo y se cierra la caja. Se incuba a 24ºC durante 2 o 3 días y se observan resultados. 2.3. Partes vegetales en medio de cultivo. La porción que interesa se desinfecta en cloro (NaOCl), se enjuaga con agua destilada estéril y se coloca en cajas con PDA solidificado. Se incuba a 24ºC y se observa después de 4 a 5 días. Cuando se desea aislar bacterias, los tejidos se lavan y se sumergen en un tubo con agua destilada estéril, se hacen diluciones que se agregan a cajas con PDA. Incube las cajas a 24ºC y observe después de 5 días. 2.4. Trampas. Plante semillas o porciones vegetales en suelo infectado, proporcione humedad e incube a temperatura ambiente. Después de 4 a 5 días se podrá apreciar el crecimiento del patógeno. Proceda a aislarlo con la técnica anterior CUESTIONARIO. 1. A qué tipo de medios de cultivo (natural, semisintético o sintético) pertenecen los utilizados en esta práctica? Explique su respuesta. 2. Qué es la esterilización y cuales son los métodos mas frecuentes para esterilizar materiales fitopatológicos? 3. Describa los tipos de colonias que surgieron en los aislamientos a partir del suelo y partes vegetales enfermas.

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4. Calcule el numero de organismos que surgieron en los aislamientos a partir del suelo por el método de dilución, de la siguiente manera No. de colonias x dilución empleada x volumen inicial = No. de organismos en 1ml Ejemplo: 2 colonias x

1 1000

x 10 ml = 0.02 organismos por ml.

5. Cómo realizaría un cultivo de Puccinia graminis tritici y del virus del mosaico

amarillo del frijol, a partir de vegetales enfermos? BIBLIOGRAFIA 1. Agrios, G. N. 2005.Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press. Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, san Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp. * 2. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355 pp 3. Echandi, 1975. Op. cit. 4. French, E.R. y Her. 1980. Métodos de Investigación Fitopatológica. IICA. Costa Rica. 5. Gaviño, G. C., C. Juárez y H. Figueroa. 1975. Op. cit. 6. López A.G. 1978. Op. cit. 7. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. 8. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. 9. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp.

PRACTICA 3 GENERALIDADES DE MICROORGANISMOS INTRODUCCION. En el proceso de diagnóstico de las enfermedades de las plantas, la identificación del agente causal ocupa un lugar preponderante. Las enfermedades vegetales pueden ser causadas por agentes abióticos y bióticos. Las técnicas de identificación particularizan en los agentes bióticos, es decir, en los microorganismos fitopatógenos, entre los que encontramos virus, viroides, micoplasmas, espiroplasmas, riquettsias, bacterias, hongos y nemátodos. De estos, algunos son tan pequeños o requieren de técnicas microscópicas tan elaboradas para su observación, que

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es imposible determinar su morfología en un laboratorio escolar, en tanto que otros se prestan a su trabajo en éstos. Concretamente, los que resultan mas fáciles de identificar son las bacterias, los hongos y los nemátodos. OBJETIVOS. Reconocer las características morfológicas que distinguen a las bacterias, a los hongos y a los nemátodos, en preparaciones temporales y permanentes.

PRIMERA PARTE: VIRUS (esta parte se hará con equipos que trabajen virus fitopatógenos en su seminario) Purificación de partículas virales REACTIVOS Fosfato potásico Sulfito de sodio Cloroformo Tetracloruro de carbono Glicol-polietileno (PEG) SOLUCIONES Solución 1: Fosfato potásico 0.5M (1:2 p/v), pH=7.5, con 0.5% sulfito de sodio. Solución 2: Glicol-polietileno al 6% (PEG). Solución 3: Fosfato de potasio 0.25 M, pH=7.5 Solución 4: glicol-polietileno al 20.0% (PEG). METODOLOGÍA 1. Pesar un gramo del tejido cosechado 2. Lavarlo bajo el chorro de agua corriente 3. Someterlo a un lavado con Tween 20 sobre agitador magnético por 3 minutos 4. Lavarlo con una solución de cloro al 10% por 4 minutos en agitador magnético 5. Enjuagar con agua destilada estéril (150 ml en vaso de precipitado) sobre agitador magnético por un minuto. 6. Dar un enjuage final con con agua destilada estéril (150 ml en vaso de precipitado) sobre agitador magnético por un minuto. 7. Secar en papel filtro. 8. Colocar en bolsa para macerar 9. Agregar 2 ml de la solución 1 10. Macerar 11. Agregar 1 ml de la solución al macerado 12. Macerar 13. Decantar en un tubo tipo Ependorf, en caso necesario agregar 1 ml de solución 1 para facilitar la decantación. 14. El macerado se homogeniza durante un minuto.

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15. Enseguida se agregan al homogenizado Cloroformo y Tetracloruro de carbono (0.5:1 v/p de cada uno). 16. Homogeneizar dos minutos más. 17. Centrifugar a 5000 rpm durante cinco minutos. 18. El sobrenadante que resulta se trata con la solución 2 y se agita en frío (4º C) durante dos horas. 19. Se centrífuga a 8 500 rpm durante diez minutos. 20. El precipitado obtenido se resuspende en la solución 3 y se incuba durante seis horas. 21. Después se centrífuga a 10,000 rpm durante diez minutos. 22. Al sobrenadante se añade la solución 4 (2 ml PEG/5 ml sobrenadante). 23. Se incuba durante una hora en frío (4º C). 24. El precipitado se centrífuga a 12,000 rpm durante diez minutos. 25. Después se resuspende en la solución 3 (0.5 ml de solución por cada 100 g de tejido). 26. Después de doce horas, se centrífuga a 10,000 rpm durante diez minutos. 27. Se usa el sobrenadante para el diagnóstico. RESULTADOS:

SEGUNDA PARTE: BACTERIAS Las bacterias son microorganismos pertenecientes al reino Monera. Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. Su forma puede ser esférica, bacilar o espiralada. Se encuentran constituidos por una cápsula de secreción, pared celular, membrana y citoplasma este último conteniendo gránulos de grasa, vacuolas, pigmentos y material genético disperso, es decir, carecen de núcleo verdadero. La pared celular determina la forma de las bacterias y es selectiva, pudiendo contener aminoácidos aromáticos, ácido murámico y azúcar. Dependiendo de la cantidad de estos, las bacterias pueden teñirse de rojo o de violeta al seguir la técnica de tinción de Gram. Se conocen aproximadamente 1600 especies de bacterias. La mayoría son saprófitas obligadas, y como tales benefician al hombre porque ayudan descomponiendo grandes cantidades de materia orgánica y deshechos animales y vegetales. El manual de Bergey cita 180 especies de bacterias reconocidas como fitopatógenas, de las cuales, con pocas excepciones, todas son saprófitas facultativas, por lo que pueden ser cultivadas en medios artificiales. Ciertas bacterias son flageladas y pueden desplazarse en medios líquidos. Algunas forman esporas, aunque no es el caso de las fitopatógenas. Todas las bacterias fitopatógenas conocidas hasta el presente son aerobias, aún cuando existen anaerobias facultativas, facultad que no ejercen dentro del tejido vegetal. ACTIVIDADES. 1. Elaboración de preparaciones temporales y permanentes de bacterias. 2. Tinción de bacterias por el método de Gram, Tinción de cápsula y productos de

excreción, Tinción de flagelos.

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3. Observación de preparaciones temporales permanentes de bacterias. 4. Esquematización de lo observado, indicando los nombres de las estructuras.

MATERIALES Y METODOS. Porta y cubreobjetos Caja de petri Agujas de disección Cultivos de bacterias Preparaciones de bacterias Mordiente para tinción de flajelos Tejidos vegetales enfermos

Cristal violeta para tinción de Gram Safranina para tinción de gram Tinta china bacteriológica Sulfato de cobre Lugol Cristal violeta para flagelos Alcohol etílico

ANTES DE EMPEZAR A TRABAJAR, DESINFECTE LA MESA CON CLORO TECNICA PARA REALIZAR PREPARACIONES TEMPORALES Trabaje cerca de la flama. Flamee el asa o aguja de disección para evitar contaminaciones. Con el asa tome una pequeña muestra de microorganismos del cultivo, colóquela en un portaobjetos limpio con una gota de agua destilada. Coloque el cubreobjetos, evitando que se formen burbujas colocando inclinado, y cuando el líquido se haya extendido por el borde, deje caer el cubreobjetos suavemente. Observe la preparación al microscopio usando diferentes objetivos. Siempre se empieza por 10X. Recuerde que a 100X es necesario usar aceite de inmersión. Puede teñir la preparación siguiendo las técnicas adecuadas. TINCION DE PRODUCTOS DE EXCRESION Y CAPSULA DE BACTERIAS. 1. Coloque en un portaobjetos una gota de tinta china bacteriológica, agregue una pequeña muestra de bacterias, coloque el cubreobjetos y observe. 2. Haga un frotis, séquelo al aire, agregue cristal violeta durante 2 min. Lave con sulfato de cobre al 2 % Séquelo con papel absorbente. Las cápsulas aparecen en color azul y violeta y los cuerpos bacterianos en azul obscuro. COLORACION DE GRAM. Reactivos: Solución de Cristal violeta con oxalato de amonio: Solución A: Cristal violeta……………………………2.0g. Alcohol etílico……………………………20ml Solución B Oxalato de amonio………………………..0.8g. Agua destilada…………………………….80ml Mezclar las soluciones A y B Solución lugol

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Yodo…………………………………………1.0g. KI…………………………………………….2.0g Agua destilada………………………………...100ml.

Colorante de contraste ( solución de afranina) Safranina al 2.5% en alcohol etílico al 95%................10ml. Agua destilada…………………………………………100ml. En una gota de agua coloque una pequeña masa de bacterias esparciéndolas a lo largo. Debe de ser un cultivo de 24 horas. Fije la preparación al aire o con calor (a la flama). Cubra la preparación con cristal violeta 1 min. y decante. Cubra la preparación con lugol 1 min y lave con agua corriente. Decolore con alcohol etílico por 30 seg. agitando para una decoloración homogénea, lave con agua corriente. Cubra la coloración con safranina 1 min. y lave con agua corriente. Absorba el agua con papel sin frotar. Observe al microscopio. TINCION DE FLAGELOS DE BACTERIAS. *Mordiente: Acido tánico…………..…20 gr Agua caliente……………..80ml Posteriormente adicionamos 15 ml Trióxido de Cromo al 2.5%, finalmente dejamos reposar durante cuatro días a temperatura de 180, filtramos y usamos Cristal violeta Cristal violeta……………………………..0.5g Fenol………………………………………2.5g Etanol a 97%................................................20ml. Glicerina……………………………………80ml. Agua destilada………………………………100ml. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Se prepara un frotis y se seca al aire. Se añade el mordiente filtrado y se deja de 1 a 5 min. Se lava con agua cuidadosamente. Se cubre con cristal violeta se deja actuar 2 min. Se repite el lavado de la misma forma. Se seca la preparación al aire. Se observa al microscopio con el objetivo de inmersión. TERCERA PARTE: HONGOS

Los hongos comprenden al grupo más numeroso de microorganismos fitopatógenos, siendo además los causantes de las mayores pérdidas económicas agrícolas, debido al gran número de enfermedades que ocasionan.

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Se considera que todas las plantas son susceptibles al ataque de por lo menos un hongo, y muchas son afectadas por un gran número de estos organismos. El hábitat de los hongos es muy amplio, ya que se encuentran en el suelo, en el agua y dentro o sobre plantas y animales. Pueden desarrollarse en condiciones climáticas muy variadas, encontrándolos en rangos de temperatura que van desde los 0ºC hasta los 50º . Los hongos pertenecen al reino Fungi, son microscópicos y macroscópicos, uni y pluricelulares, carentes de clorofila. Están constituidos por células redondas u ovales solitarias o en plasmodios, o más frecuentemente por estructuras alargadas y ramificadas llamadas hifa, cuyo conjunto se denomina micelio. Cada hifa está constituida por una pared celular que protege a la membrana celular y al contenido protoplasmático, en donde se encuentran dispersos sus núcleos verdaderos, así como las mitocondrias, ribosomas, retículo endoplásmico y gránulos de sustancias de reserva. Si las hifas están separadas en celdas, se dice que el micelio es septado, y si el protoplasma es continuo en las hifas el micelio es cenocítico. En algunos hongos el micelio llega a formar pseudotejidos. Prosénquima y pseudoparénquima . Entre las estructuras de reproducción asexual están , los oídos, clamidosporas, esporangios y conidios, estos últimos solitario o agrupados en sinemas, esporodoquios, acérvulos o picnidios. Algunas estructuras de reproducción sexual son las oosporas, ascas -libres o en apotecios, peritecios y cleistotecios- y basidios, que nacen directamente de una espora de resistencia o en basidiocarpos. ACTIVIDADES. 1. Elaboración de preparaciones temporales y permanentes de hongos, utilizando diferentes técnicas de tinción. 2. Observación de preparaciones permanentes de hongos. 3. Esquematización de lo observado, indicando los nombres de las estructuras.

MATERIALES Y METODOS. Porta y cubreobjetos Mechero o lampara de alcohol Caja de Petri Agujas de disección Tejidos vegetales enfermos Azul de lactofenol

azul de metileno rojo congo lugol preparaciones de hongos cultivos de hongos Azul de algodón

PREPARACIONES TEMPORALES DE HONGOS 1. Con una asa estéril (o una aguja de disección ), tome una pequeña muestra de hongos y colóquela en un portaobjetos con una gota de agua destilada. 2. Extienda el micelio y agregue una gota de azul de metileno.

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3. Coloque el cubreobjetos y observe al microscopio. TINCION CON ROJO CONGO. 1. 2.

Realice una preparación temporal de hongos, usando lactofenol en lugar de agua para colocar el micelio. Coloque el cubreobjetos y por un extremo agregue una gota de rojo congo*, permita que se difunda y observe al microscopio. • Esta técnica se puede seguir, sustituyendo colorantes.

IMPORTANTE. Al final de cada práctica todo el material biológico y medios de cultivo: Antes de lavarlo se esteriliza, los desechos sólidos se colocan en el lugar indicado para estos, se lava, se seca se vuelve a esterilizar y se entrega al laboratorista en las mismas condiciones en que lo recibió para llevar a cabo la práctica

MICROCULTIVO

Introducción. Una vez que se tiene el resultado de las diferentes técnicas de aislamiento como lo es la obtención de la cepa pura, el siguiente paso para cumplir a cabalidad con el segundo postulado de Koch, es la identificación del agente causal y una herramienta más para cumplir con este objetivo, en caso que este agente causal sea un hongos como en la mayoría de las enfermedades que limitan la producción agrícola: es la técnica de microcultivo; con esta técnica se obtienen las distintas fases del ciclo de vida de los hongos, que va de germinación de la espora, formación del tubo germinativo, hifas, micelio, diferenciación de las estructuras reproductivas asexuales y sexuales. Se debe dar un manejo de tiempos en el desarrollo de los hongos para poder observar las estructuras desde el inicio de su formación. Por ejemplo esta técnica resulta sumamente útil para aquellos hongos en los que es difícil observar la formación de los conídios sobre los conidióforos y la forma y estructura de éstos; porque, al efectuar el preparado correspondiente, se desprenden y/o se rompen. Mediante este método se puede observar bajo el microscopio, su crecimiento y esporulación en todos sus detalles y así tener elementos morfológicos de estructuras somáticas y reproductivas completas para así poder hacer la identificación con mayor confiabilidad y conocer a los hongos como agentes causales de enfermedades en los cultivos de importancia agrícola Dhingra, and Sinclair(1985) Trigiano, Windham,. and Windham,, (2004) Objetivo. •

Conocer la técnica de microcultivo para la caracterización de estructuras somáticas y reproductivas para identificar morfológicamente a los hongos fitopatógenos.

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Materiales y Métodos. Recipiente con alcohol al 96%. Pinzas de disección. Aguja de disección. Bisturí. Caja de Petri estériles con PDA. Caja con cepa pura. Caja de Petri con portaobjeto, cubreobjeto y triangulo de vidrio (estéril). Pipeta. Puntas. Agua estéril. Papel parafí

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1. Con un bisturí estéril se cuadricula el medio de cultivo de la caja de Petri con PDA en cuadros de aproximadamente 1 cm2. este paso se realiza en el interior de una campana de flujo laminar preparada para trabajar bajo condiciones asépticas 2. Dentro de la cámara de flujo laminar, con la ayuda de un bisturí estéril, uno de los cuadros de PDA se transfiere al portaobjetos que esta en la cámara de microcultivo ;este portaobjetos debe de estar sobre el triangulo de vidrio 3. Con la aguja de disección estéril o con una asa bacteriológica estéril se lleva el inóculo a las orillas superiores e inferiores del cuadro de PDA 4. Se coloca el cubre objetos sobre el cuadro de PDA inoculado, procurando que quede bien centrado. 5. Se agregan 2ml de agua estéril, en el fondo de la cámara de microcultivo para mantener la humedad, sin mojar el área de crecimiento del hongo. Los pasos 1-5 se llevan a cabo en el interior de una campana de flujo laminar o en mesas de trabajo en condiciones asépticas 6. Se sella el dispositivo de microcultivo con papel parafilm y se rotula. 7. El crecimiento del hongo se detiene cada 24, 8. se repiten los pasos del 1 al 7 para mas microcultivos, y detener su desarrollo a la 48, 72 y 96 hrs. respectivamente BIBLIOGRAFÍA Ø Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355 pp SB 732.5 D45 Ø Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscópicos saprobios y parásitos: Métodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp. QK 603 M55. Ø Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventory and monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777pp. C.B. QK600.3 M84 Ø Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37 Ø Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63 Ø Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53 Ø Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis. Marcel Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37.

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MEDIDA DE ESTRUCTURAS DE AGENTES FITOPATÓGENOS CON MICROSCOPIO ÓPTICO Introducción. Para identificar a un agente fitopatógeno y cumplir cabalmente con el segundo postulado de Koch de además de los datos correspondientes al aspecto de los síntomas que hayan causado en su hospedante, o de las colonias que hayan formado sobre las placas en medios de cultivo, de los datos morfológicos que hayan resultado de la técnica de microcultivo es necesario saber las medidas de las estructuras somáticas y reproductivas que se observan en el microscopio óptico para tener una identificación confiable del agente causal. Por ejemplo si se habla de hongos fitopatógenos las estructuras que se miden para identificarlos son: picnidios, acérvulos, esporodoquios, sinemas, peritecios, apotecios, clestotecios entre otras. La The American Phytopathological Society en todas sus obras de enfermedades de los cultivos agrícolas, las claves que usa para la identificación de los diferentes grupos de hongos fitopatógenos están en función del tamaño de las estructuras somáticas y de reproducción de este grupo de fitopatógenos. La identificación del agente causal es básica para precisar el diagnóstico y así poder establecer el mejor método de control para estas limitantes biológicas en la producción agrícola. Objetivo. • Que el alumno aprenda a calibrar y medir células, estructuras somáticas y reproductivas de importancia taxonómica de agentes fitopatógenos con el microscopio. óptico para su identificación morfológica Material. Un microscopio óptico. Un micrómetro ocular. Un portaobjetos micrométrico. Preparaciones permanentes y/o temporales de estructuras fitopatógenos. Metodología. Calibración de los lentes objetivos. 1.- Se coloca en el ocular del microscopio óptico el micrómetro ocular –aunque a menudo se trabaja con el ocular micrométrico permanente puesto en el microscopio. Hay que evitar que quede invertida la escala (Ver Fig 1).

Fig 1.- A.- Colocación de la reglilla ocular, y B.- Escala de la reglilla ocular micrométrica 2.- Sobre la platina del microscopio se pone el micrómetro del objeto similar portaobjeto como si fuese una preparación.

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Fig 2.- Escala de la reglilla portaobjeto 3.- Moviendo la platina se hace coincidir el margen de una raya del ocular micrométrico con una del portaobjetos micrométrico. Puesto que las rayas del portaobjetos aparecen tanto más gruesas cuanto mayor son los aumentos, la superposición de las líneas ha de ser siempre al comienzo del margen exterior de éstas.

3.- Moviendo la platina se observa a través de microscopio con ambas reglillas colocadas se les puede ver superpuestas en el campo visual, y se puede saber cuantas líneas del micrómetro ocular concuerdan con cuantas lineas del micrómetro del objeto se hace coincidir el margen de una raya del micrómetro ocular con una del micrómetro del objeto. Ver figura 3

Fig 3.- Vista simultánea del ocular y de la reglilla micrométrica 4.- Cuando se observa a través del microscopio con ambas reglillas micrométricas colocadas, se les puede ver superpuestas en el campo visual, y se puede saber cuántas líneas del micrómetro ocular concuerdan con cuántas líneas del micrómetro del objeto. En el campo visual, la reglilla ocular se encuentra graduada del 0 al 10 a un lado la reglilla del objeto con 100 divisiones; como cada línea del micrómetro del objeto corresponde a 10 micras, se hacen coincidir ambas reglillas en el cero, en el otro extremo de las reglillas se observa cual de las 100 líneas de la reglilla ocular coinciden con otra de la reglilla del portaobjetos. Y se hacen los cálculos correspondientes. •

Ejemplos 1: Se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen 1) y se observa que en el otro extremo de las reglillas el 100 de la reglilla ocular coincide con el 97 de los trazos de la reglilla del objeto, es decir 0.97 mm; por lo tanto, una línea del micrómetro ocular es equivalente a 0.009 mm = 9 µm y este valor es el que utilizamos para definir el tamaño de cada estructura que se mide, es obvio que esta calibración es para este microscopio, con ese ocular y objetivos respectivamente. Esta operación se deberá repetir cuando se cambie de microscopio o de objetivos para evitar errores.

•

Ejemplo 2: Se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen 2) y se observa que siete divisiones del ocular micrométrico coinciden con dos divisiones del portaobjetos micrométrico. Puesto que cada división de éste equivale a 10 µm, el

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valor de cada división del ocular se obtiene mediante una simple regla de tres: 7 divisiones del ocular = 20 µm; una división del ocular = 20/7 = 2.8 µm (Ver Fig 4).

Fig 4.- Vista simultánea del ocular y de la reglilla micrométrica, donde coinciden la primera línea de las dos reglillas y la línea 2 de la reglilla portaobjetos con la siete de la ocular b).- Medición de ejemplares y estructuras de micromicetes. 1.- Una vez que se ha cuantificado el valor de cada línea en la reglilla del ocular ( 9 y 2.8 µm en los ejemplos), se puede retirar el portaobjetos micrómetro y en su lugar se puede colocar un portaobjetos normal con el espécimen a medir y se deja colocado el micrómetro ocular, de manera que se puede colocar una célula o estructura celular cualquiera, en este caso, se hace coincidir una raya de la escala con los márgenes de la estructura fúngica elegida, y se cuenta el número de divisiones de la escala comprendidas en la longitud y en el ancho de dicha estructura. •

Ejemplo 3: Si la estructura del hongo se extiende a lo largo de 16 líneas y cada una de ellas vale 9 micras, según se explicó antes, por tanto el tamaño total de esta célula es de 16 x 9, es decir 144 micras.

2.- Si se llega a cambiar el objetivo por otro menor aumento se debe repetir la operación para encontrar nuevos valores en la reglilla, esta medición se puede realizar en un microscopio mono o binocular, pero en este último caso se tiene que mantener inalterada la distancia interpupilar, puesto que el cambio altera la distancia mecánica y el valor del micrómetro depende de ella. BIBLIOGRAFIA Barrera, E. H y R. Cárdenas 1997 El microscopio óptico FES- Iztacala-UNAM P y V editores. Estado de México. 86pp. Barthelemy, E. R. Dawson, R. J., y A. E. Lee. 1984. Técnicas para el Laboratorio de Biología. 2ª. Edición. CECSA editor. México, D. F. México. 148 pp. Mateu, B. 1972. Atlas de Microscopia. 4ª. Edición. Jover Ediciones. Barcelona, España. 96 pp. Muntañola, M. 1999. Guía de los hongos microscópicos. 1ª. Edición. Omega editores. Barcelona, España. 167 pp. ____________. 1996. El Microscopio Óptico. FES Zaragoza UNAM. México, D. F. México.

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AISLAMIENTO DE DNA FUNGICO DE CULTIVOS PUROS CON DNeasy Plant Mini Kit (esta práctica solo se realizara sí los alumnos seleccionan a hongos fitopatógenos en su seminario) OBJETIVO: Obtener DNA de cultivos puros de hongos fitopatógenos. INTRODUCCIÓN: MATERIALES Y METODOS 100 g. tejido vegetal Mortero con pistilo estéril Tubos eppendorf Hielo Nitrógeno líquido Espátula Pipetas de plástico Gradillas eppendorf y de unicel Balanza Baño maría

Centrifuga Vortex Reloj Autoclave Horno Pipetas de 10 ul Pipetas de 100 ul Pipetas de 1000 ul DNeasy Plant Mini Kit

1.- Pesar directamente en un mortero 100 mg de tejido fungico y macerarlo con nitrógeno líquido hasta un polvo fino usando el pistilo, transferir el tejido en polvo a un tubo eppendorf permitiendo que el nitrógeno se evapore impidiendo que las muestras se descongelen. Continúe inmediatamente con el paso 2. 2.- Añadir 400 ul de Buffer AP1 y 4 ul de RNAsa solución stock (100 mg/ml) para unmáximo de 100 mg (peso fresco) o 20 mg (peso seco) de tejido vegetal y agitar vigorosamente en vortex. 3.- Incubar la mezcla por 10 minutos a 65o C. Mezclar dos o tres veces durante la incibación invirtiendo el tubo. 4.- Añadir 130 ul de buffer AP2 a el lisado, mezclar e incubar por 5 minutos en hielo. Opcional centrifugar el lisado por 5 minutos a alta velocidad 5.-.Aplicar o transferir el lisado a el QIA Shredder spin column (tubo lila) sentado en un tubo de 2 ml y centrifugar por 2 minutos a máxima velocidad. 6.- Tranferir el flujo del paso 5 a un nuevo tubo (no abatecido) sin provocar disturbios o perturbar el peller de desechos celulares. 7.- Añadir 1.5 volúmenes de buffer AP3/E a el lisado clarificado y mezcle por pipeteo. 8.- Aplicar 650 ul de la mezcla del paso 7, incluyendo el precipitado que pudo haberse formado a el DNeasy mini spin colum sentado en un tubo colector de 20 ml (abastecido). Centrifugar por 1 minuto a = a 6000 xg corresponde a = 8000 rpm para la mayoría de las centrífugas y desechar el fluido. 9.- Colocar la DNeasy a un nuevo tubo colector de 2 ml (abastecido) añadir 500 ul de buffer AW a el DNeasy colum y centrifugar por un minuto a = 6000 xg ( = 8000 rpm). Desechar el fluido y reusar el tubo colector en el paso 11.

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11.- Añadir 500 ul buffer AW a el DNeasy colum y centrifugar dos minutos a una máxima velocidad para secar la membrana. 12.- Transferir el DNeasy colum a tubos de cetrífuga de 1.5 ml o de 2 ml (no abastecidos) pipetesr 100 ul de buffer AE precalentado (65oC) directamente en la membrana de DNeasy. Incubar por 5 minutos a temperatura de la boratorio y después centrifugar por un minuto a = 6000 xg (= 8000 rpm) para diluir. 13.- Repetir la dilución (paso 12) como esta descrito. RESULTADOS ELECTROFORESIS PARA DE DNA DE HONGOS FITOPATOGENOS Kit (esta práctica solo se realizara sí los alumnos seleccionan a hongos fitopatógenos en su seminario) MATERIAL, EQUIPO Y SUSTANCIAS -

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Recipiente de unicel con hielo Marcador λ 50 ng/µl se usa para DNA de banda grande o 3 µl para un pozo del gel y 6 µl para otro pozo; el marcador se pone en los pozos de los extremos delas muestras. Se colocan directamente del tubo al pozo. O bien, marcador XIV se usa para DNA de banda pequeña, 3 µl para un pozo y 6 µl para otro pozo, el marcador se pone en los pozos de los extremos, una vez que se ponen las muestras en el gel. Se colocan directamente del tubo al pozo. Muestras de DNA de productos DNeasy en este caso, son las siguientes muestras: P16, P25, P26, P27, S27, S28, S26, CAB, TA29 (10 µl por muestra) Tinte para electroforesis 2 µl para cada una de las muestras de DNA Gradilla Gel de agarosa en TAE1X (ver elaboración de gel de agarosa) Rotulador Papel de parafilm rotulado con el nombre de las muestras (diseño de corrimiento) en el orden que se colocan en el pozo del gel. Micropipetas de 10 µl Puntas blancas estériles Pipetas de plástica Centrífuga Equipo de electroforesis Analizador de geles Flúor-S

PROCEDIMIENTO a) Colocar el gel de agarosa dentro de la cámara de electroforesis. b) Cubrir el gel con el amortiguador TAE1X hasta que quede sumergido a 4 mm de profundidad respecto a la superficie del TAE; cuidar de no formar burbujas en la placa de gel, se si formaran, retirarlas con la pipeta de 10 µl

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c) Sacar las muestras de DNA del congelador y descongelarlas a temperatura de laboratorio en una gradilla. d) Centrifugar las muestras de DNA a alta velocidad durante 5-10 segundos y se colocan en un recipiente de unicel con hielo. e) En un trozo de papel parafilm, rotular en el siguiente orden las muestras de DNA y marcadores. M 3 µl 50 ng/µl

P16

P25

Todas

las

P26

P27

muestras llevan

S27 10 µl

S28

S26 M +2 µl 6 µl de de 50 DNA tinte ng/µl

CA8

TA29

f) Colocar en el papel parafilm 2 µl de tinte y en esta gota formada en el papel , se colocan los 10 µl de DNA de la correspondiente muestra. Este mismo procedimiento se lleva a cabo para cada una de las muestras de ADN. (Se forma en el papel una gota de 12 µl de cada muestra) g) Los marcadores se aplican directamente del tubo que los contiene, en un extremo se colocan 3 µl a una concentración de 50 ng/µl y en el otro extremo se colocan 6 µl a la misma concentración, como lo indica el esquema h) En el mismo orden, colocar cuidadosamente las muestras de ADN tenidas (gotas) en los respectivos pozos de gel, evitando derramarlas en los pozos adyacentes. i) Tapar la cámara de electroforesis. Asegurarse de que los electrodos de la tapa tengan el rojo al frente y el azul atrás en la tapa y en la consola de mando el rojo (+) en la parte de arriba y azul (-) en la parte de abajo, encender la fuente deponer a 75 voltios y dejarla que corra durante 40-45 minutos. Resultados Bibliografía Ø Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355 pp SB 732.5 D45 Ø Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37 Ø Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63 Ø Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53 Ø Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis. Marcel Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37

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CUARTA PARTE: NEMATODOS Los nemátodos son organismos fitopatógenos que pertenecen al reino Animal y son probablemente los organismos pluricelulares más abundantes en el mundo, después de los insectos. Su tamaño fluctúa entre unas cuantas micras hasta 0.5-1 mm. Los nemátodos son gusanos cilíndricos con cuerpo alargado y delgado con simetría bilateral. Su cutícula es lisa, no segmentados y carecen de patas u otros apéndices. Presentan todos los sistemas fisiológicos principales de los animales como lo son el sistema excretor, nervioso, reproductor y digestivo. Durante el ciclo de vida de los nemátodos se llegan a presentar cinco estados y cuatro mudas. En algunas especies de nemátodos la primera y segunda etapa larval no puede infectar a las plantas y sus funciones metabólicas son realizadas a expensas de la energía almacenada en el huevecillo. Los nemátodos fitopatógenos presentan géneros ectoparásitos, los cuales pasan toda su vida en el suelo y se alimentan externamente de las raíces de las plantas hospederas, por ejemplo ,Cricononemoides, Hemicycliophora, Cacopaurus,etc. Otros géneros son endoparásitos, produciendo lesiones internas en los tejidos vegetales. Generalmente se ubican en el parénquima cortical, o bien llegan hasta el cilindro central de las raíces hospederas, en donde permanecen o migran hacia otros órganos de las plantas, por ejemplo, Aphelenchoides, Anguina, Ditylenchus, etc. Otros géneros pasan una parte de su vida como endoparásitos y la otra parte la pasan en el suelo que se encuentra alrededor de las raíces que parasitan , a estos se les conoce como nemátodos semiendoparásitos, Algunos ejemplos de estos son Meloidogyne, Heterodera y Tylenchus. ACTIVIDADES. 1. 2. 3. 4.

Extracción de nemátodos . Observación de nemátodos vivos. Observación de preparaciones permanentes y temporales de nemátodos. Esquematización de lo observado, indicando los nombres de las estructuras.

MATERIALES Y METODOS. Plástico de 1 m 2 Probeta 2 cubetas Tamices de 100, 100 y 325 mallas /cm2 Pizeta Vasos de precipitados Preparaciones permanentes

Muestra de suelo Tubos de centrífuga Centrífuga Agitadores Cajas de petri pequeñas Caolín Solución azucarada (55 gr. de azúcar +100 ml de agua)

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EXTRACCION DE NEMATODOS POR EL METODO DE TAMIZADOCENTRIFUGADO 1.

Se coloca la muestra de suelo sobre un plástico, se deshacen los terrones y se retiran las basuras, piedritas, raíces, etc. Se remueve bien la tierra para homogeneizarla.

2.

En una probeta o vaso de precipitados se ponen 200 ml de agua y se agrega suelo hasta que la marca del agua llegue a 400 ml. Esto se hace con el objeto de tener una referencia del tamaño de la población que se encuentra en 200 ml de suelo, sobre todo si se desea hacer un estudio cuantitativo.

3.

Esta mezcla se vacía en una cubeta A con un poco más de agua, se deshacen los grumos y se vacía el sobrenadante en los tamices de 100, 200 y 325 sobrepuestos y se recoge en la cubeta B.

4.

Esta operación se repite 2 veces más.

5.

La arenilla que quedo en el tamiz de 325 se recoge en un vaso de precipitados con una pizeta, procurando que el ángulo que forma el chorro de agua con el tamiz sea lo más agudo posible, nunca recto, ya que de esta forma el agua ayudaría a pasar a los nemátodos a través de la malla del tamiz y los dañaría.

6.

El agua que se recogió en la cubeta B, se vierte a través del tamiz de 325 y se recoge en la cubeta A.

7.

Esta operación se repite dos veces más.

8.

La arenilla que quedó en el tamiz se recoge con una pizeta de la misma forma que se mencionó en el núm. 5 y se pasa al mismo vaso de precipitados.

9.

La arenilla recogida se distribuye en los tubos de centrífuga y se le agrega un poco de caolín a cada tubo. Se agitan bien.

10. Se centrifugan durante 5 min. a 2900 rpm. 11. Se tira el sobrenadante. 12. Al sedimento se le agrega la solución azucarada y se agita bien. 13. Se centrifugan durante 3 min. a 2900 rpm. 14. Se pasa el sobrenadante por el tamiz de 325 y se lava perfectamente bien hasta eliminar por completo la solución azucarada. 15. Se recoge el sedimento con una pizeta y se pasa a una caja de petri pequeña con un poco de agua. 16. Se observa al microscopio.

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Este método de extracción brinda la oportunidad de obtener casi todos los nemátodos del suelo de una forma rápida. El suelo retenido en los tamices se centrifuga para separar a los nemátodos de las partículas orgánicas mediante la flotación de los mismos en una solución de gravedad específica mayor de la que poseen los nemátodos. Se emplea el caolín para sedimentar a los nemátodos y poder eliminar el agua sobrenadante de la muestra. La solución azucarada, como tiene una gravedad específica mayor a la que presentan los nemátodos, hace que estos floten y queden suspendidos en la solución. EXTRACCION DE NEMATODOS POR EL METODO DE EMBUDOS DE BAERMAN Este método se basa en los principios de movilidad de los nemátodos y de mayor densidad de estos que el agua, por lo que este método funciona solamente para nemátodos muy móviles, normalmente los nemátodos parásitos tienen escasa movilidad, siendo los de vida libre los que más se mueven y los que más abundantes resultan en este método de extracción

MATERIALES. Embudos preferentemente de vidrio de 15 cm. de diámetro Una pinza Mohr

CUESTIONARIO. 1. Describa la morfología de la que obtuvo su colonia de bacterias. Indique si es Gram (+) o Gram (-). 2. En qué se diferencian bioquímicamente las bacterias Gram (+) y las Gram( -)? 3 . Cómo están organizadas las células de los hongos? 4. Señale 3 ejemplos de hongos fitopatógenos de cada clase de hongos, mencionando la

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enfermedad que provocan. 5. En qué se diferencian los nemátodos de vida libre de los fitopatógenos? Señale por lo menos 3 características. 6. Qué importancia tienen las técnicas de tinción de microorganismos? BIBLIORAFIA. 1.- Agrios, G. N. 2005.Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press. Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, san Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp. * 1. Barne H, H. L. end Hunter B. B. 1987. Illustrated genera of imperfect fungi. Fourth edition. MacMillan Publishing Company. 218 pp. QK 625 D1 B3 2. Bridge, P. D. 1998. Applications of PCR in mycology. CAB, International. C.B. QK603 A66 3. Cummins, G. B. and Hiratsuka, Y. 2003. Illustrated genera of rust fungi. Third Edition. APS Press 225 pp. OK 627. A1 4. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355 pp SB 732.5 D45 5. French, E.R.; Herbert, T.T. 1980 Métodos de investigación fitopatológico, I.I.C.A. San José, Costa Rica. 6. Hanlin, R. T. 1997. Illustrated genera of ascomycetes. Volume 1. APS Press. 263 pp. QK 623.A1 H35 7. León Gallegos, H. M. y Cummins, G. B. 1981. Uredinales (royas) de México. SARH. Vol 1. 440 pp. y Vol 2 492 pp. C3 8. Kálman Vánky. 2002. Illustrated genera of smut fungi. APS Press. Second edition. 238 pp. QK 628 A1 V35. 9. Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscópicos saprobios y parásitos: Métodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp. QK 603 M55. 10. Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventory and monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777pp. C.B. QK600.3 M84 11. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37 12. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63 13. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53

PRACTICA 4 SINTOMATOLOGIA INTRODUCCION. La Sintomatología es la rama de la Fitopatología que estudia la los síntomas y los signos que producen los patógenos en las plantas que atacan. El conocimiento de la sintomatología es indispensable para el diagnóstico de las enfermedades.

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se dice que un SINTOMA es la manifestación visible de una condición patológica en una planta sensible, y un SIGNO es la estructura o evidencia del patógeno mismo, producida dentro o fuera de los tejidos del hospedero. Debido a la gran cantidad de síntomas que existen, se han agrupado bajo diversas condiciones, dependiendo de diversos factores tales como el lugar de aparición, del efecto del medio ambiente, del número de patógenos involucrados, etc. Así, tenemos que los síntomas que ocurren en los órganos directamente atacados por los patógenos se llaman Síntomas primarios, en cambio, a los que aparecen en otro órgano de la planta, no atacado directamente por el patógeno, sino como una secuela de este, se llaman síntomas secundarios. En algunas ocasiones los hospederos son atacados simultáneamente por más de un patógeno, provocando síntomas complejos. Otras veces los síntomas no se expresan totalmente, debido a condiciones ambientales favorables al patógeno, denominado a estos síntomas enmascarados. Típicamente cada enfermedad produce varios síntomas característicos, que generalmente aparecen en series subsecuentes durante el curso de la enfermedad. A dicha serie se le denomina síndrome. Desde el punto de vista morfofisiológico, los síntomas se agrupan en necrosis, hipoplasias e hiperplasias. OBJETIVOS. Identificar los diferentes síntomas y signos que ocurren en enfermedades vegetales, mediante la observación de material fresco y de herbario. ACTIVIDADES. Identificación de síntomas y signos en ejemplares vegetales enfermos utilizando las claves incluidas en la metodología. MATERIALES Y METODOS Ejemplares fitopatológicos de herbario Ejemplares fitopatológicos frescos Lupas Microscopios compuestos Microscopio estereoscópico Agujas de disección Navaja Los ejemplares a identificar se observan cuidadosamente, utilizando la lupa y el microscopio cuando sea necesario, y se siguen las claves indicadas a continuación.

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1. NECROSIS. Caracterizadas por la degeneración y muerte celular Si se presentan antes de que ocurra la muerte celular..........1.1. PLESIONECROSIS Si se manifiestan hasta que las células y los tejidos mueren..1.2. HOLONECROSIS 1.1. PLESIONECROSIS El tejido foliar toma coloraciones amarillentas debido a la destrucción de la clorofila.............................................………………………....1.1.1. AMARILLEO Presencia de tejidos débiles, flácidos, debido a la pérdida de la turgencia celular provocada por la carencia de agua, casi siempre por el taponamiento de los vasos conductores a causa de los patógenos...........................….…..1.1.2. MARCHITEZ Manchas traslúcidas, acuosas, como pequeñas gotas de agua contenidas dentro de los espacios intercelulares. Estas acumulaciones de líquidos provienen de células que han sufrido daños en sus membranas celulares.......................1.1.3. HIDROSIS 1.2. HOLONECROSIS Si se presentan en tejidos de almacenamiento.............……………………......1.2.1. Si se presentan tejidos verdes................................…………………….............1.2.2. Si se presentan tejidos leñosos..........................................……………………..1.2.3. 1.2.1.Tejidos de almacenamiento Los tejidos sufren rápidamente una pudrición...........…..1.2.1.1. PODREDUMBRE 1.2.1.1. PODREDUMBRE Si es antecedida por hidrosis con un reblandecimiento de los tejidos………………. 1.2.1.1.1. PUDRICIÓN BLANDA. El agua es eliminada rápidamente de los tejidos, por lo que el órgano atacado se seca, quedando con un aspecto arrugado, seco duro....1.2.1.1.2. MOMIFICACIÓN 1.2.2. Tejidos verdes. Marchitez y caída de las plantitas de almácigo, como consecuencia de la necrosis del cuello del tallo....……………………………………….. 1.2.2.1 AHOGAMIENTO ó "DAMPING-OFF" Necrosis localizada alrededor del borde de la hoja………1.2.2.2. CHAMUSCADO Necrosis extendida en toda la lamina foliar de forma irregular…….1.2.2.3. TIZON Zonas de tejido necrótico, bien definidas, diversos colores y tamaños, en ocasiones rodeadas por un borde púrpura o de algún otro color................1.2.2.4. MANCHAS Manchas necrótica que posteriormente se rasga y cae, dejando pequeños agujeros...................................................….............1.2.2.5.TIRO DE MUNICION

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Mancha necrótica sobre la cual hay crecimiento micelial obscuro…………... 1.2.2.6. RONCHA ó ERUPCION Manchas necróticas muy pequeñas extendidas en todo el órgano............................ 1.2.2.7. ABIGARRADO Zonas alargadas en necrosis, a lo largo de venas y tallos…..……1.2.2.8. RAYADO Zonas necróticas alargadas, en las regiones intervenales de la lámina .................. .1.2.2.9.BANDEADO Repentina desecación debilitación y muerte de toda la hoja debido a la acción indirecta de la actividad del patógeno................................ 1.2.2.10.QUEMADURA Necrosis epidérmica que da como resultado un blanqueado de la epidermis y de los tejidos adyacentes en el fruto y hojas.............................1.2.2.11. ESCALDADURA Muerte repentina de brotes o yemas foliares………..1.2.2.12. AGOSTAMIENTO Necrosis extensiva que provoca la caída de los frutos……………………………… .1.2.2.13. DESGRANAMIENTO 1.2.3. Tejidos leñosos Necrosis restringida a los tejidos corticales del tallo o raíz, generalmente rodeado de un callo de tejido sano............................................1.2.3.1.CANCER(CANCRO) Necrosis extensiva que se origina en el apéndice de brotes corre hacia su base, generalmente después de la hibernación...............1.2.3.2.MUERTE REGRESIVA Exudado de tejidos leñosos, de consistencia acuosa, generalmente coloreados vivamente..................................................……................1.2.3.3. SANGRADURA Exudados de consistencia viscosa (gomosa),generalmente en frutos ………………. ..1.2.3.4. GOMOSIS 2. HIPOPLASIAS. Síntomas caracterizados por la debilidad de órganos o plantas para desarrollarse completamente. Debilidad para alcanzar un tamaño normal.....................……........2.1. ENANISMO Crecimiento escaso de los entrenudos. Lo que ocasiona que las hojas estén muy juntas.........................................................................................2.2. ARROSETADO Supresión completa de color en hojas o frutos. ………………….2.3.BLANQUEO Las plantas adquieren una coloración amarillenta, debido a la no formación de clorofila............................................................………....................2.4. CLOROSIS Moteado de colores verdes y amarillos o bien de tonos verdes.........2.5. MOSAICO

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Debilidad completa de la planta para desarrollar algún órgano….2.6. SUPRESION (EXTINCION) Tono amarillento blanquecino, en ocasiones acompañado por enanismo; los tallos con crecimiento excesivo, que se tornan quebradizos (aparece en plantas mantenidas en la obscuridad)............................………………..2.7. ETIOLACION 3. HIPERPLASIAS. Síntomas que resultan de un desarrollo excesivo en tamaño y color, de algún órgano de la planta o de la planta completa, o bien por un desarrollo precoz de los órganos. Síntomas con desarrollo excesivo........................………….....3.1. GIGANTISMO Síntomas con acumulación excesiva de pigmentos………… 3.2. HIPERCROMIA Los órganos se desarrollan fuera de lugar o con otras formas…3.3. METAPLASIA 3.1. GIGANTISMO. Se da un torcimiento de los brotes o enrollamiento de las hojas por crecimiento excesivo de una parte del órgano………. 3.1.1.. RIZAMIENTO (VERRUCOSIS) Sobrecrecimiento de tejido epidérmico, en forma de pequeñas lesiones, ásperas, elevadas, formadas por células con paredes suberizadas……………………………. 3.1.2. COSTRA (ESCARA) Marchitez causada por hinchamientos de las células epidérmicas y subepidérmicas, provocada por la acumulación excesiva de agua..….......3.1.3. INTUMESCENCIA Hinchazón provocada por la acumulación excesiva de material nutritivo, generalmente encima de un área constreñida........…………..…..3.1.4. SARCOSIS Hinchazón localizada, que envuelve a órganos completos…………………………... .3.1.5.TUMEFACCION (tumores, nódulos ó agallas) Desarrollo de órganos adventicios alrededor de un punto local.…………………….. 3.1.6. FASCICULACION "ESCOBA DE BRUJA" Crecimiento laminar de tallos u otros órganos cilíndricos, provocando que estos tomen forma aplanada, extendida……………………………..3.1.7. FASCIACION Desarrollo continuado después de que se alcanza el desarrollo normal...…………... .3.1.8. PROLIFERACION Crecimiento de tejido sano, como respuesta a una lesión, generalmente rodeando cánceres; proviene de la difusión del patógeno dentro de las áreas adyacentes al tejido sano.....……………………………………………...................3.1.9. CALLO 3.2. HIPERCROMIA

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Coloración verdosa, en tejidos normalmente carentes de clorofila, debido a la producción y acumulación de ésta en los órganos…………..3.2.1. VIRESCENCIA Coloración púrpura resultante del desarrollo excesivo de antocianinas……………... 3.2.3. ANTOCIANESCENCIA Coloración cobriza, resultado de diversos procesos, algunas veces por deficiencia de potasio.........................................................................….... 3.2.3. BRONCEADO 3.3. METAPLASIA Desarrollo de órganos en posiciones anormales................3.3.1. HETEROTOPIAS Desarrollo de Pétalos u otros órganos florales en forma de hojas.........................…... 3.3.2.FILODIOS Desarrollo de hojas juveniles en plantas maduras………...3.3.3. JUVENILODIOS 4. SIGNOS Se observa el crecimiento vegetativo del hongo, como un micelio de color blanquecino o grisáceo, en pequeños manchones o de forma continua. En algunas ocasiones se observan conidios y cleistotecios. Todos son producidos por Erysiphales..............................……………………………………….4.1. OIDIO O CENICILLA POLVOSA Se observa el crecimiento del hongo, con micelios, esporangios, etc., con apariencia de fieltro suave, localizado en el envés de las hojas; casi siempre se observa en el haz una mancha en correspondencia. Son producidos por Peronosporales………….. 4.2. MILDIU O CENICILLA VELLOSA Se caracteriza por la presencia de pequeñas pústulas o ampollas subepidérmicas, de color blanco, constituidas por fructificaciones de Albugináceas....…………………. 4.3. ROYA BLANCA O MAL DE LA CAL Presencia de pústulas que contienen una gran cantidad de esporas de uredinales; son circulares en dicotiledóneas y alargadas en monocotiledóneas. Su color varía del amarillo al café oscuros, pudiendo ser anaranjadas...................................4.4. ROYA Se presenta una masa de color negro, compuesta por teliosporas de Ustilaginales, la cual puede estar cubierta por una membrana, o bien, puede estar desnuda…………. 4.5. CARBON O HUITLACOCHE. Estructura de hongos -micelio y conidios- de color oscuro, producidos por Meliolaceas o Capnodiaceas. Llegan a formar sobre la epidermis de las hojas, frutos o ramas, verdaderas costras………………………………………4.6. FUMAGINA U OLLIN

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Se presentan casi siempre sobre manchas foliares o de frutos, y son las fructificaciones como acérvulos, picnidios, apotecios, etc…………………………... 4.7. PUNTUACIONES NEGRAS Es la apariencia de polvo sobre manchas de diversos órganos, corresponden casi siempre a fructificaciones de Moniliales……………….4.8 EFLORESCENCIAS GRISACEAS. Son exudados bacterianos, de tipo cremosos, de color blanquecino, amarillento u otros………………………………………………………………4.9. ZOOGLEAS.

BIBLIOGRAFIA. 1. Agrios, G. N. 2005.Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press. Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, san Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp. * 1. Blancard, Dominique. 1990. Enfermedades del Tomate: Observar, Identificar, Luchar. Mundi-Prensa. España.* 2. Blancard, Dominique. 1991. Enfermedades de Cucurbitaceas: Observar, Identificar, Luchar. Mundi-Prensa. España.* 3. Brunt, Alan; Crabtree K., Gibbs A. 1990. Viruses of Tropical plants. Descriptions and List from the VIDE Database. CAB International Australian Center for International Agricultural Research (ACIAR). U.K. Redwood Press Ltd. London. 707 pp. * 4. Shew H.D. and G.B. Lucas 1991. Compendium of tobacco diseases. St. Paul Minnesota American Phitopatologhical Society. U.S.A. 5. Hull, R. 2002. Matthews´ Plant Virology. Fourth Ed. Academic Press. San Diego, San Francisco, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo. 1001 pp. * 6. Kurstak, R.E.F. 1991. Plant virus infections. Elselvier/North-Holland. Biomedical Press. 7. Matthews, R.E.F. 1991. Plant Virology. Academic Press. New York. London, Toronto, Sydney, S. Francisco. 897 pp. 8. Matthews, R.E.F. 1992. Diagnosis of Plant Virus Diseases, Ed. C.R.C. Press. USA. 374 pp. 9. Schwartz, H:F.; E. Galves (eds). 1980. Bean production problems: diseases, insect, soil climatic contraints of Phaseolus vulgaris, Centro Internacional de Agricultura Tropical Cali Colombia. 424 p. 10. Zitter Th. A., D.L. Hopkins, C.E. Thomas. 1996. Compendium of cucurbit diseases. APS Press. St Paul, Minn. U.S.A. 1. Lapierre H, P-A Signoret. 2004. virases diseases of Poaceae (Gramineae). INRA. Paris France. 857 pp.* 2. Sutic, Dragoldjub D. R.E. Ford, M.T. Tosic. 1999Hand boock of Plant virus diseases. CRC Press LLC. Boca Raton, Florida. 553 pp* * En Biblioteca de la FES Cuautitlán C-4

PRACTICA 5

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GENERALIDADES SOBRE EL CONTROL QUIMICO DE ENFERMEDADES INTRODUCCIÓN. La producción agrícola mundial sufre anualmente grandes perdidas debido a enfermedades causadas por agentes de diversa índole, entre los que se encuentran los virus, las bacterias, los hongos y los nemátodos. La necesidad de prevenir o controlar el desarrollo de las enfermedades ha motivado la creación de nuevos químicos capaces de obtener la deseada toxicidad selectiva hacia los patogenos problema. Hoy día se tiene la capacidad de controlar algunos patogenos con un amplio espectro de compuestos químicos. La principal excepción la constituyen los virus, que hasta ahora han desafiado todos los intentos de control directo mediante compuestos químicos. Los compuestos químicos utilizados para prevenir o controlar el desarrollo de las enfermedades se clasifican por: 1. Su origen químico. a. Orgánicos b. Inorgánicos 2. Modo de acción. a. De contacto o residuales. La acción se restringe al sitio de aplicación. b. Sistémicos. Son transportados en la savia de la planta, pudiendo ser acropétalos si se mueven de las raíces al follaje, o bien, basipétalos si se mueven de las raíces al follaje, o bien, basipétalos si el movimiento es a la inversa. 3. Modo de aplicación. a. Protectivos/ Profilácticos. Se requieren varias aplicaciones para proteger los nuevos brotes y para reforzar la capa de crecimiento antes de la infección. b. Curativos. El tratamiento se realiza. durante el período de incubación. c. Erradicativos. El tratamiento se realiza después del periodo de incubación 4. Sitio de aplicación. a. Foliar. Se aplica al follaje. b. Tratamiento al suelo. Se aplica al suelo contra fitopatógenos transmitidos por esta vía y para algunos sistémicos de transmisión aérea. c. tratamiento a la semilla. Se aplica a la semilla contra fitopatógenos transmitidos por el suelo y contra los transmitido por la misma semilla. d. Tratamiento postcosecha. Se aplica para proteger a los productos cosechados. OBJETIVOS.

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Conocer algunos productos fitosanitarios - pesticidas- utilizados para el control de enfermedades, sus características mas importantes, así como su manejo y modo de acción. MATERIALES Y METODOS. Etiquetas de productos químicos comercialmente utilizados para el control o prevención de enfermedades. Los alumnos serán los encargados de conseguir las etiquetas en las casas comerciales o directamente con los fabricantes de dichos productos, con la finalidad de obtener la siguiente información: a. Nombre (s) comercial (es) b. Nombre químico c. Tipo o modo de acción d. Origen e. Toxicidad f. Formulación g. Fitotoxicidad

h. Usos i. Enfermedades importantes que controla o previene j. Dosis k. Aplicación l. Precauciones m. Información adicional.

CUESTIONARIO. 1. Defina que es un fungicida, un nematicida y un bactericida. 2. Defina. a. Fungicida protectivo, residual o de contacto. b. Fungicida curativo o sistémico. 1. Mencione los principales factores que afectan la efectividad de campo de un producto químico al momento de su aplicación. Explique cada uno de ellos. 2. Durante una entrevista a un productor, este menciona que nunca utiliza la dosis indicada en la etiqueta del producto, puesto que el fabricante solo quiere ganar mas dinero haciendo que el productor aplique una dosis superior a la realmente necesaria. Cómo respondería usted a este comentario?.

BIBLIOGRAFIA 1. Agrawal, A. A., Tuzun, S. and Bent, E. 2000. Induce plant defensor against pathogens and herbivores. APS Press. 390 pp SB 750 I54 2. Deacon J. W., Microbial control of plant and diseases, 1983, Washington, berkshire,: Van Nostrand Reinhold, 88 pp. 3. Deng, J. L., and Jones, J. D. G. 2001. Plant. Pathogens and integrated defense responses to infection. Nature 411, 826- 833.

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