PO L SK IE TOWA R Z YST WO MIK RO B IO LOGÓW Kwartalnik Tom 55 Zeszyt

1•2016

STYCZE¡ – MARZEC

CODEN: PMKMAV 55 (1) 2016

Advances in Microbiology

Index Copernicus ICV = 98,38 (2014) Impact Factor ISI = 0,286 (2014) Punktacja MNiSW = 15,00 (2014)

http://www.pm.microbiology.pl

http://www.pm.microbiology.pl

RADA REDAKCYJNA JACEK BARDOWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), DARIUSZ BARTOSIK (Uniwersytet Warszawski), JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), NADZIEJA DRELA (Uniwersytet Warszawski), EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), MAREK JAKÓBISIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), JACEK MIĘDZOBRODZKI (Uniwersytet Jagielloński), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski), ANTONI RÓŻALSKI (Uniwersytet Łódzki), ALEKSANDRA SKŁODOWSKA (Uniwersytet Warszawski), RADOSŁAW STACHOWIAK (Uniwersytet Warszawski), BOHDAN STAROŚCIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), BOGUSŁAW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdański), ELŻBIETA TRAFNY (Wojskowa Akademia Techniczna), STANISŁAWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Państwowy Zakład Higieny), GRZEGORZ WĘGRZYN (Uniwersytet Gdański), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski) REDAKCJA JACEK BIELECKI (redaktor naczelny), BOHDAN STAROŚCIAK (zastępca), RADOSŁAW STACHOWIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich) ADRES REDAKCJI Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel. (22) 554 13 12; fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected] Redaktorzy: Redaktor naczelny: Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel. (22) 554 13 04; fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected] Zastępca: Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa; tel.: (22) 628 08 22, (22) 621 13 51 e-mail: [email protected] Sekretarz: Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel. (22) 554 13 12; fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected] PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie) Adres Redaktora działu Publikacje Metodyczne i Standardy ul. Malinowa 11, 72-003 Wołczkowo tel. 605031324; fax (91) 3113186; e-mail: [email protected] lub [email protected] STALI RECENZENCI: JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), JÓZEF KUR (Politechnika Gdańska), EUGENIUSZ MAŁAFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki), ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wrocławiu) ISBN 978 - 83 - 923731 - 3 - 1 Informacja o zdjęciu na okładce: Komórki Neisseria gonorrhoeae, mutant szczepu FA1090. Preparatyka: dr Agnieszka Kwiatek, Zakład Wirusologii, Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski. Zdjęcie: mgr Paweł Bącal, Pracownia Teorii i Zastosowań Elektrod, Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski. Obraz SEM uzyskano przy użyciu aparatury zakupionej w ramach projektu CePT POIG.02.02.00-14-024/08-00. P O L S K I E T O WA R Z Y S T W O M I K R O B I O L O G Ó W Nakład 1150, Objętość 16 ark. wyd., Papier offset 90 g Skład i druk: Zakład Wydawniczy Letter Quality, tel.: 22 115 38 10, 607 217 879 e-mail: [email protected]; projekt okładki: Jerzy Grzegorkiewicz

NOWOCZESNE METODY ZWALCZANIA BIOFILMU BAKTERYJNEGO

POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 3–11 http://www.pm.microbiology.pl

Magdalena Maciejewska1, 2, Marta Bauer2, Małgorzata Dawgul2* 1  Laboratorium Farmaceutyczne AVENA Sp.j., Osielsko  Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej, Wydział Farmaceutyczny, Gdański Uniwersytet Medyczny

2

Wpłynęło w lipcu 2014 r. Zaakceptowano w listopadzie 2015 r.

1. Wstęp. 2. Etapy powstawania biofilmu, a oporność na antybiotyki. 3. Strategie zapobiegania tworzenia się biofilmu. 3.1. Celowanie w  początkową fazę rozwoju biofilmu. 3.1.1. Związki niskocząsteczkowe (Small Molecules). 3.1.2. Ingerencja w quorum sensing. 3.1.3. Przeciwciała. 3.1.4. Biofilm drobnoustrojów niepatogennych. 3.2. Modyfikacja biomateriałów w celu zwiększenia ich odporności na adhezję drobnoustrojów. 3.2.1. Materiały antyadhezyjne. 3.2.2. Powłoki bakteriobójcze/bakteriostatyczne. 4. Metody eradykacji biofilmu. 4.1.  Fizyczne metody eradykacji biofilmu. 4.2. Biologiczne metody eradykacji biofilmu. 4.3. Chemiczne metody eradykacji biofilmu. 5. Peptydy przeciwdrobnoustrojowe. 6. Podsumowanie Novel methods of bacterial biofilm elimination Abstract: Bacterial biofilm is defined as a sessile, tridimensional microbial community composed of bacteria immersed in a polysaccharide matrix. The structures can grow on human tissues or medical devices resulting in biofilm related infections, which are very often impossible to treat with the commonly used antibiotics. Due to their resistance to the conventional antimicrobial therapy, efficient methods of treatment as well as prophylaxis need to be developed. Biofilm formation can be reduced by inhibiting the process of adhesion and by interfering with quorum sensing system. Very promising is also the application of appropriate antibodies or use of non-pathogenic bacterial strains. Another approach focuses on the surface modifications in order to obtain the resistance to microbial colonization. Disruption of mature structures can be achieved by several physical, chemical and biological methods. The novel approaches, which are currently being under intensive investigation, include: phage therapy, matrix targeting enzymes, photodynamic therapy and antimicrobial peptides. The above-mentioned strategies are described in the presented work with a special focus on antimicrobial peptides as the potential tool for prophylaxis as well as elimination of mature biofilms. 1. Introduction. 2. Stages of biofilm formation and the resistance to antibiotics. 3. Strategies of prevention of biofilm formation. 3.1. Targeting the initial phase of biofilm formation. 3.1.1. Small Molecules. 3.1.2. Interference in quorum sensing. 3.1.3. Antibodies. 3.1.4. Biofilm of nonpathogenic microorganisms. 3.2. Modification of biomaterials for increased resistance to microbial adhesion. 3.2.1. Anti-adhesive materials. 3.2.2. Bacteriostatic/bactericidal coatings. 4. Methods for biofilm eradication. 4.1. Physical methods for biofilm eradication. 4.2. Biological methods for biofilm eradication. 4.3. Chemical methods for biofilm eradication. 5. Antimicrobial peptides. 6. Conclusions Słowa kluczowe: biofilm, eradykacja biofilmu, hamowanie rozwoju biofilmu, infekcje związane z biofilmem Key words: biofilm, biofilm elimination, biofilm growth inhibition, biofilm related infections

1. Wstęp Istotną rolę w patogenezie zakażeń związanych ze stosowaniem biomateriałów odgrywa zdolność bakterii do tworzenia biofilmu. Biofilmem nazywane są przylegające do powierzchni stałych, zorganizowane struktury, utworzone przez otoczone warstwą egzopolisacharydu komórki drobnoustrojów należących do jednego, kilku, a nawet kilkunastu gatunków [75]. W  porównaniu do komórek wolnopływających, mikroorga­ nizmy rosnące w populacji biofilmu są znacznie mniej wrażliwe na działanie antybiotyków, antyseptyków oraz mechanizmów obronnych organizmu ludzkiego. W  związku z powyższym, infekcje związane z  biofilmem są przyczyną licznych komplikacji terapeutycznych. Poza tym, często przechodzą w stan przewlekły i nawracają po wyleczeniu.

Dynamiczny rozwój w dziedzinie biomateriałów znacząco przyczynił się do poprawy jakości życia pacjentów, jednakże jest także przyczyną zwiększonego ryzyka rozwoju infekcji związanych z biofilmem. Niezależnie od stopnia zaawansowania implantów biomedycznych, czy produktów inżynierii tkankowej, stanowią one potencjalną powierzchnię dla kolonizacji drobnoustrojów. Szacuje się, że ok. 60–70% zakażeń szpitalnych jest wynikiem tworzenia się biofilmu na powierzchni stosowanych materiałów medycznych, m.in. implantów sercowych, cewników, rozruszników serca, protez naczyniowych oraz ortopedycznych [10]. Zdolność do adhezji, kolonizacji powierzchni, a  w  konekwencji do formowania biofilmu wykazuje szerokie spektrum drobnoustrojów. Do najpowszechniejszych szczepów tworzących biofilm na powierzchni biomateriałów zalicza się: Enterococcus faecalis,

*  Autor korespondencyjny:  Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej, Wydział Farmaceutyczny, Gdański Uniwersytet Medyczny, Hallera 107, 80-416 Gdańsk; tel. 58 349 1488; fax 58 349 1624; e-mail: [email protected]

4

MAGDALENA MACIEJEWSKA, MARTA BAUER, MAŁGORZATA DAWGUL

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Strep­ tococcus viridans, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis i Pseudomonas aeruginosa [18]. S. aureus i S. epidermidis są najczęściej występującymi szczepami na implantach sercowo-naczyniowych [54, 55]. Szacuje się, że są odpowiedzialne za ok. 40–50% infekcji sercowo-naczyniowych związanych z  biofilmem oraz za ok. 50–70% infekcji związanych z  tworzeniem się biofilmu na cewnikach [2]. Występowanie szczepów E. faecalis związane jest z  rozwojem infekcji u pacjentów z wkłuciem cen­ tral­nym lub wentylowanych mechanicznie. Poza tym bakterie tego gatunku często są izolowane od chorych z  wprowadzonymi implantami ortopedycznymi. Biofilmy formowane przez E. faecalis i S. viridans odpowiadają za występowanie zapalenia wsierdzia [6]. Natomiast drobnoustroje Gram-ujemne są najczęstszymi czynnikami etiologicznymi zakażeń układu moczowego oraz infekcji związanych z wykorzystaniem cewników urologicznych [13]. 2. Etapy powstawania biofilmu, a oporność na antybiotyki Powstawanie biofilmu jest procesem złożonym i wieloetapowym (Rys. 1). Etapem inicjującym jest proces adhezji pojedynczych komórek do powierzchni biomateriałów, ciał obcych oraz tkanek. Następnie dochodzi do proliferacji kolonizujących komórek oraz produkcji pozakomórkowej substancji polisacharydowej (EPS, extracellular polymeric substance). Warstwa nierozpuszczalnych egzopolimerów ułatwia adhezję kolejnych bakterii do podłoża oraz stanowi barierę ochronną, zabezpieczającą mikroorganizmy przed niekorzystnymi

warunkami środowiska (np. działaniem antybiotyków) oraz odpowiedzią humoralną gospodarza. Podczas fazy dojrzewania biofilmu dochodzi do zmian ekspresji genów oraz metabolizmu drobnoustrojów położonych wewnątrz zorganizowanej populacji. Może dojść do aktywacji genów kodujących enzymy rozkładające leki lub kodujących białka wypompowujące leki z komórek bakteryjnych (drug effux pumps). Maleje tempo wzrostu i metabolizm drobnoustrojów. Proces formowania biofilmu jest kontrolowany poprzez mechanizm oceny liczebności (quorum sensing) – unikalny system komunikacji międzykomórkowej zwiększający zdolności adaptacyjne biofilmu. W końcowym etapie dojrzewania biofilmu komórki bakteryjne odczepiają się od struktury, aby rozpocząć proces ekspansji nowych powierzchni. Dojrzałe struktury wykazują znacznie zmniejszoną wrażliwość na stosowane środki przeciwdrobnoustrojowe, a nieprawidłowo przeprowadzona antybiotyko­ terapia może być przyczyną rozwoju subpopulacji bak­ teryjnych komórek przetrwałych (persister cells), które po zakończeniu leczenia umożliwiają odnowienie populacji biofilmu [38, 52]. Problemy terapeutyczne wynikające z rozwoju infekcji związanych z biofilmem są przyczyną poszukiwania i rozwoju nowych metod eliminacji, jak i profilaktyki tego typu zakażeń. 3.  Strategie zapobiegania tworzenia się biofilmu Ograniczenie ryzyka rozwoju biofilmu na powierzchni biomateriałów stanowi jeden z podstawowych celów grup badawczych poszukujących skutecznych strategii profilaktyki infekcji związanych z biofil-

Rys. 1.  Etapy formowania biofilmu

NOWOCZESNE METODY ZWALCZANIA BIOFILMU BAKTERYJNEGO

mem [14, 66]. Główne podejścia zakładają modyfikacje powierzchni materiałów celem ograniczenia adhezji drobnoustrojów oraz ingerencję w początkowe fazy rozwoju biofilmu. 3.1. Celowanie w początkową fazę rozwoju biofilmu 3.1.1. Związki niskocząsteczkowe (Small Molecules) W ostatnich latach wiele ośrodków naukowych skupiło swoją uwagę na związkach niskocząsteczkowych zdolnych do hamowania rozwoju biofilmu. Zidentyfikowano m.in. szereg związków, które po­przez inhibicję genów odpowiedzialnych za ekspresję czynników wirulencji szczepów, takich jak Streptococcus pyogenes i S. aureus, powodują zahamowanie formowania się ich biofilmów [41, 66]. Wykazano, że produkowany przez szczep P. aeruginosa, kwas cis-2-decylenowy posiada zdolność eradykacji dojrzałego biofilmu bakterii z gatunku E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, S. pyogenes, Bacillus subtilis, S. aureus i  Candida albicans [16]. Podobne działanie wykazują produkowane przez bakterie D-aminokwasy. Mechanizm działania D-aminokwasów na rozwijający się biofilm nie został dotychczas wyjaśniony, jednak związki te okazały się skuteczne w hamowaniu tworzenia się biofilmu przez szczepy: S. aureus i P. aeruginosa [36]. Poprzez hamowanie rozwoju egzopolisacharydu N-acetylocysteina skutecznie zapobiega tworzeniu się biofilmu S. epidermidis [58]. Kationy metali, tj. Ca2+ i  Mg2+, biorąc udział w adhezji drobnoustrojów do powierzchni, pełnią ważną rolę w procesie formowania biofilmu. Użycie związków chelatujących umożliwia inhibicję rozwoju biofilmu [1]. Liczba aktywnych związków należących do omawianej grupy stale rośnie, w związku z czym stanowią one istotny aspekt poszukiwań nowych metod walki z biofilmem. Poza poszukiwaniem nowych cząsteczek trwają badania mechanizmu działania wyżej wymienionych substancji o potwierdzonych zdolnościach do hamowania rozwoju biofilmu. Związki poddawane są także ocenie ich właściwości farmakokinetycznych [14]. 3.1.2.  Ingerencja w quorum sensing Quorum sensing jest chemicznym sposobem komunikacji drobnoustrojów. Mikroorganizmy wytwarzają i wydzielają do otoczenia substancje sygnałowe, które służą m.in. do skoordynowanej regulacji ekspresji genów, których produkty zaangażowane są m.in. w proces tworzenia się biofilmu [45]. W ostatnich latach podejmowane są próby ingerencji w system quorum sensing w celu niedopuszczenia do wytworzenia się biofilmu [25]. Strategia ta opiera się na stosowaniu naturalnych lub syntetycznych analogów substancji sygnałowych wykazujących zdolność do: hamowania ich syntezy lub uwalniania, blokowania przekazu i odbioru sygnałów

5

poprzez receptory wewnątrz komórek drobnoustrojów oraz ich syntetycznej lub enzymatycznej inaktywacji [30, 76]. Badania Zimmermana i wsp. wykazały zdolność laktonu N-(3-oksododekanylo)-L-homoseryny (3OC12-HSL) do stymulacji immunologicznej odpowiedzi komórkowej poprzez chemotaksję neutrofili in vitro. 3OC12-HSL jest syntetyzowana przez P. aeruginosa i odpowiedzialna za zjawisko quorum sensing. Wyniki badań potwierdziły udział komunikacji międzykomórkowej w procesie tworzenia się biofilmu [78]. Hamowanie komunikacji szczepów tworzących biofilm stanowi obiecujący kierunek poszukiwań skutecznej terapii. Jednakże zastosowanie blokowania systemu QS stwarza także pewne trudności ze względu na specyfikę działania. Niskocząsteczkowe związki sygnałowe są charakterystyczne dla poszczególnych grup mikroorganizmów, a jeden szczep może wytwarzać kilka rodzajów takich cząsteczek [45]. Poza tym, inhibitory systemu QS zazwyczaj nie oddziałują na inne procesy życiowe drobnoustrojów, co znacznie ogranicza ich zastosowanie jako samodzielnej terapii. Dlatego prowadzone są badania w kierunku wykorzystania inhibitorów QS jako uzupełnienia leczenia konwencjonalnego [22]. 3.1.3. Przeciwciała Jedną z obiecujących strategii ograniczania kolonizacji biomateriałów jest stosowanie przeciwciał wiążących adhezyny produkowane przez drobnoustroje. Jak wcześniej wspomniano, jednym z najczęstszych czynników etiologicznych zakażeń spowodowanych stosowaniem materiałów medycznych jest S. epidermidis. Kolonizacja często jest przyczyną rozwoju trudnych w  leczeniu infekcji i może prowadzić do niszczenia zaaplikowanych biomateriałów. Formowanie biofilmu przez S. epidermidis wymaga obecności białka AAP, tzw. białka akumulacji. W  badaniach przeprowadzonych w warunkach in vitro wykazano, że użycie odpowiednich przeciwciał monoklonalnych efektywnie hamuje proces tworzenia się biofilmu poprzez blokowanie wyżej wymienionego czynnika [26]. Najnowsze dane dotyczące zagadnienia molekularnych mechanizmów formowania biofilmu wskazują, iż proces ten związany jest z makrocząsteczkami błony komórkowej drobnoustrojów. Uważa się, że mogą one stanowić kolejne miejsce docelowe działania przeciwciał. Przypuszczalnie ich zastosowanie zaburza interakcje na poziomie komórka drobnoustroju –  powierzchnia kolonizowana oraz oddziaływania pomiędzy komórkami bakteryjnymi, co ingeruje w proces adhezji. Wykorzystanie przeciwciał nie prowadzi do śmierci drobnoustrojów, a tym samym nie indukuje silnej odpowiedzi układu immunologicznego gospodarza. Zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko makrocząsteczkom błony komórkowej drobnoustrojów wydaje się więc obiecującym rozwiązaniem [65].

6

MAGDALENA MACIEJEWSKA, MARTA BAUER, MAŁGORZATA DAWGUL

3.1.4.  Biofilm drobnoustrojów niepatogennych Innym sposobem zabezpieczającym przed rozwojem infekcji „odbiomateriałowych” jest zastosowanie interferencji bakteryjnej. Metoda ta jest rozpatrywana przede wszystkim pod kątem zapobiegania infekcjom układu moczowego. Głównym założeniem jest wykorzystanie szczepu niepatogennego do wytworzenia biofilmu na materiale wprowadzonym do organizmu pacjenta. Wykazano, że fragmenty cewnika urologicznego inkubowane wcześniej w zawiesinie komórek szczepu niepatogennego są odporne na kolonizację in vitro przez uropatogeny. Pierwsze próby przeprowadzone in vivo dotyczyły osób z uszkodzonym rdzeniem kręgowym, które wymagały cewnikowania. Doświadczenie polegało na wprowadzeniu niepatogennego szczepu E. coli do pęcherza moczowego pacjenta. Stwierdzono, że zabieg nie spowodował rozwoju infekcji, a metoda wykazała skuteczność w redukcji częstości zakażeń [68]. 3.2. Modyfikacja biomateriałów w celu zwiększenia ich odporności na adhezję drobnoustrojów 3.2.1.  Materiały antyadhezyjne Właściwości fizykochemiczne wykorzystanych biomateriałów mają bardzo istotny wpływ na zdolności mikroorganizmów do tworzenia biofilmu. Zależą od nich między innymi rodzaj i liczba bakterii przylegających do powierzchni. W związku z powyższym prowadzone są intensywne badania mające na celu opracowanie materiałów o optymalnych właściwościach ograniczających ryzyko adhezji mikroorganizmów. Właściwości powierzchni biomateriałów można modyfikować poprzez aplikację powłok antyadhezyjnych, zmianę ładunku powierzchniowego, struktury, jej chropowatości, aktywności chemicznej oraz właści­ wości hydrofilowych i hydrofobowych [9, 67, 69]. Istotny wpływ na przyleganie komórek do po­ wierzchni mają właściwości hydrofobowe biomateriału. Zastosowanie nanostruktur fluorowanych koloidów krzemionkowych jako syntetycznej, silnie hydrofobowej powłoki na powierzchniach szklanych skutecznie zredukowało stopień przylegania komórek S. aureus i  P. aeruginosa [59]. Niska energia powierzchniowa oraz hydrofobowość powierzchni są przyczynami zmniejszonej adsorpcji białek i adhezji drobnoustrojów. Tekstura biomateriałów również jest istotnym czynnikiem wpływającym na interakcje bakterii z kolonizowaną powierzchnią. Wyniki wielu badań potwierdziły istotny wpływ wysokiej chropowatości powierzchni biomateriałów na stopień adhezji drobnoustrojów [28, 46, 69]. Stopień adhezji i rozwój S. epidermidis na tytanowych szorstkich powierzchniach były znacząco wyższe w  porównaniu do tych samych, ale gładkich, polerowanych powierzchni [73]. Zdolności przylegania do powierzchni o różnym stopniu gładkości są jednak zależne od gatunku drobnoustroju. W przypadku

S. aureus zaobserwowano zwiększone przyleganie do powierzchni tytanowej poddanej mechaniczno-chemicznej obróbce i polerowaniu [69]. Wiele doniesień literaturowych dotyczy wykorzystania powłok antyadhezyjnych. Znaczące zahamowanie wiązania komórek biofilmu S. epidermidis zaobserwowano na stalowych i tytanowych biomateriałach z nanopowłoką TMS-trimetylosilkanu, natomiast powlekanie tytanowych biomateriałów PEG (polietylenoglikolem) zredukowało adhezję szczepu S. aureus [24, 40]. Xu i wsp. wykazali, że submikronowa (400–500 nm) warstwa poli(uretano-mocznika) ogranicza powierzchnię biomateriałów dostępną dla bakterii, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo rozwoju biofilmu, zwłaszcza S. epidermidis i S. aureus [74]. Obiecującą strategią zabezpieczającą przed tworzeniem się biofilmu jest pokrycie powierzchni biomateriałów tzw. szczotkami polimerowymi. Powłokę tworzą długie łańcuchy hydrofilowych polimerów związanych z powierzchnią i eksponowanych do otoczenia [11, 63]. Najczęściej stosowanymi powłokami tego typu są szczotki wykonane z politlenku etylenu (PEO) [27]. Wyniki badań wykazały znaczące zmniejszenie adsorpcji protein i  przylegania bakterii, potwierdzając tym samym ich skuteczność w  profilaktyce rozwoju biofilmu [61, 62]. W warunkach in vivo wyniki z użyciem PEO nie były zadowalające ze względu na niską trwałość materiału oraz na wysoką podatność na uszkodzenia oksydacyjne. Cechy te uniemożliwiają zastosowanie powłok PEO w obecnej formie w warunkach in vivo [63]. Lellouche i wsp. wykazali, że powlekanie fragmentów cewnika Foley’a za pomocą fluorku itru pozwala ograniczyć adhezję i wpływa na redukcję dojrzałego biofilmu tworzonego przez szczepy E. coli i S. aureus. Stwierdzono istotny wpływ wielkości cząsteczek zastosowanego związku chemicznego na jego właściwości przeciwbakteryjne. Największą efektywność działania uzyskano stosując powlekanie fluorkiem itru w postaci nanocząstek [39]. Zastosowanie powłok antyadhezyjnych jest bardzo skuteczną metodą zapobiegania tworzenia się biofilmu in vitro na wczesnych etapach jego rozwoju. W warunkach in vivo skuteczność tego typu powłok jest uzależniona od złożonych interakcji między powierzchnią biomateriału, a komórkami drobnoustrojów oraz organizmu ludzkiego, które mogą obniżać efektywność stosowanej metody. W związku z powyższym niezbędna jest kontynuacja badań mających na celu optymalizację powłok i ostatecznie umożliwienie wykorzystania tej obiecującej strategii zapobiegania rozwojowi infekcji związanych z biofilmem [14]. 3.2.2.  Powłoki bakteriobójcze/bakteriostatyczne Obiecującą strategią stosowaną w walce z zakażeniami towarzyszącymi stosowaniu biomateriałów jest stosowanie powłok wykazujących właściwości bakte-

NOWOCZESNE METODY ZWALCZANIA BIOFILMU BAKTERYJNEGO

riostatyczne lub bakteriobójcze [57]. Do impregnacji materiałów biomedycznych wykorzystywano między innymi konwencjonalne antybiotyki. Wykazano, że powierzchnie tytanowe biomateriałów kowalencyjnie związane z  wankomycyną skutecznie hamują rozwój biofilmu S. epidermidis [5]. S. aureus natomiast był skutecznie eliminowany z powlekanych gentamycyną protez bezcementowych stosowanych w arteroplastyce [52]. Powlekanie materiałów medycznych antybiotykami może stanowić skuteczną profilaktykę zakażeń towarzyszących stosowaniu biomateriałów. Należy jednak pamiętać, że stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działania niesie za sobą ryzyko rozwoju szczepów wieloopornych. Rozwiązaniem alternatywnym jest stosowanie powłok wykonanych z metali szlachetnych. Wykazano, że pokrycie zaczepów aparatów ortodontycznych jonami srebra skutecznie hamuje wzrost drobnoustrojów odpowiedzialnych za rozwój próchnicy zębów i paradontozy w warunkach in vitro. Poza tym, powłoka spowodowała redukcję ilości komórek tworzących biofilm Streptococcus sorbinus na fragmentach zaczepów [47]. Komercyjnie dostępne są cewniki urologiczne powlekane srebrem. Wyniki badań sprzed kilku lat sugerowały ich wysoką skuteczność przeciwdrobnoustrojową i odporność na kolonizację bakteryjną. Ostatnie doniesienia wskazują jednak, że zastosowanie powłoki srebrowej nie powoduje statystycznie istotnej redukcji częstości infekcji związanych z wykorzystaniem cewników [60]. 4.  Metody eradykacji biofilmu W sytuacjach, kiedy profilaktyka zawodzi, dochodzi do kolonizacji stosowanych biomateriałów i  rozwoju infekcji związanych z biofilmem. W związku z  tym, że wiele, do tej pory rutynowo stosowanych środków przeciwdrobnoustrojowych jest nieskutecznych w zwalczaniu tego typu infekcji, stanowią one bezpośrednie zagrożenie dla życia pacjentów. Stwarza to potrzebę rozwoju nowych strategii zwalczania zakażeń związanych z biofilmem. Dotychczas stosowane i opracowywane metody mające na celu eradykację biofilmu bakteryjnego można zaklasyfikować do 3 grup: metod fizycznych, biologicznych oraz chemicznych. 4.1.  Fizyczne metody eradykacji biofilmu Podstawową metodą fizyczną, która wykazuje wysoką skuteczność, jest mechaniczne niszczenie struktury biofilmu. Oczyszczanie powierzchni można przeprowadzić poprzez szorowanie lub skrobanie. Wadą tych działań jest niewielka uniwersalność zastosowania wynikająca z różnej budowy kolonizowanych materiałów i urządzeń.

7

Inną metodą fizyczną jest zastosowanie wysokiej temperatury. Potwierdzono, że biofilm poddany działaniu temperatury powyżej 95°C przez 100 min. ulega całkowitemu zniszczeniu. Podobną efektywność uzyskuje się poprzez wykorzystanie niskich temperatur. Cykl trzykrotnego zamrażania (–12°C) i rozmrażania struktury bakteryjnej powoduje jej eliminację. Prowadzone są badania nad możliwością zastosowania fal ultradźwiękowych. Do tej pory wiadomo, że ich działanie polega głównie na redukcji ilości komórek bakteryjnych, które uległy adhezji [7, 50]. Podejmowane są także próby eliminacji biofilmu przez zastosowanie pola elektrycznego. Według literatury wykorzystanie prądu o niskim natężeniu, generowanego przez elektrody przewodzące, zwiększa przepuszczalność błony komórkowej bakterii dla substancji przeciwdrobnoustrojowych. Dodatkowo, potwierdzono hamujący wpływ pola elektrycznego na wzrost mikroorganizmów. Testy z zastosowaniem pola elektrycznego o niskim natężeniu dały obiecujące wyniki w stosunku do szczepów S. aureus i P. aeruginosa [21]. Duże nadzieje pokłada się w metodach wykorzystujących zimną plazmę będącą mieszaniną wolnych rodników, jonów, wzbudzonych cząsteczek i  promieniowania UV. Dokładny mechanizm oddziaływania strumienia plazmy z komórką bakteryjną nie został jeszcze poznany. Przypuszcza się, że istnieją 3 główne drogi działania: dezorganizacja błony komórkowej, niszczenie białek wewnątrzkomórkowych i  niszczenie struktury DNA [42]. Interesującą alternatywą jest także terapia fotodynamiczna. Jej działanie polega na zastosowaniu związków fotouczulających, które po aktywacji światłem wykazują działanie cytotoksyczne poprzez generowanie reaktywnych form tlenu. Terapia fotodynamiczna wykazała wysoką skuteczność w zwalczaniu infekcji przyzębia [8]. Efektywność terapii potwierdzono także w stosunku do szczepów z rodzaju Enterococcus, Escherichia, Staphylococcus i  Klebsiella wyizolowanych od pacjentów z głębokimi ropniami tkanek [23]. Terapia fotodynamiczna okazała się również dobrym narzędziem w eradykacji in vitro metycylinoopornych szczepów S. aureus [77]. Prowadzone są również badania nad zmniejszaniem szkodliwości terapii fotodynamicznej. Dobrym rozwiązaniem wydaje się być zastosowanie terapii fotodynamicznej w kombinacji z nanocząsteczkemi srebra. Metoda efektywnie redukowała ilość komórek S. aureus w testach in vitro [51]. 4.2.  Biologiczne metody eradykacji biofilmu Spośród intensywnie badanych metod biologicznych eradykacji biofilmu najbardziej obiecującą wydaje się fagoterapia, polegająca na wykorzystaniu wirusów atakujących bakterie. Potwierdzono wysoką aktywność bakteriofagów w stosunku do drobnoustrojów

8

MAGDALENA MACIEJEWSKA, MARTA BAUER, MAŁGORZATA DAWGUL

Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Z powodzeniem od lat wykorzystywane są w leczeniu eksperymentalnym zakażeń szczepami m.in. z rodzaju Salmonella, Proteus, Staphylococcus, Enterococcus, Escherichia i  Enterobacter. Doświadczenie przeprowadzone na modelu zwierzęcym z rozwiniętą infekcją E. coli wykazało wyższą skuteczność jednorazowego podania fagów niż serii dawek antybiotyku. Fagoterapia ma największe znaczenie w przypadku eliminacji bakterii wielolekoopornych. Potwierdzono jej efektywność wobec szczepów gronkowca złocistego opornego na metycylinę i wankomycynoopornych enterokoków [44]. Badano także możliwość stosowania bakteriofagów w leczeniu infekcji płuc wywołanych przez P. aeruginosa u chorych na mukowiscydozę. Wykazano skuteczność bakteriofagów w stosunku do szczepów klinicznych zarówno w formie planktonowej, jak i tworzących zorganizowane skupiska [3]. Inną strategią biologicznej walki z biofilmem jest stosowanie enzymów skierowanych wobec macierzy polisacharydowej (matrix-targeting enzymes). Ingerencja w strukturę lub degradacja zewnątrzkomórkowej macierzy polimerowej biofilmu może skutecznie go osłabić lub prowadzić do jego rozproszenia. Przeprowadzono szereg badań nad zdolnością związków do degradacji składników macierzy, takich jak polisacharydu, zewnątrzkomórkowego genomowego DNA (eDNA) i białek [34]. Wykazano, że Dyspersyna  B, produkowana przez Gram-ujemne bakterie jamy ustnej Actinobacillus actinomycetemcomitans, zakłóca strukturę macierzy zewnątrzkomórkowej biofilmu innych szczepów. Związek wpływa m.in. na strukturę zewnątrzkomórkowej macierzy biofilmu S. epidermidis prowadząc do jego rozproszenia [14, 33]. Zastosowanie enzymu DNAzy okazało się skuteczne w eliminacji biofilmu S. aureus [43, 29]. Podobne właściwości wobec biofilmu S. aureus wykazały proteinaza K i trypsyna [12]. Skuteczność enzymów wobec matrix nie została jednak jeszcze potwierdzona w testach in vivo. Istnieje wiele ograniczeń w tego typu podejściu, jednym z nich jest ryzyko wystąpienia reakcji zapalnych i alergicznych [12, 14]. 4.3.  Chemiczne metody eradykacji biofilmu Aktywność wielu dostępnych związków przeciw­ drobnoustrojowych w stosunku do biofilmu jest znacznie ograniczona w porównaniu do aktywności tych substancji wobec komórek wolnopływających tych samych szczepów drobnoustrojów. Wynika to przede wszystkim z warstwowej budowy biofilmu oraz obecności macierzy polisacharydowej, co utrudnia penetrację związków do wnętrza struktury. Poza tym dochodzi do zmian ekspresji genów oraz metabolizmu komórek

drobnoustrojów położonych w głębszych warstwach struktury, prowadzących do obniżonej wrażliwości na wiele substancji przeciwdrobnoustrojowych [37]. Wykorzystywane metody chemiczne opierają się głównie na zastosowaniu substancji utleniających, np. chloru i  jego związków, które powodują degradację budowy przestrzennej. W stosunku do biofilmu skuteczny jest także formaldehyd i  czwartorzędowe sole amoniowe. Pozytywne wyniki w  eradykacji biofilmu uzyskuje się również dzięki zastosowaniu surfaktantów, których mechanizm działania polega na zaburzaniu integralności struktury. Zastosowanie wyżej wymienionych związków chemicznych ogranicza się do procesów dezynfekcji powierzchni [50]. Do najskuteczniejszych, obecnie stosowanych antyseptyków należy chlorowodorek oktenidyny. Związek został wprowadzony do powszechnego użytku ponad dwie dekady temu i do tej pory stanowi najlepsze rozwiązanie w zapobieganiu i terapii infekcji ran. Potwierdzono jego wysoką skuteczność w stosunku do drobno­ustrojów Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych oraz grzybów. Ponadto, jest aktywny wobec szczepów S. aureus opornych na metycylinę. Oktenidyna jest również skuteczna w zwalczaniu biofilmu bakteryjnego. Wykazano między innymi, że preparat zawierający dichlorowodorek oktenidyny skuteczniej eliminuje biofilmy tworzone przez S. aureus i  P. aeruginosa w  porównaniu do mleczanu etakrydyny i jodopowidonu [31, 48]. 5.  Peptydy przeciwdrobnoustrojowe Obiecującą grupą związków o potencjalnym zastosowaniu do walki z biofilmem wydają się być peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP, Antimicrobial Peptides), charakteryzujące się silnymi właściwościami przeciwdrobnoustrojowymi oraz szerokim spektrum działania [17, 35]. Stanowią one istotną część wrodzonej odporności, a ze względu na wysoką aktywność wobec biofilmu i niskie ryzyko rozwoju oporności w porównaniu do konwencjonalnych antybiotyków ich potencjalne zastosowanie w terapii zakażeń wydaje się uzasadnione [64]. Wyniki licznych badań przeprowadzonych w warunkach in vitro i in vivo potwierdzają zdolność AMP do eliminacji oraz zapobiegania tworzenia się struktur biofilmu. Wykazano między innymi, że ludzka katelicydyna LL-37 hamuje proces formowania się biofilmu oraz powoduje jego eradykcję w stężeniach znacznie niższych niż stężenia hamujące wzrost komórek planktonowych [56, 70]. Już w stężeniu 0,5 μg/ml, LL-37 wykazuje silną aktywność antybiofilmową w stosunku do P. aeruginosa, głównego czynnika etiologicznego zapalenia płuc u  chorych na mukowiscydozę oraz

NOWOCZESNE METODY ZWALCZANIA BIOFILMU BAKTERYJNEGO

wobec szczepu Francisella novicida odpowiedzialnego za rozwój tularemii [4]. Sugeruje się możliwość zastosowania wytwarzanej przez neutrofile laktoferyny (LF) w terapii stomatologicznej. Związek ten naturalnie występuje także w ślinie, łzach, mleku, nasieniu oraz w śluzowo-surowiczej wydzielinie okrężnicy. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe laktoferyny wynikają z jej zdolności do wiązania jonów Fe3+. Potwierdzono zdolność związku do hamowania i zapobiegania tworzeniu się biofilmów szczepów Porphyromonas gingivalis i Prevotella intermedia, odpowiedzialnych za powstawanie biofilmu na blaszkach poddziąsłowych [71]. Powlekanie biomateriałów za pomocą AMP stanowi obiecującą opcję profilaktyki zakażeń związanych z biofilmem. Przykładem zastosowania AMP do tego celu jest powlekanie powierzchni soczewek kontaktowych Meliminą, zbudowaną z fragmentów Mellityny i Protaminy. Peptyd ten skutecznie zapobiega adhezji komórek P. aeruginosa i S. aureus, natomiast wyniki przeprowadzonych testów toksyczności sugerują także bezpieczeństwo w stosunku do ludzkiego organizmu [19, 72]. Badania in vivo przeprowadzone na królikach i świnkach morskich, u których wywołano owrzodzenie oka i zapalenie spojówek, wykazały, że stosowanie soczewek kontaktowych pokrytych peptydem znacznie redukuje objawy zakażenia [15]. Liczne badania in vivo potwierdzają zdolność innych AMP do zapobiegania, a także eliminacji infekcji związanych z biofilmem. Potwierdzono między innymi skuteczność Citropiny 1.1, Temporyny A oraz IB-367 na zwierzęcych modelach infekcji wywołanych przez S. aureus [32]. Ponadto, Temporyna  A skutecznie zapobiega adhezji komórek S. epidermidis do protezy naczyniowej na modelu szczurzym [20]. Peptyd IB-367 okazał się skuteczny w redukcji mikroflory jamy ustnej będącej potencjalnym czynnikiem etiologicznym zapalenia błony śluzowej. Zaobserwowano redukcję kolonizacji przez bakterie Gram-ujemne, szczepy z  rodzaju Staphylococcus oraz całkowitą eradykację grzybów [49]. Wyniki dotychczasowych doświadczeń przeprowadzonych z wykorzystaniem peptydów przeciwdrobnoustrojowych czynią z nich doskonałą matrycę do projektowania nowych związków przeciwdrobnoustrojowych oraz zachęcają do kontynuacji badań naturalnych AMP. 6. Podsumowanie Złożoność struktury biofilmu i jego wysoka oporność wobec konwencjonalnych antybiotyków są przyczynami trudności napotykanych podczas terapii infekcji związanych z biofilmem. Pogłębianie wiedzy na temat tworzenia się, funkcjonowania i struktury biofilmu stanowią podstawę dla poszukiwania alternatyw-

9

nych metod profilaktyki i leczenia zakażeń związanych z jego występowaniem. Opisane dotychczas strategie mające na celu zmniejszenie ryzyka kolonizacji powierzchni przez drobnoustroje chorobotwórcze obejmują między innymi zastosowanie niskocząsteczkowych molekuł oraz ingerencję w procesy quorum sensing. Bardzo obiecującym rozwiązaniem jest także zastosowanie przeciwciał wiążących adhezyny bakteryjne oraz użycie biofilmu drobnoustrojów niepatogennych. Inne metody mające zapobiegać procesowi rozwoju biofilmu dotyczą modyfikacji powierzchni biomateriałów. Prowadzone badania mają na celu opracowanie materiału odpornego na kolonizację i jednocześ­ nie bezpiecznego dla ludzkiego organizmu. Modyfikacje obejmują zmiany ładunku powierzchniowego, zmniejszenie energii powierzchniowej oraz zwiększanie hydrofobowości materiałów medycznych. Istotnym podejściem jest także powlekanie biomateriałów za pomocą związków prezentujących właściwości przeciwdrobnoustrojowe. W przypadku niepowodzenia profilaktyki dochodzi do kolonizacji tkanek, bądź powierzchni biomateriałów, co często skutkuje rozwojem zakażenia. W związku z  niską skutecznością antybiotykoterapii, możliwości terapii infekcji związanych z biofilmem są bardzo ograniczone. Dostępne fizyczne metody eliminacji biofilmu ograniczają się głównie do usuwania biofilmu z  powierzchni nieożywionych. Zastosowanie związków o właściwościach utleniających lub surfaktantów także ogranicza się głównie do procesów dezynfekcji. Spośród antyseptyków stosowanych w lecznictwie największą skuteczność w eradykacji biofilmu wykazuje chlorowodorek oktenidyny. Do obiecujących metod alternatywnych należą terapia fotodynamiczna, fagoterapia oraz terapia z wykorzystaniem peptydów przeciwdrobnoustrojowych.

Piśmiennictwo   1. Abraham N.M., Lamlertthon S., Fowler V.G., Jefferson  K.K.: Chelating agents exert distinct effects on biofilm formation in Staphylococcus aureus depending on strain background: Role for clumping factor B. J. Med. Microbiol. 61, 1062–1070 (2012)   2. Agarwal A., Singh K.P., Jain A.: Medical significance and management of staphylococcal biofilm. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 58, 147–160 (2010)   3. Alemayehu D., Casey P.G., McAuliffe O., Guinane C.M., Martin J.G., Shanhan F., Coffey A., Ross R.P., Hill C.: Bacteriophages ϕMR299-2 and ϕNH-4 can eliminate Pseudomonas aeruginosa in the murine lung and on cystic fibrosis lung airway cells. MBio, 3, (2012)   4. Amer L.S., Bishop B.M., Hoek van M.L.: Antimicrobial and antibiofilm activity of cathelicidins and short, synthetic peptides against Francisella. Biochem. Biophys. Res. Commun. 396, 246–251 (2010)

10

MAGDALENA MACIEJEWSKA, MARTA BAUER, MAŁGORZATA DAWGUL

  5. Antoci Jr V., Hickok N.J. i wsp.: The inhibition of Staphylococcus epidermidis biofilm formation by vancomycin-modified titanium alloy and implications for the treatment of periprosthetic infection. Biomaterials, 29, 4684–4690 (2008)   6. Arciolo C.R., Baldassarri L., Campoccia D., Creti R., Pirini V., Huebner J., Montanaro L.: Strong biofilm production, antibiotic multi-resistant and high gelE expression in epidemic clones of Enterococcus faecalis from orthopaedic implant infections. Biomaterials, 29, 580–586 (2008)   7. Axelsson L., Holch A., Rud I., Samah D., Tierce P., Favre M., Kure C.F.: Cleaning of conveyor belt materials using ultrasound in thin layer of water. J. Food. Prot. 76, 1401–1407 (2013)   8. Betsy J., Prasanth C.S., Baiju K.V., Prasanthila J., Subhash N.: Efficacy of antimicrobial photodynamic therapy in the management of chronic periodontitis: a randomized controlled clinical trial. J. Clin. Periodontal. 41, 573–581 (2014)   9. Boks N.P., Kaper H.J., Norde W., Mei van der H.C., Busscher H.J.: Mobile and immobile adhesion of staphylococcal strains to hydrophilic and hydrophobic surfaces. J. Colloid Interface Sci. 331, 60–64 (2009) 10. Bryers J.D.: Medical Biofilms. Biotechnol. Bioeng. 1, 1–18 (2008) 11. Busscher H.J., Rinastiti M., Siswomihardjo W., Mei van der H.C.: Biofilm formation on dental restorative and implant materials. J. Dent. Res. 89, 657–665 (2010) 12. Chaignon P., Sadovskaya I., Ragunah C., Ramasubbu N., Kaplan J.B., Jabbouri S. Susceptibility of staphylococcal biofilms to enzymatic treatments depends on their chemical composition. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 125–132 (2007) 13. Chatterjee S., Maiti P., Dey R., Kundu A., Dey R.: Biofilms on indwelling urologic devices: microbes and antimicrobial management prospect. Ann. Med. Health Sci. Res. 4, 100–104 (2014) 14. Chen M., Yu Q., Sun H.: Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int. J. Mol. Sci. 14, 18488–18501 (2013) 15. Cole N., Hume E.B.H., Vijay A.K., Sankaridurg P., Kumar N., Willcox M.D.P.: In vivo performance of Melimine as an antimicrobial coating for contact lenses in models of CLARE and CLPU. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 390–395 (2010) 16. Davies D.G., Marques C.N.: A fatty acid messenger is responsible for inducing dispersion in microbial biofilms. J. Bacteriol. 191, 1393–1403 (2009) 17. Dawgul M., Barańska-Rybak W., Bielińska S., Nowicki R., Kamysz W.: Wpływ peptydów przeciwdrobnoustrojowych na biofilm Candida. Alergia Astma Immunologia, 15, 220–225 (2010) 18. Donlan R.M.: Biofilms and device-associated infections. Emerg. Infect. Dis. 7, 277–281 (2001) 19. Dutta D., Cole N., Kumar N., Willcox M.D.P.: Broad spectrum antimicrobial activity of Melimine covalently bound to contact lenses. Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 54, 175–182 (2013) 20. Ghiselli R., Giacometti A., Cirioni O., Mocchegini F., Orlando F., Kamysz W., Del Prete M. S., Lukasiak J., Scalise G., Saba  V.: Temporin A as a prophylactic agent against methicillin-sodium susceptible and methicillin sodium-resistant Staphylococcus epidermidis vascular graft infection. J. Vasc. Surg. 36, 1027–1030 (2002) 21. Gilodi M. Porat X., Blatt A., Wasserman Y., Kirson E.D., Dekel E., Palti Y.: Microbial growth inhibition by alternating electric fields. Antimicrob. Agents Chemother. 52, 3517–3522 (2008) 22. Gospodarek E., Zalas P.: Ingerencja człowieka w komunikowanie się drobnoustrojów. Post. Mikrobiol. 47, 365–370 (2008) 23. Haidaris C.G., Foster T.H., Waldman D.L., Mathes E.J., McNamara J., Curran T.: Effective photodynamic therapy against microbial populations in human deep tissue abscess. Laser. Surg. Med. 45, 509–516 (2013)

24. Harris L.G., Tosatti S., Wieland M., Textor M., Richards R.G.: Staphylococcus aureus adhesion to titanium oxide surfaces coated with non-functionalized and peptide-functionalized poly(L-lysine)-grafted-poly(ethylene glycol) copolymers. Biomaterials, 25, 4135–4148 (2004) 25. Hogan D.A.: Talking to themselves: autoregulation and quorum sensing in fungi. Eukaryot. Cell, 5, 613–619 (2006) 26. Hu J., Xu T., Zhu T., Wang X., Wu Y., Huang R., liu J., Liu H., Yu  F., Ding B., Huang Y., Tong W., Qu D.: Monoclonal anti­ bodies against accumulation-associated protein affect EPS biosynthesis and enhance bacterial accumulation of S. epidermidis. PLoS One, 6 (2011) 27. Huang N.P., Michel R., Voros J., Textor M., Hofer M., Rossi A., Elbert D.L., Hubbell J.A., Spencer N.D.: Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: Surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir, 17, 489–498 (2001) 28. Ivanova E.P., Mitik-Dineva N., Wang J., Pham D.K., Wright J.P., Nicolau D.V., Mocanasu R.C., Crawford R.J.: Staleya guttiformis attachment on poly(tert-butylmethacrylate) polymeric surfaces. Micron, 39, 1197–2104 (2008) 29. Izano E.A., Amarante M.A., Kher W.B., Kaplan J.B.: Differential roles of poly-N-acetylglucosamine surface polysaccharide and extracellular DNA in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 470–476 (2008) 30. Jabra-Rizk M.A., Shirtliff M., James C., Meiller T.: Effect of farnesol on Candida dubliniensis biofilm. FEMS Yeast Res. 6, 1063–1073 (2006) 31. Junka A., Bartoszewicz M., Smutnicka D., Secewicz A., Szymczak P.: Efficacy of antiseptics containing povidone-iodine, octenidine dihydrochloride and ethacridine lactate against biofilm formed by Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus measured with the novel biofilm-oriented antiseptic test. Int. Wound J. 11, 730–734 (2013) 32. Kamysz W., Nadolski P.: Przeciwbakteryjna aktywność peptydów ze skóry płazów. Ann. Acad. Med. Gedan. 35, 29–34 (2005) 33. Kaplan J.B, Ragunath C., Velliyagounder K., Fine D.H, Ramasubbu N.: Enzymatic detachment of Staphylococcus epidermdis biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 2633–2636 (2004) 34. Kiedrowski M.R., Horswill A.R.: New approaches for treating staphylococcal biofilm infections. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1241, 104–121 (2011) 35. Koczulla A.R., Bals R.: Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential. Drugs, 63, 389–406 (2003) 36. Kolodkin-Gal I., Romero D., Cao S., Clardy J., Kolter R., Losick R.: D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science, 328, 627–629 (2010) 37. Kołwzan B.: Analiza zjawiska biofilmu – warunki jego powstawania i funkcjonowania. Ochrona środowiska, 33, 3–14 (2011) 38. LaFleur M., Kumamoto C.A., Lewis K.: Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 3839–3846 (2006) 39. Lellouche J., Friedman A., Banin E.: Antimicrobial and antibiofilm properties of yttrium fluoride nanoparticles. Int. J. Nanomidicine. 7, 5611–5624 (2012) 40. Ma Y., Chen M., Jones J. E., Ritts A.C., Yu Q., Sun H.: Inhibition of Staphylococcus epidermidis biofilm by trimethylsilane plasma coating. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5923–5937 (2012) 41. Ma Y., Xu Y., Yestrepsky B.D., Sorenson R.J., Chen M., Larsen  S.D., Sun H.: Novel inhibitors of Staphylococcus aureus virulence gene expression and biofilm formation. PLoS One, 7, 47255 (2012) 42. Mai-Prochnow A., Murphy A.B., McLean K.M., Hong M.G., Ostrikov K.: Atmospheric pressure plasmas: infection control

NOWOCZESNE METODY ZWALCZANIA BIOFILMU BAKTERYJNEGO

and bacterial responses. Int. J. Antimicrob. Agents. 43, 508–516 (2014) 43. Mann E.E., Rice K.C., Boles B.R., Endres J.L., Ranjit D., Chandra­ mohan L., Tsang L.H., Smeltzer M.S., Horswill A.R., Bayles K.W.: Modulation of eDNA release and degradation affects Staphylococcus aureus biofilm maturation. PLoS One, 4, 5822 (2009) 44. Międzybrodzki R., Borysowski J., Fortuna W., Dąbrowska-Weber B., Górski A.: Terapia fagowa jako alternatywa w leczeniu zakażeń wywołanych przez bakterie antybiotykooporne. Kardiochir. Torakochir. Pol. 3, 201–205 (2006) 45. Miller M.B., Bassler B.L.: Quorum sensing in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 55, 165–199 (2001) 46. Mitik-Dineva N., Wang J., Truong V.K., Stoddart P., Malherbe F., Crawford R.J., Ivanova E.P.: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus attachment patterns on glass surfaces with nanoscale roughness. Curr. Microbiol. 58, 268–273 (2009) 47. Morita Y., Imai S., Hanyuda A., Matin K., Hanada N., Nakomura Y.: Effect of silver ion coating of fixe orthodontic retainers on the growth of oral pathogenic bacteria. Dent. Mater J. 33, 268–274 (2014) 48. Moritz S., Wiegand C., Wesarg F., Hessler N., Müller F., Kralisch D., Hipler U., Fischer D.: Active wound dressing based on bacterial nanocellulose as drug delivery system for octenidine. Int. J. Pharm. 471, 45–55 (2014) 49. Mosca D.A., Hurst M.A., So W., Vijar B.S.C., Fujii C.A., Falla T.J.: IB-367, a protegrine peptide with in vitro and in vivo activities against the microflora associated with oral mucositis. Anti­microb. Agents Chemother. 44, 1803–1808 (2000) 50. Myszka K., Czaczyk K.: Metody usuwania biofilmów bakteryjnych z powierzchni stałych. Przemysł Spożywczy, 2, 18–21 (2007) 51. Nakonieczna J., Rapacka-Zdonczyk A., Bielawski K.P., Grinholc M.: Sub-lethal photodynamic inactivation renders Staphylococcus aureus susceptible to silver nanoparticles. Photochem. Photobiol. Sci. 12, 1622–1627 (2013) 52. Neut D., Dijkstra R.J.B., Thompson J.I., Mei van der H.C., Busscher H.J.A gentamycin-releasing coating for cementless hip prostheses-longitudinal evaluation of efficacy using in vivo bio-optical imaging and its wide-spectrum antimicrobial efficacy. J. Biomed. Mater Res. 12, 3220–3226 (2012) 53. Nobile C.J., Mitchell A.P.: Genetics and genomics of Candida albicans biofilm formation. Cell Microbiol. 8, 1382–1391 (2006) 54. Otto M.: Staphylococcal biofilms. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 207–228 (2008) 55. Otto M.: Staphylococcus epidermidis- the “accidental” pathogen. Nat. Rev. Microbiol. 7, 555–567 (2009) 56. Overhage J., Campisano A., Bains M., Torfs E.C.W., Rehm B.H.A., Hancock R.E.W.: Human host defense peptide LL-37 prevents bacterial biofilm formation. Infect. Immun. 76, 4176–4182 (2008) 57. Pavithra D., Doble M.: Biofilm formation, bacterial adhesion and host response on polymeric implants-issues and prevention. Biomed. Mater. 3, 034003 (2008) 58. Perez-Giraldo C., Rodriguez-Benito A., Moran F.J., Hurtado C., Blanco M.T., Gomez-Garcia A.C.: Influence of N-acetylcysteine on the formation of biofilm by Staphylococcus epidermidis. J. Antimicrob. Chemother. 39, 643–646 (1997) 59. Privett B.J., Youn J., Hong S.A., Lee J., Han J., Shin J.H., Schoen­ fisch M.H.: Antibacterial fluorinated silica colloid superhydrophobic surfaces. Langmuir, 27, 9597–9601 (2011) 60. Regev-Shoshani G., Ko M., Crowe A., Av-Gay Y.: Comparative efficacy of commercially available and emerging antimicrobial urinary catheters against bakteriuria caused by E. coli in vitro. Urology, 78, 334–339 (2011)

11

61. Roosjen A., Kaper H.J., Mei van der H.C., Norde W., Busscher  H.J.: Inhibition of adhesion of yeasts and bacteria by poly(ethylene oxide)-brushes on glass in a parallel plate flow chamber. Microbiology, 149, 3239–3246 (2003) 62. Roosjen A., Mei van der H.C., Busscher H.J., Norde W.: Microbial adhesion to poly(ethylene oxide) brushes: Influence of polymer chain lenghth and temperature. Langmuir, 20, 10949–10955 (2004) 63. Roosjen A., Norde W., Mei van der H.C., Busscher H.J.: The use of positively charged or low surface free energy coatings versus polymer brushes in controlling biofilm formation. Prog. Colloid. Polym. Sci. 132, 138–144 (2006) 64. Rossi L.M., Rangasamy P., Zhang J., Qiu X.Q., Wu G.Y.: Research advances in the development of peptide antibiotics. J. Pharm. Sci. 97, 1060–1070 (2008) 65. Sun D., Accavitti M.A., Bryers J.D.: Inhibition of biofilm formation by monoclonal antibodies against Staphylococcus epidermidis RP62A accumulation-associated protein. Clin. Diag. Lab. Immunol. 12, 93–100 (2005) 66. Sun H., Ginsburg D. i wsp.: Inhibitor of streptokinase gene expression improves survival after group A streptococcus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 3469–3474 (2012) 67. Tang H., Cao T., Liang X., Wang A., Salley S.O., McAllister J., Ng K.Y.: Influence of silicone surface roughness and hydrophobicity on adhesion and colonization of Staphylococcus epidermidis. J. Biomed. Mater. Res. 88, 454–463 (2009) 68. Trautner B.W., Hull R.A., Darouiche R.O.: Prevention of catheter-associated urinary tract infection. Curr. Opin. Infect. Dis. 18, 37–41 (2005) 69. Truong V.K., Lapovok R., Estrin Y.S., Rundell S., Wang J.Y., Fluke C.J., Crawford-Ivanova E.P.: The influence of nano-scale surface roughness on bacterial adhesion ultrafine-grained titanium. Biomaterials, 31, 3674–3683 (2010) 70. Varra M.: New approaches in peptide antibiotics. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 571–576 (2009) 71. Wakabayashi H., Yamauchi K., Kobayashi T., Yaeshima T., Iwatsuki K., Yoshie H.: Inhibitory effects of lactoferrin on growth and biofilm formation of Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3308–3316 (2009) 72. Willcox M.D.P., Hume E.B.H., Aliwarga Y., Kumar N., Cole N.: A novel cationic-peptide coating for the prevention of microbial colonization on contact lenses. J. App. Microbiol. 105, 1817–1825 (2008) 73. Wu Y., Zitelli J.P., Ten-Huisen K.S., Yu X., Libera M.R.: Differential response of Staphylococci and osteoblasts to varying titanium surface roughness. Biomaterials, 32, 951–960 (2010) 74. Xu L.C., Siedlecki C.A.: Submicron-textured biomaterial surface reduces staphylococcal bacterial adhesion and biofilm formation. Acta Biomater. 8, 72–81 (2012) 75. Yount N.Y., Yeaman M.R.: Multidimensional signatures in antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 7363–7368 (2004) 76. Zhang L.H., Dong Y.H.: Quorum sensing and signal interference: diverse implications. Mol. Microbiol. 53, 1563–1571 (2004) 77. Zhao Z., Li Y., Meng S., Li S., Wang Q., Lin T.: Susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus to photodynamic antimicrobial chemotherapy with α-D-galactopyranosyl zinc phthalocyanines: in vitro study. Lasers Med. Sci. 29, 1131–1138 (2014) 78. Zimmermann S., Wagner C., Müller W., Brenner-Weiss G., Hug F., Prior B., Obst U., Hänsch G.M.: Induction of neutrophil chemotaxis by the quorum-sensing molecule N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone. Infect. Immun. 74, 5687–5692 (2006)

POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 12–18 http://www.pm.microbiology.pl

ODDZIAŁYWANIE FUNGICYDÓW NA MIKROORGANIZMY W ŚRODOWISKU GLEBOWYM Sławomir Sułowicz1*, Zofia Piotrowska-Seget1  Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski

1

Wpłynęło w lutym 2015 r. Zaakceptowano w marcu 2015 r.

1. Charakterystyka fungicydów. 2. Wpływ presji fungicydowej na ekosystem glebowy. 3. Oddziaływanie fungicydów na mikroorganizmy glebowe. 4. Triazole – charakterystyka i wpływ na ekosystem glebowy. 5. Podsumowanie The impact of fungicides on soil microorganisms Abstract:  Modern agriculture depends heavily on pesticides, including fungicides. Fungicides such as triazoles, when applied every year, may accumulate in soils leading to the development of resistance to the applied compounds and subsequently to the spread of resistance genes to other fungi. Additionally, fungicides can impact non-target soil microorganisms by reducing their biomass, changing microbial activity, and altering functional and structural diversity of bacterial and fungal communities. Soil quality is closely linked to the microbial activity, therefore, the effects of fungicides on non-target soil microorganisms increase concerns about the fertility of soil. This new knowledge about specific interaction between fungicides and soil microorganisms has to be taken into consideration in designing a new strategy for soil protection. 1. Fungicides. 2. The influence of fungicide pressure on soil ecosystem. 3. The impact of fungicides on soil microorganisms. 4. Triazoles – their characteristic features and influence on soil ecosystem. 5. Conclusions Słowa kluczowe: fungicydy, gleba, triazole, zespół mikroorganizmów Key words: fungicides, microbial community, soil, triazoles

1.  Charakterystyka fungicydów Jednym z największych zadań stojących przed współczesnym rolnictwem jest wyżywienie wzrastającej liczby ludności. Ponieważ powierzchnia gruntów rolnych, które można wykorzystać pod uprawy, jest ograniczona, konieczne staje się zwiększanie wydaj­ności produkcji rolniczej. Do osiągnięcia tego celu stosuje się nawozy oraz środki ochrony roślin określane wspólnym mianem pestycydów (z łac. pestis – szkodnik, cedeo – niszczyć). Wśród związków wykorzystywanych jako środki ochrony roślin są zarówno substancje pochodzenia naturalnego, syntetyczne [3], jak również preparaty zawierające żywe organizmy lub ich metabolity, tzw. biopestycydy [6]. Jedną z najważniejszych i najczęściej stosowanych grup pestycydów są fungicydy, których blisko połowa światowego zużycia przypada na Europę [8]. Fungicydy stosowane są w rolnictwie do zapobiegania i zwalczania chorób roślin użytkowych wywoływanych przez grzyby. Spośród 462 dopuszczonych do stosowania w krajach Unii Europejskiej środków ochrony roślin, w 135 substancja aktywna charakteryzuje się właściwoś­ ciami przeciwgrzybicznymi [14]. Zużycie fungicydów w Europie w 2010 roku, obliczane przez ECPA (European Crop Protection Association, Europejskie Stowarzyszenie Ochrony Roślin), organizację reprezentującą

producentów środków ochrony roślin z 28 europejskich krajów, szacowane jest na ponad 100 000 ton [15]. Istnieje wiele sposobów klasyfikacji fungicydów. Za kryterium podziału przyjmuje się m.in. docelowe miejsce działania związku w komórce patogenu, budowę chemiczną środków grzybobójczych czy też ich toksycz­ność [3, 51]. Powołana w 1981 roku przez producentów środków ochrony roślin organizacja FRAC (Fungicide Resistant Action Committee), monitorująca pojawianie się grzybów opornych na stosowane fungicydy, klasyfikuje fungicydy ze względu na 10 możliwych mechanizmów działania (tab. I). Klasyfikacja ta obejmuje ponadto fungicydy działające na wiele miejsc w komórce jednocześnie, jak również grupę pestycydów, dla których nie jest zdefiniowany mechanizm działania [17]. Fungicydy klasyfikuje się także ze względu na budowę chemiczną związku, będącego substancją aktywną stosowanego preparatu pestycydowego. Wśród związków wykorzystywanych jako fungicydy są zarówno związki nieorganiczne, np. związki miedzi, jak i różne grupy związków organicznych [3]. Spośród tych ostatnich do 100 najważniejszych grup wykorzystywanych w rolnictwie i sadownictwie zalicza się m.in. triazole, będące najliczniejszą grupą fungicydów, strobiluryny, ditiokarbaminiany, imidy kwasu ftalowego czy związki benzimidazolowe [8].

*  Autor korespondencyjny:  Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski, ul. Jagiellońska 28, 40-032 Katowice; tel. 32 2009 357; e-mail: [email protected]

ODDZIAŁYWANIE FUNGICYDÓW NA MIKROORGANIZMY W ŚRODOWISKU GLEBOWYM

13

Tabela I Klasyfikacja fungicydów ze względu na sposób działania wg FRAC [17] Symbol grupy

Cel działania fungicydu

Wybrane grupy

Przykładowy fungicyd

A:

synteza kwasów nukleinowych

pochodne acylalaniny

mefenoksam, metalaksyl

B:

mitoza i podział komórki

benzimidazole

benomyl, karbendazym, tiabendazol



tiofanaty

tiofanat metylowy



pochodne fenylmocznika

pencykuron



N-fenylokarbaminiany

dietofenkarb

C: oddychanie

strobiluryny

azoksystrobina



karboksyanilidy

karboksyna



2,6-dinitroaniliny

fluazynam

D:

synteza aminokwasów i białek

anilinopirymidyny

cyprodynil

E:

transdukcja sygnału

dikarboksyimidy

iprodion

F:

synteza lipidów i błon komórkowych

fosforotiolany

kitazin (iprobenfos)

G:

biosynteza steroli

pirymidyny

nuarimol

imidazole

prochloraz



triazole

difenokonazol, epoksykonazol, fenbukonazol, heksakonazol, penkonazol, propikonazol, tebukonazol, tetrakonazol, triadimefon, tritikonazol



morfoliny

fenpropimorf

H:

biosynteza ściany komórkowej

pochodne kwasu cynamonowego dimetomorf

I:

synteza melaniny w ścianie komórkowej

triazolobenzotiazole

P:

indukcja roślinnych mechanizmów obronnych tiadiazole

–

nieznany sposób działania

tiokarbamiany

metasulfokarb

–

wielomiejscowy sposób działania

chinony

ditianon



imidy kwasu ftalowego

kaptafol, kaptan



ditiokarbaminiany

mankozeb, tiram



chloronitryle

chlorotalonil

tricyklazol izotianil

Kursywą zaznaczono fungicydy wymienione w tekście.

Inny użyteczny sposób podziału pestycydów, w tym fungicydów, grupuje je ze względu na stopień ich tok­ sycz­­ności. Klasyfikacja ta umożliwia szybką identyfikację potencjalnego zagrożenia, jakie niesie ze sobą stosowanie środków ochrony roślin dla zdrowia i życia ludzi. Przykładowo, WHO wyróżnia cztery klasy toksycz­ności. Do klasy związków skrajnie toksycznych (Ia) zaliczono 28  pestycydów, spośród których cztery – kaptafol, heksa­chlorobenzen, chlorek rtęci i octan fenylortęci – to związki o właściwościach przeciwgrzybicznych [51]. 2.  Wpływ presji fungicydowej na ekosystem glebowy Z uwagi na sezonowe występowanie chorób grzybowych, związki wykorzystywane do zwalczania grzybów patogennych roślin stosowane są na tym samym terenie rok rocznie, często wielokrotnie w trakcie sezonu. Regularne wprowadzanie fungicydów do środowiska może prowadzić do ich akumulacji w glebie. Związki te

pozostając w ekosystemie przez dłuższy czas, zwiększają swój negatywny wpływ na jego funkcjonowanie [18]. W kontekście funkcjonowania ekosystemów najważniejsze znaczenie mają dawki subletalne i stężenia resztkowe pestycydów. Dawki subletalne osiągane są w środowisku w wyniku stosowania ilości pestycydu, która nie wywołuje zamierzonego efektu biobójczego, bądź powstają na skutek rozproszenia wprowadzonego do środowiska środka ochrony roślin. Nie powodują śmierci organizmu, ale przyczyniają się do selekcji organizmów (mutantów) charakteryzujących się zmniejszoną wrażliwością na pestycyd [8]. W konsekwencji prowadzi to do rozprzestrzenienia się w  populacji genów warunkujących oporność na stosowany pestycyd. Zjawisko zmniejszającej się wrażli­ wości na środki ochrony roślin dotyczy między innymi mikroorganizmów, takich jak bakterie i grzyby. Organizmy te, z uwagi na krótki czas generacji mają duży potencjał powstawania mechanizmów oporności na środki ochrony roślin. U grzybów nowe mechanizmy

14

SŁAWOMIR SUŁOWICZ, ZOFIA PIOTROWSKA-SEGET

oporności powstają głównie poprzez mutacje i późniejszy proces selekcji, podczas gdy bakterie uzyskują geny warunkujące oporność głównie poprzez wymianę materiału genetycznego na drodze horyzontalnego transferu genów [21]. Wpływ dawek subletalnych wiąże się nie tylko ze zjawiskiem nabywania oporności na stosowane pestycydy. Wśród organizmów narażonych na wpływ pestycydów obserwowane jest zjawisko tzw. oporności krzyżowej, kiedy to rozwój oporności na jeden ze stosowanych środków ochrony roślin zapewnia jedno­czesną oporność na inny pestycyd [9]. Takie zjawisko jest możliwe, gdy istnieje wspólny mechanizm oporności na dany związek, np. system transportu pestycydów z komórki (oporność krzyżowa) lub gdy geny, kodujące mecha­ nizmy warunkujące oporność na dwa różne związki, zlokalizowane są na tym samym elemencie genetycznym, np. plazmidzie [4]. Obserwowano patogenne szczepy grzybów opornych na benomyl, charakteryzujące się także opornością na inne fungicydy z grupy benzimidazoli jak karbendazym, tiabendazol czy tiofanat metylowy [9]. Zjawisko współwystępowania opor­ności na różne związki jest także odpowiedzialne za rozprzestrzenianie się, pod wpływem presji środowiskowej powstałej w wyniku stosowania pestycydów, opor­ności na antybiotyki [48]. Możliwa jest także negatywna oporność krzyżowa, gdy zmiana prowadząca do nabycia przez organizm oporności na jeden fungicyd powoduje zwiększenie wrażliwości na inny (karben­da­ zym i dietofenkarb) [9, 27, 28]. Drugim, obok dawek subletalnych, ważnym czynnikiem wpływającym na funkcjonowanie zespołu mikroorganizmów glebowych są stężenia resztkowe, czyli pozostałość pestycydu w środowisku po jego aplikacji. Główną metodą aplikacji fungicydów jest oprysk [8]. Jak się szacuje, mniej niż 0,1% stosowanego pestycydu osiąga swój cel, co sprawia, że większość aplikowanych pestycydów dostaje się bezpośrednio, bądź pośrednio wraz z  deszczem do gleby [42, 43]. Oddziałując z  jej elementami, stanowią potencjalne zagrożenie dla organizmów niebędących celem ich działania [52]. Jednak ocenę potencjalnego wpływu fungicydów na mikro­ organizmy glebowe utrudnia plastyczność reakcji bakterii i grzybów na jego obecność w środowisku glebowym. Z powodu małych rozmiarów mikroorganizmów stosunek powierzchni do objętości komórki jest wysoki, co znaczy, że mikroorganizmy charakteryzują się dużą powierzchnią oddziaływania ze środowiskiem. Z  tego powodu odpowiedź mikroorganizmów na  wprowadzenie do środowiska nowej substancji jest szybka i czuła, a wielokrotne wprowadzanie do środowiska danego środka ochrony roślin wspomaga adaptację mikro­ organizmów do niego. Obserwowany później brak reakcji zespołu mikro­ organizmów glebowych na ponowną aplikację pesty-

cydu może być związany z  rozwinięciem zdolności mikroorganizmów glebowych do szybszej degradacji danego środka, bądź nabytą tolerancją zespołu mikroorganizmów na pestycyd [25]. 3. Oddziaływanie fungicydów na mikroorganizmy glebowe Pomimo dużej zdolności mikroorganizmów glebowych do adaptacji i szybkiej ewolucji w wyniku presji fungicydowej, ich wpływ na mikroorganizmy niebędące celem działania środków ochrony roślin budzi obawy [11, 23]. Jakość i żyzność gleby jest ściśle związana z  aktywnością mikroorganizmów glebowych –  bak­ terii i grzybów. Mikroorganizmy te odgrywają kluczową rolę w obiegu pierwiastków, w tym węgla, azotu, fosforu czy siarki, jak również w procesach tworzenia gleby [5]. Liczne grupy bakterii zasiedlające ryzosferę biorą udział w  promowaniu wzrostu roślin poprzez wydzielanie enzymów i hormonów wspomagających wzrost roślin, wydzielanie sideroforów ułatwiających wiązanie żelaza, jak również chronią przed patogenami [19, 31, 45]. Tym samym zmiany w obrębie zespołów mikroorganizmów glebowych powstałe pod wpływem wprowadzenia do środowiska fungicydów mogą negatywnie wpływać na żyzność gleby, a w konsekwencji prowadzić do spadku produkcji plonów [11]. Wyniki wielu badań wskazują, że stosowanie fungicydów może skutkować naruszeniem stabilności zespołu mikroorganizmów glebowych objawiającym się m.in. spadkiem liczebności mikroorganizmów niebędących celem działania fungicydu. Zmniejszenie liczeb­ności niepatogennych saprofitycznych grzybów glebowych obserwowano m.in. w przypadku wprowadzenia do gleby fungicydów takich jak ditianon [29], pencykuron [40, 41] czy prochloraz [50]. Zmniejszenie biomasy mikroorganizmów notowano także pod wpływem tebukonazolu [37], pencykuronu stosowanego do ochrony upraw ryżu [41] czy w wyniku długotrwałej aplikacji fungicydów opartych na związkach miedzi [54]. Toksyczny efekt w stosunku do bakterii zasiedlających tereny podmokłe i osady denne wykazywały także fungicydy tiram, kaptan i benomyl [33]. Ahemad i Khan [1] wykazali hamujący wpływ fungicydów (heksakonazolu, metalaksylu i kitazinu) na wzrost i aktywność bakterii promujących wzrost roślin (PGPB, plant growth promoting bacteria) z rodzaju Rhizobium. W  wyniku stosowania rekomendowanych przez producenta dawek pestycydów obserwowano także ich hamujący wpływ na proces bakteryjnej syntezy auksyny i sideroforów. Fungicydy mogą także wpływać na aktywność enzymatyczną gleby. Zmniejszenie ogólnej aktyw­ności enzymatycznej gleby mierzonej jako zdolność do rozkładu

ODDZIAŁYWANIE FUNGICYDÓW NA MIKROORGANIZMY W ŚRODOWISKU GLEBOWYM

dwuoctanu fluoresceiny (FDA) obserwowano w glebie traktowanej iprodionem [34], a krótkotrwały spadek odnotowano w glebie traktowanej pencykuronem [40, 41]. Pod wpływem ditianonu obserwowano spadek aktywności enzymatycznej mierzonej jak zdolność redukcji dimetylosulfotlenku (DMSO) do siarczku dimetylu (DMS) [29], natomiast zmniejszenie aktywności dehydrogenazy stwierdzono w glebach traktowanych azoksytrobinem, chlorotalonilem i tebukonazolem [7, 49], mefenoksamem czy metalaksylemem [35]. Tebukonazol powodował także spadek aktywności ureazy, arylsulfatazy, β-glukozydazy i fosfatazy zasadowej w glebie badanej przez Muñoz-Leoz i wsp. [37]. Spadek aktywności ureazy, fosfatazy kwaśnej i inwertazy obserwowano również w glebach pochodzących z sadu opryskiwanego fungicydami [54]. Negatywny wpływ fungicydów na aktywność fosfataz obserwowano w glebach traktowanych kaptanem [44], benomylem [10] czy mieszaniną mankozebu i dimetomorfu [12]. Stosowanie fungicydów może prowadzić także do zaburzenia przemian związków azotowych [59]. Odnotowano, że tiram i kaptan powodowały zmniejszenie tempa procesu denitryfikacji [33], a tebukonazol w ciągu pierwszych 30  dni eksperymentu powodował zaburzenia procesu nitryfikacji [37]. Z drugiej strony wykazano, że w odpowiedzi na wprowadzenie niektórych fungicydów do środowiska obserwowany jest wzrost aktywności enzymatycznej mikroorganizmów. Zwiększenie aktywności dehydrogenazy, ureazy, β-glukozydazy i fosfatazy obserwowano w odpowiedzi na wprowadzenie do gleby prochlorazu [50]. W glebie traktowanej flua­zi­namem obserwowano wzrost aktywności chitynaz i α-glukozydaz, chociaż towarzyszył temu spadek aktywności aminopeptydazy leucynowej [38]. Aplikacja fungicydów może przyczyniać się do zmiany funkcjonalnej bioróżnorodności bakteryjnych zespołów [30, 37, 56], zmniejszenia bioróżnorod­ności zespołów mikroorganizmów i zmiany struktury zespołów mikroorganizmów glebowych [23]. Przykładowo kaptan powodował zmiany w strukturze zespołu bakterii zasiedlających osady denne [58]. Natomiast Yen i  wsp. [60] obserwowali wpływ triadimefonu i  propikonazolu na strukturę zespołu bakterii, który był widoczny po 2  miesiącach od aplikacji. Wykazano również zmiany w strukturze zespołu bakterii i redukcję bioróżnorodności mikroorganizmów glebowych powstałą w wyniku wielokrotnej aplikacji karbendazymu [55]. Konsekwencją wyżej wymienionych zmian zachodzących w zespole mikroorganizmów glebowych może być spadek tempa procesów odpowiedzialnych za mikrobiologiczną degradację pestycydów w glebie. Udowodniono, że aplikacja fungicydu chlorotalonilu do gleby powodowała wzrost trwałości herbicydów w glebie – czterokrotny w przypadku izoproturonu [16] oraz dwukrotny w przypadku metalochloru [57].

15

Należy jednak zaznaczyć, że w wielu opisywanych w literaturze przypadkach negatywny wpływ pestycydów na ekosystem glebowy obserwowany był w sytua­ cji narażenia mikroorganizmów na dawki znacznie przewyższające stężenia zalecane przez producenta. Często wpływ fungicydów stosowanych w rekomendowanych dawkach na mikroorganizmy glebowe był niewielki bądź krótkotrwały [23, 40, 50, 56, 57]. Ponadto obserwowany wpływ fungicydów na funkcjonowanie ekosystemów glebowych może też być mniejszy niż to wynika z przewidywań dokonanych w oparciu o wyniki badań toksyczności związku. Chociaż badania mogą wskazywać na wysoką toksyczność testowanego związku w stosunku do konkretnego szczepu lub grupy mikroorganizmów, jednak jego wprowadzenie do środowiska może nie mieć istotnego wpływu na funkcjonowanie ekosystemu. Dzieje się tak w przypadku, gdy inne mikroorganizmy przejmują rolę fizjologiczną tych, które na skutek zanieczyszczenia pestycydami wypadły ze składu zespołu mikroorganizmów [32]. 4. Triazole – charakterystyka i wpływ na ekosystem glebowy Najliczniejszą grupą fungicydów wykorzystywanych w rolnictwie i w sadownictwie są związki z grupy azoli. Fungicydy azolowe zapobiegają rozwojowi patogennych grzybów takich jak Podosphaera leucotricha, Venturia inaequalis, Mycosphaerella fragarie, Oidium lycopersicum, Cercospora beticola czy grzybów z rodzaju Fusarium. Do najczęściej stosowanych fungicydów z grupy azoli należą triazole [53]. Mechanizm ich działania polega na hamowaniu zależnej od cytochromu  P450 14α-demetylazy lanosterolu, w wyniku, czego dochodzi do zahamowania biosyntezy ergosterolu [2, 9]. Jednym ze środowisk silnie narażonych na długotrwały wpływ fungicydów triazolowych są sady. Prowadzenie sadów wiąże się z koniecznością aplikacji pestycydów o podobnym zakresie działania na tym samym obszarze przez wiele lat [54]. Jednakże częste stosowanie fungicydów z tej grupy może prowadzić do pojawiania się szczepów charakteryzujących się mniejszą wrażliwością na stosowane triazole [8, 9]. Holb i Schnabel [22] wykazali, że szczepy grzybów Monilinia fucticola izolowane z gleby z sadu brzoskwiniowego, w którym od 10  lat stosowano triazole, charakteryzowały się mniejszą wrażliwością na fenbukonazol, tebukonazol oraz propikonazol w porównaniu do szczepu izolowanego z terenu, gdzie triazole nie były stosowane. Azole zaliczane są do fungicydów charakteryzujących się średnim ryzykiem wystąpienia oporności u grzybów. Uważa się, że do pojawienia się szczepów opornych konieczne jest występowanie w komórce jednocześnie kilku mechanizmów oporności [9]. Szczepy

16

SŁAWOMIR SUŁOWICZ, ZOFIA PIOTROWSKA-SEGET

grzybów tracą wrażliwość na triazole dzięki usuwa­ niu ich cząsteczek z  komórki z  wykorzystaniem transporterów ABC (superrodziny białek transportowych odpowiedzialnych za usuwanie z komórki m.in. metali czy antybiotyków) oraz nadprodukcji hamowanej 14α-demetylazy lanosterolu. Ponadto możliwa jest także zmiana w strukturze następnego enzymu szlaku biosyntezy sterolu, 5-6-desaturazy sterolu, która umożliwia przekształcanie metylowanego substratu [13, 47]. Badania dotyczące fungicydów z grupy triazoli wskazują, że ich stosowanie może prowadzić także do powstania oporności krzyżowej. Karaoglanidis i Thanassoulopoulos [24] obserwowali oporność krzyżową na różne fungicydy triazolowe u  grzyba Cercospora beticola (chwościk burakowy). Zjawisko to obserwowano również u szczepów Cercospora beticola, których oporność na tetrakonazol była wynikiem mutagenezy indukowanej światłem UV. W tym przypadku grzyby charakteryzowały się dodatkowo opornością na inne triazole –  difenokonazol i penkonazol oraz fungicyd pirymidynowy nuarimol [36]. Badania Hayashi i wsp. [20] nad opornością na okspokonazol u wywołującego pleśń szarą grzyba Botrytis cinerea wskazują, że zmniejszeniu jego wrażliwości na stosowany fungicyd towarzyszy wzrost ekspresji genu kodującego białko BcatrD, będącego transporterem ABC. Wzrost ekspresji genu kodującego to białko obserwowano także pod wpływem iprodionu (dikarboksyimid) oraz karbendazymu (benzimidazol), jak również antybiotyku cykloheksymidu. Wyniki te wskazują, że powstała pod wpływem triazoli wielo­ oporność może obniżać także skuteczność pestycydów należących do innych grup chemicznych, jak również sprzyjać rozprzestrzenianiu się antybiotykoopor­ ności. Na korelację między stosowaniem pestycydów a  opornością grzybów na antybiotyki wskazuje też Verweij i wsp. [53]. Spośród izolowanych od pacjentów w Holandii opornych na azole patogennych szczepów Aspergillus fumigatus, 94% charakteryzowało się tym samym rodzajem mechanizmu oporności. Obejmował on substytucję leucyny na histydynę w kodonie 98 genu cyp51A, kodującego 14-α-demetylazę i wstawienie 34-zasadowego tandemowego powtórzenia w obrębie promotora. Autorzy sugerują, że kliniczne szczepy grzybów nabyły tę zdolność w wyniku stosowania fungicydów azolowych w rolnictwie. Hipotezę tę wspiera fakt, że większość szczepów izolowanych z gleby użytkowanej rolniczo posiada ten sam mechanizm opor­ ności, co szczepy izolowane od pacjentów. Przytoczone przez autorów statystyki wskazują, że chociaż zużycie pestycydów w krajach Unii Europejskiej zmniejszało się w  ostatnich dziesięcioleciach, to zużycie fungicydów w Holandii w latach 1995–2007 utrzymywało się na stałym poziomie, a ilość stosowanych w tym czasie triazoli nawet się podwoiła. Przykładowo, w 2004 roku

ilość stosowanych w Holandii związków azolowych w rolnictwie była około 320 razy większa od stosowanej w lecznictwie. Prowadzi to do powstania silnej presji selekcyjnej sprzyjającej rozwojowi i rozprzestrzenianiu się skutecznego mechanizmu oporności na azole. Wykazano także, że niektóre fungicydy hamujące syntezę ergosterolu (SBI, sterol biosynthesis inhibitors) zwiększają toksyczny efekt insektycydów z grupy pyretroidów. Mieszanina α-cypermetryny z epoksykonazolem lub propikonazolem powodowała 6–7-krotny wzrost toksyczności w środowisku wodnym względem Daphnia magna w porównaniu do wartości spodziewanej na podstawie modelu teoretycznego [39]. Wykorzystanie triazoli w rolnictwie i sadownictwie wpływa także na bakterie zasiedlające gleby. Mimo że w  skład błon bakteryjnych nie wchodzą sterole, fungicydy należące do azoli mogą wywierać wpływ na te mikroorganizmy. Przykładowo obserwowano długoterminowy wpływ triadimefonu na strukturę zespołu bakteryjnego, natomiast stosowanie tritikonazolu stymulowało namnażanie się bakterii w glebie. W przypadku aplikowania do gleby propikonazolu notowano zmniejszenie aktywności enzymatycznej bakterii [59]. 5. Podsumowanie Skażenie środowiska glebowego przez środki och­ rony roślin jest jednym z wielu negatywnych aspektów działalności rolniczej prowadzonej przez człowieka. Obok rozwoju miast i skutków działalności przemysłowej przyczynia się ona do degradacji i zanieczyszczenia gleb w wielu miejscach Europy. Według szacunków Unii Europejskiej, ponad 115 milionów hektarów narażonych jest na erozję wodną, kolejne 42 miliony hektarów na erozję powietrzną, a około 3,5 miliona miejsc w Europie określa się jako potencjalnie zanieczyszczone [26]. Dane te skłoniły do podjęcia działań, mających na celu kompleksową ochronę gleby. Przyjęta 13 listopada 2007 roku przez Parlament Europejski rezolucja Komisji Europejskiej w sprawie strategii tematycznej w dziedzinie ochrony gleby „Towards a Thematic Strategy for Soil Protection” zobowiązuje kraje członkowskie do utworzenia ramowego prawodawstwa regulującego ochronę i określającego kierunki zrównoważonego użytkowania gleby, w tym utrzymania biologicznej bioróżnorodności środowiska glebowego. Przyjęta strategia zobowiązuje także do prowadzenia badań dotyczących metod rekultywacji, zapobiegania dalszej degradacji gleb oraz wprowadzenie monitoringu jakości gleb, z uwzględnieniem nie tylko fizykochemicznych, ale i biologicznych parametrów. Tym samym szczególnie ważne stają się badania mające na celu zrozumienie interakcji między organizmami zasiedlającymi glebę, a wprowadzanymi do środowiska ksenobiotykami, takimi jak pestycydy [46].

ODDZIAŁYWANIE FUNGICYDÓW NA MIKROORGANIZMY W ŚRODOWISKU GLEBOWYM

Podziękowania Artykuł powstał w wyniku realizacji projektu finansowanego ze środków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji numer DEC-2011/01/N/NZ9/00245.

Piśmiennictwo   1. Ahemad M., Khan M.S.: Effects of insecticides on plant-growth-promoting activities of phosphate solubilizing rhizobacterium Klebsiella sp. Strain PS19. Pestic. Biochem. Physiol. 100, 51–56 (2011)   2. Amer M.M., Shehata M.A., Lotfy H.M., Monir H.H.: Determination of tetraconazole and diniconazole fungicide residues in tomatoes and green beans by capillary gas chromatography. Yakugaku Zasshi, 127, 993–999 (2007)  3. Arias-Estévez M., López-Periago E., Martínez-Carballo E., Simal-Gándara J., Mejuto J-C., García-Río L.: The mobility and degradation of pesticides in soils and the pollution of ground­ water resources. Agric. Ecosyst. Environ. 123, 247–260 (2008)   4. Baker-Austin C., Wright M.S., Stepanauskas R., McArthur J.V.: Co-selection of antibiotic and metal resistance. Trends Microbiol. 14, 176–182 (2006)   5. Barrios E.: Soil biota, ecosystem services and land productivity. Ecol. Econ. 64, 269–285 (2007)   6. Bateman R.: Rational pesticide use: spatially and temporally targeted application of specific products (w) Optimising Pesticide Use, red. M.F. Wilson, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2003, s. 131–159  7. Bending G., Rodriguez-Cruz M.S., Lincoln S.D.: Fungicide impacts on microbial communities in soils with contrasting management histories. Chemosphere, 69, 82–88 (2007)   8. Brent K.J., Hollomon D.: Fungicide resistance in crop pathogens: how can it be managed? FRAC, Monograph No. 1 (second, revised edition), 2007, http://www.frac.info/publications/downloads (11.02.2015)   9. Brent K.J., Hollomon D.: Fungicide resistance: the assessment of risk. FRAC Monograph No. 2 (second, revised edition), 2007, http://www.frac.info/publications/downloads (11.02.2015) 10. Chen S.-K., Edwards C.A., Subler S.: Effects of the fungicides benomyl, captan and chlorothalonil on soil microbial activity and nitrogen dynamics in laboratory incubations. Soil Biol. Biochem. 33, 1971–1980 (2001) 11. Chowdhury A., Pradhan S., Saha M., Sanyal N.: Impact of pesticides on soil microbiological parameters and possible bioremediation strategies. Indian J. Microbiol. 48, 114–127 (2008) 12. Cycoń M., Piotrowska-Seget Z., Kozdrój J.: Responses of indigenous microorganisms to a fungicidal mixture of mancozeb and dimethomorph added to sandy soils. Int. Biodeter. Biodegr. 64, 316–323 (2010) 13. de Waard M.A., Andrade A.C., Hayashi K., Schoonbeek H., Stergiopoulos I., Zwiers L.: Impact of fungal drug transporters on fungicide sensitivity, multidrug resistance and virulence. Pest. Manag. Sci. 62, 195–207 (2006) 14. EU Pesticides Database, http://ec.europa.eu/food/plant/protection/evaluation/database_act_subs_en.htm (11 lutego 2015 roku) 15. European Crop Protection Association, http://www.ecpa.eu/ information-page/industry-statistics-ecpa-total (11.02.2015) 16. Fogg P., Boxall A.B.A., Walker A.: Degradation of pesticides in biobeds: The effect of concentration and pesticide mixtures. J. Agric. Food Chem. 51, 5344–5349 (2003) 17. FRAC Code List 2014: Fungicides sorted by mode of action (including FRAC Code numbering), http://www.frac.info (11.02.2015)

17

18. Gevao B., Semple K.T., Jones K.C.: Bound pesticide residue in soils: a review. Environ. Pollut. 108, 3–14 (2000) 19. Glick B.R.: Using soil bacteria to facilitate phytoremediation. Biotech. Adv. 28, 367–374 (2010) 20. Hayashi K., Schoonbeek H., Sugiura H., De Waard M.A.: Multi­ drug resistance in  Botrytis cinerea associated with decreased accumulation of the azole fungicide oxpoconazole and increased transcription of the ABC transporter gene Bcatr D. Pestic. Biochem. Physiol. 70, 168–179 (2001) 21. Hof H.: Is there a serious risk of resistance development to azoles among fungi due to the widespread use a long-term application of azoles antifungals in medicine? Drug Resist. Updates, 11, 25–31 (2008) 22. Holb I.J., Schnabel G.: Differential effect of triazoles on mycelia growth and disease measurements of Monilinia fructicola isolates with reduced sensitivity to DMI fungicides. Crop Prot. 26, 753–759 (2007) 23. Imfeld G., Vuilleumier S.: Measuring the effects of pesticides on bacterial communities in soil: A critical review. Eur. J. Soil Biol. 49, 22–30 (2012) 24. Karaoglanidis G.S., Thanassoulopoulos C.C.: Cross-resistance patterns among sterol biosynthesis inhibiting fungicides (SBIs) in Cercospora beticola. Eur. J. Plant Pathol. 109, 929–934 (2003) 25. Klose S., Wu B.M., Ajwa H.A., Koike S.T., Subbarao K.V.: Reduced efficacy of rovral and botran to control Sclerotinia minori in lettuce production in the Salinas Valley may be related to accelerated fungicide degradation in soil. Crop Prot. 29, 751–756 (2010) 26. Komunikat Komisji Wspólnot Europejskich pt. „Strategia tematyczna w dziedzinie ochrony gleby” z dnia 22.09.2006 (COM (2006)0231), http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ. do?uri=COM:2006:0231:FIN:PL:PDF (11 lutego 2015) 27. Leroux P., Chapeland F., Arnold A., Gredt M.: New cases of negative cross-resistance between fungicides, including sterol biosynthesis inhibitors. J. Gen. Plant Pathol. 66, 75–81 (2000) 28. Leroux P., Fritz R., Debieu D., Albertini C., Lanen C., Bach J., Gredt M., Chapeland F.: Mechanisms of resistance to fungicides in field strains of Botrytis cinerea. Pest Manag. Sci. 58, 876–888 (2002) 29. Liebich J., Schäffer A., Burauel P.: Structural and functional approach to studying pesticide side-effects on specific soil function. Environ. Toxicol. Chem. 22, 784–790 (2003) 30. Lupwayi N.Z., Harker K.N., Dosdall L.M., Turkington K., Blackshaw R.E., O’Donowan J.T., Cárcamo H.A., Otani J.K., Clayton G.W.: Changes in functional structure of soil bacterial communities due to fungicide and insecticide applications in canola. Agr. Ecosyst. Environ. 130, 109–114 (2009) 31. Ma Y., Prasad M.N.V., Rajkumar M., Freitas H.: Plant growth promoting rhizobacteria and endophytes accelerate phytoremediation of metalliferous soils. Biotech. Adv. 29, 248–258 (2011) 32. Mele P.M., Crowley D.E.: Application of self-organizing maps for assessing soil biological quality. Agr. Ecosyst. Environ. 126, 139–152 (2008) 33. Milenkovski S., Bååth E., Lindgren P-E., Berglund O.: Toxicity of fungicides to natural bacterial communities in wetland water and sediment measured using leucine incorporation and potential denitrification. Ecotoxicology, 19, 285–294 (2010) 34. Miñambres G.G., Conles E.I.L., Verdenelli R.A., Meriles J.M., Zygadlo J.A.: Application of thymol and iprodione to control garlic white rot (Sclerotium cepivorum) and its effect on soil microbial communities. World J. Microb. Biot. 26, 161–170 (2009) 35. Monkiedje A., Spiteller M.: Effects of the phenylamide fungicides, mefenoxam and metalaxyl, on the microbiological properties of a sandy loam and a sandy clay soil. Biol. Fert. Soils 35, 393–398 (2002)

18

SŁAWOMIR SUŁOWICZ, ZOFIA PIOTROWSKA-SEGET

36. Moretti M., Arnoldi A. D’Agostina A., Farina G., Gozzo F.: Characterization of fields-isolates and derived DMI-resistant strains of Cercospora beticola. Mycol. Res. 107, 1178–1188 (2003) 37. Muñoz-Leoz B., Ruiz-Romera E., Antigüedad I., Garbisu C.: Tebuconazole application decreases soil microbial biomass and activity. Soil Biol. Biochem. 43, 2176–2183 (2011) 38. Niemi R.M., Heiskanen I., Ahtiainen J.H., Rahkonen A., Mäntykoski K., Welling L., Laitinen P., Ruuttunen P.: Microbial toxicity and impacts on soil enzyme activities of pesticides used in potato cultivation. App. Soil Ecol. 41, 293–304 (2009) 39. Nørgaard J., Cedergreen N.: Pesticide cocktails can interact synergistically on aquatic crustaceans. Environ. Sci. Pollut. R. 17, 957–967 (2010) 40. Pal R., Chakrabarti K., Chakraborty A., Chowdhury A.: Pencycuron application to soils: Degradation and effect on microbiological parameters. Chemosphere, 60, 1513–1522 (2005) 41. Pal. R., Das P., Chakrabarti K., Chakraborty A., Chowdhury A.: Side effects of pencycuron on nontarget soil microorganisms in waterlogged soil: Field experiment. App. Soil Ecol. 38, 161–167 (2008) 42. Pimentel D., Burgess M.: Small amount of pesticides reaching target insects. Environ. Dev. Sustain. 14, 1–2 (2012) 43. Pimentel D.: Amounts of pesticides reaching target pests: Environmental impacts and ethics. J. Agr. Environ. Ethic. 8, 17–29 (1995) 44. Piotrowska-Seget Z., Engel R., Nowak E., Kozdrój J.: Successive soil treatment with captan or oxytetracycline affects non-target microorganisms. World J. Microb. Biot. 24, 2843–2848 (2008) 45. Rajkumar M., Ae N., Narasimha M., Prasad V., Freitas H.: Potential of siderophore-producing bacteria for improving heavy metal phytoextraction. Trends Biotech. 28, 142–149 (2010) 46. Rezolucja Parlamentu Europejskiego z dnia 13 listopada 2007 r. w  sprawie strategii tematycznej w dziedzinie ochrony gleby (2006/2293(INI), http://www.europarl.europa.eu/sides/getDoc. do?pubRef=-//EP//TEXT+TA+P6-TA-2007-0504+0+DOC+ XML +V0//PL (11.02.2015) 47. Schnabel G., Jones A.L.: The 14α-demethylase (CYP51A1) gene is overexpressed in Venturia inaequalis strains resistant to myclo­ butanil. Phytopatology, 91, 102–110 (2001) 48. Shafiani S., Malik A.: Tolerance of pesticides and antibiotic resistance in bacteria isolated from wastewater-irrigated soil. World J. Microb. Biot. 19, 897–901 (2003) 49. Sopeña F., Bending G.D.: Impacts of biochar on bioavailability of the fungicide azoxystrobin: a comparison of the effect

on biodegradation rate and toxicity to the fungal community. Chemosphere, 91, 1525–1533 (2013) 50. Tejada M., Gómez I., Garcia-Martinez A.M., Osta P., Parrado J.: Effects of prochloraz fungicide on soil enzymatic activities and bacterial communities. Ecotox. Environ. Safe. 74, 1708–1714 (2011) 51. The WHO recommended classification of pesticides by hazard and guidelines to classification: 2009, World Health Organization 2010, http://www.who.int/ipcs/publications/pesticides_ hazard/en/ (11.02.2015) 52. Vergucht S., De Voghel S., Misson C., Vrancken, C., Callebaut K., Steurbaut W., Pussemier L., Marot J., Maraite H., Vanhaecke P.: Health and environmental effects of pesticides and type 18 biocides (HEEPEBI). Belgian Science Policy and  Federal Public Service, Health, Food Chain Safety and Environment, Brussels, Belgium (2006) 53. Verweij P.E., Snelders E., Kema G.H.J., Mellado E., Melchers W.J.G.: Azole resistance in Aspergillus fumigates: a side-effect of environmental fungicide use? Lancet Infect. Dis. 9, 789–795 (2009) 54. Wang Q-Y., Zhou D-M., Cang L.: Microbial and enzyme properties of apple orchard soil as affected by long-term application of copper fungicide. Soil Biol. Biochem. 41, 1504–1509 (2009) 55. Wang X., Song M., Gao Ch., Dong B., Zhang Q., Fang H., Yu Y.: Carbendazim induces a temporary change in soil bacterial community structure. J. Environ. Sci. 21, 1679–1683 (2009) 56. Wang X., Song M., Wang Y., Gao Ch., Zhang Q., Chu X., Fang H., Yu Y.: Response of soil bacterial community to repeated applications of carbendazim. Ecotox. Environ. Safe. 75, 33–39 (2012) 57. White P.M., Potter T.L., Culbreath A.K.: Fungicide dissipation and impact on metolachlor aerobic soil degradation and soil microbial dynamics. Sci. Total Environ. 408, 1393–1402 (2010) 58. Widenfalk A., Bertilsson S., Sundh I., Goedkoop W.: Effects of pesticides on community composition and activity of sediment microbes – responses at various levels of microbial community organization. Environ. Pollut. 152, 576–584 (2008) 59. Yang Ch., Hamel Ch., Vujanovic V., Gan Y., 2011, Fungicide: Modes of action and possible impact on nontarget microorganisms. ISRN Ecology, DOI: 10.5402/2011/130289 (2011) 60. Yen J.H., Chang J.S., Huang P.J., Wang Y.S.: Effects of fungicides triadimefon and propiconazole on soil bacterial communities. J. Environ. Sci. Health, (B), 44, 681–689 (2009)

POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 19–26 http://www.pm.microbiology.pl

WYKORZYSTANIE ODPADÓW POCHODZĄCYCH Z PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO DO PRODUKCJI BIOMASY DROŻDŻY PASZOWYCH CANDIDA UTILIS Agnieszka Kurcz1*, Stanisław Błażejak1, Anna Maria Kot1, Anna Bzducha-Wróbel1

1

 Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Wydział Nauk o Żywności, Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny Żywności, Zakład Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Wpłynęło w lutym 2015 r. Zaakceptowano w czerwcu 2015 r.

1. Wstęp. 2. Biotechnologiczne wykorzystanie drożdży Candida utilis. 3. Surowce wykorzystywane do produkcji biomasy drożdży paszo­ wych. 4. Produkcja biopaliw i gospodarka odpadami z produkcji biodiesla. 4.1. Wykorzystanie glicerolu w procesach biotechnologicznych 5.  Produkcja skrobi ziemniaczanej. 5.1. Charakterystyka odpadowej ziemniaczanej wody sokowej i kierunki jej wykorzystania. 6. Podsumowanie The use of agri-food industry waste for the production of Candida utilis fodder yeast biomass Abstract: Both glycerol and potato wastewater are difficult-to-utilize waste from industrial processing. Thus, it is necessary to search for new economical methods of waste utilization to obtain products of higher value, decrease the production costs and protect the environment. One of the solutions to this problem might be simultaneous application of glycerol and potato wastewater as components of culture media for the production of Candida utilis fodder yeast biomass. This yeast strain is able to use glycerol from culture media as the only source of carbon, while the deproteinated potato wastewater might be the source of nitrogenous compounds and minerals. As a result, there is the possibility to obtain C. utilis fodder yeast biomass rich in such valuable nutrients as protein, fat, β-glucans, vitamins and microelements. 1. Introduction. 2. Biotechnological use of the yeast Candida utilis. 3. Raw materials used for the production of fodder yeast biomass. 4. Production of biofuels and the management of biodiesel post-production waste. 4.1. The use of glycerol in biotechnological processes. 5. Production of potato starch. 5.1. Characteristics of potato wastewater and its potential usage. 6. Conclusion Słowa kluczowe: biodiesel, SCP, skrobia ziemniaczana, utylizacja odpadów Key words: biodiesel, SCP, potato starch, waste utilization

1. Wstęp W ostatnich latach problem ochrony środowiska naturalnego stał się jednym z najważniejszych priorytetów polityki międzynarodowej, szczególnie wśród krajów rozwiniętych. Problem postępującej degradacji środowiska spowodowany jest przede wszystkim dużymi ilościami odpadów produkowanych przez człowieka. Dotyczy to zarówno odpadów komunalnych, jak i tych wytwarzanych przez przemysł. Stanowią one często produkt bardzo trudny do utylizacji lub zagospodarowania, nie wspominając o możliwości ekonomicznego ich wykorzystania. Odprowadzanie odpadów do ścieków pociąga za sobą ryzyko nałożenia na zakład wysokich kar pieniężnych, a większość sposobów utylizacji i składowania jest kosztowna i nieopłacalna. Istnieją jednak metody przekształcania odpadów przemysłowych do produktów o wartości dodanej. Jednym z rozwiązań może być próba zastosowania ich jako surowców do produkcji biomasy drobnoustrojów. Idea produkcji biomasy i wykorzystania mikro­ organizmów jako źródła żywności dla ludzi i zwierząt powstała już na początku dwudziestego wieku. Termin SCP – single-cell protein (białko jednokomórkowców)

został po raz pierwszy wykorzystany w  1966  roku w  Massachusetts Institute of Technology [2]. Liczne badania [17, 46] nad możliwością produkcji białka drobnoustrojów wykazały szereg jego zalet, dzięki którym przewyższa białko pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Do najważniejszych należą: krótki czas generacji mikroorganizmów, wysoka zawartość białka o odpowiedniej jakości w komórkach oraz możliwość kształtowania profilu aminokwasowego białek poprzez regulację składu podłoża, warunków hodowli lub modyfikacje genetyczne danego szczepu. Ponadto produkcja SCP może być prowadzono w procesie ciągłym i jest niezależna od czynników klimatycznych. Do jego otrzymywania stosowane są przede wszystkim drożdże (Candida, Saccharomyces), a także bakterie (Cellulomonas, Alcaligenes), grzyby strzępkowe (Aspergillus, Penicillium) i glony (Chlorella, Scenedesmus) [17]. 2. Biotechnologiczne wykorzystanie drożdży Candida utilis Nazwa gatunkowa drożdży Candida utilis występuje w literaturze pod wieloma synonimami, między innymi Pichia jadinii, Saccharomyces jadinii, Torula utilis.

*  Autor korespondencyjny:  Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Wydział Nauk o Żywności, Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny Żywności, Zakład Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, ul. Nowoursynowska 159C, 02-776 Warszawa; tel. (022) 59 37 663; e-mail: [email protected]

20

AGNIESZKA KURCZ, STANISŁAW BŁAŻEJAK, ANNA MARIA KOT, ANNA BZDUCHA-WRÓBEL

Najczęściej traktowane były jako aseksualna forma gatunku Pichia jadiini [22], chociaż najnowsze badania zaprzeczają bliskiemu pokrewieństwu filogenetycznemu tych dwóch gatunków [50]. Obecnie, według National Center for Biotechnology Information (NCBI), gatunek C. utilis jest klasyfikowany jako anamorficzna forma Cyberlindnera jadinii [35]. Drożdże, jako organizmy pozbawione chlorofilu, nie są zdolne do przeprowadzania procesu fotosyntezy. Do rozwoju i wzrostu wymagają organicznych form węgla, w  związku z  czym zaliczane są do chemoorganotrofów. Drożdże dzikie, do których należy rodzaj Candida, w przeciwieństwie do drożdży szlachetnych (Saccharomyces), nie są wymagające pod względem wykorzystywanych źródeł węgla i obecności substancji biologicznie aktywnych [52]. Drożdże C. utilis wykazują zdolność do fermentacji glukozy i sacharozy. Ponadto asymilują maltozę, rafinozę, trehalozę, celobiozę, ksylozę, inulinę, etanol, glicerol, cytryniany i azotany [22]. Optymalna temperatura dla ich wzrostu wynosi 25–30°C, a pH mieści się w zakresie 4,0–6,0 [3]. Drożdże C. utilis spełniają wszystkie wymagania stawiane drożdżom paszowym: wysoka zawartość białka w suchej substancji, maksymalne wykorzystanie wszystkich obecnych w pożywce substancji odżywczych, mała wrażliwość na substancje toksyczne w podłożu hodowlanym oraz krótki czas generacji [15]. Ponadto ich stosunkowo duże wymiary ułatwiają separację komórek z podłoża po hodowli [32]. Istotny jest również fakt, że zawartość kwasów nukleinowych w komórkach tych drożdży jest mniejsza niż u innych gatunków. Wynosi zwykle około 100 g/kg biomasy, a w przypadku drożdży Saccharomyces cerevisiae – 160 g/kg biomasy [3]. Koncepcja wykorzystania drożdży C. utilis do produkcji żywności na szeroką skalę została po raz pierwszy zaproponowana przez niemieckich pracowników Instytutu Przemysłu Fermentacyjnego w Berlinie podczas I Wojny Światowej. Wynikało to głównie z możliwości wykorzystania tanich substratów odpadowych jako składników podłoża hodowlanego, a w szczególności pentozanów i ługów posulfitowych z produkcji papieru [22]. Obecnie gatunek C. utilis został uznany przez FDA (Food and Drug Administration – Agencja Żywności i Leków) za bezpieczny do spożycia i wpisany na amerykańską listę GRAS (Generally Recognized As Safe – „uważane za bezpieczne”). Dzięki temu biomasa tych drożdży, jak i ich metabolity, mogą być stosowane zarówno w przemyśle spożywczym, jak i w produkcji pasz [28]. Zainteresowanie drożdżami C. utilis jako źródłem białka wynika z dużej jego zawartości w suchej substancji tych komórek, zwykle od 45 do 75%. Charakteryzuje się ono wysoką wartością odżywczą oraz dobrą strawnością sięgająca 50%. W skład tego białka wchodzi duża zawartość aminokwasów egzogennych, a w szcze-

gólności lizyny. Zawartość tego aminokwasu w komórkach drożdży C. utilis wynosi około 7,1 g/100 g białka. Pomimo dobrze zbilansowanego składu aminokwasowego, białko to cechuje się niedoborem aminokwasów siarkowych, w szczególności metioniny i cysteiny. Zawartość aminokwasów może być jednak regulowana, gdyż jest w dużej mierze zależna od rodzaju podłoża hodowlanego i zawartych w nim składników [3, 52]. W biomasie komórkowej drożdży C. utilis stwierdzono obecność witamin z grupy B, na przykład ryboflawiny, kwasu foliowego i nikotynowego. Zawartość kwasu pantotenowego i pirydoksyny jest nawet wyższa niż w przypadku innych drożdży, takich jak S. cerevisiae czy Kluyveromyces marxianus [3, 54]. Gatunek C. utilis zdolny jest również do produkcji ergosterolu, związku z grupy steroidów, będących bezpośrednim prekursorem witaminy D2. Drożdże te mogą gromadzić ergosterol na poziomie od 1 do 3% w suchej substancji, zależnie od wieku komórek oraz warunków prowadzenia hodowli [30, 44]. Gatunek C. utilis może stanowić bardzo dobre źródło składników mineralnych. Drożdże te zawierają więcej wapnia, potasu, fosforu, cynku i manganu w  porównaniu do innych gatunków, np. S. cerevisiae. Drożdże C. utilis są zdolne do wiązania jonów metali z podłoża hodowlanego często w ilości przekraczającej naturalne zapotrzebowanie, a następnie ich wewnątrzkomórkowej bioakumulacji i włączenia w struktury komórkowe. Podczas hodowli w podłożu suplementowanym jonami magnezu uzyskano biomasę drożdżową zawierająca 9,09 mg  Mg2+/gs.s., czyli prawie 10-krotnie więcej niż w hodowli kontrolnej. Dzięki tym właściwościom istnieje możliwość wykorzystania drożdży w produkcji tak zwanych biopleksów – połączeń jonów metali z białkami. Mogą one być wykorzystywane w suplementacji diety, gdyż składniki mineralne w takiej formie są łatwiej przyswajalne przez organizmy ludzi i zwierząt niż połączenia nieorganiczne [4]. Drożdże paszowe są również stosowane w żywieniu zwierząt gospodarskich. Mogą być one dodawane do pasz w dwojaki sposób: jako komponenty, mające za zadanie zwiększenie wartości odżywczej paszy lub w postaci żywych kultur. W ostatnich latach obserwuje się wzrost znaczenia drożdży jako dodatku paszowego, co związane jest głównie z kryzysem BSE, który przyczynił się do wprowadzenia od listopada 2004 roku zakazu stosowania mączek pochodzenia zwierzęcego jako składnika paszy [8]. W paszach roślinnych aminokwasem ograniczającym jest lizyna, która z  kolei występuje w dużych ilościach (8,3–7,1 g/100g) w białku drożdżowym. Przygotowanie odpowiednich mieszanek z  drożdżami paszowymi umożliwia otrzymanie pełnowartościowej paszy bogatej w aminokwasy egzogenne, witaminy i  składniki mineralne. Odpowiedni skład ami­nokwasowy paszy jest niezbędny dla pra-

WYKORZYSTANIE ODPADÓW POCHODZĄCYCH Z PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO

widłowego wzrostu i rozwoju, szczególnie młodych osobników [16]. Stosowanie żywych kultur drożdży jako dodatków do pasz związane jest z ich działaniem probiotycznym. Produkowane przez nie enzymy w przewodzie pokarmowym ułatwiają trawienie składników żyw­ ności. Istotne znaczenie mają również składniki ściany komórkowej drożdży – oligomannany i β-glukany. Przeprowadzone badania potwierdzają ich korzystny wpływ na mikroflorę przewodu pokarmowego zwierząt, gdyż są one dobrze wykorzystywane przez bakterie kwasu mlekowego. Polisacharydy te stymulują działanie układu immunologicznego oraz wykazują niszczące działanie w stosunku do bakterii chorobotwórczych E. coli i Salmonella pullorum, będących częstą przyczyną chorób u drobiu. Polimery ściany komórkowej drożdży wykazują również zdolność do adsorpcji szkodliwych substancji chemicznych, na przykład mikotoksyn [7, 26]. Drożdże C. utilis są także zdolne do biosyntezy wew­nątrzkomórkowego tłuszczu (SCO), charakteryzującego się wartościowym, z  żywieniowego punktu widzenia, profilem kwasów tłuszczowych (ok. 25% kwasu oleinowego, 32% linolowego i 18% linolenowego). Biosynteza wielonienasyconych kwasów tłuszczowych przez mikroorganizmy ma szansę stać się nowym, alternatywnym źródłem tych związków. Skład kwasów tłuszczowych w  komórkach drożdży może być regulowany poprzez dobór odpowiedniego składu pożywki oraz warunków procesu [6, 12]. W ten sposób można ukierunkować szlaki biosyntezy w komórkach drobnoustrojów na syntezę pożądanych kwasów tłuszczowych PUFA, które mogą być stosowane jako suplementy diety oraz w żywności funkcjonalnej [13]. 3. Surowce wykorzystywane do produkcji biomasy drożdży paszowych Zrozumienie wymagań pokarmowych drożdży jest istotne, nie tylko w przypadku hodowli w warunkach laboratoryjnych, ale przede wszystkim w przemysłowej produkcji drożdży paszowych. Podczas namnażania biomasy drożdży należy zapewnić w podłożu hodowlanym obecność wszystkich niezbędnych do ich wzrostu składników. Należą do nich przyswajalne źródła węgla i  azotu, związki siarki i fosforu, składniki mineralne oraz ewentualne aktywatory wzrostu (witaminy) [52]. Drożdże paszowe, zaliczane do drożdży dzikich, posiadają bogaty układ enzymatyczny umożliwiający wzrost na różnorodnych źródłach węgla. Poza węglowodanami są zdolne do asymilacji wielu innych związków organicznych (alkohole, kwasy organiczne, węglowodory), co umożliwiło wykorzystywanie do ich produkcji różnorodnych surowców odpadowych. Ważne jest również zapewnienie odpowiedniego źródła

21

azotu. W przemysłowej produkcji najczęściej stosuje się sole amonowe, które są łatwo przyswajalne przez drożdże. Są one również zdolne do wykorzystywania z podłoża azotanów. Dobrym rozwiązaniem jest dostarczenie drożdżom azotu bezpośrednio w postaci aminokwasów (hydrolizaty kazeiny, ekstrakty drożdżowe), są to jednak składniki drogie. Dlatego również w przypadku źródeł azotu poszukuje się surowców odpadowych, które mogłyby zaspokoić zapotrzebowanie drożdży na ten biopierwiastek [44, 52]. Podłoża hodowlane wzbogaca się także w związki siarki i fosforu, najczęściej poprzez stosowanie nieorganicznych form tych pierwiastków (siarczany, ortofosforany). Siarka ma szczególne znaczenie w sytuacji, gdy dąży się do zwiększenia zawartości aminokwasów siarkowych w biomasie drożdży. Z kolei fosfor jest niezbędnym składnikiem kwasów nukleinowych oraz fosfolipidów. Wśród pozostałych składników mineralnych najważniejszą rolę odgrywają potas i magnez (uznawane za makroelementy) oraz pozostałe pierwiastki wymagane w ilościach śladowych (mikroelementy): wapń, mangan, żelazo, cynk, miedź, kobalt i  molibden. Niezbędne jest również dostarczenie odpowiedniej ilości tlenu, który jest wykorzystywany w  procesach oddechowych komórek drożdży i namnażania biomasy bez produkcji alkoholu etylowego. Z kolei obecność czynników wzrostowych nie jest niezbędna w  przypadku hodowli drożdży dzikich [52]. Przemysłowa produkcja drożdży paszowych oparta jest przede wszystkim na surowcach odpadowych, pochodzących z różnych gałęzi przemysłu [44]. W większości stosowane są surowce węglowodanowe, między innymi melasa i wywar melasowy, hydrolizaty drewna, ługi posiarczynowe, odpady skrobiowe i ligninocelulozowe oraz serwatka [18, 32]. Stanowią one tanie i dobre źródło węgla dla drożdży paszowych, a niekiedy również związków azotowych i składników mineralnych, jak w przypadku głównego odpadu z produkcji wina ryżowego (wywaru, tzw. „thin stillage”) [55]. Jako źródło azotu mogą być również wykorzystywane odpady z przetwórstwa ziemniaczanego i skrobiowego, na przykład ziemniaczana woda sokowa [5, 33]. W ostatnich latach prowadzone są badania nad zastosowaniem nowych, niekonwencjonalnych substratów do produkcji drożdży paszowych. Należą do nich między innymi odpady z przemysłu tłuszczowego, mięsnego czy zmielone muszle krewetkowe [18]. Szczególnie duże nadzieje wiąże się z możliwością utylizacji kłopotliwych odpadów tłuszczowych z procesów smażalniczych przez drożdże Yarrowia lipolytica [34]. Istnieje również możliwość wykorzystania odpadów z produkcji glutaminianu sodu jako źródła azotu do produkcji biomasy drożdży i SCO [53]. Do nowych surowców, nad którym prowadzone są w ostatnich latach badania mające na celu jego

22

AGNIESZKA KURCZ, STANISŁAW BŁAŻEJAK, ANNA MARIA KOT, ANNA BZDUCHA-WRÓBEL

ekologiczną i ekonomiczną utylizację, należy glicerol. Stanowi on dobre źródło węgla dla drobnoustrojów i jest prekursorem do produkcji wielu cennych metabolitów [1]. Jak pokazują prowadzone badania [7, 18, 49] glicerol może być z powodzeniem wykorzystywany do produkcji biomasy drożdży, które są w stanie asymilować go jako jedyne źródło węgla. 4. Produkcja biopaliw i gospodarka odpadami z produkcji biodiesla Biopaliwo jest to olej napędowy stosowany w silnikach wysokoprężnych, który zawiera w swoim składzie biologiczny komponent w postaci estrów metylowych kwasów tłuszczowych (Biodiesel) lub też składa się z niego w całości (BIOESTER 100). W zależności od kraju, stosuje się różny dodatek tych estrów. Unia Europejska narzuca krajom członkowskim 5% dodatek, a do 2020 jego zwiększenie do 10%. [38, 43]. W ostatnich latach obserwuje się dynamiczny rozwój rynku biopaliw nie tylko w Europie, ale również na całym świecie. Globalna produkcja biodiesla w 2005 wyniosła nieco ponad 3 mln ton, a po 5 latach wzrosła sześciokrotnie do poziomu 18 mln ton. W 2013 roku wyprodukowano ponad 27 mln ton biodiesla i szacuje się dalszy wzrost produkcji w kolejnych latach. Również w Polsce można zaobserwować intensywny rozwój rynku biopaliw. W 2005 roku produkcja biodiesla wyniosła 64 tys. ton, a w 2013 wzrosła do 648 tys. ton [40, 43, 56]. Do produkcji biodiesla wykorzystuje się surowce oleiste, najczęściej rzepak, soję i palmę oleistą (zależnie od rejonu upraw) [43]. Otrzymany z tych surowców olej poddawany jest procesowi metanolizy, polegającemu na transestryfikacji estrów wyższych kwasów tłuszczowych – triacylogliceroli. W procesie tym olej mieszany jest z roztworem metanolu oraz katalizatorem alkalicznym. Po przeprowadzonej reakcji następuje rozdział na niepolarną fazę estrową oraz polarną glicerynową [31]. Ta druga, oprócz glicerolu stanowiącego około 40–70%, zawiera również wiele zanieczyszczeń, w szczegól­ności metanol, wolne kwasy tłuszczowe, zneutralizowany katalizator, mydła oraz wodę i inne składniki (np. śladowe ilości metali ciężkich) [9, 41]. Otrzymana w ten sposób surowa gliceryna najczęś­ ciej poddawana jest złożonym i kosztownym procesom oczyszczania, dzięki którym może być wykorzystywana w przemyśle kosmetycznym, spożywczym, farmaceutycznym lub chemicznym [39]. Jednak w małych przetwórniach budowanie instalacji oczyszczającej fazę glicerynową jest nieopłacalne. W takich warunkach utylizuje się ją poprzez rozcieńczanie wodą w stosunku 1:100 i zastosowanie jako nawozu [51]. Ponadto faza glicerynowa, ze względu na wysoką wartość opałową, może być wykorzystywana jako komponent mieszanki

paliwowej dostarczanej do kotłów i  pieców. Intensywny rozwój produkcji biodiesla przyczynił się do zwiększenia ilości powstającej gliceryny (z 300 tys. ton w 2005 roku do 2,7 mln ton w 2013), w wyniku czego stała się trudnym do zagospodarowania odpadem przemysłowym [41]. 4.1. Wykorzystanie glicerolu w procesach biotechnologicznych Interesującym rozwiązaniem problemu utylizacji gliceryny odpadowej jest jej wykorzystanie jako składnika podłoży w hodowlach drobnoustrojów. Dzięki bogatym i  różnorodnym układom enzymatycznym, mikroorganizmy potrafią asymilować i  przekształcać pobierany glicerol do wielu użytecznych przemysłowo związków chemicznych [1]. Najwięcej uwagi poświęca się badaniom nad możliwością biosyntezy 1,3-propanodiolu. Związek ten wykorzystywany jest do produkcji smarów, rozpuszczalników organicznych, poliestrów i poliuretanów. W procesie biotransformacji glicerolu do 1,3-propanodiolu mogą być wykorzystywane takie gatunki jak Klebsiella pneumoniae, Clostridium butyricum, Citrobacter freundii i Enterobacter agglomerans [47]. Glicerol może być także stosowany jako składnik podłoża do produkcji kwasu bursztynowego przez Basfia succiniciproducens, wykorzystywanego w przemyśle chemicznym i kosmetycznym [11]. Innym cennym produktem otrzymywanym w wyniku biotransformacji glicerolu jest kwas propionowy, mający zastosowanie w utrwalaniu żywności i  pasz. Kwas ten produkowany jest przez bakterie z  rodzaju Propionibacterium. Według badań Kośmider i  wsp. [20] zastosowanie glicerolu jako jedynego źródła węgla w podłożu hodowlanym dla Propionibacterium freudenreichii spowodowało zwiększenie wydajność biosyntezy kwasu propionowego o 34% w porównaniu z podłożem zawierającym glukozę. Z kolei odpowiednio wyselekcjonowane lub zmutowane szczepy drożdży Y. lipolytica były zdolne do pobierania glicerolu i biotransformacji w warunkach tlenowych w kierunku kwasu cytrynowego [45]. Glicerol może być również wykorzystywany przez bakterie octowe, między innymi Gluconobacter oxydans, które przekształcają go do dihydroksyacetonu. Produkt ten znalazł zastosowanie w kosmetologii, farmakologii oraz w przemyśle spożywczym [48]. Liczne gatunki drożdży są w stanie wykorzystywać glicerol jako jedyne źródło węgla, co znalazło przemysłowe zastosowanie przy produkcji biomasy drożdży paszowych [18, 49]. Ze względu na małe rozmiary cząsteczki glicerolu, może być on pobierany przez mikroorganizmy na drodze dyfuzji ułatwionej, a następnie wykorzystany jako jedyne źródło węgla i  energii [9]. Po wniknięciu do cytozolu ulega fosforylacji do L-3-fosfoglicerolu z  udziałem jednej cząsteczki ATP

WYKORZYSTANIE ODPADÓW POCHODZĄCYCH Z PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO

23

Rys. 1.  Metabolizm glicerolu w komórkach drożdży. 1 – kinaza glicerolowa, 2 – dehydrogenaza glicerolofosforanowa, 3 – izomeraza triozofosforanowa (opracowanie na podstawie [1])

przez enzym kinazę glicerolową (EC 2.7.1.30). Powstały związek w kolejnym etapie utleniany jest przez dehydrogenazą glicerolofosoranową (EC 1.1.1.8) współdziałającą z NAD+ do fosfodihydroksyacetonu. Następnie, z udziałem izomerazy triozofosforanowej (EC 5.3.1.1), ulega izomeryzacji do aldehydu 3-fosfoglicerynowego, który jako związek pośredni szlaku glikolizy zostaje włączony do dalszych jego przemian (rys. 1) [1, 14]. Powstały w procesie glikolizy pirogronian przekształcany jest do acetylokoenzymu A, a ten może zostać wykorzystany w dalszych procesach energetycznych komórki, w ten sposób umożliwiając drożdżom wykorzystanie glicerolu do wzrostu i produkcji biomasy [1]. Drożdże są również w stanie wykorzystywać powstały acetylokoenzym A w procesie biosyntezy kwasów tłuszczowych i produkcji tłuszczu mikrobiologicznego (SCO). Podczas biosyntezy SCO również istotne znaczenie odgrywa pobierany z podłoża glicerol, który po fosforylacji do L-3-fosfoglicerolu wykorzystywany jest jako szkielet do biosyntezy triacylogliceroli [37]. 5.  Produkcja skrobi ziemniaczanej Skrobia jest odnawialnym biopolimerem, występującym naturalnie w przyrodzie w wielu różnych roślinach, a przede wszystkim w zbożach i bulwach ziemniaka. Określone cechy fizyczne i chemiczne umożliwiają jej łatwą modyfikację oraz przydatność w wielu gałęziach przemysłu (spożywczym, drzewno-papierniczym, włókienniczym). Światowy rynek produkcji skrobi zdominowany jest głównie przez skrobię kukurydzianą i  pszeniczną, które uznawane są za w pełni zastępowalne w stosunku do ziemniaczanej. Nie można jednak zapominać o pewnych argumentach, przemawiających na korzyść produkcji skrobi z ziemniaków. W porównaniu do innych surowców, charakteryzuje się ona wyższą jakością [10]. Wynika to głównie z dużej wielkości ziaren skrobiowych w bulwach ziemniaka w porównaniu

do innych surowców. Skrobia gruboziarnista charakteryzuje się lepszymi właściwościami fizycznymi (bielsza, o większej lepkości), a ponadto łatwiej ulega dekstrynizacji, scukrzaniu i kleikowaniu [42]. Argumentem przemawiającym za produkcją skrobi ziemniaczanej jest również znaczenie upraw ziemniaka skrobiowego. Dalsze zmniejszanie powierzchni upraw okopowych może prowadzić do niekorzystnych zmian w  płodozmianie i zagrozić istotnemu celowi Wspólnej Polityki Rolnej, jakim jest zachowanie bioróżnorodności upraw oraz osiągnięcie zróżnicowanych strukturalnie systemów uprawy rolnej [10]. W najbliższych latach polski przemysł krochmalniczy będzie musiał zmierzyć się z kolejnymi trudnoś­ ciami, związanymi ze zmianami we Wspólnej Polityce Rolnej, a  mianowicie zniesieniem dopłat produkcyjnych dla producentów skrobi. Może to doprowadzić do kryzysu w przetwórstwie krochmalniczym i zmniejszenia produkcji skrobi ziemniaczanej, która w ostatnich latach wynosiła ok. 105 tysięcy ton. W zaistniałej sytuacji przedsiębiorstwa powinny szukać nowych rozwiązań umożliwiających zmniejszenie kosztów produkcji skrobi [10]. Jednym ze sposobów może być szukanie nowych metod ekonomicznej utylizacji głównych odpadów pochodzących z procesu produkcyjnego – wycierki oraz wody sokowej. 5.1. Charakterystyka odpadowej ziemniaczanej wody sokowej i kierunki jej wykorzystania Przemysł krochmalniczy należy do największych producentów ścieków w branży spożywczej. Ich cechą charakterystyczną jest wysoka zawartość substancji organicznych i biogennych, a także kampanijność wytwarzania, co stwarza bardzo duże trudności w ich utylizacji. Podstawowym odpadem wchodzącym w skład ścieków z przemysłu ziemniaczanego jest woda sokowa [24], której powstaje około 600 ton przy przerobie

24

AGNIESZKA KURCZ, STANISŁAW BŁAŻEJAK, ANNA MARIA KOT, ANNA BZDUCHA-WRÓBEL

1000 ton ziemniaków [25]. W skład odpadowej wody sokowej wchodzi ok. 1% substancji nieorganicznych oraz 4% organicznych, z czego 2% stanowią związki białkowe [21]. W  Polsce, w celu zmniejszenia obciążenia ścieków z przemysłu ziemniaczanego, stosuje się usuwanie związków azotowych poprzez koagulację kwasowo-termiczną [24]. Podczas tego procesu do koagulatu przechodzi ok. 34% suchej substancji wody sokowej, 54 % białka surowego oraz 74% białka właś­ ciwego. W związku z tym, że koagulat zawiera głównie białko właściwe, w odbiałczonej wodzie sokowej pozostaje przede wszystkim część białka surowego, w  którego skład wchodzi białko rozpuszczalne oraz substancje azotowe niebiałkowe (peptydy, aminokwasy i mineralne związki azotu) [25]. Woda sokowa po odbiałczeniu w dalszym ciągu charakteryzuje się bogatym i zróżnicowanym składem chemicznym [24, 25]. Zawartość suchej substancji stwierdzono na poziomie 3,8%, a związków białkowych ok. 1,4%, z czego 78% stanowi białko rozpuszczalne i substancje azotowe niebiałkowe. Spośród aminokwasów wolnych i związanych w  największej ilości występują kwas asparaginowy i glutaminowy. Zawartość cukrów redukujących (głównie glukoza, ramnoza i galaktoza) wynosi około 0,5–1,0%. Woda sokowa charakteryzuje się również zawartością popiołu rzędu 1,1–1,2%. W jego skład wchodzi między innymi potas, magnez, wapń, fosfor, sód i cynk. W wodzie sokowej wykryto również biotynę oraz kwasy organiczne, głównie szczawiowy, cytrynowy i jabłkowy. Powszechnie stosowaną metodą zagospodarowania wody sokowej jest jej rozcieńczanie wodą, a następnie wykorzystanie do spryskiwania łąk lub rolniczego nawadniania. Działanie takie umożliwia wzbogacenie gleby w związki azotowe przyswajalne przez rośliny i  obniżenie jej kwasowości. Jest to naturalna, biologiczna metoda oczyszczania ścieków połączona z  ich rolniczym wykorzystaniem. Do głównych zalet tej metody należą względy ekonomiczne oraz prostota jej realizacji [27]. Metoda ta może jednak budzić pewne obawy ze względu na duży ładunek zanieczyszczeń ziemniaczanej wody sokowej wyrażony wysokimi wskaźnikami ChZT i BZT5 (odpowiednio ok. 30 000 mg O2 · L–1 oraz ok. 22 000 mg O2 · L–1). W celu odpowiedniego zutylizowania tego odpadu konieczne są duże ilości tlenu, niezbędne do rozkładu obecnych w wodzie sokowej substancji. Z tego powodu wskazane jest szukanie alternatywnych metod utylizacji odpadowej ziemniaczanej wody sokowej [19, 25, 29]. Do metod takich może należeć jej wykorzystanie w procesach biotechnologicznych. Ziemniaczana woda sokowa, ze względu na bogaty skład chemiczny, może stanowić przydatny substrat do mikrobiologicznej syntezy białka. Jednocześnie można znacząco obniżyć ładunek zanieczyszczeń w ściekach

poprodukcyjnych. Liczne badania [19, 23, 25, 36] potwierdziły możliwość wykorzystania odbiałczonej ziemniaczanej wody sokowej w procesach biotechnologicznych, co umożliwiło zredukowanie wskaźników BZT5 i ChZT nawet o 60–90%. 6. Podsumowanie W ostatnich latach coraz częściej podejmuje się badania nad możliwością wykorzystania surowców odpadowych w procesach biotechnologicznych. Powstająca podczas produkcji skrobi odpadowa ziemniaczana woda sokowa charakteryzuje się wysoką zawartością różnych składników odżywczych niezbędnych do wzrostu drożdży. Należą do nich przede wszystkim przyswajalne formy azotu (wolne aminokwasy i peptydy, związki nieorganiczne). Obecne są w  niej również składniki mineralne, takie jak potas, magnez i  fosfor, które są kluczowe do prawidłowego funkcjonowania enzymów i przebiegu procesów biochemicznych w komórkach drożdży. Ze względu na niskie stężenia cukrów prostych, korzystne jest konstruowanie pożywek poprzez łączenie wody sokowej z innymi substratami stanowiącymi źródło węgla. Jednym z takich surowców może być frakcja glicerynowa, powstająca w procesie otrzymywania biodiesla. Drożdże C. utilis wykazują zdolność do wydajnego wzrostu i asymilacji tego związku z podłoża hodowlanego [18]. Połączenie takie umożliwia uzyskanie wyższego plonu biomasy drożdży, niż podczas hodowli na samej wodzie sokowej [5]. W rezultacie istnieje możliwość utylizacji kłopotliwych odpadów przemysłowych, z  jednoczesną produkcją biomasy drożdżowej ukierunkowaną na biosyntezę wartościowych składników odżywczych, takich jak białko, tłuszcz, glukany, witaminy oraz metalobiałka. Piśmiennictwo   1. Amaral P.F.F., Ferreira T.F., Fontes G.C., Coelho M.A.Z.: Glycerol valorization: New biotechnological routes. Food Bioprod. Process. 87, 179–186 (2009)   2. Anupama, Ravindra P.: Value-added food: Single cell protein. Biotechnol. Adv. 18, 459–479 (2000)   3. Błażejak S.: Studia nad pozyskiwaniem biopleksów z biomasy drożdży Candida utilis wzbogaconych magnezem. Wyd. SGGW, Warszawa, 2006   4. Błażejak S., Duszkiewicz-Reinhard W., Gniewosz M., Kamiński  T.: Badanie zdolności wiązania magnezu przez drożdże paszowe Candida utilis ATCC 9950 w warunkach hodowli wgłębnej. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 2, 109–123 (2003)   5. Błażejak S., Gientka I., Bzducha-Wróbel A., Stastak-Różańska L., Maszewska M.: Ocena zdolności biosyntezy tłuszczu przez drożdże Rhodotorula gracilis w podłożach zawierających ziemniaczaną odpadową wodę sokową wzbogaconą glicerolem. ZPPNR, 576, 3–12 (2014)

WYKORZYSTANIE ODPADÓW POCHODZĄCYCH Z PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO

  6. Brown C.M., Rose A.H.: Fatty-Acid Composition of Candida utilis as Affected by Growth Temperature and Dissolved-Oxygen Tension. J. Bacteriol. 99, 371–378 (1969)   7. Bzducha-Wróbel A., Kieliszek M., Błażejak S.: Chemical composition of the cell wall of probiotic and brewer’s yeast in response to cultivation medium with glycerol as a carbon source. Eur. Food Res. Technol. 237, 489–499 (2013)  8. Dobrzański Z., Dolińska B., Chojnacka K., Opaliński S., Ryszka F.: Znaczenie drożdży w żywieniu zwierząt gospodarskich. Acta Sci. Pol, Madic. Veterin. 5, 49–66 (2006)   9. Dobson R., Gray V., Rumbold K.: Microbial utilization of crude glycerol for the production of value – added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39, 217–226 (2012) 10. Dzwonkowski W.: Perspektywy rynku skrobi i produkcji ziemniaków skrobiowych w kontekście zmian Wspólnej Polityki Rolnej. Biul. IHAR, 265, 99–108 (2012) 11. Edzard S., Torsten R., Jochen T.: Continuous cultivation approach for fermentative succinic acid production from crude glycerol by Basfia succiniciproducens DD1. Biotechnol. Lett. 31, 1947–1951 (2009) 12. Enshaeieh M., Abdoli A., Nahvi I., Madani M.: Bioconversion of different carbon sources in to microbial oil and biodiesel using oleaginous yeats. J. Biol. Today’s World, 1, 82–92 (2012) 13. Fidler N., Koletzko B., Sauerwald T.U.: Single cell oils production and application. Zb. Biotehniske fak. Univ. v Ljubljani. Kmetijstvo. Zootehnika, 74, 37–45 (1999) 14. Gancedo C., Gancedo J.M., Sols A.: Glycerol Metabolism in Yeasts. Pathways of Utilization and Production. Eur. J. Biochem. 5, 165–172 (1968) 15. Jarociński J., Jarosz K.: Gorzelnictwo i drożdżownictwo. Wydawnictwa Szkolne i Pedagogiczne, Warszawa, 1983 16. Jamroz D., Buraczewski S., Kamiński J.: Żywienie zwierząt i paszoznawstwo tom 1. Fizjologiczne i biochemiczne podstawy żywienia zwierząt. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2001 17. Jay J.M.: Modern food microbiology. Chapman & Hall, London, 1992 18. Juszczyk P., Musiał I., Rymowicz W.: Dobór szczepów drożdży do produkcji biomasy z glicerolu odpadowego. Acta Sci. Pol., Biotechnol. 4, 65–76 (2005) 19. Kosiek E.: Próby wykorzystania soku ziemniaczanego w produkcji drożdży piekarskich. Zesz. Nauk. PŁ, Technol. Chem. Spoż. 648, 31–41 (1993) 20. Kośmider A., Drożdżyńska A., Czaczyk K.: Możliwość wykorzystania surowców odpadowych w procesie fermentacji propionowej. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 6, 45–58 (2009) 21. Kowalczewski P., Celka K., Białas W., Lewandowicz G: Antioxidant activity of potato juice. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 11, 175–181 (2012) 22. Kurtzman C.P., Fell J.W.: The Yeasts A Taxonomic Study. Fourth Revised and Enlarged Edition. Vol 1. Elsevier, New York, 1998 23. Liu B., Song J., Li Y., Niu J., Wang Z., Yang Q.: Towards Industrially Feasible Treatment of Potato Starch Processing Waste by Mixed Cultures. App. Biochem. Biotechnol. 171, 1001–1010 (2013) 24. Lubiewski Z., Śmiegielska H., Lewandowicz G., Balcerek W.: Charakterystyka odcieku po koagulacji białka pozyskiwanego w toku kampanii krochmalniczej. ZPPNR, 511, 617–626 (2006) 25. Łabendziński S.: Surowce niekonwencjonalne dla przemysłowej biosyntezy białka. II. Odpady przemysłu krochmalniczego. Przem. Ferm. i Rolny, 20, 1–3 (1976) 26. Mardarowicz L.: Drożdże w żywieniu drobiu. Pol. Drobiar. 9, 14–16 (1997) 27. Marzec H.: Wpływ nawadniania ściekami krochmalniczymi na plonowanie roślin. ZPPNR, 414, 119–125 (1994)

25

28. Microorganisms & Microbial-Derived Ingredients Used in Food (Partial List). Food and Drug Administration, http://www.fda. gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/GRAS/MicroorganismsMicrobialDerivedIngredients/default.htm (22.02.2015) 29. Miedzianka J., Pęksa A., Smolarczyk E.: Zastosowanie przemysłowego soku ziemniaczanego do otrzymywania preparatów białka arylowanego. ZPPNR, 557, 261–273 (2010) 30. Miura Y., Kondo K., Toshiko S., Shimada H., Fraser P.D., Misawa N.: Production of the Carotenoids Lycopene, β-Carotene, and Astaxanthin in the Food Yeast Candida utilis. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1226–1229 (1998) 31. Moser R.B.: Biodiesel production, properties, and feedstocks. In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant, 45, 229–266 (2009) 32. Munawar R.A., Irfan M., Nadeem M., Syed Q.A., Siddique Z.H.: Biosynthesis of single cel biomass of Candida utilis by submerged fermentation. Pak. J. Sci. 62, 1–5 (2010) 33. Muniraj I.K., Xiao L., Hu Z., Zhan X., Shi J.: Microbial lipid production from potato processing wastewater using oleaginous filamentous fungi Aspergillus oryzae. Water Res. 47, 3477–3483 (2013) 34. Musiał I., Rymowicz W., Kita A.: Produkcja biomasy drożdży Yarrowia lipolytica z tłuszczów odpadowych po smażeniu produk­ tów przekąskowych. Acta Sci. Pol., Biotechnol. 3, 75–83 (2004) 35. National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm. nih.gov/taxonomy (22.02.2015) 36. Nowak J., Lasik M.: Wysokotemperaturowa bioremediacja ścieków z przemysłu ziemniaczanego z wykorzystaniem mieszanej kultury bakteryjnej. Nauka Przyr. Technol. 3, 1–10 (2009) 37. Papanikolaou S., Aggelis G.: Lipids of oleaginous yeast. Part I: Biochemistry of single cell oil production. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 113, 1052–1073 (2011) 38. Piwowarczyk K.: Zachowanie otoczenia przy produkcji biodiesla do celów transportowych, pochodzących z przeróbki rzepaku (w) Materiały Krakowskiej Konferencji Młodych Uczonych, Fundacja Studentów i Absolwentów Akademii Górniczo-Hutniczej „Academica”, Kraków, 2007, 335–341 39. Podkówka W.: Biopaliwo, gliceryna, pasza z rzepaku. Wyd. Akademii Techniczno-Rolniczej, Bydgoszcz, 2004 40. Produkcja biodiesla na świecie w 2013 roku i prognozy na rok 2014. Gospodarz.pl, http://www.gospodarz.pl/aktualnosci/ paliwa-i-biopaliwa/produkcja-biodiesla-na-swiecie-w-2013roku-i-prognozy-na-2014-rok.html (22.02.2015) 41. Quispe C.A.G., Coronado C.J.R., Carvalho J.A.Jr.: Glycerol: Production, consumption, prices, charakterization and new trends in combustion. Renew. Sust. Energ. Rev. 27, 475–493 (2013) 42. Ratuszniak E., Kubas A.: Wykorzystanie metody mikroskopowej do badania wielkości ziaren skrobi u różnych gatunków roślin. SPB, 4, 93–107 (2007) 43. Rosiak E., Łopaciuk W., Krzemiński M.: Produkcja biopaliw i jej wpływ na światowy rynek zbóż oraz roślin oleistych i tłuszczów roślinnych. Instytut Ekonomiki Rolnictwa i Gospodarki Żywnościowej – Państwowy Instytut Badawczy, Warszawa, 2011 44. Russel S.: Biotechnologia. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa, 1990 45. Rywińska A.: Wykorzystanie glicerolu odpadowego do biosyntezy kwasu cytrynowego przez Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG 7. Acta Sci. Pol., Biotechnol. 7, 13–22 (2008) 46. Rywińska A., Juszczyk P., Wojtatowicz M., Robak M., Lazar Z., Tomaszewska L., Rymowicz W.: Glycerol as a promising substrate for Yarrowia lipolytica biotechnological applications. Biomass Bioenerg. 48, 148–166 (2013) 47. Sun-Ae J., Chuloo M., Cheol-Hee K., Sean W.K., Byoung-In S., Youngsoon U.: Microbial Fed-batch Production of 1,3-Propanediol Using Raw Glycerol with Suspended and Immobilized Klebsiella pneumoniae. Appl. Biochem. Biotechnol. 161, 491–501 (2010)

26

AGNIESZKA KURCZ, STANISŁAW BŁAŻEJAK, ANNA MARIA KOT, ANNA BZDUCHA-WRÓBEL

48. Stasiak L., Błażejak S.: Acetic acid bacteria – perspectives of application in biotechnology – a review. Pol. J. Food Nutr. Sci. 59, 17–23 (2009) 49. Taccari M., Canonico L., Comitini F., Mannazzu I., Ciani M.: Screening of yeasts for growth on crude glycerol and optimization of biomass production. Bioresour. Technol. 110, 488–495 (2012) 50. Tomita Y., Ikeo K., Tamakawa H., Gojobori T., Ikushima S.: Genome and Transcriptome Analysis of the Food-Yeast Candida utilis. PLoS ONE, 7: e37226. Doi:10.1371/journal.pone.0037226, 1–10 (2012) 51. Tys J., Piekarski W., Jackowska I., Kaczor A., Zając G., Starobrat P.: Technologiczne i ekonomiczne uwarunkowania produkcji biopaliw z rzepaku. Acta Agrophys. 99 (2003) 52. Walker G.M.: Yeast – Physiology and Biotechnology. Wiley, New York, 1998

53. Xue F., Miao J., Zhang X., Luo H., Tan T.: Studies on lipid production by Rhodotorula glutinis fermentation using monosodium glutamate wastewater as culture medium. Bioresour. Technol. 99, 5923–5927 (2008) 54. Yanez E., Ballester D., Fernandez N., Gattas V., Monckeberg F. 1972: Chemical composition of Candida utilis and the biological quality of the yeast protein. J. Sci. Food Agric. 23, 581–586 (1972) 55. Yen H., Yang Y., Yu Y.: Using crude glycerol and thin stillage for the production of microbial lipids through the cultivation of Rhodotorula glutinis. J. Biosci. Bioeng. 114, 453–456 (2012) 56. Zestawienie wytworzonych i sprzedanych biokomponentów – 2013. Urząd Regulacji Energetyki, http://www.ure.gov.pl/pl/ rynki-energii/paliwa-ciekle/biokomponenty-i-biopal/danedotyczace-rynku-b/5379,Zestawienie-wytworzonych-isprzedanych-biokomponentow-2013.html (22.02.2015)

POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 27–44 http://www.pm.microbiology.pl

ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH WE WSPÓŁCZESNEJ WAKCYNOLOGII Katarzyna Roeske1*, Radosław Stachowiak1, Jacek Bielecki1 1

 Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Wpłynęło w kwietniu 2015 r. Zaakceptowano w listopadzie 2015 r.

1. Wakcynologia – rys historyczny i perspektywy. 2. Swoista (nabyta) odpowiedź immunologiczna. 3. Komórki efektorowe odpowiedzi typu komórkowego. 4. Prezentacja antygenu i jego rozpoznanie przez limfocyty. 5. Pamięć immunologiczna. 6. Szczepionki indukujące odpowiedź komórkową. 7. Szczepionki podjednostkowe. 8. Adiuwanty. 9. Szczepionki wektorowe. 10. Bakterie patogenne jako wektory szczepionkowe. 11. Bakterie niepatogenne jako wektory szczepionkowe. 12. Podsumowanie Principles and perspectives of using live bacterial vectors in modern vaccinology Abstract:  Various strategies can be used to deliver antigens to the cytosol of antigen presenting cells, e.g. using nanoparticles, liposomes, immune stimulating complexes, viruses or bacteria. Among them, the use of bacterial carriers constitutes probably the most studied strategy. Depending on the extra- or intracellular life cycle of the pathogen, different immune responses are required for protection. Vaccines formulated on the basis of killed whole cells or isolated cell fractions tend to induce strong antibody response, however, they are ineffective at inducing cellular immunity. Due to these characteristics such antigens are used mainly to immunize against extracellular pathogens. Conversely, live attenuated mutants induce a broad range of immune responses including CD8+ T cell response, thereby leading to effective immunization against intracellular pathogens. Besides adjuvant properties provided by carried molecular patterns, live bacterial carriers have other important advantages, such as the ability to mimic natural infection and possibility to be administered in a needle-free manner. Remarkably, vector-based vaccines can be designed to enable induction of immune response against their own or carried heterologous antigens. Both pathogenic and commensal microorganisms are used in the next generation vaccine design, however, due to the potential risk of conversion to a virulent strain and causing infection or the loss of immunogenic potency, pathogenic vectors are less likely to use. Questions concerning safety which have arisen with the advent of live-attenuated bacterial vectors made the researchers turn their attention to non-pathogenic bacteria. 1. Vaccinology – historical background and perspectives. 2. Acquired immunity. 3. Effector cells of cell-mediated immune response. 4.  Antigen presentation and its recognition by T-cells. 5. Immunological memory. 6. Vaccines inducing cellular immune response. 7. Subunit vaccines. 8. Adjuvants. 9. Vector vaccines. 10. Pathogenic bacteria as vaccine vectors. 11. Non-pathogenic bacteria as vaccine vectors. 12. Summary Słowa kluczowe: odpowiedź komórkowa, pamięć immunologiczna, prezentacja antygenu, szczepionka, wektor bakteryjny Key words: antigen presentation, bacterial vector, cell-mediated immune response, immune memory, vaccine

1.  Wakcynologia – rys historyczny i perspektywy Postępy w nauce od zawsze stanowiły siłę napędową w  badaniach nad konstrukcją nowych, skutecznych szczepionek (Rys. 1). Termin „szczepionki” w znaczeniu preparatu biologicznego wzmagającego odporność na daną chorobę oraz koncepcja szczepień zostały wprowadzone przez Edwarda Jennera w  1796  roku. Wykorzystał on materiał zakaźny ospy krowianki do zaszczepienia 8-letniego chłopca, co przyniosło efekt w  postaci skutecznej immunizacji przeciw wirusowi ospy prawdziwej [73]. Złotą erę wakcynologii zapoczątkowały odkrycia Pasteura i Kocha, którzy opracowali preparaty szczepionkowe opierające się na żywych, atenuowanych mikroorganizmach, organiz­mach inaktywowanych bądź produkowanych przez nie toksynach. Ludwik Pasteur w 1885 roku dokonał pierwszych skutecznych szczepień chroniących przed wirusem

wścieklizny. Opracował on metodę szybkiego namnażania wirusa poprzez hodowlę w organizmach królików oraz jego atenuacji na drodze odwadniania płynu mózgowo-rdzeniowego zainfekowanych wirusem króli­ ków poprzez jego ekspozycję na działanie powietrza [13]. Robert Koch w toku swoich badań nad przecinkowcem cholery (Vibrio cholerae) dowiódł, że pojedyncze zakażenie chroni przed kolejnymi infekcjami w czasie tej samej epidemii. Pierwsze próby zastosowania zabitych komórek V. cholerae do immunizacji zostały natomiast podjęte pod koniec XIX wieku przez Jaime Ferrána, a także Sawtschenko i Sabolotnego [47]. Początek XX wieku przyniósł odkrycie nowego typu szczepionek, w których wykorzystywano toksoidy, inaktywowane na drodze chemicznej lub termicznej toksyny bakteryjne, które pozbawione były cech toksyczności, ale jednocześnie wykazywały potencjał immunizacyjny. Powstały szczepionki na bazie toksyny

*  Autor korespondencyjny:  Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego; ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel. (22) 55 41 311; e-mail: [email protected]

28

KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

Rys. 1.  Główne odkrycia wakcynologii – objaśnienia w tekście

tężcowej Clostridium tetani oraz toksyny błoniczej Corynebacterium diphtheriae. Następnym krokiem było opracowanie pierwszych skojarzonych szczepionek, uodparniających na błonicę i tężec (Di-Te) lub na błonicę, krztusiec i tężec równocześnie (Di-Per-Te). Kolejny przełom w badaniach z  dziedziny wakcyno­ logii nastąpił w drugiej połowie XX wieku jako następstwo rozwoju technik hodowli komórkowych, dzięki którym możliwe stało się namnażanie cząstek wirusowych. Umożliwiło to stworzenie szczepionek skutecznie immunizujących przeciw rotawirusom czy wirusom zapalenia wątroby typu A, polio, różyczki, świnki, odry i ospy wietrznej. Dalszy postęp w dziedzinie mikrobiologii doprowadził do opracowania szczepionek polisacharydowych, które wywoływały odpowiedź przeciw polisacharydom otoczkowym bakterii takich jak Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis serotyp A, C, W i Y czy Haemophilus influenzae. Tego typu terapeutyki indukowały jednak stosunkowo słabą reakcję odpornościową u dzieci. Opracowanie szczepionek

w formie glikokoniugatów pozwoliło na pokonanie tych ograniczeń, gdyż powodowało indukcję humoralnych mechanizmów odpornościowych. Odkrycia biologii molekularnej pozwoliły również na skonstruowanie preparatów immunizujących przeciw mikroorganiz­ mom nie dającym się namnażać w hodowli komórkowej, takim jak wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) czy wirus brodawczaka ludzkiego (HPV). Szczepionki przeciw tym patogenom mają postać oczyszczonych, zrekombinowanych białek wirusa, które tworzą niewirulentne cząstki wirusowe (viral-like particle, VLP) [20]. Ostatnie dwie dekady przyniosły nowe rozwiązania w wakcynologii, które umożliwiają poszukiwanie najbardziej immunogennych antygenów. Zsekwencjonowanie kompletnych genomów organizmów chorobotwórczych oraz człowieka doprowadziło do powstania tzw. „odwrotnej wakcynologii”, techniki, która na drodze analiz genomicznych pozwala na wytypowanie najlepszych celów dla komórek układu odpornościowego. Genom danego organizmu stanowi bowiem rezerwuar

ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH

genów kodujących białka stanowiące potencjalny immunogen, który może być zastosowany do konstrukcji szczepionki [40]. Sztandarowym przykładem wykorzystania tej techniki jest opracowanie szczepionki wywołującej odpowiedź przeciw bakterii Neisseria meningitidis serotypu B (MenB), która w przeciwieństwie do meningokoków innych typów pokryta jest polisacharydem wykazującym duże podobieństwo do polisacharydu obecnego w ludzkich tkankach. Cecha ta sprawiła, że szczepionki glikokoniugatowe były nieskuteczne w immunizacji przeciw MenB. Wybrane na drodze analiz genomu białka poddano ekspresji w komórkach E. coli, dzięki czemu uzyskano pierwszą skuteczną szczepionkę przeciw MenB [30]. Kolejnym wyzwaniem współczesnej wakcynologii stało się również opracowanie szczepionek przeciw mikroorganizmom wykazującym duże różnice w ekspresji antygenów, jako że preparaty opracowane w  XX  wieku wykazują skuteczność głównie w profilaktyce zakażeń patogenami cechującymi się niską zmiennością antygenową. Rozwiązaniem jest stosowanie szczepionek zawierających antygeny wielu szczepów jednocześnie. Przykładem takich immunoterapeutyków są poliwalentne szczepionki koniugatowe zawierające antygeny 7, 9 lub 13 spośród 93 znanych serotypów streptokoków [8] lub poliwalentna szczepionka przeciw wirusowi grypy zmieniana sezonowo w oparciu o przewidywania dotyczące ewolucji biologicznej szczepów [48]. Do tej pory nie udało się jednak opracować skutecznej i trwale immunizującej szczepionki przeciw mikroorganizmom, które charakteryzuje bardzo duże tempo mutacji, takim jak wirusy HIV czy HCV. Potrafią one uniknąć mechanizmów obronnych orga­nizmu gospodarza dzięki zmianom antygenów będących celem układu odpornościowego. W ciągu ostatniego wieku szczepienia w bardzo znaczącym stopniu przyczyniły się do ograniczenia zapadalności na choroby zakaźne oraz zmniejszyły wywoływaną przez nie śmiertelność. Światowa Organizacja Zdrowia (World Health Organization, WHO) podaje, że szczepienia mogą ratować życie od 2 do 3 milionów ludzi każdego roku. Dzięki rozbudowanym programom szczepień choroby takie jak ospa prawdziwa czy polio zostały wyeliminowane na całym świecie. Z danych raportu WHO z 2014 roku wynika, że w latach 2000–2012 o 78% spadła również liczba zgonów spowodowanych przez odrę. Jednocześnie organizacja informuje, że przy pomocy szczepień można kontrolować zapadalność na jedynie 25 ze wszystkich znanych chorób zakaźnych (Tab. I). W 2012 roku w czołówce chorób powodujących najwyższą śmiertelność i przeciw którym nie istnieje skuteczna szczepionka AIDS (1,6 miliona zgonów), gruźlica (1,3  miliona zgonów) czy malaria (0,6  miliona zgonów). Coraz większe zagrożenie stanowią również nowotwory, które w 2012 roku spowo-

29

Tabela I Dostępne szczepionki uodparniające przeciw chorobom zakaźnym Choroby bakteryjne

wąglik cholera zakażenia meningokokowe dyfteryt tężec krztusiec gruźlica zakażenia pneumokokowe dur brzuszny zakażenia   Haemophilus influenzae

Choroby wirusowe odra różyczka grypa świnka WZW A WZW B WZW E polio wirusowe zapalenie mózgu wścieklizna ospa wietrzna zakażenia papillomawirusami zakażenia rotawirusami żółta febra japońskie zapalenie mózgu

dowały śmiertelność rzędu 8,2 miliona osób. Ich profilaktyka za pomocą szczepień stanowi więc poważne wyzwanie dla współczesnej wakcynologii. 2.  Odporność swoista Szczepienie ma na celu wywołanie swoistej odpowiedzi odpornościowej, dlatego warunkiem niezbędnym do opracowania nowych metod skutecznej immunizacji jest bardzo dokładne poznanie jej mechanizmów. Terminem swoistej odpowiedzi immunologicznej określa się mechanizm nabytej odporności organizmu zależny od rozpoznania antygenów przez przeciwciała produkowane przez limfocyty B (odpowiedź humoralna) i receptory znajdujące się na limfocytach T (odpowiedź komórkowa). Cechuje ją specyficzność względem unikalnego antygenu oraz zdolność do wywoływania tzw. pamięci immunologicznej zapewniającej długotrwałą odporność organizmu na dany patogen. Przeciwciała produkowane przez limfocyty B wiążą się z antygenami na powierzchni czynników infekcyjnych. Może to skutkować zniszczeniem patogenu w drodze różnych mechanizmów takich jak fagocytoza czy aktywacja dopełniacza lub mobilizacją komórek odpornościowych na skutek wydzielania mediatorów stanu zapalnego. Przeciwciała są odpowiedzialne za eliminowanie zakażeń patogenami, które mają pozakomórkowy etap w swoich cyklach życiowych lub które produkują metabolity wydostające się poza komórki gospodarza. Drugim typem odpowiedzi swoistej, która ma decydujące znaczenie w niszczeniu patogenów wewnątrzkomórkowych, a także przy zwalczaniu komórek nowotworowych jest odpowiedź typu komórkowego. Komórkami efektorowymi tej odpowiedzi są limfocyty cytotoksyczne, CD8+ (cytotoxic T cell, CTL) oraz limfocyty pomocnicze, CD4+ (helper T cell, Th). Komórki

30

KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

CD8+ rozpoznają obce antygeny i prowadzą do zabicia komórki zainfekowanej wirusem, wewnątrzkomórkową bakterią czy też do eliminacji komórki nowotworowej, podczas gdy komórki CD4+ stymulują aktywność pozostałych leukocytów poprzez wydzielanie cytokin bądź przez bezpośredni kontakt z nimi. Na skuteczność odporności nabytej wpływają zarówno prawidłowy przebieg humoralnej oraz komórkowej odpowiedzi, jak i odpowiednia interakcja między komórkami efektorowymi obu typów odpowiedzi. Bardzo duże znaczenie w odpowiedzi humoralnej, zwłaszcza na antygeny białkowe, ma współpraca limfocytów T helperowych CD4+ z limfocytami B. Co najważniejsze, w przebiegu odporności nabytej powstają limfocyty pamięci, dzięki którym ponowny kontakt z  tym samym antygenem prowadzi do szybszej i efektywniejszej odpowiedzi odpornościowej [68]. 3. Komórki efektorowe odpowiedzi typu komórkowego Limfocyty T pomocnicze (CD4+, Th) Limfocyty T pomocnicze (T helper cells, Th) o fenotypie CD4+ odgrywają kluczową rolę w rozwoju odporności nabytej. Regulują funkcje efektorowe limfocytów B i  limfocytów T cytotoksycznych, komórek odpor­ ności wrodzonej, szczególnie o aktywności fagocytarnej, a  także odpowiadają za utrzymanie homeostazy i uczestniczą w kontroli reakcji autoimmunizacyjnych. Są również mediatorami pamięci immunologicznej, a  zmniejszenie ich liczby w organizmie przyczynia się do zwiększonej podatności na choroby infekcyjne. Tak różnorodną rolę mogą pełnić dzięki różnicowaniu naiwnych limfocytów T CD4+ do odmiennych efektorowych limfocytów T w odpowiedzi na aktywację antygenami prezentowanymi przez komórki prezentujące antygen (APC, antigen-presenting cells). W 1986 roku Mosmann i wsp. [54] wykazali istnienie dwóch populacji limfocytów T CD4+, (Th1 i Th2) różniących się profilem produkowanych cytokin oraz markerami powierzchniowymi. Cechą charakterystyczną limfocytów Th1 wspomagających głów­ nie odpowiedź typu komórkowego jest wydzielanie interferonu-γ (IFN-γ) oraz interleukiny-2 (IL‑2). Limfocyty Th2 biorące udział w odpowiedzi humoralnej produkują inny, charakterystyczny zestaw cytokin: interleukiny IL-4, IL-5 i IL-13. W 2003 roku zidentyfikowano kolejną populację limfocytów T CD4+, która charakteryzuje się zdolnością do syntezy następującego zestawu interleukin: IL-17A, IL-17F i IL-22 [55]. Limfocyty te nazwano Th17 [36, 61] i wykazano ich rolę między innymi w generowaniu odporności przeciwbakteryjnej we wczesnych etapach zakażeń M. tuberculosis [43]. Ponadto aktywowane, naiwne limfocyty T CD4+

różnicują w limfocyty o fenotypie CD4+CD25+Foxp3+ charakteryzujące się aktywnością supresorową [17]. Są one zaangażowane w utrzymanie tolerancji na antygeny własne i obce. Powstają one w obwodowych narządach limfoidalnych, co odróżnia je od naturalnych regulatorowych limfocytów T o takim samym fenotypie powstających w grasicy [35]. Wśród różnych funkcjonalnie populacji limfocytów T CD4+ opisano pęcherzykowe limfocyty Tfh (follicular T  helpers). Migrują one do ośrodków rozmnażania (GC, germinal centers) limfocytów B w  tkance limfoidalnej, gdzie wspomagają ich różnicowanie w komórki plazmatyczne lub limfocyty B pamięci [62]. Scharakteryzowano również inne populacje limfocytów Th, takie jak aktywne w trakcie zakażeń pasożytniczych i mogące się przyczyniać do chorób autoimmunizacyjnych limfocyty Th9 [85] czy Th22, które mogą być zaangażowane w reakcje odpornościowe i naprawę tkanki skórnej [23]. Powstanie tak zróżnicowanych populacji efektorowych i regulatorowych limfocytów T CD4+ zależy od ekspresji specyficznych czynników transkrypcyjnych i rodzaju transkrybowanych genów, co w  hodowlach in vitro warunkowane jest obecnością różnych zestawów cytokin tworzących mikrośrodowisko w  trakcie aktywacji naiwnych limfocytów T CD4+ przy udziale receptora TCR. Różnicowanie naiwnych limfocytów Th do populacji Th1 wymaga obecności IL-12, która jest produkowana przez komórki dendrytyczne aktywowane substancjami pochodzącymi od patogenów. Powstałe limfocyty Th1 wytwarzają natomiast IFN-γ, który aktywuje makrofagi działające na bakteryjne i wirusowe czynniki infekcyjne. Tego typu sprzężenie dodatnie obserwowane jest również przy różnicowaniu populacji komórek Th2, która generowana jest w  obecności IL-4. Ta cytokina aktywuje limfocyty  B oraz pobudza makrofagi i monocyty do wydzielania cytokin prozapalnych, pośrednio przyczyniając się do wytworzenia ogniska zapalnego, co prowadzi do usunięcia infekcji tego typu patogenami. W  przypadku zakażeń grzybami lub niektórymi gatunkami bakterii komórki prezentujące antygen wytwarzają z kolei IL-1β, IL-6 i IL-23 indukujące powstanie limfocytów Th17, które przez sekrecję IL-17 i rekrutację neutrofilów pośredniczą w obronie przed patogenami zewnątrzkomórkowymi [69]. Różnicowanie limfocytów iTreg odbywa się natomiast w obecności TGF-β i IL-2 [93]. Odebranie pozakomórkowego sygnału ze strony cytokin przez aktywowane limfocyty Th powoduje zmianę ekspresji czynników transkrypcyjnych. Różnicowanie do komórek Th1 zależy od aktywacji czynnika STAT1 i ekspresji T-box (T-bet) [41]. W procesie różnicowania limfocytów Th2 IL-4 aktywuje z kolei czynnik STAT6, co prowadzi do syntezy czynnika transkrypcyjnego Gata3 [4]. Przy powstawaniu limfocytów Th17 indukowana jest ekspresja czynnika RORγT [22], nato-

ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH

31

Rys. 2.  Różnicowanie limfocytów CD4+ Limfocyty Th posiadają zdolność różnicowania do różnych populacji w zależności od obecności cytokin w trakcie rozpoznania kompleksów MHC-peptyd, np. komórki Th1 różnicują w obecności IL-12. Indukcja różnicowania powoduje uruchomienie ekspresji różnych czynników transkrypcyjnych, np. RoRγt w limfocytach Th17. Powstałe populacje limfocytów wytwarzają cytokiny regulujące przebieg odpowiedzi odpornościowej na patogen.

miast czynnik transkrypcyjny Foxp3 syntetyzowany jest w przypadku komórek regulatorowych Treg (Rys. 2). Limfocyty cytotoksyczne (CD8+, Tc) Limfocyty T cytotoksyczne (Tc) cechujące się obecnością powierzchniowego markera CD8 odpowiadają za eliminację komórek nowotworowych lub komórek zainfekowanych patogenami wewnątrzkomórkowymi. Swoją funkcję efektorową zyskują dzięki produkcji cytokin takich jak IFN-γ czy TNF-α (tumor necrosis factor α) lub poprzez aktywność cytolityczną. Po aktywacji limfocytów Tc dochodzi do uwolnienia granzymów i  uszkadzających błonę komórkową perforyn, a także do indukcji apoptozy w zainfekowanej komórce na drodze FasL. Produkowana przez limfocyty Tc cytokina FasL łączy się z komórką przeznaczoną do apoptozy za pośrednictwem zewnątrzkomórkowej domeny receptora Fas, FASR, który zawiera również domenę transbłonową kotwiczącą receptor i domenę cytoplazmatyczną, zwaną domeną śmierci FADD (Fas associated death domain) o charakterze wykonawczym. Przekazuje ona sygnał do białek cytoplazmy, kontrolujących fazę kontrolno-decyzyjną [70]. 4. Prezentacja antygenu i jego rozpoznanie przez limfocyty T Antygeny są cząsteczkami lub fragmentami cząsteczek posiadającymi zdolność do wiązania się z  przeciwciałem lub receptorem na powierzchni limfocy-

tów B lub T. Jeśli przyczyniają się one do wzbudzenia odpowiedzi odpornościowej, nazywa się je immunogenami. Nie wszystkie antygeny mają potencjał immunogenny, co jest bardzo istotnym aspektem konstruo­ wania nowych szczepionek, które powinny indukować wysoki poziom odpowiedzi odpornościowej, aby skutecznie chronić przed patogennymi mikroorganiz­ mami. Immunogenność zależy od wielu czynników. Duże znaczenie ma stopień obcości danej molekuły dla organizmu, gdyż autoantygeny zazwyczaj nie indukują odpowiednio silnej odpowiedzi odpornościowej. Równie istotne są parametry fizyczne – duże cząsteczki takie jak białka, polisacharydy czy kwasy nukleinowe należą do najbardziej immunogennych. Cząsteczki o mniejszej masie molekularnej mogą zaś funkcjonować jako hapteny, antygeny zyskujące immunogenność po połączeniu z odpowiednim nośnikiem. Obok fizyko-chemicznych cech antygenu, skuteczną odpowiedź przeciw niemu warunkuje również jego stężenie i  droga podania. Immunogenność antygenu może być również wzmagana poprzez dostarczanie antygenu z  innymi substancjami, zwanymi adiuwantami [68]. Limfocyty biorące udział w komórkowej odpowiedzi immunologicznej rozpoznają antygeny, które są prezentowane na komórkach eukariotycznych w kompleksach z  cząsteczkami układów zgodności tkankowej MHC klasy I (limfocyty Tc) i MHC klasy II (limfocyty Th). Cząsteczki MHC klasy I eksprymowane na wszystkich jądrzastych komórkach prezentują peptydy endogennego, cytoplazmatycznego lub jądrowego pochodzenia (Rys. 3). Znane są dwa szlaki prezentacji antygenu

32

KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

Rys. 3.  Ścieżka prezentacji antygenu w kompleksach z cząsteczkami MHC klasy I. Prezentacja wewnątrzkomórkowych immunogennych peptydów jest wynikiem serii zdarzeń. Antygeny ulegają degradacji w proteasomie, a powstałe peptydy są translokowane za pomocą transporterów TAP do ER, gdzie tworzą kompleksy z cząsteczkami MHC I. Kompleksy peptyd-MHC I są uwalniane z ER i przy udziale aparatu Golgiego transportowane na powierzchnię komórki, gdzie mogą być rozpoznane przez limfocyt cytotoksyczny. APC – komórka prezentująca antygen; TAP – transporter associated protein; ER – retikulum endoplazmatyczne; TCR – receptor limfocytu T.

w MHC I: a) endogenny szlak przetwarzania antygenów wewnątrzkomórkowych w  proteasomie i  tworzenia kompleksów z MHC I, b) prezentacja krzyżowa pozakomórkowych antygenów, które trafiają do wnętrza komórki prezentującej na drodze endocytozy lub peptydów pochodzących z degradacji antygenu białkowego przekazywanych przez wyspecjalizowane wewnątrzkomórkowe kanały zwane „gap junctions”. W procesie krzyżowej prezentacji zachodzącej tylko w niektórych typach APC antygeny trafiają do komórki na drodze fagocytozy lub makropinocytozy, a  następnie ulegają kompleksowaniu z MHC I na drodze jednego z trzech znanych szlaków. Pierwszym z nich jest proces o nieznanym mechanizmie, udokumentowany dla wirosomów, kompleksów immunostymulujących czy liposomów, w którym białko przedostaje się z fagosomu do cytoplazmy, a następnie wchodzi na ścieżkę TAP-zależnej prezentacji [75]. Drugim sposobem jest opuszczenie

fagosomu przez antygen, jego obróbka w proteasomie, a następnie powrót do fagosomu, w którym zachodzi łączenie z  MHC klasy I [67]. Trzecia ścieżka zwana wakuolarną różni się od pierwszej brakiem zaangażowania transporterów TAP i proteasomu w kompleksowaniu antygenu z MHC [67]. Najczęściej wykorzystywany jest klasyczny, endogenny szlak prezentacji. Białka cytoplazmatyczne lub jądrowe podlegają w nim ubikwitynylacji, a następnie degradacji w  proteasomie. Są to białka, których czas trwania kończy się, białka będące defektywnymi produktami translacji zwanymi DRiPs (defective ribosomal products) lub białkowe produkty patogenów wewnątrzkomórkowych. Powstałe w wyniku degradacji peptydy są translokowane do retikulum endoplazmatycznego (ER) przez białka transportujące TAP (transporters associated with antigen presentation), gdzie łączą się z cząsteczkami MHC I. Heterodimery MHC I składają się z polimorficznych łańcuchów: ciężkiego  α i  lekkiego zwanego β2‑mikroglobuliną (β2m). Związanie 8–10-aminokwasowego peptydu do rowka MHC  I zapewnia stabilność całej strukturze. W stanie nie wiążącym peptydu łańcuchy MHC są stabilizowane przez białka chaperonowe ER takie jak kalretikulina, ERp57, izomeraza PDI czy tapazyna. Ostatnie z  wymienionych białek oddziałuje z  transporterem TAP, zapewniając łączność między procesem translokacji peptydu do ER i jego dostarczaniem do MHC I. Po związaniu peptydu białka chaperonowe są uwalniane, a kompleksy są transportowane na powierzchnię komórki, gdzie mogą być rozpoznane przez limfocyty T cytotoksyczne (CD8+, Tc) [56]. W przeciwieństwie do MHC klasy  I, kompleksy MHC klasy II są obecne na profesjonalnych komórkach prezentujących antygen takich jak komórki dendrytyczne (DC), makrofagi i limfocyty B. Ich ekspresja może być jednak wzbudzona przez IFN-γ lub inne czynniki na nieprofesjonalnych komórkach prezentujących, takich jak fibroblasty, komórki nabłonkowe, keratynocyty, co obserwuje się w przypadku dermatoz, a  także na jelitowych komórkach glejowych w  przebiegu choroby Crohna. Kompleksy MHC II powstają w ER z transmembranowych łańcuchów α i β i połączonych z łańcuchem niezmiennym Ii zapobiegającym tworzeniu kompleksów z peptydami pochodzącymi z  degradacji wewnątrzkomórkowych białek. Kompleksy te trafiają do endosomu MIIC (MHC class  II compartment), gdzie łańcuch  Ii jest trawiony. Pozostały w rowku heterodimeru peptyd CLIP jest następnie wymieniany przy udziale chaperonu HLA-DM na specyficzny peptyd pochodzenia pozakomórkowego uzyskany poprzez degradację na ścieżce endosomalnej (Rys. 4). Następnie kompleksy MHC II-peptyd są transportowane na powierzchnię komórki, gdzie mogą zaprezentować antygen limfocytom T CD4+ [56].

ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH

33

Rys. 4.  Ścieżka prezentacji antygenu w kompleksach z cząsteczkami MHC klasy II. Składanie heterodimerów MHC II z łańcuchów α i β oraz łańcucha zmiennego Ii odbywa się w ER. Przy udziale aparatu Golgiego są one bezpośrednio lub poprzez błonę komórkową transportowane do kompartmentu MIIC. W MIIC łańcuch Ii oraz białka pobrane poprzez endocytozę są trawione przez obecne tam proteazy. Peptyd CLIP będący produktem degradacji Ii początkowo blokuje rowek wiążący peptyd w dimerze MHC II, a następnie jest wymieniany na antygenowy peptyd przy pomocy chaperonu HLA-DM. Kompleksy peptyd-MHC II są kolejno transportowane na powierzchnię błony komórki APC, gdzie mogą być rozpoznane przez limfocyty pomocnicze. APC – komórka prezentująca antygen; ER – retikulum endoplazmatyczne; TCR – receptor limfocytu T; CLIP – fragment peptydu Ii związanego z MHC II; MIIC – kompartment MHC II.

Cytotoksyczne lub pomocnicze limfocyty T do proliferacji i  różnicowania w komórki efektorowe wymagają obecności trzech sygnałów. Dwa z nich dostarczane są przez komórki dendrytyczne, których rola w aktywacji bądź wywołaniu stanu anergii limfocytów jest kluczowa. Pierwszy sygnał zapewnia inter­ akcja cząsteczek MHC wiążących peptyd na komórce dendrytycznej z receptorem TCR (T cell receptor) na limfocycie. W  celu uniknięcia anergii limfocytów  T oraz umożliwienia ich proliferacji niezbędny jest drugi, kostymulujący sygnał zapewniany przez interakcję cząsteczek kostymulatorowych obecnych jedynie na dojrzałych APC, takich jak białka B7 (CD80 i CD86) łączących się z powierzchniowymi cząsteczkami CD28 limfocytów T (Rys. 5). Ekspresja białek B7 na komórkach prezentujących antygen wzrasta w trakcie ich dojrzewania wskutek aktywacji przez związki, których źródłem są patogeny i jest wzmagana przez cytokiny, które stanowią trzeci sygnał aktywacji. Stopień ekspresji CD80 i CD86 warunkuje z kolei interakcję między cząsteczkami CD40 na komórkach dendrytycznych i ligandem CD40L na limfocytach. Aktywowane limfocyty CD4+ wytwarzają CD40L, który stymuluje ekspresję CD40 na APC, przez co zyskują one zdolność pobudzenia antygenowo swoistych limfocytów CD8+. Interakcja między cząsteczką kostymulatorową a CD28 limfocytu T indukuje aktywny transport białek sygnało-

wych limfocytu T do miejsca kontaktu z komórką APC. Ich akumulacja wzmaga intensywność i wydłuża czas trwania procesu sygnalizacyjnego zapoczątkowanego przez pierwszy sygnał. W przypadku infekcji patogenami wewnątrzkomórkowymi komórkami efektorowymi odpowiedzi odpornościowej są limfocyty CD8+. Ich aktywacja zależy od obecności antygenowo-specyficznych prekursorów, siły oddziaływania receptora TCR z kompleksem MHC I-peptyd czy poziomu cytokin prozapalnych. W przeciwieństwie do limfocytów Th, zapoczątkowanie programu prowadzącego do osiągnięcia funkcji efektorowej oraz wytworzenia pamięci immunologicznej przez limfocyty Tc wymaga uzyskania trzeciego sygnału zapewnianego przez IL-12 lub IFN-α. W przypadku jego braku dochodzi jedynie do ograniczonej klonalnej ekspansji i wytworzenia stanu tolerancji [52]. Rola limfocytów CD4+ w inicjowaniu odpowiedzi limfocytów CD8+ jest złożona i w dużej mierze zależy od tego, w jakich warunkach analizowany jest dany model infekcji. Liczne eksperymenty, w których dokonywano immunizacji przy pomocy wirulentnych (adenowirusy, wirus grypy) lub nieinfekcyjnych czynników (owoalbumina jaja kurzego) wykazały, że limfocyty Th są niezbędne do zajścia odpowiedzi typu komórkowego, gdyż aktywują APC dostarczając ligand CD40L w procesie zwanym „licencjonowaniem”. Z  drugiej strony

34

KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

Rys. 5.  Ścieżki aktywacji limfocytów T. A. Dojrzała komórka APC aktywuje limfocyt T dostarczając 2 sygnały. B. Niedojrzała komórka APC dostarcza jedynie I sygnał, co prowadzi do śmierci lub inaktywacji limfocytu.

niejednokrotnie w toku badań wykazano, że w przypadku infekcji patogenami takimi jak wirus limfocytarnego zapalenia splotu naczyniówkowego (LCMV) czy wirus HIV dochodzi do wzbudzenia silnej odpowiedzi limfocytów CD8+, niezależnej od pomocy limfocytów pomocniczych, co związane jest ze zdol­nością danych czynników infekcyjnych do aktywacji APC poprzez receptory PRR (pattern recognition receptors). Udokumentowano także przypadki, w których mimo wykorzystania tego samego modelu infekcji uzyskiwano rozbieżne rezultaty dotyczące roli limfocytów CD4+ w  generowaniu odpowiedzi limfocytów CD8+ [88]. Wszystkie wirusowe i bakteryjne patogeny niosą ligandy PRR (m. in. LPS, CpG, DNA, flagellinę), dzięki którym mogą wzbudzać odpowiedź zapalną i prowadzić do aktywacji APC. Nadal nie jest więc jasne, które z  interakcji miedzy PAMP i  PRR sprawiają, że aktywacja APC jest zależna lub niezależna od limfocytów Th. W przypadku infekcji patogenami niosącymi słabe ligandy PRR, limfocyty CD4+ wspomagają dojrzewanie APC poprzez regulację ekspresji cząsteczek kostymulatorowych oraz zapewnianie trzeciego sygnału ze strony cytokin takich jak IL-12. Infekcje patogenami, które indukują słabą syntezę IFN typu I mogą również wymagać obecności limfocytów pomocniczych do wytworze-

nia trzeciego sygnału dla limfocytów cytotoksycznych poprzez indukcję wytwarzania IL-12 w  komórkach dendrytycznych. W przeciwieństwie do wyżej wymienionych, infekcje patogenami, które wywołują silną odpowiedź zapalną i produkcję wysokich stężeń IFN typu I wiążą się z wystarczającą regulacją ekspresji cząsteczek kostymulatorowych na komórkach prezentujących antygen, w związku z czym udział limfocytów CD4+ w ich dojrzewaniu nie jest wymagany [9]. 5.  Pamięć immunologiczna Bardzo ważnym aspektem przebiegu swoistej odpowiedzi immunologicznej jest indukcja pamięci immunologicznej. Komórki pamięci są komórkami potomnymi naiwnych limfocytów, które uległy klonalnej ekspansji w trakcie odpowiedzi immunologicznej i przetrwały po wyeliminowaniu antygenu. Zapewniają one natychmiastową ochronę organizmu przy ponownym kontakcie z danym antygenem. Limfocyty  T pamięci zdecydowanie różnią się od limfocytów  T naiwnych, ponieważ odpowiadają na niższe stężenia antygenu, produkują szerszy wachlarz antywirusowych oraz prozapalnych cytokin, wzbudzają szybką cytoli-

ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH

tyczną aktywność oraz skuteczniej migrują do innych tkanek objętych infekcją [69]. Udowodniono również, że dzielą się one w znacznie szybszym tempie niż limfocyty T naiwne tuż po rozpoczęciu infekcji wirusowej, ale podobnie jak one wykazują 48–72-godzinną fazę opóźnienia, w której nie ulegają podziałom [87]. Komórki T pamięci dzielą się na dwie grupy. Pierwszą z  nich stanowią efektorowe limfocyty T pamięci (TEM), które rezydują w tkankach lub krążą po organizmie. Są one odpowiedzialne za natychmiastową obronę organizmu przed patogenami ze względu na zachowaną gotowość do pełnienia funkcji efektorowej. Do drugiej grupy należą limfocyty TCM, centralne limfocyty pamięci, które nadzorują obwodowe tkanki limfoidalne, gdzie mogą proliferować w odpowiedzi na prezentację antygenu przez APC [69]. Komórki pamięci stanowią jedynie niewielką frakcję limfocytów powstałych podczas odpowiedzi immunologicznej. Stosunek prekursorów limfocytów efektorowych i pamięci zależy od różnej ekspresji czynników transkrypcyjnych, na którą wpływają z kolei stymulacja przez antygen, cytokiny i wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne. W toku analiz naiwnych limfocytów  T znakowanych genetycznymi znacznikami w warunkach lokalnej i systemowej infekcji wykazano, że, niezależnie od warunków, jednocześnie zachodzi różnicowanie do obu typów komórek [28]. Czas życia limfocytów pamięci oraz ich liczba zależą od poziomu cytokin. W  przypadku limfocytów pamięci CD4+ i CD8+, cytokinami umożliwiającymi ich przetrwanie są IL-7 i IL-15, indukujące proliferację [78]. Sun i wsp. [76] w badaniach z wykorzystaniem myszy laboratoryjnych pozbawionych limfocytów CD4+ wykazali, że właśnie limfocyty CD4+ są odpowiedzialne nie tylko za dostarczanie trzeciego sygnału indukcji niezbędnego do różnicowania limfocytów Tc, ale również za utrzymanie populacji limfocytów CD8+ pamięci. Za populację długożyjących limfocytów T pamięci uważa się limfocyty TCM, w związku z czym obecnie prowadzi się intensywne badania nad opracowaniem leków sprzyjających różnicowaniu limfocytów naiwnych CD4+ do komórek pamięci tego typu­. Araki i wsp. [5] dowiedli, że rapamycyna, obniżając aktywność kinazy treoninowo-serynowej mTOR będącej sensorem różnych czynników środowiskowych i  regulatorem metabolizmu komórkowego, wpływa na przyspieszoną konwersję naiwnych limfocytów T do limfocytów TCM.

35

w taki sposób, aby stymulować odpowiedź humoralną skierowaną przeciw powierzchniowym cząsteczkom komórek bakteryjnych czy wirusów. Dowiedziono jednak, że odpowiedź taka jest nieskuteczna w wywoływaniu odporności przeciw patogenom wewnątrz­ komórkowym [16]. Preparaty nowej generacji powinny wzbudzać odpowiedź typu komórkowego z udziałem limfocytów Th oraz Tc, gdyż jedynie te komórki mogą wywoływać ochronę przed patogenami, które wykazują dużą zmienność serotypową (adenowirusy), prowadzą wewnątrzkomórkowy tryb życia lub które cechuje zdolność do wytwarzania form latentnych (np. HIV, Herpex, HBV, HCV, Helicobacter pylori, Plasmodium falciparum, Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis, Salmonella enterica, Brucella spp., Burkholderia spp.). Należy podkreślić, że ten typ odpowiedzi chroni także przed rozwojem nowotworów lub chorobami auto­ immunizacyjnymi. Najnowsze badania dotyczące odpowiedzi immunologicznej myszy zakażonych prątkami gruźlicy dowodzą, że limfocyty B mogą regulować przebieg infekcji M. tuberculosis poprzez produkcję cytokin czy przeciwciał, jednak ich rola w kontroli zakażenia jest poboczna [83]. Limfocyty  B mogą mieć jedynie ograniczony kontakt z antygenami prątków tuż przed ich wniknięciem do komórki gospodarza lub w  czasie ich rozprzestrzeniania między komórkami. Szczepionki indukujące odpowiedź komórkową muszą być konstruowane w sposób umożliwiający dostarczenie antygenu do APC, dzięki czemu będzie on prezentowany w  kontekście cząsteczek MHC na powierzchni komórki. Głównym zadaniem współczesnej wakcynologii jest opracowanie preparatów wzbudzających odpowiedź typu komórkowego. Nowe szczepionki powinny być więc konstruowane tak, aby wybiórczo aktywować limfocyty T o określonym fenotypie i w ściśle okreś­lonej lokalizacji. Najważniejszym aspektem badań jest opracowanie metod generowania stabilnej puli limfocytów T pamięci prawidłowo umiejscowionych w szczepionym organizmie w taki sposób, aby wektor szczepionkowy był jak najbardziej bezpieczny dla szczepionego organizmu, a patogen w przypadku infekcji był jak najszybciej usuwany. W celu dobrania warunków sprzyjających wywoływaniu długotrwałej odporności szczepionego organizmu opracowano szereg systemów dostarczania antygenu, do których należą szczepionki podjednostkowe kierowane i wzmacniane przy udziale adiuwantów oraz szczepionki wektorowe wykorzystujące wirusy oraz żywe atenuowane lub niewirulentne bakterie.

6. Szczepionki indukujące odpowiedź typu komórkowego

7.  Szczepionki podjednostkowe

Preparaty szczepionkowe konstruowane w przesz­ łości oparte na inaktywowanych organizmach lub produkowanych przez nie białkach zostały zaprojektowane

Próby opracowania nowych szczepionek podjednostkowych podyktowane są wzrastającym zapotrzebowaniem na szczepionki bardzo dobrze zdefiniowane

36

KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

pod względem molekularnym, które zastąpią preparaty oparte na całych inaktywowanych patogenach zawierających wiele antygenów jednocześnie. Obecnie podejmuje się próby konstrukcji szczepionek opartych na wybranych antygenach będących celem dla układu odpornościowego, a nawet na ich najbardziej immunogennych, pojedynczych peptydach zwanych epitopami, pochodzących od czynnika infekcyjnego, komórki nowotworowej bądź alergenu. Szczepionki o minimalnej zawartości antygenów, cechujące się jednocześnie wysoką specyficznością opracowywane są na podstawie wysokoprzepustowych analiz in silico lub eksperymentalnych metod mapowania epitopów [49]. Docelowe preparaty mogą być wprowadzane jako oczyszczone białko, peptyd lub niebiałkowy składnik patogenu bądź ulegać ekspresji z wektora plazmidowego lub zrekombinowanego wirusa. Poszukiwanie podjednostkowych szczepionek stanowi obecnie ważny trend współczesnej wakcynologii. Większość opracowywanych szczepionek wywołujących odporność przeciw leiszmaniozom wywoływanym przez wiciowce z rodziny Leishmania ma podjednostkową formę. Dowiedziono skutecz­ności zastosowania szczepionki zawierającej białko gp63 z adiuwantem hsp70, która powodowała wzrost poziomu IFN-γ oraz obniżenie ekspresji IL-4 i IL-10 w surowicy myszy laboratoryjnych [42]. Trwają również prace nad szczepionką podjednostkową wywołującą odporność przeciw Chlamydia muridarum, w której wykorzystano główne białko błony zewnętrznej MOMP [81] czy przeciw F. tularensis, w której białko szoku cieplnego DnaK połączono z powierzchniowym białkiem patogenu Tul4 [7]. Obie szczepionki stymulowały wydzielanie IFN-γ oraz produkcję przeciwciał. W drugą fazę badań klinicznych wchodzi obecnie szczepionka H56 przeciw M. tuberculosis zawierająca trzy gruźlicze antygeny: Ag85B, ESAT-6 oraz białko stanu latencji Rv2660c, jak również adiuwant IC31, która w myszach wzbudza silną odpowiedź limfocytów CD4+ i powstrzymuje reaktywację latentnej formy gruźlicy [86]. W ciągu ostatnich 20 lat najwięcej uwagi poświęcono konstrukcji szczepionek DNA, które z powodzeniem wprowadzono do użytku w weterynarii m.in. do prewencji zakażeń łososi wodnymi rabdowirusami [26] czy zachorowań psów na czerniaka złośliwego jamy ustnej [33]. Pomimo sukcesu szczepionek DNA o weterynaryjnym zastosowaniu, istnieje silna potrzeba optymalizacji warunków ich użycia do  szczepienia ludzi. Podejmowane są liczne próby opracowania wektorów DNA – sukcesem zakończyła się między innymi druga faza badań klinicznych ludzkiej terapeutycznej szczepionki DNA VGX-3100 w postaci plazmidu kodującego antygeny E6/E7 wirusów HPV 16 i HPV 18 dostarczanego przy pomocy elektroporacji in vivo (dane National Cancer Institute z lipca 2014 roku). Podanie szczepionki kobietom, u których wykryto raka szyjki macicy

typu CIN 2/3 doprowadziło do indukcji limfocytów T cytotoksycznych i znacznego ograniczenia wzrostu nowotworu lub jego zaniku [10]. 8. Adiuwanty Molekularna formuła szczepionkowa często bywa słabo immunogenna, co sprawia, że poszukiwane są odpowiednie adiuwanty, formuły szczepionkowe oraz wektory wzmagające poziom odpowiedzi komórkowej. Adiuwantem szczepionkowym określa się składnik, który może wspomagać efektywność szczepionki poprzez indukcję silnej odpowiedzi immunologicznej. Koncepcja zastosowania adiuwantów została zaproponowana w 1925 roku przez Ramona, który zaobserwował, że dodanie do szczepionek tężcowej i  błoniczej substancji takich jak agar, tapioka, lecytyna, olej krochmalowy czy saponina powoduje wzrost miana specyficznych przeciwciał [71]. Jednocześnie, w 1926 roku, Glenny i wsp. zaobserwowali, że nanoszenie antygenu na nierozpuszczalne cząsteczki związków glinu przed immunizacją generuje lepszą odpowiedź za pośrednictwem przeciwciał niż w przypadku zastosowania rozpuszczalnej formy immunogennego białka [51]. Od tego odkrycia związki glinu były bardzo powszechnie wykorzystywane do wzmagania odpowiedzi immunologicznej. Zastosowanie adiuwantów w wakcynologii jest bardzo szerokie – są one wykorzystywane do modulowania odpowiedzi immunologicznej poprzez dostarczanie antygenu w natywnej formie, redukują potrzebę wieloetapowej immunizacji i obniżają tym samym jej koszty, a także przyczyniają się do wzmożonej odpowiedzi u dzieci lub dorosłych pacjentów z obniżoną odpornością [1]. Mogą być również podzielone na 2  klasy w zależności od dominującego mechanizmu działania na: a) systemy nośnikowe oraz b) wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej. Systemy nośnikowe koncentrują antygen i prezentują go w zorganizowanej formie, podczas gdy wzmacniacze aktywują mechanizmy wrodzonej odpowiedzi immunologicznej [53]. Efektami działania adiuwantów są: wzrost produkcji przeciwciał i  zwiększenie populacji antygenowo-specyficznych limfocytów  T, wydłużenie czasu trwania odpowiedzi, wzmocniona ochrona przeciw różnym wariantom tego samego patogenu czy zmniejszona liczba dawek wymaganych do uzyskania ochronnego poziomu przeciwciał czy limfocytów pamięci. Tabela II przygotowana według publikacji przeglądowej Mohan i wsp. [53] przedstawia listę znanych adiuwantów oraz mechanizmy ich działania. Wyniki najnowszych badań nad zastosowaniem no­wo­czesnych systemów adiuwantów wspomagających indukcję odpowiedzi immunologicznej przez szczepionki

ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH

37

Tabela II Adiuwanty szczepionkowe Typ

Formuła

Działanie

SOLE ALUMINIUM

fosforan aluminium, wodorotlenek aluminium spowalnianie tempa uwalniania antygenu, wydłużanie kontaktu antygenu z układem immunologicznym, stymulowanie odpowiedzi limfocytów Th2 INNE SOLE MINERALNE, sole wapnia, żelaza, cyrkonu

np. fosforan wapnia KOMPLETNY ADIUWANT FREUNDA

inaktywowane termicznie komórki z rodzaju Mycobacterium

EMULSJE

(niekompletny adiuwant typu „olej w wodzie” i „woda w oleju” Freunda, montanid, MF59, adiuwant 65)

ułatwiona adsorpcja antygenu, indukcja wysokiego poziomu przeciwciał IgG stymulacja komórkowej odpowiedzi immunologicznej oraz produkcji IgG i IgA stymulacja limfocytów B i Tc

BAKTERYJNE TOKSYNY: toksyna CT mieszana lub koniugowana z antygenami Vibrio cholerae śluzówkowymi toksyna PT inaktywowane komórki B. pertussis Bordetella pertussis (mieszanina toksyny zawiera LPS) toksyna A i B oczyszczony preparat Clostridium difficile toksyna STx oczyszczony preparat Schigella dysenteriae enterotoksyny oczyszczony preparat Staphylococcus NIETOKSYCZNE BIAŁKA:

wzmaganie immunogenności słabych antygenów wzmaganie komórkowej odpowiedzi immunologicznej zwiększanie poziomu przeciwciał IgA wzmaganie odpowiedzi humoralnej i komórkowej zwiększanie poziomu przeciwciał IgG i IgA

lipopeptydy izolowane z bakteryjnych lipoprotein dipeptyd muramylowy izolacja ze ściany komórkowej mykobakterii (MDP)

adiuwanty przy szczepieniach drogą pokarmową stymulacja niespecyficznych mechanizmów skierowanych przeciw bakteriom i komórkom rakowym

proteosomy niejednorodne preparaty błony zewnętrznej meningokoków

zwiększanie poziomu IgA

LIPOSOMY



syntetyczne sfery składające się z warstwy lipidowej otaczającej antygen

wzmaganie humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej

ŚRODKI POWIERZCH- NIOWO CZYNNE

składnik detergentu saponiny izolowanej z Quillaja saponaria

wzmaganie odpowiedzi przeciw T-zależnym i T-niezależnym antygenom

(Quil-A)

KOMPLEKSY cząstki formowane podczas mieszania IMMUNOSTYMULUJĄCE cholesterolu z Quil-A (ISCOM)

stymulacja produkcji immunoglobulin wszystkich klas, wzmaganie komórkowej odpowiedzi immunologicznej, w tym odpowiedzi CTL

ADIUWANTY złożone związki wodorowęglanowe naturalnego indukcja humoralnej i komórkowej odpowiedzi WODOROWĘGLANOWE pochodzenia, np. γ-inulina immunologicznej OLIGONUKLEOTYDY

niemetylowane dinukleotydy CpG obecne CpG w DNA bakterii

bezpośrednia aktywacja limfocytów B i komórek dendrytycznych poprzez receptory TLR9, wzmaganie komórkowej odpowiedzi immunologicznej

WZORCE MOLEKU- składniki komórkowe bakterii lub ich LARNE lub ich pochodne chemicznie uzyskiwane pochodne (np. MPL

wzmaganie wrodzonych mechanizmów immunologicznych (fagocytozy, wydzielana prostaglandyn, rekrutacji komórek stanu zapalnego) oraz humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej

(LPS, MPL, peptydo- glikan, flagellina, kwasy lipotejchojowe)

– lipid A Salmonella minnesota pozbawiony grupy (R)-3-hydroksydekanoilowej

CYTOKINY GM-CSF – INF – IL-1 – IL-2 – IL-6 –

indukcja migracji komórek dendrytycznych, zwiększenie ekspresji MHC I na ich powierzchni indukcja proliferacji komórek T, aktywacja komórek NK, modulowanie produkcji cytokin rekrutacja neutrofili do miejsca stanu zapalnego wzmaganie komórkowej odpowiedzi immunologicznej limfocytów CD4+ stymulacja limfocytów B

38

KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

Tabela II c.d. Typ

Formuła

Działanie

IL-12 – IL-15 – IL-18 –

indukcja komórek NK oraz limfocytów B i T indukcja komórek NK oraz limfocytów T wzmaganie proliferacji komórek NK oraz limfocytów CD8+

CHEMOKINY

wzmaganie wrodzonych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej

– POLIMERY

biodegradowalne – (poliliaktydy PLA, PLG)

adsorpcja antygenów na powierzchni lub ich zamknięcie wewnątrz, stopniowe uwalnianie antygenu

niedegradowalne (złoto, – lateks, krzem, polistyren)

usprawnianie dostarczania antygenu do wnętrza komórek prezentujących antygen

WIRUSOWE

wirosomy

struktury powstałe z połączenia lipidów błonowych z białkami błonowymi wirionu

dostarczanie antygenu do wnętrza komórek prezentujących antygen

VLP wielkocząsteczkowe kompleksy białek kapsydu wzmaganie odpowiedzi humoralnej i komórkowej (ang. virus-like particles) nie zawierającego informacji genetycznej

DNA u ludzi są obiecujące. W badaniach klinicznych przetestowano już dużą liczbę adiuwantów będących celami receptorów Toll-like takich jak TLR4 lub TLR9. W  Stanach Zjednoczonych w  2006  roku za drugi po związkach glinu adiuwant dopuszczony do użytku w  licencjonowanych ludzkich szczepionkach uznano monofosfolipid-A (MPL), który jest agonistą TLR4 [29]. W Europie dopuszczone jest również stosowanie wirosomów, cząstek VLP (virus-like particles) i emulsji typu „olej w wodzie” takich jak MF59, AS03 i AF03 [25]. Pozytywne wyniki daje zastosowanie adiuwantów cytokinowych – testuje się między innymi podanie interleukiny-12 stymulującej różnicowanie aktywowanych naiwnych limfocytów T do populacji limfocytów Th1 czy czynnika wzrostu makrofagów GM-CSF, który indukuje dojrzewanie APC [24]. Należy zaznaczyć, że wybór adiuwanta może znacząco wpłynąć na ostateczny wynik szczepienia. Ota i wsp. [59] udowodnili, że obecność glinu w składzie szczepionek używanych w  Rozszerzonym Programie Szczepień WHO (Expanded Programme of Immunization, EPI) spowodowała obniżenie skuteczności szczepionki MVA85B stosowanej w immunizacji noworodków przeciw gruźlicy. Adiuwanty mogą być z powodzeniem wykorzystywane jako składnik kompleksowego szczepienia podjednostkowymi szczepionkami w immunizacji typu „prime-boost”, która wzmacnia odporność organizmu uprzednio traktowanego szczepionką wektorową. Dzięki tej technice pokonany może być problem pojawiającej się odporności na zastosowany wektor. Lin i wsp. [46] wykazali, że podanie szczepionki H56 w kompleksie z adiuwantem IC31 opóźnia i osłabia objawy kliniczne gruźlicy, a także zapobiega reaktywacji uśpionej infekcji w makakach uprzednio immunizowanych szczepem BCG i eksponowanych na działanie M. tuberculosis.

9.  Szczepionki wektorowe Szczepionki wektorowe dostarczają antygeny do komórek prezentujących antygen wykorzystując orga­ nizmy posiadające naturalną zdolność do wnikania do wnętrza komórki eukariotycznej, takie jak wirusy czy bakterie. Spośród wszystkich znanych typów szczepionek, szczepionki oparte na żywych atenuowanych mikroorganizmach najskuteczniej indukują komórkowe mechanizmy odporności, przy czym w najwyższym stopniu modulują odpowiedź cytotoksycznych limfocytów  T. Skutecznie wzbudzają również syntezę przeciwciał, a niekwestionowaną zaletą ich użycia jest możliwość podania bez użycia strzykawki [70, 82]. Śmierć zainfekowanej komórki dodatkowo promuje fagocytozę przez komórki APC, co przyczynia się do zwiększonej prezentacji antygenu. Wektory oparte na wirusach lub bakteriach za sprawą niesionych przez nie wzorców molekularnych, takich jak LPS, CpG czy flagellina, mają ponadto właściwości auto-adiuwantów, dzięki czemu wzmagana jest prezentacja heterologicznego antygenu. Zgodnie z naturalnym cyklem życiowym, wektory wirusowe posiadają zdolność do efektywnego wnikania do ludzkich komórek i do wewnątrzkomórkowej ekspresji niesionych genów. Naśladowanie infekcji ułatwia indukcję silnej odpowiedzi limfocytów T, w tym limfocytów cytotoksycznych, dzięki czemu indukowane jest powstawanie limfocytów T pamięci i trwała odporność przeciw patogenom wewnątrzkomórkowym. Do konstrukcji szczepionek wykorzystywane są zarówno replikujące, jak i niezdolne do replikacji wirusy, takie jak: pokswirusy, adenowirusy, alfawirusy, flawiwirusy, pikornawirusy czy paramykso­wirusy. Wybór odpowiedniego wirusowego wektora zależy od charakterystyki

ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH

patogenu, przeciw któremu wywoływana jest odpowiedź oraz od tego czy szczepionka ma powodować całkowitą immunizację lub być stosowana w  modelu „prime-boost”. Większość wektorów wirusowych będących przedmiotem badań klinicznych opiera się na atenuowanych adenowirusach lub zmodyfikowanym wirusie Ankara (MVA). Adenowirusy dzięki zdolności do replikacji w ludzkich komórkach wydłużają ekspresję antygenu i jego prezentację na komórkach APC, co przyczynia się do wzmożonej odpowiedzi humoralnej i komórkowej. Duża powszechność infekcji adenowirusowych powoduje jednak, że zachodzi skierowana przeciw wektorowi odpowiedź immunologiczna skutkująca szybkim usuwaniem wirusa i  obniżoną immunogen­ noś­cią szczepionki [18]. Dwie szczepionki oparte na adenowirusach 35 i 5 eksprymujących antygen Ag85A M. tuberculosis są obecnie w  fazie  II niezależnych od siebie badań klinicznych w  Republice Południowej Afryki [38, 72]. Dowiedziona została ich skuteczność w  indukowaniu odporności pacjentów uprzednio szczepionych BCG i wzmaganiu produkcji IFN-γ przez komórki Th i Tc. Podobnie jak w przypadku adenowirusów, niereplikujący wirus MVA ma duży potencjał do indukcji limfocytów CD4+. MVA85A jako pierwsza szczepionka na bazie tego wirusa osiągnęła fazę II b badań klinicznych. Badania z udziałem dzieci nie potwierdziły jednak skuteczności szczepionki, natomiast dowiodły zdolności wektora do wzmagania syntezy IFN-γ [79]. Wykorzystanie wektorów wirusowych niesie za sobą pewne ograniczenia, do których zalicza się trudności w produkcji na dużą skalę, ograniczoną wielkość informacji genetycznej pakowanej do kapsydu niektórych wirusów, odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw samemu wektorowi oraz brak możliwości transdukcji do niektórych typów komórek. Co więcej, wirusy wyzwalają silną odpowiedź zapalną, a integracja do genomu gospodarza może przyczyniać się nawet do wytworzenia stanów chorobowych takich jak białaczka [80]. Alternatywą dla użycia wektorów na bazie wirusów jest wykorzystanie komórek bakteryjnych. W ciągu ostatniego półwiecza postępy w biologii molekularnej i rozumieniu bakteryjnych cykli życiowych przyczyniły się do znacznego postępu w pracach nad stworzeniem wektorów bakteryjnych zdolnych do dostarczania heterologicznych antygenów do komórek APC in vivo. Poznano drogi trwałej i  dobrze scharakteryzowanej atenuacji genów wirulencji, możliwa stała się regulacja poziomu ekspresji i lokalizacji antygenu niesionego przez komórkę bakteryjną, opracowano różne drogi podania bakteryjnego preparatu szczepionkowego, a co więcej określono potencjał do wzbudzania wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej. Dużą zaletą wykorzystania żywych wektorów bakteryjnych jest zdolność do naśladowania naturalnej

39

infekcji, dzięki czemu aktywowana może być zarówno niespecyficzna odpowiedź prozapalna, jak i, w  przypadku użycia modyfikowanych szczepów wnikających do komórek APC, antygenowo specyficzna odpowiedź komórkowa. Bakteryjne wektory dzięki jednoczesnemu dostarczaniu sygnału antygenowego oraz wzorców molekularnych związanych z patogenami lub ligandów TLR umożliwiają przełamanie stanu tolerancji orga­ nizmu wobec antygenu, co jest podstawowym założeniem immunoterapii opierającej się na odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T. Rozpoznanie niesionych przez komórki APC wzorców prowadzi do pozytywnej regulacji ekspresji cząsteczek kostymulatorowych na powierzchni, dojrzewania i migracji komórek APC, co wzmacnia odpowiedź immunologiczną przeciw dostarczanemu antygenowi. Inną zaletą nośników antygenowych na bazie bakterii jest to, że mogą one być zaprojektowane w taki sposób, aby wywoływać odporność przeciw własnym bądź eksprymowanym heterologicznie antygenom, a składniki szczepionkowe mogą być dostarczone w formie białka, DNA lub terapeutyku. 10. Bakterie patogenne jako wektory szczepionkowe Od lat 80. XX wieku podejmowane są liczne próby wykorzystania żywych wektorów bakteryjnych do dostarczania antygenów. Wykorzystują one naturalną zdolność wirulentnych bakterii do wnikania do wnętrza komórek eukariotycznych, dzięki czemu dostarczony antygen może wywoływać komórkową odpowiedź immunologiczną. Do konstrukcji żywych, atenuowanych szczepionek wykorzystuje się bakterie Shigella flexneri [90, 92], S. enterica [19, 65], Yersinia enterocolitica [3], Listeria monocytogenes [44, 50], Mycobacterium bovis BCG [6, 32] i wiele innych. Do tej pory jedynie dwie szczepionki pozytywnie przeszły testy kliniczne i zostały dopuszczone do użytku [21]. Pierwsza z  nich, szczepionka Ty21 uodparniająca na dur brzuszny, zawiera żywe atenuowane bakterie Salmonella ser. Typhi podawane doustnie w 3 dawkach w formie płynu lub kwasoodpornych kapsułek. Drugą dostępną szczepionką jest CVD 103-HgR immunizująca przeciw cholerze, która niesie atenuowane komórki V. cholerae podawane w płynnej formie w jednej dawce. Obecnie trwają testy kliniczne kilku innych szczepionek przeciw patogenom wewnątrzkomórkowym lub nowotworom. Warta uwagi jest szczepionka VPM1002 będąca w fazie II a badań klinicznych, która poprawia immunogenność szczepu BCG. Opiera się ona na szczepie BCG zmodyfikowanym poprzez wstawienie genu hly kodującego główny czynnik patogenezy L. monocytogenes, listeriolizynę O oraz delecję genu ureC kodującego ureazę C (BCGΔureChly+). Listeriolizyna  O (LLO) umożliwia ucieczkę z wakuoli do cytoplazmy

40

KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

zainfekowanej komórki, natomiast delecja ureazy powoduje odpowiednie dla aktywności LLO zakwaszenie wakuoli komórki. Dzięki wprowadzonym zmianom szczep BCG efektywnie ucieka z fagosomu zainfekowanej komórki i  przyczynia się do wzmożonej prezentacji antygenu [32]. Zakończyła się również druga faza badań klinicznych szczepionki terapeutycznej ADXS‑HPV bazującej na bakterii L. monocytogenes, która ma na celu leczenie pacjentek chorujących na raka szyjki macicy wywołanego przez wirus HPV. Atenuowany szczep bakteryjny wydzielający jednocześ­ nie fuzyjne białko kodujące antygen E7 w fuzji z niehemolityczną częścią LLO i adiuwant okazał się mieć skuteczność porównywalną do chemioterapii [50]. W toku licznych badań opracowywane są metody trwałej atenuacji, która w jak najmniejszym stopniu wpływa na immunogenność szczepów bakteryjnych. Ten proces w  wielu przypadkach jest jednak bardzo trudny, długotrwały i żmudny, a największe wyzwanie stanowi zachowanie równowagi między minimalną patogennością szczepu a  maksymalną zdolnością do indukcji odpowiedzi immunologicznej. Podczas opracowywania nowych wektorów dużą uwagę należy zwracać na fakt, że w zależności od typu modyfikacji można uzyskać zróżnicowaną reakcję odpornościową, np. doustne podanie mutanta PhoP Salmonella skutkuje indukcją mechanizmów odporności wrodzonej, podczas gdy mutanty aroA wzmacniają odpowiedź limfocytów Th1 [84]. Co więcej, atenuowane szczepy nie są odpowiednimi wektorami szczepionkowymi dla osób o niskiej lub upośledzonej odporności takich jak dzieci, ludzie starsi czy zakażeni wirusem HIV czy dla pacjentów skłonnych do chorób autoimmunizacyjnych. 11. Bakterie niepatogenne jako wektory szczepionkowe W związku z licznymi zagrożeniami związanymi z wykorzystaniem patogennych bakterii do konstrukcji szczepionek, uwaga badaczy zwróciła się ku wykorzystaniu niewirulentnych gatunków. W przeciwieństwie do atenuowanych, zazwyczaj Gram-ujemnych patogennych szczepów bakterii takich jak Shigella czy Salmonella, Gram-dodatnie niewirulentne gatunki są bezpieczne, ponieważ stanowią naturalny składnik flory bakteryjnej człowieka lub są powszechnie wykorzystywane przez człowieka w  przemyśle. W  opracowaniu wektorów z ich użyciem często wykorzystywana jest unikalna cecha bakterii Gram-dodatnich, jaką jest zdolność do tworzenia endospor. Obecnie najczęściej podejmowane są próby konstrukcji niewirulentnych wektorów bakteryjnych z wykorzystaniem wegetatywnych bakterii kwasu mlekowego (LAB), m.in. Lactococcus lactis [66, 91], Lactobacillus plantarum [31],

Lactobacillus casei [45] czy Streptococcus gordonii [12], a  także spor modelowej bakterii Gram-dodatniej, B. subtilis [37, 57, 58]. Główną wadą systemów wykorzystujących niewirulentne gatunki jest brak inwazyjności, co sprawia, że dostarczanie antygenu może być mniej efektywne niż w przypadku wykorzystania patogennych bak­ terii. Sposobem na rozwiązanie tego problemu może być ekspresja determinantów patogenezy wirulentnych szczepów w gatunkach niepatogennych. Wśród białek, których aktywność prowadzi do wniknięcia do komórki eukariotycznej oraz ucieczki z fagosomu do cytoplazmy są czynniki wirulencji wewnątrzkomórkowego patogenu L. monocytogenes. Guimaraes i wsp. [34] opracowali szczep L. lactis produkujący zakotwiczoną w ścianie komórkowej internalinę  A L. monocytogenes, który był zdolny do inwazji do komórek eukariotycznych in vitro i in vivo. Samo wniknięcie wektora do komórki gospodarza nie wystarcza jednak do tego, aby antygen był prezentowany w kompleksie z MHC klasy I i by w konsekwencji wzbudzona została odpowiedź limfocytów CD8+. Jednym ze sposobów na dostarczenie antygenu do cytoplazmy APC jest również ekspresja listeriolizyny O, głównego czynnika patogenezy L. monocytogenes, który umożliwia translokację komórki bakteryjnej z  wakuoli komórki gospodarza do jej cytoplazmy. Za początek badań w tym obszarze uznaje się odkrycie prof. Bieleckiego i wsp. [14], którzy dowiedli, że B. subtilis wytwarzający LLO jest zdolny do wniknięcia do niefagocytujących i fagocytujących komórek eukariotycznych, ucieczki z ich wakuoli do cytoplazmy komórki gospodarza i przetrwania w  jej wnętrzu. Toksyna swoje właściwości zawdzięcza specyficznej strukturze. Białko o masie 58 kDa ulega sekrecji poza komórkę bakteryjną w postaci rozpuszczalnych w wodzie monomerów, które mogą wiązać się do błon biologicznych zawierających cholesterol i oligomeryzować do struktury β-baryłki, tworząc w błonie pory. LLO jest aktywna jedynie w kwaśnym pH, co ogranicza zakres jej działalności do wakuoli komórki gospodarza i w ten sposób chroni ją przed śmiercią [77]. W trakcie infekcji L. monocytogenes odpowiedź limfocytów  Th i Tc jest skierowana przeciwko LLO [27]. Permeabilizująca aktywność toksyny umożliwia dostęp heterologicznych antygenów do cytozolu i ich wejście na egzogenną TAP‑zależną ścieżkę prezentacji białka. Prezentowany w kontekście MHC klasy I antygen jest rozpoznawany przez limfocyty CD4+ i  CD8+, co prowadzi do kompleksowej odpowiedzi komórkowej. Koekspresja LLO z innymi antygenami jest intensywnie wykorzystywana w  badaniach nad konstrukcją żywych szczepionek. Bahey-el-Din i wsp. [11] w badaniach z  wykorzystaniem zakażonych myszy wykazali, że jednoczesna ekspresja LLO z białkiem p60 w L. lactis skutecznie wywołuje odpowiedź limfocytów Tc, a także zapewnia

ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH

odporność na infekcje L. monocytogenes. Trwają także zaawansowane badania kliniczne nad modyfikowaną szczepionką przeciwgruźliczą BCGΔureChly+, w której toksyna dzięki swej aktywności wzmaga prezentację antygenów M. tuberculosis i generowaną dzięki niej pamięć immunologiczną [32]. Aktywność LLO wykorzystywana jest również przy opracowywaniu szczepionek przeciwnowotworowych – Radford i  wsp. [63, 64] wykazali, że komórki Escherichia coli produkujące LLO oraz owoalbuminę jaja kurzego (OVA) są zdolne do usunięcia komórek czerniaka linii B16-OVA oraz skutecznie zapobiegają wzrostowi nowotworu. Bardzo interesującą cechą listeriolizyny O jest fakt, że jednocześnie stanowi ona główny czynnik patogenezy oraz główny immunogen, co sprawia, że jest ona idealnym kandydatem na adiuwant szczepionkowy. Poddanie APC działaniu nanomolarnych, niemających cytotoksycznego efektu, stężeń cytolizyny powodowało aktywację limfocytów CD8+, podczas gdy pikomolarne stężenia wystarczały do zaobserwowania aktywacji komórek CD4+ [15]. Co więcej, zainfekowane komórki i rozpoznające je limfocyty  T w  obecności LLO produkują szerokie spektrum cytokin i chemokin takich jak IL-1, IL-6, IL-12, CCL2, IFN-β czy TNF-α, które aktywują APC i wzmacniają odporność wrodzoną oraz odpowiedź limfocytów Th1 [60]. Huang i  wsp. [39] w  badaniach z wykorzystaniem spor B. subtilis koeks­prymujących LLO z antygenem protekcyjnym PA Bacillus anthracis potwierdzili wpływ LLO na poprawę odpowiedzi odpornościowej. Zaobserwowali, że spory powodowały wzrost poziomu przeciwciał IgG2a PA swoistych oraz poziomu IFN-γ i IL-12 przy jednocześnie zmniejszonym stężeniu IL-4 w surowicy myszy, co świadczy o wzmożonej odpowiedzi typu Th1. Brak związku między cytotoksycznością a immunogennością czyni ponadto z LLO wyjątkowe białko w  immuno­ terapii nowotworów. Aktywność cytotoksyczna może posłużyć do bezpośredniego zabijania komórek rakowych, natomiast ze względu na swoją immunogenność LLO może mieć również aktywność adiuwantową wykorzystaną przy konstrukcji szczepionek zawierających antygeny nowotworowe, które indukują usuwanie komórek ulegających transformacji nowotworowej. Obie te cechy z powodzeniem mogą być wykorzystane jednocześnie. Stachowiak i wsp. [74] w swoich badaniach analizowali aktywność LLO względem komórek białaczkowych komórek T Jurkat, dowodząc ograniczonej selektywności toksyczności, która z powodzeniem może być zastosowana do niszczenia nowotworów przy zawężeniu obszaru działania do miejsc zawierających zmienione chorobowo komórki. Drugim sposobem umożliwiającym dostarczanie antygenów do cytoplazmy jest wykorzystanie systemu sekrecji typu  3 (T3SS). T3SS jest skomplikowanym aparatem, który umożliwia wielu Gram-ujemnym bak-

41

teriom, takim jak: S. enterica, Yersinia spp., Shigella spp., E. coli czy Pseudomonas aeruginosa dostarczanie białek efektorowych do cytoplazmy komórki gospodarza. Stworzenie minimalnego, funkcjonalnego systemu wymaga ekspresji ponad 20 genów. Pomimo to, z powodzeniem są one klonowane w niepatogennych bakteriach takich jak E. coli K12 [2] czy P. putida [89], stając się narzędziem do dostarczania antygenów i indukcji odpowiedzi limfocytów Tc. 12. Podsumowanie Początek XXI wieku przyniósł wiele nowych odkryć w dziedzinie wakcynologii, które dały początek wdrożeniu nowych preparatów szczepionkowych lub ich doprowadzeniem do zaawansowanych testów klinicznych. Dzięki zastosowaniu odwrotnej wakcynologii i  znacznemu poszerzeniu wiedzy immunologicznej z  zakresu prezentacji antygenu i indukcji trwałej pamięci immunologicznej testowane są obecnie liczne skierowane przeciw patogenom tj. HIV, malaria, M. tuberculosis czy S. aureus szczepionki, w  opracowaniu których do tej pory zawodziły konwencjonalne metody. Nowatorskie wektory oraz adiuwanty mogą w  znacznej mierze prowadzić do opracowania preparatów terapeutycznych do stosowania w  leczeniu chorób nowotworowych, przewlekłych infekcji czy chorób autoimmunizacyjnych. Nowoczesne strategie mogą więc nie tyle wzmagać, ile modulować odpowiedź immunologiczną, prowadząc do osiągnięcia z góry zamierzonego efektu. Prowadzone obecnie testy kliniczne pokazują, że ważna jest nie tylko siła zachodzącej odpowiedzi i miejsce jej indukcji, ale również czas jej trwania oraz trwałość generowanej pamięci. Głównym wyzwaniem jest więc opracowanie skutecznych metod określania immunogenności patogennych i nowotworowych białek, która będzie miała przełożenie na skuteczną immunizację. Podziękowania Praca finansowana z grantów Narodowego Centrum Badań i Rozwoju (nr N R13 0046 06) oraz Narodowego Centrum Nauki (2013/09/N/NZ1/00182).

Piśmiennictwo   1. Aguilar J.C., Rodriguez E.G.: Vaccine adjuvants revisited. Vaccine, 25, 3752–3762 (2007)   2. Akeda Y., Kimura T., Yamasaki A., Kodama T., Iida T., Honda T., Oishi K.: Functional cloning of Vibrio parahaemolyticus type III secretion system 1 in Escherichia coli K-12 strain as a molecular syringe. Biochem. Biophys. Res. Commun. 427, 242–247 (2012)   3. Al-Mariri A., Tibor A., Lestrate P., Mertens P., De Bolle X., Letesson J.J.: Yersinia enterocolitica as a vehicle for a naked DNA

42

KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

vaccine encoding Brucella abortus bacterioferritin or P39 antigen. Infect. Immun. 70, 1915–1923 (2002)   4. Ansel K.M., Lee D.U., Rao A.: An epigenetic view of helper T cell differentiation. Nat. Immunol. 4, 616–623 (2003)   5. Araki K., Turner A.P., Shaffer V.O., Gangappa S., Keller S.A., Bachmann M.F., Larsen C.P., Ahmed R.: mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature, 460, 108–112 (2009)  6. Arbues A., Aguilo J.I., Gonzalo-Asensio J., Marinova D., Uranga  S., Puentes E., Fernandez C., Parra A., Cardona P.J., Vilaplana C. et al.: Construction, characterization and preclinical evaluation of MTBVAC, the first live-attenuated M. tuberculosis-based vaccine to enter clinical trials. Vaccine, 31, 4867–4873 (2013)   7. Ashtekar A.R., Katz J., Xu Q., Michalek S.M.: A mucosal subunit vaccine protects against lethal respiratory infection with Francisella tularensis LVS. PLoS One, 7, e50460 (2012)   8. Auranen K., Rinta-Kokko H., Halloran M.E.: Estimating strain-specific and overall efficacy of polyvalent vaccines against recurrent pathogens from a cross-sectional study. Biometrics, 69, 235–244 (2013)  9. Bachmann M.F., Zinkernagel R.M., Oxenius A.: Immune responses in the absence of costimulation: viruses know the trick. J. Immunol. 161, 5791–5794 (1998) 10. Bagarazzi M.L., Yan J., Morrow M.P., Shen X., Parker R.L., Lee  J.C., Giffear M., Pankhong P., Khan A.S., Broderick K.E. et al.: Immunotherapy against HPV16/18 generates potent TH1 and cytotoxic cellular immune responses. Sci. Transl. Med. 4, 155ra138 (2012) 11. Bahey-El-Din M., Casey P.G., Griffin B.T., Gahan C.G.: Expression of two Listeria monocytogenes antigens (P60 and LLO) in Lactococcus lactis and examination for use as live vaccine vectors. J. Med. Microbiol. 59, 904–912 (2010) 12. Beninati C., Oggioni M.R., Boccanera M., Spinosa M.R., Maggi  T., Conti S., Magliani W., De Bernardis F., Teti G., Cassone A. et al.: Therapy of mucosal candidiasis by expression of an anti-idiotype in human commensal bacteria. Nat. Biotechnol. 18, 1060–1064 (2000) 13. Berche P.: Louis Pasteur, from crystals of life to vaccination. Clin. Microbiol. Infect. 18 Sup. 5, 1–6 (2012) 14. Bielecki J., Youngman P., Connelly P., Portnoy D.A.: Bacillus subtilis expressing a haemolysin gene from Listeria monocytogenes can grow in mammalian cells. Nature, 345, 175–176 (1990) 15. Carrero J.A., Vivanco-Cid H., Unanue E.R.: Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. PLoS One, 7, e32310 (2012) 16. Casadevall A., Pirofski L.A.: A reappraisal of humoral immunity based on mechanisms of antibody-mediated protection against intracellular pathogens. Adv. Immunol. 91, 1–44 (2006) 17. Chen W., Jin W., Hardegen N., Lei K.J., Li L., Marinos N., McGrady G., Wahl S.M.: Conversion of peripheral CD4+CD25-naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J. Exp. Med. 198, 1875– 1886 (2003) 18. Chirmule N., Propert K., Magosin S., Qian Y., Qian R., Wilson J.: Immune responses to adenovirus and adeno-associated virus in humans. Gene Ther. 6, 1574–1583 (1999) 19. Darji A., Guzman C.A., Gerstel B., Wachholz P., Timmis K.N., Wehland J., Chakraborty T., Weiss S.: Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell, 91, 765–775 (1997) 20. Delany I., Rappuoli R., De Gregorio E.: Vaccines for the 21st century. EMBO Mol. Med. 6, 708–720 (2014) 21. Dietrich G., Griot-Wenk M., Metcalfe I.C., Lang A.B., Viret J.F.: Experience with registered mucosal vaccines. Vaccine, 21, 678–683 (2003)

22. Dong C.: TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat. Rev. Immunol. 8, 337–348 (2008) 23. Duhen T., Geiger R., Jarrossay D., Lanzavecchia A., Sallusto F.: Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin-homing memory T cells. Nat. Immunol. 10, 857–863 (2009) 24. Flingai S., Czerwonko M., Goodman J., Kudchodkar S.B., Muthumani K., Weiner D.B.: Synthetic DNA vaccines: improved vaccine potency by electroporation and co-delivered genetic adjuvants. Front. Immunol. 4, 354 (2013) 25. Foged C., Hansen J., Agger E.M.: License to kill: Formulation requirements for optimal priming of CD8(+) CTL responses with particulate vaccine delivery systems. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 482–491 (2012) 26. Garver K.A., LaPatra S.E., Kurath G.: Efficacy of an infectious hematopoietic necrosis (IHN) virus DNA vaccine in Chinook Oncorhynchus tshawytscha and sockeye O. nerka salmon. Dis. Aquat. Organ. 64, 13–22 (2005) 27. Geginat G., Schenk S., Skoberne M., Goebel W., Hof H.: A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J. Immunol. 166, 1877–1884 (2001) 28. Gerlach C., van Heijst J.W., Swart E., Sie D., Armstrong N., Kerkhoven R.M., Zehn D., Bevan M.J., Schepers K., Schumacher  .N.: One naive T cell, multiple fates in CD8+ T cell differentiation. J. Exp. Med. 207, 1235–1246 (2010) 29. Giannini S.L., Wettendorff M.A. i wsp.: Enhanced humoral and memory B cellular immunity using HPV16/18 L1 VLP vaccine formulated with the MPL/aluminium salt combination (AS04) compared to aluminium salt only. Vaccine, 24, 5937–5949 (2006) 30. Giuliani M.M., Adu-Bobie J., Comanducci M., Arico B., Savino  S., Santini L., Brunelli B., Bambini S., Biolchi A., Capecchi B. et al.: A universal vaccine for serogroup B meningococcus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 10834–10839 (2006) 31. Grangette C., Muller-Alouf H., Goudercourt D., Geoffroy M.C., Turneer M., Mercenier A.: Mucosal immune responses and protection against tetanus toxin after intranasal immunization with recombinant Lactobacillus plantarum. Infect. Immun. 69, 1547–1553 (2001) 32. Grode L., Ganoza C.A., Brohm C., Weiner J., Eisele B., Kaufmann S.H.: Safety and immunogenicity of the recombinant BCG vaccine VPM1002 in a phase 1 open-label randomized clinical trial. Vaccine, 31, 1340–1348 (2013) 33. Grosenbaugh D.A., Wolchok J.D. i wsp.: Safety and efficacy of a xenogeneic DNA vaccine encoding for human tyrosinase as adjunctive treatment for oral malignant melanoma in dogs following surgical excision of the primary tumor. Am. J. Vet. Res. 72, 1631–1638 (2011) 34. Guimaraes V.D., Gabriel J.E., Lefevre F., Cabanes D., Gruss A., Cossart P., Azevedo V., Langella P.: Internalin-expressing Lactococcus lactis is able to invade small intestine of guinea pigs and deliver DNA into mammalian epithelial cells. Microbes. Infect. 7, 836–844 (2005) 35. Haribhai D., Williams C.B. i wsp.: A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity, 35, 109–122 (2011) 36. Harrington L.E., Hatton R.D., Mangan P.R., Turner H., Murphy T.L., Murphy K.M., Weaver C.T.: Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T  helper type 1 and 2 lineages. Nat. Immunol. 6, 1123–1132 (2005) 37. Hinc K., Stasilojc M., Piatek I., Peszynska-Sularz G., Isticato R., Ricca E., Obuchowski M., Iwanicki A.: Mucosal adjuvant activity of IL-2 presenting spores of Bacillus subtilis in a murine

ZAŁOŻENIA I PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA ŻYWYCH WEKTORÓW BAKTERYJNYCH

model of Helicobacter pylori vaccination. PLoS One, 9, e95187 (2014) 38. Hoft D.F., Sadoff J. i wsp.: A recombinant adenovirus expressing immunodominant TB antigens can significantly enhance BCG-induced human immunity. Vaccine, 30, 2098–2108 (2012) 39. Huang J.M., La Ragione R.M., Cooley W.A., Todryk S., Cutting S.M.: Cytoplasmic delivery of antigens, by Bacillus subtilis enhances Th1 responses. Vaccine, 26, 6043–6052 (2008) 40. Kanampalliwar A.M., Soni R., Girdhar A., Tiwari A.: Reverse vaccinology: basics and applications. J. Vaccines Vaccin. 4, 194–198 (2013) 41. Kanno Y., Vahedi G., Hirahara K., Singleton K., O’Shea  J.J.: Transcriptional and epigenetic control of T helper cell specification: molecular mechanisms underlying commitment and plasticity. Annu. Rev. Immunol. 30, 707–731 (2012) 42. Kaur T., Sobti R.C., Kaur S.: Cocktail of gp63 and Hsp70 induces protection against Leishmania donovani in BALB/c mice. Parasite Immunol. 33, 95–103 (2011) 43. Khader S.A., Cooper A.M. i wsp.: IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat. Immunol. 8, 369–377 (2007) 44. Le D.T., Laheru D.A. i wsp.: A live-attenuated Listeria vaccine (ANZ-100) and a live-attenuated Listeria vaccine expressing mesothelin (CRS-207) for advanced cancers: phase I studies of safety and immune induction. Clin. Cancer. Res. 18, 858–868 (2012) 45. Lee J.S., Poo H., Han D.P., Hong S.P., Kim K., Cho M.W., Kim E., Sung M.H., Kim C.J.: Mucosal immunization with surface-displayed severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein on Lactobacillus casei induces neutralizing antibodies in mice. J. Virol. 80, 4079–4087 (2006) 46. Lin P.L., Andersen P. i wsp.: The multistage vaccine H56 boosts the effects of BCG to protect cynomolgus macaques against active tuberculosis and reactivation of latent Mycobacterium tuberculosis infection. J. Clin. Invest. 122, 303–314 (2012) 47. Lopez A.L., Gonzales M.L., Aldaba J.G., Nair G.B.: Killed oral cholera vaccines: history, development and implementation challenges. Ther. Adv. Vaccines, 2, 123–136 (2014) 48. Luksza M., Lassig M.: A predictive fitness model for influenza. Nature, 507, 57–61 (2014) 49. Lundegaard C., Lund O., Nielsen M.: Predictions versus high-throughput experiments in T-cell epitope discovery: competition or synergy? Expert Rev. Vaccines, 11, 43–54 (2012) 50. Maciag P.C., Radulovic S., Rothman J.: The first clinical use of a live-attenuated Listeria monocytogenes vaccine: a Phase I safety study of Lm-LLO-E7 in patients with advanced carcinoma of the cervix. Vaccine, 27, 3975–3983 (2009) 51. Marrack P., McKee A.S., Munks M.W.: Towards an understanding of the adjuvant action of aluminium. Nat. Rev. Immunol. 9, 287–293 (2009) 52. Mescher M.F., Curtsinger J.M., Agarwal P., Casey K.A., Gerner  M., Hammerbeck C.D., Popescu F., Xiao Z.: Signals required for programming effector and memory development by CD8+ T cells. Immunol. Rev. 211, 81–92 (2006) 53. Mohan T., Verma P., Rao D.N.: Novel adjuvants & delivery vehicles for vaccines development: a road ahead. Indian J. Med. Res. 138, 779–795 (2013) 54. Mosmann T.R., Cherwinski H., Bond M.W., Giedlin M.A., Coffman R.L.: Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136, 2348–2357 (1986) 55. Murphy C.A., Langrish C.L., Chen Y., Blumenschein W., McClanahan T., Kastelein R.A., Sedgwick J.D., Cua D.J.: Divergent pro- and antiinflammatory roles for IL-23 and IL-12 in joint autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 198, 1951–1957 (2003)

43

56. Neefjes J., Jongsma M.L., Paul P., Bakke O.: Towards a systems understanding of MHC class I and MHC class II antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 11, 823–836 (2011) 57. Negri A., Potocki W., Iwanicki A., Obuchowski M., Hinc K.: Expression and display of Clostridium difficile protein FliD on the surface of Bacillus subtilis spores. J. Med. Microbiol. 62, 1379–1385 (2013) 58. Ning D., Leng X., Li Q., Xu W.: Surface-displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome virus in crayfish by oral administration. J. Appl. Microbiol. 111, 1327–1336 (2011) 59. Ota M.O., McShane H. i wsp.: Immunogenicity of the tuberculosis vaccine MVA85A is reduced by coadministration with EPI vaccines in a randomized controlled trial in Gambian infants. Sci. Transl. Med. 3, 88ra56 (2011) 60. Pamer E.G.: Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat. Rev. Immunol. 4, 812–823 (2004) 61. Park H., Li Z., Yang X.O., Chang S.H., Nurieva R., Wang Y.H., Wang Y., Hood L., Zhu Z., Tian Q. et al: A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat. Immunol. 6, 1133–1141 (2005) 62. Pratama A., Vinuesa C.G.: Control of TFH cell numbers: why and how? Immunol. Cell. Biol. 92, 40–48 (2014) 63. Radford K.J., Higgins D.E., Pasquini S., Cheadle E.J., Carta L., Jackson A.M., Lemoine N.R., Vassaux G.: A recombinant E. coli vaccine to promote MHC class I-dependent antigen presentation: application to cancer immunotherapy. Gene Ther. 9, 1455– 1463 (2002) 64. Radford K.J., Jackson A.M., Wang J.H., Vassaux G., Lemoine  N.R.: Recombinant E. coli efficiently delivers antigen and maturation signals to human dendritic cells: presentation of MART1 to CD8+ T cells. Int. J. Cancer, 105, 811–819 (2003) 65. Roberts M., Chatfield S., Pickard D., Li J., Bacon A.: Comparison of abilities of Salmonella enterica serovar typhimurium aroA aroD and aroA htrA mutants to act as live vectors. Infect. Immun. 68, 6041–6043 (2000) 66. Robinson K., Chamberlain L.M., Schofield K.M., Wells J.M., Le Page R.W.: Oral vaccination of mice against tetanus with recombinant Lactococcus lactis. Nat. Biotechnol. 15, 653–657 (1997) 67. Rock K.L., Shen L.: Cross-presentation: underlying mechanisms and role in immune surveillance. Immunol. Rev. 207, 166–183 (2005) 68. Rote N.S.: Adaptive immunity (w) Pathophysiology: The biological basis for disease in adults and children, red. K. McCance, S. Huether, Elsevier Mosby, St. Louis, 2014, s. 224–261 69. Sallusto F., Lanzavecchia A., Araki K., Ahmed R.: From vaccines to memory and back. Immunity, 33, 451–463 (2010) 70. Seder R.A., Hill A.V.: Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity. Nature, 406, 793–798 (2000) 71. Sivakumar S.M., Safhi M.M., Kannadasan M., Sukumaran N.: Vaccine adjuvants – Current status and prospects on controlled release adjuvancity. Saudi Pharm. J. 19, 197–206 (2011) 72. Smaill F., Xing Z. i wsp.: A human type 5 adenovirus-based tuberculosis vaccine induces robust T cell responses in humans despite preexisting anti-adenovirus immunity. Sci. Transl. Med. 5, 205ra134 (2013) 73. Smith K.A.: Smallpox: can we still learn from the journey to eradication? Indian J. Med. Res. 137, 895–899 (2013) 74. Stachowiak R., Lyzniak M., Grabowska M., Roeske K., Jagielski  T., Bielecki J., Budziszewska B.K., Hoser G., Kawiak  J.: Cytotoxicity of purified listeriolysin O on mouse and human leukocytes and leukaemia cells. BMC Biotechnol. 14, 77 (2014) 75. Sun H.X., Xie Y., Ye Y.P.: ISCOMs and ISCOMATRIX. Vaccine, 27, 4388–4401 (2009)

44

KATARZYNA ROESKE, RADOSŁAW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

76. Sun J.C., Williams M.A., Bevan M.J.: CD4+ T cells are required for the maintenance, not programming, of memory CD8+ T cells after acute infection. Nat. Immunol. 5, 927–933 (2004) 77. Sun R., Liu Y.: Listeriolysin O as a strong immunogenic molecule for the development of new anti-tumor vaccines. Hum. Vaccin. Immunother. 9, 1058–1068 (2013) 78. Surh C.D., Sprent J.: Homeostasis of naive and memory T cells. Immunity, 29, 848–862 (2008) 79. Tameris M.D., McShane H. i wsp.: Safety and efficacy of MVA85A, a new tuberculosis vaccine, in infants previously vaccinated with BCG: a randomised, placebo-controlled phase 2b trial. Lancet, 381, 1021–1028 (2013) 80. Thomas C.E., Ehrhardt A., Kay M.A.: Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346–358 (2003) 81. Tifrea D.F., Pal S., Toussi D.N., Massari P., de la Maza L.M.: Vaccination with major outer membrane protein proteosomes elicits protection in mice against a Chlamydia respiratory challenge. Microbes Infect. 15, 920–927 (2013) 82. Titball R.W.: Vaccines against intracellular bacterial pathogens. Drug Discov. Today, 13, 596–600 (2008) 83. Torrado E., Fountain J.J., Robinson R.T., Martino C.A., Pearl J.E., Rangel-Moreno J., Tighe M., Dunn R., Cooper A.M.: Differential and site specific impact of B cells in the protective immune response to Mycobacterium tuberculosis in the mouse. PLoS One, 8, e61681 (2013) 84. VanCott J.L., Chatfield S.N., Roberts M., Hone D.M., Hohmann E.L., Pascual D.W., Yamamoto M., Kiyono H., McGhee  J.R.: Regulation of host immune responses by modification of Salmonella virulence genes. Nat. Med. 4, 1247–1252 (1998)

85. Veldhoen M., Uyttenhove C., van Snick J., Helmby H., Westendorf A., Buer J., Martin B., Wilhelm C., Stockinger B.: Transforming growth factor-beta ‘reprograms’ the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9-producing subset. Nat. Immunol. 9, 1341–1346 (2008) 86. Weiner J., Kaufmann S.H.: Recent advances towards tuberculosis control: vaccines and biomarkers. J. Intern. Med. 275, 467–480 (2014) 87. Whitmire J.K., Eam B., Whitton J.L.: Tentative T cells: memory cells are quick to respond, but slow to divide. PLoS Pathog, 4, e1000041 (2008) 88. Wiesel M., Oxenius A.: From crucial to negligible: functional CD8(+) T-cell responses and their dependence on CD4(+) T-cell help. Eur. J. Immunol. 42, 1080–1088 (2012) 89. Wilson J.W., Nickerson C.A.: Cloning of a functional Salmonella SPI-1 type III secretion system and development of a method to create mutations and epitope fusions in the cloned genes. J. Biotechnol. 122, 147–160 (2006) 90. Xu F., Hong M., Ulmer J.B.: Immunogenicity of an HIV-1 gag DNA vaccine carried by attenuated Shigella. Vaccine, 21, 644– 648 (2003) 91. Zhang Z.H., Jiang P.H., Li N.J., Shi M., Huang W.: Oral vaccination of mice against rodent malaria with recombinant Lactococcus lactis expressing MSP-1(19). World J. Gastroenterol. 11, 6975–6980 (2005) 92. Zheng J.P., Zhang Z.S., Li S.Q., Liu X.X., Yuan S.L., Wang P., Zhan D.W., Wang L.C., Huang C.F.: Construction of a novel Shigella live-vector strain co-expressing CS3 and LTB/STm of enterotoxigenic E. coli. World J. Gastroenterol. 11, 3411–3418 (2005) 93. Zhu J., Yamane H., Paul W.E.: Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annu. Rev. Immunol. 28, 445–489 (2010)

POST. MIKROBIOL., 2016, 55, 1, 45–56 http://www.pm.microbiology.pl

ZNACZENIE UROPATOGENNYCH SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI (UPEC) W ETIOPATOGENEZIE ZAKAŻEŃ UKŁADU MOCZOWEGO

Sylwia Joanna Chmielewska1*, Krzysztof Fiedoruk1, Tamara Daniluk1, Małgorzata Ściepuk1, Dorota Kaczmarzyk1, Katarzyna Leszczyńska1  Zakład Mikrobiologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

1

Wpłynęło w kwietniu 2015 r. Zaakceptowano w lipcu 2015 r. 1. Wstęp. 2. Klasyfikacja zakażeń układu moczowego (ZUM). 3. Przyczyny, czynniki ryzyka oraz objawy ZUM. 4. Czynniki etiologiczna ZUM. 4.1. Zakażenia układu moczowego u osób dorosłych. 4.2. ZUM u dzieci. 4.3. ZUM u osób starszych. 5. Uropatogenne szczepy Escherichia coli. 5.1. Adhezyny. 5.2. Odpowiedź immunologiczna gospodarza na zakażenie UPEC. 6. Podsumowanie Significance of uropathogenic strains of Escherichia coli (UPEC) in the pathogenesis of urinary tract infections Abstract: Urinary tract infections (UTIs) are one of the most widespread infections, particularly among women (40–50%) as well as newborns, infants and elderly persons. In addition, recurrent episodes of UTIs are common and frequently become chronic. Escherichia coli is the most common cause of UTIs, bothcommunity- and hospital-acquired, followed by other Enterobacteriaceae (Proteus spp., Klebsiella spp.), Pseudomonas spp. and Gram-positive cocci. The majority of UTIs are caused by uropathogenic E. coli (UPEC) characterized by the presence of various adhesive fimbriae (pili) e.g., type 1 or P, S and Afa/Dr fimbriae, the crucial virulence factors for their pathogenic capabilities. For example, type 1 fimbriae are common among cystitis-associated UPEC, P fimbriae are characteristic adhesins in E. coli pyelonephritis, and Dr fimbriae UPEC strains are frequently isolated (40%) from pregnancy-associated pyelonephritis cases. In consequence, Dr+ E. coli may contribute to serious pregnancy complications, including premature births or damage of the fetus. Therefore, the more extensive knowledge about mechanisms of pathogenesis of UPEC strains may facilitate development of novel diagnostic methods and might prove essential for better risk assessment for patients with UTIs. 1. Introduction. 2. Classification of urinary tract infections (UTIs). 3. The causes, risk factors and symptoms of UTIs. 4. Etiological factors of UTIs. 4.1. Urinary tract infections in adults. 4.2. UTIs in children population. 4.3. UTIs in the elderly. 5. Uropathogenic strains of Escherichia coli (UPEC). 5.1. Fimbriae. 5.2. Host immune response against UPEC colonization of the urinary tract. 6. Summary Słowa kluczowe: Fimbrie, UPEC, zakażenia układu moczowego Key words: Fimbriae, UPEC, urinary tract infections

1. Wstęp Zakażenia układu moczowego (ZUM, Urinary Track Infections) stanowią poważny problem kliniczny, w Polsce klasyfikują się na drugim miejscu zaraz po infekcjach układu oddechowego. Należy jednak podkreślić, że ze względu na możliwość częstych nawrotów i powikłań ZUM są poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie. U pacjentów z ostrym zapaleniem pęcherza w 15–50% przypadków rozwija się odmiedniczkowe zapalenie nerek, z kolei u 12% tych pacjentów pojawia się później bakteriemia. Szacuje się, że ZUM stanowią ok. 10–20% wszystkich zakażeń pozaszpitalnych oraz ok. 40–50% zakażeń szpitalnych, a także są częstą przyczyną wypisywania leków przeciwbakteryjnych [6, 40, 58]. W  USA w  2012 r. zarejestrowano ponad 7  milionów wizyt lekarskich spowodowanych przez infekcje układu moczowego, z czego 100 tysięcy pacjentów wymagało hospitalizacji, najczęściej z  powodu odmiedniczkowego zapalenia nerek. Całkowite wydatki związane z  leczeniem pacjentów ambulatoryjnych i szpitalnych ocenia się na

ok. 1,6 miliarda dolarów rocznie [21]. W skali globalnej odnotowuje się szacunkowo 150 milionów przypadków ZUM rocznie [50]. Dlatego też tak ważna jest właściwa terapia zakażeń układu moczowego, która może przyczynić się do zmniejszenia wskaźnika zachorowań oraz obniżenia kosztów związanych z ich leczeniem [8, 45]. 2.  Klasyfikacja zakażeń układu moczowego (ZUM) W piśmiennictwie stosowane są różne klasyfikacje ZUM, jednak przeważa kryterium praktyczne, w którym zwraca się uwagę przede wszystkim na lokalizację anatomiczną zakażenia i przebieg zakażenia (powikłane, niepowikłane, nawracające, ponowne, objawowe, bezobjawowe) [11, 21, 57]. Biorąc pod uwagę anatomiczną lokalizację ZUM wyróżnia się infekcje obejmujące górne (nerki, moczowody) i  dolne (pęcherz moczowy, cewka moczowa) odcinki układu moczowego. Granicę między nimi wyznaczają ujścia moczowodów do pęcherza moczowego [11, 21, 57].

*  Autor korespondencyjny:  Zakład Mikrobiologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, ul. Mickiewicza 2C, 15-222 Białystok; tel./fax (85) 748-55-62; e-mail: [email protected]

46

S.J. CHMIELEWSKA, K. FIEDORUK, T. DANILUK, M. ŚCIEPUK, D. KACZMARZYK, K. LESZCZYŃSKA

Niepowikłane ZUM występują u pacjentów z prawidłowym pod względem anatomicznym i czynnościowym układem moczowym oraz sprawnymi mechanizmami obronnymi. Natomiast powikłane ZUM wywołane często przez nietypowe drobnoustroje, dotyczą osób z anomaliami strukturalnymi lub funkcjonalnymi w obrębie układu moczowego oraz pacjentów z upośledzonym układem immunologicznym [11, 21, 57]. Nawrót ZUM występuje po leczeniu przeciwdrobnoustrojowym, a czynnikiem etiologicznym jest drobnoustrój przetrwały w drogach moczowych będący przyczyną poprzedniego ZUM. W praktyce za nawrót ZUM przyjmuje się, objawy pojawiające się do 2 tygodni od zakończenia terapii. Reinfekcja, czyli ponowne ZUM to infekcja wywołana nowym czynnikiem etiologicznym pochodzącym spoza układu moczowego [17, 57]. Bakteriuria bezobjawowa powinna być traktowana, jako szczególna jednostka, ponieważ może mieć swoje źródło zarówno w obrębie dolnych jak i górnych dróg moczowych. W bakteriurii bezobjawowej stwierdza się obecność bakterii w moczu (bakteriuria znamienna), przy czym brak jest leukocyturii oraz klinicznych objawów zakażenia. Bakteriuria bezobjawowa wymaga leczenia tylko w określonych przypadkach np. dotyczy około 4–10% kobiet w ciąży [17, 21, 57]. Występowanie bakteriurii bezobjawowej szacowane jest na około 3,5% populacji i wzrasta wraz z wiekiem; częściej dotyczy kobiet, a także mężczyzn powyżej 70 r.ż. z zapaleniem gruczołu krokowego [17, 30]. Czynnikiem sprzyjającym bakteriurii bezobjawowej jest cukrzyca. Przeprowadzone badania wskazują, że u kobiet z cukrzycą typu 2, u których stwierdzono bezobjawową bakteriurię istnieje większe ryzyko rozwoju objawowego zakażenia układu moczowego. Ponadto bakteriuria bezobjawowa u osób chorych na cukrzycę wiąże się z czterokrotnie wyższym ryzykiem hospitalizacji [30]. 3.  Przyczyny, czynniki ryzyka oraz objawy ZUM W warunkach zdrowia drogi moczowe powyżej zwieracza pęcherza są jałowe (nie zawierają bakterii), w  niektórych sytuacjach dochodzi jednak do wniknięcia drobnoustrojów i ich namnożenia. Bakterie mogą przedostać się do układu moczowego na kilka sposobów np. drogą wstępującą przez cewkę moczową (zakażenie urogenne), drogą krwionośną (zakażenie hematogenne), drogą naczyń chłonnych (zakażenie limfogenne) oraz przez przetoki pomiędzy drogami moczowymi a pochwą lub macicą, lub przez przetoki moczowodowo-pęcherzowo-jelitowe, istnieje również możliwość przedostania się bakterii poprzez naruszenie ciągłości tkanek [44, 57, 58]. Do czynników utrudniających drobnoustrojom kolonizację układu moczowego należą:

1)  wypłukiwanie drobnoustrojów w czasie opróżniania pęcherza moczowego (mikcji), co zapobiega namnażaniu się bakterii, 2) kwaśne pH moczu oraz wydzieliny z pochwy (hamowanie wzrostu bakterii), 3)  przeciwbakteryjne działanie wydzieliny gruczołu krokowego, 4) obecność białka Tamma-Horsfalla, które chroni przed adhezją bakterii, 5) naturalna mikroflora okolicy cewki moczowej zapobiegająca kolonizacji patogennych bakterii, 6) mukopolisacharydy błony śluzowej pęcherza moczowego uniemożliwiające przyleganie bakterii, 7) obecność wydzielniczej immunoglobuliny IgA, 8) fagocytarne działanie leukocytów, 9) złuszczanie się komórek nabłonka dróg moczowych [57]. Dodatkowo bardzo ważną funkcję ochronną pełni uroepithelium, spełniające rolę bariery przeciwko patogenom, toksynom, jonom zapobiegając ich przejściu do głębszych warstw tkanek [3]. Główne czynniki ryzyka zakażeń układu moczowego przedstawiono na Rys. 1 [44, 51]. ZUM stwierdza się najczęściej w okresie niemowlęctwa oraz u osób po 65 roku życia, u których infekcje dróg moczowych odnotowuje się u po­nad 20% kobiet i ponad 10% mężczyzn. Kobiety (z wyjątkiem pierwszych kilku miesięcy) są zdecydowanie bardziej podatne na ZUM. Określa się, że schorzenia układu moczowego występują nawet 14 razy częściej u  kobiet niż u mężczyzn. Szacuje się około 40–50% dorosłych kobiet doświadczyła przynajmniej raz w życiu zakażenia dróg moczowych, z czego u większości obserwuje się wielokrotne zakażenia. Ponadto częstotliwość ta zwiększa się wraz z wiekiem; u kobiet w przedziale 65–70 lat bakteriomocz stwierdzono w 10–15% przypadków, zaś u pacjentek po 80 r.ż. u 15–20%. Zmiany hormonalne po menopauzie, powodują, że liczba zakażeń układu moczowego wzrasta nawet, o 40%, co związane jest z niedoborem estrogenów zapewniających prawidłową florę pochwy oraz z nadmiernym namnażaniem się Escherichia coli. Do wad anatomicznych lub czynnościowych dróg moczowych utrudniających odpływ moczu i predysponujących do ZUM zalicza się: przerost gruczołu krokowego, zaburzenia w odpływie pęcherzykowo-moczowodowym, neurogenne zaburzenia czynności pęcherza, niedrożność spowodowana kamicą dróg moczowych. Wśród innych przyczyn i czynników ryzyka infekcji dróg moczowych należy wymienić: cukrzycę (zwłaszcza niekontrolowaną i źle leczoną), nabyte niedobory odporności (zakażenie wirusem HIV), niektóre zabiegi diagnostyczne lub lecznicze wykonywane w obrębie dróg moczowych (cewnikowanie, chirurgia urologiczna, przezcewkowa resekcja gruczołu krokowego), stany zapalne w okolicy krocza, pochwy, stulejkę z zapaleniem żołędzi, złe nawyki higieniczne, zaparcia oraz zbyt rzadkie oddawanie moczu (przetrzymywanie moczu w pęcherzu) [11, 17, 44, 57]. Do głównych objawów zakażenia układu moczowego należą – trudności w oddawaniu moczu, dysu-

ZNACZENIE UROPATOGENNYCH SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI (UPEC) W ETIOPATOGENEZIE

47

Rys. 1. Czynniki sprzyjające zakażeniom układu moczowego

ria (bolesność przy oddawaniu moczu), częstomocz, nykturia (oddawanie moczu w nocy, więcej niż jeden raz), tkliwość pęcherza, gorączka, bóle w okolicy lędźwiowej, bóle brzucha, czasami bóle głowy i nudności [21]. W około 30% przypadków ostrego odmiedniczkowego zapalenia nerek może rozwinąć się bakteriemia prowadząca do posocznicy, a nawet do śmierci pacjenta [8, 21, 45]. 4.  Czynniki etiologiczne ZUM Czynniki etiologiczne ZUM zostały dobrze poznane, jednak w ciągu ostatnich 10 lat obserwuje się znaczne zmiany w profilu lekooporności drobnoustrojów, co stanowi poważny problem współczesnej medycyny. Leczenie empiryczne wymaga stałej oceny wrażliwości bakterii na antybiotyki, a wybór skutecznego przeciwbakteryjnego leku pozwalającego na właściwe wyleczenie pacjenta oraz niepowodującego selekcji szczepów opornych jest wyzwaniem dla urologii [21, 51]. Głównymi czynnikami etiologicznymi zakażeń układu moczowego są bak­terie. Zdecydowanie w mniejszym stopniu za infekcje odpowiedzialne są wirusy,

grzyby, pierwotniaki oraz pasożyty [21, 51]. W przypadku bakterii w przeważającej większości izoluje się bakterie Gram-ujemne kolonizujące przewód pokarmowy, a także przedsionek pochwy u kobiet czy okolicę podnapletkową u mężczyzn [32]. W ostatnim czasie bakteryjne czynniki etiologiczne ZUM ulegają licznym zmianom. Wprawdzie E. coli jest nadal najczęstszą przyczyną infekcji, to udział innych pałeczek jelitowych i  niefermentujących glukozy takich jak Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii znacząco wzrósł. Spośród pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae narastającym problemem jest Klebsiella pneumoniae szczególnie szczepy wytwarzające karbapenemazy KPC, które powodują ZUM zarówno u pacjentów szpitalnych jak i ambulatoryjnych. Opcje terapeutyczne tych zakażeń są bardzo ograniczone [20]. W chwili obecnej coraz częściej diagnozuje się ZUM wywołane przez bakterie atypowe Chlamydia tracho­ matis, Mycoplasma spp. i Ureaplasma urealyticum. Grzyby, a zwłaszcza gatunek Candida albicans odpowiedzialne są za zakażenia obserwowane u wcześniaków, noworodków, zaś u osób dorosłych powodują infekcje u chorych z zaburzeniami odporności lub kobiet cierpiących na grzybicze zapalenie pochwy [32].

48

S.J. CHMIELEWSKA, K. FIEDORUK, T. DANILUK, M. ŚCIEPUK, D. KACZMARZYK, K. LESZCZYŃSKA

Tabela I Drobnoustroje odpowiedzialne za zakażenia układu moczowego Zapalenie cewki moczowej (łac. urethritis)

ZAKAŻENIA WSTĘPUJĄCE

Bakterie Gram-ujemne Escherichia coli, Proteus spp., Klebsiella spp., Neisseria gonorrhoeae

Bakterie Gram-dodatnie Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus

Bakterie atypowe Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium

Zapalenie pęcherza moczowego (łac. cystitis) Bakterie Gram-ujemne Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Inne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae

Bakterie Gram-dodatnie Enterococcus spp., Staphylococcus saprophyticus (młode kobiety), Corynebacterium urealyticum

ZAKAŻENIA ZSTĘPUJĄCE

Ostre odmiedniczkowe zapalenie nerek (łac. pyelonephritis acuta) Bakterie Gram-ujemne Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa

Najważniejsze bakteryjne czynniki etiologiczne infekcji dróg moczowych z uwzględnieniem ich anatomicznej lokalizacji przedstawiono w Tabeli I [51, 57]. 4.1. Zakażenia układu moczowego u osób dorosłych Najczęstszym czynnikiem etiologicznym zakażeń układu moczowego zarówno górnych jak i dolnych odcinków jest E. coli (75–90%) odpowiedzialna za około 80–90% niepowikłanych infekcji oraz około 40–60% zakażeń szpitalnych [28, 35, 45, 58]. Bakterie z rodzaju Proteus spp. odpowiedzialne są za 7% przypadków ZUM, ale odsetek ten może wzrosnąć nawet do 20% u pacjentów ze współistniejącą patologią układu moczowego [4, 25, 45]. W mniejszym odsetku izoluje się pozostałe pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae takie jak: Klebsiella spp. czy Enterobacter spp. [4, 11, 36, 45, 51]. Bakterie z rodzaju Proteus izoluje się najczęściej z moczu od pacjentów ze współistniejącymi zaburzeniami dróg moczowych. Wśród mężczyzn ważną rolę odgrywa P. vulgaris, gdyż stanowi on florę fizjologiczną okolicy napletka, a w sprzyjających okolicznościach może stać się przyczyną wstępującego zakażenia (30% zakażeń u chłopców po 6 m.ż.). Pałeczka odmieńca jest najczęstszym czynni­kiem etiologicznym skomplikowanych ZUM oraz drugą, co do częstości przyczyną bakteriurii związanej z długo­terminowym cewnikowaniem. Z kolei P. mirabilis jest powszechnym czynnikiem zakażeń szpitalnych, aczkolwiek procentowy udział tej bakterii różni się w zależności od specyfiki oddziału szpitalnego [32, 45]. Wydalany przez nerki mocznik stymuluje produkcję ureazy przez bakterie z  rodzaju Proteus, zwiększając stężenie tego enzymu od 5 do nawet 25 razy [52]. Tworzenie złogów jest w szczególności udziałem

Bakterie Gram-dodatnie Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus (młode kobiety), Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae

P. mirabilis [57]. W układzie moczowym ureaza katalizuje reakcję hydrolitycznego rozkładu mocznika na amoniak i dwutlenek węgla, uwalniany wówczas amoniak uszkadza nabłonek i alkalizuje mocz, co skutkuje precypitacją jonów wapnia i magnezu z utworzeniem kryształów struwitu i apatytu [41, 49, 57]. Powstające kryształy łączą się z bakteriami i rozpoczyna się proces krystalizacji. W ten sposób mogą formować się pierwsze jądra krystalizacji. Bakterie z rodzaju Proteus zdolne są do przeżycia wewnątrz tworzonych kamieni, gdyż są one trudno dostępne dla stosowanych antybiotyków, co dodatkowo ogranicza skuteczne leczenie przeciwbakteryjne. Co więcej bakterie umożliwiają ciągłość reakcji chemicznych pozwalających na utrzymanie zasadowego pH moczu, które zapewnia nierozpuszczalność kryształów struwitu i apatytu [52, 57]. Kamienie moczowe zwiększają ryzyko infekcji dróg moczowych, zwężając średnicę przewodów moczowych, co skutkuje zastojem moczu. Utworzone kamienie mogą zwiększać adhezję bakterii do błony śluzowej układu moczowego, w wyniku jej uszkodzenia bądź podrażnienia [44]. Infekcje wywołane przez bakterie Gram-dodatnie występują zdecydowanie rzadziej i stanowią