EVALUATION OF (CA)n DINUCLEOTIDE MARKERS IN PATERNITY ANALYSIS Anitha A., Moinak BANERJEE Rajiv Gandhi Centre for Biotechnology, Jagathy, Kerala, India ABSTRACT: Developing robust molecular markers for forensic DNA fingerprinting is an important issue, as stringent criteria for their selection and use have to be met. In our study, the effectiveness of several (CA)n dinucleotide molecular markers was evaluated in several random individuals from various ethnic backgrounds of Kerala, for paternity analysis. We used the most advanced technique of PCR genotyping, using microsatellite markers. Allele patterns were detected by electrophoresis of the PCR products on a 6% denaturing polyacrylamide gel, followed by autoradiography. The heterozygosity values of D9S1847, D9S1813, D10S558 and D22S446 microsatellite markers in the representative populations were in the range of 0.84 to 0.89. These loci were found to be highly effective for paternity analysis and have great potential to be developed into markers for probability searches of forensic samples. KEY WORDS: Paternity; Microsatellites; Alleles; Heterozygosity.

Z Zagadnieñ Nauk S¹dowych, z. XLIX, 2002, 74–83 Received 16 March 2001; accepted 18 December 2001

INTRODUCTION

The application of DNA fingerprinting in the forensic field is becoming a challenging enterprise due to the shift from the conventional Southern-based technique to the more advanced PCR genotyping. Identifying suitable markers for forensic DNA fingerprinting is an important issue, as stringent criteria for their selection and use have to be met. DNA markers used in paternity analysis should exhibit high heterozygosity and should allow easy and fast scoring. DNA fingerprinting involving the use of single locus or multilocus minisatellite probes is the most conventional method. Though minisatellites are highly polymorphic, this method is labour intensive and expensive, and the markers are difficult to score. Microsatellite loci represent a class of hypervariable polymorphic loci where allelic variations are caused by tandem repeats of nucleotide sequences varying between 1 and 5 basepairs in length [11]. They have now become a robust tool for DNA fingerprinting, owing to their desirable properties like high polymorphism, frequent and even

Evaluation of (CA)n dinucleotide markers ...

75

distribution in the genome, easy access, easy and fast assay procedures, multiplexing and high reproducibility. Thousands of polymorphic microsatellite loci are now mapped in the human genome. The large number of alleles, and the resulting heterozygosities at microsatellite loci, make them particularly useful for gene mapping [8], determination of relationships between individuals [2, 6], forensic identification of individuals [3, 5] and evolutionary studies [1, 2]. There is a need to identify population specific loci for paternity analysis, as all microsatellite loci may not be informative for a particular population group. Therefore, in the present study, we investigated the usefulness of four dinucleotide repeats in several random individuals and family samples from various ethnic backgrounds of Kerala.

MATERIALS AND METHODS

Blood samples were collected from 210 random individuals and twenty families belonging to various ethnic communities of Kerala. 10 ml of peripheral blood was collected with the informed consent of the individuals, in EDTA tubes. DNA was extracted by the standard phenol/chloroform method [9]. PCR amplification of the microsatellite loci The sequence tagged sites (STS) for the microsatellite markers were selected from the Genethon maps [4]. Only those microsatellite markers were selected which showed more than 80% heterozygosity in CEPH families. Table I shows the characteristics of the loci and primers used in this study. The PCR mixture contained 50 ng template DNA, 10–30 pmol of primers, 1 ´ Taq buffer containing 1.5 mM MgCl2, 0.25 mM dNTPs and 0.75 U Taq DNA polymerase in a reaction volume of 25 ml. The CA strand of each primer was end labeled at its 5’ end with gP32ATP in the presence of T4 polynucleotide kinase. The amplification conditions were set with an initial denaturation at 95°C for 5min; cycle denaturation, annealing and extension temperatures were as follows: 94°C for 1 min, 54°C (D9S1847) / 55°C (D10S558, D22S446) / 60°C (D9S1813) for 1min and 72°C for 2 min, for 35 cycles. Final extension was set at 72°C for 20 min. All amplifications were performed with an oil overlay in a DNA Thermal Cycler 480 PCR System (Perkin Elmer). Allele genotyping of microsatellite loci The PCR products were separated through a 0.4 mm thick 6% denaturing polyacrylamide gel containing 7 M urea. pUC18 / Hae III digest was used as the standard molecular weight marker. Electrophoresis was performed at

76

A. A., M. Banerjee

50 W in 0.5 ´ TBE buffer (pH = 8.0) for 2 h. Amplification products were visualised by autoradiography. Bands were scored and analysed by Biorad’s Quantity One software. The effectiveness of four unlinked (CA)n dinucleotide markers was tested in a series of family samples and random individuals, for heterozygosity analysis, and for their usefulness in paternity analysis. Allelic frequencies and heterozygosity were calculated using Arlequin 2.0. Polymorphic information content (PIC) for each locus, and an average for all loci were calculated. Deviations from the Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) were assessed using an c2 goodness of fit, which compares observed genotype frequencies with expected genotype frequencies. Expected heterozygosity was calculated from allele frequencies assuming HWE. Yates correction for continuity was applied when there was only one degree of freedom (Cervus 2.0). TABLE I. MICROSATELLITE MARKERS WITH THEIR PRIMER SEQUENCES, ALLELE SIZE RANGE, AND ALLELE FREQUENCY RANGE

Locus

D9S1847 D9S1813 D10S558 D22S446

Primer sequences

5’ TACAGCGCCAGATTTGG 3’ 5’ GGCAGGAGCCGTGTGT 3’ 5’ GGGCCTGGCACTTAATAC 3’ 5’ AATGGCCTAAATAAAACCTGG 3’ 5’ ATGAACATCACCAAGGCATATAG 3’ 5’ ATAGTAGGCCGCCAGTCTC 3’ 5’ CCGGAACTTTGGAAGG 3’ 5’ CCACTTGGGTAACCACTG 3’

Allele size range [bp]

Allele frequency range

163–203 0.019–0.234 226–276 0.012–0.183 188–218 0.039–0.227 198–238 0.036–0.167

RESULTS

In the present study we used four unlinked microsatellite loci from chromosomes 9, 10 and 22. These markers were tested for polymorphism in several family samples, and in random individuals from different ethnic backgrounds of Kerala (Figure 1). A high level of polymorphism was observed in the microsatellite markers D9S1847, D9S1813, D10S558 and D22S446. Table I shows the allele size range and the range of allele frequencies for these loci. A maximum number of 13 alleles were observed in locus D9S1813. The

77

Evaluation of (CA)n dinucleotide markers ...

influence of stutter bands on the main allelic bands was minimised by measuring the relative peak heights using Biorad’s Quantity One software. Individual allelic frequencies for each locus are shown in Figure 2. Higher observed heterozygosity (O) was seen in the loci with higher heterozygotes i.e. D9S1813 and D10S558, but D10S558 had the least number of alleles. Therefore, the unbiased estimate of expected heterozygosity values was observed to be the lowest in D10S558. The expected heterozygosity Fig. 1. Representing different loci and their in- varied between 0.84 and 0.89 heritance pattern in a family: lane A – father; across all the loci (Table II). lane B – mother; lane C – child. Average PIC across all the loci was found to be very high i.e. 0.86. No significant deviation from HWE was observed in D9S1813 and D10S558 loci. The combined power of all the four loci to exclude a randomly selected unrelated candidate parent from the parentage of an arbitrary offspring was calculated to be 0.97. The results obtained in our study were highly reproducible. All the loci, D9S1847, D9S1813, D10S558 and D22S446, were found to be very effective for paternity analysis, in all the family samples studied. TABLE II. SUMMARY TABLE OF THE ANALYSED DATA

Locus

N

k

Het

Hom

H (O)

H (E)

PIC

HWE

D9S1813

164

13

135

29

0.82

0.89

0.88

NS

D9S1847

158

11

110

48

0.70

0.86

0.85

**

D10S558

165

8

126

39

0.76

0.84

0.82

NS

D22S446

161

12

98

63

0.61

0.89

0.87

**

N – number of individuals; k – number of alleles, Het – heterozygotes, Hom – homozygotes, O – heterozygosity observed, E – heterozygosity expected, HWE – polymorphic information content (PIC) and test of Hardy-Weinberg equilibrium, NS – no significant deviation from HWE, ** – significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium at 95% confidence level.

78

A. A., M. Banerjee

Fig 2. Allele frequency of all observed alleles for four analysed loci.

DISCUSSION

When dealing with genetic variation studies in a highly diverse population, the range of heterozygosity has been found to vary considerably. Consequently, a DNA marker that exhibits a high heterozygosity value in a normal population may show high homozygosity in an inbred population. Hence, before using a particular marker for forensic DNA fingerprinting, a genetic database of the representative population has to be made, which will provide insight into the range of heterozygosity exhibited by the marker in that population. Our study proves beyond doubt the effectiveness of D9S1847, D9S1813, D10S558 and D22S446 dinucleotide markers in paternity analysis of different communities of Kerala with various ethnic backgrounds. PIC gave a measure of informativeness related to expected heterozygosity and HWE. The combined power of exclusion probability of the markers used in the present study was found to be very high, which proves the effectiveness of these markers in paternity analysis. Markers that show significant deviations from HWE were found to have higher null allele frequency. Markers such as D9S1847 and D9S1813 can be multiplexed for PCR amplification, which makes the procedure less tedious and more economical. These markers have a very good potential to be used in the future, for probability searches of forensic samples in populations in this part of the globe.

Evaluation of (CA)n dinucleotide markers ...

79

Acknowledgement: The authors are grateful to CSIR for providing a Senior Research Fellowship for the research work. References:

1. B o w c o c k A . M . , R u i z - L i n a r e s A . , T o m f o h r d e J . [et al.], High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites, Nature 1994, vol. 368, pp. 455–457. 2. C h a k r a b o r t y R . , J i n L ., A unified approach to studying hypervariable polymorphisms: Statistical considerations of determining relatedness and population distances, [in:] DNA fingerprinting: State of the science, Pena S. D. J., Chakraborty R., Epplen J. T. [et al.], [eds.], Birkhauser, Basel 1993. 3. C h a k r a b o r t y R . , K i d d K ., The utility of DNA typing in forensic work, Science 1991, vol. 254, pp. 1735–1739. 4. D i b C . , F a u r e S . , F i z a m e s C . [et al.], A comprehensive genetic map of the human genome based on 5264 microsatellites, Nature 1996, vol. 380. 5. E d w a r d s A . , H a m m o n d H . A . , J i n L . [et al.], Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups, Genomics 1992, vol. 12, pp. 241–253. 6. J e f f r e y s A . J . , T u r n e r M . , D e b e n h a m P ., The efficiency of multilocus DNA fingerprint probes for individualization and establishment of family relationships, determined from extensive casework, American Journal of Human Genetics 1991, vol. 48, pp. 824–840. 7. M a r s h a l l T . C . , S l a t e J . , K r u u k L . E . B . [et al.], Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations, Molecular Ecology 1998, vol. 7, pp. 639–655. 8. M a t i x T . C . , P e r l i n M . , C h a k r a v a r t i , A ., Automated construction of genetic linkage maps using an expert system (Multi Map): A human genome linkage map, Nature Genetics 1994, vol. 6, pp. 384–390. 9. S a m b r o o k J . , F r i t s c h E . F . , M a n i a t i s T ., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989. 10. S c h n e i d e r S . , R o e s s l i D . , E x c o f f i e r L ., Arlequin: A software for population genetics data analysis, ver. 2.000. 11. T a u t z D ., Notes on the definition and nomenclature of tandemly repeating DNA sequences, , [in:] DNA fingerprinting: State of the science, Pena S. D. J., Chakraborty R., Epplen J. T. [et al.], [eds.], Birkhauser, Basel 1993.

OCENA PRZYDATNOŒCI ANALIZY MARKERÓW DINUKLEOTYDOWYCH TYPU (CA)n W SPRAWACH DOTYCZ¥CYCH SPORNEGO OJCOSTWA

Anitha A., Moinak BANERJEE

WSTÊP

Zastosowanie genotypowania DNA (ang. DNA fingerprinting) w genetyce s¹dowej staje siê wielkim wyzwaniem w zwi¹zku z przejœciem od konwencjonalnej metody typu „southern” do bardziej zaawansowanej, a polegaj¹cej na analizie wykorzystuj¹cej technikê PCR. Identyfikacja markerów znajduj¹cych zastosowanie w analizie DNA stanowi istotny problem, co wi¹¿e siê z faktem, ¿e ich wybór i u¿ycie dla potrzeb genetyki s¹dowej musi podlegaæ okreœlonym zasadom. Markery DNA wykorzystywane w analizie spornego ojcostwa powinny wykazywaæ wysok¹ heterozygotycznoœæ, nie bez znaczenia jest te¿ ³atwe i szybkie uzyskiwanie wyników w oparciu o ich analizê. Najbardziej konwencjonalne podejœcie polega na badaniu DNA w oparciu o analizê markerów minisatelitarnych i sondy komplementarne do pojedynczego lokus (tzw. single locus probes) lub wielu loci (tzw. multilocus probes). Chocia¿ markery minisatelitarne s¹ wysoce polimorficzne, to istotn¹ niedogodnoœæ ich analizy stanowi fakt, i¿ analiza ta jest pracoch³onna, droga i nale¿y liczyæ siê z trudnoœciami w uzyskiwaniu wyników. Loci mikrosatelitarne stanowi¹ klasê wysoce zmiennych loci polimorficznych, w przypadku których zmiennoœæ jest spowodowana przez tandemowe powtórzenia sekwencji nukleotydowych o d³ugoœci od 1 do 5 par zasad [11]. Ostatnio sta³y siê one bardzo dobrym narzêdziem wykorzystywanym w genotypowaniu DNA dziêki ich cennym w³asnoœciom, jak: wysoki polimorfizm, czêsty i równy rozk³ad w genomie, ³atwy dostêp, ³atwe i szybkie procedury ich analizy, mo¿liwoœæ jednoczesnej analizy wielu loci w reakcjach PCR kompleksowego (ang. multiplex PCR) oraz wysoka powtarzalnoœæ analiz. Tysi¹ce polimorficznych loci mikrosatelitarnych s¹ obecnie mapowane w genomie cz³owieka. Du¿a liczba alleli, a w rezultacie wysoka heterozygotycznoœæ loci mikrosatelitarnych sprawiaj¹, i¿ s¹ one szczególnie u¿yteczne w badaniach nad mapowaniem genetycznym [8], w oznaczaniu pokrewieñstwa miêdzy osobami [2, 6], w identyfikacji osobniczej dla celów s¹dowych [3, 5] oraz w badaniach nad ewolucj¹ [1, 2]. Istnieje potrzeba zidentyfikowania specyficznych dla poszczególnych populacji loci u¿ytecznych dla celów analizy spornego ojcostwa, poniewa¿ nie wszystkie loci mikrosatelitarne musz¹ byæ jednakowo informatywne. W niniejszej pracy autorzy poddali ocenie u¿ytecznoœæ czterech loci o dinukleotydowej jednostce repetytywnej, analizuj¹c próbki pobrane od przypadkowo wybranych osób, jak i od przedstawicieli rodzin z ró¿nych etnicznie grup populacyjnych regionu Kerala.

Ocena przydatnoœci analizy markerów ...

81

MATERIA£Y I METODY

Próbki krwi pobrano od 210 przypadkowych osób oraz od osób z dwudziestu rodzin nale¿¹cych do etnicznie ró¿nych spo³ecznoœci regionu Kerala. 10 ml krwi obwodowej pobierano za zgod¹ badanych do probówek z EDTA. DNA poddano izolacji, stosuj¹c standardow¹ metodê ekstrakcji mieszanin¹ fenol/chloroform [9]. Amplifikacja metod¹ PCR loci mikrosatelitarnych Sekwencje dla odpowiednich markerów mikrosatelitarnych wybranych do analizy uzyskano z map genetycznych Genathon [4]. Wybrano tylko te markery mikrosatelitarne, które wykazywa³y ponad 80% heterozygotycznoœci w rodzinach CEPH. Tabela I prezentuje charakterystykê loci i starterów PCR wykorzystanych w niniejszych badaniach. Mieszanina reakcyjna PCR zawiera³a 50 ng matrycowego DNA, 10–30 pmol starterów, 1 ´ stê¿ony bufor Taq zawieraj¹cy 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM mieszaniny dNTP i 0,75 jednostek Taq DNA polimerazy w ca³kowitej objêtoœci reakcji 25 ml. Niæ CA ka¿dego ze starterów by³a znakowana przy pomocy gP32 ATP w obecnoœci kinazy polinukleotydowej T4. Warunki amplifikacji ustalono z wstêpn¹ denaturacj¹ w 95°C przez 5 min. Temperatury cyklicznej denaturacji, hybrydyzacji starterów i wyd³u¿ania wynosi³y odpowiednio: 94°C przez 1 min, 54°C (D9S1847) / 55°C (D10S558, D22S446) / 60°C (D9S1813) przez 1 min i 72°C przez 2 min przy zastosowaniu 35 cykli PCR. Wyd³u¿anie koñcowe prowadzono w 72°C przez 20 min. Wszystkich amplifikacji dokonano z zastosowaniem aparatu Thermal Cycler 480 PCR System (Perkin Elmer), pokrywaj¹c mieszaninê reakcyjn¹ olejem. Genotypowanie alleli loci mikrosatelitarnych Produkty reakcji PCR poddawano rozdzia³owi elektroforetycznemu w 6% poliakrylamidowych ¿elach denaturuj¹cych o gruboœci 0,4 mm, zawieraj¹cych 7 M mocznik. Jako marker d³ugoœci fragmentów wykorzystywano pUC18 trawiony enzymem Hae III. Elektroforezê prowadzono przy ustalonej mocy 50 W w 0,5 ´ stê¿onym buforze TBE (pH = 8,0) przez 2 godziny. Produkty amplifikacji by³y nastêpnie uwidaczniane metod¹ autoradiograficzn¹. Pr¹¿ki DNA analizowano przy pomocy oprogramowania Biorad Quantity One. U¿ytecznoœæ czterech niesprzê¿onych markerów o jednostce repetytywnej typu (CA)n testowano w seriach próbek pobranych od cz³onków rodzin, jak i od przypadkowych osób, analizuj¹c wartoœci heterozygotycznoœci i mo¿liwoœci ich zastosowania do analizy spornego ojcostwa. Frekwencje alleli i heterozygotycznoœæ kalkulowano, stosuj¹c program Arlequin 2.0. Obliczono równie¿ wspó³czynnik zawartoœci informacji polimorficznej (PIC) dla ka¿dego lokus z osobna, jak i œredni¹ wartoœæ dla wszystkich analizowanych loci. Odchylenia od równowagi Hardy’ego-Weinberga (HWE) oszacowano, stosuj¹c test c2 , który umo¿liwia dokonanie porównania obserwowanych frekwencji genotypów z frekwencjami oczekiwanymi. Oczekiwan¹ heterozygotycznoœæ liczono na podstawie frekwencji alleli, zak³adaj¹c HWE. Poprawka Yatesa stosowana by³a w celu uzyskania ci¹g³oœci w sytuacji, gdy uzyskano tylko jeden stopieñ swobody (Cervus 2.0).

82

A. A., M. Banerjee

WYNIKI

Praca prezentuje wyniki badañ prowadzonych nad czterema niesprzê¿onymi loci mikrosatelitarnymi zlokalizowanymi na chromosomach 9, 10 i 22. Markery te testowano ze wzglêdu na stopieñ polimorfizmu, analizuj¹c szereg próbek pochodz¹cych od przedstawicieli rodzin, jak i od przypadkowych osób z ró¿nych etnicznych grup z regionu Kerala (rycina 1). Badania wykaza³y wysoki stopieñ polimorfizmu charakteryzuj¹cy analizowane markery mikrosatelitarne D9S1847, D9S1813, D10S558 i D22S446. Tabela I prezentuje zakres d³ugoœci alleli oraz frekwencje alleli badanych loci. Najwy¿sz¹ liczbê – 13 alleli – stwierdzono w lokus D9S1813. Wp³yw pr¹¿ków typu „stutter” na g³ówne pr¹¿ki pochodz¹ce od alleli zminimalizowano poprzez pomiar wzglêdnej wysokoœci szczytu, stosuj¹c oprogramowanie Biorad Quantity One. Frekwencje alleli charakteryzuj¹ce poszczególne loci prezentuje rycina 2. Wy¿sz¹ obserwowan¹ heterozygotycznoœæ (O) stwierdzono dla loci z wiêksz¹ liczb¹ heterozygot, tj. D9S1813 i D10S558, lecz D10S558 posiada ni¿sz¹ liczbê alleli. Dlatego te¿ najni¿sz¹ wartoœæ przybli¿enia oczekiwanej heterozygotycznoœci zaobserwowano w³aœnie dla uk³adu D10S558. Dla analizowanych loci wartoœci oczekiwanej heterozygotycznoœci zawiera³y siê miêdzy 0,84 a 0,89 (tabela II). Œrednia wartoœæ PIC dla badanych uk³adów by³a bardzo wysoka, osi¹gaj¹c wartoœæ 0,86. Brak znacz¹cego odchylenia odchylenie od stanu równowagi Hardy’ego-Weinberga zanotowano dla loci D9S1813 i D10S558. £¹czna si³a wykluczenia ojcostwa przypadkowego, niespokrewnionego pozwanego mê¿czyzny dla czterech analizowanych loci wynosi 0,97. Wyniki uzyskiwane w trakcie prowadzenia badañ by³y powtarzalne. Wszystkie uk³ady (D9S1847, D9S1813, D10S558 i D22S446) oceniono jako bardzo u¿yteczne z punktu widzenia analizy spornego ojcostwa dla wszystkich w³¹czonych w badania próbek pobranych od przedstawicieli rodzin.

DYSKUSJA

Gdy badania nad zró¿nicowaniem genetycznym prowadzi siê w wysoce zró¿nicowanej populacji, skala heterozygotycznoœci tak¿e znacznie siê ró¿ni. W rezultacie marker DNA, który wykazuje wysok¹ wartoœæ heterozygotycznoœci w normalnej populacji, mo¿e ujawniaæ wysok¹ homozygotycznoœæ w populacji inbredowej. St¹d zanim wybrany marker mo¿e zostaæ zastosowany w badaniach z zakresu genetyki s¹dowej, musi byæ sporz¹dzona genetyczna baza danych reprezentatywnej próbki populacyjnej, która umo¿liwi oszacowanie skali heterozygotycznoœci charakteryzuj¹cej ten marker w danej populacji. Prezentowane badania dowodz¹ ponad wszelk¹ w¹tpliwoœæ u¿ytecznoœci dinukleotydowych markerów D9S1847, D9S1813, D10S558 i D22S446 w badaniach spornego ojcostwa prowadzonych w spo³ecznoœciach o ró¿nych korzeniach etnicznych zamieszkuj¹cych region Kerala. PIC umo¿liwi³ oszacowanie informatywnoœci zwi¹zanej z oczekiwan¹ heterozygotycznoœci¹ oraz HWE. £¹czna si³a wykluczenia prawdopodobieñstwa markerów wykorzystanych w obecnych badaniach zosta³a oceniona jako bardzo wysoka, co dowodzi u¿ytecznoœci badanych markerów w sprawach spornego ojcostwa. W przypadku markerów, które wykazuj¹ znacz¹ce odchylenie od HWE, zanotowano wy¿sz¹ czêstoœæ alleli zerowych. Markery takie, jak D9S1847 i D9S1813, mog¹ podlegaæ jednoczesnej amplifikacji w reakcji kompleksowego PCR,

Ocena przydatnoœci analizy markerów ...

83

co sprawia, ¿e analiza staje siê szybsza i tañsza. Wspomniane markery nadaj¹ siê do wykorzystania w przysz³oœci dla celów s¹dowych w populacjach zamieszkuj¹cych tê czêœæ œwiata.

Podziêkowania: Autorzy pragni¹ wyraziæ wdziêcznoœæ pracownikom instytucji CSIR za sprawowanie opieki naukowej nad prowadzonymi badaniami.