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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 220 420

51 Int. Cl. : A61K 35/74

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C12N 1/20 A23L 1/29 A23C 9/152 // C12N 1:20 C12R 1:225

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 00909291 .7

86 Fecha de presentación: 02.03.2000

87 Número de publicación de la solicitud: 1165104

87 Fecha de publicación de la solicitud: 02.01.2002

54 Título: Cepa de Lactobacillus parcasei capaz de prevenir la diarrea.

30 Prioridad: 11.03.1999 EP 99104924

73 Titular/es: SOCIÉTÉ DES PRODUITS NESTLÉ S.A.

Case Postale 353 1800 Vevey, CH

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.12.2004

72 Inventor/es: Reniero, Roberto;

Bruessow, Harald; Rochat, Florence; Von der Weid, Thierry y Blum-Sperisen, Stéphanie

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Isern Jara, Jorge

ES 2 220 420 T3

16.12.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 220 420 T3 DESCRIPCIÓN Cepa de lactobacillus parcasei capaz de prevenir la diarrea. 5

La presente invención pertenece a nuevos microorganismos de la familia Lactobacillaceae, especialmente a microorganismos del género Lactobacillus, que son útiles en la prevención o tratamiento de la diarrea. En particular, la presente invención se refiere al uso de dichos microorganismos para la preparación de un soporte ingerible y una composición conteniendo el mismo.

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Los organismos que producen ácido láctico como un componente metabólico principal han sido conocidos durante mucho tiempo. Estas bacterias se pueden encontrar en la leche o en fábricas de procesamiento de leche, respectivamente, en plantas vivas o en proceso de descomposición pero también en el intestino humano y de animales. Estos microorganismos, resumidos bajo el término “bacterias ácido-lácticas”, representan un grupo bastante poco homogéneo y comprenden, por ejemplo, el género Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus, etc...

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Las bacterias ácido-lácticas han sido utilizadas como agentes de fermentación para la preservación de los alimentos beneficiándose de un pH bajo y la acción de los productos fermentados generados durante la actividad fermentativa de los mismos para inhibir el crecimiento de bacterias expoliadoras. Para este fin, se han utilizado bacterias ácidolácticas para la preparación de una variedad de diferentes alimentos como queso, yoghurt y otros productos lácticos fermentados. Las bacterias ácido lácticas muy recientemente han atraído una gran parte de la atención ya que se ha encontrado que algunas cepas exhiben propiedades valiosas en hombres y animales tras la ingestión. En particular, se han encontrado cepas específicas de Lactobacillus o Bifidobacterium que son capaces de colonizar la mucosa intestinal y ayudar al mantenimiento del ser humano y animal. En este aspecto, PE 0 768 375 revela cepas específicas del género Bifidobacterium, que son capaces de llegar a implantarse en la flora intestinal y se pueden adherir a las células intestinales. Se reveló que estas bifidobacterias ayudaban a la inmunomodulación, siendo capaces de excluir completamente la adhesión de bacterias patógenas a células intestinales, ayudando de esta manera al mantenimiento de la salud del individuo. Durante los últimos años la investigación también se ha centrado en el uso potencial de bacterias ácido-lácticas como agentes probióticos. Los probióticos están considerados como preparaciones microbianas viables que promueven la salud del individuo mediante la preservación de la microflora natural del intestino. Una preparación microbiana puede estar comúnmente aceptada como probiótica en caso de que sus microbios competentes y su modo de acción sean conocidos. Se estima que los probióticos se unen a la mucosa intestinal, colonizan el tracto intestinal y asimismo previenen la unión de microorganismos dañinos. Un prerrequisito crucial para su acción reside en que tienen que alcanzar la mucosa del intestino de una manera adecuada y viable y no ser destruidos en la parte superior del tracto gastrointestinal, especialmente por la influencia del bajo pH predominante en el estómago. En este aspecto, WO 97/00078 revela una cepa específica, denominada Lactobacillus GG (ATCC 53103), como un probiótico. El microorganismo se utiliza particularmente en un método de prevención o tratamiento de reacciones de hipersensibilidad inducidas por comida en que se administra a un receptor junto con un material alimenticio que ha sido sometido a un tratamiento de hidrólisis con pepsina y/o tripsina. La cepa Lactobacillus seleccionada se caracteriza por exhibir propiedades de adhesión y propiedades de colonización y muestra un sistema enzimático proteasa, de manera que el material protéico contenido en el producto alimenticio que va a ser administrado es además hidrolizado por las proteasas secretadas por la cepa específica Lactobacillus. El método discutido en este documento eventualmente resultará en la captación de material protéico por parte del intestino que no muestre una cantidad sustancial de material alergénico. Además, en PE 0 577 903 se hace referencia al uso de tales bacterias ácido-lácticas que tienen la habilidad de reemplazar Helicobacter pylori, causa conocida del desarrollo de úlceras, en la preparación de un soporte que se pretende usar para el tratamiento profiláctico o terapéutico de úlcera asociada con la acción de Helicobacter pylori.

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En conocimiento de las propiedades beneficiosas que pueden proporcionar cepas particulares de bacterias ácidolácticas hay un deseo en este campo de cepas adicionales de bacterias ácido-lácticas que sean beneficiosas para la salud del hombre y/o animales. 60

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Consecuentemente, un problema de la presente invención es proporcionar cepas de bacterias adicionales que exhiban nuevas propiedades beneficiosas para el hombre y/o animales. El problema anterior ha sido solucionado con el suministro de nuevos microorganismos, principalmente, bacterias ácido-lácticas, pertenecientes al género Lactobacillus que tienen las características de ser capaces de adherirse a y esencialmente colonizar la mucosa intestinal y prevenir la infección de las células epiteliales intestinales por rotavirus. Estas cepas de Lactobacillus son capaces de crecer en la presencia de hasta 0,4% de sales biliares, así pueden atravesar fácilmente el tracto gastrointestinal y permanecer esencialmente activas. 2

ES 2 220 420 T3 La bacteria ácido-láctica de la invención es Lactobacillus paracasei CNCM I-2116.

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Se ha demostrado que los microorganismos de la presente invención que exhiben las siguientes propiedades, son gram positivos, catalasa negativos, formación de NH3 de arginina negativa y la producción CO2 de negativa. Producen ácido láctico L(+), son capaces de crecer en presencia de sales biliares en una concentración de hasta 0,4% y pueden prevenir esencialmente la infección de células epiteliales por rotavirus. Los nuevos microorganismos pueden ser utilizados para la preparación de una gran variedad de materiales de soporte ingeribles, tales como por ejemplo leche, yoghurt, cuajada, leches fermentadas, productos a base de leche fermentada, productos a base de cereales fermentados, polvos a base de leche, formulaciones infantiles y pueden estar incluidas en el soporte en una cantidad desde unas 105 ufc/g hasta unas 1011 ufc/g. Para el propósito de la presente invención, la abreviación ufc designa una “unidad formadora de colonias” que se define como el número de células bacterianas reveladas mediante el contaje microbiológico en placas de agar. La presente invención también proporciona un alimento o composición farmacéutica que contiene al menos la cepa de Lactobacillus de esta invención que tenga las características anteriores. Para preparar la composición alimenticia de acuerdo con la presente invención, al menos la cepa de Lactobacillus, de acuerdo con la invención se incorpora en un soporte adecuado, en una cantidad de desde unas 105 ufc/g a 1011 ufc/g, preferiblemente desde unas 106 ufc/g a 1010 ufc/g, más preferiblemente desde unas 107 ufc/g a 109 ufc/g. En caso de una preparación farmacéutica, el producto puede ser preparado en forma de comprimidos, suspensiones líquidas bacterianas, suplementos orales secos, suplementos orales húmedos, alimentación por tubo húmeda o alimentación por tubo seca etc... con la cantidad de cepas de Lactobacillus a ser incorporadas aquí estando en un rango de hasta 1012 ufc/g, preferiblemente a partir de 107 ufc/g a 1011 ufc/g, más preferiblemente desde 107 ufc/g hasta 1010 ufc/g. La actividad de los nuevos microorganismos en el intestino del individuo es naturalmente dependiente de la dosis. Esto es, que cuantos más nuevos microorganismos sean incorporados por medios de ingestión del material alimenticio anterior o de la composición farmacéutica, más actividad protectora y/o curativa de los microorganismos. Debido a que los nuevos microorganismos no son perjudiciales para el ser humano y animales y han sido eventualmente asilados a partir de heces infantiles, una elevada cantidad de los mismos podrá ser incorporada de manera que esencialmente una elevada proporción del intestino del individuo será colonizado por los nuevos microorganismos. En las figuras, La Fig. 1 muestra un esquema que ilustra el cribado del cultivo celular para evaluar las propiedades protectoras rotavirales de las cepas bacterianas.

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La Fig. 2 muestra la acidificación de la cepa L. casei CNCM I-2116 (denominada ST11) en un medio de crecimiento diferente. La Fig. 3 muestra la tasa de supervivencia de la cepa L. casei ST11 a 10ºC medidos durante 30 días.

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La Fig. 4 muestra el patrón de mRNA de IL-2 e IL-10 en células adherentes de ratón derivadas de la médula ósea después de la incubación de las células con diluciones en serie de ST11. La Fig. 5 muestra el resultado de la diferenciación Th2 como resultado en la producción disminuida de IL-4.

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Durante los estudios extensivos que llevaron a la presente invención los inventores han investigado las heces infantiles y han aislado una variedad de diferentes cepas bacterianas de las mismas. Estas cepas fueron subsecuentemente examinadas por su capacidad para prevenir la infección de células epiteliales con rotavirus que se conoce que causan diarrea.

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Varios géneros bacterianos comprendiendo Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus fueron cribados por sus propiedades inhibidoras de rotavirus. Las pruebas para la propiedad inhibidora se realizaron esencialmente con tres serotipos de rotavirus que representan la mayoría de agentes etiológicos de la diarrea vírica humana (serotipos G1, G3 y G4).

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Se hizo crecer a las diversas bacterias ácido-lácticas en un medio adecuado, tales como MRS, Hugo-Jago o medio M17 a temperaturas desde 30 a 40ºC correspondientes a su temperatura de crecimiento óptima. Después de alcanzar el crecimiento estacionario, las bacterias se recogieron mediante centrifugación y se resuspendió en una solución de NaCl fisiológica. Entre las diferentes pruebas las células bacterianas se conservaron congeladas (-20ºC).

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Los diversos estocs de rotavirus se prepararon por la infección de monocapas de células confluyentes. Los rotavirus se incubaron antes de la infección. Las células se infectaron con 20 dosis infecciosas de cultivo tisular. Para evaluar las propiedades anti-rotavirales se aplicaron dos protocolos diferentes. De acuerdo con un protocolo 3

ES 2 220 420 T3 las diversas cepas bacterianas se examinaron para su directa interacción con los rotavirus mientras que en el segundo protocolo las bacterias se cribaron para aquellas cepas que interactúan con los receptores celulares de los rotavirus. 5

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El primer protocolo implicó el contacto de cada respectiva suspensión bacteriana con una cepa de rotavirus diferente y la incubación en un medio adecuado. Subsecuentemente, la mezcla de virus y bacterias se aplicó a una monocapa celular de células humanas de adenoma de colon indiferenciadas HT-29 y se continuó con la incubación. Se ensayó entonces la replicación del virus. El segundo protocolo implicó la incubación de la respectiva suspensión bacteriana primero juntamente con una monocapa celular de células humanas de adenoma de colon indiferenciadas HT-29 y la adición a continuación del virus. Después de la incubación continuó el ensayo de la replicación del virus. La replicación de los rotavirus puede ser fácilmente evaluada mediante la tinción histo-inmunológica de las proteínas de rotavirus en células infectadas.

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Un efecto inhibitorio del rotavirus se atribuyó a una bacteria dada cuando el número de células infectadas se redujo un 90% en el cultivo celular inoculado con rotavirus más la bacteria indicada en comparación con las células inoculadas sólo con rotavirus. 20

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De un total de 260 cepas bacterianas diferentes primariamente aisladas, sólo se pudo demostrar que 9 inhibían esencialmente la replicación rotaviral. Se verificó que las diferentes bacterias pertenecían al género Lactobacillus subespecies rhamnosus o paracasei. Una cepa, denominada Lactobacillus casei ST11, que ha sido depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest y ha recibido los números de depósito NCC 2461 (I-2116), se ha demostrado que es extremadamente efectiva en la prevención de la infección de células humanas por rotavirus. Además, esta cepa en particular, muestra unas propiedades de crecimiento excelentes como se puede mostrar mediante la acidificación en diferentes medios. La cepa también muestra un buen funcionamiento en cuanto a la tasa de supervivencia durante el almacenamiento a bajas temperaturas de alrededor de unos 10ºC, que la hace una excelente candidata para ser incluida en productos alimenticios o composiciones farmacéuticas que van a ser almacenadas en condiciones de refrigeración. Además en el descubrimiento anterior también se puede demostrar que las cepas sorprendentemente también exhiben propiedades antialérgicas en aquellas dichas cepas teniendo un impacto en la síntesis de diferentes mediadores inmunológicos. Generalmente se acepta que las respuestas inmunes humorales y las reacciones alérgicas están mediadas por linfocitos T CD4+ llevando el fenotipo de tipo 2 (Th2). Los linfocitos Th2 están caracterizados por la producción de elevados niveles de interleucina 4 (IL-4), una citoquina requerida para la secreción de IgE, que es la clase de anticuerpo principal implicada en las reacciones alérgicas. La diferenciación de los linfocitos Th2 es dañada por INF-γ, una citoquina particular que surge del subgrupo Th1 mutuamente exclusivo de los linfocitos T CD4+ . Dichos linfocitos Th1 están a su vez fuertemente inducidos por la interleucina 12 (IL-12). En contraposición a IL-10, se ha demostrado que otra citoquina tiene un fuerte impacto supresor en la proliferación de los linfocitos Th1 y es por lo tanto llamado a desempeñar un papel importante en los mecanismos inmunosupresores.

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En resumen, ambas IL-12 y IL-10 tienen fuertes efectos moduladores en el desarrollo de linfocitos T CD4+ mediante su influencia en el desarrollo del conjunto Th1. IL-12 es una citoquina reguladora clave para la inducción de la diferenciación Th1 y por lo tanto inhibe así la generación de respuestas Th2. Un camino principal para la inhibición de los linfocitos Th2 es por lo tanto visto en la estimulación de la síntesis de IL-12 mediante células accesorias.

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Es bien conocido que algunos componentes de bacterias gram negativas, tales como LPS, inducen elevados niveles de IL-12 en células adherentes, tales como macrófagos y células dendríticas. Consistentemente, se ha descubierto que bacterias gram negativas pueden influenciar fuertemente la diferenciación de los linfocitos T CD4+ hacia el fenotipo Th1.

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El microorganismo ST11 como un ejemplo de cepas de Lactobacillus de la presente invención ha sido ensayado por un potencial papel en la inducción de citoquinas implicadas en la regulación de la diferenciación de los linfocitos T CD4+ . En particular, se ha estudiado el efecto de ST11 en el fenotipo de los linfocitos CD4+ experimentando la diferenciación Th2.

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En este aspecto la capacidad de ST11 para inducir la síntesis de mRNA codificando estas dos citoquinas reguladoras en células adherentes de ratón derivadas a partir de la médula ósea se comparó con otras 4 cepas de Lactobacilli y con un control de bacterias gram negativas (E. coli K12). El mRNA se midió mediante RT-PCR semicuantitativa después de 6 horas de incubación de las células con diluciones en serie de bacterias comprendiendo desde 109 hasta 107 ufc/ml.

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Aunque todas las cepas de Lactobacillus podrían inducir la trascripción de mRNA de IL-12 en un cierto grado, podría demostrase que ST11 es el inductor más fuerte, ya que su señal PCR pudo ser detectado incluso en la dosis bacteriana más baja. De hecho, la capacidad de ST11 para inducir el mRNA de IL-12 fue tan fuerte como la de E.coli. La inducción del mRNA de IL-10 fue en general más débil que para el mRNA de IL-12, ya que sólo se puedo detectar 4

ES 2 220 420 T3 señal en elevadas dosis bacterianas. Sin embargo, ST11 fue el inductor más fuerte del mRNA IL-10, comparado con otros Lactobacilli y el control E. coli. 5

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Por lo tanto, se estima que ST11 es eficiente en la inducción de citoquinas inmunoreguladoras implicadas en la diferenciación de linfocitos T CD4+ . Su fuerte capacidad para inducir IL-12 hace que sea un candidato para inhibir las respuestas Th2 y su inducción mesurable de IL-10 puede prevenir respuestas inflamatorias. Además del descubrimiento anterior, también se determinó si ST11 tenía un efecto inhibitorio en los linfocitos T CD4+ que experimentan diferenciación Th2 y un efecto positivo en las funciones Th1. Se utilizó un sistema de cultivo de diferenciación celular bien establecido, donde los precursores de los linfocitos T CD4+ se activaron policlonalmente y modularon la diferenciación Th1 o Th2, dependiendo del tipo de co-estímulo proporcionado en el medio de cultivo. La diferenciación Th1/Th2 se indujo durante 7 días en un cultivo primario, después del que las células se reestimularon durante dos días en un cultivo secundario que contenía medio simple y la adquisición de un fenotipo específico (Th1 o Th2) se evaluó mediante la medición de los tipos de citoquinas producidas en el sobrenadante (IFN-γ vs. IL-4). Se sabe que el precursor de los linfocitos T CD4+ de ratón del antecedente BALB/c preferentemente se diferencian hacia el fenotipo predominante Th2 (IL-4 elevado, IFN-γ bajo en los sobrenadantes del cultivo secundario) tras la activación bajo condiciones neutras (medio simple en el cultivo primario). Este fenotipo podría ser revertido completamente a un patrón Th1 (IFN-γ elevado, IL-4 bajo) hasta la adición de un anticuerpo monoclonal de bloqueo a IL-4 en el primer cultivo. Para investigar el papel potencial de ST11 en la inhibición Th2, se activaron los precursores purificados de los linfocitos T CD4+ a partir de ratones BALB/c en la presencia de células adherentes de la médula ósea como células accesorias durante el primer cultivo. Estas células se co-cultivaron tanto en medio simple, o en la presencia de 1 mg/ml LPS, o 108 ufc/ml de ST11, o 108 ufc/ml de otro Lactobacillus. Después de este tiempo, las células se lavaron y los linfocitos CD4+ T se purificaron otra vez y se reestimularon en el cultivo secundario con medio simple. Las citoquinas producidas por los linfocitos CD4+ T diferenciados se midieron después de 2 días. Tal como se esperaba, las células diferenciadas en la presencia de un medio simple mostraron un fenotipo dominante Th2. La adición de ST11 a los primeros cultivos moduló fuertemente el resultado de la diferenciación Th2, tal como resultó en un descenso de hasta 8 veces en la producción de IL-4. Esta inhibición fue de magnitud similar a la observada en cultivos derivados de células diferenciadas en la presencia de LPS. En contraposición, la otra cepa de Lactobacillus no tuvo un impacto mesurable en los niveles de IL-4. Interesantemente los niveles de IFN-γ no aumentaron con la adición de ST11 en los cultivos primarios.

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En resumen, el ST11 específicamente distorsiona la producción de IL-4 por parte de los linfocitos CD4+ T que experimentan la diferenciación Th2, pero no incrementa significativamente la secreción de IFN-γ. El hecho de que el ST11 no aumente la producción de IFN-γ puede ser debido a su capacidad de inducir IL-10 con la consecuencia de que puede contener un bajo impacto inflamatorio a pesar de su actividad anti-Th2.

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Consecuentemente, se podría demostrar que el ST11 es una cepa de Lactobacillus que tiene un buen patrón antiTh2 que la hace una excelente candidata para su uso como una bacteria con actividad probiótica y antialérgica. La presente invención ahora se describe a modo de ejemplo.

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Medios y soluciones MRS (Difco),

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Hugo-Jago (Triptona Difco 30 g/l, Extracto de Levadura Difco 10 g/l, Lactosa Difco 5 g/l, KH2 PO4 5 g/l, Extracto de Ternera Difco 2 g/l, agar Difco 2 g/l) M17 (Difco) M199 (Seromed)

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Solución Ringer (Oxoid) PBS (NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, Na2 HPO4 1,15 g/l, KH2 PO4 0,2 g/l) 60

Caldo de triptosa fosfato (Flow) Solución de EDTA-Tripsina (Seromed)

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El rotavirus humano Wa (Serotipo G1) y el rotavirus simio SA 11 (Serotipo G3) se obtuvieron a partir de P.A. Offit, Hospital Infantil de Philadelphia, EEUU. El virus DS-1xRRV reclasificado se obtuvo a partir de A. Kapikian, NIH Bethesda, EEUU. El serotipo 4 del rotavirus humano Hochi se obtuvo a partir de P. Bachmann, Universidad de Munich, Alemania. 5

ES 2 220 420 T3 Ejemplo 1 Aislamiento de bacterias ácido-lácticas a partir de heces de bebés 5

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Se recogieron las heces frescas de pañales de 16 bebés sanos que tenían de 15 a 27 días. Se depositó 1 gramo de heces frescas bajo condiciones anaeróbicas para el transporte al laboratorio y los análisis microbiológicos empezaron en 2 horas tras la toma de muestra mediante diluciones en serie en solución de Ringer y sembrando en un medio selectivo. Agar MRS más antibióticos (fosfomicina 80 µg/ml, sulfametoxazol 93 µg/ml, trimetoprim 5 µg/ml) incubados a 37ºC durante 48 horas se utilizaron para aislar bacterias ácido-lácticas. Las colonias se escogieron aleatoriamente y se purificaron. Se realizó una caracterización genética y fisiológica en los aislados. Ejemplo 2 Ensayo de cepas en cultivo celular para actividad anti-rotaviral

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Algunos géneros de bacterias comprendiendo Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus se seleccionaron y ensayaron para encontrar miembros que mostrasen actividad anti-rotavirus en la prueba de inhibición del cultivo celular. El género Lactococcus se representó por una única especie (Lc. lactis) que consistía en dos subespecies (Lc. lactis subsp. lactis y cremoris). Se ensayaron un total de 30 cepas. El género Streptococcus fue representado por una única especie (S. thermophilus) con 45 cepas. Los géneros Leuconostoc y Propionibacterium fueron representados por una única especie (6 cepas), mientras que los géneros Enterococcus y Staphylococcus fueron representados por dos especies cada uno y un total de 17 cepas. En total se ensayaron 260 cepas bacterianas para la actividad inhibitoria del rotavirus.

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1º protocolo:

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Se mezclaron 30 µl de una suspensión bacteriana (conteniendo una media de 3x106 bacterias) con 70 µl de medio M199 suplementado con un 10% de caldo triptosa fosfato (Flow) y un 5% de una solución tripsina-EDTA (Seromed) (dilución 1:4 en el caso de células HT-29) y 100 µl de virus en medio M199 suplementado. La mezcla de virus y bacterias se incubó durante 1 hora a 4ºC y durante 1 hora a 37ºC. las células de las células de adenomas de colon indiferenciadas HT-29 creciendo como una monocapa confluyente en placas de 96 pocillos microtituladas se lavaron tres veces con un tampón fosfato salino (PBS; pH 7,2). Las mezcla de virus y bacterias se aplicó a las células y las placas microtituladas se incubaron durante 18 h en un incubador CO2 (Heraeus). La replicación del virus se ensayó tal como se describe posteriormente. 2º protocolo:

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Se mezclaron 30 µl de la suspensión bacteriana (supra) con 70 µl de medio M199 suplementado con un 10% de caldo triptosa fosfato (Flow) y un 5% de solución tripsina-EDTA (Seromed) (dilución 1:4 en el caso de células HT29) y se aplicó directamente a las células en las placas microtituladas. Después de una hora de incubación a 37ºC se añadieron 100 µl de virus en medio M199 suplementado a las células de las placas microtituladas. La incubación continuó durante 18 h en un incubador CO2 (Heraeus). Las replicación del virus se ensayó tal como se describe posteriormente.

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La replicación del rotavirus de evaluó mediante tinción histo-inmunológica de las proteínas de rotavirus en células infectadas tal como se describe posteriormente. 50

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Un día después de la infección, el medio de cultivo celular se retiró de las placas microtituladas y las células se fijaron con etanol absoluto durante 10 minutos. El etanol se retiró, y las placas se lavaron tres veces con tampón PBS. Entonces 50 µl de un suero de anti-rotavirus (principalmente dirigido contra la proteína VP6), producido en ratones (obtenida a partir de la ISREC University of Lausanne) y diluida 1:2000 en PBS fue añadido a cada pocillo e incubado durante 1 h a 37ºC con una cubierta para prevenir la desecación de los pocillos. Después se descartó el antisuero y las placas se lavaron tres veces con PBS. Entonces 50 µl del antisuero de la inmunoglobina G anti-conejo (IgG) producida en cabras y acoplada a peroxidasa (GAR.IgG-PO; Nordic) se añadieron en una dilución de 1:500 en PBS a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. El suero se retiró y las placas se volvieron a lavar tres veces con PBS. Entonces 100 µl de la siguiente mezcla sustrato se añadieron a cada pocillo: 10 ml de 0,05 M Trishidrocloruro (pH 7,8), 1 ml de H2 O2 (30% suprapur, diluido 1:600 en H2 O; Merck) y 200 µl de 3-amino-9-etilcarbazol (0,1 g/10 ml de etanol almacenado en alícuotas de 200 µl a -80ºC; A-5754; Sigma). Las placas se incubaron durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. El sustrato se retiró y los pocillos se llenaron con 200 µl de H2 O para parar la reacción. Los focos celulares infectados se contaron con un microscopio invertido (Diavert; Leitz). Sólo unas pocas cepas bacterianas interactuaron con los rotavirus. Simplemente 9 de cada 260 células bacterianas primeramente seleccionadas inhibieron la replicación de los rotavirus en al menos un protocolo. El Lactobacillus paracasei NCC 2461 (ST11) mostró una capacidad extremadamente elevada en contra del rotavirus Serotipo 1, rotavirus SA-11 Serotipo 3 y rotavirus Hochi Serotipo 4.

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ES 2 220 420 T3 Ejemplo 3 Propiedades de ST11 5

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El ST 11 ha sido sometido a incubación en jugo gástrico simulado. El jugo gástrico simulado se preparó mediante la suspensión de pepsina (3 g/l) en salina estéril (0,5% p/v) y ajustando el pH a 2,0 y pH 3, respectivamente con HCl concentrado. ST 11 ha crecido en cantidades variables en el medio anterior y se ha determinado la resistencia de los microorganismos. Los resultados están resumidos en la tabla I posterior. TABLA I

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PH

ufc/ml a T 0

ufc a T 1 min.

ufc a T 15

ufc a T 30

ufc a T 60

2,0

2,0 x 109

1,8 x 109

1,2 x 109

3,7 x 108

7,0 x 103

3,0

2,0 x 109

1,9 x 109

1,7 x 109

1,7 x 109

8,4 x 108

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ST11 tiene las siguientes propiedades tal como está definido de acuerdo con los métodos revelados en el género de las bacterias ácido-lácticas, Ed. B.J.B. Wood and W.H. Holzapfel, Blackie A&P. 25

- gram positivo, - catalasa negativo, - formación NH3 de arginina negativa

30

- producción de CO2 negativa - producción de L(+) ácido láctico 35

- crecimiento en presencia de sales biliares en una concentración de hasta un 0,4%. Ejemplo 4 Crecimiento de ST 11 bajo condiciones diferentes

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ST 11 se incubó a 37ºC en medio a base de tomate (4% de polvo de tomate rehidratado en agua destilada) suplementado con sacarosa (0, 0,5, 1 ó 2%) o peptona de soja (0,5%) o glucosa (0,5%) para diferentes periodos de tiempo. Los resultados se muestran en la figura 2. 45

ST 11 además se añadió en una cantidad de 2,5% a un medio compuesto por harina de arroz (3%), harina de trigo (2%) y sacarosa (3%) y se incubó a 37ºC hasta que se alcanzó un pH de 4,4. Después de enfriar el producto se empaquetó con o sin adición de vitamina C y se almacenó a 10ºC. Ejemplo 5

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Inducción de la síntesis de mRNA de IL-12 e IL-10 en células adherentes de ratón mediante ST11

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Las células de la médula ósea se aislaron a partir del fémur y tibia de ratones C57BL/6 libres de patógeno específicos de 8 semanas de edad y se incubaron a una concentración de 2x106 células/ml en medio RPMI (Gibco) conteniendo un 10% de suero bovino fetal, 1 mM de L-Glutamina, 12 mM Hepes, 0,05 mM 2-mercaptoetanol, 100 U/ml penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (todos los reactivos de Gibco) durante 12 horas a 37ºC en una atmósfera con 5% CO2 . Las células no adherentes se retiran mediante tres lavados consecutivos con medio de cultivo simple y las células adherentes remanentes se cultivaron e incubaron a una concentración de 106 células/ml durante 6 horas en la presencia o ausencia de bacterias. Previamente se determinó que seis horas representan un pico de tiempo óptimo para la síntesis de mRNA de la citoquina por parte de las células adherentes de ratón en respuesta a LPS. Las bacterias se añadieron a diferentes concentraciones desde 109 a 107 ufc/ml. Las bacterias crecieron y se almacenaron tal como se indicó anteriormente (página 8). Al final del periodo de cultivo de 6 horas, las células se aislaron mediante centrifugación y se lisaron utilizando el equipo de reacción TRIzol (GibcoBRL, Cat. No. 15596-018) siguiendo las instrucciones del fabricante. El RNA total se aisló mediante la precipitación con isopropanol y se transcribió reversamente en cDNA durante 90 minutos a 42ºC utilizando 200 U de transcriptasa reversa (Superscript II, BRL) en un volumen de reacción de 40 µl que contiene 200 mM de Tris pH 8,3, 25 mM de KCl, 1µg/ml oligo d(T)15 (Boehringer Mannheim), 1 mM DTT (Boehringer Mannheim), 7

ES 2 220 420 T3 4 mM de cada dNTP (Boehringer Mannheim) y 40 U/ml Rnasina (Promega). Los cebadores y condiciones de la PCR se utilizaron tal como se describió en Kopf et al. (Journal of Experimental Medecine 1996 Sep 1;184(3):1127-36). Cantidades de cDNA se normalizaron en las muestras utilizando cebadores específicos para el mantenimiento del gen (β-2-microglobulina). Los productos PCR se separaron en un gel de agarosa al 2% y las bandas se analizaron bajo UV. 5

Tal como se muestra en la Figura 4, ST11 mostró la inducción más fuerte del mRNA de IL-2 e IL-10, que fue comparable a los niveles observados en el control positivo (E. coli). Las diferencias se aprecian mejor en las concentraciones más bajas de bacterias (107 ufc/ml). 10

Ejemplo 6 Supresión de la síntesis de IL-4 por ST11

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Los linfocitos T CD4+ se purificaron a partir del bazo de ratones BALB/c libres del patógenos específicos utilizando el equipo MiniMACS de Miltenyi Biotec (Cat. No. 492-01). Los linfocitos T CD4+ se cultivaron a una concentración de 2x105 células/ml en medio RPMI conteniendo un 10% de suero bovino fetal, 1 mM L-Glutamina, 12 mM Hepes, 0,5 mM 2-mercaptoetanol, 100 U/ml penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina y se activaron durante una semana por entrecruzamiento con los anticuerpos monoclonales unidos a placa a CD3 (clon 2C11) y CD28 (clon 37.51, ambos anticuerpos de Pharmigen). Durante este primer cultivo, los linfocitos T CD4+ se co-cultivaron con células adherentes de médula ósea (aisladas tal como se describe anteriormente) como células accesorias y con 108 ufc/ml de ST11, ó 108 ufc/ml de Lal, o 1 mg/ml LPS, o medio simple. Después de este tiempo, las células se lavaron y los linfocitos T CD4+ se volvieron a purificar utilizando la tecnología del equipo MiniMACS y se reestimularon en un cultivo secundario que contenía medio simple. Las citoquinas producidas por linfocitos T CD4+ indiferenciadas se midieron en los sobrenadantes después de dos días utilizando un sándwich ELISA (equipos de Endogen y Pharmigen).

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Los resultados se muestran en la Figura 5. Las células diferenciadas en la presencia de medio simple mostraron un fenotipo Th2 dominante caracterizado por elevados niveles de IL-4. La adición de ST11 a los primeros cultivos moduló fuertemente el resultado de la diferenciación Th2, así resultó en un descenso 8 veces en la producción de IL-4. Esta inhibición fue de similar magnitud a la observada en cultivo derivados de células diferenciadas en presencia de LPS. En contraposición, la otra cepa Lactobacillus no tuvo un impacto mesurable en los niveles de IL-4. Interesantemente, los niveles IFN-γ no aumentaron hasta la adición de ST11 en los cultivos primarios. Tal como se puede ver anteriormente, las cepas de la presente invención pueden estar bien preparadas para la producción de un alimento y/o vehículo farmacéutico sacando provecho de las propiedades valiosas de estos microorganismos. Ejemplo 7

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La cepa ST11 se ensayó en un ensayo clínico en una comunidad en las afueras de la ciudad de Guatemala para dilucidar su capacidad para influenciar la transmisión y padecimiento de diarrea aguda de la estación lluviosa experimentada por muchos de los niños en esa zona. Un total de 203 niños, con edades comprendidas de los 35 a 70 meses participaron en el estudio y recibieron una dosis objetivo de 1010 organismos viables (ST11) o ninguna (placebo) durante un periodo de alimentación de 29 días. Los niños seleccionados tanto para la muestra como para el placebo, respectivamente, tuvieron el típico déficit en peso por edad y altura por edad característicos debido a la desnutrición.

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Antes de iniciar el ensayo de alimentación en niños preescolares, se realizó una evaluación de la seguridad basada en estudios in vivo e in vitro. Los estudios in vitro mostraron un patrón de resistencia a antibióticos similar a aquellos de los otros lactobacilli utilizados en aplicaciones alimenticias, y ningún potencial para la formación de aminas biogénicas, para degradar la mucina y para desconjugar las sales biliares. En un estudio clínico controlado con placebo que implicó a 42 voluntarios adultos, ST11 fue bien tolerado y no indujo ningún efecto adverso, entre las potenciales manifestaciones monitorizadas, tales como, flatulencia, número de deposiciones por día y consistencia de las heces; los niveles de proteínas de fase aguda en el suero no supusieron ninguna preocupación respecto a la potencial reacción inflamatoria. Las muestras y los placebos han sido empaquetados en sobres en la instalación de fabricación del Centro de Tecnología de Productos Nestlé en Konolfingen, Suiza, y enviado en barco refrigerado a Guatemala. Cada sobre de 10 g consistía en un vehículo de sabor chocolate y 0,2 g de ST11 (1010 ufc) o, en caso de placebo, 0,2 g de leche en polvo. El vehículo con sabor de chocolate consistía en polvo de cacao, azúcar, lecitina de soja, vainilla y canela. Los sobres se almacenaron a 4ºC a 6ºC hasta dos horas antes de su uso. Antes del uso el sobre tenía que ser disuelto en 100 ml de agua proporcionados por Nestlé, que estaba libre de cualquier contaminación bacteriana. De acuerdo con el protocolo aplicado, la diarrea se definió como el advenimiento de tres o más evacuaciones fecales informes o líquidas durante un periodo de 24 horas. Un episodio de diarrea se definió como un suceso que presenta la evidencia de diarrea (3 evacuaciones diarreicas en 24 horas). Su duración total en horas se calculó desde el momento del primero de los tres indicios de heces hasta la aparición de la primera deposición con forma o un periodo de 24 horas sin ninguna defecación. Para considerar que un niño sufre un “nuevo” episodio, deben haber pasado 48 horas desde la finalización del episodio primario. Si no, es considerado como una continuación del mismo episodio y la duración total entonces se utiliza para la evaluación. Un caso consistía en un niño que experimentó uno o más 8

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episodios documentados de diarrea durante un periodo de observación de 29 días. La intensidad de un episodio de diarrea se basaba en el número total de defecaciones blandas producidas. Los elementos de gravedad del episodio abarcaban la presencia de sangre, moco o pus en las heces, junto con los síntomas de fiebre y vómito. Una intensidad de 7 deposiciones por 24 horas o la necesidad de la intervención por parte de un profesional sanitario en un hospital, centro de salud o centro clínico también clasificaba al episodio como grave. Cuando se diagnosticaba un episodio de diarrea a través del sistema de vigilancia, se recogía una muestra de las heces diarreicas para el examen microscópico y el cultivo para identificar los potenciales patógenos etiológicos de aquel episodio. La muestra se diagnosticó por el antígeno de rotavirus, Giardia, y E. histolytica, en caso de que la muestra fuera disentérica, y para los patógenos bacterianos incluyendo Shigella, Salmonella, Aeromonas, Plesiomonas shigelloides, E. coli y posiblemente V. cholerae. Durante el periodo de investigación se recogieron las muestras de producto para examinar la viabilidad de los microorganismos incluyendo el periodo de administración. Se puede demostrar que el microorganismo se mantuvo viable en los sobres durante todo el estudio de tal manera que al final del estudio los sobres eran capaces de llevar 1010 microorganismos viables hasta la reconstitución con agua. El estudio reveló que la muestra que contenía el microorganismo probiótico podía disminuir el advenimiento de diarrea en contraposición con el grupo control (placebo) en un 30%. Aún más, el grupo control también exhibió un número decrecido de episodios de diarrea sobre la población normal que no recibía ninguna de las muestras o placebo, respectivamente. Este último descubrimiento puede ser en parte explicado basándonos en que los niños recibieron una nutrición valiosa adicional y agua libre de contaminación. Sin embargo, desde que el estudio se realizó en el campo se dedujo claramente que ST11 puede seguramente reducir el advenimiento de diarrea in vivo.

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ES 2 220 420 T3 REIVINDICACIONES 1. Una cepa de Lactobacillus paracasei que es el Lactobacillus paracasei CNCM I-2116. 5

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2. El uso de la cepa de Lactobacillus de acuerdo con la reivindicación 1 para la preparación de un soporte material ingerible. 3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la cepa Lactobacillus está contenida en un soporte material en una cantidad de desde unos 105 ufc/g a 1012 ufc/g de soporte material. 4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en donde el material de soporte es un compuesto alimenticio seleccionado de leche, yoghurt, cuajada, queso, leches fermentadas, productos a base de leche fermentada, helados, productos a base de cereales fermentados, leches en polvo, fórmulas infantiles.

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5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en donde el soporte material es utilizado para el tratamiento y/o prevención de trastornos asociados con la diarrea. 6. Comida o composición farmacéutica que contiene al menos una cepa de Lactobacillus de acuerdo con la reivindicación 1. 7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, que es seleccionada a partir de leche, yoghurt, cuajada, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, helados, productos basados en cereales fermentados, leches en polvo, fórmulas infantiles, comprimidos, suspensiones líquidas bacterianas, suplementos orales secos, suplementos orales húmedos, alimentación seca en tubo o alimentación húmeda en tubo.

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