Casa Rosada Buenos Aires, AR abril de 2008
W.J.Melo
RODOVIA MAR DEL PLATA BUENOS AIRES
W.J.Melo
DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE PROTEÍNAS
W.J.Melo
Proteínas
AVALIAÇÃO QUANTITATIVA ! Há vários métodos para determinação quantitativa de proteínas em amostras de tecido animal, vegetal, de microrganismos, alimentos, etc. ! A seleção de um ou outro método depende da sensibilidade desejada e do tipo de equipamento disponível. ! Métodos: titulométricos, colorimétricos, turbidimétricos, espectrofotométricos, W.J.Melo
Proteínas
MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DE PROTEÍNAS ! Métodos titulométricos #Determinação do N-total #Proteína= 6,25 x N-total ! Métodos colorimétrocs #Macrobiureto, microbiureto, Lowry, Hartree ! Métodos turbidimétricos #Precipitação da proteína com TCA ! Métodos espectrofotométricos #Leitura da absrobância no UV (E280, E260) W.J.Melo
Proteínas
REAÇÃO COM BIURETO ! Biureto #Constituição
CuSO4.5H2O - o Cu é o elemento ativo do reagente. tartarato duplo de sódio e potássio - complexar o Cu para evitar formação de óxido cúprico (precipitado preto) sob aquecimento. hidróxido de sódio - alcalinizar o meio iodeto de potássio - evitar auto-oxidação do Cu
#Reação W.J.Melo
I C=O
I O=C NH
HN
+
R-C-H I O=C
Cu
+
H-C-R I C=O
NH
HN
R1-C-H I
H-C-R1
I
proteína
REAÇÃO DO BIURETO
proteína
I O=C
I C=O NH
R-C-H I O=C NH R1-C-H I
HN
Cu
H-C-R I C=O HN H-C-R1
I
complexo de cor violeta
W.J.Melo
Proteínas
MÉTODO MACROBIURETO ! Método espectrofotométrico ! Baseia-se na reação da proteína com o reagente macrobiureto #As proteínas reagem com o biureto, formando um complexo de cor violeta ! Componentes do macrobiureto #sulfato de cobre pentaidratado, tartarato duplo de sódio e potássio, hidróxido de sódio, iodeto de potássio ! Sensibilidade #O método macrobiureto consegue determinar proteínas em concentrações de 30 a 250 mg L -1 W.J.Melo
Proteínas
MÉTODO DO MACROBIURETO I C=O
I O=C NH R-C-H I O=C NH R1-C-H I
HN
Cu
H-C-R I C=O HN H-C-R1
I
complexo de cor violeta W.J.Melo
Proteínas
MÉTODO MACROBIURETO CURVA DE CALIBRAÇÃO
ETAPAS
EXTRAÇÃO
CÁLCULOS
APLICAÇÃO W.J.Melo
Proteínas
MÉTODO DO MACROBIURETO ! Curva de calibração #Tem o objetivo de relacionar a concentração de uma solução protéica padrão (soroalbumina bovina) com a absorbância. #A vários tubos de ensaio, colocam-se concentrações diferentes de uma proteína padrão, aplica-se a reação de cor e lê-se a absorbância do complexo colorido. #A relação absorbância/concentração é uma reta dentro de certos limites concentração. W.J.Melo
Proteínas
MÉTODO DO MACROBIURETO ! Curva de calibração #A 7 tubos de ensdaio, adicionar, respectivamente, 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 e 1,4 mL da solução padrão de proteína (albumina bovina 1%) #Completar o volume a 4 mL com água destilada #Adicionar a cada tubo 4 mL da solução de macrobiureto #Aguardar 15 minutos e ler a absorbância a 540 nm
W.J.Melo
Proteínas
MÉTODO DO MACROBIURETO -EXTRAÇÃO ! Aplicação a uma amostra de folha #Pesar 1,0 g de tecido fresco de folha e colocar em almofariz. #Adicionar 7 mL de água destilada, um pouco de areia lavada e extrair a proteína solúvel em água. #Transferir para tubo de centrífuga e centrifugar (15 minutos a 17.000 rpm). #Transferir o sobrenadante para balão volumétrico de 10 mL e completar o volume com água destilada. W.J.Melo
Proteínas
MACROBIURETO - EXTRAÇÃO ! Pipetar 4 mL do extrato para tubo de centrífuga e adicionar 1 mL de solução de TCA 50%. ! Agitar e centrifugar (10 minutos a 3.500 rpm). ! Suspender o precipitado em 5 mL de acetona gelada (5 oC). ! Centrifugar e ressuspender em 5 mL de acetona gelada. Repetir a operação até que o sobrenadante se apresente sem coloração. ! Suspender o precipitado em 2 mL de solução de NaOH 0,1 mol L -1. ! A solução obtida é o extrato de proteína. W.J.Melo
Proteínas
MACROBIURETO APLICAÇÃO AO EXTRATO OBTIDO ! O extrato de proteína obtido deve ser submetido à mesma seqüência usada para a obtenção da curva de calibração. #Pipetar um volume menor que 4 mL do extrato de proteína para tubo de ensaio (no caso, 0,6 mL). #Adicionar volume de água para completar o volume de extrato usado a 4 mL (no caso, 3,.4 mL). #Adicionar 4 mL do reativo do macrobiureto, agitar bem e aguardar 15 minutos. #Ler a absorbância do complexo colorido em com-primento de onda de 540 nm. W.J.Melo
Proteína
MÉTODO MACROBIURETO CÁLCULOS ! Curva de calibração #1. Método da relação Absorbância/Conentração #2. Método da Regressão Linear
! Concentração de proteína na amostra de folha
W.J.Melo
MÉTODO DA RELAÇÃO CONCENTRAÇÃO/ABSORBÂNCIA
W.J.Melo
A RELAÇÃO CONCENTRAÇÃO/ABSORBÂNCIA É CONSTANTE
tg
absorbância = concentração
concentração W.J.Melo
MACROBIURETO - RESULTADOS Tubo
Padrão mL
Água mL
Abs
1 2 3 4 5 6 7
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,4
4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,4
0,155 0,184 0,252 0,301 0,347 0,398 0,420
Média
Abs-Br Conc. g L-1 0,000 0,029 0,097 0,146 0,192 0,243 0,265
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,5
Conc./Abs-Br -17,24 10,31 10,27 10,42 10,29 13,21 11,96 W.J.Melo
MÉTODO DA REGRESSÃO LINEAR
W.J.Melo
MACROBIURETO CURVA DE CALIBRAÇÃO 0,3
-
0,2
-
0,1
-
0,0
0,0
y= 0,0829x + 0,0086 r2= 0,095
x= 12,0627y - 0,1037
I
I
I
I
1,0
2,0 Proteína (g L-1)
3,0
4,0
W.J.Melo
Proteínas
MACROBIURETO - CÁLCULOS PROTEÍNA NO EXTRATO PROTÉICO ! Absorbâncias #Amostra: 0,420 #Branco: 0,155 ! Método da relação Conc/Abs #proteína (mg mL -1)= 11,95 x (Aa - Ab) #proteína (mg mL -1)= 11,95 x (0,420-0,155) #proteína (mg mL -1)= 3,17 ! Método da regressão linear #proteína (mg mL -1)= 12,06 x (Ab - Ab) -0,10 ! Proteína (mg mL -1)= 12,06 x (0,420 -0,155) -0,10 #proteína (mg mL -1)= 3,10 W.J.Melo
Proteínas
MACROBIURETO - PROTEÍNA NA AMOSTRA ! Diluições do extrato #1. 1,0 g de folha 10 mL #2. 0,6 mL extrato ¾ 4 mL #Fd= 10/1 x 4/0,6= 66,67 ! Concentrações do extrato #1. 4 mL ¾ 2 mL #Fc= 4/2= 2 ! Proteína na amostra de folha #proteína (mg kg -1)= Conc extrato x Fd/Fc #proteína (mg kg -1)= 3,17 x 66,67/2 #proteína (mg kg -1)= 105,67 W.J.Melo
