ANTECEDENTES

Aspectos Generales de la Tuberculosis La tuberculosis es una enfermedad que ha afectado al hombre durante varios siglos, y a pesar de que hace 50 años se consideraba erradicada; en la última década ha cobrado muchas vidas. En la actualidad, cada segundo una persona se infecta con M. tuberculosis y una persona con la enfermedad activa puede infectar entre 10 a 15 persona más por año (Corbett y col., 2003; Dye C y col., 1999; Dye C y col., 2005). La tuberculosis se transmite directamente cuando una persona enferma con tuberculosis pulmonar, tose o estornuda, emitiendo un aerosol en donde se encuentra el bacilo y el sujeto sano lo inhala. Cuando se desarrolla la tuberculosis activa, la localización de la enfermedad y la severidad es muy variable. Primero se desarrolla en los pulmones, pero puede presentarse en otros órganos del cuerpo debido a la diseminación de la bacteria vía hematógena; por lo que representa la manifestación más seria de la enfermedad (Van Crevel y col., 2002). La progresión de la tuberculosis está determinada principalmente por la respuesta inmune del hospedero y la eficacia de esta respuesta depende de los diferentes factores, tanto del huésped (constitución genética, respuesta inmunológica), de la bacteria (genes, factores de virulencia), como del medio ambiente (pobreza, desnutrición, hacinamiento) (Hernández y col., 2004; Smith, 2003). Pero una vez, que la micobacteria llega al alvéolo pulmonar, existen diferentes mecanismos por los cuales, la persona se enfrenta a ella.

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Primero, el bacilo puede ser destruido inmediatamente por las células efectoras de la inmunidad innata del hospedero. Segundo, una proporción de personas infectadas por M. tuberculosis desarrolla la tuberculosis en forma activa en un tiempo definido (1 a 3 años), siendo este grupo, incapaz de controlar la infección inicial y desarrollar una respuesta protectora adecuada. Finalmente, la mayoría de las personas infectadas presentan una infección clínicamente latente, pero no presentan ningún síntoma clínico y tampoco representan riesgo de contagio para el resto de la población (Flynn y Chan, 2001).

Respuesta Inmune en la Tuberculosis La respuesta inmune contra M. tuberculosis es fundamental para combatir la infección, ya que en la mayoría de los casos (90%) resulta eficiente y no progresa a la enfermedad. Sin embargo, el riesgo de desarrollarla aumenta considerablemente con la presencia de alteraciones en el sistema inmune.

La respuesta inmune que monta el hospedero infectado contra M. tuberculosis es de tipo celular principalmente; en la cual, la eliminación de la micobacteria depende principalmente de la interacción entre los macrófagos infectados y los linfocitos T. Los macrófagos y las células dendríticas, son las primeras células involucradas en la respuesta inmune innata contra la tuberculosis y en el inicio de la inmunidad adaptativa, la cual depende de tres procesos: presentación del antígeno, coestimulación y producción de citocinas. Los pacientes con la tuberculosis activa pueden sufrir anergia o falta de respuesta de los linfocitos T, esto debido a defectos intrínsecos del huésped o a la inhibición de alguno de los tres procesos por parte de la micobacteria, ya que

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ésta tiene la capacidad de desarrollar diferentes mecanismos antagonistas (Van Crevel y col., 2002). Una vez que M. tuberculosis coloniza el epitelio pulmonar, se pueden presentar dos escenarios: en el primero, los macrófagos alveolares fagocitan a la micobacteria y a través de la fusión fagosoma-lisosoma, la bacteria es destruida por el efecto del pH ácido y las enzimas lisosomales; éstas, favorecen la producción de intermediarios reactivos de oxígeno (ROI)

y de nitrógeno

(RNI) y de esta manera, destruyen al microorganismo sin que se presente una respuesta inmune adaptativa. En

el

segundo

escenario,

cuando

la

micobacteria

evade

el

microambiente hostil de los macrófagos, se establece la infección, y se desarrolla una respuesta inflamatoria inespecífica, regulada por citocinas pro- y anti-inflamatorias y quimiocinas, derivadas principalmente por las células fagocíticas, las cuales atraen más células. Un ejemplo de estas citocinas es la interleucina-12 (IL-12). La IL-12 induce la producción de interferón gamma (IFNγ), la cual es una citocina esencial en la respuesta inmune protectora del hospedero contra la tuberculosis (Doherty y Anderson, 2005; Van Crevel y col., 2002). Cuando la micobacteria se encuentra dentro de los macrófagos, sus antígenos

asociados

a

las

moléculas

del

complejo

principal

de

histocompatibilidad (MHC) de clase II son presentados a los linfocitos T CD4+. La principal función de estas células es la producción de IFN-γ; además ayudan en el desarrollo de la respuesta celular mediada por linfocitos T CD8+. Los mecanismos usados por los linfocitos T CD8+ para controlar la tuberculosis, son la producción de citocinas y la lisis de las células infectadas, asociada a la exocitosis mediada por granzimas y perforinas (Caruso y col., 1999; Serbina y col., 2001).

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El papel central del IFN-γ en el control de la tuberculosis se ha demostrado por la alta susceptibilidad a la infección micobacteriana en ratones “knockout” del gen de IFN-γ; y en humanos, por las mutaciones en el receptor de IFN-γ. Por lo tanto, la identificación de los antígenos inmunodominantes micobacterianos que activan a los linfocitos T para que proliferen y secreten IFN-γ pudieran ser utilizados para el desarrollo de vacunas efectivas contra la tuberculosis (Van Crevel y col., 2002; Skeiky y col., 2000). La cepa atenuada de M. bovis: el bacilo de Calmette-Guérin (BCG) es actualmente la única vacuna disponible contra la tuberculosis. Sin embargo, la eficacia de la BCG en el control de la tuberculosis es muy variable geográficamente en las diferentes poblaciones y puede causar la diseminación de la enfermedad en individuos inmunocomprometidos. A pesar de que la BCG se administra al 90% de los recién nacidos a nivel mundial, la tasa de incidencia de la enfermedad permanece elevada, además de que solo protege a la población infantil, pues la inmunidad adquirida disminuye con la edad ocasionando una protección deficiente contra la enfermedad. Por lo anterior, actualmente los esfuerzos se centran en el desarrollo de una vacuna más eficiente y segura contra la tuberculosis (Doherty y Anderson, 2005; Ginsberg, 2002; Kaufmann, 2005; Skeiky y col., 2000; Wiker y col., 2006).

Relevancia de los Factores de Virulencia de M. tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis se caracteriza por poseer además de su membrana celular, una pared celular con una alta composición de ácidos grasos, ácidos micólicos y peptidoglicanos (única en su tipo dentro de los procariotes); que le confiere las características de su arquitectura y la capacidad

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de resistir ciertos agentes antimicrobianos (Brennan y Nikaido, 1995). Por lo que la identificación de las proteínas localizadas en esta fracción celular pueden ser utilizadas en el desarrollo de nuevas pruebas diagnósticas. Además, las proteínas de la membrana también pueden ser una clave en el desarrollo de vacunas, porque están involucradas en la interacción huésped-parásito y pueden ser utilizadas por la micobacteria como factores de virulencia del huésped (Cimino y col., 2006; Riley, 2006). La habilidad de M. tuberculosis para mantener una infección crónica y causar enfermedad, depende de sus factores de virulencia que capacitan al microorganismo para invadir y sobrevivir indefinidamente dentro de las células fagocíticas mononucleares y así poder evadir los mecanismos celulares antimicrobianos. La caracterización de estos factores es esencial para comprender la patogénesis de M. tuberculosis e induce la búsqueda de nuevas herramientas diagnósticas, de prevención e inmunoprofilaxis (Issar, 2003). Actualmente se hace uso de técnicas de manipulación genética y mutagénesis, para identificar los genes que codifican factores de virulencia y componentes de la superficie celular de la bacteria; y combinado con la información disponible de la secuenciación completa del genoma de Mycobacterium tuberculosis (Cole y col., 1998), se ha podido caracterizar la función de varias proteínas de la micobacteria. La primera secuencia del genoma de una cepa patogénica de M. tuberculosis (cepa H37Rv) se encuentra disponible desde 1998 la cual revela que posee una secuencia de 4,411,529 pares de bases (4,411,532 pares de bases para el 2002), la cual se caracteriza por un contenido alto de guanina mas citosina (G+C, 65%), el cual es uniforme en la mayoría del genoma (Figura 1). Existe un grupo sobresaliente de genes con un alto contenido de G+C

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(mayor al 80%) que pertenecen a dos familias de proteínas, con dominios ricos en prolina (P) y ácido glutámico (E): PE y PPE. Se ha encontrado que estas familias de reciente caracterización, influyen en la virulencia de la micobacteria y son consideradas una fuente de variabilidad antigénica; por lo que la función de estas proteínas es de gran relevancia inmunológica (Camus y col., 2002; Cole y col., 1998; Flores y Espitia, 2003).

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Figura 1. Mapa circular del cromosoma de M. tuberculosis H37Rv. El círculo exterior muestra la escala en megabases (Mb), donde el cero (0) representa el origen de replicación. El primer anillo del exterior denota la posición del gen ARN (ARNt se encuentra en azul, los demás en rosa) y la región repetida directa (cubo rosa); el segundo anillo del interior muestra la secuencia de la cadena codificante de ADN (a la derecha, verde oscuro; a la izquierda, verde claro); el tercer anillo representa el ADN repetitivo (secuencias de inserción, naranja; familia 13E12 REP, rosa oscuro; profago, azul); el cuarto anillo muestra la posición de los miembros de la familia PPE (verde); el quinto anillo muestra los miembros de la familia PE (morado, excepto PGRS), y el sexto anillo muestra la posición de las secuencias PGRS (rojo oscuro). El histograma del centro representa el contenido de G + C en rojo. La figura fue generada con el software DNASTAR (Cole y col.,1998).

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Familia de Proteínas PE y PPE de Mycobacterium tuberculosis El diez por ciento del genoma de M. tuberculosis está representado por dos familias de genes conocidas como PE y PPE, consideradas como la mayor fuente de variabilidad genética de la bacteria, las cuales se pueden dividir en subfamilias de acuerdo a la homología y presencia de motivos característicos en el dominio carboxilo terminal de sus secuencias. Ambas familias de genes codifican para familias de proteínas de 99 y 69 miembros respectivamente (Gey van Pittius y col., 2006; Karboul y col., 2006). La familia PE se caracteriza por la presencia de motivos ricos en prolina y ácido glutámico (PE) en el dominio amino terminal altamente conservado entre sus miembros, constituido por 110 aminoácidos aproximadamente. En forma similar, la familia PPE tiene un dominio amino terminal conservado de 180 aminoácidos, con motivos ricos en Prolina-Prolina-Ácido Glutámico (PPE). En cambio, el dominio carboxilo terminal de las dos familias de proteínas varía en tamaño, secuencia y número de copias de las secuencias repetidas (Figura 2) (Gey van Pittius y col., 2006). La familia PE se divide en dos subfamilias: PE de 34 miembros y PE_PGRS de 65. Los miembros de la subfamilia PGRS (Polymorphic GC-RichRepetitive Sequence) se diferencia de la subfamilia PE, porque poseen un dominio con múltiples repeticiones en “tandem” de Glicina-Glicina-Alanina o Glicina-Glicina-Asparagina en el extremo carboxilo terminal, mientras que presentan el dominio amino terminal conservado (Gey van Pittius y col., 2006).

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Representación de la familia PE PE ~110 aa

PE ~110 aa

PGRS

(GGAGGA)n

0_>1,400 aa

Única secuencia 0_>500 aa

Representación de la familia PPE PPE ~180 aa

PPE ~180 aa

PPE ~180 aa

MPTR

(NxGxGNxG)n

~200_>3,500 aa

GxxSVPxxW ~200_~400 aa

Única secuencia 0_~400 aa

Figura 2. Clasificación de la familia de proteínas PE y PPE. Las familias de proteínas PE y PPE poseen múltiples copias de secuencias polimórficas repetidas, conocidas como PGRS y repeticiones polimórficas en tandem (MPTR) respectivamente. Los nombres PE y PPE derivan de los motivos ProGlu (PE) y Pro-Pro-Glu (PPE) que se encuentran cerca de la región amino terminal en la mayoría de los casos (Cole y col.,1998).

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La familia PPE está formada por 69 miembros, la cual se divide en cuatro subfamilias en base a los motivos de aminoácidos que presenta en el dominio carboxilo terminal de su secuencia de aminoácidos. También presentan un dominio amino terminal conservado que comprende un residuo de 180 aminoácidos,

seguido

por

segmentos

carboxilo

terminal

que

varían

marcadamente en secuencia y longitud. Una de las subfamilias más relevantes, está constituida por la clase MPTR, caracterizada por la presencia de múltiples copias en tandem con los motivos Asn-X-Gly-X-Gly-Asn_X-Gly (asparagina y glicina, la X representa cualquier otro aminoácido). A pesar de que la función de los 168 miembros de las familias de proteínas PE y PPE no se conocen en detalle, se tienen varias hipótesis, las cuales sugieren que estas proteínas están involucradas en la variación genética y antigénica de la micobacteria debido a la naturaleza polimórfica de sus dominios carboxilo-terminales (Chaitra y col., 2005; Cole y col., 1998; Delogu y Brennan, 2001; Karboul y col., 2006).

Por lo anterior, estas 2 familias de proteínas resultan sumamente interesantes desde el punto de vista inmunológico; ya que representan una fuente de variación antigénica para M. tuberculosis en el orden de evadir la respuesta inmune del huésped (Ramakrishnan y col., 2000) y como antígenos de superficie celular que interaccionan con las moléculas de los macrófagos. Además, algunas proteínas PE y PPE han mostrado ser potentes antígenos de linfocitos T y B (Banu y col., 2002; Delogu y Brennan, 2001). Las proteínas PE_PGRS se han encontrado que son exclusivas de los miembros del complejo de M. tuberculosis, por lo que son buenos candidatos para determinantes antigénicos, además de que sirven como marcadores en estudios filogenéticos y de evolución (Fleishman y col., 2002; Marri y col., 2006; Hermans y col., 1992; Poulet, 1995).

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Actualmente se han identificado genes de la familia de PE_PGRS que codifican para ligandos de proteínas de la matriz extracelular como la fibronectina que le permite a la micobacteria adherirse a las células del huésped, tal es el caso de la proteína Rv1759c (Brennan y col., 2001; Espitia y col., 1999). A estas proteínas también se les ha asociado, la capacidad de la micobacteria de replicarse en los macrófagos y persistir dentro de los granulomas (Ramakrishnan y col., 2000).

Proteína PE_PGRS33 (Rv1818c) de M. tuberculosis Recientemente se ha encontrado una proteína PE_PGRS33 codificada por el gen Rv1818c de Mycobacterium tuberculosis compuesta por 498 aminoácidos con un 41% de glicina y 20% de alanina; que presenta en su dominio PE amino terminal, una alta homología con los miembros de la familia PE (Cole y col., 1998; Delogu y Brennan, 2001). La proteína PE_PGRS33 está involucrada en la interacción de las moléculas de superficie celular de la micobacteria con los macrófagos del huésped. Ya que, por estudios de fraccionamiento celular y análisis de fluorescencia se encontró que la proteína se localiza en la membrana celular de la micobacteria (Delogu y col., 2004; Talarico y col., 2005). Se ha demostrado que la proteína PE_PGRS33 participa en la patogénesis de la tuberculosis, mediante un estudio en el que se expresó el gen de esta proteína en una cepa no patogénica (Mycobacterium smegmatis), que normalmente no expresa el gen. Se observó que la cepa recombinante persistió

dentro

de

macrófagos

in

vitro

y

en

ratones

inoculados

intraperitonealmente, en comparación con la cepa silvestre o con la cepa que expresaba solamente el dominio PE de la proteína PE_PGRS33. Por lo que la 16

proteína PE_PGRS33 juega un papel muy importante en la persistencia de la micobacteria (Dheenadhayalan y col., (2006a); Talarico y col., 2007). Por otra parte, mediante las técnicas de RT-PCR y microarreglos de genes, se evaluó la expresión de los genes de la familia PE_PGRS en diferentes cepas de M. tuberculosis y M. bovis, modificando las condiciones de cultivo in vitro, e induciendo posteriormente la infección en cultivos de macrófagos o en ratones. Con ésto se identificaron los genes que se expresaron en todas las cepas bajo las diferentes condiciones de cultivo, como el gen de PE_PGRS33, sugiriendo que las proteínas codificadas son críticas para las funciones vitales de la micobacteria. Además, se identificaron aquellos genes que presentaron diferentes niveles de expresión en respuesta a los cambios en las condiciones de cultivo, y se observó una alteración en las propiedades antigénicas y funcionales de las proteínas codificadas por estos genes. Esto pudiera tener efectos en cómo la micobacteria es presentada en el sistema inmune del hospedero (Dheenadhayalan y col., (2006b)). En un experimento realizado por Delogu y Brennan en el 2001, para investigar la respuesta inmunológica inducida por la proteína PE_PGRS33, se evaluó la respuesta inmune humoral y celular durante la infección por M. tuberculosis en un modelo murino, utilizando constructos de ADN del gen PE_PGRS33 y del gen que codifica solo para el dominio PE. Se observó el desarrollo de una respuesta inmune humoral contra la proteína PE_PGRS, pero no contra la proteína recombinante PE, sugiriendo de esta manera que la respuesta humoral se debe solamente a los epítopes presentes en el dominio PGRS. Por otra parte, se evaluó la habilidad de secretar IFN-γ de los esplenocitos de ratones inmunizados con los dos constructos de ADN después de una reestimulación in vitro, y se observó que solo los esplenocitos de los ratones inmunizados con PE secretaron cantidades significativas de IFN-γ,

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sugiriendo con ello que el dominio PE puede inducir una respuesta inmune celular efectiva. Por lo tanto, resulta interesante evaluar la respuesta inmune celular inducida por la proteína PE_PGRS33 de M. tuberculosis, por medio de un sistema de procesamiento y presentación de los determinantes antigénicos de la proteína in vitro. Para lo cual, se requieren herramientas biológicas como lo son los hibridomas de células T, los cuales se activan al reconocer específicamente el complejo formado por los epítopes de la proteína y las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad, de las células presentadoras de antígeno (CPA).

Uso de Hibridomas de Células T Como Herramienta en el Estudio de la Respuesta Inmune Celular Contra M. tuberculosis Basándose en lo descrito anteriormente, se conoce el importante papel que desempeñan los linfocitos T en el control de la tuberculosis mediante la respuesta inmune celular; por lo tanto, la identificación de los epítopes de antígenos inmunológicamente relevantes representa un paso crítico en el desarrollo de vacunas (Chaitra y col., 2005). Sin embargo, el estudio del procesamiento y presentación de antígenos, por las CPA humanas, se ha limitado por la dificultad de producir y mantener clones de linfocitos T humanos. Por esta razón se ha desarrollado un método que permite fusionar células T antígeno específico, con células provenientes de tumor (inmortal), para generar hibridomas de células T. Éstas resultan más convenientes de usar para estudios in vitro de la presentación de antígenos por las CPA, ya que representan una fuente ilimitada de células. Utilizando ratones transgénicos con genes de MHC restringidos a alelos HLA humanos (HLA-A2,

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DR1 y DR4), se pueden producir hibridomas murinos de células T, que respondan a macrófagos humanos, células dendríticas y linfocitos B para evaluar el procesamiento y presentación de antígenos (Canaday y col., 2003). Debido a la importancia de las proteínas de la familia PE de Mycobacterium tuberculosis en la generación de la respuesta inmune, pueden ser utilizadas como marcadores inmunológicos de infección o para el desarrollo de vacunas contra la tuberculosis. El propósito de este trabajo es generar una fuente ilimitada de células T específicas contra péptidos inmunodominantes de la proteína PE_PGRS33 (Rv1818c) de Mycobacterium tuberculosis, que permitan evaluar el procesamiento y presentación de antígenos in vitro utilizando un modelo de ratón singénico C3H/HeJ.

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