POL SK IE TOWA R Z YST WO MIK ROBIOLOGÓW Kwartalnik Tom 50 Zeszyt

3•2011

LIPIEC – WRZESIE¡

CODEN: PMKMAV 50 (3) 2011

Advances in Microbiology

POL SK IE TOWA R Z YST WO MIK ROBIOLOGÓW Kwartalnik Tom 50 Zeszyt

4•2011

PAèDZIERNIK – GRUDZIE¡

CODEN: PMKMAV 50 (4) 2011

Punktacja za publikację naukową wg MNiSW: 13.00 (2010) Index Copernicus ICV = 9,00 (2010) Impact Factor ISI = 0,108 (2010)

Advances in Microbiology

http://www.pm.microbiology.pl

RADA REDAKCYJNA JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), DANUTA DZIERŻANOWSKA (Centrum Zdrowia Dziecka), EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), MAREK JAKÓBISIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), ANDRZEJ PASZEWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski), ANTONI RÓŻALSKI (Uniwersytet Łódzki), ALEKSANDRA SKŁODOWSKA (Uniwersytet Warszawski), BOHDAN STAROŚCIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), BOGUSŁAW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdański), ELŻBIETA TRAFNY (Wojskowy Instytut Higieny i Epidemiologii), STANISŁAWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Państwowy Zakład Higieny), GRZEGORZ WĘGRZYN (Uniwersytet Gdański), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski) REDAKCJA JERZY HREBENDA (redaktor naczelny), JACEK BIELECKI (zastępca), BOHDAN STAROŚCIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich) Adresy redakcji Redaktorzy: Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (22) 554 13 05/304, fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected]; [email protected] Sekretarz Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa, tel. (22) 628 08 22, (22) 621 13 51 e-mail: [email protected] PublikacjE Metodyczne i StanDARDY Redaktor odpowiedzialny: Stefania Giedrys-Kalemba (Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie) Adres Redaktora działu Publikacje Metodyczne i Standardy Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiej Akademii Medycznej, Al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin, tel./fax: (91) 46 616 51, 52, lub fax: (91) 46 616 59, e-mail: [email protected] lub [email protected] Stali recenzenci: Jerzy Długoński (Uniwersytet Łódzki), Waleria Hryniewicz (Narodowy Instytut Leków), Józef Kur (Politechnika Gdańska), Eugeniusz Małafiej (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki), Anna Przondo-Mordarska (Akademia Medyczna we Wrocławiu)

CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOWĄ POMOCĄ MINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WYŻSZEGO ISBN 978 - 83 - 923731 - 3 - 1 Informacja o zdjęciu na okładce: Komórki Bacillus subtilis (BR-1-S) wnikające do komórki linii Int 407 Fotografia: J. Wiśniewski – Zakład Mikrobiologii Stosowanej Instytut Mikrobiologii Uniwersytetu Warszawskiego

P O L S K I E T O WA R Z Y S T W O M I K R O B I O L O G Ó W Nakład 1150, Objętość 11 arkuszy wyd., Papier offser 80 g Skład i druk: Zakład Wyd. Letter Quality, tel. 22 631 45 18, 607 217 879, e-mail: [email protected]; projekt okładki: Jerzy Grzegorkiewicz

POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 3, 175–190 http://www.pm.microbiology.pl

Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga Joanna Monika Łoś1*, Grzegorz Węgrzyn1 1

Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk Wpłynęło w czerwcu 2011

1. Wstęp. 2. Bakteriofagi niosące geny toksyn Shiga – ogólna charakterystyka. 3. Bakteriofagi lambdoidalne. 4. Bakteriofag λ. 4.1. Adsorpcja i injekcja DNA. 4.2. Faza decyzji „liza czy lizogenia”. 4.3. Rozwój lizogeniczny. 4.4. Indukcja. 4.5. Rozwój lityczny. 5. Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC). 6. Toksyny Shiga. 7. Indukcja profagów niosących geny toksyn Shiga. 8. Rola represora CI i miejsc operatorowych fagów kodujących toksyny Shiga. 9. Podsumowanie Enterohemorrhagic strains of Escherichia coli (EHEC) and Shiga toxin-encoding bacteriophages Abstract:  Escherichia coli is a bacterium naturally present in the mammalian intestine, occupying this habitat as a commensale. Most E. coli strains are lysogenic and the prophage status usually does not changes their relations with the host. However, some strains of this bacterium, including enterohemorrhagic E. coli (EHEC), carry virulence genes, and thus are capable of causing disease in humans. Infection of humans by these strains causes hemorrhagic colitis and may result in hemolytic-uremic syndrome, a severe complication, which can be fatal. The major virulence factors of EHEC are Shiga toxins, encoded by genes located on genomes of lambdoid prophages. Effective production and release of these toxins depend mostly on the induction of Shiga toxin-converting prophages. Many antibiotics used to treat bacterial infections stimulate induction of Shiga toxin-converting prophages, enhancing severity of the disease symptoms. Hence, treatment with antibiotics is restricted if infection with EHEC is confirmed or even suspected, which causes serious therapeutic problems. In this light, understanding the mechanisms of prophage induction and regulation of development of lambdoid phages in human intestine is important to facilitate the discovery of procedures preventing or alleviating Shiga toxin-caused diseases. In this article, we present an overview of EHEC and Shiga toxin-converting phages, providing also the background for molecular biology of lambdoid bacteriophages (which is important to understand mechanisms of control of development of phages carrying Shiga toxin genes) and discussing recently published reports in this field. 1. Introduction. 2. Bacteriophages carrying Shiga toxin genes – general characteristics. 3. Lambdoid bacteriophages. 4. Bacteriophage λ. 4.1.  DNA adsorption and injection. 4.2. Decision phase: “lysis or lysogeny”. 4.3. Lysogenic development. 4.4. Prophage induction. 4.5. Lytic development. 5. Enterohemorrhagic strains of Escherichia coli (EHEC). 6. Shiga toxins. 7. Induction of prophages carrying ) Shiga toxin genes. 8. Role of the CI repressor and operator sites of Shiga toxin-encoding bacteriophages. 9. Concluding remarks Słowa kluczowe: bakteriofagi lambdoidalne, enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli, indukcja profaga Key words: Enterohemorrhagic strains of Escherichia coli, lambdoid bacteriophages, prophage induction.

1. Wstęp Mimo iż większość szczepów Escherichia coli to bakterie występujące w jelicie człowieka jako komensale, występują wśród nich również szczepy patogenne dla ludzi. Przykładem są enterokrwotoczne E. coli (EHEC), powodujące krwawe biegunki, ze stosunkowo często występującymi poważnymi powikłaniami, jak np. zespół hemolityczno-mocznicowy [98]. Zakażenia szczepami EHEC mają najczęściej charakter lokalnych epidemii, czego przykładem były niedawne liczne infekcje, które miały miejsce w Niemczech i które doprowadziły do kilkudziesięciu zgonów zakażonych osób [71]. Szczepy EHEC produkują różnorodne czynniki infekcyjne, niemniej jednak najgroźniejszymi z nich są toksyny Shiga. To właśnie działanie tych toksyn powoduje najpoważniejsze powikłania związane z infekcjami

tymi bakteriami [62]. W przeciwieństwie do wielu innych czynników infekcyjnych, toksyny Shiga kodowane są nie w chromosomie bakterii, ale w genomie bakteriofagów występujących w szczepach EHEC w postaci profagów [41]. W związku z powyższym efektywna ekspresja tych genów (zwanych stx) następuje dopiero po indukcji profaga i rozpoczęcia przez bakteriofaga rozwoju litycznego. Związana z tym masowa produkcja to­ksyn Shiga oraz ich uwolnienie po spowodowanej przez faga lizie komórki bakteryjnej skutkuje ich specyficznym działaniem na komórki ludzkie, wywołującym charakterystyczne objawy chorobowe. W tym artykule podsumujemy aktualną wiedzę o szczepach EHEC i bakteriofagach kodujących toksyny Shiga oraz przedyskutujemy problemy związane z potencjalnym zapobieganiem zakażeniom i ich efektom oraz leczeniem, w przypadku gdy do zakażenia doszło.

*  Autor korespondencyjny: Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk; tel. (58) 523 6387; fax: (58) 523 5501; e-mail: [email protected]

176

Joanna Monika Łoś, Grzegorz Węgrzyn

2. Bakteriofagi niosące geny toksyn Shiga – ogólna charakterystyka Bakteriofagi przenoszące geny toksyn Shiga zostały zidentyfikowane w 1983 roku. Genomy tych bakteriofagów stanowi dwuniciowy, liniowy DNA o długości od około 40 do 70 tysięcy par zasad (kpz) [73]. Na podstawie ich budowy morfologicznej można wyróżnić kilka typów. Jedne są zbudowane z ikozaedralnej główki i krótkiego cienkiego ogonka np. 933W i φ24B [3]. Inne składają się z wydłużonej ikozaedralnej główki oraz długiego, cienkiego ogonka np. H-19B [81] i 2851 [83]. Mogą też posiadać ikozaedralną główkę i gruby, długi ogonek np. φP27 [51]. Fagi z krótkim ogonkiem wykorzystują do adsorpcji białko YaeT. Jest to białko zewnętrznej błony, szeroko rozpowszechnione i konserwowane ewolucyjnie u bakterii Gram-ujemnych. Fagi z długimi ogonkami adsorbują się zwykle na ligandach powierzchniowych, takich jak OmpC [81]. Bakteriofagi przenoszące geny toksyn Shiga należą do fagów lambdoidalnych, których genom zbudowany jest w podobny sposób jak u faga λ (Rys. 1). Składa się on z bloków genów, kodujących białka odpowiedzialne za konkretne funkcje. Skutkiem tego jest to, że genomy fagów lambdoidalnych wykazują mozaikowatą budowę

gdyż często dochodzi pomiędzy nimi do rekombinacji i wymiany genów [35]. Mimo podobieństw w morfo­ logii i strukturze genomu mają zróżnicowaną sekwencję nukleotydową [14]. Poza kodowaniem toksyny Shiga, część z  tych fagów koduje również kinazę serynowo-treoninową oraz zawiera geny dla rzadkich tRNA izoleucyny i argininy, które to aminokway znajdują się w toksynie oraz we wspomnianej wcześniej kinazie [63]. Bakteriofagi te są zdolne do infekcji i lizogenizacji laboratoryjnych [1] oraz pochodzących z ludzkiego jelita szczepów E. coli zarówno niepatogennych jak i patogennych, również tych posiadających już profaga kodującego toksynę Shiga. Powstałe w ten sposób lizogeny są zdolne do produkcji toksyn oraz infekcyjnych cząstek fagowych. Powoduje to rozprzestrzenianie się genów toksyn wśród innych szczepów E. coli oraz innych szczepów z rodziny Enterobacteriaceae [72]. Fagi te w podobny sposób powodują transdukcję genów to­ksy­ny Shiga również u zwierząt [15]. Wydaje się że jedynym możliwym ograniczeniem w rozprzestrzenianiu się tych fagów w jelitach ssaków jest brak odpowiedniego gospodarza, wrażliwego na danego faga [75]. Kolejnym ważnym czynnikiem umożliwiającym rozprzestrzenianie się genów tych toksyn, jak i innych genów są defektywne profagi. Okazuje się, że część z nich, po zakażeniu komórki innym fagiem indukuje się i jest uwalniana z komórki bakteryjnej jako DNA mogące transformować inne bakterie. Stanowią więc one ważne elementy genetyczne o dużej zdolności do rozprzestrzeniania się wśród komórek bakteryjnych [5]. Ponieważ – jak wspomniano powyżej – bakteriofagi niosące geny toksyn Shiga należą do rodziny fagów lambdoidalnych, poniżej omówione zostaną pokrótce mechanizmy kontroli rozwoju faga λ, najlepiej poznanego członka tej rodziny. Poznanie bowiem tych mechanizmów jest kluczowe dla zrozumienia specyfiki regulacji zarówno procesów zachodzących podczas rozwoju fagów niosących geny toksyn Shiga jak i produkcji tych toksyn. 3. Bakteriofagi lambdoidalne

Rys. 1. Uproszczona mapa genomu bakteriofaga λ i plazmidów od niego pochodzących. Zaznaczone są rejony genomu kodujące białka pełniące funkcje w poszczególnych procesach zachodzących podczas rozwoju bakteriofaga (tworzenie główki i ogonka, rekombinacja, replikacja, regulacja ekspresji genów, liza komórki gospodarza). Strzałkami zaznaczone są główne transkrypty, a poprzeczne linie oznaczają położenie głównych terminatorów transkrypcji

Cechą charakterystyczną wszystkich fagów lambdoidalnych jest podobna organizacja genomu. Zbudowany jest on z bloków genów, z których każdy odpowiada za poszczególne funkcje np.: blok genów regulacyjnych, replikacyjnych czy strukturalnych. Powoduje to, że geny odpowiedzialne za poszczególne procesy mają podobną lokalizację w genomie np.: gen represora cI jest położony zawsze pomiędzy promotorami pL i pR. Kolejną cechą tych fagów jest to, że geny znajdują się pod kontrolą podobnie działających promotorów oraz są regulowane przez podobne procesy jak np.: antyterminacja transkrypcji. Również powstające białka wykazują podobieństwo w funkcji, np. żaden z fagów lambdoidalnych nie

Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga

koduje własnej polimerazy, ale każdy ma swoje białka antyterminatorowe [12]. Dzięki takiej budowie genomu łatwo dochodzi do wymiany poszczególnych modułów genów pomiędzy fagami lambdoidalnymi. Proces ten zachodzi poprzez horyzontalny transfer genów, który może nastąpić albo w procesie homologicznej rekombinacji, dzięki krótkim sekwencjom homologicznym znajdującym się na granicy genów, albo rekombinacji niehomologicznej, w przypadkowym miejscu w genomie. Niehomologiczna rekombinacja może prowadzić do uszkodzenia regionów kodujących, co z kolei może powodować eliminację takiego faga z naturalnego środowiska. W związku z tym pozostaną tylko te, które w wyniku takiej rekombinacji nie mają uszkodzonych żadnych istotnych genów [10]. Skutkiem tych procesów jest powstanie bakteriofaga o genomie, który składa się z bloków genów pochodzących od różnych fagów, czyli charakteryzuje się mozaikowatą budową genomu np.: geny strukturalne faga λ mają inną zawartość par GC niż geny regulacyjne, co może świadczyć o tym, że pochodzą z innego źródła [13]. Bakteriofagi posiadają również dodatkowe elementy genetyczne nazwane w literaturze anglojęzycznej „moron” (od ang. more – więcej), ponieważ zwiększają one ilość DNA w genomie faga. Są to geny, pochodzące z  zewnętrznego źródła, nie związane z funkcją sąsiadujących genów, posiadające własny promotor i terminator. Mogą dawać korzyść gospodarzowi lub być wykorzys­tane w czasie rozwoju faga [29]. Do wymiany tych elementów genetycznych pomiędzy bakteriofagami może dojść, gdy tę samą bakterię atakują różne fagi, lub gdy w zaatakowanej bakterii znajdują się profagi [28]. W genomach niektórych bakterii, np. enterokrwotocznych E. coli (EHEC), może być nawet do kilkunastu profagów lambdoidalnych, co prowadzi do łatwej rekombinacji z genomem infekującego faga. Niektóre profagi są defektywne, a ich geny mogą być wykorzystywane przez bakterię, np. produkty genów ogonka znajdujących się pod kontrolą regulacyjnych systemów bakterii mogą działać jako bakteriocyny [30]. Mechanizm wymiany dodatkowych elementów genetycznych prowadzi między innymi do przenoszenia przez bakteriofagi genów kodujących czynniki wirulencji takie jak toksyny Shiga, białka błony zewnętrznej czy enzymy zmieniające strukturę LPS [91]. Bakteriofagi są więc ważnymi pośrednikami w horyzontalnym transferze genów pomiędzy bakteriami, oraz wpływają na różnorodność bakteryjnych genomów [58, 61]. 4. Bakteriofag λ Najlepiej poznanym przedstawicielem fagów lambdoidalnych jest bakteriofag λ (Rys. 2). W tym rozdziale, w przypadku podstawowych informacji będziemy odno-

177

Rys. 2. Wirion bakteriofaga λ. Zdjęcie spod mikroskopu elektronowego TEM (dzięki uprzejmości dr Grażyny Konopy, Uniwersytet Gdański).

sić się do opublikowanych stosunkowo niedawno artykułów przeglądowych [59, 93, 95], w których czytelnik znajdzie szersze dane literaturowe, ograniczymy się natomiast do cytowania jedynie najważniejszych i najnowszych prac oryginalnych dotyczących bakteriofaga λ. Genom faga λ, schematycznie przedstawiony na Rys. 1., stanowi linowa, dwuniciowa cząsteczka DNA o  długości 48502 par zasad zakończona 12-nukleotydowymi lepkimi końcami. Bakteriofag λ został sklasyfikowany do rzędu Caudovirales i rodziny Siphoviridae. Wirion zbudowany jest z ikozaedralnej główki o średnicy 54 nm i ogonka nie posiadającego kurczliwej pochewki o średnicy 15 nm i długości 150 nm. Na końcu ogonka znajduje się włókienko końcowe o  średnicy 2 nm i długości 25 nm. Badania nad bakteriofagiem λ zaczęto w połowie XX wieku. Od tego czasu stał się on organizmem modelowym, dzięki któremu poznano regulację podstawowych procesów genetycznych takich jak: represja i aktywacja promotorów, antyterminacja transkrypcji czy rekombinacja DNA [95]. Wykorzystywany jest również jako najprostszy model do badania czynników mających wpływ na wybór alternatywnych dróg rozwojowych. Jest to kluczowe dla efektywnej propagacji tego faga, w różnych warunkach wzrostu komórek gospodarza [95]. Poniżej przedstawione zostaną dwie alternatywne drogi rozwojowe bakteriofaga  λ i poszczególne ich etapy.

178

Joanna Monika Łoś, Grzegorz Węgrzyn

4.1. Adsorpcja i injekcja DNA Infekcja rozpoczyna się od adsorpcji faga na powierzchni komórki bakteryjnej [95]. Podczas tego procesu dochodzi do specyficznego oddziaływania pomiędzy fagowym białkiem J, budującym włókienko końcowe, a bakteryjnym białkiem LamB, tworzącym porynę maltozową. Poryna ta umożliwia transport maltozy do wnętrza komórki i jest umiejscowiona wzdłuż komórki gospodarza na błonie zewnętrznej. Adsorpcja faga zależy od obecności jonów Mg2+, które neutralizują ujemny ładunek na powierzchni błony. Pierwotnie wyizolowany bakteriofag λ miał dodatkowo sześć długich włókien przyśpieszających adsorpcję, jednak zostały one utracone przez mutację w genie stf. Efektem tego było zwiększenie łysinek fagowych co znacznie ułatwiło pracę z tym bakteriofagiem. Natomiast w warunkach naturalnych, czyli w jelitach ssaków, gdzie znajdują się sole żółciowe i węglowodany, do adsorpcji faga na powierzchni komórki potrzebne jest jeszcze jedno białko zewnętrznej błony gospodarza: Ag43, które bierze udział w autoagregacji komórek Escherichia coli. Białko to może działać jako dodatkowe miejsce wiązania faga z komórką bakteryjną w środowisku o niskim stężeniu jonów dwuwartościowych [95]. Po zaadsorbowaniu się cząstki fagowej na powierzchni błony dochodzi do przesunięcia związanego wirionu z białkiem LamB do bieguna komórki. Tutaj znajduje się największa koncentracja białka ManY, niezbędnego do injekcji fagowego DNA. Białko to umiejscowione jest w błonie wewnętrznej i jest jednym z elementów budujących system transportujący mannozę. Tak się dzieje jeśli komórkę gospodarza zainfekuje mała liczba cząstek fagowych od 1 do 5 na jedną komórkę (niskie m.o.i. czyli wielokrotność zakażenia). Przy większej liczbie bakteriofagów injekcja może nastąpić w miejscu zaadsorbowania się faga. W procesie tym biorą też udział następujące białka fagowe: V (główne białko ogonka), G i H (białka łączące włókienko końcowe z ogonkiem) oraz Z (łączy główkę z ogonkiem oraz jest związane z końcem DNA wystającym do ogonka) [17]. Podczas wprowadzania fagowego materiału genetycznego do wnętrza komórki dochodzi do niespecyficznych wiązań z białkami gospodarza np. HU. Powoduje to kondensację DNA fagowego i wepchnięcie go na skutek gradientu ciśnienia osmotycznego pomiędzy cytoplazmą a  środowiskiem zewnętrznym do upakowanej cytoplazmy gospodarza [34]. 4.2. Faza decyzji „liza czy lizogenia” Po injekcji następuje cyrkularyzacja fagowego DNA dzięki 12-nukleotydowym końcom cos, które są ligowane przez ligazę gospodarza. Na tym etapie fag musi „podjąć decyzję” o wyborze jednej z alternatywnych

dróg rozwojowych: litycznej bądź lizogennej (do szczegółowych odnośników literaturowych odsyłamy czytelnika do prac przeglądowych: [59, 95]). Po cyrkularyzacji genomu faga, bakteryjna polimeraza RNA rozpoczyna transkrypcję z dwóch wczesnych promotorów fagowych: pL i pR. Pierwszymi genami transkrybowanymi z promotora pR są cro i cII. Natomiast z promotora pL transkrybowany jest gen N, kodujący białko antyterminatorowe. Tworzy ono kompleks z białkami bakteryjnymi powodujący, że polimeraza RNA nie rozpoznaje terminatorów w operonach pL i pR, co umożliwia transkrypcję kolejnych genów. Z kolei białko CII (produkt genu cII) jest aktywatorem promotora pE, z którego rozpoczyna się transkrypcja genu cI. Współzawodnictwo pomiędzy białkiem Cro (produkt genu cro), decydującym o rozwoju litycznym, a białkiem CI (produkt genu cI), decydującym o rozwoju lizogenicznym, jest kluczowym procesem przy decyzji „liza czy lizogenia”. Związane jest to z oddziaływaniem obu tych białek z regionami operatorowymi OL1, OL2 i OL3 promotora pL oraz OR1, OR2 i OR3 promotora pR, w wyniku czego dochodzi do zahamowania transkrypcji z tych promotorów [59]. Białko CI działa jako dimer w którym każdy z monomerów zbudowany jest z dwóch domen. Jedną z nich jest domena N-terminalna zawierająca motyw helisa-zwrot-helisa, odpowiadająca za wiązanie do DNA. Natomiast druga domena C-terminalna zawiera harmonijkę β biorącą udział w tworzeniu dimerów i interakcji pomiędzy dimerami. W tej domenie znajduje się też miejsce autoproteolizy białka CI, do której dochodzi podczas indukcji profaga. Dimery białka CI kooperatywnie wiążą się do operatorów OL1 i OL2 hamując aktywność promotora pL oraz do operatorów OR1 i OR2 hamując aktywność promotora pR. Następnie dochodzi do zagięcia DNA i oddziaływania pomiędzy ustawionymi naprzeciwko siebie tetramerami CI związanymi z wyżej wymienionymi miejscami operatorowymi, tworząc oktamery. Powoduje to powstanie pętli na DNA, która wzmacnia aktywność promotora pM, zaktywowanego po związaniu białka CI w operatorze OR2. Z tego promotora następuje efektywna transkrypcja genu  cI. Podczas rozpoczęcia transkrypcji polimeraza RNA może wiązać się zarówno do promotora pR jak i pM, ale szybkość tworzenia kompleksu otwartego na promotorze pR jest wyższa niż na pM. Ponadto jeśli polimeraza RNA jest związana jednocześnie z tymi promotorami, to na pM nie dochodzi do utworzenia kompleksu otwartego. Otwarcie kompleksu transkrypcyjnego zachodzi dzięki specyficznym oddziaływaniom między polimerazą RNA a dwoma regionami bogatymi w pary AT, które znajdują się przed miejscem „start” na DNA. Powoduje to owinięcie DNA wokół polimerazy RNA w czym bierze udział C-terminalna domena podjednostki α polimerazy RNA. Promotor pM jest słabym promotorem bez aktywacji przez białko CI. Dochodzi do wiąza-

Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga

nia tetramerów CI w operatorach OL3 i OR3 co stabilizuje powstałą pętlę i efektywnie hamuje promotory pL, pR jak i pM. Współdziałanie dimerów CI podczas wią­zania do operatorów nie jest konieczne w rozwoju faga λ, ale powoduje, że mniejsza ilość tego białka jest potrzebna do ustanowienia decyzji o lizogenicznym rozwoju bakteriofaga [7]. Białko Cro zbudowane jest z jednej domeny i wiąże się również jako dimer do tych samych miejsc operatorowych, ale w odwrotnej kolejności niż białko CI [59]. Do niedawna uważano, że białko Cro wiążąc się z operatorem OR3 hamuje promotor  pM, uniemożliwiając produkcję wystarczającej ilości białka CI do rozpoczęcia cyklu lizogenicznego, a przez to powoduje rozpoczęcie rozwoju litycznego. Ostatnie badania pokazały, że związanie Cro do tego operatora nie jest konieczne do hamowania promotora pM podczas indukcji profaga [6]. Wydaje się, że rolą białka Cro w cyklu litycznym po związaniu do operatorów jest zahamowanie transkrypcji z promotorów pL i pR. Powoduje to zatrzymanie transkrypcji genów cII i cIII, których produkty białkowe, odpowiednio CII i CIII, pozytywnie wpływają na ilość białka CI. Zaprzestanie produkcji białka CII podczas rozwoju litycznego jest istotne również dlatego, że jest ono toksyczne dla komórek gospodarza. Białko to przez wiązanie do podjednostki β polimerazy RNA może hamować transkrypcję bakteryjnych genów. Także nadprodukcja tego białka powoduje zahamowanie replikacji genomu gospodarza. W zależności od tego, którego białka Cro czy CI jest więcej w komórce bakteryjnej, bakteriofag wybiera odpowiednią drogę rozwoju. Zależy to od warunków fizjologicznych w jakich znajduje się komórka gospodarza. Rozwojowi litycznemu sprzyjają korzystne warunki wzrostu komórek gospodarza, takie jak: bogata pożywka, wysoka temperatura i niskie m.o.i. zakażającego faga. Natomiast rozwojowi lizogenicznemu sprzyjają niekorzystne warunki wzrostu, czyli: uboga pożywka, niska temperatura oraz duża liczba fagów infekująca tą samą komórkę bakteryjną [95]. Również w populacji bakterii rosnących w takich samych warunkach, komórki większe, czyli będące w lepszej kondycji częściej będą lizowane po zakażeniu bakteriofagiem λ niż te mniejsze [82]. 4.3. Rozwój lizogeniczny Kluczowym białkiem w rozwoju lizogenicznym jest białko CII, od którego aktywności zależy poziom białka CI. Białko CII tworzy tetramery zbudowane z podobnych dimerów. Każdy z monomerów tego białka zawiera motyw helisa-zwrot-helisa, ale tylko dwa monomery biorą udział w wiązaniu do DNA. Białko to jest aktywatorem trzech promotorów fagowych: pE, pI i paQ (Rys. 3). Stymulacja tych promotorów polega na związaniu się

179

Rys. 3. Schemat mechanizmu wyboru rozwoju lizogenicznego faga lambdoidalnego. Nazwy genów znajdują się pomiędzy przerywanymi liniami symbolizującymi genom faga λ. Strzałki wzdłuż przerywanych linii pokazują kierunek transkrypcji z promotorów. Strzałki odchodzące od białka N pokazują antyterminację, a od białka CII aktywację promotorów. Tępo zakończone linie oznaczają hamowanie aktywności białka lub genu

białka CII w miejscu zachodzącym na rejon –35 promotora i oddziaływaniu z podjednostką α polimerazy RNA. Aktywacja promotora pE powoduje transkrypcję genu cI. Dzięki temu powstaje pula białka CI aktywująca, po związaniu z OR2, własny promotor pM [59]. Z kolei na matrycy mRNA tworzonego z promotora pI powstaje białko Int niezbędne w procesie integracji genomu faga λ z chromosomem gospodarza (Rys. 3). Gen int jest także pod kontrolą promotora pL, ale powstające z niego transkrypty są degradowane zanim dojdzie do translacji białka Int. Dochodzi tutaj do tzw. retroregulacji. Polega ona na tym, że za genem int znajduje się region sib tworzący strukturę szpilki do włosów. Jest to struktura rozpoznawana przez bakteryjną RN-azęIII, która degraduje mRNA dla białka Int. Region sib jest transkrybowany, ponieważ polimeraza RNA jest w kompleksie z antyterminatorowym białkiem N, przez co nie rozpoznaje terminatora tLI położonego pomiędzy genem int a regionem sib. Natomiast gdy transkrypcja genu int zachodzi z promotora pI polimeraza RNA nie jest związana z białkiem N i zatrzymuje się na terminatorze tLI. Region sib nie jest transkrybowany i dochodzi do efektywnej translacji białka Int. Ostatnim promotorem aktywowanym przez tetramer białka CII jest promotor paQ, w wyniku czego powstaje RNA antysensowny do transkryptu białka Q (Rys. 3). Białko to jest kolejnym czynnikiem antyterminatorowym umożliwiającym transkrypcję genów strukturalnych bakteriofaga λ oraz genów kodujących białka powodujących lizę komórki gospodarza. Dzięki aktywności paQ nie dochodzi do złożenia i uwolnienia cząstek fagowych w komórce lizogennej fagiem λ. W aktywacji promotorów pI i paQ, ale nie pE może brać udział oprócz białka CII również bakteryjne białko SeqA [95]. Schemat przedstawiający początkową fazę wyboru rozwoju lizogenicznego jest przedstawiony na Rys. 3. Ilość białka CII w komórce zależy od różnych czynników zarówno bakteryjnych jak i fagowych. Pierwszym z  nich jest antysensowny transkrypt powstający

180

Joanna Monika Łoś, Grzegorz Węgrzyn

z fagowego promotora pO, tzw. OOP RNA. Jest on komplementarny do końca 3’ transkryptu dla białka CII, co uniemożliwia translację i powstanie tego białka. Stabilność OOP RNA zależy z kolei od wydajności jego poliadenylacji przez bakteryjną poli(A) polimerazę I, PAP I, co powoduje degradację tak zmodyfikowanego mRNA przez RN-azę III. W wolno rosnących komórkach gospodarza dochodzi do wydajniejszej poliadenylacji OOP RNA, a co za tym idzie do powstania większej ilości białka CII, mogącego aktywować promotory pE, pI i paQ [33]. Kolejnym białkiem bakteryjnym wpływającym na ilość białka CII, w tym przypadku wpływającego na jego stabilność, jest proteaza HflB (FtsH), która degraduje białko CII (Rys. 3). Dzieje się tak dzięki odpowiedniej sekwencji sygnałowej znajdującej się na C-końcu monomeru CII. Na stabilność białka CII ma także wpływ temperatura. Im jest ona niższa tym powstaje więcej stabilnych tetramerów białka CII. W temperaturze poniżej 20–25°C dochodzi tylko do rozwoju lizogenicznego. W  wyższych temperaturach przeważają monomery i dimery białka CII, które są efektywnie degradowane przez proteazę HflB. Natomiast aktywność tej proteazy jest hamowana przez bakteryjne alarmony głodu cAMP i ppGpp, których ilość wzrasta w komórkach gospodarza podczas hodowli w ubogiej pożywce. Prowadzi to do zwiększenia stabilności białka CII. Nukleotyd ppGpp jest również negatywnym regulatorem promotora  pR oraz pozytywnym promotorów pE, pI i paQ aktywowanych przez białko CII [95]. Następnym czynnikiem mającym wpływ na stabilność białka CII jest fagowe białko CIII. Jest ono zbudowane z  54 aminokwasów i zawiera centralną α-helisę biorącą udział w aktywności tego białka. CIII chroni białko CII przed degradacją przez proteazę HflB. Dzieje się tak dlatego, ponieważ białko CIII jest kompetetywnym inhibitorem proteazy HflB, który wiąże się do miejsca degradacji w tej proteazie, bardziej efektywnie niż CII. W ten sposób, samemu ulegając trawieniu, hamuje degradację CII [36]. Ilość białka CIII w komórce jest zależna od temperatury, im jest ona niższa tym wydajniejsza translacja tego białka. Spowodowane jest to tworzeniem dwóch alternatywnych struktur transkryptu. W niskich temperaturach powstaje transkrypt z łatwo dostępnym miejs­ cem Shine-Dalgarno i kodonem „start” dla rybosomu, dzięki czemu zachodzi wydajna translacja tego białka. Translacja jest również stymulowana przez wiązanie RN-azy III do mRNA, co powoduje ekspozycję miejsca przyłączenia rybosomu, a nie degradację transkryptu. W niskiej temperaturze promotor pL, pod którego kontrolą znajduje się gen cIII, jest bardziej aktywny. Białko CIII powoduje też indukcję bakteryjnej odpowiedzi stresowej poprzez stabilizację czynnika σ32, który umożliwia transkrypcję białek szoku termicznego. Tak samo jak w przypadku białka CII, dzięki trawieniu CIII przez

proteazę HflB, nie dochodzi do trawienia tego czynnika transkrypcyjnego. Powoduje to z jednej strony produkcję bakteryjnej proteazy Lon, degradującej fagowe białko N, a z drugiej strony białek DnaJ, DnaK i GrpE potrzebnych podczas replikacji genomu faga  λ. Ilość białka CIII zależy również od ilości fagów zakażających jedną komórkę bakteryjną [95]. Przy niskim m.o.i, kiedy injekcja fagowego DNA zachodzi na biegunach komórkowych, dochodzi również do wydajnej degradacji białka CII. Dzieje się tak dlatego że w tym miejscu jest także duża ilość proteazy HflB, która efektywnie trawi CII, do tego jest mało kopi genu CIII, a w związku z tym powstaje mniej tego białka. Przy wysokim m.o.i. gdy injekcja genomu faga λ następuje w miejscu adsorpcji cząstki fagowej jest nie tylko wyższa produkcja białka CIII, ale również CII może pojawić się tam gdzie jest mniejsza ilość proteazy HflB, co zmniejsza efektywność trawienia tego białka [17]. Podczas rozwoju lizogenicznego następuje integracja genomu faga λ z chromosomem Escherichia coli. Odpowiedzialny jest za to proces rekombinacji miejscowo-specyficznej pomiędzy fagowym miejscem attP (POP’) a bakteryjnym miejscem attB (BOB’). Miejsce attP znajduje się za genem int w genomie bakteriofaga, a miejsce attB jest pomiędzy operonami gal i bio na chromosomie gospodarza. Miejsca integracji są do siebie homologiczne tylko w części rdzeniowej O, zbudowanej z 15 par zasad i bogatej w pary AT. Pozostałe elementy P, P’, B i B’ tworzą proste jak i odwrócone powtórzenia oraz sekwencje palindromiczne rozpoznawane przez białka biorące udział w integracji i wycięciu DNA fagowego. W rekombinacji miejscowo-specyficznej udział bierze poza fagowym białkiem Int, także bakteryjne białko IHF, które po związaniu z DNA powoduje jego zagięcie i ekspozycję miejsca attB. Białko Int po rozpoznaniu miejsc attP i attB przecina obie nici zarówno fagowego jak i bakteryjnego DNA w rejonie O, a następnie łączy je ze sobą, co powoduje integrację materiału genetycznego bakteriofaga z chromosomem gospodarza. W wyniku tej reakcji genom profaga jest flankowany hybrydowymi miejscami att: BOP’ i POB’. Miejsce attB rozpoznawane przez bakteriofaga λ, mimo że nie koduje żadnych genów jest takie same w różnych szczepach E. coli. Bakteriofag ten posiada też dodatkowe miejsce integracji z chromosomem gospodarza [38, 59]. Stan profaga jest bardzo stabilny dzięki aktywności promotora pM, z którego jest transkrybowany gen cI. Dzięki temu białko CI utrzymuje się na stałym poziomie i efektywnie hamuje promotory pL i pR oraz chroni bakterię przed zakażeniem przez innego faga λ, czyli przed tak zwaną superinfekcją (Rys. 4). Z tego promotora dochodzi również do transkrypcji dwóch dodatkowych genów: rexA i rexB. Gen rexB ma dodatkowo jeszcze dwa promotory pLit1 i pLit2, które są aktywne w stanie profaga. Produkt tego genu, białko RexB chroni komórkę

Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga

Rys. 4. Schemat transkrypcji genów profaga λ regulowanej przez białko CI. Nazwy genów znajdują się pomiędzy przerywanymi liniami symbolizującymi genom profaga λ. Strzałka wzdłuż przerywanej linii pokazuje kierunek transkrypcji z promotora. Strzałka odchodząca od białka CI pokazuje aktywację promotora, a tępo zakończone linie oznaczają hamowanie aktywności promotorów.

gospodarza przed śmiercią w czasie głodu aminokwasowego, związanego z aktywnością systemu genów mazE i mazF. Zapobiega również śmierci komórki bakteryjnej po utracie profaga P1, wykorzystującego system phd-doc, przez inaktywację bakteryjnej proteazy ClpXP. Natomiast produkty obu genów rex biorą udział w blokowaniu superinfekcji innymi fagami np. mutanta faga T4 w genie rII. W stanie profaga dochodzi do ekspresji także innych genów fagowych. Należą do nich dwa geny strukturalne ogonka G i T, gen bet, którego produkt białkowy bierze udział w rekombinacji homologicznej, gen xis związany z wycięciem genomu faga z chromosomu gospodarza oraz otwartej ramki odczytu orf63, której funkcja nie jest znana [60]. 4.4. Indukcja profaga Indukcja jest to proces, podczas którego następuje przejście ze stanu profaga w rozwój lityczny [59, 95]. Może ona nastąpić w sposób spontaniczny lub zostać wymuszona przez czynniki powodujące uszkodzenia w DNA, takie jak: promieniowanie UV, X czy za pomocą mutagenów takich jak mitomycyna C. Promieniowanie UV generuje pęknięcia w DNA, powoduje hydratację cytozyny i uracylu oraz powstawanie kowalencyjnych wiązań, czego efektem są dimery pirymidynowe. Ponadto promieniowanie to sprawia powstawanie wolnych rodników, które mają wpływ na indukuję profaga λ. Dodanie substancji wyłapującej wolne rodniki np., glutationu, powoduje opóźnienie w indukcji profaga [43]. Natomiast aktywny metabolit mitomycyny  C alkiluje azot guaniny w strukturze DNA oraz kowalencyjnie łączy komplementarne nici DNA. Może również reagować z komórkowymi cząsteczkami tlenu tworząc wolne rodniki. Indukcję profaga λ mogą wywoływać także związki nie działające bezpośrednio na strukturę DNA np. norfloksacyna (NFLX) [50]. Jest to antybiotyk należący do drugiej grupy fluorochinolonów. Hamuje on aktywność gyrazy DNA wiążąc się do jej podjednostki A, która jest odpowiedzialna za oddziaływania z DNA. Gyraza DNA wprowadza negatywne skręty do struktury DNA. Działanie NFLX powoduje zahamowanie syntezy

181

DNA i powstanie jednoniciowych fragmentów DNA. Indukcję profaga powodują również czynniki, których metabolizm w komórce prowadzi do powstania reaktywnych form tlenu np. nadtlenek wodoru. Prowadzi to do oksydacji zasad DNA i uszkodzenia jego struktury. W procesie indukcji profaga bierze udział bakteryjne białko RecA. Jest to heksamer wiążący się przy udziale ATP z jednoniciowym DNA, które powstaje w wyniku działania różnych czynników indukujących profaga. W takiej formie białko RecA jest aktywne i stymuluje autoprotolizę kolejnego bakteryjnego białka, LexA. To z kolei aktywuje geny systemu S.O.S. biorące udział w naprawie uszkodzonego DNA [25]. W podobny sposób białko RecA oddziałuje z fagowym białkiem CI, powodując jego autoprotolizę. Spadek stężenia represora CI sprawia, że promotor pM traci swoją aktywność, a promotory pR oraz pL są odblokowane i rozpoczyna się z nich transkrypcja [59, 95]. Białko CII jest degradowane przez bakteryjną proteazę HflB i jest hamowane przez białko Cro. Nie dochodzi więc do aktywacji promotora pE, z którego mógłby powstawać transkrypt dla białka CI. Następuje wycięcie profaga z chromosomu gospodarza przy udziale fagowych białek Int i Xis oraz bakteryjnych białek IHF i Fis. Brak białka CII powoduje, że promotor pI nie jest aktywny, ale dochodzi do efektywnej transkrypcji mRNA dla białka Int z promotora pL. W stanie profaga za genem int znajduje się miejsce att BOP’, a region sib w wyniku cięcia w rejonie O miejsca attP podczas integracji, znajduje się za miejscem att POB’. Białko Xis razem z białkiem IHF powodują zagięcie DNA umożliwiając wycięcie genomu profaga w procesie rekombinacji miejscowo-specyficznej przez białko Int. Wiązanie białka Fis do DNA umożliwia przyłączenie białka Xis, co jest niezbędne do efektywnego wycięcia profaga. Po wycięciu się profaga rozpoczyna się rozwój lityczny. Dochodzi do replikacji fagowego DNA, produkcji białek strukturalnych, składania nowych cząstek fagowych i uwolnienia ich przez lizę komórki gospodarza [59, 95]. Indukcja profaga może również zajść bez udziału aktywnego białka RecA. Przykładem takiej indukcji jest indukcja zygotyczna, do której dochodzi podczas koniugacji pomiędzy komórkami bakteryjnymi. W wyniku tego procesu dawca może przekazać biorcy fragment chromosomu zawierający profaga. Brak białka CI w komórce biorcy powoduje aktywację promotorów pR oraz pL i rozpoczęcie rozwoju litycznego. Również wywołanie szoku solnego w komórkach lizogennych fagiem λ wywołuje indukcję profaga. Powodem tego może być nagły wzrost superskrętów w strukturze DNA, co sprawia że represor CI oddysocjowuje od miejsc operatorowych uwalniając promotory pR oraz pL [80]. Natomiast w stacjonarnej fazie wzrostu komórek bakteryjnych, przy nadekspresji genu dsrA również dochodzi do indukcji profaga bez udziału białka RecA [68].

182

Joanna Monika Łoś, Grzegorz Węgrzyn

4.5. Rozwój lityczny W regulacji rozwoju litycznego oprócz białka Cro ważną rolę odgrywa również białko N tworzące kompleks antyterminatorowy z polimerazą RNA i innymi czynnikami bakteryjnymi (Rys. 5). Umożliwia to transkrypcję kolejnych genów z promotorów pL i pR. Białko N

Rys. 5. Schemat mechanizmu wyboru rozwoju litycznego faga lambdoidalnego. Nazwy genów znajdują się pomiędzy przerywanymi liniami symbolizującymi genom faga λ. Strzałki wzdłuż przerywanych linii pokazują kierunek transkrypcji z promotorów. Strzałki odchodzące od białka N i Q pokazują antyterminację. Tępo zakończone linie oznaczają hamowanie aktywności promotora

rozpoznaje specyficzną sekwencję nutL w powstającym transkrypcie z promotora pL, znajdującą się pomiędzy genem N a promotorem oraz nutR zlokalizowaną na transkrypcie za genem cro. Miejsce nut zbudowane jest z dwóch elementów: boxA i boxB [59]. Białko N wiąże się do struktury szpilki do włosów w boxB. Powoduje to zagięcie RNA i związanie białka antyterminatorowego z polimerazą RNA. Do tego kompleksu przyłączają się bakteryjne białka stabilizujące to wiązanie. W boxB są to białka NusA i NusG a w boxA NusB i NusE (S10) [59]. Powstanie tak złożonego kompleksu umożliwia przejście polimerazie RNA przez terminatory tL i  tR, w  wyniku czego dochodzi do transkrypcji pozostałych genów z operonów pL i pR. Dzięki temu procesowi powstaje odpowiednia ilość białek potrzebnych podczas rozwoju litycznego bakteriofaga λ. Wiązanie białka N do miejsca nutL powoduje również represję translacji tego białka przez zablokowanie wiązania rybosomu do miejsca Shine-Dalgarno [59, 95]. Jednak w warunkach umożliwiających szybki wzrost komórek gospodarza, RN-aza III przecina sekwencję nutL, co powoduje uwolnienie sekwencji Shine-Dalgarno i efektywną translację białka N. Jest to istotne aby zapewnić odpowiednią ilość białka antyterminatorowego podczas rozwoju litycznego, ponieważ białko to jest degradowane przez bakteryjną proteazę Lon [95]. Antyterminacja może być także kontrolowana przez kinetykę dysocjacji białka N z polimerazą RNA i białkami Nus. W rozwoju litycznym dochodzi do replikacji materiału genetycznego faga w wyniku czego powstaje około 100  dodatkowych kopii cząsteczek DNA. W procesie tym biorą udział fagowe białka O i P, a także bakteryjne białka szoku termicznego, białka replikacyjne i regula-

torowe. Replikacja rozpoczyna się w oriλ, które znajduje się w  środku sekwencji genu O, zawierającego rejony bogate w pary AT. Produkt tego genu, białko O, wiąże się jako pierwsze w oriλ tworząc strukturę O-somu. Następnie przyłącza się kompleks białka P z bakteryjną helikazą DnaB. Nie dochodzi do rozplecenia nici DNA przez helikazę, ponieważ białko P hamuje jej aktywność. Zdolność do działania białka DnaB przywracają białka szoku termicznego DnaK, DnaJ i GrpE przekształcając preprimosom tak, że helikaza odzyskuje swoją aktywność rozplatania nici DNA [93]. W inicjacji replikacji ważną rolę odgrywa również aktywacja transkrypcyjna origin przez bakteryjne białko DnaA. Jest to białko aktywatorowe, które po związaniu się do DNA faga stymuluje transkrypcję z promotora pR, pod którego kontrolą są między innymi geny O i P. Białko to stymuluje wiązanie, a następnie opuszczenie promotora przez polimerazę RNA. Przesuwanie się polimerazy RNA powoduje zmiany w topologii DNA, które stymulują inicjację replikacji. Kolejnym czynnikiem aktywującym transkrypcję z tego promotora jest białko SeqA. Oba te białka konkurują ze sobą o miejsce wiązania w regionie regulatorowym promotora pR. Następnie do kompleksu replikacyjnego dołącza się holoenzym polimerazy DNA i dodatkowe białka gospodarza biorące udział w replikacji, takie jak gyraza DNA, SSB [93]. Rozpoczyna się replikacja typu θ, a powstały kompleks replikacyjny jest dziedziczony przez jedną z nici potomnych [93]. Od ilości białka O zależy wydajność inicjacji replikacji fagowego DNA. Białko to w wolnej formie jest degradowane przez bakteryjną proteazę ClpP/ClpX. Dopiero utworzenie kompleksu z białkami P, DnaB i DnaK w oriλ chroni białko O przed degradacją przez te proteazy [93, 95]. W warunkach umożliwiających szybki wzrost komórek gospodarza białko O jest produkowane w dużym nadmiarze w porównaniu z ilością jaka jest potrzebna do wyprodukowania potomnych cząstek fagowych. Dzięki temu proteaza ClpP/ClpX nie jest w stanie strawić wystarczającej ilości tego białka aby nie dopuścić do powielenia fagowego materiału genetycznego [93, 95]. Podczas replikacji faga λ tworzą się dwa rodzaje kompleksów replikacyjnych: stabilne, które mogą funkcjonować przez kilka rund replikacyjnych i niestabilne. Jednak w warunkach szoku termicznego stabilne kompleksy rozpadają się w wyniku relaksacji DNA i oddysocjowania od origin. Podczas indukcji profaga w wyniku naświetlania światłem UV powstają tylko niestabilne kompleksy replikacyjne, które umożliwiają wydajne powielenie DNA faga, bo nie dochodzi w tych warunkach do relaksacji DNA. W tych warunkach białko RecA uniemożliwia tworzenie się stabilnych kompleksów replikacyjnych [94]. Po 5–6 rundach dwukierunkowej replikacji typu θ, podczas której powstaje około 50 kopii genomu bakteriofaga λ, dochodzi do jednej rundy jednokierunkowej

Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga

replikacji typu θ. Spowodowane jest to tym, że białko DnaA zostaje wymiareczkowane, przez związanie się w wielu miejscach na DNA bakteriofaga. Nie następuje, więc aktywacja transkrypcyjna bez której nie może zajść dwukierunkowa replikacja typu θ. Podczas jednokierunkowej replikacji dochodzi do odepchnięcia końca 5’ przez rosnący koniec 3’ nowo syntetyzowanej nici i rozpoczyna się replikacja typu σ, czyli toczącego się koła. Następuje to w około 15 min po infekcji [95]. W wyniku tego typu replikacji tworzą się długie konkatameryczne cząsteczki DNA. Następnie są one cięte w miejscach cos i pakowane do równocześnie powstających główek bakteriofagowych [93, 95]. Transkrypcja genów białek budujących wirion faga λ zachodzi dzięki antytermiatorowemu białku Q, którego gen jest pod kontrolą promotora pR. Rozpoznaje ono dwie specyficzne sekwencje (QBE) na DNA pomiędzy miejscem –10 a –35 promotora pR’. Podczas transkrypcji z tego promotora polimeraza RNA zatrzymuje się na specyficznej sekwencji tuż za promotorem tworząc kompleks mający cechy kompleksu zamkniętego i otwartego. Dopiero oddziaływanie z białkiem Q związanym z sekwencją QBE umożliwia powstanie stabilnego kompleksu elongacyjnego. Antyterminator może przyłączyć się do polimerazy, ponieważ dochodzi do destabilizacji oddziaływań pomiędzy podjednostką σ70 a podjednostką β polimerazy RNA przez nowopowstający transkrypt [57]. Białko Q współzawodniczy z podjednostką σ70 o miejsce w podjednostce β polimerazy RNA. Specjalne miejsca wiązania na promotorze pR’ oraz oddziaływania z polimerazą sprawiają, że antyterminator  Q jest specyficzny tylko dla tego promotora [16]. Związanie polimerazy RNA z białkiem Q powoduje, że nie rozpoznaje ona terminatorów i następuje transkrypcja genów strukturalnych faga oraz genów umożliwiających lizę komórki gospodarza, czyli tzw. genów późnych. Schemat przedstawiający fazę wyboru rozwoju litycznego znajduje się na Rys. 5. W końcowym etapie rozwoju litycznego dochodzi do składania główek fagowych, w czym udział biorą również bakteryjne białka szoku termicznego GroEL i GroES [64]. Do główek pakowane jest DNA bakteriofaga, cięte w miejscach cos, eksponowanych przez białko IHF. Następnie do wypełnionej główki przyłączany jest ogonek i potomne cząstki fagowe uwalniają się z komórki gospodarza w procesie lizy. Liza komórki bakteryjnej zachodzi dzięki fagowym białkom S, R, Rz i Rz1. Gen S koduje dwa rodzaje holiny S105 i S107. Holina S105 niszczy błony komórkowe, a białko S107 działa jak antyholina, hamując aktywność białka S105. Holina S105 tworzy oligomeryczne pory w błonie wewnętrznej przez które wydostaje się endolizyna R, niszcząca ścianę komórkową bakterii [70]. Kolejne białko Rz, umiejscowione jest w błonie wewnętrznej a Rz1 w błonie zewnętrznej. Ich C-końce wystają do przestrzeni

183

peryplazmatycznej. W ostatnim etapie lizy zmieniają swoją konformację, oddziałują ze sobą i powodują połączenie błony zewnętrznej z wewnętrzną, co usuwa ostatnią barierę do uwolnienia potomnych cząstek fagowych. Ostatni etap może być istotny w naturalnym środowisku gdzie jest więcej jonów dwuwartościowych stabilizujących błonę zewnętrzną [9]. W wyniku cyklu litycznego powstaje około 100 nowych cząstek fagowych mogących zakażać kolejne komórki Escherichia coli [59, 93, 95]. W podsumowaniu należy zaznaczyć, że poszczególne etapy rozwoju wszystkich bakteriofagów lambdoidalnych, łącznie z fagami niosącymi geny toksyn Shiga, przebiegają podobnie, aczkolwiek mogą różnić się w szczegółach. Niemniej jednak, szczegółowe poznanie mechanizmów regulujących rozwój tych fagów ma ogromne znaczenie dla zrozumienia mechanizmu patogenności szczepów EHEC. 5. Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) Gospodarzem dla bakteriofagów przenoszących geny toksyn Shiga są enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC). Wywołują one u ludzi krwotoczne zapalenie okrężnicy (HC) oraz zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS). Ze względu na częstość powodowania objawów chorobowych i epidemii u ludzi podzielono je na 5 seropatotypów od A do E. Najczęściej opisywane bakterie E. coli produkujące toksyny Shiga to O157:H7, należące do seropatotypu A, który zawiera najbardziej wirulentne szczepy EHEC. Zakażenie tą bakterią daje najsilniejsze objawy chorobowe, które najczęściej rozwijają się w zespół hemolityczno-mocznicowy, najczęściej też dochodzi do powikłań oraz do epidemii w porównaniu z innymi serotypami EHEC [27]. Infekcja tym szczepem jest najbardziej niebezpieczna u dzieci do 10 roku życia i u ludzi starszych, ponieważ u tych osób istnieje najwyższe prawdopodobieństwo wystąpienia HUS. 80% przypadków kończących się zespołem hemolityczno-mocznicowym jest spowodowana przez szczep E. coli O157:H7. Wśród pacjentów zakażonych EHEC z krwotocznym zapaleniem okrężnicy od 3 do 15% przypadków może rozwinąć się w HUS, z czego śmiertelność wynosi około 10% [65]. Zespół hemolityczno-mocznicowy charakteryzuje się ostrą niewydolnością nerek, anemią i małopłytkowością. Również inne organy takie jak: płuca, trzustka czy serce mogą zostać uszkodzone [28]. Część pacjentów cierpi też na problemy ze strony układu nerwowego takie jak: śpiączka, dezorientacja, letarg [65]. Rezerwuarem szczepów EHEC są przeżuwacze, głównie bydło i inne zwierzęta gospodarskie, ale występują też u zwierząt domowych np. psów oraz u dzikich zwierząt. Szczepy EHEC bytują w jelitach tych organizmów nie powodując objawów chorobowych. Do zakażenia tymi patogenami dochodzi najczęściej przez

184

Joanna Monika Łoś, Grzegorz Węgrzyn

zjedzenie zainfekowanego niedogotowanego mięsa, głównie wołowiny, lecz również przez spożycie zainfekowanego surowego mleka lub jego przetworów, np. sera czy jogurtu. Kolejnym źródłem zakażenia mogą być niedomyte warzywa hodowane na nawozach organicznych lub kiełki tak hodowanych roślin. Także wypicie zainfekowanej wody czy nawet kąpiel w takiej wodzie może prowadzić do zakażenia EHEC. Kolejną drogą zakażenia tymi patogenami jest bezpośredni kontakt ze zwierzęciem lub z człowiekiem będącym nosicielem [27]. Cechą charakterystyczną dla zakażeń EHEC jest bardzo niska dawka infekcyjna wynosząca poniżej 100 komórek, wystarczająca do rozwoju objawów chorobowych. Kolejną cechą jest wysoka oporność na niekorzystne warunki wzrostu. W związku z tym, że bakterie te muszą przejść przez kwaśne środowisko żołądka wykazują dużą oporność na niskie pH. Rosną też w szerokim zakresie temperatur. Następnymi cechami tych patogenów jest niezdolność do fermentacji sorbitolu oraz nie produkują one β-glukuronidazy. Jednak nie wszystkie szczepy O157:H7 wykazują te właściwości i  są takie, które fermentują sorbitol oraz produkują β-glukuronidazę [40]. Powoduje to, że mikrobiologiczne testy na obecność tej bakterii są nieskuteczne. Również testy immunologiczne nie są dostatecznie wiarygodne, ponieważ jest wiele serotypów powodujących podobne objawy chorobowe. W diagnostyce EHEC najlepiej sprawdzają się testy genetyczne oparte na wykrywaniu genów toksyny Shiga [48]. Szczepy EHEC kolonizują jelito grube człowieka, przylegając do komórek nabłonka gdzie następnie wydzielana jest toksyna Shiga. Dzięki zmysłowi gęstoś­ciowemu rozpoznają środowisko jelita i następuje aktywacja genów odpowiedzialnych za kolonizację, które znajdują się na wyspie patogennej LEE. Wyspa ta zawiera geny kodujące aparat sekrecyjny typu III, przez który wydzielane są różne białka Esp oraz białko Tir, również kodowane na LEE. Kolejnym genem występującym na tej wyspie jest gen eae kodujący główne białko adhezyjne, intyminę. Intymina znajduje się na powierzchni komórek bakteryjnych i jest rozpoznawana przez bakteryjne białko Tir umiejscowione w  błonie komórek gospodarza co powoduje przyleganie bakterii do ściany jelita [27]. Intymina rozpoznaje również eukariotyczne białko nukleolinę będące na powierzchni różnych komórek, co zwiększa adherencje bakterii do komórek eukariotycznych [67]. Białko Tir wraz z białkami Esp powoduje też transdukcję sygnału w komórkach eukariotycznych, w wyniku czego dochodzi do zmiany struktury cytoszkieletu [27]. Następnie jest uwalniana toksyna Shiga, która uszkadza komórki nabłonkowe jelita oraz naczynia krwionośne, co powoduje krwawienie do światła jelita [40]. Obecność toksyny zwiększa również zdolność bakterii do przylegania do komórek nabłonka i kolonizacji jelita przez zwiększenie ilości białka nukle-

Rys. 6. Główne czynniki wirulencji enterokrwotocznych szczepów Escherichia coli O157:H7

oliny na powierzchni komórek eukariotycznych [67]. Toksyna ta może przedostać się do krwiobiegu i powodować uszkodzenia organów wewnętrznych, głównie nerek [40]. Ekspresja genów znajdujących się na wyspie patogennej LEE następuje w późnej fazie wzrostu wykładniczego, a genów toksyn Shiga wzrasta podczas wejścia w fazę stacjonarną wzrostu bakterii [8]. Szczepy Escherichia coli O157:H7 posiadają też plaz‑ mid pO157 o wielkości od 93,6 do 104 kpz, na którym znajdują się różne geny mogące wpływać na wirulentność tej bakterii. Należy do nich enterohemolizyna (Ehly), należąca do rodziny toksyn RTX. Może ona być wykorzystywana do lizy erytrocytów i uwalniania jonów żelaza, które przyśpieszają wzrost bakterii. Szczep ten posiada specjalny system transportu żelaza umożliwiający wykorzystanie hemu i hemoglobiny jako źródła żelaza [54]. Na plazmidzie może znajdować się również gen kodujący toksynę ToxB podobną do toksyn Clostridium difficile oraz gen katP kodujący białko o aktywności katalazy i peroksydazy [40, 41]. Główne czynniki wirulencji zostały przedstawione na Rys. 6. 6. Toksyny Shiga Głównym czynnikiem wirulencji EHEC jest toksyna Shiga. Wyróżniamy dwa podstawowe rodzaje tych toksyn: Stx1 i Stx2. Białko Stx1 enterohemolitycznych Escherichia coli jest identyczne do toksyny Shiga pochodzącej ze szczepu Shigella dysenteriae I. Natomiast białko Stx2 jest homologiczne z Stx1 w 55% w podjednostce A i 57% w podjednostce B. Do tego można wyróżnić kilka wariantów toksyny Stx2 różniących się między sobą sekwencją aminokwasową: Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f, Stx2v i inne. Komórka bakteryjna szczepu EHEC może kodować tylko toksynę Stx1 lub Stx2, może kodować też obie te toksyny lub różne warianty białka Stx2 [54]. E. coli

Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga

O157:H7 najczęściej koduje toksynę Stx2, która jest bardziej toksyczna dla komórek nabłonka jelita i nerek oraz częściej powoduje HUS niż toksyna Stx1. Toksyny Shiga są podobnie zbudowane. Składają się z jednej domeny A o wielkości 32 kDa i pierścienia zbudowanego z pięciu domen B, każda o wielkości 7,7 kDa. C-koniec domeny A jest zakotwiczony wewnątrz pentameru B. Pierścień zbudowany z domen B rozpoznaje specyficzny receptor na powierzchni komórek eukariotycznych Gb3 (Stx2e wiąże się z receptorem Gb4). Poprzez endocytozę toksyna zostaje wprowadzona do wnętrza komórki gdzie może ulec fuzji z lizosomem, dzięki czemu jest degradowana. Może też być transportowana do aparatu Golgiego. W takim przypadku, przechodzi następnie do retikulum endoplazmatycznego, gdzie domena A toksyny jest odcinana przez proteazę od podjednostki B. Powstaje katalitycznie aktywny fragment A1 (27 kDa) i fragment A2 (4 kDa). Uwolniony do cytoplazmy fragment A1 ma aktywnośc N-glikozydazy RNA i tnie specyficzne wiązanie w 28S rRNA. Powoduje to zahamowanie łączenia się amino-acylo-tRNA do podjednostki 60S rybosomu, a w konsekwencji zatrzymanie procesu syntezy białek, a to prowadzi do śmierci komórki [40]. Geny toksyn Shiga znajdują się w genomie profagów lambdoidalnych zintegrowanych z chromosomem bakteryjnym. Mogą się one znajdować na funkcjonalnych jak i kryptycznych profagach. Szczep E. coli O157:H7 EDL933 posiada 18 profagów i elementów pochodzenia fagowego [31]. Toksyny te są kodowane przez dwa geny: stxA kodujący domenę A i stxB kodujący domenę  B. Gen stxA jest wydajniej transkrybowany niż gen stxB [32]. Znajdują się one wśród genów późnych bakteriofaga pomiędzy genami Q i S. Powoduje to, że ich ekspresja jest pod kontrolą późnego fagowego promotora  R’ i  antyterminatorowego białka Q. Co więcej, również uwolnienie toksyny Shiga jest regulowane poprzez lizę komórek bakteryjnych przez białka bakteriofagowe. Szczepy EHEC nie posiadają systemu do sekrecji toksyn Shiga. Produkcja dużej ilości tych toksyn jest związana z cyklem rozwojowym faga, następuje tylko po indukcji profaga i jest uwolniona do wnętrza jelita razem z potomnymi fagami przez lizę komórki bakteryjnej. Dotyczy to zarówno toksyny Stx2 [89] jak i Stx1 [90]. Geny toksyn Stx1 i Stx2 posiadają również własne promotory, które różnią się między sobą, ale wydajność transkrypcji jest podobna [85]. Schemat przedstawiający lokalizację genów toksyny na chromosomie faga znajduje się na Rys. 7. Promotor pstx1 zawiera miejsce wiązania bakteryjnego białka Fur, przez co jest zależny od stężenia jonów żelaza [11]. Wysokie stężenie tych jonów powoduje zahamowanie transkrypcji z tego promotora [92]. Natomiast aktywność promotora pstx2 jest niezależna od jonów żelaza. Nie posiada on miejsca wiązania białka

185

Rys. 7. Lokalizacja genów toksyny Shiga w genomie bakteriofaga (na schemacie przedstawiony jest jedynie fragment tego genomu – porównaj z Rys. 1)

Fur. Na ekspresję z tego promotora nie mają też wpływu warunki tlenowe wzrostu bakterii, źródło węgla, wartość pH od 6,5 do 8,5 ani różne stężenia octanu sodu. Jednak fagi które mają insercje w tym promotorze oraz posiadają gen Q podobny do genu Q faga φ21, produkują małą ilość toksyny w porównaniu z fagami o niezmienionym promotorze pstx2 i genie Q podobnym do genu Q faga 933W [49]. W związku z tym, że produkcja toksyny jest związana z indukcją profaga, zależy ona od bakteryjnego białka RecA, powodującego trawienie represora fagowego [51]. Ilość produkowanej toksyny zależy też od rodzaju bakteriofaga i od szczepu bakteryjnego [87]. Szczep O157:H7 produkuje większe ilości toksyny niż inne szczepy zarówno podczas spontanicznej indukcji jak i po indukcji spowodowanej mitomycyną C, co może mieć wpływ na większą wirulentność tych szczepów [69]. W związku z mechanizmem produkcji toksyny przez szczepy EHEC trudno jest leczyć pacjentów zakażonych tymi bakteriami. Syntezę toksyny wywołują różne antybiotyki, nie tylko te, które wywołują odpowiedź S.O.S. Wykazano, że również niektóre makrolidy, np. erytromycyna u jednych szczepów EHEC obniża produkcję białka Stx, a u innych podwyższa. Podobna sytuacja dotyczy niektórych antybiotyków β-laktamowych, które są podawane podczas biegunki będącej pierwszym objawem po zakażeniu EHEC [26]. W  związku z tym podawanie antybiotyków i innych antybakteryjnych leków jest problematyczne, ponieważ może nasilić objawy chorobowe i zwiększyć ryzyko wystąpienia HUS [65] oraz spowodować rozprzestrzenianie się fagów przenoszących toksynę Shiga wśród innych szczepów bakteryjnych. Również na farmach powinno się z dużą ostrożnością używać antybiotyków aby nie sprzyjać rozprzestrzenianiu się tych fagów wśród innych szczepów Enterobacteriaceae [97]. Wykazano też, że około 10% pacjentów chorych na raka i traktowanych mitomycyną C cierpi na niewydolność nerek związaną z zespołem hemolityczno-mocznicowym [51]. Być może ma to związek z wywołaniem produkcji toksyn Shiga przez bakterie EHEC bezobjawowo zasiedlające do tej pory jelito. Do niedawna nie znano czynnika w jelicie człowieka, który powoduje indukcje profagów kodujących białka Stx [27]. Nie wiadomo również dlaczego część osób jest nosicielami tych bakterii i nie wykazuje objawów chorobowych dopóki

186

Joanna Monika Łoś, Grzegorz Węgrzyn

nie zażyje odpowiedniego antybiotyku [21]. Może to być związane z naturalną florą bakteryjną jelita, co pokazano na mysim modelu. Powoduje ona zmniejszenie możliwości kolonizacji jelita i przetrwania szczepów EHEC. Może też mieć wpływ na ilość produkowanej toksyny Shiga. Jeśli naturalna flora jelitowa jest oporna na faga kodującego toksynę to ilość produkowanego białka Stx maleje. Jeśli natomiast jest wrażliwa na takiego faga to dochodzi do produkcji dużo większej ilości toksyny [23]. Wśród ludzkiej flory jelitowej znaleziono szczepy E. coli powodujące zahamowanie wzrostu szczepów EHEC [66]. 7. Indukcja profagów niosących geny toksyn Shiga Mechanizm indukcji profagów niosących geny toksyn Shiga jest podobny jak u bakteriofaga λ. Związany jest z aktywnością bakteryjnego białka RecA wiążącego się do jednoniciowych fragmentów DNA, co wywołuje odpowiedź S.O.S. Białko RecA bierze udział w trawieniu fagowego represora CI co powoduje wycięcie się profaga z genomu bakteryjnego i zapoczątkowuje rozwój lityczny [20]. Prowadzi to do powstania białka Q i transkrypcji z promotora pR’, pod którego kontrolą są geny stxA i stxB. Powstaje duża ilość toksyny, która jest uwalniana podczas lizy komórek bakteryjnych przez białka fagowe [86] (Rys. 8). Wszystkie czynniki, które uszkadzają DNA wywołują indukcję profagów lambdoidalnych. Należą do nich między innymi promieniowanie UV, mitomycyna C, ale również szereg innych antybiotyków np. norfloksacyna, która początkowo była rekomendowana przy leczeniu zakażeń EHEC [50]. Indukcję tych profagów wywołują również czynniki używane do konserwacji żywności takie jak wysokie ciśnienie hydrostatyczne [2] czy promieniowanie kobaltu-60 co może mieć wpływ na rozprzestrzenianie się tych bakteriofagów [96]. Profagi kodujące toksynę Stx indukują się z większą częstością niż profagi nie posiadające genów tej toksyny [44]. W przypadku faga 933W jest to związane ze słabszym oddzia-

ływaniem pomiędzy rep resorem CI a miejscem opera­ torowym OR2 w promotorze pR [18]. Ostatnio opublikowane wyniki badań wskazały, że czynnikiem efektywnie indukującym profagi niosące geny toksyn Shiga jest nadtlenek wodoru [45, 46]. Jest to odkrycie o tyle istotne, że warunki stresu oksydacyjnego mogą potencjalnie występować w jelicie człowieka, szczególnie w warunkach infekcji bakteryjnej i zależnej od funkcji neutrofili (wydzielających H2O2) odpowiedzi immunologicznej. Oprócz indukcji wymuszonej czynnikami wywołującymi odpowiedź S.O.S dochodzi też do indukcji spontanicznej bakteriofagów przenoszących geny toksyn Shiga. Związane jest to z różnicami w fizjologii bakterii raczej niż z różnicami w poziomie ekspresji represora i tylko mała frakcja lizogenów indukuje się spontanicznie [44]. Niewątpliwie ilość produkowanej toksyny a co za tym idzie wirulencja szczepów EHEC zależy od wydajności indukcji profagów [83] oraz wydajności procesu replikacji DNA faga wpływającego na liczbę kopii genów stx w komórce [55, 56]. Indukcja profagów niosących geny toksyn Shiga zależy także od miejsca integracji w genomie gospodarza. Do tej pory znaleziono 5 głównych miejsc integracji genomu fagów kodujących toksynę Shiga w chromosomie E. coli. Dwa najczęściej występujące miejsca to gen yehV, kodujący regulator transkrypcyjny i wrbA, kodujący oksydoreduktazę. Kolejne geny to sbcB, kodujący egzonukleazę, z2577 kodujący oksydoreduktazę i yecE o nieznanej funkcji [76]. Miejsce integracji zależy od rodzaju faga i od dostępności danego miejsca integracji. Fagi kodujące toksynę Stx1 najczęściej wybierają gen yehV. To samo miejsce wybierają też fagi kodujące toksynę Stx2, ale jeśli jest ono zajęte przez innego faga to integrują się w genie wrbA [78]. Natomiast fagi kodujące toksynę Stx2c integrują się w miejscu genu sbcB, dzięki czemu w chromosomie bakteryjnym może znajdować się kilka różnych kopii genu toksyny [84]. Ten sam bakteriofag może również integrować się w kilku miejscach w tej samej komórce bakteryjnej. Uwarunkowane jest to kodowaniem genu dla białka anty-represora, co umożliwia superinfekcję tym samym fagiem [19]. Miejsce insercji oraz utrzymanie się profaga zależy od tła genetycznego gospodarza [24]. Wykazano, że gdy z genomem bakteryjnym są zintegrowane dwa profagi kodujące toksynę Shiga to po działaniu czynnikiem indukującym indukuje się tylko jeden z nich. Wpływają one zatem nawzajem na ekspresję swoich genów [53]. 8. Rola represora CI i miejsc operatorowych fagów kodujących toksyny Shiga

Rys. 8. Czynniki prowadzące do indukcji profaga i ekspresji genów toksyn Shiga

Podczas powstania stanu profaga a następnie jego indukcji ważną rolę może odgrywać białko represora CI oraz miejsca operatorowe wczesnych genów faga,

Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga

tak samo jak ma to miejsce w przypadku bakteriofaga λ. Wykazano różnice w oddziaływaniu białka represora z miejscami operatorowymi OR i OL pomiędzy fagiem λ a fagami przenoszącymi geny toksyn Shiga, które mogą wpływać na rozwój tych fagów oraz produkcję toksyny. Bakteriofag 933W, tak jak fag λ, posiada trzy miejsca operatorowe OR [37, 59, 95]. Wiązanie represora do miejsc OR1 i OR2 hamuje transkrypcję z promotora pR i aktywuje działanie promotora pM u obu bakteriofagów. Jednak u faga λ dochodzi do kooperatywnego wiązania podobnej ilości represora do obu tych miejsc. Natomiast ilość represora faga 933W potrzebna do związania się z operatorem OR2 jest czterokrotnie wyższa niż do operatora OR1. Związane jest to z niższą zdolnością wiązania się represora do operatora OR2 i brakiem kooperatywności wiązania [37]. Powodować to może mniejszą stabilność lizogenów faga 933W niż faga λ, ponieważ mniejsze różnice w ilości represora mogą prowadzić do indukcji profaga. U obu tych fagów wiązanie represora do operatora OR3 powoduje zahamowanie ekspresji z promotora pM [37, 59, 95]. Kolejną różnicą pomiędzy tymi bakteriofagami jest to, że fag 933W posiada tylko dwa miejsca operatorowe OL a nie trzy tak jak fag λ. Jednak wiązanie represora 933W do tylko dwóch miejsc operatorowych jest wystarczające do zahamowania ekspresji z promotora pL. Również miejsce cięcia represora przez białko RecA jest inne u faga 933W niż u faga λ. Do cięcia u faga 933W dochodzi pomiędzy leucyną a glicyną a nie alaniną i glicyną jak to ma miejsce u faga λ [37]. Natomiast bakteriofag H-19B posiada cztery miejsca operatorowe OR. Represor CI faga H-19B najpierw wiąże się do operatora OR1, a potem do pozostałych operatorów. Jednak ilość represora potrzebna do związania się z operatorami OR2 i OR3 jest tylko nieco wyższa niż w  OR1. Również siła wiązania represora do operatora OR2 wydaje się być niezależna od związania represora w  operatorze OR1. Bakteriofag H-19B tak jak fag  λ posiada trzy miejsca OL [79]. Białko represora fagów kodujących toksynę Shiga bierze również udział w procesie insercji drugiego takiego bakteriofaga do genomu gospodarza. Powoduje też, że podwójne lizogeny są bardziej stabilne, a co za tym idzie rzadziej dochodzi do indukcji profaga i rozpoczęcia cyklu litycznego, czyli zmniejsza ilość produkowanej toksyny [77]. 9. Podsumowanie Mimo intensywnych badań dotyczących bakteriofagów przenoszących geny toksyn Shiga nadal niewiele wiadomo co powoduje indukcję tych profagów, a co za tym idzie produkcję dużej ilości toksyny w jelitach człowieka [27]. Wykazano, że dodanie enterokrwotocznej E. coli do hodowli tkankowej ludzkich neutrofili powo-

187

duje produkcję i uwolnienie toksyny Shiga. Neutrofile podczas kontaktu z patogenem wydzielają nadtlenek wodoru [88], który jest czynnikiem uszkadzającym DNA. W tym świetle ważne wydają się ostatnie doniesienia o indukcji profagów niosących geny toksyn Shiga pod wpływem działania nadtlenku wodoru [45, 46]. Warto zauważyć, że podczas stanu zapalnego wywołanego toksyną Shiga dochodzi do przenikania neutrofili w  miejsce zapalne. Toksyna ta powoduje również opóźnienie apoptozy neutrofili, co może prowadzić do dodatkowych uszkodzeń tkanek przez te komórki [42]. Co więcej, również bakterie obecne w  ludzkim jelicie mogą powodować powstawanie reaktywnych form tlenu [39], które powodują indukcję profaga λ i innych fagów lambdoidalnych [43]. Należy stwierdzić, że niewiele też wiadomo o rozwoju bakteriofagów niosących geny toksyn Shiga. Nasza wiedza w tym względzie opiera się głównie na znajomości procesów zachodzących podczas rozwoju faga λ, najlepiej poznanego przedstawiciela fagów lambdoidalnych. Problem ten dotyczy zarówno rozwoju lizogenicznego jak i rozwoju litycznego po indukcji profaga, i to zarówno w warunkach laboratoryjnych jak i w warunkach powolnego wzrostu komórek bakteryjnych występujących w jelitach. Wiadomo, że rozwój bakteriofaga λ zależy od stanu fizjologicznego komórek gospodarza i jest zahamowany podczas powolnego wzrostu ko­mórek bakteryjnych [47]. Konkludując, należy podkreślić iż pomimo podobieństw w budowie i funkcji pomiędzy fagiem λ a fagami lambdoidalnymi niosącymi geny toksyn Shiga, szczegółowe mechanizmy regulujące rozwój tych ostatnich, a  co zatem idzie produkcję toksyn, pozostają niedostatecznie poznane, szczególnie przy wzięciu pod uwagę specyficznych warunków panujących w świetle ludzkiego jelita jako środowiska bytowania EHEC. Konieczne są zatem dalsze intensywne badania nad tymi mechanizmami, które w ostateczności powinny pozwolić nam poznać sposoby zapobiegania skutkom infekcji szczepami EHEC lub efektywnego leczenia. Piśmiennictwo   1. Acheson D.W.K., Reidl J., Zhang X., Keusch G.T., Mekalanos J.J., Waldor M.K.: In vivo transduction witch Shiga toxin 1-encoding phage. Infect. Immun. 66, 4496–4498 (1998)   2. Aertsen A., Faster D., Michiels C.W.: Induction of Shiga toxin-converting prophage in Escherichia coli by high hydrostatic pressure. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1155–1162 (2005)  3. Allison H.E., Sergeant M.J., James C.E., Saunders J.R., Smith D.L., Sharp R.J., Marks T.S., McCarthy A.J.: Immunity profiles of wild-type and recombinant Shiga-like toxin-encoding bacteriophages and characterization of novel double lysogens. Infect. Immun. 71, 3409–3418 (2003)   4. Altuvia S., Oppenheim A.B.: Translational regulatory signals within the coding region of the bacteriophage λ cIII gene. J. Bacteriol. 167, 415–419 (1986)

188

Joanna Monika Łoś, Grzegorz Węgrzyn

  5. Asadulghani M., Ogura Y., Ooka T., Itoh T., Sawaguchi A., Iguchi A., Nafayama K., Hayashi T.: The defective prophage pool of Escherichia coli O157: prophage-prophage interactions potentiate horizontal transfer of virulence determinants. PLoS Pathog. 5, e1000408 (2009)   6. Atsumi S., Little J. W.: Role of the lytic repressor in prophage induction of phage λ as analyzed by a module-replacement approach. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4558–4563 (2006)   7. Babic A. C., Little J. W.: Cooperative DNA binding by CI repressor is dispensable in a phage λ variant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 17741–17746 (2007)   8. Bergholz T.M., Wick L.M., Qi W., Riordan J.T., Ouellette L.M., Whittam T.S.: Global transcriptional response of Escherichia coli O157:H7 to growth transitions in glucose minimal medium. BMC Microbiol. 7, 97 (2007)   9. Berry J., Summer E.J., Struck D.K., Young R.: The final step in the phage infection cycle: the RZ and Rz1 lysis proteins link the inner and outer membranes. Mol. Microbiol. 70, 341–35 (2008) 10. Brussow H., Hendrix R.W.: Phage genomics: small is beautiful. Cell, 108, 13–16 (2002) 11. Calderwood S.B., Mekalanos J.J.: Iron regulation of Shiga-like toxin expression in Escherichia coli is mediated by the fur locus. J. Bacteriol. 169, 4759–4764 (1987) 12. Campbell A., Botstein D.: Evolution of the lambdoid phages (w:) Lambda II red. Hendrix R.W., Roberts J.W., Stahl F.W., Weisberg R.A., Cold Spring Harbor, Lab. Press, New York, USA, 1983 s. 365–380 13. Canchaya C., Fournous G., Chibani-Chennoufi S., Dillman M.-L., Brussow H.: Phage as agents of lateral gene transfer. Curr. Opinion Microbiol. 6, 417–424 (2003) 14. Creuzburg K., Kohler B., Hempel H., Schreier P., Jacobs E., Schmidt H.: Genetic structure and chromosomal integration site of the cryptic prophage CP-1639 encoding Shiga toxin 1. Microbiol. 151, 941–950 (2005) 15. Cornick N.A., Helgerson A.F., Mai V., Ritchie J.M., Acheson D.W.K.: In Vivo transduction of an Stx-encoding phage in ruminants. Appl. Environ. Microbiol. 72, 5086–5088 (2006) 16. Deighan P., Montero Diez C., Leibman M., Hochschild A., Nickels B.E.: The bacteriophage λ Q antiterminator protein contacts the β-flap domain of RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 15305–15310 (2008) 17. Edgar R., Rokney A., Feeney M., Semsey S., Kessel M., Goldberg M.B., Adhya S., Oppenheim A.B.: Bacteriophage infection is targeted to cellular poles. Mol. Microbiol. 68, 1107–1116 (2008) 18. Evans T., Bowers R.G., Mortimer M.: Modelling the stability of Stx lysogens. J. Theor. Biol. 248, 241–250 (2007) 19. Fogg P.C.M., Gossage S.M., Smith D.L., Saunders J.R., McCarthy A.L., Allison H.E.: Identification of multiple integration sites for Stx-phage φ24B in the Escherichia coli genome, description of a novel integrase and evidence for a functional anti-repressor. Microbiol. 153, 4098–4110 (2007) 20. Fuchs S., Muhldorfer I., Donohue-Rolfe A., Kerenyi M., Emody L., Alexiev R., Nenkov P., Hacker J.: Influence of RecA on in vivio virulence and Shiga toxin 2 production in Escherichia coli pathogens. Microb. Pathog. 27, 13–23 (1999) 21. Gamage S.D., Strasser J.E., Chalk C.L., Weiss A.A.: Nonpathogenic Escherichia coli can contribute to the production of Shiga toxin. Infect. Immun. 71, 3107–3115 (2003) 22. Gamage S.D., Patton A.K., Hanson J.F., Weiss A.A.: Diversity and host range of Shiga toxin-encoding phage. Infect. Immun. 72, 7131–7139 (2004) 23. Gamage S.D., Patton A.K., Strasser J.E., Chalk C.L., Weiss A.A.: Commensal bacteria influence Escherichia coli O157:H7 persistence and Shiga toxin production in the mouse intestine. Infect. Immun. 74, 1977–1983 (2006)

24. Garcia-Aljaro C., Muniesa M., Jofre J., Blanch A.R.: Genotypic and phenotypic diversity among induced, stx2-carrying bacteriophages from environmental Escherichia coli strains. Appl. Environ. Microbiol. 75, 329–336 (2009) 25. Giese K.C., Michalowski C.B., Little J.W.: RecA-dependent cleavage of LexA dimers. J. Mol. Biol. 377, 148–161 (2008) 26. Grif K., Dierich M.P., Karch H., Allerberger F.: Strain-specific differences in the amount of Shiga toxin released from enterohemorrhagic Escherichia coli O157 following exposure to subinhibitory concentrations of antimicrobial agents. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 17, 761–766 (1998) 27. Gyles C.L.: Shiga toxin-producing Escherichia coli: An overview. J. Anim. Sci. 85, 45–62 (2007) 28. Hendrix R.W., Smith M.C.M., Burns R.N., Ford M.E., Hatfull G.F.: Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: all the world’s a phage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 2192–2197 (1999) 29. Hendrix R.W., Lawrence J.G., Hatfull G.F., Casjens S.: The origins and ongoing evolution of viruses. Trends Microbiol. 8, 504–508 (2000) 30. Hendrix R.W.: Bacteriophage genomics. Curr. Opinion Microbiol. 6, 506–511 (2003) 31. Herold S., Karch H., Schmidt H.: Shiga toxin-encoding bacteriophages-genomes in motion. Int. J. Med. Microbiol. 294, 115–121 (2004) 32. Herold S., Siebert J., Huber A., Schmidt H.: Global expression of prophage genes in Escherichia coli O157:H7 strain EDL933 in response to norfloxacin. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 931–944 (2005) 33. Jasiecki J., Węgrzyn G.: Growth-rate dependent RNA poliadenylation in Escherichia coli. EMBO Rep. 4, 172–177 (2003) 34. Jeembaeva M., Castelnovo M., Larsson F., Evilevitch A.: Osmotic pressure: resisting or promoting DNA ejection from phage? J. Mol. Biol. 381, 310–323 (2008). 35. Johansen B.K., Wasteson Y., Granum P.E., Brynestad S.: Mosaic structure of Shiga-toxin-2-encoding phages isolated from Escherichia coli O157:H7 indicates frequent gene exchange between lambdoid phage genoms. Microbiol. 147, 1929–1936 (2001) 36. Kobiler O., Rokney A., Oppenheim A.B.: Phage lambda CIII: a protease inhibitor regulating the lysis-lysogeny decision. PLoS ONE, 2, e363 (2007) 37. Koudelka A.P., Hufnagel L.A., Koudelka G.B.: Purification and characterization of the repressor of the Shiga toxin-encoding bacteriophage 933W: DNA binding, gene regulation and auto­ cleavage. J. Bacteriol. 186, 7659–7669 (2004) 38. Kuhn J., Campbell A.: The bacteriophage λ attachment site in wild strains of Escherichia coli. J. Mol. Evol. 53, 607–614 (2001) 39. Kumar A., Wu H., Collier-Hyams L.S., Hansen J.M., Li T., Yamoah K., Pan Z.Q., Jones D.P., Neish A.S.: Commensal bacteria modulate cullin-dependent signaling via generation of reactive oxygen species. EMBO J. 26, 4457–4466 (2007) 40. Law D.: Virulence factors of Escherichia coli O157 and other Shiga toxin-producing E. coli. J. App. Microbiol. 88, 729–745 (2000) 41. Lim J.Y., Yoon J.W., Hovde C.J.: A brief overview of Escherichia coli O157:H7 and its plasmid O157. J. Microbiol. Biotechnol. 20, 1–10 (2010) 42. Liu J., Akahoshi T., Sasahana T., Kitasato H., Namai R., Sasaki T., Inoue M., Kondo H.: Inhibition of neutrophil apoptosis by verotoxin 2 derived from Escherichia coli O157:H7. Infect Immun. 67, 6203–6205 (1999) 43. Liu Y., Zhang Q., Fang C., Zhu S., Tang Y., Huang S.: Effect of glutathione on UV induction of prophage lambda. Arch. Microbiol. 183, 444–449 (2005)

Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga

44. Livny J., Friedman D.I.: Characterizing spontaneous induction of Stx encoding phages using a selectable reporter system. Mol. Microbiol. 51, 1691–1704 (2004) 45. Łoś J.M., Łoś M., Węgrzyn G., Węgrzyn A.: Differential efficiency of induction of various lambdoid prophages responsible for production of Shiga toxin in response to different induction agents. Microb. Pathogen. 47, 289–298 (2009) 46. Łoś J.M., Łoś M., Węgrzyn A., Węgrzyn G.: Hydrogen peroxide-mediated induction of the Shiga toxin-converting lambdoid prophages ST2–8624 in Escherichia coli O157:H7. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 58, 322–329 (2010) 47. Łoś M., Golec P., Łoś J.M., Węglewska-Jurkiewicz A., Czyż A., Węgrzyn A., Węgrzyn G., Neubauer P.: Effective inhibition of lytic development of bacteriophages λ, P1 and T4 by starvation of their host, Escherichia coli. BMC Biotechnol. 7, 13 (2007) 48. Łoś M., Łoś J.M., Węgrzyn G.: Rapid identification of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) using electric biochips. Diagn. Mol. Pathol. 17, 179–184 (2008) 49. Matsumoto M., Suzuki M., Takahashi M., Hirose K., Minagawa H., Ohta M.: Identification and epidemiological description of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 strains producing low amounts of Shiga toxin 2 in Aichi prefecture. Jpn. J. Infect. Dis. 61, 442–445 (2008) 50. Matsushiro A., Sato K., Miyamoto H., Yamamura T., Honda T.: Induction of prophages of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with norfloxacin. J. Bacteriol. 181, 2257–2260 (1999) 51. Mühldorfer I., Hacker J., Keusch G.T., Acheson D.W., Tschäpe  H., Kane A. V., Ritter A., Olschläger T., Donohue-Rolfe A.: Regulation of the Shiga-like toxin II operon in Escherichia coli. Infect Immun. 64, 495–502 (1996) 52. Muniesa M., Recktenwald J., Bielaszewska M., Karch H., Schmidt H.: Characterization of a Shiga toxin 2e-converting bacteriophage from an Escherichia coli strain of human origin. Infect. Immun. 68, 4850–4855 (2000) 53. Muniesa M., Simon M., Prats G., Ferrer D., Panella H., Jofre J.: Shiga toxin 2-converting bacteriophages associated with clonal variability in Escherichia coli O157:H7 strains of human origin isolated from single outbreak. Infect. Immun. 71, 4554–4562 (2003) 54. Nataro J.P., Kaper J.B.: Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 11, 142–403 (1998) 55. Nejman B., Łoś J.M., Łoś M., Węgrzyn G., Wegrzyn A.: Plas­ mids derived from lambdoid bacteriophages as models for studying replication of mobile genetic elements responsible for the production of Shiga toxins by pathogenic Escherichia coli strains. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 17, 211–220 (2009) 56. Nejman B., Nadratowska-Wesołowska B., Szalewska-Pałasz A., Węgrzyn A., Węgrzyn G.: Replication of plasmids derived from Shiga toxin-converting bacteriophages in starved Escherichia coli. Microbiol. 157, 220–233 (2011) 57. Nickels B.E., Roberts C.W., Roberts J.W., Hochschild A.: RNA-mediated destabilization of the σ70 region 4/β flap interaction facilitates engagement of RNA polymerase by the Q antiterminator. Mol. Cell. 24, 457–468 (2006) 58. Ohnishi M., Kurokawa K., Hayashi T.: Diversification of Escherichia coli genomes: are bacteriopheges the major contributors? Trends Microbiol. 9, 481–485 (2001) 59. Oppenheim A.B., Kobiler O., Stavans J., Court D.L., Adhya S.: Switches in bacteriophage lambda development. Annu. Rev. Genet. 39, 409–429 (2005) 60. Osterhout R.E., Figueroa I.A., Keasling J.D., Arkin A.P.: Global analysis of host response to induction of a latent bacteriophage. BMC Microbiol. 7, 82 (2007) 61. Papke R.T., Doolittle W.F.: Phage evolution: new worlds of genomic diversity. Curr. Biology, 13, 606–607 (2003)

189

62. Pennington H.: Escherichia coli O157. Lancet, 376, 1428–1435 (2010) 63. Plunkett III G., Rose D.J., Durfee T.J., Blattner F.R.: Sequence of Shiga toxin 2 phage 933W from Escherichia coli O157:H7: Shiga toxin as a phage late-gene product. J. Bacteriol. 181, 1767–1778 (1999) 64. Polissi A., Goffin L., Georgopoulos C.: The Escherichia coli heat shock response and bacteriophege λ development. FEMS Microbiol. Rev. 17, 159–169 (1995) 65. Razzaq S.: Hemolytic Uremic Syndrome: An emerging health risk. Am. Fam. Physician, 74, 991–996 (2006) 66. Reissbrodt R., Hammes W.P., Bello F., Prager R., Fruth A., Hantke K., Rakin A., Starcic-Erjavec M., Williams P.H.: Inhibition of growth of Shiga toxin-producing Escherichia coli by nonpathogenic Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 290, 62–69 (2009) 67. Robinson C.M., Sinclair J.F., Smith M.J., O’Brien A.D.: Shiga toxin of enterohemorrhagic Escherichia coli type O157:H7 promotes intestinal colonization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 9667–9672 (2006) 68. Rozanov D.V., D’ari R., Sineoky S.P.: RecA-independent pathways of lambdoid prophage induction in Escherichia coli. J. Bacteriol. 180, 6306–6315 (1998) 69. Sablet T., Bertin Y., Vareille M., Girardeau J., Garrivier A., Gobert A.P., Martin C.: Differential expression of stx2 variants in Shiga toxin-producing Escherichia coli belonging to sero­ pathotypes A and C. Microbiol. 154, 176–186 (2008) 70. Savva C.G., Dewey J.S., Deaton J., White R.L., Struck D.K., Holzenburg A., Young R.: The holin of bacteriophage lambda forms rings with large diameter. Mol. Microbiol. 69, 784–793 (2008) 71. Scheutz F, Møller Nielsen E., Frimodt-Møller J., Boisen N., Morabito S., Tozzoli R., Nataro J.P., Caprioli A.: Characteristics of the enteroaggregative Shiga toxin/verotoxin-producing Escherichia coli O104:H4 strain causing the outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, May to June 2011. Euro Surveill. 16, pii=19889 (2011) 72. Schmidt H., Bielaszewska M., Karch H.: Transduction of enteric Escherichia coli isolates with a derivative of Shiga toxin 2-encoding bacteriophage φ3538 isolated from Escherichia coli O157:H7. Appl. Environ. Microbiol. 65, 3855–3861 (1999) 73. Schmidt H.: Shiga-toxin-converting bacteriophages. Res. Microbiol. 152, 687–695 (2001) 74. Scott Samuels D., Garon C.F.: Coumermycin A1 inhibits growth and induces relaxation of supercoiled plasmids in Borrelia burgdorferi, the lyme disease agent. Antimicrob. Agents Chemother. 37, 46–50 (1993) 75. Sekse C., Solheim H., Urdahl A.M., Wasteson Y.: Is lack of susceptible recipients in the intestinal environment the limiting factor for transduction of Shiga toxin-encoding phages? J. Appl. Microbiol. 105, 1114–1120 (2008) 76. Serra-Moreno R., Jofre J., Muniesa M.: Insertion site occupancy by stx2 bacteriophages depends on the locus availability of the host strain chromosome. J. Bacteriol. 189, 6645–6654 (2007) 77. Serra-Moreno R., Jofre J., Muniesa M.: The CI repressor of Shiga toxin-converting prophages are involved in coinfection of Escherichia coli strains, which causes a down regulation in the production of Shiga toxin. J. Bacteriol. 190, 4722–4735 (2008) 78. Shaikh N., Tarr P.I.: Escherichia coli O157:H7 Shiga toxin-encoding bacteriophages: integrations, excisions, truncations and evolutionary implications. J. Bacteriol. 185, 3596–3605 (2003) 79. Shi T., Friedman D.I.: The operator-early promoter regions of Shiga-toxin bearing phage H-19B. Mol. Microbiol. 41, 585–599 (2001)

190

Joanna Monika Łoś, Grzegorz Węgrzyn

80. Shkilnyj P., Koudelka G.B.: Effect of salt shock on stability of λimm434 lysogens. J. Bacteriol. 189, 3115–3123 (2007) 81. Smith D.L., James C.E., Sergeant M.J., Yaxian Y., Saunders J.R., McCarthy A.J., Allison H.E.: Short-tailed Stx phages exploit the conserved YaeT protein to disseminate Shiga toxin genes among Enterobacteria. J. Bacteriol. 189, 7223–7233 (2007) 82. St-Pierre F., Endy D.: Determination of cell fate selection during phage lambda infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 20705–20710 (2008) 83. Strauch E., Schaudinn C., Beutin L.: First-time isolation and characterization of a bacteriophage encoding the Shiga toxin 2c variant, which is globally spread in strains of Escherichia coli O157. Infect. Immun. 72, 7030–7039 (2004) 84. Strauch E., Hammerl J.A., Konietzny A., Schneiker-Bekel S., Arnold W., Goesmann A., Puhler A., Beutin L.: Bacteriophage 2851 is a prototype phage for dissemination of the Shiga toxin variant gene 2c in Escherichia coli O157:H7. Infect. Immun. 76, 5466–5477 (2008) 85. Sung L.M., Jackson M.P., O’Brien A.D., Holmes R.K.: Transcription of the Shiga-like toxin type II and Shiga-like toxin type II variant operons of Escherichia coli. J. Bacteriol. 172, 6386–6395 (1990) 86. Tyler J.S., Mills M.J., Friedman D.I.: The operator and early promoter region of the Shiga toxin type 2-encoding bacteriophage 933W and control of toxin expression. J. Bacteriol. 186, 7670–7679 (2004) 87. Wagner P.L., Acheson D.W.K., Waldor M.K.: Isogenic lysogens of diverse Shiga toxin 2-encoding bacteriophages produce markedly different amounts of Shiga toxin. Infect. Immun. 67, 6710–6714 (1999) 88. Wagner P.L., Acheson D.W.K., Waldor M.K.: Human neutrophils and their products induce Shiga toxin production by entero­hemorrhagic Escherichia coli. Infect. Immun. 69, 1934–1937 (2001) 89. Wagner P.L., Neely M.N., Zhang X., Acheson D.W.K., Waldor M.K., Friedman D.I.: Role for a phage promoter in Shiga toxin 2 expression from pathogenic Escherichia coli strain. J. Bacteriol. 183, 2081–2085 (2001) 90. Wagner P.L., Livny J., Neely M.N., Acheson D.W.K., Friedman D.I., Waldor M.K.: Bacteriophage control of Shiga toxin 1

production and release by Escherichia coli. Mol. Microbiol. 44, 957–970 (2002) 91. Waldor M.K.: Bacteriophage biology and bacterial virulence. Trends Microbiol. 6, 295–297 (1998) 92. Weinstein D.L., Holmes R.K., O’Brien A.: Effects of iron and temperature on Shiga-like toxin I production by Escherichia coli. Infect. Immun. 56, 106–111 (1988) 93. Węgrzyn A., Węgrzyn G.: Replikacja DNA bakteriofaga λ: nowe odkrycia dokonane przy użyciu starego modelu badawczego. Post. Biochem. 52, 42–48 (2006) 94. Węgrzyn A., Węgrzyn G.: Formation and stability of the bacteriophage λ replication complexes in UV-irradiated Escherichia coli. Curr. Microbiol. 41, 157–160 (2000) 95. Węgrzyn G., Węgrzyn A.: Genetic switches during bacteriophage lambda development. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 79, 1–48 (2005) 96. Yamamoto T., Kojio S., Taneike I., Nakagawa S., Iwakura N., Wakisaka-Saito N.: 60Co irradiation of Shiga toxin (Stx)-producing Escherichia coli induces Stx phage. FEMS Microbiol. Lett. 222, 115–121 (2003) 97. Zhang X., McDaniel A.D., Wolf L/E., Keusch G.T., Waldor M.K., Acheson D.W.K.: Quinolone antibiotics induce Shiga toxin-encoding bacteriophages, toxin production and death in mice. J. Infect. Dis. 181, 664–70 (2000) 98. Zoja C., Buelli S., Morigi M.: Shiga toxin-associated hemolytic uremic syndrome: pathophysiology of endothelial dysfunction. Pediatr. Nephrol. 25, 2231–2240 (2010) Autorzy pragną wyrazić podziękowania wszystkim członkom zespołu naukowego z Katedry Biologii Molekularnej Uniwersytetu Gdańskiego oraz Pracowni Biologii Molekularnej (afiliowanej przy Uniwersytecie Gdańskim) Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk, pracującego nad regulacją rozwoju bakterio­fagów niosących geny kodujące toksyny Shiga, za zaangażowanie w badania oraz stymulujące dyskusje. Wyżej wspomniane badania są finansowane w ramach grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (projekt nr N N301 192439, kierownik: dr hab., prof. PAN Alicja Węgrzyn).

Zakażenia ludzkimi poliomawirusami osób poddanych immunosupresji

POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 3, 191–199 http://www.pm.microbiology.pl

Sylwia Rynans*1, Tomasz Dzieciątkowski1, Grażyna Młynarczyk1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa Wpłynęło w marcu 2011 r.

1. Wstęp. 2. Ogólna budowa poliomawirusów. 3. Zakażenia układu oddechowego. 4. Śródmiąższowe zapalenie nerki przeszczepionej. 5. Krwotoczne zapalenie pęcherza. 6. Postępująca wieloogniskowa leukoencefalopatia. 7. Stwardnienie rozsiane – przypuszczalny udział poliomawirusów w patogenezie. 8.  Choroby nowotworowe powodowane przez ludzkie poliomawirusy. 9. Diagnostyka. 10.  Terapia zakażeń poliomawirusami. 11. Profilaktyka. 12. Podsumowanie Polyomavirus diseases of immunosuppressed patients Abstract: The human polyomaviruses are a group of nonenveloped, icosahedral viruses with a small, supercoiled double-stranded DNA genome. Nowadays, there are five known human polyomaviruses widespread within population: BK, JC, WU, KI and Merkel cell polyomavirus. After primary infection, they establish ubiquitous, persistent infections in healthy individuals. Reactivation can occur when the immune system is impaired, leading to disease progression. All of them are recognized as important pathogens causing severe morbidity and mortality in immunocompromised patients, especially in persons who have received a solid-organ transplant. They cause a variety of diseases in this group of patients, such as: BKV nephropathy, hemorrhagic cystitis, multifocal leukoencephalopathy, some types of cancer and also probably multiple sclerosis. This review describes the general aspects of human polyomavirus infections and pathogenicity. Commonly used diagnostic and therapeutic procedures in the field are also discussed. 1. Introduction. 2. Polyomavirus morphology. 3. Respiratory tract infection. 4.  Polyomavirus nephropathy. 5.  Hemorrhagic cystitis. 6. Multifocal leukoencephalopathy. 7. JC virus and multiple sclerosis. 8. Human polyomaviruses and cancer. 9. Diagnostics of polyomaviral diseases. 10. Treatment of polyomavirus infections 11. Prevention and prophylaxis. 12. Summary Słowa kluczowe: poliomawirusy ludzkie, immunosupresja, zakażenie Key words: human polyomaviruses, immunosuppression, infection

1. Wstęp Poliomawirusy, należące do rodziny Polyomaviridae, powodują zakażenia wielu różnych gatunków ssaków, w  tym również człowieka [6]. Obecnie znanych jest 5 poliomawirusów ludzkich: wirus BK (BKV), wirus JC (JCV), wirus WU (WUV), wirus KI (KIV) oraz poliomawirus komórek Merkela (MCV) [24]. Poliomawirusy ludzkie po raz pierwszy odkryto w roku 1971, gdy z mózgu osoby chorej na postępującą wieloogniskową leukoencefalopatię (progressive multifocal leukoencephalopathy – PML) wyizolowano wirusa JC, a BKV z  moczu pacjenta po allogenicznym przeszczepieniu nerki [37, 51]. W roku 2007 dwa niezależne zespoły ze Szwecji (Karolinska Institutet) oraz ze Stanów Zjednoczonych (Washington University), wyizolowały z materiałów klinicznych pochodzących z układu oddechowego dwa kolejne poliomawirusy ludzkie: KI oraz WU [29, 42]. Niedługo po tym odkryciu, w roku 2008, w  zmienionych nowotworowo komórkach Merkela zidentyfikowany został następny poliomawirus człowieka – MCV [11]. Określenia BKV oraz JCV pochodzą od inicjałów pacjentów, od których zostały po raz pierw-

szy wyizolowane, natomiast poliomawirusy WU oraz KI nazwano od instytucji, w których zostały wykryte [44]. Jedynie nazewnictwo MCV odbiega od tradycyjnego nazewnictwa opartego na pochodzeniu i wywodzi się z rodzaju komórek nowotworowych, w których po raz pierwszy zidentyfikowano ten patogen [23]. Zakażenia poliomawirusami są szeroko rozpowszech­ nione u ludzi i zwierząt, a  zakażenia pierwotne mają zwykle przebieg bezobjawowy. Szacuje się, że ponad 80% populacji osób dorosłych ma wykrywalne przeciwciała przeciwko poliomawirusom BK oraz JC [2, 33, 35]. Zakażenia BKV, KIV oraz WUV zazwyczaj mają miejsce we wczesnym dzieciństwie, natomiast JCV kilka do kilkunastu lat później [1, 6]. Drogi transmisji poliomawirusów nie zostały do końca poznane; sugeruje się, że wirusy te przenoszone są drogą oddechową, fekalno-oralną, a także wraz z krwią i przeszczepianym narządem [6, 22]. W następstwie zakażeń w wieku dziecięcym wirusy te przedostają się do różnych tkanek, gdzie powodują zakażenie przetrwałe [22]. Za główne miejsce persystencji BKV i JCV uważa się tkanki układu moczowego, natomiast KIV i  WUV –  tkanki układu oddechowego [1, 23, 42]. Poliomawirusy ulegają reaktywacji

* Autor korespondencyjny: Sylwia Rynans, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny; ul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa; tel: 022 628 27 39; e-mail: [email protected]

192

Sylwia Rynans, Tomasz Dzieciątkowski, Grażyna Młynarczyk

Rys. 1. Częstość występowania przeciwciał przeciwko poliomawirusom BK i JC w odniesieniu do wieku osób badanych [wg 2, 33]

w wyniku osłabienia układu immunologicznego, głównie na skutek immunosupresji związanej z  przeszczepieniem organów [6, 49]. Wówczas mogą one powodować zakażenia układu oddechowego (KIV, WUV), śródmiąższowe zapalenie nerki przeszczepionej (BKV), krwotoczne zapalenie pęcherza (BKV), postępującą wieloogniskową leukoencefalopatię (JCV) [13, 23]. Są także prawdopodobnie zaangażowane w patogenezę stwardnienia rozsianego (JCV), a także niektórych chorób nowotworowych (JCV, MCV) [13, 23]. JCV oraz BKV wykryto w nerkach, migdałkach oraz leukocytach, a JCV dodatkowo w tkankach płuc uzyskanych od pacjentów z postępującą wieloogniskową leukoencefalopatią. KIV oraz WUV można wyizolować z  materiałów klinicznych układu oddechowego, a także z tkanki limfoidalnej pacjentów poddanych immunosupresji [29]. 2. Ogólna budowa poliomawirusów Genom poliomawirusów stanowi kolisty, dwuniciowy DNA zawierający ok. 5000 par zasad (pz). Jest on zamknięty w ikozaedralnym kapsydzie o średnicy ok. 40–45 nm złożonym z 72 kapsomerów i pozbawionym osłonki. Wirusowe DNA zawiera 3 różne funkcjonalnie regiony: wczesny i późny region kodujący oraz niekodujący region regulatorowy. Region regulatorowy zawiera miejsce początku replikacji DNA oraz czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję genów wczesnych oraz późnych [6]. Region wczesny, transkrybowany przed replikacją DNA, koduje dwa białka niestrukturalne tzw. duży i mały antygen T, natomiast region późny koduje białka kapsydu VP1, VP2, VP3 oraz niestrukturalną agnoproteinę [8]. Genomy BKV oraz JCV wykazują względem siebie ok. 72% homologii [10]. DNA poliomawirusa BK zawiera 5153 pz. Na podstawie różnic w sekwencji nukleotydowej genomu, wyróż-

niamy 4 podtypy wirusa oznaczone od I do IV, w tym 4  podgrupy w obrębie podtypu I (a, b1, b2, c) [28]. BKV wiąże się do powierzchni komórki gospodarza przez receptor, który stanowi glikoproteina zawierająca łańcuchy N-glikanowe. Po endocytozie wirusa jego cząstki transportowane są do jądra komórkowego poprzez retikulum endoplazmatyczne. Białka kapsydu są usuwane przed wniknięciem DNA do jądra komórkowego, w którym następuje proces transkrypcji. Pojawienie się antygenu  T w  komórkach permisywnych powoduje przejście infekcji w zakażenie produktywne. Antygen  T (T-Ag) występuje w przeważającej części (95%) w jądrze komórki gospodarza w formie wolnej lub związanej z komórkowym DNA. T-Ag jest podstawowym białkiem wirusowym, niezbędnym do replikacji wirusowego materiału genetycznego. Ma ono także zdolność do regulacji cyklu komórkowego, przez bezpośredni wpływ na komórkowe czynniki transkrypcyjne, takie jak c-Jun czy c-Fos [26]. Nowe wiriony składane są ze zreplikowanego wirusowego DNA oraz białek strukturalnych VP1, VP2 oraz VP3. Wydostają się one z komórki poprzez jej lizę, aczkolwiek przy zakażeniach persystentnych można je także wykryć w pęcherzykach znajdujących się wewnątrz cytoplazmy [22]. Genom wirusa JC zawiera DNA o długości 5130 pz, a jego dwustronna organizacja przypomina organizację genomu BKV [19]. JCV ulega adsorpcji do komórki poprzez wiązanie reszt kwasu sialowego, a jego receptorem jest najprawdopodobniej receptor serotoninowy 5HT2AR [41]. Wirus dostaje się do komórek na drodze endocytozy i transportowany jest do jądra komórkowego w którym zachodzi replikacja DNA oraz transkrypcja genów wczesnych i późnych [25]. Wyróżniamy dwa warianty JCV: archetypowy oraz przestawiony. Forma archetypowa zawiera niezmieniony region regulatorowy i wykrywana jest zwykle w moczu. W wyniku mutacji niektórych sekwencji regulatorowych, powstaje wariant „przestawiony”, o innym tropizmie tkankowym oraz wyższym potencjale patogennym, przez co może powodować rozwój chorób takich jak postępująca wieloogniskowa leukencefalopatia [26]. Wirusy KI oraz WU zaklasyfikowano do poliomawirusów ludzkich ze względu na wysoką homologię oraz podobieństwo w organizacji genomu do poliomawirusów BK i JC. Mają one regiony kodujące antygeny T oraz białeka strukturalne VP1, VP2 i VP3, nie kodują jednak białka niestrukturalnego agnoproteiny [11]. KIV oraz WUV wykazują wysoką homologię we wczesnym regionie kodującym, natomiast ich regiony późne znacznie się różnią [4]. Genom wirusa KI zawiera 5040 pz, natomiast wirusa WU – 5229 pz [45]. Spośród ludzkich poliomawirusów MCV ma największy genom, który zawiera 5387 pz [17]. Duży antygen T wirusa wykazuje jedynie 30% homologii w stosunku do dużego antygenu T kodowanego przez pozo-

Zakażenia ludzkimi poliomawirusami osób poddanych immunosupresji

stałe poliomawirusy. Zwiększa to możliwości MCV do wiązania białka p53 oraz integracji wirusowego DNA do DNA ludzkiego, co sprzyja procesom nowotworzenia w komórkach Merkela. Podobnie jak u wirusów JC oraz WU, genom MKV nie koduje agnoproteiny [24]. 3. Zakażenia układu oddechowego Zakażenia układu oddechowego, powodowane przez WUV oraz KIV, występują najczęściej u kilkuletnich dzieci, ale także u pacjentów powyżej 45 roku życia [39]. Szacuje się, że poliomawirusy KI powodują ok. 1–2,5% zakażeń układu oddechowego, natomiast poliomawirusy WU 3–7% zakażeń układu oddechowego u dzieci poniżej 4 roku życia [38]. W badaniach przeprowadzonych przez N e s k e i wsp. poliomawirus WU został wykryty w 4,9% próbek popłuczyn gardłowych uzyskanych od dzieci hospitalizowanych z  powodu ostrych zakażeń układu oddechowego. Obecność DNA wirusa stwierdzono głównie w próbkach pochodzących od pacjentów poniżej 4 roku życia, co wskazuje na większą częstość zakażeń u dzieci w wieku przedszkolnym [40]. Detekcja KIV oraz WUV związana jest zazwyczaj ze współzakażeniem innymi wirusami, powodującymi infekcje układu oddechowego. Najczęściej wykrywanymi patogenami są w tym przypadku rinowirusy oraz bokawirusy ludzkie, nieco rzadziej adenowirusy [39]. 4.  Śródmiąższowe zapalenie nerki przeszczepionej Poliomawirus BK jest rozpoznawany jako główny czynnik etiologiczny śródmiąższowego zapalenia nerki u pacjentów po allogenicznym przeszczepieniu tego narządu. Reaktywacja wirusa w wyniku immunosupresji może prowadzić do rozwoju nefropatii u 2–9% biorców, która jest przyczyną odrzucenia przeszczepu w 30–60% przypadkach [52]. Częstość występowania nefropatii związanej z zakażeniem BKV (BK virus nephropathy – BKVN) znacznie wzrosła w ostatnich latach, co może być związane z wprowadzaniem nowych leków immunosupresyjnych, wzrostem liczby zabiegów transplantacyjnych, a także rozwojem nowych technik diagnos­ tycznych [53]. Czynnikami ryzyka choroby mogą być: obecność przeciwciał anty-BKV u dawcy narządu, niezgodność antygenów tkankowych HLA dawcy oraz biorcy, starszy wiek pacjenta czy też płeć męska [23]. Do reaktywacji BKV dochodzi zazwyczaj w pierwszym roku po transplantacji. BKVN została najwcześniej zdiagnozowana już w 6 dniu, natomiast najpóźniej w 6 lat po przeszczepieniu [8]. Do tej pory nie ustalono, czy nefropatie BKV są wynikiem reaktywacji zakażeń persystentnych, czy też mogą być powodowane przez nadkażenia poliomawirusami pochodzącymi od dawcy narządu [34].

193

Nefropatia związana z zakażeniem poliomawirusem BK charakteryzuje się nekrozą kanalików proksymalnych nerki oraz denudacją błony podstawnej nabłonka, wynikających z zakażenia litycznego komórek nabłonkowych nerki [23]. Śródmiąższowe zapalenie nerki jest chorobą przewlekłą oraz skąpobjawową, dlatego też jest trudno odróżnialne od ostrego odrzucania przeszczepu. Ostateczną diagnozę można postawić dopiero po wykonaniu biopsji nerki oraz zaobserwowaniu efektu cyotpatycznego w  komórkach nabłonkowych kanalików nerkowych [9]. W trakcie rozwoju choroby możemy wyróżnić jej trzy progresywne stadia. Początkowo wirusowe DNA jest wykrywalne w moczu, następnie w surowicy oraz ostatecznie w nerkach pacjenta [6, 47]. Wiremia BKV wykrywalna jest w surowicy większości pacjentów z  aktywną nefropatią. Niektóre raporty wskazują na obecność wiremii oraz wirurii nawet u 77% pacjentów po przeszczepieniu nerki. W badaniach przeprowadzonych przez K o u k o u l a k i i wsp. wiremię BKV wykryto w 14%, natomiast wirurię BKV w 25% próbek pochodzących od 32 pacjentów po transplantacji nerki. Obserwacje te potwierdzają, że miejscem zapoczątkowania replikacji wirusa jest układ moczowy [27]. Pacjenci po przeszczepieniu nerki, u których doszło do rozwoju nefropatii, stanowią grupę ryzyka rozwoju choroby nowotworowej. Potrzebne są jednak dokładniejsze badania stwierdzające, czy proces nowotworzenia związany jest z zakażeniem poliomawirusami, czy też wynika  z immunosupresji [7]. 5. Krwotoczne zapalenie pęcherza Reaktywacja zakażenia poliomawirusem BK u  pacjentów po allogenicznym przeszczepieniu komórek krwiotwórczych (Hematopoietic Stem Cell Transplantation – HSCT) może powodować rozwój krwotocznego zapalenia pęcherza moczowego (Hemorrhagic cystitis –  HC) w 5–40% przypadków [20]. HC u pacjentów hematologicznych objawia się różnostopniową hematurią oraz bolesnym lub utrudnionym oddawaniem moczu [23]. Na podstawie ostrości hematurii krwotoczne zapalenie pęcherza można podzielić na cztery stopnie. Z pierwszym stopniem mamy do czynienia przy mikro-, a  ze stopniem drugim przy makrohematurii. Trzeci stopień choroby jest obserwowany przy hematurii z widocznymi skrzepami, natomiast stopień czwarty przy makrohematurii z widoczną skrzepliną oraz uszkodzeniem funkcji nerek. Przebieg kliniczny choroby może być łagodny, umiarkowany lub ciężki [31]. Zakażenie BKV zostało po raz pierwszy powiązane z krwotocznym zapaleniem pęcherza w roku 1976, gdy w )moczu pacjenta z HC w mikroskopii elektronowej wykryto cząstki wirusowe podobne do papowawirusów.

194

Sylwia Rynans, Tomasz Dzieciątkowski, Grażyna Młynarczyk

Już po 10 latach wiedziano, że wiruria BKV u pacjentów po HSCT jest powiązana z  rozwojem HC [32]. W badaniach przeprowadzonych przez L e u n g i wsp. dowiedziono, że poziom wirurii u pacjentów z HC jest znacznie wyższy niż w przypadku pacjentów po HSCT wykazujących wirurię, ale u których nie doszło do rozwoju HC. U pacjentów bez HC, poziom wirurii BKV po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych wynosił ok. 104–105 kopii/ml, natomiast u pacjentów chorych na krwotoczne zapalenie pęcherza – 108–1010 kopii/ml [30]. Krwotoczne zapalenie pęcherza moczowego u pacjentów po transplantacji komórek krwiotwórczych rozwija się głównie w późnym okresie poprzeszczepowym [14]. Jednakże do rozwoju HC może dojść nawet w kilka dni po transplantacji. W badaniach przeprowadzonych przez E r a r d i wsp., spośród 33% biorców allogenicznego przeszczepu komórek krwiotwórczych u których wykryto wiremię BKV, do rozwoju HC doszło u 43% pacjentów, średnio w 9 dniu po przeszczepieniu. Krwotoczne zapalenie pęcherza u tych osób skorelowane było m.in. ze zmniejszoną liczbą płytek krwi [16]. Potencjalnymi czynnikami ryzyka rozwoju krwotocznego zapalenia pęcherza związanego z reaktywacją zakażenia BKV są: rodzaj zastosowanych leków immunosupresyjnych, podtyp poliomawirusa BK, poziom wirurii, a także, zwłaszcza u pacjentów pediatrycznych, występowanie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (Graft-versus-host disease – GvHD) [14, 21]. 6. Postępująca wieloogniskowa leukoencefalopatia Poliomawirus JC jest czynnikiem etiologicznym zespołu klinicznego znanego jako postępująca wieloognis­ kowa leukoencefalopatia (PML). Jest on zaburzeniem powodującym demielinizację tkanki nerwowej central­ nego układu nerwowego oraz pojawieniem się oligodendrocytów o nieprawidłowej budowie, będących głównym miejscem aktywnego zakażenia JCV. PML charakteryzuje się niedowładem połowicznym, demencją lub otępieniem, zaburzeniami mowy oraz widzenia [26]. Objawy nasilają się w trakcie trwania choroby, która w ciągu 3 do 6 miesięcy może spowodować zgon pacjenta. Nie jest do końca jasne czy zakażenie mózgu spowodowane przez JCV wynika z reaktywacji wirusa, czy też jest zakażeniem de novo [23]. Według F o c o s i i wsp. zakażenie JCV u pacjentów hematologicznych po przeszczepie komórek krwiotwórczych jest znaczącym czynnikiem ryzyka rozwoju PML [18]. Postępująca wieloogniskowa leukencefalopatia rozwija się często u osób zakażonych HIV oraz pacjentów poddanych immunosupresji. Liczba pacjentów z HIV chorych na PML wynosi ok. 5%, aczkolwiek obecnie odsetek ten utrzymuje się na stałym poziomie na skutek wprowadzenia wysoce efektywnej terapii antyretrowiru-

sowej (Highly Active Antiretroviral Therapy – HAART) [6]. Związek pomiędzy PML indukowanym zakażeniem JCV, a zakażeniem HIV nie jest do końca jasny. Obniżenie poziomu oraz osłabienie funkcji limfocytów T CD4+ może aktywować replikację JCV. Zakażenie HIV może również powodować załamanie się bariery krew-mózg, co umożliwia penetrację do tkanek mózgu limfocytom B zakażonym poliomawirusem JC. Kolejną hipotezą jest produkcja licznych cytokin w centralnym układzie nerwowym w odpowiedzi na zakażenie HIV, która może zainicjować aktywację promotora genu regulatorowego JCV [23]. Zmiany demielinizacyjne mózgu obrazowane są przy udziale rezonansu magnetycznego, aczkolwiek ostateczne rozpoznanie PML wymaga przeprowadzenia bio­psji mózgu. W badaniach histopatologicznych stwierdza się ogniska demielinizacyjne w warstwie podkorowej istoty białej, naciek komórkami ezozynofilnymi, a także powiększone jądra komórek glejowych skąpowypustkowych oraz astrocytów. Rozpoznanie choroby można potwierdzić wykazując przy pomocy mikroskopii elektronowej obecność JCV w ciałkach wtrętowych wewnątrz oligodendrocytów [25]. 7. Stwardnienie rozsiane Poliomawirus JC ma również stwierdzoną unikalną zdolność do wiązania komórek glejowych. Właściwość ta, wraz z wysoką zakaźnością wirusa oraz jego zdolnością do wywoływania zakażeń persystentnych, skłoniła do postawienia hipotezy, iż wirus ten może powodować rozwój stwardnienia rozsianego [25]. Istnieje kilka sprzecznych raportów dotyczących wiremii JCV u  pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. Niektórzy autorzy podają, że wykryli poliomawirusa JC w  płynie mózgowo-rdzeniowym pobranym od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, inni z kolei wskazują na brak dowodów, iż zakażenia JCV związane są z rozwojem choroby [23]. 8. Choroby nowotworowe powodowane przez poliomawirusy ludzkie Ważną grupą schorzeń, które mogą powodować poliomawirusy ludzkie są choroby nowotworowe. JCV może prawdopodobnie mieć udział w powstawaniu nowotworów przewodu pokarmowego oraz guzów mózgu [26], natomiast MCV jest czynnikiem etiologicznym nowotworów komórek Merkela (Merkel Cell Carcinoma – MCC) [17]. Nefropatie BKV mogą być także znaczącym czynnikiem ryzyka rozwoju nowotworów [7]. Jak dotąd nie ustalono czy KIV oraz WUV mają właściwości onkogenne [56].

Zakażenia ludzkimi poliomawirusami osób poddanych immunosupresji

Obecność sekwencji antygenu T wirusa JC wykazano w licznych badaniach nad nowotworami przewodu pokarmowego, w tym raku przełyku, żołądka, jelita oraz okrężnicy [26]. Przypuszczalnie są dwa mechanizmy transformacji nowotworowej związanej z  zakażeniem poliomawirusem JC. Pierwszy z nich polega na uaktywnieniu się obecnego w przewodzie pokarmowym JCV w  przypadku pojawienia się zmian nowotworowych. Drugi mechanizm zakłada zapoczątkowanie nowotworzenia bezpośrednio przez JCV oraz związane z  tym uszkodzenie DNA ludzkiego przez duży antygen  T. W badaniu przeprowadzonym na 100 próbkach zmienionych nowotworowo fragmentów okrężnicy, sekwencje dużego antygenu T poliomawirusa JC stwierdzono w  56% przypadków. Podobną częstość detekcji JCV obserwuje się w innych badaniach nad występowaniem tego wirusa w  zmienionych nowotworowo tkankach przełyku czy też żołądka [26]. Szacuje się, że ok. 69% pacjentów z różnymi guzami mózgu zawiera sekwencje wczesnych genów JCV, co sugeruje udział wirusa w etiologii tego rodzaju nowotworów. W rozwoju guzów mózgu najprawdopodobniej uczestniczą agnoproteina oraz mały i duży antygen T poliomawirusa JC. Rola JCV w rozwoju guzów mózgu jest jednak kontrowersyjna. Niektórzy autorzy podają, że specyficzne sekwencje wirusa stwierdzono w ponad 40% przypadków badanych pacjentów; natomiast w innych badaniach częstość ta wynosi zaledwie kilka procent [26]. Nowotwór komórek Merkela występuje rzadko, ale jest jedną z najbardziej agresywnych postaci neuroektodermalnego raka skóry [56]. Rolę poliomawirusa komórek Merkela w rozwoju MCC opisali F e n g i wsp. [17]. Przeprowadzili oni badanie na próbkach pochodzą­ cych od 10 pacjentów chorych na MCC oraz od 84 pacjentów zgrupowanych w 2 grupy kontrolne. Pierwszą grupę kontrolną stanowiło 59 osób, od których pobrano

Rys. 2. Efekt cytopatyczny wywołany przez poliomawirusa BK w nerce przeszczepionej. Strzałki wskazują komórki, które przybrały rurkowaty kształt pod wpływem wirusa. Powiększenie mikroskopu x400 (badania własne)

195

różne próbki tkanek, w tym 9 próbek skóry. Druga grupa kontrolna skupiała 25 pacjentów nie wykazujących MCC, od których pobrano próbki zdrowej lub zmienionej nowotworowo skóry. Obecność sekwencji genomowych MCV stwierdzono u 8 z 10 pacjentów grupy badanej, natomiast w obu grupach kontrolnych zaledwie w 8% i 16% próbek. U 6, spośród 8 pacjentów z MCC zakażonych MCV, nastąpiła integracja wirusowego DNA do DNA komórek zmienionych nowotworowo, co sugeruje, że zakażenie oraz integracja MCV może powodować klonalną ekspansję komórek nowotworowych [17]. Obserwacje te zostały potwierdzone przez innych autorów, którzy w swych pracach wykazują zbliżoną częstość występowania zakażeń MCV u pacjentów z nowotworem komórek Merkela sięgającą ok. 80% [24]. Obecność MCV w zmienionych nowotworowo komórkach Merkela może wpływać na kliniczny przebieg choroby, gdyż zaobserwowano, ze pacjenci MCV-pozytywni żyją od 3 do 5 lat dłużej niż pacjenci MCV-negatywni [24]. 9. Diagnostyka zakażeń ludzkimi poliomawirusami Zważywszy na ciągły wzrost częstości zakażeń poliomawirusami ludzkimi potrzebne są skuteczne metody detekcji oraz monitorowania tych zakażeń. Do diagnostyki zakażeń BKV oraz JCV wykorzystuje się hodowle komórkowe, reakcje serologiczne, badanie cytologiczne osadów moczu, przezskórną biopsję cienkoigłową oraz metody biologii molekularnej [8]. Hodowle komórkowe stanowią tanią oraz łatwą metodą służącą do detekcji polymawirusa BK. Aczkolwiek, z powodu ograniczeń czasowych, technika ta wykorzys­ tywana jest niemal wyłącznie w badaniach naukowych [8]. Jak dotąd nie zidentyfikowano linii komórkowych wrażliwych na zakażenia WUV, KIV oraz MCV [11]. Przez wiele lat, „złotym standardem” w wykrywaniu zakażeń BKV było przeprowadzanie biopsji nerek oraz identyfikacja wtrętów wirusowych w komórkach epitelialnych kanalików nerkowych [43]. Zmiany w zakażonych komórkach epitelialnych mogą być potwierdzone przy zastosowaniu mikroskopii elektronowej. Analiza ta umożliwia dostrzeżenie wewnątrzkomórkowych, ułożonych równolegle gęsto upakowanych skupisk wirionówo  średnicy 40–45 nm [8]. Stwierdzenie akumula­ cji tysięcy cząsteczek wirusowych przed całkowitą lizą komórki potwierdza rolę efektu cytopatycznego w rozwoju nefropatii BKV po transplantacji nerki [10]. W diag­ nostyce postępującej leukencefalopatii wieloogniskowej należy przeprowadzić biopsję mózgu. Szacuje się, że czułość tej metody wynosi 64–96%, aczkolwiek w wielu przypadkach może ona powodować zgon pacjenta. Barwienie immunohistochemiczne tkanki wykonuje się przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi T poliomawirusa SV 40. Badanie histopatologiczne

196

Sylwia Rynans, Tomasz Dzieciątkowski, Grażyna Młynarczyk

potwierdza obecność ognisk demielinizacyjnych w warstwie podkorowej istoty białej. W mikroskopie elektronowym możemy dodatkowo zaobserwować obecność JCV w ciałkach inkluzyjnych oligoendrocytów [6]. Do metod serologicznych służących do wykrywania poliomawirusów możemy zaliczyć: test zahamowania hemaglutynacji, test immunoenzymatyczny ELISA, odczyn neutralizacji oraz oznaczenia multiparametryczne na platformie Luminex, będącej udoskonaleniem testu ELISA. Każda z wymienionych metod serologicznych posiada pewne ograniczenia, dlatego też ich porównywanie może być niewspółmierne. Preferowaną metodą serologiczną do detekcji zakażeń poliomawirusami ludzkimi są testy ELISA oraz ich modyfikacja [11]. Do detekcji przeciwciał w  teście ELISA wykorzystywane są rekombinowane antygeny VP1. Istnieją doniesienia o  reaktywności krzyżowej przeciwciał anty-WUV z przeciwciałami anty-KIV, anty-JCV oraz anty-BKV, aczkolwiek badania przeprowadzone przez N g u y e n i wsp. wykazały, że reaktywność ta jest minimalna i nie powoduje obniżenia czułości metody [42]. Oznaczenia multiparametryczne z użyciem platformy Luminex pozwalają na zwiększenie efektywności oraz jakości wykonywanych oznaczeń, przy jednoczesnym zmniejszeniu nakładu pracy oraz czasu w porównaniu do tradycyjnych testów immunoenzymatycznych. Przy zastosowaniu tej metody możliwe jest jednoczesna detekcja wielu antygenów w pojedynczym dołku płytki pomiarowej [11]. Przeprowadzenie badania cytologicznego moczu umoż­liwia identyfikację tzw. decoy cells, czyli wydalanych z moczem, apoptotycznych komórek epitelialnych nerki z charakterystycznymi wtrętami wirusowymi obecnymi w jądrze komórkowym [8]. Komórki te wykrywane są w osadzie moczu po zabarwieniu metodą Papanicolau. Cytologia jest szybką i prostą metodą pozwalającą wykluczyć nefropatię BKV gdy nie stwierdzamy obecności decoy cells w moczu. W przypadku pacjentów po przeszczepieniu nerki, obecność tych komórek może świadczyć o reaktywacji wirusa bez znacznego uszkodzenia kanalików nerkowych, jak i o rozwoju śródmiąższowego zapalenia nerki [8]. Z racji ogniskowej natury zakażeń poliomawirusami wynik biopsji może być fałszywie negatywny, gdyż fragment badanej tkanki może nie być reprezentatywny. Użycie metod mniej inwazyjnych, takich jak badanie cytologiczne czy mikroskopia elektronowa jest ograniczone przez szerokie rozpowszechnienie wirusa w populacji. Dlatego też coraz częściej w detekcji zakażeń poliomawirusami ludzkimi wykorzystywane są metody biologii molekularnej [43]. Łancuchowa reakcja polimerazy (PCR) umożliwia powielenie materiału genetycznego poliomawirusów dzięki obecności specyficznych starterów. DNA poliomawirusów możemy izolować z próbek pochodzących z różnych kompartmentów ciała. Do detekcji zakażeń

układu oddechowego możemy użyć próbek popłuczyn gardłowych lub popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych. DNA poliomawirusów możemy wykrywać również w  próbkach krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego, moczu czy też kału [5]. Czułość detekcji DNA JCV w  próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego przy zastosowaniu PCR sięga 72–92%, natomiast swoistość reakcji może wynosić od 92 do 100% [6]. Konwencjonalny PCR posiada jednak wiele ograniczeń. Główną wadą reakcji jest brak dokładnej informacji ilościowej. Związane jest to ze zmienną wydajnością amplifikacji pomiędzy kolejnymy cyklami, a także obecnością inhibitorów reakcji – zwłaszcza w jej ostatnich etapach. Te czynniki mogą prowadzić do uzyskania częstych wyników fałszywie negatywnych. Ograniczenia te pozwala przezwyciężyć zastosowanie PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR, qPCR) [35, 36]. Real-time PCR wymaga minimalnej ilości matrycy, a także pozwala określić dokładną liczbę kopii materiału genetycznego wirusa w  próbce. Real-time PCR pozwala zwiększyć czułość metody, minimalizuje ryzyko kontaminacji próbek oraz eliminuje etap poamplifikacyjnej obróbki powielonego produktu [15, 54]. Ze względu na szereg zalet, reakcja PCR w czasie rzeczywistym powinna być stosowana w rutynowej diagnostyce oraz monitorowaniu zakażeń wirusowych u biorców narządów [12]. Choć biopsje narządów są potrzebne do rozpoznania, ze względu na swoją inwazyjność nie są idealnym narzędziem do monitorowania infekcji. Zakażenia ogniskowe powodują, że wykrywamy poliomawirusy w mniejszej liczbie próbek klinicznych, mimo iż większość dorosłych posiada przeciwciała, świadczące o uprzedniej ekspozycji na BKV. Do monitorowania zakażeń poliomawirusami u biorców alogenicznych przeszczepów nerki racjonalne jest użycie moczu, gdyż reprezentuje on materiał z całej nerki [48]. Przy zastosowaniu techniki real-time PCR można wykryć zakażenia poliomawirusami przed wystąpie-

Rys. 3. Zalecany schemat monitorowania zakażeń poliomawirusami u pacjentów poddanych przeszczepieniu nerki [wg 9, 36]

Zakażenia ludzkimi poliomawirusami osób poddanych immunosupresji

niem jakichkolwiek objawów klinicznych. Ilościowe oznaczanie liczby kopii wirusa w próbce umożliwia monitorowanie postępu zakażenia oraz zaklasyfikowanie pacjenta do grupy ryzyka rozwoju nefropatii. Monitorowanie obecności wirusa, poprzez częste oznaczanie ilościowe jego kopii w materiale klinicznym, pozwala także badać skuteczność terapii przeciwwirusowej [43]. 10. Terapia zakażeń poliomawirusami W związku z rosnąca liczbą osób chorych na AIDS oraz wykonywanych zabiegów transplantacyjnych nabiera znaczenia problem zakażeń poliomawirusami ludzkimi oraz potrzeba skutecznej terapii tych zakażeń. Jednak jak dotąd nie ma formalnie zatwierdzonych leków przeciwko poliomawirusom ludzkim. W przypadku pacjentów poddanych zabiegom transplantacyjnym, obniża się dawki leków immunosupresyjnych, aby organizm sam mógł zwalczyć zakażenie. Stwarza to jednak ryzyko ostrego odrzucenia przeszczepu i nie jest efektywne u wszystkich osób. W niektórych badaniach klinicznych wykazano skuteczność cidofowiru, leflunomidu oraz fluorochinolonów zastosowanych u pacjentów ze śródmiąższowym zapaleniem nerki oraz krwotocznym zapaleniem pęcherza. Brak jest jednak konkretnych danych potwierdzających skuteczność tych preparatów [23]. Cidofowir jest analogiem nukleotydowym cytozyny, hamującym wirusową polimerazę DNA, który stosowany jest w terapii zakażeń wirusem cytomegalii (CMV) u pacjentów zakażonych HIV [3]. Jednakże mechanizm hamowania replikacji BKV przez ten lek nie jest znany, gdyż genom poliomawirusa BK nie koduje polimerazy DNA. Jego skuteczność przeciwwirusowa może być spowodowana zahamowaniem syntezy wirusowego DNA lub inhibicją domeny funkcjonalnej dużego antygenu T wirusa, posiadającego aktywność polimerazy DNA. Użycie cidofowiru może powodować istotną nefrotoksyczność, jakkolwiek istnieją doniesienia o jego skuteczności u pacjentów po przeszczepieniu nerki, u których rozwinęła się nefropatia oraz krwotoczne zapalenie pęcherza [14]. W badaniach przeprowadzonych przez S a v o n ę i wsp. podawano niskie dawki cidofowiru 19 pacjentom po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych u  których rozwinęło się krwotoczne zapalenie pęcherza moczowego. Poprawa stanu klinicznego nastąpiła u  84% pacjentów, natomiast obniżenie poziomu wirurii zaobserwowano zaledwie u 47% pacjentów [50]. Z kolei W u i wsp. wykazali brak skuteczności terapii cidofowirem u 14 pacjentów po transplantacji nerki u których doszło do rozwoju nefropatii BKV [55]. Leflunomid jest lekiem immunosupresyjnym zatwierdzonym w terapii reumatoidalnego zapalenia stawów. Jego aktywność immunosupresyjna wynika z hamo-

197

wania aktywności kinazy białkowej oraz biosyntezy pirymidyn. Lek ten wykazuje także pewną aktywność przeciwwirusową in vitro w stosunku do CMV, wirusa opryszczki (HSV) oraz BKV. Jak dotąd w literaturze nie pojawiły się żadne doniesienia o stosowaniu leflunomidu u chorych na krwotoczne zapalenie pęcherza powiązane z zakażeniem poliomawirusowi BK, aczkolwiek zważywszy na jego aktywność in vitro przeciw BKV, postulowane jest jego potencjalne użycie w leczeniu tego schorzenia [14]. Aktywność in vitro przeciw poliomawirusom BK wykazują również fluorochinolony, antybiotyki hamujące replikację komórek bakteryjnych poprzez inhibicje aktywności topoizomeraz typu II, w tym gyrazy oraz topoizomerazy IV. Uważa się, że inhibitory gyrazy DNA mogą hamować replikację BKV poprzez inhibicję aktywności helikazy dużego antygenu T poliomawirusa, pełniącej funkcje zbliżone do gyrazy DNA [14]. W nierandomizowanym badaniu klinicznym, po podaniu ciprofloksacyny zauważono spadek wirurii u pacjentów, aczkolwiek nie korelowało to z redukcją przypadków krwotocznego zapalenia pęcherza. Fluorochinolony powinny być wobec tego stosowane nie jako czynniki terapeutyczne, a raczej w celu profilaktyki zakażeń BKV [21]. Nie istnieją również skuteczne leki przeciwwirusowe, które byłyby skierowane przeciwko JCV. U pacjentów zakażonych HIV, u których rozwinęła się PML rozpoczęcie HAART lub optymalizacja terapii, obniża poziom replikacji JCV, natomiast u biorców narządów z PML należy ograniczyć lub przerwać podawanie leków immunosupresyjnych [6]. W przypadku nowo odkrytych poliomawirusów ludzkich ważne jest poznanie ich biologii, dróg transmisji oraz epidemiologii. Być może wówczas zostanie odkryty skuteczny lek przeciwwirusowy hamujący replikację KIV, WUV oraz MCV [23]. 11. Profilaktyka Jak dotąd nie wynaleziono skutecznej szczepionki chroniącej przed zakażeniami poliomawirusami ludzkimi [23]. Istnieje możliwość skonstruowania szczepionek na bazie niewywołujących zakażenia cząstek wirusopodobnych (VLP, virus-like particles), podobnie jak stało się to w przypadku papillomawirusów. VLP są strukturalnie podobne do naturalnych wirionów, ale nie mają zdolności wywoływania choroby, ze względu na brak zakaźnego DNA. W przypadku szczepionek skierowanych przeciwko poliomawirusom czynnikiem immunogennym byłoby tu prawdopodobnie główne białko kapsydu VP1, syntetyzowane in vitro z udziałem wektora bakulowirusowego w hodowli komórek owadów lub z wykorzystaniem drożdży [46].

198

Sylwia Rynans, Tomasz Dzieciątkowski, Grażyna Młynarczyk

U  pacjentów po przeszczepieniach nerek oraz komórek krwiotwórczych konieczna jest minimalizacja czynników ryzyka rozwoju chorób powodowanych przez poliomawirusy. Ważne jest jak najlepsze dopasowanie dawcy oraz biorcy, użycie mało toksycznych leków immunosupresyjnych, stałe monitorowanie wiremii oraz wirurii, zapobieganie rozwojowi GvHD, a  także natychmiastowa terapia w przypadku reaktywacji wirusa w okresie potransplantacyjnym [21]. 12. Podsumowanie Poliomawirusy ludzkie są szeroko rozpowszechnione na całym świecie i atakują ok. 80% populacji. Większość chorób powodowanych przez BKV oraz JCV dotyczy dzieci i ma łagodny przebieg. Podobnie jest w przypadku dorosłych pacjentów immunokompetentnych. W obu przypadkach poliomawirusy mogą powodować zakażenia persystentne w komórkach nerek, tkankach limfoidalnych czy też w komórkach układu nerwowego. U pacjentów poddanych immunosupresji może dojść do reaktywacji wirusów oraz rozwoju chorób takich jak krwotoczne zapalenie pęcherza, śródmiąższowe zapalenie nerki, postępująca leukencefalopatia wielo­ ogniskowa czy też stwardnienie rozsiane. Nowoodkryte poliomawirusy ludzkie KI i WU mogą powodować zakażenia układu oddechowego, natomiast MCV nowotworzenie w komórkach Merkela. Chociaż w ostatnich latach nastąpił rozwój metod diagnostycznych, ułatwiających identyfikacje zakażeń, nadal brakuje skutecznych form terapii przeciwwirusowej. Stosowane w badaniach klinicznych cidofowir czy tez leflunomid nie są formalnie zarejestrowanymi lekami. Ważne jest więc ograniczenie transmisji zakażeń oraz lepsze poznanie biologii, patogenezy oraz dróg rozprzestrzeniania się, zwłaszcza niedawno odkrytych, poliomawirusów ludzkich. Piśmiennictwo   1. Abedi Kiasari B., Vallely P.J., Corless C.E., Al-Hammadi M., Klapper P.E.: Age-related pattern of KI and WU polyomavirus infection. J. Clin. Virol. 43, 123–125 (2008)  2. Antonsson A., Green A.C., Mallitt K.A., O’Rourke P.K., Pawlita M., Waterboer T., Neale R.E.: Prevalence and stability of antibodies to the BK and JC polyomaviruses: a long-term longitudinal study of Australians. J. Gen. Virol. 91, 1849–1853 (2010)  3. Araya C.E., Lew J.F., Fennell R.S. 3rd, Neiberger R.E., Dharnidharka V.R.: Intermediate-dose cidofovir without probenecid in the treatment of BK virus allograft nephropathy. Pediatr. Transplant. 10, 32–37 (2006)   4. Bialasiewicz S., Whiley D.M., Lambert S.B., Gould A., Nissen M.D., Sloots T.P.: Development and evaluation of real-time PCR assays for the detection of the newly identified KI and WU polyomaviruses. J. Clin. Virol. 40, 9–14 (2007)  5. Bialasiewicz S., Whiley D.M., Lambert S.B., Nissen M.D., Sloots T.P.: Detection of BK, JC, WU, or KI polyomaviruses in

faecal, urine, blood, cerebrospinal fluid and respiratory samples. J. Clin. Virol. 45, 249–254 (2009)  6. Boothpur R., Brennan D.C.: Human polyoma viruses and disease with emphasis on clinical BK and JC. J. Clin. Virol. 47, 306–312 (2010)   7. Chen C.H, Wen M.C, Wang M., Lian J.D., Cheng C.H., Wu M.J., Yu T.M., Chuang Y.W., Chang D., Shu K.H.; High incidence of malignancy in polyomavirus-associated nephropathy in renal transplant recipients. Transplant. Proc. 42, 817–818 (2010)   8. Cimbaluk D., Pitelka L., Kluskens L., Gattuso P.: Update on human polyomavirus BK nephropathy. Diagn. Cytopathol. 37, 773–779 (2009)   9. Costa C., Bergallo M., Astegiano S., Terlizzi M.E., Sidoti F., Segoloni G.P., Cavallo R.: Monitoring of BK virus replication in the first year following renal transplantation. Nephrol. Dial. Transplant. 23, 3333–3336 (2008) 10. Costa C., Bergallo M., Sidoti F., Astegiano S., Terlizzi M.E., Mazzucco G., Segoloni G.P., Cavallo R.: Polyomaviruses BKand JC-DNA quantitation in kidney allograft biopsies. J. Clin. Virol. 44, 20–23 (2009) 11. Dalianis T., Ramqvist T., Andreasson K., Kean J.M., Garcea R.L.: KI, WU and Merkel cell polyomaviruses: a new era for human polyomavirus research. Semin. Cancer Biol. 19, 270–275 (2009) 12. Deback C., Géli J., Aït-Arkoub Z., Angleraud F., Gautheret-Dejean A., Agut H., Boutolleau D.: Use of the Roche LightCycler® 480 system in a routine laboratory setting for molecular diagnosis of opportunistic viral infections: Evaluation on whole blood specimens and proficiency panels. J. Virol. Methods, 159, 291–294 (2009) 13. Debiaggi M., Canducci F., Brerra R., Sampaolo M., Marinozzi M.C., Parea M., Arghittu M., Alessandrino E.P., Nava S., Nucleo E., Romero E., Clementi M.: Molecular epidemiology of KI and WU polyomaviruses in infants with acute respiratory disease and in adult hematopoietic stem cell transplant recipients. Med. Virol. 82, 153–156 (2010) 14. Dropulic L.K., Jones R.J.: Polyomavirus BK infection in blood and marrow transplant recipients. Bone Marrow Transplant. 41, 11–18 (2008) 15. Elfaitouri A., Hammarin A.L., Blomberg J.: Quantitative real-time PCR assay for detection of human polyomavirus infection. J. Virol. Methods, 135, 207–213 (2006) 16. Erard V., Storer B., Corey L., Nollkamper J., Huang M.L., Limaye A., Boeckh M.: BK virus infection in hematopoietic stem cell transplant recipients: frequency, risk factors, and association with postengraftment hemorrhagic cystitis. Clin. Infect. Dis. 39, 1861–1865 (2004) 17. Feng H., Shuda M., Chang Y., Moore P.S.: Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science, 319, 1096–1100 (2008) 18. Focosi D., Maggi F., Andreoli E., Lanini L., Ceccherini-Nelli L., Petrini M.: The role of bone marrow cells for JCV pathogenicity. J. Clin. Virol. 45, 230–231 (2009) 19. Frisque R.J., Bream G.L., Cannella M.T.: Human polyomavirus JC virus genome. J. Virol. 51, 458–469 (1984) 20. Giraud G., Priftakis P., Bogdanovic G., Remberger M., Dubrulle  M., Hau A., Gutmark R., Mattson J., Svahn B.M., Ringden O., Winiarski J., Ljungman P., Dalianis T.: BK-viruria and haemorrha­gic cystitis are more frequent in allogeneic haematopoietic stem cell transplant patients receiving full conditioning and unrelated-HLA-mismatched grafts. Bone Marrow Transplant. 41, 737–742 (2008) 21. Harkensee C., Vasdev N., Gennery A.R., Willetts I.E., Taylor C.: Prevention and management of BK-virus associated haemorrhagic cystitis in children following haematopoietic stem cell transplantation: a systematic review and evidence-based guidance for clinical management. Br. J. Haematol. 142, 717–731 (2008)

Zakażenia ludzkimi poliomawirusami osób poddanych immunosupresji

22. Jeffers L.K., Madden V., Webster-Cyriaque J.: BK virus has tropism for human salivary gland cells in vitro: implications for transmission. Virology, 394, 183–193 (2009) 23. Jiang M., Abend J.R., Johnson S.F., Imperiale M.J.: The role of polyomaviruses in human disease. Virology, 384, 266–273 (2009) 24. Johnson E.M.: Structural evaluation of new human polyomaviruses provides clues to pathobiology. Trends Microbiol. 18, 215–223 (2010) 25. Khalili K., White M.K.: Human demyelinating disease and the polyomavirus JCV. Mult. Scler. 12, 133–142 (2006) 26. Kmieciak D., Dębicki S.: Rola wirusa JC w patogenezie chorób nowotworowych i zaburzeń związanych z osłabieniem odporności. Post. Mikrobiol. 47, 5–14 (2008) 27. Koukoulaki M., Grispou E., Pistolas D., Balaska K., Apostolou T., Anagnostopoulou M., Tseleni-Kotsovili A., Hadjiconstantinou V., Paniara O., Saroglou G., Legakis N., Drakopoulos S.; Prospective monitoring of BK virus replication in renal transplant recipients. Transpl. Infect. Dis. 11, 1–10 (2009) 28. Krumbholz A., Bininda-Emonds O.R., Wutzler P., Zell R.: Evolution of four BK virus subtypes. Infec.t Genet. Evol. 8, 632–643 (2008) 29. Lam W.Y., Leung B.W., Chu I.M., Chan A.C., Ng H.K., Chan P.K.: Survey for the presence of BK, JC, KI, WU and Merkel cell polyomaviruses in human brain tissues. J. Clin. Virol. 48, 11–14 (2010) 30. Leung A.Y., Suen C.K., Lie A.K., Liang R.H., Yuen K.Y., Kwong Y.L.: Quantification of polyoma BK viruria in hemorr­ ha­gic cystitis complicating bone marrow transplantation. Blood, 98, 1971–1978 (2001) 31. Leung A.Y., Mak R., Lie A.K., Yuen K.Y., Cheng V.C., Liang R., Kwong Y.L.: Clinicopathological features and risk factors of clinically overt haemorrhagic cystitis complicating bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 29, 509–513 (2002) 32. Leung A.Y., Yuen K.Y., Kwong Y.L.: Polyoma BK virus and haemorrhagic cystitis in haematopoietic stem cell transplanta­tion: a changing paradigm. Bone Marrow Transplant. 36, 929–937 (2005) 33. Lundstig A., Dillner J.: Serological diagnosis of human polyo­ mavirus infection. Adv Exp. Med. Biol. 577, 96–101 (2006) 34. Matłosz B., Durlik M.: Śródmiąższowe zapalenie nerki przeszczepionej wywołane zakażeniem wirusem polyoma BK. Przegl. Epidemiol. 60, 133–140 (2006) 35. McNees A.L., White Z.S., Zanwar P., Vilchez R.A., Butel J.S.: Specific and quantitative detection of human polyomaviruses BKV, JCV, and SV40 by real time PCR. J. Clin. Virol. 34, 52–62 (2005) 36. Merlino C., Bergallo M., Giacchino F., Daniele R., Bollero C., Comune L., Segoloni G.P., Cavallo R.: Human polyomavirus BK monitoring by quantitative PCR in renal transplant recipients. Intervirology, 47, 41–47 (2004) 37. Miyamura T., Jikuya H., Soeda E., Yoshiike K.: Genomic structure of human polyoma virus JC: nucleotide sequence of the region containing replication origin and small-T-antigen gene. J. Virol. 45, 73–79 (1983) 38. Mourez T., Bergeron A., Ribaud P., Scieux C., de Latour R.P., Tazi A., Socié G., Simon F., LeGoff J.: Polyomaviruses KI and WU in immunocompromised patients with respiratory disease. Emerg. Infect. Dis. 15, 107–109 (2009) 39. Mueller A., Simon A., Gillen J., Schildgen V., Tillmann R.L., Reiter K., Schildgen O.: Polyomaviruses KI and WU in children with respiratory tract infection. Arch. Virol. 154, 1605–1608 (2009) 40. Neske F., Blessing K., Ullrich F., Pröttel A., Wolfgang Kreth H., Weissbrich B.: WU polyomavirus infection in children, Germany. Emerg. Infect. Dis. 14, 680–681 (2008)

199

41. Neu U., Stehle T., Atwood W.J.: The Polyomaviridae: Contributions of virus structure to our understanding of virus receptors and infectious entry. Virology, 384, 389–399 (2009) 42. Nguyen N.L., Le B.M., Wang D.: Serologic evidence of frequent human infection with WU and KI polyomaviruses. Emerg. Infect. Dis. 15, 1199–205 (2009) 43. Pang X.L., Doucette K., LeBlanc B., Cockfield S.M., Preiksaitis J.K.: Monitoring of polyomavirus BK virus viruria and viremia in renal allograft recipients by use of a quantitative real-time PCR assay: one-year prospective study. J. Clin. Microbiol. 45, 3568–3573 (2007) 44. Payungporn S., Chieochansin T., Thongmee C., Panjaworayan N., Samransamruajkit R., Theamboolers A., Poovorawan  Y.: Detection and discrimination of WU/KI polyomaviruses by real-time PCR with melting curve analysis. J. Virol. Methods, 153, 70–73 (2008) 45. Payungporn S., Chieochansin T., Thongmee C., Samransamruajkit R., Theamboolers A., Poovorawan Y.: Prevalence and molecular characterization of WU/KI polyomaviruses isolated from pediatric patients with respiratory disease in Thailand. Virus Res. 135, 230–236 (2008) 46. Ramqvist T, Dalianis T. Immunotherapeutic polyoma and human papilloma virus-like particles. Immunotherapy, 1, 303–312 (2009). 47. Randhawa P., Ho A., Shapiro R., Vats A., Swalsky P., Finkelstein  S., Uhrmacher J., Weck K.: Correlates of quantitative measurement of BK polyomavirus (BKV) DNA with clinical course of BKV infection in renal transplant patients. J. Clin. Microbiol. 42, 1176–1180 (2004) 48. Randhawa P., Shapiro R., Vats A.: Quantitation of DNA of polyomaviruses BK and JC in human kidneys. J. Infect. Dis. 192, 504–509 (2005) 49. Ren L., Gonzalez R., Xie Z., Zhang J., Liu C., Li J., Li Y., Wang Z., Kong X., Yao Y., Hu Y., Qian S., Geng R., Yang Y., Vernet G., Paranhos-Baccalà G., Jin Q., Shen K., Wang J.: WU and KI polyomavirus present in the respiratory tract of children, but not in immunocompetent adults. J. Clin. Virol. 43, 330–333 (2008) 50. Savona M.R., Newton D., Frame D., Levine J.E., Mineishi S., Kaul D.R.: Low-dose cidofovir treatment of BK virus-associated hemorrhagic cystitis in recipients of hematopoietic stem cell transplant. Bone Marrow Transplant. 39, 783–787 (2007) 51. Sharp C.P., Norja P., Anthony I., Bell J.E., Simmonds P.: Reactivation and mutation of newly discovered WU, KI, and Merkel cell carcinoma polyomaviruses in immunosuppressed indi­ viduals. J. Infect. Dis. 199, 398–404 (2009) 52. Smith T.F., Espy M.J., Mandrekar J., Jones M.F., Cockerill F.R., Patel R.: Quantitative real-time polymerase chain reaction for evaluating DNAemia due to cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, and BK virus in solid-organ transplant recipients. Clin. Infect. Dis. 45, 1056–1061 (2007) 53. Sung H., Choi B.H., Pyo Y.J., Kim M.N., Han D.J.: Quantitation of BK virus DNA for diagnosis of BK virus-associated nephro­ pathy in renal transplant recipients. J. Korean. Med. Sci. 23, 4–8 (2008) 54. Whiley D.M., Mackay I.M., Sloots T.P.: Detection and differentiation of human polyomaviruses JC and BK by LightCycler PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 4357–4361 (2001) 55. Wu S.W., Chang H.R., Lian J.D.: The effect of low-dose cidofovir on the long-term outcome of polyomavirus-associated nephropathy in renal transplant recipients. Nephrol. Dial. Transplant. 24, 1034–1038 (2009) 56. zur Hausen H.: Novel human polyomaviruses: re-emergence of a well known virus family as possible human carcinogens. Int. J. Cancer. 123, 247–150 (2008)

POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 3, 201–208 http://www.pm.microbiology.pl

PLAZMIDY I BAKTERIOFAGI WYSTĘPUJĄCE U BAKTERII SALMONELLA Bożena Dera-Tomaszewska*

Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Katedra Mikrobiologii, Zakład Mikrobiologii Molekularnej i Serologii, Krajowy Ośrodek Salmonella, ul. Do Studzienki 38, 80-227 Gdańsk Wpłynęło w maju 2010 r.

1. Wprowadzenie. 2. Pozachromosomowe elementy genetyczne bakterii Salmonella. 2.1. Plazmidy. 2.2. Bakteriofagi. 3. Podsumowanie Plasmids and bacteriophages harboured by Salmonella Abstract: The genomic era brings the opportunity to analyze more comprehensively the phylogenetic relationships between Salmonella species, the evolution of pathogenicity and the genetic variability within these microoragnisms. Vast amounts of information can potentially be obtained from the multiple Salmonella genome sequences now available. Genome information can be used to gain insight into the evolution of the genus Salmonella, to identify stable regions conserved between different Salmonella species and serovars, and to identify regions that appear to be specific for individual serovars. In addition to the pathogenicity islands of Salmonella, major variations between the genomes are found in the form of mobile genetic elements such as plasmids and bacteriophages. Salmonella often carry autonomously replicating plasmids, some of which can be transferred between bacteria by conjugation. Some of these plasmids are involved in virulence or harbour drug-resistance genes, while other are cryptic, with no ascribed function. One of the most surprising revelations of the recent Salmonella genome sequencing was the relatively high proportion of bacteriophage genes within the chromosome. The genome sequence comparisons of DNA from Salmonella Typhi and Salmonella Typhimurium revealed that genes from F-type plasmids and lambdoid-like phages are major points of diversity between these two Salmonella serovars. It is clear that the number and repertoire of plasmids and prophages represent a significant source of genetic variation, and may have played a crucial role in evolution and specialization of Salmonella. Plasmids and bacteriophages which are readily harboured by Salmonella microorganisms are discussed in detail in this paper. 1. Introduction. 2. Extrachromosomal genetic elements of Salmonella. 2.1. Plasmids. 2.2. Bacteriophages. 3. Summary Słowa kluczowe: bakteriofagi, ruchome elementy genetyczne, Salmonella, plazmidy Key words: bacteriophages, mobile genetic elements, Salmonella, plasmids

1. Wprowadzenie Przeprowadzone w ciągu ostatnich lat badania z zakresu genomiki, dostarczyły ogromną ilość informacji pozwalających uświadomić sobie, iż genomy bakteryjne są bardzo plastycznymi strukturami, ulegającymi wielu rearanżacjom. Olbrzymi wkład w generowanie ich zmienności mają ruchome elementy genetyczne, posiadające między innymi, zdolność przenoszenia informacji genetycznej pomiędzy komórkami nawet odległych filogenetycznie gatunków bakterii. Wśród nich, niezwykle istotną rolę odgrywają plazmidy i bakteriofagi. Prawie wszystkie geny występujące u bakterii znajdują się na chromosomie bakteryjnym. Kilka genów jest zlokalizowanych w małych, kolistych cząsteczkach DNA zwanych plazmidami (u pewnych bakterii stwierdzono także obecność plazmidów liniowych), występujących dodatkowo u bakterii oprócz chromosomowego DNA. Są to głównie geny, które są przydatne bakteriom, ale nie są niezbędne do normalnego wzrostu i podziału komórki. Ulegają one niezależnej replikacji. Istnieje wiele różnych plazmidów, między innymi: plazmidy

typu R (opornościowe), typu F (konigacyjne), plazmidy kolicynowe, degradacyjne i plazmidy wirulencji. Bakterie mogą posiadać jednocześnie kilka typów plazmidów. Jednak nie wszystkie rodzaje plazmidów mogą współistnieć w komórce bakteryjnej, o czym decyduje ich przynależność do określonej grupy niezgodności Inc (incompatibility), stanowiącej istotny element charakterystyki plazmidów. Plazmidy zgodne (compatible) należą do różnych grup niezgodności, a niezgodne (incompatible) – do tej samej grupy niezgodności. Istnieje wiele grup niezgodności plazmidów. Tylko dla plazmidów występujących u enterobakteri wyróżniono ich około 30 (opisuje się je literami alfabetu i czasami jeszcze dodatkowymi oznaczeniami). Aby plazmidy mogły występować w tej samej komórce bakteryjnej muszą być ze sobą zgodne, czyli muszą należeć do różnych grup niezgodności. Plazmidy – samodzielne, pozachromosomowe replikony [51], są naturalnymi wektorami, mogącymi znacznie zwiększać zasób informacji genetycznej bakteryjnego gospodarza [19], wpływając przez to na jego zdolności adaptacyjne. Niektóre plaz­midy integrują się z chromosomem bakteryjnym

*  Autor korespondencyjny: Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Katedra Mikro­ biologii, Zakład Mikrobiologii Molekularnej i Serologii, Krajowy Ośrodek Salmonella; ul. Do Studzienki 38, 80-227 Gdańsk; e-mail: [email protected]

202

Bożena Dera-Tomaszewska

i  ulegają kopiowaniu w tym samym czasie co chromosom gospodarza. Ta zintegrowana forma plazmidu zwanego episomem, może przejść wiele podziałów komórkowych zanim plazmid ponownie oddzieli się od chromosomu. Cechy kodowane przez geny o lokalizacji plazmidowej są bardzo różnorodne [3, 19, 46, 56, 68]. Jest ich niezwykle dużo, a wśród nich oporność na antybiotyki i inne leki bakteriobójcze, oporność na jony metali ciężkich, wytwarzanie antybiotyków i bakteriocyn, katabolizm toksycznych związków, zdolność do koniugacji, fermentacji laktozy, pigmentacji i inne właściwości. Geny umiejscowione na plazmidach mogą również warunkować patogenność bakterii względem człowieka i zwierząt [22, 26, 34, 42, 43, 49, 50, 60]. Należą do nich, między innym, geny kodujące zdolność patogenu do adhezji do powierzchni odpowiednich komórek u zakażonego gospodarza [7, 42, 43], penetracji do wnętrza komórki, zdolność do produkcji różnych toksyn [43], oporność na bakteriobójcze działanie czynników występujących w surowicy [18] i inne. Dobrze znany jest też udział plazmidów w interakcji bakterii z roślinami. Plazmidy odgrywają także istotną rolę w ewolucji organizmów prokariotycznych. Dynamicznie ewoluująca populacja bakteriofagów [37] ma również ogromny wpływ na biologię wielu organizmów i ewolucję bakterii [11, 14]. Niektóre fagi mogą występować w komórce bakteryjnego gospo­darza zarówno w formie plazmidowej, jak i zintegrowanej. Sposób przenoszenia genów bakteryjnych zależy od cyklu życiowego bakteriofaga. Większość bakteriofagów po zainfekowaniu komórki bakteryjnej jest zdolna wyłącznie do wywołania cyklu litycznego prowadzącego na ogół do lizy swojego gospodarza. Z  kolei w  cyklu lizogenicznym genom bakteriofagów występuje w stanie utajonym i nosi nazwę profaga. Większość fagów zdolnych do lizogenizacji występuje jako profagi w postaci zintegrowanej z chromosomem, a nie jako plazmidy. Zarówno aktywne profagi (kompletne, kodujące w  pełni funkcjonalne bakteriofagi zdolne do pełnego cyklu litycznego), jak i nieaktywne profagi (defektywne, kodujące mniej lub bardziej obszerne fragmenty bakteriofagów) znajdujące się w genomie bakteryjnym nadają gospodarzowi różne szczególne właściwości, a zjawisko to określa się mianem lizogennej konwersji [11]. Zdolność do lizogenizacji jest rozpowszechniona wśród wszystkich grup bakteriofagów DNA [38]. Wziąwszy pod uwagę fakt występowania w genomach wielu bakterii sekwencji profagów, stanowiących często nawet kilka procent całego genomu, wpływ bakteriofagów na bakterie jest ewidentny [14]. Plazmidy i bakteriofagi, to mobilne elementy genetyczne stanowiące również istotne źródło zmienności genomów bakterii Salmonella. Pełnią one bardzo ważną rolę w kształtowaniu nowych wariantów tych mikro­ organizmów.

2. Pozachromosomowe elementy genetyczne bakterii Salmonella Oprócz różnic w zakresie występowania wysp patogenności, genomy bakterii Escherichia coli i Salmonella oraz genomy różnych serowarów Salmonella różnią się również między sobą obecnością mobilnych elementów genetycznych takich jak plazmidy i bakteriofagi [8, 55, 60, 66, 73]. Wiele bakterii Salmonella zawiera autonomicznie replikujące się plazmidy. Są one zaangażowane w wirulencję tych drobnoustrojów lub noszą geny oporności na leki, chociaż są i takie, które nie posiadają żadnej zdefiniowanej funkcji. Niektóre plazmidy mogą być przekazywane pomiędzy bakteriami na drodze koniugacji. Analiza sekwencji genomów bakteryjnych wykazała również obecność wielu sekwencji profagowych, stanowiących w niektórych przypadkach aż 10–20% całości genomu. Obecność aktywnych, ale również i defektywnych profagów stwierdzono u większości badanych szczepów. Na przykład, spośród 173  przebadanych szczepów Salmonella Typhimurium, aż 136 zawierało profagi [14]. Badania prowadzone z  zastosowaniem takich metod jak hybrydyzacja DNA oraz analiza porównawcza sekwencji DNA genomów Salmonella Typhi i Salmonella Typhimurium wykazały, że to głównie zawartość genów pochodzących z plazmidów typu F i lambdoidalnych fagów decyduje o różnorod­ ności obserwowanej pomiędzy tymi serowarami [8, 23]. 2.1. Plazmidy Mapa genetyczna chromosomu Salmonella Typhimurium LT2 niewiele różni się od chromosomu E. coli K-12 [50]. Stopień zgodności sekwencji nukleotydowej pomiędzy odpowiadającymi sobie genami wynosi 80–85%. Aktywność niektórych genów bakterii Salmonella została zidentyfikowana dopiero po wcześniejszym ich odkryciu u E. coli. Plazmid koniugacyjny  F, charakterystyczny dla E. coli, może być przekazywany w  procesie koniugacji z E. coli do S. Typhimurium, a także do innych typów serologicznych Salmonella [6, 9, 47, 62]. Izolowano szczepy S. Typhimurium, posiadające plazmid F wbudowany do chromosomu; szczepy takie nazywane są, podobnie jak u E. coli, szczepami Hfr (high-frequency of recombination) [62]. Istnieje więc możliwość przekazywania z  wysoką częstotliwością genów chromosomowych ze szczepów Hfr S. Typhimurium do szczepów E. coli i odwrotnie. Na przykład geny chromosomowe odpowiedzialne za syntezę antygenów O, H czy Vi bakterii Salmonella, mogą być przekazywane w procesie koniugacji, wraz z plazmidem F, bakteriom z rodzaju Escherichia. Plazmidy bakterii Salmonella mogą kodować oporność na antybiotyki. Oporność pałeczek S. Typhi na niektóre antybiotyki ma związek z obecnością plazmidów

PLAZMIDY I BAKTERIOFAGI WYSTĘPUJĄCE U BAKTERII SALMONELLA

z grupy niezgodności IncHI. Okazuje się, że plazmidy z  tej grupy, niezależnie od geograficznej lokalizacji, wykazują wysoki stopień podobieństwa [65]. Determinanty oporności umiejscowione są razem i usytuowane w  różnych regionach ewolucyjnie zakonserwowanego DNA. Znaleziony u S. Typhi CT18 plazmid pHCM1, należący do grupy IncHI1 wykazuje znaczące podobieństwo do plazmidu R27 [57, 63, 71], wyizolowanego w Winchester w 1961 roku ze szczepu S. Typhimurium, który kodował jedynie oporność na tetracyklinę. Oba te plazmidy wyizolowano z różnych serowarów, na różnych kontynentach, w odstępie ponad 30 lat, a mimo to wykazują one 99% podobieństwa w zakresie sekwencji DNA. I chociaż obserwuje się pewne różnice pomiędzy plazmidami z grupy niezgodności IncH oraz okazjonalnie rejestruje również obecność plazmidów oporności z grup IncB, IncN, IncP, IncB/O [45] i IncF [52], to nie ulega wątpliwości, że plazmidy IncHI1, nadające oporność pałeczkom S. Typhi są ewolucyjnie konserwowane i  szybko rozpowszechniane w obrębie populacji tych bakterii. Udział R-plazmidów w generowaniu lekooporności u innych serowarów Salmonella jest również dobrze udokumentowany [16, 20, 21, 30, 31]. Inne plazmidy bakterii Salmonella kodują wytwarzanie bakteriocyn, niektóre cechy metaboliczne jak zdolność fermentacji laktozy czy sacharozy, a także mogą powodować zmiany faktorów antygenów somatycznych. P o p o f f i L e M i n o r [58] wykazali, iż faktor O:54 bakterii Salmonella jest determinowany obecnością plaz­midu wielkości 7,5 kpz. Utrata plazmidu oznacza utratę faktora. Faktor O:54 występuje u 15 serowarów Salmonella, uwzględnionych w tymczasowej grupie serologicznej O:54 schematu White’a-Kauffmanna-Le Minora (dokument referencyjny przeznaczony do identyfikacji serologicznej bakterii Salmonella) [29]. Część bakterii Salmonella zawiera duże plazmidy typu  F, wielkości od 50 do 90 kpz, kodujące niektóre cechy ich chorobotwórczości [60]. Występujące zwykle w  niewielkiej liczbie kopii, tak zwane plazmidy wirulencji (virulence plasmids) bakterii Salmonella zawierają ważne informacje genetyczne, które determinują ich właściwości patogenne. Plazmidy te są istotne dla namnażania się bakterii Salmonella w komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego stałocieplnych kręgowców. Obecność plazmidów wirulencji wykazano jedynie u kilku serowarów z podgatunku enterica, szczególnie u tych, które charakteryzują się znaczącą adaptacją do określonych organizmów (tzw. hostadapted serovars) i dlatego plazmidy te często określa się również mianem „serovar-specific plasmids” [60]. Są one potrzebne do wywoływania ogólnoustrojowych infekcji. Ich udział w przebiegu jelitowej postaci zakażeń Salmonella jest niejasny. Chociaż plazmidy wirulencji nie uczestniczą bezpośrednio w procesach patologicznych zachodzących w organizmie podczas infekcji, to

203

jako czynniki kontrolujące ekspresję niektórych właściwości patogennych zarazka, są pośrednimi wskaźnikami jego chorobotwórczości [53, 73]. Obecność różniących się wielkością plazmidów wirulencji typu F wykazano wśród wielu szczepów S. Typhimurium (90 kpz), S. Choleraesuis (50 kpz), S. Enteritidis (60 kpz), S. Dublin (80 kpz), S. Gallinarum (85 kpz), S. Gallinarum biowar Pullorum (85 kpz) i S. Abortusovis (50–67 kpz). Obecne były również w szczepach S. Johannesburg, S. Kottbus, S. Give, S. Newport oraz S. Derby. Co ciekawe, plazmidów tego typu (i  regionu spv) nie posiadają pałeczki Salmonella Typhi (wywołujące dur brzuszny), S. Paratyphi A i S. Paratyphi B (serowary odpowiedzialne za dury rzekome) oraz S. Sendai [60]. Wyjątek w tej grupie serowarów, patogennych wyłącznie dla człowieka (human-adapted serovars), stanowi S. Paratyphi  C, chociaż udział plazmidu wirulencji (54 kpz) w przebiegu uogólnionego zakażenia wywoływanego przez ten drobnoustrój jest nieznany. Znakomita większość plazmidów wirulencji może być przekazywana innym bakteriom, ale tylko niektóre z nich zachowały zdolności koniugacyjne [2]. M o n t e n e g r o i wsp. [54] w swoich badaniach wykazali, że większość plazmidów wirulencji jest wzajemnie ze sobą spokrewnionych. Posiadają one wspólny region wirulencji, wielkości ~8kpz DNA, zawierający geny spv (Salmonella plasmid virulence) [32], które u serowarów Salmonella z podgatunków salamae (II), arizonae (IIIa) i indica (VI) odnaleziono w chromosomowym DNA, co wskazuje na zachodzące rearanżacje materiału genetycznego. Plazmidy determinujące chorobotwórczość są niezbędne do ekspresji „pełnego” fenotypu wirulentnego in vivo. Na przykład, charaktery­ s­tyczna dla pałeczek S. Enteritidis skłonność do wywoływania i utrzymywania się zakażeń głównie u drobiu, jest zredukowana u szczepów pozbawionych plazmidu wirulencji [70]. Utrzymywanie się zakażeń u tego właśnie gospodarza, jak i wzmożona wirulencja względem tego gospodarza, może mieć związek z obecnością genów spv. Badania przeprowadzone na myszach dowiodły, że region wielkości ~8kpz, zawierający wszystkie geny spv (spvRABCD), może przywrócić wirulencję szczepom Salmonella Typhimurium nie posiadającym plazmidu wirulencji [32]. Co więcej, obecność tylko 2 genów spvB i spvC jest wystarczająca do uzyskania pełnej wirulencji do zakażania myszy przez szczep S. Typhimurium pozbawiony pozostałej części plazmidu [48], a serowary gatunku S. enterica zmutowane w obrębie genu spvR prezentowały znaczne osłabienie właściwości chorobotwórczych dla cieląt [44]. U S. Choleraesuis, S. Typhimurium, S. Dublin i pojawiających się ostatnio coraz liczniej, jednofazowych szczepów S. enterica o  wzorze antygenowym 4,[5],12:i:− (zwanych również U302), wykazano związek plazmidów wirulencji z genami oporności na antybiotyki [16, 30, 31]. Obecność tych ostatnich, jest

204

Bożena Dera-Tomaszewska

prawdopodobnie wynikiem rekombinacji plazmidów wirulencji z plazmidami kodującymi lekooporność. Niezwykły, zdolny do samodzielnego przenoszenia się plaz­ mid wirulencji pUO-StVR2, którego obecność wykazano u niektórych szczepów S. Typhimurium, posiada zarówno geny spv, jak i geny oporności na ampicylinę, chloramfenikol, streptomycynę, sulfonamidy i tetracyklinę [31]. Wykazano również, iż plazmidy wirulencji posiadają wyrafinowane systemy, które zapewniają im możliwość utrzymania się w populacji bakterii [35]. W  niektórych przypadkach, utrata plazmidu oznacza śmierć komórki gospodarza. Jednym z takich systemów jest tzw. system toksyna/antytoksyna (toxin/antitoxin system), określany również jako posegregacyjne zabijanie komórek bezplazmidowych (postsegregation killing), gwarantujący przeżywalność plazmidu w komórce bakteryjnej. Do F-plazmidowych genów należą także geny operonu pef [7], zawierające pełną informację genetyczną dotyczącą syntezy jednego z kilku rodzajów fimbrii (tzw. plasmid-encoded fimbriae) oraz gen rck, kodujący oporność na działanie komplementu [36]. Geny wykazujące podobieństwo do genów faeH i faeI, kodujących fimbrie E. coli K88, mogą wpływać na wirulencję S. Gallinarum. Obecność ich wykazano również w  plazmidach wirulencji występujących u  S. Dublin i  S. Gallinarum biowar Pullorum; nie znaleziono ich jednak w  plazmidach obecnych u  S. Typhimurium, S. Enteritidis czy S. Choleraesuis [61]. U pałeczek S. Typhimurium i S. Enteritidis zaobserwowano również pewną zależność pomiędzy obecnością plazmidu wirulencji i prezentowanym przez nie typem bakteriofagowym [73]. Typ bakteriofagowy pałeczek S. Typhimurium jest także determinowany przez niektóre plazmidy oporności [68]. Pozostałe plazmidy występujące u bakterii Salmonella to tzw. plazmidy kryptyczne (cryptic plasmids), czyli plazmidy bez określonej (jak do tej pory) funkcji, których obecność nie nadaje komórce żadnych szczególnych cech fenotypowych odróżniających ją od komórki bezplazmidowej [5, 40]. Należy do nich mały, liczący ~3 kpz plazmid pIMVS1 występujący u S. Typhimurium. Sugeruje się, iż może on odgrywać istotną rolę w patogenezie zakażeń u ludzi, nie posiada jednak żadnych genów charakterystycznych dla patogennego fenotypu. W tej grupie znajduje się także plazmid pHCM2, odkryty u S. Typhi CT18 w 1993 roku. Małe, kryptyczne plazmidy typu ColE1 (3–5,6 kpz) znaleziono również u  bakterii Salmonella Enteritidis. Jeden z  nich (plaz­ mid  pC) koduje system modyfikacji czynnej restrykcji, co mogłoby wyjaśniać wysoką oporność szczepów S. Enteritidis posiadających plazmid pC na zakażenia fagami i niezwykle rzadko prezentowaną przez ten serowar, plazmidowo kodowaną lekooporność [27]. Niektóre plazmidy bakterii Salmonella w pełni zsekwencjonowano. Należą do nich: plazmid lekoopor­

ności R27 (prototypowy plazmid Salmonella, wielkości 180 kpz, z grupy niezgodności IncHI1), dwa plazmidy pHCM1 (R-plazmid, ~200 kpz, grupa niezgodności IncHI1) i pHCM2 (funkcja nieznana, 106 kpz) występujące u S. Typhi CT18 [40, 57, 63, 71], plazmid wirulencji pSLT występujący u S. Typhimurium LT2 [50] oraz plaz­ mid wirulencji pKDSC50, wielkości 50 kpz, znaleziony u S. Choleraesuis [33]. Dostępne są również mapy genetyczne i dane dotyczące częściowej sekwencji innych plazmidów bakterii Salmonella, takich jak plazmid wirulencji, wielkości 60 kpz, występujący u S. Enteritidis [59]. 2.2. Bakteriofagi Do pozachromosomowych elementów genetycznych wzbogacających genom komórki bakteryjnej, należą również bakteriofagi, wirusy zdolne do infekowania bakterii, występujące także u pałeczek Salmonella [4, 8, 39, 41]. Bakteriofagi pośredniczące w transdukcji materiału genetycznego izolowano zarówno z zawartości jelit, jak i ze środowiska. Wiele bakteriofagów jest zdolnych do wejścia w stan zwany lizogenią (fagi lizogeniczne, czasem zwane łagodnymi) poprzez integrację z chromosomem bakteryjnego gospodarza (z wyjątkiem faga Mu). Ma to szczególne znaczenie w sytuacji gdy bakteriofag jest nosicielem dodatkowych genów (cargo genes), nie odgrywających żadnej roli w procesie proliferacji faga [10]. Obecność aktywnych i  nieaktywnych profagów w genomie gospodarza nadaje bakteriom różne szczególne właściwości. Znaczącą manifestacją tego stanu jest tzw. „lizogenna konwersja”, w  wyniku której, np.: niechorobotwórczy szczep bakteryjny może stać się szczepem patogennym na skutek nabycia dodatkowych determinant wirulencji zawartych w bakteriofagu [13]. Jedną z najbardziej nieoczekiwanych rewelacji, będącą wynikiem przeprowadzanych ostatnio badań porównawczych sekwencji genomów bakterii Salmonella, była stosunkowo duża zawartość genów fagowych, co wskazuje na istotny udział bakteriofagów w procesie ewolucji Salmonella [41, 50, 57, 67]. Znakomita większość (ponad 170) bakteriofagów powodujących zakażenia pałeczek Salmonella należy do rzędu Caudovirales, dużych wirusów, głównie lizogenicznych, o złożonej strukturze wirionu, charakteryzującej się posiadaniem ogonka, zawierających jako genom dwuniciowy, liniowy DNA (dsDNA). Te spośród nich, których genomy zostały całkowicie zsekwencjonowane przedstawiono w Tabeli I. Zakażenia bakterii Salmonella powodują również bakteriofagi nie posiadające ogonków, o helikalnej bądź izometrycznej strukturze, należące do czterech rodzin: Inoviridae (fagi ssDNA o helikalnym kapsydzie: C-2, I2-2, SF, tf-1, X-2), Leviv iridae (fagi ssRNA o izometrycznym kapsydzie: Iα, M, PRR1), Microviridae (fagi ssDNA o izometrycznym kapsydzie: φX174, 1φ7, 1φ1, 1φ3, 1φ9, φR) i Tectiviridae (fagi dsDNA o izometrycz-

PLAZMIDY I BAKTERIOFAGI WYSTĘPUJĄCE U BAKTERII SALMONELLA

205

Tabela I Bakteriofagi* występujące u bakterii Salmonella, których genomy zostały w pełni zsekwencjonowane [1, 15, 41, 74] Rząd

Rodzina

Caudovirales

1

Myoviridae 2

Rodzaj

Bakteriofag

wirusy podobne do faga P2

Fels-2, SopEφ, PSP3 oraz fag Felix O15

Siphoviridae3

wirusy podobne do faga λ Gifsy-1, Gifsy-2, Fels-1, ES18 wirusy podobne do faga P27 ST64B

Podoviridae4

wirusy podobne do faga T7 SP6 wirusy podobne do faga P22 ε34, P22, ST104, ST64T oraz fagi KS7 i ε155

*192 bakteriofagi (zarówno lityczne, jak i lizogeniczne) powodują zakażenia bakterii Salmonella; 176 spośród nich, to głównie lizogeniczne fagi należące do rzędu Caudovirales (w tym 44 z rodziny Myoviridae, 68 z rodziny Siphoviridae i 64 z rodziny Podoviridae) 1 duże fagi posiadające ogonki, zawierające jako genom dwuniciowy, liniowy DNA (dsDNA);   2 fagi posiadające kurczliwe ogonki (np.: fagi P2, Mu);  3 fagi posiadające długie, niekurczliwe ogonki (np.: fag λ);  4 fagi posiadające krótkie, niekurczliwe ogonki (np.: fagi T7, P22);   5 fagi Felix O1 oraz KS7 i ε15 spełniają taksonomiczne kryteria przynależności do rodziny odpowiednio Myoviridae i Podoviridae, jednak ze względu na brak podobieństwa do innych bakteriofagów z danej rodziny, nie należą do żadnego ze znanych rodzajów (określane są mianem „orphans”)

nym kapsydzie: PRD1, PR5), chociaż nie są to wirusy sensu stricto specyficzne dla Salmonella. Analiza profagów bakterii Salmonella opierała się głównie na wynikach sekwencjonowania materiału genetycznego szczepów S. Typhi CT18 i S. Typhimurium LT2. Bakteriofagowy DNA zawarty w obu genomach występował głównie w dwóch odmiennych formach. W postaci krótkich fragmentów (mniej niż 5 genów), które często kodowały również transpozazy (enzym katalizujący proces transpozycji) i które świadczą o mającym wcześniej miejsce zjawisku wycięcia bakteriofagowego DNA z DNA komórki bakteryjnego przodka. Drugi rodzaj bakteriofagowego DNA zawiera większe zespoły genów kodujące kompletne profagi lub obszerne ich fragmenty. W przypadku S. Typhi CT18 geny te stanowiły około 4% genomu bakteryjnego [57]. Genom S. Typhimurium LT2 zawiera aż sześć regionów DNA, reprezentujących zarówno większe fragmenty profagów, jak i niewielkie ich pozostałości. Dwa lambdoidalne (lambdoid-like) profagi Gifsy-1 i Gifsy-2 wpływają na wirulencję swojego bakteryjnego gospodarza. Pozbawienie bakterii S. Typhimurium profaga Gifsy-2 stukrotnie obniża ich wirulencję przy zakażaniu myszy [24, 25]. Do nie-fagowych genów wykrywanych w obrębie profaga Gifsy-2 należy gen sodCI, kodujący dysmutazę nadtlenkową (superoxide dismutase), mającą związek z przeżywalnością bakterii w makrofagach [64, 69]. Bakteriofag Gifsy-1 zawiera gen gipA, uczestniczący w procesie kolonizacji jelita cienkiego i gen sseI, kodujący białko efektorowe systemu sekrecji typu III, związanego z  wyspą patogenności 2 (SPI-2) [25]. Z kolei S. Typhi CT18 jest gospodarzem siedmiu regionów DNA pochodzenia bakteriofagowego, wykazujących silne podobieństwo do fagów z rodzin faga P2, P4, Lambda i faga Mu [67]. Badania porównawcze zawartości genów fagowych w szczepie S. Typhi CT18 i innych szczepach S. Typhi oraz innych serowarach Salmonella wskazują na ogromną różnorodność genów bakteriofagowych obecnych w genomach bakterii Salmonella warunku-

jącą znaczne zróżnicowanie pomiędzy serowarami Salmonella (inter-serovar variation), ale również w obrębie przedstawicieli tego samego serowaru. Niektóre z tych profagowych regionów były specyficzne dla szczepu S. Typhi CT18, co sugeruje „wewnątrzserowarową” zmienność (intra-serovar variation) zachodzącą w obrębie poszczególnych szczepów S. Typhi [67]. To podważa opinię na temat pałeczek S. Typhi powszechnie uznawanych za organizmy klonalnie spokrewnione („clonal” organisms). Owe różnice dotyczą na ogół regionów genomu skojarzonych z małymi wysepkami genowymi (gene islets), regionów znajdujących się w obrębie wysp patogenności i  w  bakteriofagach. Zatem chromosom S. Typhi może również posiadać pewne „plastyczne” regiony, spełniające rolę niestabilnego źródła genetycznego zróżnicowania w obrębie „highly clonal” populacji jaką stanowią pałeczki duru brzusznego. Regiony te zachwiały stabilność klonalnej ekspresji S. Typhi. Badania w dziedzinie typowania bakteriofagowego przyniosły wiele wniosków z zakresu lizogenii i dziedziczności oraz stały się podstawą interpretacji wyników lizotypii w dochodzeniach epidemiologicznych w przypadkach występowania zjawiska zmienności w obrębie tego samego typu bakteriofagowego [12, 17]. Fagi bakteryjne zdolne do lizogenizacji mogą również, w  wyniku lizogennej konwersji, modyfikować strukturę części O-antygenowej LPS bakterii Salmonella [39]. Bakteriofag P22 jest odpowiedzialny za zmianę typu wiązania pomiędzy glukozą i galaktozą w  podjednostce O-swoistego łańcucha LPS, z wiązania  1–4 na wiązanie 1–6, co w efekcie objawia się powstaniem nowego czynnika O:1 [28]. Pojawienie się determinanty antygenowej O:27, będącej efektem zmiany rodzaju wiązania pomiędzy monomerami, z  1–2 na wiązanie typu 1–6, uważane do tej pory za wynik lizogenizacji fagiem  φ27, w rzeczywistości jest modyfikacją uwarunkowaną obecnością genu wzyα(1–6) zlokalizowanego na chromosomie bakteryjnym, w  obrębie głównego zespołu genów odpowiedzialnych za antygen O (major

206

Bożena Dera-Tomaszewska

O-antigen gene cluster) [29, 72]. Fakt ten uwzględniono w najnowszej edycji schematu White’a-Kauffmanna-Le Minora rezygnując z podkreślenia przy prezentowaniu faktora  O:27 (faktory będące wynikiem lizogenizacji wyróżnia się w schemacie podkreśleniem) [29]. Fagi  ε15 oraz ε34 zmieniają O faktory w grupie O:3,10 (E1). Znacząca liczba, jak i  różnorodność profagów, których obecność wykazano w genomach pałeczek Salmonella, stanowi ważne źródło genetycznej zmienności i może odgrywać istotną rolę w ewolucji i specjalizacji tych bakterii. 3. Podsumowanie Genomy bakteryjne, są strukturami dynamicznymi, podlegającymi stałej ewolucji. Najważniejszym mechanizmem warunkującym ich ciągłą zmienność jest horyzontalny transfer genów, stanowiący główną siłę napędową ewolucji bakteryjnej, stwarzającą możliwość nabycia wielu genów w czasie jednego zdarzenia rekombinacyjnego. Jest ona szczególnie istotna dla bakterii patogennych, do których należą również pałeczki Salmonella. Rola jaką odgrywają w tym procesie ruchome elementy genetyczne, takie jak plazmidy i bakteriofagi, jest ogromna. Przenoszenie genów za pośrednictwem plazmidów i  bakteriofagów, to najczęś­ ciej transfer odbywający się w  obrębie gatunku, lecz możliwa jest również międzygatunkowa wymiana informacji genetycznej. Plazmidy są naturalnymi wektorami, mogącymi znacznie zwiększać zasób informacji genetycznej swojego bakteryjnego gospodarza. Pałeczki Salmonella, podobnie jak wiele innych bakterii, zawierają autonomicznie replikujące się plazmidy, które przede wszystkim uczestniczą w wirulencji tych drobnoustrojów lub noszą geny oporności na leki, chociaż izoluje się również tzw. plazmidy kryptyczne, czyli plazmidy bez określonej (jak do tej pory) funkcji. Do pozachromosomowych elementów genetycznych wzbogacających genomy bakterii Salmonella, należą również bakteriofagi. Obecność aktywnych i nieaktywnych profagów w genomie nadaje bakteriom Salmonella różne szczególne właściwości. Modyfikują one strukturę części O-antygenowej LPS, zmieniają faktory antygenów somatycznych, wpływają na wirulencję swojego bakteryjnego gospodarza, warunkują znaczne zróżnicowanie pomiędzy serowarami Salmonella i  wśród przedstawicieli tego samego serowaru. W wyniku przeprowadzanych ostatnio badań porównawczych sekwencji genomów pałeczek Salmonella, wykazano stosunkowo dużą zawartość genów fagowych, co wskazuje również na istotny udział bakteriofagów w procesie ewolucji tych drobnoustrojów. W niniejszej pracy opisano najważniejsze, poznane do tej pory plazmidy i bakteriofagi, które goszczą u bakterii Salmonella. Ich znacząca liczba i różnorodność stanowi

ważne źródło genetycznej zmienności pałeczek Salmonella oraz odgrywa istotną rolę w ewolucji i specjalizacji tych mikroorganizmów. Piśmiennictwo   1. Ackermann H.W.: Salmonella phages examined in the electron microscope (w) Salmonella. Methods and Protocols, red. A.  Schatten, A. Eisenstark, Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USA, 2007, s. 213−234   2. Ahmer B., Tran M., Heffron F.: The virulence plasmid of Salmonella typhimurium is self-transmissable. J. Bacteriol. 181, 1364−1368 (1999)   3. Anderson E.S., Threlfall E.J.: The characterization of plasmids in the enterobacteria. J. Hyg. Camb. 72, 471−487 (1974)   4. Anjum M.F.: Revealing the mosaic nature of Salmonella genomes using microarrays (w) Salmonella. Molecular biology and pathogenesis, red. M. Rhen, D. Maskell, P. Mastroeni, J. Threlfall, Horizon Bioscience, Norfolk UK, 2007, s. 169−190   5. Astill D.S., Manning P.A., Hauzenroeder M.W.: Characterization of the small cryptic plasmid, pIMVS1, of Salmonella enterica ser. Typhimurium. Plasmid, 30, 258−267 (1993)   6. Baron L.S., Carey W.F., Spilman W.M.: Characteristics of a high frequency of recombination (Hfr) strains of Salmonella typhosa compatible with Salmonella, Shigella, and Escherichia species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 45, 1752−1757 (1959)   7. Bäumler A.J., Tsolis R.M., Bowe F.A., Kusters J.G., Hoffmann S., Heffron F.: The pef fimbrial operon of Salmonella typhimurium mediates adhesion to murine small intestine and is necessary for fluid accumulation in the infant mouse. Infect. Immun. 64, 61−68 (1996)   8. Bishop A.L., Dougan G., Baker S.: The Salmonella genome: a global view (w) Salmonella infections. Clinical, immunological and molecular aspects, red. P. Mastroeni, D. Maskell, Cambridge University Press, Cambridge UK, 2006, s. 117−145   9. Boyd E.F., Hartl D.L.: Recent horizontal transmission of plas­ mids between natural populations of Escherchia coli and Salmonella enterica. J. Bacteriol. 179, 1622−1627 (1997) 10. Boyd E.F., Brüssow H.: Common themes among bacteriophage-encoded virulence factors and diversity among the bacteriophages involved. Trends Microbiol. 10, 521−529 (2002) 11. Brüssow H., Canchaya C., Hardt W-D.: Phages and the evolution of bacterial pathogens: from genomic rearrangements to lysogenic conversion. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 560−602 (2004) 12. Buczowski Z., Lachowicz K.: Obserwacje dotyczące zmien­ ności typów bakteriofagowych S. typhi. Med. Dośw. Mikrobiol. 5, 297−301 (1953) 13. Canchaya C., Fournous G., Chibani-Chennoufi S., Dillmann M.L., Brüssow H.: Phage as agents of lateral gene transfer. Curr. Opin. Microbiol. 6, 417−424 (2003) 14. Casjens S.: Prophages and bacterial genomics: what we have learned so far? Mol. Microbiol. 49, 277−300 (2003) 15. Casjens S.R., Gilcrease E.B., Winn-Slapley D.A, Schicklmaier P., Schmieger H., Pedulla M.L., Ford M.E., Houtz J.M., Hartfull  G.F., Hendrix R.W.: The generalized transducing Salmonella bacteriophage ES18: complete genome sequence and DNA packaging strategy. J. Bacteriol. 187, 1091−1104 (2005) 16. Chu C., Chiu C.H., Wu W.Y., Chu C.H., Lu T.P., Ou J.T.: Large drug resistance virulence plasmids of clinical isolates of Salmonella enterica serovar Choleraesuis. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2299−2303 (2001)

PLAZMIDY I BAKTERIOFAGI WYSTĘPUJĄCE U BAKTERII SALMONELLA

17. Chomiczewski J.: Badania nad typowaniem bakteriofagowym i biochemicznym Salmonella typhi. Zmienność obrazu typów bakteriofagowych w środowisku endemicznym. Med. Dośw. Mikrobiol. 13, 217−228 (1961) 18. Cirillo D.M., Heffernan E.J., Wu L., Harwood J., Fierer J., Guiney D.G.: Identification of a domain in Rck, a product of Salmonella typhimurium virulence plasmid, required for both serum resistance and cell invasion. Infect. Immun. 64, 2019−2023 (1996) 19. Cohen S.N.: Transposable genetic elements and plasmids evolution. Nature, 263, 731−738 (1976) 20. Cooke F.J., Wain J.: Antibiotic resistance in Salmonella infections (w) Salmonella infections. Clinical, immunological and molecular aspects, red. P. Mastroeni, D. Maskell, Cambridge University Press, Cambridge UK, 2006, s. 25−56 21. Cooke F.J., Threlfall J., Wain J.: Current trends in the spread and occurrence of human salmonellosis: molecular typing and emerging antibiotic resistance (w) Salmonella. Molecular biology and pathogenesis, red. M. Rhen, D. Maskell, P. Mastroeni, J. Threlfall, Horizon Bioscience, Norfolk UK, 2007, s. 1−29 22. Elwell L.P., Shipley P.L.: Plasmid-mediated factors associated with virulence of bacteria to animals. Ann. Rev. Microbiol. 34, 465−469 (1980) 23. Emmerth M., Goebel W., Miller S.I., Hueck C.J.: Genomic subtraction identifies Salmonella typhimurium prophages, F-related plasmid sequences, and novel fimbrial operon, stf, which are absent in Salmonella typhi. J. Bacteriol. 181, 5652−5661 (1999) 24. Figueroa-Bossi N., Bossi L.: Inducible prophages contribute to Salmonella virulence in mice. Mol. Microbiol. 33, 167−176 (1999) 25. Figueroa-Bossi N., Uzzau S., Maloriol D., Bossi L.: Variable assortment of prophages provides a transferable repertoire of pathogenic determinants in Salmonella. Mol. Microbiol. 39, 260−271 (2001) 26. Gemski P., Lazere J.R., Casey T.: Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependency of Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 27, 682−685 (1980) 27. Gregorova D., Pravcova M., Karpiskova R., Rychlik I.: Plazmid pC present in Salmonella enterica serovar Enteritidis PT14b strains encodes a restriction modification system. FEMS Microbiol. Lett. 214, 195−198 (2002) 28. Grimont P.A.D., Grimont F., Bouvet P.: Taxonomy of the genus Salmonella (w) Salmonella in domestic animals, red. C. Wray, A. Wray, CABI Publishing, New York USA, 2000, s. 1−17 29. Grimont P.A.D., Weill F-X.: Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 9th edition. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur, Paris, France, 2007 30. Guerra S., Soto S.M., Arguelles J.M., Mendoza M.C.: Multidrug resistance is mediated by large plasmids carrying a class 1 integron in the emergent Salmonella enterica serotype [4,5,12:i:-]. Antimicrob. Agents Chemiother. 45, 1305−1308 (2001) 31. Guerra B., Soto S., Helmuth R., Mendoga M.C.: Characterization of a self-transferable plasmid from Salmonella enterica serotype Typhimurium clinical isolates carrying two integron-borne gene cassettes together with virulence and drug resis­tance genes. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 2977−2981 (2002) 32. Guling P.A., Danbara H., Guiney D.G., Lax A.J., Norel F., Rhen M.: Molecular analysis of spv virulence genes of the Salmonella virulence plasmids. Mol. Microbiol. 7, 825−830 (1993) 33. Haneda T., Okada N., Nakazawa N., Kawakami T., Danbara H.: Complete DNA sequence and comparative analysis of the 50-kilobase virulence plasmid of Salmonella enterica serovar Choleraesuis. Infect. Immun. 69, 2612−2620 (2001)

207

34. Harris J.R., Wachsmuth J.K., Davis B.R., Cohen M.L.: Highmolecular-weight plasmid correlates with Escherichia coli enteroinvasiveness. Infect. Immun. 37, 1295−1298 (1982) 35. Hayes F.: Toxin-antitoxin: plasmid maintenance, programmed cell death, and cell cycle arrest. Science, 301, 1496−1499 (2003) 36. Heffernan E.J., Harwood J., Fierer J., Guiney D.: The Salmonella typhimurium virulence plasmid complement resistance gene rck is homologous to a family of virulence-related outer membrane protein genes including pagC and ail. J. Bacteriol. 174, 84−91 (1992) 37. Hendrix R.W., Lawrence J.G., Hatfull G.F., Caskjens S.: The origins and ongoing evolution of viruses. Trends Microbiol. 8, 504−507 (2000) 38. Hendrix R.W.: Bacteriophage genomics. Curr. Op. Microbiol. 6, 506−511 (2003) 39. Iino T., Ledeberg J.: Genetics of Salmonella (w) The world problem of salmonellosis, red. E. Van Oye, Dr. W. Junk Publishers, Hague, 1964, s. 111142 40. Kidgell C., Dougan G. i wsp.: Characterisation and distribution of a cryptic Salmonella typhi plasmid pHCM2. Plasmid, 47, 159−171 (2002) 41. Kropinski A.M., Sulakwelidze A., Konczy P., Poppe C.: Salmonella phages and prophages – Genomics and practical aspects (w) Salmonella. Methods and Protocols, red. A. Schatten, A. Eisenstark, Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USA, 2007, s. 133−175 42. Levine M.M., Nataro J.P., Karach H., Baldini M.M., Kaper J.B., Black R.E.: The diarrheal response of humans to some classic serotypes of enteropathogenic Escherichia coli dependent on a plasmid encoding an enteroadhesivenes factor. J. Infect. Dis. 152, 550−559 (1985) 43. Levine M.M.: Escherichia coli that cause a diarrhea: entero­toxi­ genic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohaemorrha­gic and enteroadherent. J. Infect. Dis. 155, 377−389 (1987) 44. Libby S.J., Adams L.G., Ficht T.A., Allen C.A., Whitford H.A., Buchmeier, S. Bossie N.A., Guiney D.G.: The spv genes on the Salmonella dublin virulence plasmid are required for severe enteritis and systemic infection in the natural host. Infect. Immun. 65, 1786−1792 (1997) 45. Ling J., Chau P.Y.: Plasmids mediating resistance to chloramphenicol, trimethoprim, and ampicilin in Salmonella typhi strains isolated in the Siutheast Asian region. J. Infect. Dis. 149, 652 (1984) 46. Ling J., Chau P.Y.: Incidence of plasmids in multiply-resistant salmonella isolates from diarrhoeal patients in Hong Kong from 1973–82. Epidem. Inf. 99, 307−321 (1987) 47. Mäkelä P.H.: Hfr males in Salmonella abony. Genetics, 48, 423−429 (1963) 48. Matusi H., Bacot C.M., Garlington W.A., Doyle T.J., Roberts S., Guling P.A.: Virulence plasmid-borne spvB i spvC genes can replace the 90-kilobase plasmid in conferring virulence to Salmonella enterica serovar Typhimurium in subcutaneously inoculated mice. J. Bacteriol. 183, 4652−4658 (2001) 49. Maurelli, A.T.: Regulation of virulence genes in Shigella. Mol. Biol. Med. 6, 425–432 (1989) 50. McClelland M., Wilson R.K. i wsp.: Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Nature, 413, 852−856 (2001) 51. Miljkovic-Selimovic B., Babic T., Kocic B., Stojanovic P., Rostic L., Dinic M.: Bacterial plasmids. AMM, 46, 61−65 (2007) 52. Mirza S., Kariuki S., Mamun K.Z., Beeching N.J., Hart C.A.: Analysis of plasmid and chromosomal DNA of multidrug-resistant Salmonella enterica serowar Typhi from Asia. J. Clin. Microbiol. 38, 1449−1452 (2000)

208

Bożena Dera-Tomaszewska

53. Molenda J.: Czynniki chorobotwórczości pałeczek Salmonella. Post. Mikrobiol. 30, 3−19 (1991) 54. Montenegro M.A., Morelli G., Helmuth R.: Heteroduplex analysis of Salmonella virulence plasmids and their prevalence in isolates of defined sources. Microb. Pathog. 11, 7−16 (1991) 55. Namimatsu T., Asai T., Osumi T., Imai Y., Sato S.: Prevalence of virulence plasmid in Salmonella Typhimurium isolates from pigs. J. Vet. Med. Sci. 68, 187−188 (2006) 56. O’Brien T.F., Ross D.G., Guzman M.A., Medeiros A.A., Hedges R.W., Bostein D.: Dissemination of an antibiotic resistance plas­ mid in hospital patient flora. Antimicrob. Agents Chemother. 17, 537−543 (1980) 57. Parkhill J., Barrell B.G. i wsp.: Complete genome sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serowar Typhi CT18. Nature, 413, 848−852 (2001) 58. Popoff, M.Y., Le Minor L.: Expression of antigenic factor O:54 is associated with the presence of a plasmid in Salmonella. Annales de l’Institut Pasteur/Microbiologie, 136B, 169−179 (1985) 59. Rodrígues-Peña J.M., Buisán M., Ibáñez M., Rotger R.: Genetic map of the virulence plasmid of Salmonella enteritidis and nucleotide sequence of its replicons. Gene, 188, 53−61 (1997) 60. Rotger R., Casadesús J.: The virulence plasmids of Salmonella. Internatl. Microbiol. 2, 177−184 (1999) 61. Rychlik, I., Lovell M.A., Barrow P.A.: The presence of genes homologous to the K88 genes faeH and faeI on the virulence plasmid of Salmonella gallinarum. FEMS Microbiol. Lett. 159, 255−260 (1998) 62. Sanderson K.E., Ross H., Ziegler L., Mäkelä P.H.: F+, Hfr, and F’ strains of Salmonella typhimurium and Salmonella abony. Bacteriol. Rev. 36, 608−637 (1972) 63. Scherburne C.K., Lawley T.D., Glimour M.W., Blattner F.R., Burland V., Grotbeck E., Rose D.J., Taylor D.E.: The complete DNA sequence and analysis of R27, a large IncHI plasmid from Salmonella typhi that is temperature sensitive for transfer. Nucleic Acids Res. 28, 2177−2186 (2000) 64. Slauch J.M.: Genetic analysis of bacterial pathogenesis (w) Molecular paradigms of infectious disease. A bacterial perspective, red. C.A. Nickerson, M.J. Schurr, Springer, New York USA, 2006, s. 1−33

65. Taylor D.E., Brose E.C.: Characterization of incompatibility group HI1 plasmids from Salmonella typhi by restriction endonuclease digestion and hybridization of DNA probes for Tn3, Tn9, and Tn10. Can. J. Microbiol. 31, 721−729 (1985) 66. Tezcan-Merdol D., Ygberg S.E., Rhen M.: The Salmonella enterica virulence plasmid and the spv gene cluster (w) Salmonella. Molecular biology and pathogenesis, red. M. Rhen, D. Maskell, P. Mastroeni, J. Threlfall, Horizon Bioscience, Norfolk UK, 2007, s. 89−103 67. Thomson N., Dougan G. i wsp.: The role of prophage-like elements in diversity of Salmonella enterica serovars. J. Mol. Biol. 339, 279−300 (2004) 68. Threlfall E.J., Ward L.R., Rowe B.: The use of phage typing and plasmid characterization in studying the epidemiology of multiresistant Salmonella typhiumurium (w) Antibiotics: methods of assessing antimicrobial resistance and the occurrence of resistance, red. A.P. Russell, L.B. Quesnel, Academic Press, London UK, 1983, s. 285−297 69. Uzzau S., Bossi L., Figuerosa-Bossi N.: Differential accumulation of Salmonella [Cu, Zn] superoxide dismutases SodCI and SodCII in intracellular bacteria: correlation with their relative contribution to pathogenicity. Mol. Microbiol. 46, 147−156 (2002) 70. Virlogeux-Payant I., Mopart F., Velge P., Bottreau E., Pardon P.: Low persistence of a large-plasmid-cured variant Salmonella enteritidis in ceca of chicks. Avian Dis. 47, 163−168 (2003) 71. Wain J., Dougan G. i wsp.: Molecular analysis of incHI1 antimicrobial resistance plasmids from Salmonella serovar Typhi strains associated with typhoid fever. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 2732−2739 (2003) 72. Wang L., Andrianopoulos K., Liu D., Popoff M., Reeves P.R.: Extensive variation on the O-antigen gene cluster within one Salmonella enterica serogroup reveals an unexpected complex history. J. Bacteriol. 184, 1669−1677 (2002) 73. Woodward M.J., McLaren I., Wray C.: Distribution of virulence plasmids within salmonellae. J. Gen. Microbiol. 135, 503−511 (1989) 74. Whichard J.M., Weigt L.A., Borris D.J., Li L.L., Zhang Q., Kapur V., Pierson F.W., Lingohr E.J., She Y.M., Kropinski A.M., Sriranganathan N.: Complete genomic sequence of bacteriophage Felix O1. Viruses, 2, 710−730 (2010)

Przeciwwirusowe peptydy kationowe człowieka i owadów

POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 3, 209–216 http://www.pm.microbiology.pl

Magdalena Mizerska-Dudka1*, Mariola Andrejko2, Martyna Kandefer-Szerszeń1 1

Zakład Wirusologii i Immunologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, UMCS, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin 2 Zakład Immunologii Bezkręgowców, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, UMCS Wpłynęło w marcu 2011 r.

1. Wstęp. 2. Ogólna charakterystyka peptydów przeciwdrobnoustrojowych. 3. Przeciwwirusowe peptydy kationowe. 3.1. Peptydy kationowe człowieka. 3.1.1. Defensyny. 3.1.2. Katelicydyny. 3.1.3. Laktoferyna i jej pochodna laktoferycyna. 3.2. Peptydy kationowe owadów. 3.2.1. Melityna i cekropina A. 3.2.2. Alloferon 1 i 2. 3.2.3. Mirystylowany peptyd Heliothis virescens. 4. Mechanizmy przeciwwirusowego działania peptydów kationowych. 5. Podsumowanie Antiviral cationic peptides in humans and insects Abstract: Antimicrobial peptides (AMP’s), sometimes called Host Defense Peptides (HDP’s), synthesised by various kind of living organisms (animals, plants, bacteria) present broad range of activities. Antibacterial, antifungal, antiparasitic, antiviral, anticancer or even contraceptive activities of AMP’s have been indicated. Important feature of these molecules is also immunomodulation, which enable synchronized function of immune system against infection or cancer cells. Properties and modes of action of AMP’s make them potential therapeutic agents against viruses. Among human AMP’s, antiviral activity was examined for defensins, LL-37 or lactoferrin/lactoferricin. Insects like other invertebrate organisms, are also good source of antiviral peptides, for example cecropin A, melittin, alloferon 1 and 2, myristoylated peptide of Heliothis virescens. These peptides inhibit binding of viruses to host cells, exert influence on viral envelope or host cells membranes. AMP’s can also modulate expression of both viral or host genes essential for viral replication. Important features of antiviral peptides are the regulation of the synthesis of cytokines and their receptors, and modulation of immunocompetent cell activity or chemotactic activity, called in general immunomodulation. 1. Introduction. 2. Basic features of antimicrobial peptides. 3. Antiviral cationic peptides. 3.1. Cationic peptides in humans. 3.1.1. Defensins. 3.1.2. Cathelicidins. 3.1.3. Lactoferrin and its derivative – lactoferricin. 3.2. Cationic peptides from insects. 3.2.1. Melittin and cecropin A. 3.2.2. Alloferon 1 and 2. 3.2.3. Miristoylated peptide of Heliothis virescens. 4. Mechanisms of action of antiviral cationic peptides. 5. Summary Słowa kluczowe: AMP’s człowieka, AMP’s owadów, immunomodulacja, przeciwwirusowe peptydy kationowe, odporność wrodzona Key words: antiviral cationic peptides, human AMP’s, immunomodulation; innate immunity, insect AMP’s

1. Wstęp Odkrycie przez A. Fleminga antybiotycznych właściwości pleśni kropidlaka Penicillum notatum, a następnie penicyliny i jej aktywności terapeutycznej przez H. Florey i B. Chain rozpoczęło złotą erę antybiotyków [25]. Jednak powszechne i często nieprawidłowe stosowanie leków spowodowało pojawianie się antybiotykooporności wśród mikroorganizmów. Obecnie można zaobserwować pewnego rodzaju wyścig pomiędzy naukowcami poszukującymi nowych, bardziej skutecznych antybiotyków, a mikroorganizmami rozwijającymi nowe mechanizmy antybiotykooporności. Dlatego zwrócono uwagę na związki przeciwdrobnoustrojowe, w tym peptydy kationowe, zaangażowane we wrodzone mechanizmy odpowiedzi immunologicznej zarówno zwierząt (kręgowców i bezkręgowców), jak i  roślin. Stwierdzono również, że bakterie, głównie Gram-dodatnie pałeczki fermentacji mlekowej z rodzaju Lactobacillus, są zdolne do wytwarzania przeciwdrobnoustrojowych peptydów – bakteriocyn (AMP’s – Antimicrobial

Peptides) [33, 44, 49]. Badania dowiodły, że AMP’s poza działaniem przeciwdrobnoustrojowym (przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, Gram-ujemnym, grzybom), wykazują również działanie przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe, przeciwpasożytnicze i/lub antykoncepcyjne [44, 48, 50]. Ważną cechą peptydów kationowych jest działanie immunomodulujące, warunkujące koordynację całego układu immunologicznego gospodarza, pozwalające na skuteczną eliminację czynników patogennych lub komórek nowotworowych. W  celu podkreślenia tej funkcji, peptydy kationowe są również nazywane peptydami odpornościowymi (Host Defense Peptides – HDP) [17, 20, 27, 31]. Obecnie prowadzone są badania nad uzyskaniem syntetycznych i modyfikowanych pochodnych na bazie naturalnie występujących AMP’s (LL-37), charakteryzujących się niewrażliwością na działanie proteaz, brakiem toksyczności, zdolnością do hamowania stanu zapalnego poprzez efektywniejsze wiązanie LPS (lipopolisacharydu) lub LTA (kwasu lipotejchojowego) oraz większą aktywnością przeciwdrobno­ustrojową [37]. Ogromnym problemem w medycy-

*Autor korespondencyjny: Zakład Wirusologii i Immunologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, UMCS; ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin; tel. (081) 537 59 42; e-mail: [email protected]

210

Magdalena Mizerska-Dudka, Mariola Andrejko, Martyna Kandefer-Szerszeń

nie obok antybiotykooporności bakterii i grzybów jest dostępność związków przeciwwirusowych, skutecznych wobec zagrażających życiu wirusów, np. HIV (Human Immunodeficiency Virus), HBV (Hepatitis B Virus) i HCV (Hepatitis C Virus). Właściwości oraz mechanizm działania peptydów kationowych skłoniły wielu badaczy do poszukiwania tych związków wśród AMP’s. 2. Ogólna charakterystyka peptydów przeciwdrobnoustrojowych Na podstawie informacji umieszczonych w bazie danych Antimicrobial Peptides Database, do grudnia 2010, u organizmów prokariotycznych i eukariotycznych opisano 1670 peptydów przeciwdrobnoustrojowych [24]. Do AMP’s zaliczono peptydy zbudowane z 12–50 aminokwasów i posiadające masę cząsteczkową 3–10 kDa, rzadko powyżej 20 kDa, których cechą charakterystyczną jest obecność 2–9 ładunków dodatnich. Obecnie do przeciwdrobnoustrojowych i odpornoś­ ciowych AMP’s włączono także polipeptydy i białka o masie cząsteczkowej znacznie większej od klasycznych AMP’s oraz peptydy o charakterze anionowym [39, 60]. Obecność dodatniego ładunku w cząsteczkach AMP’s związana jest z brakiem lub niewielką ilością aminokwasów kwaśnych (Glu lub Asp) oraz dużą aminokwasów zasadowych (Arg, Lys, His). Aminokwasy hydrofobowe stanowią 30–50% składu aminokwasowego AMP’s [20]. Na podstawie sekwencji aminokwasowej oraz struktury drugorzędowej, określonej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Nuclear Magnetic Resonance – NMR), AMP’s można zaliczyć do następujących klas [44]: • liniowych, α-helikalnych peptydów; • peptydów o strukturze stabilizowanej mostkami dwusiarczkowymi, zawierających w cząsteczce kom­binację układu α-helisy i β-kartki, trzy antyrów-

nolegle ułożone struktury β-kartki lub strukturę szpilki do włosów zbudowaną z motywu β-kartki; • peptydów zawierających znaczną ilość aminokwasu jednego typu, np. glicyny i/lub proliny; • peptydów zawierających rzadkie, modyfikowane aminokwasy. Podstawową właściwością peptydów przeciwdrobnoustrojowych, warunkującą zdolność niszczenia komórek drobnoustrojów i komórek nowotworowych jest posiadanie dodatniego ładunku oraz właściwości amfipatycznych. Dzięki temu peptydy kationowe wiążą się z ujemnie naładowaną powierzchnią komórki docelowej [23]. W przypadku komórek bakterii Gram-ujemnych AMP’s oddziałują z LPS, a w przypadku Gram-dodatnich z kwasem tejchojowym i peptydoglikanem (PG), wypierając jony dwuwartościowe. Umożliwia to wiązanie się z ujemnie naładowanymi lipidami, występującymi po zewnętrznej stronie błony komórkowej, tj. z fosfatydyloglicerolem, kardiolipiną, czy fosfatydyloseryną [21]. Peptydy kationowe wykazują również działanie przeciwnowotworowe, wiążąc się z ujemnie naładowanymi lipidami w błonie komórek nowotworowych [23]. Mechanizm działania peptydów kationowych polega na dezintegracji błony komórkowej, poprzez formowanie w niej kanałów, depolaryzację lub fragmentację, w efekcie prowadząc do śmierci komórki. Na podstawie sposobu oddziaływania peptydów z błoną komórkową oraz mechanizmu jej niszczenia wyróżniamy kilka modeli oddziaływania AMP’s z błoną komórki docelowej: model „dywanowy”; „klepek beczki”; „porów toroidalnych” oraz model nawiązujący do działania detergentów [23]. Według modelu „dywanowego” peptydy układają się na powierzchni błony komórkowej, równolegle do jej płaszczyzny. Po osiągnięciu określonego stężenia progowego, wykazują właściwości podobne do detergentów, co prowadzi do powstawania w błonie porów i jej fragmentacji w wyniku formowania miceli. Natomiast model „klepek beczki” sugeruje, że peptydy

Rys. 1. Rola peptydów przeciwdrobnoustrojowych w regulacji odpowiedzi immunologicznej ssaków na przykładzie defensyn i LL-37 [8, 18, 31]

Przeciwwirusowe peptydy kationowe człowieka i owadów

wbudowują się w błonę komórkową prostopadle do jej płaszczyzny, ściśle przylegając do siebie w ten sposób, że ich hydrofilne regiony skierowane są do światła formowanego kanału, natomiast regiony hydrofobowe oddziałują z  dwuwarstwą lipidową. Również model „porów toroidalnych” zakłada formowanie porów przez AMP’s w  błonie komórki docelowej, z tym że hydrofilne regiony peptydów asocjują z resztami fosfolipidowymi lipidów błony, natomiast regiony hydrofobowe z lipidami. W powstających porach błona komórkowa wyściela wnętrze porów [27]. Wykazano, że niektóre AMP’s mogą prowadzić do śmierci komórki docelowej poprzez hamowanie syntezy białek, składników ściany komórkowej, hamowanie aktywności enzymów czy hamowanie syntezy DNA lub RNA [23, 27, 30, 39, 42]. Badania wykazały, że niektóre z peptydów przeciwdrobnoustrojowych charakteryzują się słabą aktywnoś­ cią bakteriobójczą, a ich główną funkcją jest immunomodulacja, umożliwiająca zsynchronizowane działania całego układu odpornościowego, w celu zwalczenia zakażenia lub eliminacji komórek nowotworowych. Aktywują one wrodzone mechanizmy odpowiedzi immunologicznej, regulują stan zapalny, stymulują gojenie ran i inicjują odporność nabytą [31]. 3. Przeciwwirusowe peptydy kationowe Większość obecnie znanych AMP’s posiada aktywność przeciwbakteryjną i/lub przeciwgrzybową. Coraz większe zainteresowanie budzą jednak peptydy o działaniu przeciwwirusowym. Na podstawie bazy danych APD takie działanie przypisuje się obecnie 103 AMP’s. Wśród nich dużą grupę stanowią peptydy kationowe ssaków i owadów [24]. 3.1. Peptydy kationowe człowieka 3.1.1. Defensyny Ssacze defensyny są to nieglikozylowane peptydy kationowe o masie cząsteczkowej 3,5–6 kDa, zróżnicowanej sekwencji aminokwasowej i konserwatywnych cysteinach tworzących mostki dwusiarczkowe stabilizujące strukturę cząsteczki. U człowieka wyróżniono dwie klasy defensyn: α-defensyny i β-defensyny [14, 17]. α-defensyny posiadają mostki dwusiarczkowe utworzone pomiędzy cysteinami w pozycji 1 i 6, 2 i 4 oraz 3 i 5. Należą do nich HNP-1, 2, 3, 4 (Human Neutrophil Peptides) oraz HD5 i HD6 (Human Defensins). W β-defensynach mostki dwusiarczkowe są formowane pomiędzy cysternami w pozycji 1–5, 2–4 i 3–6. U człowieka zidentyfikowano sześć β-defensyn, hBD-1 do 6 (human β Defensins) [17]. Defensyny wytwarzane są w postaci nieaktywnych propeptydów, ulegających aktywacji na drodze proteolizy. α-defensyny są syntetyzowane konstytutywnie i magazynowane w granulach neu-

211

trofilów, komórkach Paneth’a, wytwarzane są również przez monocyty/makrofagi i komórki NK. Natomiast β-defensyny są syntetytyzowane po indukcji, np. LPS lub cytokinami (INF-γ, TNF, IL-1β) przez keratynocyty i komórki nabłonkowe błon śluzowych układu oddechowego, pokarmowego, moczowego i rozrodczego [14, 31]. 3.1.2. Katelicydyny Katelicydyny są peptydami powstającymi z białka prekursorowego, zawierającego na N-końcu wysoce konserwatywną sekwencję sygnałową i proregion podobny do katelin, inhibitorów katepsyny L [32]. U człowieka pojedynczy gen camp koduje nieaktywne białko prekursorowe o masie cząsteczkowej ok. 18  kDa, zwane hCAP-18. Cząsteczka białka prekursorowego jest stabilizowana dwoma mostkami dwusiarczkowymi. Białko prekursorowe jest magazynowane w granulach neutro­ filów, NK i komórek tucznych. Również komórki nabłonkowe skóry, płuc, jelit, gruczołów mlecznych wytwarzają i uwalniają hCAP18. W  surowicy krwi stwierdzono obecność hCAP18, związanego z  lipoproteinami. W wyniku ograniczonej proteolizy z prekursorowego białka powstaje aktywny peptyd – LL-37. W jego uwalnianiu uczestniczy proteaza serynowa kalikreina (z keratynocytów) lub proteinaza 3 z neutrofilów. W przypadku LL-37 powstającego w skórze, peptyd ten może ulegać dalszej obróbce z udziałem m.in. proteaz wytwarzanych przez mikroflorę do pochodnych o różnorodnych funkcjach. Nazwa LL-37 dotyczy dojrzałego AMP’s. Zbudowany jest z 37 aminokwasów, z czego dwa pierwsze to leucyny. Peptyd ten, bogaty w lizynę i argininę, należy do liniowych, α-helikalnych AMP’s [14, 17, 31, 32]. LL-37 został opisany jako peptyd przeciwbakteryjny, ale o małej aktywności. Dopiero wysokie stężenie peptydu lub obniżona siła jonowa środowiska i zawartość jonów dwuwartościowych, wpływa na wzrost aktywności przeciwbakteryjnej. Natomiast jego główną rolą jest udział w regulacji odpowiedzi immunologicznej oraz działanie przeciwzapalne [32]. 3.1.3. Laktoferyna i jej pochodna laktoferycyna Laktoferyna jest glikoproteiną o masie cząst. 80 kDa, wiążącą Fe3+ i wytwarzaną przez neutrofile. W dużych ilościach występuje np. w mleku, ślinie, spermie, łzach oraz w wydzielinie śluzowo-surowiczej okrężnicy. Jej właściwości przeciwdrobnoustrojowe determinuje zdolność wiązania jonów żelaza [3]. Pochodną laktoferyny o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych i immunomodulujących jest laktoferycyna. In vivo powstaje ona w przewodzie pokarmowym na drodze proteolitycznego odcięcia (z  udziałem pepsyny) N-końca laktoferyny. Ludzka laktoferycyna, zbudowana z 49 aminokwasów jest stabilizowana przez dwa mostki dwusiarczkowe. Laktoferycyna ma właściwości amfipatyczne warunkujące jej właściwości przeciwdrobnoustrojowe [36].

212

Magdalena Mizerska-Dudka, Mariola Andrejko, Martyna Kandefer-Szerszeń

3.2. Peptydy kationowe owadów Zainteresowanie peptydami przeciwdrobnoustrojowymi bezkręgowców, a szczególnie owadów, rozpoczęło się w 1980 roku od izolacji cekropin z immunizowanych poczwarek Hyalophora cecropia [52]. Od tego momentu opisano wiele peptydów u różnych przedstawicieli tej gromady. U Drosophila melanogaster, najlepiej zbadanego gatunku owada stwierdzono obecność 20 genów kodujących 8 rodzin AMP’s (większość występuje w postaci kilku izoform): andropin, attacyn, cekropin, defensyn, dipterycyn, drosomycyn, drosocyn, mecznikowin [26, 54]. W ostatnich latach opisano 12 peptydów otrzymanych z hemolimfy gąsienic Galleria mellonella immunizowanych żywymi komórkami bakterii Gram-ujemnej E. coli i/lub Gram-dodatniej Micrococcus luteus, tj. Gm peptyd bogaty w prolinę 1 i 2, Gm anionowy peptyd 1 i 2, defensyna Galleria (galiomycyna), Gm peptyd podobny do defensyn (gallerimycyna), Gm apolipoforycyna, Gm peptyd podobny do cekropiny D oraz 4 peptydy podobne do moricyny A1 Bombyx mori [7, 12]. Głównym miejscem syntezy AMP’s owadów jest ciało tłuszczowe, a w mniejszym stopniu hemocyty i komórki nabłonkowe. Wydzielane do hemolimfy, współdziałają ze sobą oraz innymi czynnikami mechanizmów systemowej odpowiedzi immunologicznej. Z  kolei wytwarzane przez nabłonki peptydy uczestniczą w lokalnych mechanizmach odpowiedzi immunologicznej [16, 22, 54]. Istnieją doniesienia o przeciwwirusowym działaniu niektórych peptydów kationowych owadów. Mechanizm działania przeciwwirusowego został zbadany m. in. dla melityny, cekropiny A, alloferonu 1 i 2 oraz mirystylo­wa-­ nego peptydu wyizolowanego z Heliothis virescens [58]. 3.2.1.  Melityna i cekropina A Melityna i cekropina A należą do klasy α-helikalnych peptydów przeciwdrobnoustrojowych owadów. Cekropiny były pierwszymi peptydami opisanymi u zwierząt [52]. Zbudowane są z  29–42 aminokwasów i pozbawione cysteiny i  metioniny [9]. Cechą charakterys­ tyczną większości cekropin jest obecność tryptofanu jako pierwszego lub drugiego aminokwasu N-końca oraz obecność na C-końcu grupy amidowej. Liniowe, α-helikalne AMP’s wykazują przede wszystkim działanie bakteriobójcze w stosunku do Gram-ujemnych i  w  mniejszym stopniu do bakterii Gram-dodatnich [9]. Do cekropin należy również melityna, zbudowana z 26 aminokwasów, wyizolowana z jadu pszczoły Apis mellifera. Wykazuje ona toksyczne działanie wobec komórek ssaków (liza erytrocytów). Badania nad stworzeniem pochodnej owadzich peptydów cekropiny i  melityny, mającej zastosowanie terapeutyczne i pozbawionej aktywności hemolitycznej zaowocowały uzyskaniem peptydu modelowego CEMA (cecropin-melittin hybryd peptide), który wykazywał właściwości

immunomodulujące. Między innymi hamował ekspresję genów indukowaną LPS poprzez blokowanie oddziaływań pomiędzy endotoksyną i surowiczym białkiem wiążącym LPS ( LPS Binding Protein – LBP) [4, 21, 47]. 3.2.2. Alloferon 1 i 2 Alloferon 1 i 2 zostały wyizolowane z hemolimfy gąsienic plujki pospolitej, Calliphora vicina, immunizowanych martwymi komórkami bakterii Gram-ujemnej E. coli i Gram-dodatniej M. luteus. Zbudowane są odpowiednio z 13 i 12 aminokwasów. Alloferon 2 odpowiada skróconej, N-końcowej formie alloferonu 1. Nie wiadomo czy alloferon 2 powstaje na drodze proteolizy alloferonu 1, czy obie formy są kodowane przez dwa różne geny [11]. Nazwa alloferon nawiązuje do funkcjonalnego podobieństwa (pobudzanie komórek cytotoksycznych) pomiędzy tymi peptydami a interferonem (-feron) i izolacji z organizmu bezkręgowca (allo-) [48]. 3.2.3.  Mirystylowany peptyd Heliothis virescens N-mirystylowany peptyd, o m. cząsteczkowej 916 Da został wyizolowany z hemolimfy gąsienic H. virescens. Zbudowany jest z 6 aminokwasów, a na N-końcu ma przyłączoną resztę nasyconego, 14-węglowego mirystylowego kwasu tłuszczowego. Natomiast na C-końcu cząsteczki występuje histydyna z przyłączonymi dwoma grupami metylowymi, co nadaje cząsteczce dodatni ładunek. Niewielka masa cząsteczkowa, obecność dodatniego ładunku oraz kwasu tłuszczowego warunkuje prawdopodobnie wewnątrzkomórkowe, przeciwwirusowe działanie peptydu [41]. Peptyd ten został wyizolowany ze zmelanizowanej hemolimfy, istnieje więc prawdopodobieństwo, że jest on metabolitem powstającym podczas syntezy melanin. Obserwowana w badaniach aktywność przeciwwirusowa hemolimfy H. virescens wobec 6 wirusów DNA i RNA, związana z obecnością profenoolooksydazy i melanizacją, zależała właśnie od tego peptydu [40, 43]. 4. Mechanizmy przeciwwirusowego działania peptydów kationowych Przeciwwirusowe działanie, głównie przeciwko otoczkowym wirusom DNA i RNA, wykazują przedsta­wiciele wszystkich czterech klas AMP’s [27].Wyróżniono następujące mechanizmy przeciwwirusowego działania AMP’s: 1. Blokowanie adhezji wirusa do powierzchni komórki wrażliwej. 2. Oddziaływanie z otoczką wirusową lub błoną komórki docelowej. 3. Modulowanie ekspresji genów wirusowych/interferencja z replikacją wirusa. 4. Regulowanie/modulowanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

Przeciwwirusowe peptydy kationowe człowieka i owadów

ad. 1. Stwierdzono, że proteoglikany (anionowe związki występujące na powierzchni komórek i w macierzy zewnątrzkomórkowej), a w szczególności siarczan heparanu biorą udział w adhezji niektórych wirusów do powierzchni komórki [51]. W związku z tym, obdarzone dodatnim ładunkiem peptydy kationowe na zasadzie oddziaływań elektrostatycznych i kompetycji, mogą blokować wiązanie wirusów do powierzchni komórki docelowej. Stwierdzono, że α-defensyny, laktoferyna/ laktoferycyna oraz peptyd LL-37 wiążą się do proteo­ glikanów, hamując adhezję wirusów do komórki [2, 36, 45]. Laktoferyna i jej pochodna laktoferycyna są aktywne zarówno w stosunku do wirusów otoczkowych, HSV-1 i -2 (Herpes Simplex Virus-1 i -2), HIV (Human Immunodeficiency Virus), HCV (Hepatitis C Virus), jak i pozbawionych otoczki, tj. HPV (Human Papillomavirus). Oba peptydy hamują zakażenie komórek wrażliwych na wczesnych etapach infekcji, poprzez bezpośrednie oddziaływanie z wirusem lub wiązanie do komórkowych receptorów wirusa, tj. siarczanu heparanu [1, 36]. Stwierdzono, że laktoferyna może efektywnie zapobiegać zakażeniom HCV poprzez bezpośrednie oddziaływanie z białkami (E1 i E2) otoczki wirusowej. Natomiast działanie przeciwko HBV polega na bezpośrednim oddziaływaniu laktoferyny na komórki wrażliwe na wirusa [55]. ad. 2.  Przeprowadzone badania dowiodły, że przeciwwirusowa aktywność peptydów kationowych może wynikać z ich oddziaływania na błonę komórki docelowej lub też na otoczkę wirusową. Niektóre z peptydów w sposób bezpośredni inaktywują wirusy, zapobiegając zakażeniom na etapach poprzedzających adhezję i wnikanie wirusa do komórki wrażliwej. Prawdopodobny mechanizm takiego działania peptydów polega na niszczeniu otoczek wirusowych w sposób analogiczny do niszczenia błony komórek bakteryjnych [29]. Taki mechanizm działania przypisuje się α-defensynie człowieka, HNP-1, która jest aktywna wobec HSV-1 i HSV-2, jak również w stosunku do VSV (Vesicular Stomatitis Virus), wirusa grypy i CMV (Cytomegalovirus). Należy jednak zauważyć, że peptyd ten wykazuje różny stopień aktywności wobec wymienionych wirusów, co może wynikać z różnej budowy otoczek lipidowych wirusów [13, 29]. Przeciwwirusowe działanie HNP-1 stwierdzono również wobec wirusa HIV. W dawkach nietoksycznych i fizjologicznych oraz przy braku surowicy (np. na powierzchni błon śluzowych), peptyd ten w sposób bezpośredni działa na cząstki wirusa HIV, znosząc ich zakaźność [10, 34]. HNP1-3 mogą również funkcjonować jako lektyny, które wiążąc krzyżowo glikoproteinę gp120 HIV i CD4 komórki docelowej, zapobiegają zakażeniu na etapie adhezji i wnikania wirusa [58, 29]. Podobnie wiązanie krzyżowe hemaglutyniny wirusa grypy przez defensynę, HBD3 hamuje fuzję otoczki wirusa z błoną endosomów komórki gospodarza [29]. Natomiast β-defensyny 2 i 3

213

stymulują internalizację koreceptora CXCR4, niezbędnego do zakażenia przez wirus HIV komórek immunokompetentnych [15]. ad. 3.  Niektóre peptydy kationowe, np. LL-37 i laktoferycyna mogą wnikać poprzez błonę komórkową lub błonę jądrową, odpowiednio do cytoplazmy lub jądra komórkowego [32]. Dzięki temu mogą regulować aktywność szlaków sygnałowych oraz wpływać na ekspresję genów zarówno komórkowych, jak i wirusowych. Stwierdzono, że AMP’s modulują aktywność, proliferację i różnicowanie komórek immunologicznie kompetentnych, zaangażowanych w zwalczanie zakażeń wirusowych [6, 28, 56]. Mechanizm działania HNP-1 przeciwko HIV, w obecności surowicy lub po zakażeniu komórek wrażliwych CD4+, polega na hamowaniu aktywności komórkowej kinazy PKC, niezbędnej do replikacji wirusa. HNP-1 hamuje replikację wirusa na etapie odwrotnej transkrypcji i integracji genomu do materiału genetycznego gospodarza [10]. Owadzie peptydy kationowe, melityna i cekropina A, wykazują działanie przeciwko HIV, poprzez hamowanie ekspresji genów wirusa (genu gag) i hamowanie aktywności sekwencji LTR wirusa. Melityna może również regulować transdukcję sygnałów, poprzez aktywację fosfolipazy  A2 lub obniżenie aktywności kalmoduliny i PKC. Prowadzi do zmiany aktywności czynników zaangażowanych w transkrypcję HIV, np. NF-κB, AP-1 lub NFAT lub do indukcji inhibitorów transkrypcji, podobnych do tych indukowanych interferonem [56]. Cekropina A zapobiega również namnażaniu wirusa Junin i innych gatunków arenawirusów przez zahamowanie syntezy białek wirusa. Cekropina A powoduje zmiany w ekspresji i rozmieszczeniu białka G1 wirusa Junin. Zaburzenia w transporcie i  insercji tego białka do błony komórkowej gospodarza, zapobiega powstawaniu cząstek wirusowych, ponieważ w  przypadku arenawirusów są one uwalniane z zakażonej komórki poprzez pączkowanie błony komórkowej [35]. Również przeciwwirusowe działanie mirystylowanego peptydu H. virescens opiera się na zaburzeniu morfogenezy i/lub pączkowania wirusów. Niektóre wirusy wykorzystują mirystylowane białka w celu przyłączenia się do błony komórkowej od strony cytoplazmatycznej, co inicjuje składanie cząstek wirusa i/lub pączkowanie z błony komórkowej. Owadzi peptyd kationowy na zasadzie kompetycji z białkami wirusowymi, hamuje formowanie zakaźnych cząstek wirusa. In vitro peptyd ten wykazuje działanie przeciwko HIV i HSV-1. Działanie przeciwko HIV może być uwarunkowane blokowaniem wiązania białka Gag do błony komórkowej, ponieważ posiada ono resztę kwasu mirystylowego na N-końcu, niezbędną do wiązania białka do cytoplazmatycznej warstwy błony komórkowej [41]. Stwierdzono, że ludzka laktoferyna może być pochłaniana przez niektóre typy komórek, np. monocyty oraz wykazuje zdolność wiązania do DNA. Dodatkowo na N-końcu posiada 4 argininy,

214

Magdalena Mizerska-Dudka, Mariola Andrejko, Martyna Kandefer-Szerszeń

które mogą stanowić sygnał transportu do jądra komórkowego. Istnieje więc możliwość, że laktoferyna/laktoferycyna funkcjonują jako peptydy przeciwwirusowe o  aktywności czynników transkrypcyjnych indukują­ cych odpowiedź immunologiczną gospodarza [1]. Peptyd LL-37 może być zaangażowany w różnicowanie komórek dendrytycznych. Pod jego wpływem mieloidalne komórki dendrytyczne (Dendritic Cells – DC’s) wykazują zwiększoną zdolność do endocytozy i fagocytozy, co prawdopodobnie jest wynikiem wzrostu ekspresji α2-integryn i receptorów CR3 i CR4. Takie zmiany w prekursorach DC’s, zwiększają ich zdolność do prezentacji antygenów, a tym samym do indukcji nabytych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej [5, 36]. ad. 4.  Immunomodulująca funkcja peptydów kationowych polega na regulacji syntezy czynników odpowiedzi immunologicznej, np. cytokin i chemokin oraz ich receptorów, modulowaniu aktywności komórek immunokompetentnych oraz działaniu chemotaktycznym. Jest ona bardzo ważna w zwalczaniu zakażeń, ponieważ niektóre AMP’s w fizjologicznych warunkach (stężenie, obecność jonów czy surowicy) nie wykazują bezpośredniej aktywności przeciwdrobnoustrojowej [29]. Do takich peptydów należy LL-37 [5]. Badania dowiodły, że peptyd ten zwiększa ekspresję IL-8, MCP-1 i MCP-3 oraz receptorów CXCR-4, CCR2 i IL-8R, jak również sekrecję IL-8. Immunomodulująca funkcja LL-37 związana jest z aktywacją kinaz MAP, ERK1/2 i p38 w monocytach krwi obwodowej i komórkach linii komórkowej nabłonka oskrzeli [6, 46]. Natomiast HNP-1 i HNP-2 w makrofagach zwiększają ekspresję CC-chemokin (MIP-1α i MIP-1β), które na zasadzie kompetycji o receptor (CCR5), uniemożliwiają wnikanie wirusa HIV do komórki docelowej [19]. Właściwości immunomodulujące posiadają także alloferony 1 i 2. In vitro syntetyczny odpowiednik tych peptydów stymuluje naturalną cytotoksyczność komórek NK. Natomiast in vivo po podaniu myszom obserwowano indukcję syntezy INF [11]. Jedną z funkcji kationowych peptydów, która również odgrywa istotną rolę w zwalczaniu zakażeń wirusowych jest działanie chemotaktyczne wobec leukocytów. Ludzka α-defensyna 1 i 2 wykazuje zdolność przyciągania limfocytów T i monocytów, natomiast β-defensyny  1 i 3 funkcjonują jako chemoatraktanty wobec niedojrzałych komórek dendrytycznych oraz limfocytów T pamięci poprzez oddziaływanie z CCR6 [53, 59]. Również peptyd LL-37 wykazuje zdolność do przyciągania komórek immunologicznie kompetentnych (monocyty, limfocyty T, neutrofile oraz komórki tuczne) do miejsca zakażania [18, 38]. 5. Podsumowanie Naturalnie występujące przeciwdrobnoustrojowe katio­nowe peptydy, charakteryzujące się różnorodnymi właściwościami biologicznymi, stanowią atrakcyjne

źródło związków o znaczeniu terapeutycznym. Pozyskiwane na ich bazie syntetyczne pochodne mogą okazać się skuteczne w zwalczaniu zakażeń wirusowych oraz wywołanych patogennymi mikroorganizmami i pasożytami. Obiecujące może być również stosowanie konwencjonalnych metod leczenia (np. antybiotykoterapia) w połączeniu z AMP’s. Tak skonstruowane terapie mogą okazać się skuteczne miedzy innymi ze względu na różnorodne mechanizmy działania peptydów kationowych i obecnie stosowanych terapeutyków. Piśmiennictwo   1. Andersen J.H., Jenssen H., Sandvik K., Gutteberg T.J.: Anti-HSV activity of lactofferin and lactoffericin is dependent on the presence of heparan sulphate at the cell surface. J. Med. Virol. 74, 262–271 (2004)   2. Andersen J.H., Osbakk S.A., Vorland L.H., Traavik T., Guttenberg T.J.: Lactoferrin and cyclic lactoferricin inhibit the entry of human cytomegalovirus into human fibroblasts. Antiviral Res. 51, 141–149 (2001)  3. Baker E.N., Baker H.M.: Molecular structure, binding pro­ perties and dynamics of lactoferrin. Cell. Mol. Life Sci. 62, 2531–2539 (2005)   4. Boman H.G., Wade D., Boman I.A., Wahlin B., Merrifield R.B.: Antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids. FEBS Lett. 259, 103–106 (1989)   5. Bowdish D.M.E., Davidson D.J., Lau Y.E., Lee K., Scott M.G., Hancock R.E.W.: Impact of LL-37 on anti-infective immunity. J. Leukoc. Biol. 77, 451–459 (2005)   6. Bowdish D.M.E., Davidson D.J., Speert D.P., Hancock R.E.W.: The human cationic peptide LL-37 induces activation of the Extracellular Signal-Regulated Kinase and p38 Kinase pathways in primary human monocytes. J. Immunol. 172, 3758–3765 (2004)   7. Brown S.E., Howard A., Kasprzak A.B., Gordon K.H., East P.D.: The discovery and analysis of a diverged family of novel antifungal moricin-like peptides in the wax moth Galleria mellonella. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 201–212 (2008)   8. Bucki R., Leszczyńska K., Namiot A., Sokołowski W.: Cathelicidin LL-37: A Multitask antimicrobial peptide. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 15–25 (2010)   9. Bulet P., Stöcklin R.: Insect antimicrobial peptides: structures, properties and gene regulation. Protein Pept. Lett. 12, 3–11 (2005) 10. Chang T.L., Vargas J. Jr., DelPortillo A., Klotman M.E.: Dual role of α-defensin-1 in anti-HIV-1 innate immunity. J. Clin. Immunol. 115, 765–773 (2005) 11. Chernys S., Kim., Bekker G., Pleskach V.A., Filatova N.A., Anikin V.B., Platonov V.G., Bulet P.: Antiviral and antitumor peptides from insects. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12628–12632 (2002) 12. Cytryńska M., Mak P., Zdybicka-Barabas A., Suder P., Jakubowicz T.: Purification and characterization of eight peptides from Galleria mellonella immune hemolymph. Peptides, 28, 533–546 (2007) 13. Daher K.A., Selsted M.E., Lehrer R.I.: Direct inactivation of viruses by human granulocyte defensins. J. Virol. 60, 1068–1074 (1986) 14. De Smet K., Contreras R.: Human antimicrobial peptides: defensins, cathelicidins, histatins. Biotechnol. Lett. 27, 1337– 1347 (2005)

Przeciwwirusowe peptydy kationowe człowieka i owadów

15. Feng Z., Dubyak G.R., Lederman M.M., Weinberg A.: Cutting edge: human β-defensin 3 – a novel antagonist of the HIV-1 coreceptor CXCR4. J. Immunol. 177, 782–786 (2006) 16. Ferrandon D., Jung A.C., Criqui M., Scheffler L., Brunnert S., Tang H., Prince A.: A drospmycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBO J. 17, 1217–1227 (1998) 17. Guani-Guerra E., Santos-Mendoza T., Lugo-Reyes S.O., Terán L.M.: Antimicrobial peptides: general overview and clinical implications in human health and disease. Clin. Immunol. 135, 1–11 (2010) 18. Gudmundsson G.H., Agerberth B.: Neutrophil antibacterial peptides, multifunctional effector molecules in the mammalian immune system. J. Immunol. Methods, 232, 45–54 (1999) 19. Guo Ch.-J., Tan N., Song L., Douglas S.D., Ho W.-Z.: Alpha-defensins inhibit HIV infection of macrophages through upregulation of CC-chemokines. AIDS, 18, 1217–1228 (2004) 20. Hancock R.E.W., Brown K.L., Mookherjee N.: Host defence peptides from invertebrates – emerging antimicrobial strategies. Immunobiology, 211, 315–322 (2006) 21. Hancock R.E.W., Scott M.G.: The role of antimicrobial peptides in animal defenses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 8856–8861 (2000) 22. Hetru C, Hoffman D., Bulet P.: Antimicrobial peptides from insects (w) Molecular mechanisms of immune responses in insects, red. Brey P.T., Hultmark D., Chapman and Hall, London, 1998, s.40 23. Hoskin D.W., Ramamoorthy A.: Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochem. Biophys. Acta – Biomembranes, 1778, 357–375 (2008) 24. http://aps.unmc.edu/AP/about.php (22 grudnia 2010) 25. http://nobelprizes.com/nobel/nobel.html (22 grudnia 2010) 26. Irving P., Troxler L., Hetru C.: Is innate enough? The innate immune response in Drosophila. Comptes Rendus Biologies, 327, 557–570 (2004) 27. Jenssen H., Hamil P., Hancock R.E.W.: Peptide antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev. 19, 491–511 (2006) 28. Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Buneva V.N., Nevinsky G.A.: Human milk lactoferrin binds two DNA molecules with different affinities. FEBS Lett. 451, 235–237 (1999) 29. Klotman M.E., Chang T.L.: Defensins in innate antiviral immunity. Nat. Immunol. 6, 447–456 (2006) 30. Kragol G., Lovas S., Varadi G., Condi B.A., Hoffmann R., Otvos L.Jr.: The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assited protein folding. Biochemistry, 40, 3016–3026 (2001) 31. Lai Y., Gallo R.L.: AMPed upon immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131–141 (2009) 32. Lau Y., Rozek A., Scott M.G., Goosney D.L., Davidson D.J., Hancock R.E.W.: Interaction and cellular localization of the human host defense peptide LL-37 with lung epithelial cells. Infect. Immun. 73, 583–591 (2005) 33. Lüders T., Birkemo G.A., Fimland G., Nissen-Meyer J.N., Nes I.F.: Strong synergy between a eukaryotic antimicrobial peptide and bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl. Environment. Microbiol. 69, 1797–1799 (2003) 34. Mackiewicz C.A., Yuan J., Tran P., Diaz L., Mack E., Selsted M.E., Levy J.A.: α-defensins can have anti-HIV activity but are not CD8 cell anti-HIV factors. AIDS, 17, F23–F32 (2003) 35. Mantanic V.A.A., Castilla V.: Antiviral activity of antimicrobial cationic peptides against Junin virus and herpes simplex virus. Int. J. Antimicrob. Agents, 23, 382–389 (2004)

215

36. Mistry N., Drobni P., Näslund J., Sunkari V.G., Jenssen H., Evander M.: The anti-papillomavirus activity of human and bovine lactoffericin. Antiviral Res. 75, 258–265 (2007) 37. Nell M.J., Tjabringa G.S., Wafelman A.R., Verrijk R., Hiemstra P.S., Driffhout J.W., Grote J.J.: Development of novel LL-37 derived antimicrobial peptides with LPS and LTA neutralizing and antimicrobial activities for therapeutic application. Peptides, 27, 649–660 (2006) 38. Niyonsaba F., Iwabuchi K., Someya A., Hirata M., Matsuda H., Ogawa H., Nagaoka I.: A cathelicidin family of human antimicrobial peptide LL-37 induces Mast cell chemotaxis. Immunology, 106, 20–26 (2002) 39. Otvos L.Jr.: The short proline-rich antimicrobial peptide family. Cell. Mol. Life Sci. 59, 1138–1150 (2002) 40. Ourth D.D., Renis H.E.: Antiviral melanization reaction of Heliothis virescens hemolymph against DNA i RNA viruses in vitro. Comp. Biochem. Phys. B – Comp. Biochem. 105, 719–723 (1993) 41. Ourth D.D.: Antiviral activity against human immunodeficiency virus-1 in vitro by myristoylated-peptide from Heliothis virescens. Biochem. Biophys. Research. Comm. 320, 190–196 (2004) 42. Patrzykat A., Friedrich C.L., Zhang L., Mendoza V., Hancock R.E.W.: Sublethal concentrations of pleurocidin-derived antimicrobial peptides inhibit macromolecular synthesis in Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 605–614 (2002) 43. Popham H.J.R., Shelby K.S., Brandt S.L., Coudron T.A.: Potent virucidal activity in larval Heliothis virescens plasma against Helicoverpa zea single capsid nucleopolyhedrovirus. J. Gen. Virol. 85, 255–261 (2004) 44. Reddy K.V.R., Yedery R.D., Aranha C.: Animicrobial peptides: premises and promises. Inter. J. Antimicrob. Agents, 24, 536–547 (2004) 45. Schmidtchen A., Frick I.-M., Anderson E., Tapper H., Björck L.: Proteinases of common pathogenic bacteria degrade and inactivate the antibacterial peptide LL-37. Mol. Microbiol. 46, 157–168 (2002) 46. Scott M.G., Davidson D.J., Gold M.R., Bowdish D., Hancock R.E.W.: The human antimicrobial peptide LL-37 is a multifunctional modulator of innate immune responses. J. Immunol. 169, 3883–3891 (2002) 47. Sitaram N., Nagaraj R.: Interaction of antimicrobial peptides with biological and model membranes: structural and charge requirements for activity. Biochem. Biophys. Acta – Biomembranes, 1462, 29–54 (1999) 48. Słocińska M., Marciniak P., Rosinski G.: Insects antiviral and anticancer peptides: new leads for the future? Protein Pept. Lett. 15, 578–585 (2008) 49. Słońska A., Klimuszko D.: Bakteriocyny probiotycznych pałeczek z rodzaju Lactobacillus. Post. Mikrobiol. 40, 87–96 (2010) 50. Smolarczyk R., Cichoń T., Szala St.: Peptydy – nowa klasa leków przeciwnowotworowych. Post. Hig. Med. Dośw. 63, 360–368 (2009) 51. Spillman D.: Heparan sulphate: anchor for viral intruders? Biochimie, 83, 811–817 (2001) 52. Steiner H., Hulmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G.: Sequence and specificity of two antimicrobial proteins in insect immunity. Nature, 292, 246–248 (1981) 53. Territo M.C., Ganz T., Selsted M.E., Lehrer R.: Monocyte-chemotactic activity of defensins from human neutrophils. J. Clin. Invest. 84, 2017–2020 (1989) 54. Uvell H., Engström Y.: A multilayered defense against infection: combinatorial control of insect immune genes. Trends Genet. 23, 342–349 (2007)

216

Magdalena Mizerska-Dudka, Mariola Andrejko, Martyna Kandefer-Szerszeń

55. Valenti P., Antonini G.: Lactoferrin: an important host defence against microbial and viral attack. Cell. Mol. Life Sci. 62, 2576– 2587 (2005) 56. Wachinger M., Brack-Werner R. i wsp.: Antimcrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human mmunodeficiency virus 1 by suppressing viral gene expression. J. Gen. Virol. 79, 731–740 (1998) (praca jest dziełem 10 autorów) 57. Wang G., Watson K.M., Peterkofsky A., Buckheit R.W. Jr.: Identification of novel Human Immunodeficiency Virus type 1-inhibitory peptides based on the antimicrobial peptide database. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 1343–1346 (2010)

58. Wang W., Owen S.M., Rudolph D.L., Cole A.M., Hong T., Waring A.J., Lal R.B., Lehrer R.I.: Activity of α-defensins and θ-defensins against primary isolates of HIV-1. J. Immunol. 173, 515–520 (2004) 59. Yang D., Oppenheim J.J. i wsp.: β-defensins: linking innate and adaptive immunity trough dendritic and T Cell CCR6. Sci. 286, 525–528 (1999) (praca jest dziełem 11 autorów) 60. Yuant N.Y., Bayer A.S., Xiong Y.Q., Yeaman M.R.: Advances in antimicrobial peptide immunology. Biopolymers, 84, 435–458 (2006)

CYTOKINY Z RODZINY INTERLEUKINY 1

POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 3, 217–221 http://www.pm.microbiology.pl

Beata Tokarz-Deptuła*1, Tymoteusz Miller1, Wiesław Deptuła1 1

Katedra Mikrobiologii i Immunologii, Wydział Nauk Przyrodniczych, Uniwersytet Szczeciński, 71-412 Szczecin, ul. Felczaka 3c Wpłynęło w kwietniu 2011 r.

1. Wprowadzenie. 2. Charakterystyka interleukin zaliczanych do rodziny IL-1. 2.1. IL-1α i IL-1β oraz IL-1Ra. 2.2. IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10. 2.3. IL-18. 2.4. IL-33. 2.5. SIGIRR. 2.6. IL-36 i IL-37. 3. Podsumowanie The interleukin-1 family of cytokines Abstract: Interleukins, proteins, forming of groups within cytokines, i.a. serve as communication links between the immune system cells, and form an important element of both innate and adaptive immunity. 15 cytokines belonging to the interleukin-1 family have been described and characterized which are related to inteleukins synthesis site and cooperation with other cytokines or factors playing significant role in immune system reaction. 1. Introduction. 2. Characteristics and significance of interleukin-1 family of cytokines. 2.1. IL-1α and IL-1β and IL-1Ra. 2.2. IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10. 2.3. IL-18. 2.4. IL-33. 2.5. SIGIRR. 2.6. IL-36 i IL-37. 3. Summary Słowa kluczowe: cytokiny, interleukiny, rodzina IL-1 Key words: cytokines, interleukins, IL-1 family

1. Wprowadzenie Interleukiny (IL) tworzą jedną z grup cytokin, służącą m.in. do komunikowania się komórek układu odpornościowego, które stanowią elementy odporności wrodzonej i nabytej [7]. Są to substancje o charakterze białkowym, produkowane głównie przez leukocyty, choć również przez inne elementy makroorganizmu np.: IL-33 produkowana jest przez fibroblasty, komórki endotelialne, komórki tłuszczowe-adipocyty oraz przez komórki okrężnicy i szpiku kostnego [7, 20]. Do roku 2010 opisano 37 interleukin [7, 15, 16], które ze względu na ich różne cechy biologiczne, w tym zróżnicowanie molekularne i ich strukturę, zgrupowano w trzy rodziny [4]. Pierwsza – bez nazwy – obejmuje dwie podrodziny, to jest podrodzinę interleukiny 2, do której zalicza się IL-3-7, 9, 11-15, 21, 23, 30 oraz takie substancje jak CSF (colony-stimulating factor), LIF (leukemia inhibitory factor), prolaktynę oraz podrodzinę interferonów (IFN), która reprezentowana jest przez INF-α i INF-β. Drugą rodzinę tworzy IL-1 obejmująca: IL-1α, IL-1β oraz IL-18 wraz z  ich pochodnymi, choć B u r g e r i  wsp. [3], w  oparciu o wysoce konserwatywną strukturę genów kodujących i homologię sekwencji aminokwasowych, zaliczyli do tej rodziny, oprócz wymienionych wcześ­ niej IL-1α i IL-1β, także IL-1Ra (receptor antagonist), IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10 oraz IL-33. Natomiast do trzeciej rodziny zalicza się interleukinę 17A, B, C, D, F oraz IL-8, 25 (dawniej IL-17E) i 27, a także IL-31, 32 i 33. Znane są także kryteria podziału IL, oparte o strukturalne podobieństwo ich genów kodu-

jących [5], co spowodowało wyodrębnieniem wśród nich, dodatkowej nadrodziny IL-10, do której zaliczono IL-10 oraz IL-19, 20, 22, 24, 26, 28 i 29. Obecnie przyjmuje się [3,4,7], że rodzinę interleukiny  1 tworzą IL wcześniej wymieniane tj. IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10, IL-18, IL-33, ale także IL-36 i IL-37 oraz SIGIRR (SIGIRR – single immunoglobulin IL-1 receptor-related molecule) – członek rodziny IL-1R [12, 15, 16, 21]. 2. Charakterystyka interleukin zaliczanych do rodziny IL-1 2.1. IL-1α i IL-1β oraz IL-1Ra Ze względu na podobną aktywność biologiczną i  przechodzenie sygnału przez ten sam receptor dla Il-1, u  IL-1α (IL-1F1) i IL-1β (IL-1F2), opisywane są one często tylko jako jedna IL-1 [1, 3, 5, 19, 22]. Trzeba jednak stwierdzić, że różnią się one między sobą choćby miejs­ cem syntezy. IL-1α syntetyzowana jest przez monocyty, makrofagi, neutrofile, limfocyty, komórki glejowe, keratynocyty, komórki śródbłonka [3, 5, 21], natomiast IL-1β głównie przez monocyty – makrofagi [1, 19, 20, 21]. Nadto ta ostatnia (IL-1β), podobnie jak IL-18 i IL-33, wytwarzana jest w postaci prointerleukiny, która wskutek przekształceń, przy pomocy kaspazy 1, zmienia się w  formę dojrzałą [1, 20, 21]. Dalsza różnica między nimi polega na tym, że IL-1α jest związana z błoną komórek produkujących ją i stąd oddziaływuje

* Autor korespondencyjny: Katedra Mikrobiologii i Immunologii, Wydział Nauk Przyrodniczych, Uniwersytet Szczeciński; ul. Felczaka 3c, 71-412 Szczecin; tel. (91) 444-16-05; e-mail: [email protected]

218

Beata Tokarz-Deptuła, Tymoteusz Miller, Wiesław Deptuła

ona na komórki będące w najbliższym sąsiedztwie, czyli działa lokalnie, natomiast IL-1β jest wydzielana do krwi i ma działanie ogólnoustrojowe [21]. Cytokiny te różną się także wkładem w tworzenie odpowiedzi immunologicznej, na skutek zróżnicowanej regulacji genów w czasie ich rozwoju oraz jako efekt reakcji na oddziaływanie środowiskowe [21]. Badania przeprowadzone na myszach knockout, wykazały istotny wpływ IL-1α na aktywność limfocytów T w alergii kontaktowej i udział jej w indukcji syntezy surowiczej IgE po immunizacji np.: albuminami [21]. Natomiast rola IL-1β w porównaniu do IL-1α, w  większym stopniu odpowiada za indukcję gorączki [21]. Wykazano, że w  warunkach zdrowia makro­organizmu, cytokiny te występują na niskim poziomie aktywności, zaś w warunkach choroby, ich aktywność wzrasta, co objawia się m.in. stanami gorączkowymi, wysypką, a nawet zapaleniem stawów [3, 5, 21]. Obie interleukiny pobudzają bazofile do wydzielania histaminy, co wzmaga efekt działania IL-18 i IL33, a także IgE [21]. Efektem wspólnego ich działania oraz IL-18, jest aktywacja komórek dendrytycznych (DC) manifestująca się zwiększoną ekspresją receptorów TNF, głównie TNFRSF4 (TNF receptor super family) (dawniej OX40, CD134), TNFRDF5 (dawniej CD40) oraz czynnika przenoszącego sygnał aktywujący limfocyty (SLAM – signalling lymphocytic activation molecule) i IL-12 [21]. IL-1α i IL-1β wspomagają także odpowiedź komórek T oraz są jednymi z podstawowych substancji warunkujących powstawanie komórek Th17 [21, 23]. Syntetyzowane przez komórki MN oddziaływają bezpośrednio na różnicowanie się limfocytów T naiwnych oraz limfocytów T pamięci [21]. Zwiększają one także ekspresję IL-2R, przez co aktywują ścieżki sygnalne, mające działanie antyapoptotycze, np. poprzez drogę NF-κB lub PI-3 kinazę, przez co dochodzi do zwiększenia proliferacji limfocytów efektorowych (Teff ) i  regulatorowych (Treg) jak też wydzielania przez te ostatnie IL-17 [21]. Substancje te, pełnią również kluczową rolę w  pobudzaniu limfocytów T pamięci do syntezy nie tylko IL-17 ale także IL-22 [21]. Wspomagają one, jak wspomniano, nie tylko rozwój limfocytów Th17, przez indukcję czynnika regulującego gen dla interferonu, ale także komórek Th2 [21]. Zaobserwowano również, że limfocyty Tγδ pod wpływem stymulacji IL-1α i  β oraz IL-23, zwiększają syntezę IL-17 [21,23]. Także ich działanie wraz z IL-18 i 33 oraz IL-2 i IL-11, wzmacnia różnicowanie limfocytów T poprzez STAT (signac transducers and activators of transcription) – których wymienia się sześć, od STAT1 do STAT6 [10], a które aktywowane przez wiele interleukin i czynniki wzrostu, pełnią ważne funkcje np. w powstawaniu stanu zapalnego wątroby. W  przypadku cytokin z  rodziny IL-1, liczą się głównie STAT 3, 4 i 5, jako że poprzez STAT5 wzmacnia się różnicowanie komórek T w Th2, STAT3 – w Th17, zaś STAT4 w Th1 [10, 21]. Dowiedziono [21],

że kombinacja tych STAT i  właściwych sygnałów dla IL-1R (receptor dla IL-1), prowadzi dodatkowo do zwiększenia ekspresji innych swoistych czynników transkrypcyjnych dla subpopulacji limfocytów T min. T-bet dla Th1, GATA3 dla Th2 oraz RORγt dla Th17 [21]. Dowiedziono również, że IL-1α i  IL-1β w  obecności immunoglobulin powierzchniowych i ligacji receptora CD40, silnie aktywują proliferację limfocytów B [19, 21]. Indukują one także ekspresję CD40L i OX40 (znany również jako TNFRSF4) na limfocytach [21], z tym że poprzez CD40L stymulują limfocyty B do proliferacji i zmiany syntetyzowanych klas Ig, zaś poprzez regulację OX40L pobudzają produkcję cytokin przez komórki Th2 [21]. W  przypadku IL-1Ra (receptor antagonist – antagonista receptora dla IL-1), wykazano że wiążąc się z receptorem IL-1R1 [7, 14)] uniemożliwia łączenie się IL-1α i IL-1β oraz IL-1RAP (receptor dla tzw. białek pomocniczych) [1, 2, 21, 22]. Opisano także że IL-1α i β działa blokująco poprzez dwa receptory tj. znacznik IL-1R1 i IL-1R2 [1, 6, 21, 22]. Trzeba dodać, że bodźcami indukującymi ekspresję IL-1Ra jest LPS, agregaty IgG, a także anty-zapalne cytokiny, takie jak IL-4 i 10 [8, 21]. Dowiedziono również, że antagonista dla IL-1Ra, może być pochodzenia zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowe [8, 21]. Wykazano, że w budowie IL-1R2 [1, 2, 6, 8, 21] występuje pozakomórkowy region, który jest podobny w swojej strukturze do IL-1R1, choć ma on krótszą domenę cytoplazmatyczną, która nie może pełnić funkcji sygnalizacyjnych, przez co receptor IL-1R2, działa jak „receptor-pułapka”. Biorąc pod uwagę możliwość słabego wiązania się IL-1R2 z IL-1Ra, należy stwierdzić, że antagoniści IL-1 raczej wzmacniają, niż anulują wzajemne działania [1, 6, 21]. IL-1R1 podobnie jak IL-1R2 ulegają ekspresji na komórkach produkujących IL-1α i IL-1β i ich główną rolą jest zapobieganie samoaktywacji tych komórek, przez IL-1 [21]. Zarejestrowano, że receptor IL-1R2 „zrzucony” z powierzchni komórki w  postaci białka rozpuszczalnego, wykazuje także zdolności inhibicyjne, bo w wyniku oddziaływania z postacią rozpuszczalną IL-1RAP, zwiększa aktywność hamującą IL-1R2 i IL-1Ra [21]. 2.2. IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10 Według informacji zawartej w Nature Immunology [9] nazewnictwo IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, jest następujące IL-1F5 to IL-36Ra, IL-1F6 to IL-36α, IL-1F8 to IL-36β, a IL-1F9 to IL-36γ. Ich synteza zachodzi m.in. w keratynocytach, a także w monocytach [21], a w przypadku IL-1F5, która wykazuje trójwymiarową strukturę [21], produkcje jej stwierdzono także w komórkach łożyska, mózgu, grasicy i nerek [19]. Interleukiny 1F5, 1F6, 1F8, 1F9, wchodząc w interakcje z receptorem IL-1RL2 występującym na makrofagach i komórkach dendrytycznych, są zdolne do ich pobudzenia [21].

CYTOKINY Z RODZINY INTERLEUKINY 1

Nadto IL-1F6, IL-1F8 i IL-1F9 aktywują czynnik jądrowy NF-κB i cząsteczki MAPKs (kinazy aktywowane miogenami), wpływając na ekspresję genów, podziały i różnicowanie komórek UO oraz ich apoptozę [12, 21, 23]. Działanie tych cytokin, regulowane jest przez antagonistę receptora dla IL-1F5, analogicznego do IL-1Ra [21, 22]. W przypadku IL-1F9, dodatkowo wykazano, że zwiększa się jej synteza w obliczu stymulacji keratynocytów przez IL-1β, TNFα i IFNγ [6, 12], choć obraz taki zarejestrowano również w przypadkach łuszczycy oraz podczas infekcji HSV (Herpes simplex virus), co dowodzi roli IL-1F9 również w  procesach zapalnych skóry [12]. Odnośnie IL-1F10 wiadomo jedynie, że jest wydzielana tylko w warstwie podstawnej naskórka i w centrach rozrodczych migdałków, choć także podczas proliferacji limfocytów B [21]. Genomowa struktura i sekwencja aminokwasów IL-1F10, wskazują na bliższe pokrewieństwo do IL-1Ra i IL-1F5 niż do reszty rodziny IL-1, sugerując, że może pełnić przeciwstawną rolę [13, 21]. 2.3. IL-18 Cytokina ta jest syntetyzowana przez wiele ko­­mórek UO, m.in. makrofagi, komórki Browicz-Kupffera oraz DC, keratynocyty i komórki nabłonkowe [3, 5, 6, 8, 21]. Jej aktywność jest regulowana przez białko rozpuszczalne IL-18BP, które wiąże IL-18 jako receptor „pułapkę”, uniemożliwiają jej wchodzenie w interakcje z receptorami na komórkach układu odpornościowego [21]. W  warunkach zdrowia stężenie białka IL-18BP jest zwykle 20-krotnie wyższe niż stężenie IL-18, jednak podczas zapalenia, stosunek ten ulega zmianie, co przyczynia się do zwiększenia tych ostatnich stanów [21]. IL-18 głównie wzmaga odpowiedź immunologiczną warunkowaną komórkami Th2, dzięki temu, że indukuje i zwiększa syntezę IL-4 i IL-13 [21]. Wykazano, że IL-18 również pobudza komórki NK do produkcji INFγ, a  po działaniu IL-12 zwiększa jego uwalnianie [3, 5, 6, 17, 21]. Zwiększa ona także cytotoksyczność komórek NK przez indukowanie zwiększonej ekspresji perforyn i  ligandu FAS (FASL – zwanego również jako CD95L) [21]. Wraz z IL-33 aktywuje komórki NKT, które wykazują zwiększoną produkcję IL-4, 5, 13, GM-CSF oraz czynnika TNF [21, 22], a współdziałając z  IL-12, indukują niezależną od antygenu ekspresję IFNγ [18, 21, 22]. Współdziałanie z IL-33, wzmaga siłę bójczą nie tylko komórek NKT, ale także i  ko­mórek NK, w infekcjach bakteryjnych i wirusowych [cyt. 21]. Dowiedziono, że IL-18 pobudza również limfocyty Th1 do proliferacji i wpływa na syntezę INFγ, jako, że receptor dla IL-18 (IL-18R), jest unikalnie wytwarzany przez Th1 w odpowiedzi na IL-12 [21,23]. Cytokina ta poprzez oddziaływanie stymulujące na limfocyty T naiwne i limfocyty  Th1, wpływa na syntezę cytokin typu  Th2 oraz

219

wykazuje supresorową aktywność wobec limfocytów Treg w modelu ksenoprzeszczepu [21]. Sugeruje to, że IL-18 dodatkowo oprócz aktywacji limfocytów  T, oddziaływuje na odpowiedź immunologiczną związaną z działaniem hamującym limfocytów  Treg [21]. Zauważono także, że IL-18 w obecności IL-12 oddziaływując na Th, zwiększa swoją aktywność, co doprowadza do zwiększenia produkcji IFNγ i hamuje syntezę IgE [21, 26]. 2.4. IL-33 IL-33 (IL-1F11), w przeciwieństwie do innych członków tej rodziny, nie jest syntetyzowany przez leukocyty, a obficie jest wytwarzana w wielu tkankach, m.in. wysokim śródbłonku naczyń włosowatych, mięśniach gładkich dróg oddechowych, centralnym układzie nerwowym – w  szczególności w astrocytach, kolonocytach okrężnicy, szpiku kostnym, natomiast w  stanach chorobowych również w migdałkach i błonie maziowej stawów [7, 14, 20, 21, 24]. Jej struktura jest podobna do IL-18 [14]. Receptorem dla IL-33 jest glikoproteina ST2 (IL-1RL1 – podobna do IL-1R) [14, 20, 21, 24] – marker charakterystyczny dla limfocytów  Th2 [14, 20, 21, 24] i  stąd stymuluje ona limfocyty  Th2 do produkcji IL-5 i IL-13 [13, 14]. Ze względu na ekspresję receptora ST2, IL-33 działa bezpośrednio na eozynofile, zwiększając ich przeżywalności i „przyczepność” oraz produkcję nadtlenków i chemokin CXCL8 [3,5,21,24]. Współdziałając z  IL-3 i 5 oraz GM-CSF, wpływa mobilizująco na odpowiedź immunologiczną związaną z eozynofilami [19]. Stymuluje ona także komórki tuczne do produkcji np. IL-5 i 6 [19] i przyspiesza ich dojrzewanie oraz ich czas życia, a wraz z IL-25 i IL-23, wpływa na procesy immunosupresyjne komórek UO [23]. Indukuje ona degranulację komórek tucznych i  w  ten sposób może wywoływać anafilaksję, bez obecności specyficznego alergenu [21]. Także pomimo, że rola IL-33 związana jest z odpowiedzią typu Th2, wpływa ona na indukcję produkcji IFNγ przez komórki NK [21]. 2.5. IL-36 i IL-37 IL-36 jak i IL-37 to cytokiny, które były wymieniane wcześniej jako IL-1F7 [12, 15, 16, 22]. Są one syntetyzowane w większości tkanek, ale największą ich produkcję obserwuje się w komórkach jąder, grasicy i macicy, jak również w makrofagach oraz komórkach nabłonkowych, z  tym że w przypadku IL-37 dodatkowym miejs­cem jej syntezy są makrofagi oraz komórki nabłonkowe w  wyniku stymulacji min. Il-18, IL-1β, TNF i IFNγ [14, 16, 21]. Obecność IL-37 została stwierdzona również w komórkach plazmatycznych migdałków oraz komórkach nowotworowych piersi [16]. Synteza IL-36 zachodzi w  postaci niedojrzałej prointerleukiny, która pod wpływem kaspazy  1

220

Beata Tokarz-Deptuła, Tymoteusz Miller, Wiesław Deptuła

i  4, zostaje odszczepiona i  powstaje w  pełni aktywna IL-36 [11]. Natomiast w przypadku IL-37 stwierdzono, że występuje w  postaci izoform, tj. IL-37a-e (IL-F7a-e) [16]. Aktywność biologiczna IL-36 i  IL-37 , związana jest z  supresją wrodzonej odpor­noś­ci immunologicznej poprzez współdziałanie z  TGF-β poprzez sygnalne białko SMAD3 (białko modulujące aktywność TGF-β) [15, 16], co skutkuje zahamowaniem produkcji mediatorów prozapalnych takich jak IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-12,TNFα, G-CSF i GM-CSF [11, 15, 16]. Wykazano również, że IL-18, IFN-γ, IL-1β, TNF i dinukleotyd CpG, powodują wzrost poziomu syntezy IL-37, choć IL-4 w połączeniu z GM-CSF istotnie ją hamują [16]. Przykładami oddziaływań IL-36 i IL-37, jest i to, że po wyciszeniu endogennej syntezy IL-36 i IL-37 w ludzkich komórkach krwi – PBMC (peripheral blond mononuclear cell), w czasie gdy poziom przeciwzapalnych cytokin (np. IL-10) pozostaje niezmieniony, obserwuje się wzrost poziomu IL-1α, IL-1β, IL-6, TNFα oraz GM-CSF [15, 16]. Natomiast w chwili wprowadzenia IL-36 do mysich lub ludzkich makrofagów, czy ludzkich komórek nabłonkowych płuc, obserwuje się całkowite zahamowanie produkcji IL-1α/β, IL-6, TNFα i GM-CSF [15, 16]. Udowodniono, że w makrofagach ludzkich właś­ciwości supresyjne IL-36 i IL-37 zmniejszają się, gdy aktywność białka Smad3 zostaje zahamowana [15, 16]. Znaczący wpływ na powyższe interakcje ma TGF-β1, ponieważ jego niskie stężenia indukują endogenną IL-37. IL-36 i IL-37 wiążąc się z receptorami IL-18R, a także IL-18BP, zwiększają swoją zdolność do wzmacniania aktywności IL-18 [11, 16]. Wykazano, że IL-37 jest jedyną cytokiną wiążącą białko SMAD3, które po fosforylacji zostaje przeniesione do jądra komórkowego, co po związaniu z  DNA, w komórkach DC i  makrofagach powoduje zahamowanie ich aktywacji, w tym ich cytotoksyczność oraz stan ten zwiększa tolerancję limfocytów T [16]. 2.6. SIGIRR Cząsteczka ta zawiera jedną domenę immunoglobulinową powiązaną z IL-1R, zwana jest także TIR8 (Toll-IL-1R 8) i  jest jednym z inhibitorów receptorów dla IL-1R [17, 21]. Cząsteczka SIGIRR wykazuje także rolę regulatorową, przez wytworzone kompleksy z receptorem dla IL-1, 18, 33 oraz IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9 oraz receptorów TLR (Toll-like receptor) [21]. Jest to cząsteczka o bardzo wysokiej ekspresji w  komórkach nabłonkowych nerek pierwotnych i  jelit oraz średniej ekspresji w splenocytach i komórkach dendrytycznych [17]. Natomiast stymulacja monocytów, makrofagów i keratynocytów, LPS prowadzi do zmniejszenia ekspresji SIGIRR, co wskazuje również na jej rolę w procesach zapalnych [21]. W przypadku braku SIGIRR, aktywność interleukin rodziny IL-1 jest bardziej uwydatniona, chociażby poprzez wzmożenie procesów zapalnych

[17, 21]. Wykazano też, że SIGIRR hamuje syntezę IL-1α i β, czego efektem jest osłabione powstawanie komórek Th17 [21]. 3. Podsumowanie Cytokiny rodziny interleukiny 1 są produkowane przez komórki nabłonkowe (np. IL-18, IL-36, IL-37), śródbłonkowe (np. IL-1α, IL-33), dendrytyczne (np. IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9), glejowe (np. IL-1α, IL-33), makrofagi (np. IL-1α, IL-1β, IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9), monocyty (np. IL-1α, IL-1β), neutrofile (np. IL-1α), limfocyty (np. IL-1α), keratynocyty (np. IL-1α, IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, IL-36, IL-37) i fibroblasty (np. IL-33). Interleukiny stwierdzono w tkance nabłonkowej, mięśniowej, oraz skórze i krwi (np. IL-1α, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10, IL-1β, IL-18, IL-33, IL-36 i IL-37) [3, 6–8, 14, 21], mózgu (np. IL-33, IL-1F5) [14, 19, 21], płucach (np. IL-33) [14, 21], grasicy (np. IL-36, IL-37, IL-1F5) [15, 16, 19,21], jądrach (np. IL-36, IL-37) [15, 16, 21], jajnikach (np. IL-36, IL-37) [15, 16, 21], macicy (np. IL-1F5, IL-36, IL-37) [14, 15, 19, 21], migdałkach (np. L-33, IL-1F10) [14, 21] oraz szpiku (np. IL-33) [7]. Stanowią one grupę cytokin pełniących fundamentalną rolę w  układzie immunologicznym, jako że wykazują stymulujące działanie na UO oraz indukują procesy zapalne, chociażby poprzez pobudzanie limfocytów T i ich subpopulacji (Th1, Th2, Th17, Treg, Tγδ) (np. IL-1, IL-18), bazofili (komórek tucznych) (np. IL-1, IL-18, IL-33), eozynofili (np. IL-33), komórek dendrytycznych (np. IL-1, IL-18) oraz komórek NK i NKT (np. IL-18, IL-33). Cytokiny te, wykazują także działania supresyjne na UO, co dotyczy szczególnie IL-36 i IL-37, które ograniczają odporność wrodzoną, hamując produkcję cytokin prozapalnych oraz hamując działanie IL-18, jak też zaktywowanych komórek DC i  oraz makrofagów, a nadto hamują kinazę STAT1-4, receptor IL-1Ra, IL-1F10 (spokrewnienie z IL-1Ra- antagonistą receptora IL-1), SIGIRR (inhibicja działania IL-1) oraz IL-33 (np. poprzez IL-23 wobec DC).

Piśmiennictwo)   1. Allan S.M., Tyrrell P.J., Rothwell N.J.: Interleukin-1 and neuronal injury. Nature Rev. Immunol. 5, 629–640 (2005)   2. Boutin H., Kimber I., Rothwell N.J., Pinteaux E.: The expanding interleukin-1 family and its receptors. Molec. Neurobiol. 27, 239–248 (2003)   3. Burger D., Dayer J.M., Palmer G., Gabay C.: Is IL-1 a good therapeutic target in the treatment of arthritis? Best Partice & Res. Clin. Rheumatol. 20, 879–896 (2006).   4. Collinsom L.W., Vignali D.A.A.: Interleukin-35: odd one out or part of the family? Immunol. Rev. 226, 248–262 (2008)

CYTOKINY Z RODZINY INTERLEUKINY 1

  5. Commins S.P., Borish L., Steinke J.W.: Immunologic messenger molecues: Cytokines, interferons, and chemokines J. Allergy Clin. Immunol. 125, 53–72 (2009)   6. Debets R., R.A. Kastelein i wsp.: Two novel IL-1 family members, IL-1d and IL-1e, functionas an antagonist and agonist of NF-kB activation through the orphan IL-1 receptor-related protein 2. J. Immunol. 167, 1440–1446 (2001) (cytowana praca jest dziełem 11 autorów)   7. Deptuła W., Tokarz-Deptuła B., Stosik M.: Immunologia dla biologów – wydanie nowe. US Szczecin, Szczecin 2008.   8. Dewberry R.M., King A.R., Crossman C.D., Francis S.E.: Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) modulates endothelial cell proliferation. FEBS Letters, 582, 886–890 (2008).  9. Dinarello C., C. Gabel i wsp.: IL-1 family nomenclature. Nature Immunol. 11, 973 (2010) (cytowana praca jest dziełem 30 autorów). 10. Gao B.: Cytokines, STATs and liver disease. Cell. Moll. Immunol. 2, 92–100 (2005). 11. Kumar S., M.T. Lotze.: Interleukin-1F7B (IL-1H4/IL-1F7) is processed by caspaze-1 and mature IL-1F7B to the IL-18 receptor but does not induce INF-γ production. Cytokine, 18, 61–71 (2002) (cytowana praca jest dziełem 13 autorów) 12. Kumar S., P.R. Young.: Identification and initial characterization of four novel members of the interleukin-1 family. J. Biol. Chem. 275, 10308–10314 (2000) (cytowana praca jest dziełem 11 autorów) 13. Lin H., Ho A.S., Haley-Vicente D., Zhang J., Bernal-Fussell J., Pace A.M., Hansen D., Schweighofer K., Mize N.K., Ford J.E.: Cloning and characterization of IL-1HY2, a novel interleukin-1 family member. J. Biol. Chem. 276, 20597–20602 (2001) 14. Nile C.J., Barksby E., Jitprasertwong P., Preshaw P.M., Taylor J.J.: Expression and regulation of interleukin-33 in human monocytes. Immunology, 130, 172–180 (2009) 15. Nold M.F., Nold-Perty C.A., Zepp J.A., Bufler P., Palmer B.E., Dinarello C.A.: IL-36 (Formely IL-1F7) suppresses innate immunity by inhibiting inflammatory cytokines and dendritic cell activation by association with SMAD 3. Cytokine, 52, 3–4, (2010)

221

16. Nold M.F., Nold-Petry C.A., Zepp J.A., Palmer B.E., Bufler P., Dinarello C.A.: IL-37 is a fundamental inhibitor of innate immunity. Nat. Immunol. 11, 1014–1022 (2010) 17. Qin J., Qian Y., Yao J., Grace Q., Li X.: SIGIRR inhibits interleukin-1 receptor- and Toll-like receptor 4-mediated signaling through different mechanisms. J. Biol. Chem. 280, 25233–25241 (2005) 18. Reilly C.E., Wands J.R., Brossay L.: Cytokine dependent and independent iNKT cell activation. Cytokine, 51, 227–231 (2010) 19. Schmitz J., R.A. Kastelein.: IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines. Immunity, 23, 479–490 (2005) (wyżej cytowana praca jest dziełem 11 autorów) 20. Seidelin J.B., Bjerrum J.T., Coskun M., Widjaya B., Vainer B., Nielsen O.H.: IL-33 is upregulated in colonocytes of ulcerative colitis. Immunol. Lett. 128, 80–85, 2010 21. Sims J.E., Smith D.E.: The IL-1 family: regulators of immunity. Nature Rev. Immunology, 10, 89–102 (2010) 22. Smith D.E., Renshaw B.R., Ketchem R.R., Kubin M., Garka K.E., Sims J.E.: Four new members expand the interleukin-1 superfamily. J. Biol. Chem. 275, 1169–1175, (2000) 23. Sutton C.E., Lalor S.J., Sweeney C.M., Brereton C.F., Lavelle  E.C., Mills K.H.G.: Interleukin-1 and IL-23 induce innate IL-17 production from gd T cells, amplifying Th17 responses and autoimmunity. Immunity. 31, 331–341 (2009) 24. Swamy M., Jamora C., Havran W., Hayday A.: epithelial decision   markers: In  serach   of the “epimmunome”. Nature Immunol. 11, 656–665 (2010) 25. Towne J.E., Garka K.E., Renshaw B.R., Virca G.D., Sims J.E.: Interleukin (IL)-1F6, IL-1F8, and IL-1F9 signal through IL-1Rrp2 and IL-1RAcP to activate the pathway leading to NF-κB and MAPKs. J. Biol. Chem. 279, 13677–13688 (2004) 26. Yoshimoto T., Okamura H., Tagawa Y., Iwakura Y., Naka­ nishi K.: Interleukin 18 together with interleukin 12 inhibits IgE production by induction of interferon-γ production from activated B cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 3948–3953 (1997)

Defensyny – peptydy o aktywności przeciwbakteryjnej

POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 3, 223–234 http://www.pm.microbiology.pl

Monika Żyłowska1, Agnieszka Wyszyńska1, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka*1 1

Instytut Mikrobiologii Uniwersytetu Warszawskiego, Zakład Genetyki Bakterii, ul. Miecznikowa 1, 02-096, Warszawa Wpłynęło w marcu 2011 r.

1. Wstęp. 1.1. Ogólna charakterystyka antybakteryjnych peptydów. 1.2 Klasyfikacja antybakteryjnych peptydów. 1.3. Mechanizmy działania antybakteryjnych peptydów. 2. Charakterystyka defensyn. 2.1 Klasyfikacja, identyfikacja i struktura defensyn. 2.1.1 Defensyny α. 2.1.2. Defensyny β. 2.1.3. Defensyny θ. 2.1.4. Defensyny bezkręgowców. 2.1.5. Defensyny roślinne. 2.2 Biosynteza defensyn. 2.3. Struktura genetyczna i regulacja ekspresji genów kodujących defensyny. 2.4. Interakcje defensyn z błoną komórkową patogenu. 2.5. Modulacja działania układu immunologicznego przez defensyny. 2.6. Mechanizmy oporności bakterii na defensyny. 3. Podsumowanie Antimicrobial peptides – defensins Abstract: Numerous organisms produce antimicrobial peptides (AMP) as part of their innate immunity and host defense. Antimicrobial peptides are implicated in antibacterial as well as antifungal activity in phagocytes, inflammatory fluids and intestinal secretions. Among them, the most abundant and the best characterized are defensins. Most of them have been recently sequenced and their structures have been solved. Defensins are small (about 5 kDa), mainly basic, cystein – rich peptides. The global fold comprises an antiparallel β sheet and an α helix, which is stabilized by disulfide bridges. The mammalian defensins can be subdivided into three main classes according to their structural differences: α, β and, recently described, θ defensins. Several models have been recently proposed to explain the mechanism of bacterial membrane perturbation by defensins, leading to pore formation. This review describes recent findings in defensin biology focusing mainly on mammalian defensins. 1. Introduction. 1.1. Characterization of antimicrobial peptides. 1.2. Antimicrobial peptide classification. 1.2. Mechanism of antibacterial peptide activity. 2. Main features of defensins. 2.1. Defensin classification, structure and identification. 2.1.1. Defensins α. 2.1.2. Defensins β. 2.1.3. Defensins θ. 2.1.4 Invertebrate defensins. 2.1.4. Plant defensins. 2.2. Defensin biosynthesis. 2.4. Genetic organization and expression of gene encoding defensins. 2.4 Interaction between defensins and bacterial cell wall. 2.5. Influence of defensins on vertebrate immunological system. 2.6. Mechanisms of bacterial resistance to defensins. 3. Summary Słowa kluczowe: antybakteryjne peptydy, defensyny, oporność, patogeny, układ immunologiczny Key words: antimicrobial peptides, defensins, immunological system, pathogens, resistance

1. Wstęp 1.1. Ogólna charakterystyka     przeciedrobnoustrojowych peptydów Istotnym elementem mechanizmów odpornościowych funkcjonującym zarówno u roślin, jak i zwierząt –  bezkręgowych i kręgowców, są peptydy przeciw­ drobnoustrojowe (AMP, antimicrobial peptides). Są one prawdopodobnie jednym z podstawowych i jednocześ­ nie najbardziej prymitywnych mechanizmów obronnych. AMP zostały opisane na początku lat osiemdziesiątych XX wieku u żab i ropuch, u których bezpośrednio po zranieniu obserwowano wydzielanie substancji niszczących drobnoustroje. Substancje te nazwano magaininami. Następnie wykryto podobne substancje u innych gatunków zwierząt: cekropiny u ciem, tachyplezyny u krabów, tioniny u roślin i defensyny u  ssaków. Odkrycie pokrewieństw strukturalnych i funkcjonalnych między tymi substancjami pozwoliło na wysunięcie

hipotezy, że AMP są jednym z najstarszych mechaniz­ mów obronnych [80]. Do chwili obecnej opisano ponad 1500 przeciw­drob­no­ustrojowych peptydów. Dzięki dostępnym bazom danych można na bieżąco śledzić odkrycia w dziedzinie AMP. Informacje możemy znaleźć zarówno w specjalistycznych bazach danych, takich jak Antimicrobial Sequence Database (AMSDb) [http://www.bbcm.univ. trieste.it/~tossi/amsdb.html] i Antimicrobial Peptide database (APD) [http://aps.unmc.edu/AP/main.php], jak i w ogólnych bazach danych takich jak GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html], EMBL [http://www.ebi.ac.uk/embl/] i innych [63]. AMP są produkowane w wielu tkankach przez różne typy komórek roślin, grzybów i zwierząt oraz bak­terii. Mają kilka wspólnych cech: są małymi peptydami o ładunku dodatnim. Znamy również peptydy anionowe i amfipatyczne. Peptydy te wykazują aktywność przeciwwirusową, przeciwbakteryjną, przeciwgrzybiczą oraz przeciwpasożytniczą. Oprócz niszczenia patogenów

*  Autor korespondencyjny: Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka, Zakład Genetyki Bakterii, Wydział Biologii, UW; ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; e-mail: [email protected]

224

Monika Żyłowska, Agnieszka Wyszyńska, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka

AMP mają zdolność do neutralizacji toksyn, wykazują aktywność chemotaktyczną, modulują działanie układu immunologicznego oraz indukują procesy angiogenezy i gojenia ran [7]. 1.2. Klasyfikacja antybakteryjnych peptydów Klasyfikacja AMP przyjmuje jako kryterium podziału ich sekwencję aminokwasową, liczbę mostków dwusiarczkowych oraz strukturę. Aktualnie najczęściej stosowana jest klasyfikacja zaprezentowana przez B r o d g e n a, według którego możemy wśród tych peptydów wyróżnić pięć podgrup [5]. Do pierwszej z nich należą anionowe peptydy. Są one małe (726,1–823,8 Da) a dominującymi aminokwasami w ich sekwencji są kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Produkowane są np. przez komórki nabłonkowe w milimolarnych stężeniach. W obecności cynku, który jest ich kofaktorem, wykazują aktywność wobec bak­terii zarówno Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych. Do tej klasy peptydów należy m.in. dermicydyna, produkowana w  gruczołach potowych człowieka. Rozpuszcza się w pocie i po proteolitycznym procesowaniu do peptydu o długości 47 aminokwasów, jest razem z potem wydzielana na powierzchnię skóry. Oprócz właściwości bakteriobójczych dermicydyna ma również właściwości grzybobójcze, np. w stosunku do drożdżaka białego (Candida albicans) [20]. Do drugiej podgrupy należy około 290 krótkich, kationowych peptydów o strukturze α-helisy. Zwykle ich długość nie przekracza 40 reszt aminokwasowych. W  roztworach wodnych struktura wielu z  tych peptydów jest zaburzona, natomiast w obecności trifluo­ roetanolu, dodecylosiarczanu sodu (SDS) i  lipidu  A, cząsteczka przyjmuje właściwą konformację. Peptydy należące do tej klasy są aktywne wobec Gram-dodatnich i Gram-ujemnych bakterii. Przedstawicielami tej grupy są cekropiny: A i B. Po raz pierwszy opisano je u ćmy Hyalophora cecropia, później stwierdzono ich obecność również u ssaków. Ich strukturę cechuje obecność dwóch α-helis, obie wykazują właściwości cytolityczne w  stosunku do kilku linii komórek nowotworowych [40]. Innym przykładem jest pierwszy poznany peptyd przeciwdrobnoustrojowy, magainina zbudowany z 21–27 aminokwasów. Przedstawicielami tej podgrupy są również andropina, mellityna i ceratotoksyna owadów, dermaseptyna, bombinina, brewinina i buforyna II płazów, misguryna i pleurocydyna ryb oraz owispiryna, królicza katelicydyna CAP-18 (cationic antimicrobial peptide) i ludzka katelicydyna LL-37. Trzecią podgrupę tworzy około 44 kationowych peptydów z dominującą liczbą takich aminokwasów jak: prolina, arginina, glicyna i tryptofan. Do tej klasy należy m.in. PR-39 (proline-arginine rich antibacterial peptide), peptyd izolowany z jelita cienkiego świń

i z neutrofili. Inne przykłady to: abaecyna bogata w prolinę, drozomycyna i apidaecyna bogate w prolinę i argininę, koleopterycyna i hymeoptaecyna owadów bogate w glicynę, oraz baktenecyna bogata w prolinę i argininę, profenina bogata w prolinę i fenyloalaninę, idolicydyna i histatyny ssaków bogate w tryptofan. Kolejną podgrupę stanowią anionowe i kationowe peptydy zawierające reszty cysteinowe i mostki disulfidowe [1–3]. Przykładem takich peptydów jest protegryna, 16-aminokwasowy peptyd z dwoma mostkami disulfi­dowymi, izolowany z leukocytów świń. Do tej klasy należy również bardzo zróżnicowana grupa defensyn. Do tej pory opisano ok. 300 defensyn kręgowców (80 α-defensyn, około 190 β-defensyn, 5 defensyn θ), ok. 170 defensyn owadzich, ok. 60 defensyn roślinnych [http://defensins.bii.a-star.edu.sg/]. Inne peptydy należące do tej grupy to m.in. drozomycyna owadów, tachyplezyna skorupiaków oraz brewinina ssaków, która charakteryzuje się obecnością tylko jednego mostka disulfidowego [5]. Ostatnią podgrupę AMP stanowią anionowe i kationowe peptydy będące fragmentami większych białek. Mają one aktywność przeciwbakteryjną i są strukturalnie podobne do wcześniej opisanych peptydów, ale ich rola w odporności nie jest do końca poznana. Do tej klasy należy m.in. laktoferrycyna. Jest to peptyd obecny w neutrofilach, w mleku i w ślinie, powstały na skutek hydrolizy przez kwaśną peptydazę laktoferryny, białka wiążącego żelazo. 1.3.  Mechanizmy działania przeciwbakteryjnych     peptydów AMP niszą komórki drobnoustroju głównie przez dezintegrację ich osłon komórkowych. Wiążą się z błoną komórkową patogenu dzięki oddziaływaniom elektrostatycznym między ujemnie naładowanymi lipidami błony komórkowej drobnoustroju a kationowymi peptydami. Aby dotrzeć do błony cytoplazmatycznej, peptyd musi „pokonać” zewnętrzne warstwy komórki – u bakterii Gram-ujemnych błonę zewnętrzną i cienką warstwę peptydoglikanu, a  u  Gram-dodatnich grubą warstwę peptydoglikanu. Umożliwiają mu to ujemnie naładowane cząsteczki obecne w osłonach komórek bakteryjnych, z którymi peptyd może oddziaływać – m.in. anionowe fosfolipidy i grupy fosforanowe lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych oraz kwasy tejchojowe i lipotejchojowe wchodzące w skład peptydoglikanu bakterii Gram-dodatnich. Gdy peptyd zakotwiczy się w błonie cytoplazmatycznej drobnoustroju, następuje zmiana jego struktury a następnie wbudowanie do dwuwarstwowej fosfolipidowej błony cytoplazmatycznej. W niskim stężeniu peptydy są wbudowywane do błony równoległe, natomiast gdy ich stężenie wzrasta, zmieniają położenie na prostopadłe. W odpowiednio wysokim stężeniu i prostopadłej względem błony orientacji, peptydy zaczy-

Defensyny – peptydy o aktywności przeciwbakteryjnej

nają tworzyć transmembranowe pory. W  zależności od budowy peptydu możemy wyróżnić trzy mechaniz­ ­my niszczenia błon: „klepek beczki”, „pierścieniowy” i „dywanowy”. Istnieje również czwarty, rzadziej występujący mechanizm tworzenia „nieuporządkowanych pierścieniowych porów” [43]. W modelu „klepek beczki” biorą udział α-helikalne peptydy. Formują w centrum membrany wiązkę z kanałem w środku. Od tej formy pochodzi nazwa mechanizmu działania – wiązka ta przypomina beczkę zbudowaną z klepek. Powstałe w błonie pory powodują wyciekanie składników cytoplazmy i spadek potencjału błonowego. W ten sposób niszczą błonę peptydy takie jak alametycyna i gramicydyna A [34]. Drugim mechanizmem niszczenia błon jest model „dywanowy”. W tym modelu peptydy kumulują się na powierzchni błony cytoplazmatycznej, nie przenikając przez nią. Peptydy oddziałują elektrostatycznie z hydrofilowymi głowami fosfolipidów pokrywając powierzchnię błony jak dywan. Przy dużym stężeniu peptydów następuje destabilizacja błony, jej pęknięcie, obniżenie potencjału błonowego komórki i wyciekanie składników cytoplazmy. Jest to mechanizm podobny do działania detergentu. Tak działa np. cekropina [55]. Kolejnym mechanizmem jest model „pierścieniowy”. Peptydy wnikają między dwie warstwy błony i powodują, że pojedyncza warstwa fosfolipidowa zagina się do wewnątrz tworząc szczelinę, w której znajdują się głowy fosfolipidów i peptydy. Peptydy połączone są przez cały czas z polarnymi głowami lipidów, nawet podczas przenikania przez dwuwarstwową błonę. Ten mechanizm niszczenia błon jest reprezentowany przez magaininę, protegrynę i mellitynę [60]. Ostatnią ze strategii niszczenia błon jest mechanizm tworzenia „nieuporządkowanych pierścieniowych porów”. Ta modyfikacja porów pierścieniowych polega na tym, że ułożenie peptydów jest mniej restrykcyjne niż w modelu „pierścieniowym”. Peptydy nie ustawiają się zawsze prostopadle w stosunku do błony, tak jak to było w modelu „pierścieniowym”, ale mogą być zakotwiczone w błonie pod różnym kątem [43]. Pomimo wielu różnic, te cztery mechanizmy mają również cechy wspólne. Wszystkie one prowadzą do destabilizacji błony i utraty zdolności komórki do życia. Zaburzony zostaje potencjał błonowy, gradient pH, regulacja osmotyczna oraz zatrzymany proces oddychania. Lokalne stężenie peptydów w błonie jest około 10 000 razy wyższe niż ich stężenie w fazie wodnej [43]. Oprócz dezintegracji błony komórkowej, przeciwdrobnoustrojowe peptydy mogą zabijać komórki patogenu w inny sposób. Wiele peptydów przekracza błonę cytoplazmatyczną i kumuluje się wewnątrz komórki. Peptydy te hamują syntezę kwasów nukleinowych poprzez wiązanie z DNA lub/i RNA, syntezę białek wpływając na aktywność ATPazową DnaK czy syntezę skład-

225

ników ściany komórkowej. Niektóre dodatkowo blokują aktywność innych enzymów [5, 6, 50]. Przedstawiona praca przeglądowa dotyczy jednej klasy AMP – defensyn. 2. Charakterystyka defensyn 2.1. Klasyfikacja, identyfikacja i struktura defensyn Defensyny są małymi (3–5 kDa) peptydami przeciwdrobnoustrojowymi o strukturze β-harmonijki, zawierającymi zwykle sześć reszt cysteinowych połączonych trzema mostkami dwusiarczkowymi. Możemy wśród nich wyróżnić 5 grup: defensyny kręgowców, do których należą defensyny ssaków α-, β-, i θ- oraz defensyny bezkręgowców i roślin. Obecnie znamy około 550 defensyn [www.defensins.bii.a-star.edu.sg]. Defensyny są wytwarzane przez różnorodne komórki wielu tkanek różnych organizmów. Defensyny α zidentyfikowano u królików, świnek morskich, szczurów, myszy i ludzi, natomiast defensyny β u bydła, owiec, kóz, świń, ptaków i ludzi. Ludzkie defensyny α, HNP-1,2,3,4 są wytwarzane w granulach neutrofili, a defensyny HD-5,6, (human defensins) w komórkach Paneth’a oraz komórkach nabłonkowych dróg rozrodczych kobiet. Ludzkie defensyny β charakteryzuje większa różnorodność miejsca wytwarzania. HBD-1 (human beta-defensin) jest syntetyzowana w komórkach nabłonkowych płuc i dróg moczowych, łożysku, nerkach, trzustce, tchawicy i prostacie, HBD-2 w komórkach nabłonkowych skóry, płuc, jelit i dróg moczowo-płciowych, HBD-3 w komórkach nabłonkowych nosa, migdałków, trzustki i oskrzeli oraz w ślinie i wydzielinie pochwowej a HBD-4 w jądrach, żołądku i macicy, płucach i nerkach [26, 62]. Defensyny θ wytwarzane są przez leukocyty i monocyty małp. U człowieka również zidentyfikowano gen, które mógłby potencjalnie kodować defensynę θ, ale w jego sekwencji nukleotydowej występuje przedwczes­ny kodon „stop”, co powoduje zahamowanie procesu translacji [47]. Defensyny bezkręgowców zostały wyizolowane z orga­nizmów nicieni, stawonogów i mięczaków, natomiast defensyny roślinne są wytwarzane przez wiele gatunków roślin. Wszystkie defensyny charakteryzują się strukturą stabilizowaną przez mostki disulfidowe pomiędzy resztami cysteinowymi. W defensynach α i β występują 3 mostki disulfidowe – w przypadku defensyn α pomiędzy cysteinami 1 i 6, 2 i 4 oraz 3 i 5, natomiast w przypadku defensyn β pomiędzy cysteinami 1 i 5, 2 i  4 oraz 3 i 6. W defensynach θ również występują trzy mostki disulfidowe. Niektóre defensyny bezkręgowców są stabilizowane przez 3 mostki disulfidowe – pomiędzy

226

Monika Żyłowska, Agnieszka Wyszyńska, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka

cysteinami 1 i 5, 2 i 4 oraz 3 i 6, natomiast inne charakteryzują się obecnością 4 mostków łączących cysteiny 1 i 8, 2 i 5, 3 i 6, 4 i 7, tak jak u roślin [31]. 2.1.1. Defensyny α Defensyny α nazywamy również defensynami klasycznymi. Są pierwszą odkrytą grupą defensyn. W 1980 roku L e h r e r wyizolował je z króliczych makrofagów, nieco później wykryto je również w króliczych granulocytach, a  następnie w fagocytach innych ssaków, takich jak: świnki morskie, szczury, myszy i człowiek. Do chwili obecnej opisano około 80 defensyn α. Ze względu na wiele interesujących funkcji, starano się poznać strukturę tych peptydów. Wiele z nich zostało oczyszczonych i zsekwencjonowanych. U człowieka dokładnie scharakteryzowano sześć α-defensyn, z  których cztery są odnajdywane głównie w ziarnach z  granulocytów (HPN-1, HPN-2, HPN-3 i HPN-4) a pozostałe dwie w komórkach Paneth’a jelita cienkiego (HD-5 i HD-6). Metodami krystalograficznymi i spektroskopowymi rozwiązano struktury kilku defensyn. Udokumentowano, że wszystkie klasyczne defensyny mają podobną konformację zawierającą trzypasmową strukturę β-kartki i  pętlę łączącą te pasma. Struktura ta tworzy tzw. „szpilkę do włosów”. Ludzkie defensyny tworzą formy dimeryczne, które formują wąską część lejka. Szersza część lejka jest tworzona przez sześciopasmowe β-kartki połączone dwoma pętlami. Takie ułożenie multimetrów jest łatwe do uformowania w roztworze oraz korzystne w  dwuwarstwowej błonie lipidowej. Fałdowanie tych peptydów jest procesem konserwowanym [29, 51]. Klasyczne defensyny są aktywne w stężeniu od  1 do 100  µg/ml przeciwko bakteriom, zarówno Gram-dodatnim jak i Gram-ujemnym, wirusom i grzybom. Aktywność przeciwbakteryjna i przeciwgrzybicza defensyn w granulocytach jest często hamowana przez białka osocza oraz kationy sodu i wapnia. Efekt działania jonów sodu polega na zahamowaniu niespecyficznych interakcji elektrostatycznych pomiędzy dodatnio naładowaną defensyną a ujemnie naładowaną błoną. Efekt hamującego działania wapnia jest częściej spotykany wobec bakterii Gram-ujemnych i polega na współzawodnictwie o specyficzne miejsca wiążące zewnętrznej błony tych drobnoustrojów [21]. Ludzkie defensyny, pomimo wielu podobieństw strukturalnych, różnią się aktywnością wobec tych samych gatunków drobnoustrojów. Wykazano, że najsilniejszą bakteriobójczą aktywność spośród defensyn neutrofilnych przeciwko Staphylococcus aureus wykazuje defensyna HNP-2 a najsłabszą HNP-4. Natomiast najsilniejszą aktywność przeciwko Escherichia coli i Enterobacter aerogenes wykazuje HNP-4, a najsłabszą HPN-1 i HPN-3. Defensyna HD-5, podobnie jak HNP-2, wykazywała wysoką aktywność wobec bakterii Gram-ujemnych,

a defensyna HD-6 wykazywała aktywność tylko wobec Bacillus cereus [17]. Co ciekawe, defensyny klasyczne mogą również stymulować adherencję niektórych bakterii do komórek wytwarzających te peptydy. Adherencja Heamophilus influenzae, Moraxella catarrhalis i Neisseria meningitidis do różnych typów komórek jest istotnie wyższa w obecności defensyn. Tak więc w niektórych przypadkach defensyny mogą działać niekorzystnie dla organizmu i brać udział w wywołaniu objawów chorobowych [24]. S a l z m a n i wsp. udowodnili, że α-defensyny wytwarzane przez komórki układu pokarmowego ssaków biorą udział w utrzymaniu homeostazy jelitowej. W jelicie cienkim człowieka dochodzi do ekspresji genów kodujących dwie α-defensyny: HD-5 i HD-6. Udokumentowano silną korelację pomiędzy poziomem α-defensyn a rodzajem limfocytów obecnych w jelitowej tkance limfatycznej. Zachowanie równowagi pomiędzy dwoma typami komórek T (helperowych i regulatorowych) jest niezbędna do prawidłowej regulacji odpowiedzi immunologicznej. W jej utrzymaniu biorą udział defensyny [59]. D e L e e u w i wsp. udowodnili, że defensyna HNP-1 wykazuje mechanizm działania inny niż permeabilizacja błony komórkowej. Peptyd ten wiąże się do prekursora syntezy ściany komórkowej, lipidu II, przez co hamuje syntezę ściany komórkowej patogenu. Niszczenie w ten sposób komórek bakteryjnych zależy od poziomu lipidu II. Obecność inhibitorów syntezy ściany komórkowej, takich jak fosfomycyna, D-cykloseryna lub bacitracyna, znacząco obniża zdolność defensyny HNP-1 do zabijania patogenów. Mechanizm ten wyjaś­ nia, dlaczego α-defensyny są dużo bardziej skuteczne wobec bakterii Gram-dodatnich niż defensyny β [14]. 2.1.2. Defensyny β Defensyny β, zbudowane 38–42 aminokwasów, odkryto na początku lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku. Peptydy te zidentyfikowano u bydła, owiec, kóz, świń, ptaków (kur i indyków) i ludzi. Pierwszą β-defensyną odkrytą u ssaków był peptyd TAP (tracheal antymicrobial peptide) wyizolowany z bydlęcej tkanki tchawicy przez Diamonda w 1991 roku. Peptyd ten wykazywał właściwości bakteriobójcze wobec Gram-ujemnych i Gram-dodatnich bakterii oraz właściwości przeciwgrzybicze wobec drożdżaków z rodzaju Candida [15]. U  ludzi pierwszą β-defensynę odkryto w 1995 roku (HBD-1). Jej obecność stwierdzono w komórkach nabłonkowych tchawicy, oskrzeli, dróg oddechowych, przyusznicy, błony śluzowej policzków, języka i dziąseł także w jelicie cienkim, trzustce, nerkach, prostacie, jądrach, pochwie, macicy, jajowodach, łożysku i grasicy. Defensyna HBD-1 działa przeciwko bakteriom Gram-ujemnym [3]. Obecnie znamy ok. 190 β-defensyn: 48 z nich to defensyny ludzkie. Rozwiązano struktury dwunastu z nich.

Defensyny – peptydy o aktywności przeciwbakteryjnej

W sekwencjach aminokwasowych β-defensyn występuje sześć reszt cysteinowych, których położenie jest konserwowane. Oprócz nich występuje niewiele innych konserwowanych reszt aminokwasowych: glicyna i glutamina. W 4 β-defensynach (HBD-1–4) człowieka odnotowano wysoką zawartość kationowych reszt lizyny i argininy, zgromadzonych w karboksyterminalnym fragmencie peptydu [52]. Rdzeń β-defensyn jest zbudowany z trzech β-harmonijek tworzących antyrównoległą β-kartkę. β-kartka jest oflankowana α-helikalnym segmentem o zróżnicowanej długości. Orientacja α-helisy względem β-kartki jest stabilizowana przez mostki disulfidowe. Z powodu specyficznych połączeń pomiędzy resztami cysteinowymi β-defensyny zostały uznane za oddzielną grupę defensyn. Część drugiej β-harmonijki, z konserwowanym motywem Gly-X-Cys, formuje strukturę zwaną β-wybrzuszeniem niezbędną dla prawidłowego zwijania i formowania struktury natywnej ssaczych defensyn [82]. Defensyny β formują oligomeryczne struktury, które odgrywają znaczącą rolę w ich aktywności biologicznej i funkcjonowaniu. Za pomocą metod krystalograficznych zaobserwowano tworzenie oktamerów przez defensynę HBD-2. Oktamery tworzą cztery niekowalencyjnie połączone dimery, stabilizowane przez inter­ akcje pomiędzy pierwszymi β-harmonijkami monomerów. Defensyna HBD-1 tworzy słabo połączone ze sobą dimery, stabilizowane przez mostki solne, podobnie jak defensyna HBD-3, której symetryczne dimery oprócz mostków solnych są stabilizowane przez wiązanie hydrofobowe. Defensyna HBD-3 tworzy w roztworach stabilne dimery. Jej aktywność przeciwbakteryjna jest niezależna od obecności soli, w odróżnieniu od HBD-1, której aktywność zależy od stężenia NaCl [4, 30]. β-defensyny wykazują różne spektrum działania, najczęściej jednak wykazują aktywność przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym oraz drożdżakom. Np. defensyna bydlęca TAP jest aktywna wobec takich gatunków bakterii jak E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, oraz drożdżaków: C. albicans i C.tropicalis a  jej minimalne stężenie hamujące wynosi 6–125 µg/ml w zależności od drobnoustroju. Podobnie inne defensyny mogą wykazywać aktywność wobec wielu drobnoustrojów, jednak niektóre wykazują przeciwbakteryjne działanie w niższym stężeniu a inne dopiero wtedy, gdy ich stężenie jest odpowiednio wysokie [45]. Badania dotyczące ludzkich defensyn β udokumentowały, że peptydy te wykazują większą aktywność wobec patogenów tlenowych niż wobec beztlenowych [36]. Niektóre badania wykazały również potencjalną przeciwbakteryjną aktywność syntetycznej defensyny HBD-4 wobec Burkholderia cepacia, bakterii opornej na działanie innych peptydów przeciwdrobnoustrojowych i antybiotyków.

227

2.1.3. Defensyny θ Defensyny θ są najpóźniej poznaną grupą defensyn. Pierwszą defensynę z tej grupy, RTD1 (rhesus theta-defensin), obecną w leukocytach i monocytach rezusa (Rhesus macaque), opisał zespół S e l s t e d a w 1999 roku [71]. Nieco później wykryto u rezusa obecność dwóch kolejnych defensyn – RTD-1 i RTD-2. Defensyny RTD-1, -2 i -3 wykazują aktywność przeciwbakteryjną, przeciwgrzybiczą oraz przeciwwirusową. Peptydy te mają kolistą strukturę, powstającą przez połączenie dwóch 9-amino­ kwasowych sekwencji pochodzących z  prekursorów θ-defensyn. Budują je dwie antyrównoległe β-kartki połączone dwoma pętlami α. Defensyny  θ wykazują aktywność w obecności NaCl, dwuwartościowych jonów oraz osocza, w odróżnieniu od defensyn α i β [73]. N g u y e n i wsp. prowadzili badania filogenetyczne, które ujawniły, że geny θ-defensyn występują u innych małp Starego Świata oraz u dwóch małp człekokształtnych (gibon i orangutan). U ludzi, szympansów i goryli występuje pseudogen, którego prekursor mRNA zawiera przedwczesny kodon „stop” w sekwencji sygnałowej, przez co nie dochodzi do jego translacji [47]. Defensyny θ są również wytwarzane przez pawiana. Pięć tych defensyn zostało wyizolowanych i oczyszczonych (BTD1-5, babon theta-defensin). Analizy RT-PCR mRNA pochodzącego ze szpiku kostnego pawiana wykazały obecność trzech (u Papio Anubis) i czterech (u  Theropitecus gelada) prekursorów mRNA. Defensyny  θ pawiana wykazały aktywność wobec bakterii Gram-ujemnych, Gram-dodatnich oraz drożdży [23]. Zespół S t e g e m a n n a wyizolował dwie θ-defensyny (PhTD-1, -3, papio hamadrys theta-defensin) z leu­kocytów pawiana płaszczowego (Papio hamadrys). Defensyny te mają strukturę taką samą jak inne defensyny θ. Wykazują aktywność w stosunku do bakterii takich jak Listeria monocytogenes, metycylinooporne szczepy S. aureus, E. coli oraz drożdżaków C. albicans [69]. 2.1.4. Defensyny bezkręgowców Defensyny bezkręgowców, wyizolowane z komórek nicieni, stawonogów i mięczaków, pełnią kluczową rolę w odporności tych organizmów. Peptydy te są zbudowane z 38–45 reszt aminokwasowych, jednak sekwencja aminokwasowa defensyn u różnych gatunków jest odmienna. Obecnie znamy około 170 defensyn bez­ kręgowców. Peptydy te wytwarzane są przez komórki tłuszczowe oraz komórki krwi – trombocyty. W strukturze trzeciorzędowej zawierają α-helisę połączoną pętlą z  antyrównoległą β-kartką. U większości bezkręgowców struktura trzeciorzędowa defensyn jest stabilizowana przez trzy mostki disulfidowe, jednak w niektórych występują cztery mostki, np. w defensynie MGD1 wyizolowanej z Mytilus galloprovincialis oraz drozomycynie wyizolowanej z Drosophilla melanogaster.

228

Monika Żyłowska, Agnieszka Wyszyńska, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka

Duża zmienność sekwencji aminokwasowej defensyn bezkręgowców wynika z różnorodności sekwencji aminokwasowej ich prekursorów oraz struktury intronów i eksonów. Ta wielka różnorodność jest skutkiem zmian defensyn w procesie ewolucji – wraz z ewolucją bezkręgowców ewoluowały defensyny przez nie produkowane [58]. Hemolimfa owadów nabywa właściwości przeciwdrobnoustrojowych po zranieniu owada lub penetracji przez drobnoustroje. Defensyny owadzie są dużą grupą peptydów odnajdywaną w hemolimfie różnych gatunków owadów. Większość defensyn owadzich ma aktywność przeciwbakteryjną wobec bakterii gramdodatnich. Do zahamowania wzrostu tych bakterii dochodzi już w  niskim stężeniu defensyn (1–100 µg/ml). Gram-ujemne bakterie, drożdżaki i grzyby strzępkowe są mniej wrażliwe na ich działanie. Zidentyfikowano także kilka defensyn o właściwościach przeciwgrzybiczych: termicyna z Pseudacanthotermes spiniger, drozomycyna z D. melanogaster, heliomycyna z Heliothis verescens oraz gallerimycyna z larwy Galleria mellonella [2]. 2.1.5. Defensyny roślinne Defensyny roślinne są małymi peptydami, zbudowanymi z 45–54 reszt aminokwasowych, zawierającymi charakterystyczny wzór zwinięcia stabilizowany czterema mostkami disulfidowymi. Pierwsza roślinna defensyna, γ-tionina, została wyizolowana z ziaren pszenicy i jęczmienia w 1990 roku. Podobieństwo struktury γ-tioniny do defensyn ssaczych i owadzich pozwoliło zaklasyfikować ten peptyd do rodziny defensyn [11]. Struktura defensyn roślinnych jest podobna do struktur trzeciorzędowych ssaczych β-defensyn i defensyn owadów – struktura β-kartki połączona równolegle z α-helisą. W genomie Arabidopsis thaliana zidentyfikowano 13 genów potencjalnie kodujących defensyny. Okazało się, że wytwarzane jest tylko 11 peptydów. Dwa dodatkowe geny kodują białka o długości 122 i 129 aminokwasów, których karboksyterminalne domeny wykazują obecność konserwowanego wzoru reszt cysteinowych charakterystycznego dla wszystkich roślinnych defensyn. Prawdopodobnie białka te są białkami fuzyjnymi [72]. Większość defensyn roślinnych hamuje wzrost wielu rodzajów grzybów, a niektóre również wykazują aktywność przeciwbakteryjną. W odróżnieniu do defensyn bezkręgowców i ssaków, defensyny roślinne nie oddziałują bezpośrednio z fosfolipidami błony komórkowej. Ich działanie opiera się głównie na modulowaniu stężenia jednowartościowych i dwuwartościowych kationów we wnętrzu komórki. Przeciwgrzybiczą aktywność wykazują defensyny wyizolowane z dalii, rzodkiewki, żurawki, groszku i lucerny [8].

2.2. Biosynteza defensyn Dzięki sklonowaniu cDNA przedstawicieli wszystkich klas ludzkich defensyn wykazano, że wszystkie ich typy są syntetyzowane w postaci prepropeptydów, w których skład wchodzą: sekwencja sygnalna, sekwencja aminokwasowa propeptydu oraz sekwencja aminokwasowa kodująca dojrzałe białko. Defensyny α są produkowane w postaci prepropeptydu zbudowanego z 90–100 reszt aminokwasowych, w którego skład wchodzą: prekursor aminokwasowy zawierający w N-terminalnym fragmencie około 19-aminokwasową sekwencję sygnalną, ok. 5-aminokwasowy anionowy propeptyd oraz ok. 30-aminokwasową, C-terminalną, kationową sekwencję aminokwasową kodującą dojrzały peptyd [13]. Biosynteza defensyn α ma miejsce w  szpiku kostnym oraz w neutrofilowych komórkach prekursorowych. Dojrzałe neutrofile krążą w krwi w poszukiwaniu odpowiedniej tkanki; w tym czasie nie zachodzi jeszcze synteza nowych defensyn. Podczas syntezy defensyn w komórkach szpiku kostnego, sekwencja sygnałowa jest szybko usuwana, ale późniejsze procesowanie proteolityczne prepropeptydu do dojrzałej defensyny zajmuje wiele godzin, a końcowe proteolityczne roz­ szczepienie ma miejsce już w dojrzałych granulach [75]. Struktura prekursora defensyn β jest prostsza. Prekursor jest zbudowany z aminokwasowej sekwencji sygnalnej, krótkiego propeptydu (może w ogóle nie być propeptydu) i C-terminalnej sekwencji aminokwasowej dojrzałej defensyny. Ich procesowanie również polega na obróbce proteolitycznej [20]. W biosyntezie defensyn θ biorą udział dwa prepropetydy. W ich skład wchodzą aminokwasowe sekwencje sygnalne, sekwencja aminokwasowa propeptydu oraz dojrzałej defensyny. Prepropeptydy są zbudowane z ok. 90 aminokwasów, natomiast dojrzały peptyd, po obróbce proteolitycznej, z 9 aminokwasów. Podczas procesowania dochodzi do połączenia C-terminalnych domen, w wyniku czego powstaje 18-aminokwasowy peptyd [71]. Analiza sekwencji aminokwasowych najbardziej powszechnych defensyn, wydedukowana z sekwencji nukleotydowej ich cDNA, wykazuje charakterystyczny rozkład aminokwasów – ujemny ładunek sekwencji aminokwasowej propeptydu neutralizuje dodatni ładunek sekwencji aminokwasowej dojrzałego peptydu. Ta obserwacja sugeruje, że propeptyd oddziałuje z dojrzałym peptydem podczas biosyntezy defensyn, ułatwiając proces zwijania białka oraz zapobiegając nieprawidłowym interakcjom z innymi białkami [44]. 2.3. Struktura genetyczna i regulacja ekspresji     genów kodujących defensyny Geny kodujące defensyny charakteryzują się bardzo różnorodną strukturą genetyczną i wieloma sposobami

Defensyny – peptydy o aktywności przeciwbakteryjnej

regulacji kodujących je genów. Te wyizolowane ze szpiku zawierają trzy eksony, natomiast geny kodujące defensyny występujące w komórkach Paneth’a zawierają dwa eksony. Fragment 5’ genów, nie podlegający translacji, oraz fragment kodujący sekwencję sygnalną są silnie konserwowane. W obu grupach, propeptyd i dojrzała część defensyn są kodowane przez oddzielne eksony. Taka organizacja genetyczna może sprzyjać rekombinacji pomiędzy fragmentem kodującym propeptyd i fragmentem kodującym dojrzałą defensynę, co skutkuje powstawaniem różnych peptydów w tych samych przedziałach komórki. Zmienność peptydów może być też wynikiem różnej obróbki potranslacyjnej, co prowadzi do powstawania peptydów o różnym składzie aminokwasowym na N-końcu. Wszystkie geny kodujące klasyczne defensyny są zlokalizowane na chromosomie 8 [75]. W genomie człowieka odnaleziono około 40-stu regionów potencjalnie kodujących β-defensyny. Z powodu wysokiej częstości zachodzenia procesu duplikacji genów w skupiskach genów kodujących β-defensyny, możemy podejrzewać, że liczba tych genów jest nawet wyższa. Niektóre ze zidentyfikowanych genów to pseudogeny zawierające w mRNA przedwczesny kodon „stop”. Geny kodujące β-defensyny znajdują się na różnych chromosomach: 8, 6, 20 [61]. Geny kodujące ludzkie β-defensyny mają podobną strukturę genetyczną. Zawierają dwa eksony i jeden intron. Jedynym wyjątkiem jest gen kodujący defensynę HBD-1, który zawiera trzy eksony i dwa introny. Pierwszy ekson koduje hydrofobową sekwencję sygnalną a w drugim zawarte są informacje o sekwencji aminokwasowej dojrzałego białka poprzedzonego krótkim, anionowym propeptydem. Potranslacyjna obróbka obejmuje proteolityczne wycięcie sekwencji sygnalnej przez enzym elastazę lub proteinazę a następnie usunięcie N-końcowego propeptydu [74]. Regulacja ekspresji genów kodujących β-defensyny jest bardzo skomplikowana. Ekspresja defensyny HBD-1 może być konstytutywna lub indukowana obecnością lipopolisacharydu (LPS) lub interferonu gamma (IFN-γ) [16]. Poziom ekspresji genów kodujących defensynę HBD-2 w jelicie jest dużo niższy niż genów kodujących defensynę HBD-1, co sugeruje, że regulacja ekspresji musi przebiegać inaczej. Ekspresja hBD-2 jest stymulowana przez interleukinę 1α (IL-1α), interleukinę 1β (IL-1β), czynnik nekrozy nowotworów (TNF-α), izoleucynę, 1,25-dihydroksywitaminę D, lipopolisacharyd oraz niektóre Gram-ujemne bakterie [16]. Transformujący czynnik wzrostu β1 (TGF-β1) również stymuluje transkrypcję i ekspresję hBD-2, ale tylko w komórkach naczyń śródbłonka naczyniowego. W komórkach nabłonkowych jamy ustnej nie zaobserwowano stymulacji ekspresji genów kodujących tą defensynę przez czynnik TGF-β1 [38]. Udowodniono również, że eks-

229

presja hBD-2 w limfocytach B może być indukowana przez DNA zawierający motywy CpG. DNA, zawierający nie zmetylowane dinukleotydy cytozyny i guaniny, stymuluje ekspresję hBD-2 w komórkach nabłonkowych układu oddechowego [28]. Indukcja ekspresji genów kodujących defensyny może również zachodzić po pobudzeniu receptorów TLR, które rozpoznają tzw. wzorce molekularne mikroorganizmów patogennych takie jak np. LPS, flagellinę czy lipoproteidy. Stymulacja TLR4 indukuje ekspresję hBD-2 w odpowiedzi na infekcję Chlamydia pneumoniae [9]. Podobnie regulowana jest ekspresja genu kodującego defensynę HBD-3, choć zaobserwowano wpływ na ten proces także transformowanego czynnika wzros­tu  α (TGF-α) oraz podobnego do insuliny czynnika wzrostu 1 (IGF-1) [66]. Ekspresję hBD-3 w keratynocytach stymuluje histamina. Defensyna HBD-3 wiąże się z receptorami na powierzchni komórek tucznych i wpływa na ich chemotaksję i degranulację, co w rezultacie prowadzi do uwolnienia histaminy. Uwolniona histamina aktywuje syntezę HBD-3 poprzez oddziaływanie z receptorem H1 obecnym na powierzchni keratynocytów [33]. Poznane czynniki regulujące ekspresję genów kodujących defensynę HBD-4 są podobne do czynników wymienionych w przypadku hBD-2 i hBD-3 [66]. 2.4. Interakcje defensyn z błoną komórkową patogenu Wszystkie defensyny mają zdolność do zabijania lub inaktywowania określonych gatunków bakterii, wirusów, grzybów lub pasożytów i są uważane za główne efektory odporności wrodzonej organizmu. Do niszczącego działania defensyn dochodzi w wakuolach fagocytów, na powierzchni skóry i w komórkach nabłonkowych, gdzie panuje niska siła jonowa. Selektywność działania peptydów jest uzależniona od różnic w budowie błony komórkowej patogenów [83]. Celem przeciwbakteryjnego działania defensyn jest błona komórkowa patogenów. Peptydy te oddziałują elektrostatycznie z błoną poprzez interakcje z ujemnie naładowanymi lipidami lub/i oddziaływanie defensyn jest determinowane przez potencjał transmembranowy błony. Jej struktura różni się od bogatych w fosfatydylocholinę cytoplazmatycznych błon eukariotycznych i  dzięki temu defensyny selektywnie działają tylko na błony komórkowe bakterii [79]. Wielu interesujących informacji dotyczących oddziaływań defensyn z błoną komórkową dostarczyły eksperymenty wykorzystujące sztucznie stworzone modele błon komórkowych lub pęcherzyki lipidowe. K a g a n i wsp. analizowali oddziaływania króliczej defensyny NP-1 i ludzkiej HNP-1 wykorzystując dwuwarstwową błonę zbudowaną z lipidowej mieszaniny zawierającej w różnych ilościach cząsteczki fosfatydyletanoloaminy, fosfatydylocholiny oraz fosfatydyloseryny.

230

Monika Żyłowska, Agnieszka Wyszyńska, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka

Udokumentowano, że wydajność permeabilizacji błony przez defensyny zależy od jej składu chemicznego [37]. Stosując jako model badawczy małe jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe zbudowane z mieszaniny dipalmitylofosfocholiny i dioleilofosfatydyloseryny analizowano interakcje z błoną α-defensyn (NP-2 i HNP-1). Wykazano, że badane peptydy powodują fuzję i lizę pęcherzyków na drodze oddziaływań zarówno elektrostatycznych jak i hydrofobowych. Udokumentowano także, zgodnie z poprzednio poczynionymi obserwacjami, że defensyny o  zredukowanych wiązaniach dwusiarczkowych nie wykazują pełnej aktywności [19, 51]. W i m l e y i wsp. badali interakcje defensyny ludzkiej HNP-2 z dużymi jednowarstwowymi pęcherzykami lipidowymi zbudowanymi z ujemnie naładowanego lipidu palmitylooleilofosfatydyloglicerolu. Udowodnili oni, że defensyna ta tworzy pierścieniowe pory uformowane w heksamer. Zarówno natywna, jak i zredukowana forma HNP-2 powoduje przeciekanie błony prowadzące do śmierci komórki, jednak mechanizm działania obu tych form nieco się różni i jest zależny od stężenia dimerów peptydu wbudowanych w błonę [81]. 2.5.  Modulacja działania układu immunologicznego     przez defensyny Defensyny odgrywają istotną rolę zarówno we wrodzonej, jak i nabytej odporności organizmu. We wrodzonej odporności peptydy te głównie pełnią rolę cząs­ teczek efektorowych, natomiast w odporności nabytej przyczyniają się do regulacji odpowiedzi immunologicznej w odpowiedzi na inwazję patogenów. Defensyny α i β wywierają wpływ na odporność wrodzoną. Ludzkie neutrofilne defensyny α wprowadzone do mysich makrofagów podwyższają ich zdolność do fagocytozy [32]. Defensyny α człowieka, królika i świnki morskiej oraz defensyny β indukują aktywację i degranulację komórek tucznych, co prowadzi do uwolnienia histaminy i prostaglandyny D2, które są mediatorami stanu zapalnego [48]. HNP-1, -2 i -3 stymulują komórki tkanki nabłonkowej oskrzeli do transkrypcji genów interleukiny 8 (IL-8), aktywującej neutrofile [77]. Ludzkie defensyny α mogą zwiększać poziom produkcji czynnika nekrozy nowotworów (TNF) i interleukiny-1 (IL-1) oraz obniżać poziom produkcji interleukiny 10 (IL-10), która jest czynnikiem przeciwzapalnym, efektywnie limitującym produkcję czynników prozapalnych [10]. Defensyna HBD-3 wywołuje odwrotny efekt – działa przeciwzapalnie. Dowiedziono, że w obecności LPS, HBD-3 efektywnie hamuje akumulację czynników prozapalnych TNF-α i IL-6 w osoczu. Przeciwzapalny efekt działania HBD-3 nie jest zależny od IL-10 oraz od poziomu cAMP, ważnego czynnika kontrolującego układ immunologiczny. Zarówno cAMP jak i HBD-3 obniżają poziom czynnika TNF-α w komórce, ale obecność HBD-3 hamuje działanie cAMP, co sugeruje, że

cAMP i HBD-3 działają na zasadzie dwóch różnych mechanizmów. Obniżanie poziomu czynnika TNF-α w osoczu, indukowanego obecnością LPS, przez HBD-3 wskazuje, że HBD-3 może być ważnym czynnikiem kontrolującym proces zapalny i szok septyczny [63]. Co więcej, defensyny wzmacniają lub tłumią aktywację klasycznej ścieżki układu dopełnicza [76]. Defensyny jelitowe, HD-5 i HD-6, wytwarzane przez komórki Paneth’a w jelicie cienkim, odgrywają istotną rolę w zwalczaniu infekcji jelitowych. Znokautowane myszy z inaktywowanym genem kodującym matryli­ zynę, metaloproteazę przekształcającą nieaktywne formy defensyn wytwarzanych przez te komórki do form aktywnych, były dużo bardziej wrażliwe na zakażenia bakteryjne i szybciej umierały po infekcji Salmonella enterica sv. Typhimurium. Utwierdza to w przekonaniu, że α-defensyny pełnią ważną rolę w ochronie przed jelitowymi patogenami. Defensyny HD-5 i HD-6 hamują rozwój choroby Leśniowskiego-Crohna – choroby zapalnej jelita. Uwalnianie defensyn z komórek Paneth’a jest stymulowane obecnością glikolipidów ścian komórkowych bakterii [70]. U pacjentów ze stanem zapalnym końcowej części jelita cienkiego – jelita krętego, wykazano dużo niższy poziom defensyn HD-5 i HD-6. Defensyny α działają chemotaktycznie na niedojrzałe komórki dendrytyczne, niedojrzałe limfocyty T oraz limfocyty T CD8. Natomiast defensyny β są bardziej selektywne i działają chemotaktycznie wyłącznie na komórki posiadające receptor CCR6, odpowiedzialny za chemotaksję chemokiny prozapalnej makrofagów – białka 3α (MIP-3α, macrophage inflammatory protein) oraz defensyn β [49]. 2.6.  Mechanizmy oporności bakterii na defensyny Różnorodność defensyn produkowanych przez wiele ewolucyjnie odległych organizmów utrudnia pato­ genom ochronę przed nimi. Drobnoustroje wykształciły wiele mechanizmów oporności, pozwalających im uniknąć destrukcyjnej działalności niektórych przeciwbakteryjnych peptydów. Do tych strategii należy unikanie wiązania i wbudowywania peptydu w błonę oraz zmiany przepuszczalności błony cytoplazmatycznej. Najczęściej stosowaną strategią jest zmiana struktur osłon komórkowych. Jednym z mechanizmów oporności wykształconych przez bakterie jest zamiana anionowych składników ściany komórkowej na składniki kationowe. Takiej strategii używa Gram-dodatni gronkowiec, S. aureus. Ujemny ładunek w ścianie komórkowej wytworzony przez kwasy tejchojowe jest modyfikowany przez wbudowywanie do osłon komórkowych D-alaniny transportowanej z cytoplazmy, przez produkty genów operonu dlt. Inaktywacja operonu dlt skutkuje zwiększeniem wrażliwości S. aureus na defensyny [54]. Ope-

Defensyny – peptydy o aktywności przeciwbakteryjnej

ron dlt występuje również w genomach innych Gram-dodatnich patogenów np. Listeria monocytogenes [1] i Streptococcus grupy B [56]. Estryfikacja kwasów tejchojowych także powoduje zmianę ładunku ujemnego na dodatni, przez dodanie grup aminowych. S. aureus modyfikuje błonę poprzez wbudowanie L-lizyny do fosfatydyloglicerolu, dzięki obecności genu mprF kodującego syntazę lizylofosfatydyloglicerolu (LPG), co również skutkuje wzrostem oporności na defensyny [53]. Bakterie Gram-ujemne „bronią się” przed defensynami poprzez modyfikację zewnętrznej błony komórkowej. Modyfikacja ta polega na acylacji lipidu  A lipopolisacharydu lub na redukcji płynności błony zewnętrznej wskutek oddziaływań hydrofobowych między wzrastającą liczbą acylowanych cząsteczek lipidu A. W komórkach S. enterica genem odpowiedzialnym za acylację lipidu A jest gen pagP kodujący transferazę palmitynową [27]. Jego homologami są rcp, kodujący białko Rcp Legionella pneumophila [57] i htrB kodujący acylotransferazę Heamophilus influenzae [68]. S. enterica sv. Typhimurium wykształciła również inny sposób obrony przed działaniem defensyn. Do fosforanowych grup w lipidzie A przyłączane są cząsteczki arabinozy, co redukuje oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy kationowymi peptydami a negatywnie naładowanymi fosforanami [25]. Ten mechanizm oporności wymaga aktywności dwuskładnikowego systemu regulatorowego PhoP-PhoQ. Dołączanie cząsteczek arabinozy do grup fosforanowych w lipidzie A jest również strategią obrony przed defensynami Proteus mirabilis, bakterii powodującej infekcje dróg moczowych. [42]. Dowiedziono również, że „niszczenie” błony komórkowej S. enterica sv. Typhimurium prowadzi do indukcji regulonu σE , kontrolującego ekspresję wielu genów, między innymi genów zaangażowanych w mechanizmy oporności na defensyny [12]. Podobnie jest w przypadku bakterii Listeria monocytogenes i L. ivanovii – termoregulowany czynnik transkrypcyjny PrfA kontroluje ekspresję genów regulujących oporność bakterii na defensyny. W temp. 37°C patogenne szczepy L. monocytogenes i L. ivanovii są oporne na bakteriobójcze działanie defensyn HD-1 i HD-2, natomiast szczepy niepatogenne są wrażliwe [39]. Mycobacterium marinum wytwarza specyficzne lipidowe składniki ściany komórkowej, występujące jedynie u prątków – kwasy mikolowe . Ich wytwarzanie jest zależne między innymi od obecności genu kasB (3-oxyl-(acyl carrier protein) synthase I). Badania wykorzystujące mutagenezę insercyjną wykazały, że mutanty z unieczynnionym genem kasB wykazują większą wrażliwość na defensyny [22]. W komórkach niektórych Gram-ujemnych bak­ terii oporność na defensyny związana jest z obecnością specyficznych białek błony zewnętrznej. W komórkach Yersinia enterocolitica oporność warunkowana jest obec-

231

nością plazmidu pYVe, który koduje między innymi wielofunkcyjną adhezynę A (YadA). Mutanty ze znokautowanym genem kodującym białko YadA wykazują wyższą wrażliwość na defensyny niż szczepy dzikie [78]. Inny rodzaj strategii wypracowanej przez mikro­ organizmy polega na wytwarzaniu polisacharydowych otoczek. Przykładem może być występowanie otoczki komórek Klebsiella pneumoniae, która zapewnia bakterii oporność na defensyny HNP-1 oraz HBD-1 i -2. Otoczka K. pneumoniae nie tylko chroni bakterię przez niszczącym działaniem peptydów, ale może również, prawdopodobnie na drodze przekazywania sygnału, hamować ekspresję genów β-defensyn HBD-1 i  -2 w  komórkach nabłonkowych układu oddechowego. Mutanty ze znokautowanymi genami kodującymi antygen O lipopolisacharydu wykazywały podobny poziom oporności jak dzikie patogeny, co utwierdza w przekonaniu, że nie antygen O, a otoczka polisacharydowa ma największy wpływ na oporność K. pneumoniae. Bezotoczkowe mutanty indukują wyższy poziom indukcji ekspresji β-defensyn niż typ dziki i są na nie dużo bardziej wrażliwe [46]. S. aureus wytwarza stafylokinazę, białko aktywujące plazminogen. Okazało się, że stafylokinaza również indukuje uwalnianie α-defensyn z leukocytów wielo­ jądrzastych. Stafylokinaza wiąże się z α-defensynami, co w konsekwencji prowadzi do zahamowania bakteriobójczego działania defensyn. Stafylokinaza z zablokowanym miejscem wiążącym plazminogen zachowuje zdolność do neutralizacji działania defensyn, ale jedna mutacja punktowa w stafylokinazie – zmiana lizyny na alaninę w  pozycji 74, skutkuje obniżeniem oporności o 50% [35]. Streptococcus grupy A wykazuje podobny mechanizm oporności. Patogen ten wytwarza wielofunkcyjne białko M, które pokrywa powierzchnię komórki oraz jest jednym z istotnych czynników wirulencji. Białko M w obecności czynników przeciwbakteryjnych aktywuje sekrecję białka SIC (complement inhibitor protein) na zewnątrz komórki, które ma zdolność do wiązania się z α-defensynami i ich inaktywowania [18]. Kolejnym mechanizmem oporności na defensyny są pompy wyrzutowe (efflux pumps). H. influenzae wytwarza białka budujące pompę wyrzutową o aktywności zależnej od stężenia jonów K+, dzięki której możliwe jest aktywne usuwanie β-defensyn z komórki bakteryjnej, przy równoczesnym pobieraniu jonów potasu do jej wnętrza [41]. Wiele innych patogenów również posiada pompy wyrzutowe, ale zapewniają one oporność na inne ro­dzaje AMP, np. Neisseria gonorrhoeae posiada zależny od energii system wyrzutowy MtrCDE, który warunkuje oporność na protegrynę-1 i ludzką katelicydynę LL-37 [65]. Patogeny mogą też modulować poziom ekspresji genów kodujących defensyny. Shigella flexneri, Gram-ujemny patogen powodujący ciężkie zatrucia pokarmowe wpływa na poziom ekspresji genów kodujących

232

Monika Żyłowska, Agnieszka Wyszyńska, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka

AMP. W komórkach pobranych podczas biopsji odbytniczej pacjentów zarażonych tą bakterią stwierdzono bardzo niski poziom defensyny HBD-1 i katelidycyny LL-37. Sperandio i wsp. badali za pomocą techniki qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction) poziom ekspresji genów kilku AMP w  dwóch różnych liniach komórkowych zainfekowanych dzikim i zmutowanym szczepem S. flexneri. Typ dziki modulował ekspresję genów kodujących HBD-3 i  LL-37, natomiast mutant z inaktywowanym genem mxiE (gen kodujący czynnik transkrypcyjny MxiE), nie wpływał na ekspresję tych genów. Białka zależne od aktywatora MxiE są niezbędne dla procesu inwazji. Aktywator transkrypcji MxiE pośrednio wpływa na transkrypcję genów kodujących defensyny – zależne od niego cząsteczki efektorowe obniżają poziom ekspresji genów kodujących chemokiny, co prowadzi do zablokowania rekrutacji komórek dendrytycznych do zainfekowanego miejsca [67]. Mechanizmy oporności bakterii na defensyny kształtowały się od milionów lat, dlatego istnieje tak wiele strategii wykorzystywanych przez różne gatunki bak­ terii. Niektóre mikroorganizmy wykształciły kilka mechanizmów oporności, dzięki czemu są oporne na kilka rodzajów peptydów. Jednak gdy porównamy szybkość pojawiania się szczepów opornych na antybiotyki, które są powszechnie stosowane od niecałych 100 lat do szybkości pojawiania się szczepów opornych na defensyny, które istnieją od milionów lat, możemy stwierdzić, że oporność bakterii na działanie tych peptydów kształtuje się bardzo powoli. 3. Podsumowanie Bardzo wiele organizmów, odległych ewolucyjnie, wytwarza defensyny, jednak ich rolę odkryto stosun­kowo niedawno, około 30 lat temu. Od tamtego momentu rozpoczęto intensywne badania dotyczące ich struktury, mechanizmu działania, biosyntezy, regulacji ekspresji oraz czynników wpływających na ich aktywność. Defensyny są peptydami o ogromnym potencjale, który może być wykorzystany w niedalekiej przyszłości w terapiach przeciwbakteryjnych, wykazują bowiem nie tylko bezpośrednie, niszczące działanie wobec drobnoustrojów, ale również działają na komórki układu immunologicznego, stymulując lub hamując ich aktywność i kontrolując nabytą odpowiedź immunologiczną organizmu na infekcje. Trwają badania kliniczne dotyczące wielu defensyn. W 2005 roku duńska firma biotechnologiczna Novozymes ogłosiła sensacyjne odkrycie pierwszego peptydu przeciw bakteryjnego, nazwanego Plectasin, występującego u grzyba, Pseudoplectania nigrella i wykazującego aktywność wobec wieloopornych szczepów bakterii Gram-dodatnich, m.in. wobec

Streptococcus pneumoniae. Wykazano, że związek ten stosowany w terapii zapalenia płuc spowodowanego S. pneumoniae jest równie skuteczny jak penicylina i wankomycyna, a oprócz tego nie jest toksyczny [www. drugdevelopment-technology.com]. Również syntetycznea defensyna, o sekwencji aminokwasowej identycznej jak defensyna wytwarzana naturalnie przez kleszcze wykazuje wysoką aktywność antybakteryjną wobec bakterii Gram-dodatnich i może znaleźć zastosowanie terapeutyczne. Prowadzone są też liczne badania, często z wynikami pozytywnymi, dotyczące zastosowania defensyn w terapiach przeciwnowotworowych. Piśmiennictwo   1. Abachin E., Poyart C., Pellegrini E., Milohanic E., Fiedler F., Berche P., Trieu-Cuot P.: Formation of D-alanyl-lipoteichoic acid is required for adhesion and virulence of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 43, 1–14 (2002)  2. Aerts A.M., Francois I.E., Cammue B.P., Thevissen K.: The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life. Sci. 65, 2069–2079 (2008)  3. Bensch K.W., Raida M., Magert H.J., Schulz-Knappe P., Forssmann W.G., hBD-1: a novel beta-defensin from human plasma. FEBS Lett. 368, 331–335 (1995)   4. Boniotto M., Crovella S. i wsp.: A study of host defence peptide beta-defensin 3 in primates. Biochem. J. 374, 707–714 (2003)   5. Brogden K.A.: Antimicrobial peptides: pore formers or meta­ bolic inhibitors in bacteria? Nat. Rev. Microbiol. 3, 238–250 (2005)   6. Brotz H., Bierbaum G., Leopold K., Reynolds P.E., Sahl H.G.: The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II. Antimicrob. Agents. Chemother. 42, 154–160 (1998)  7. Bulet P., Stocklin R., Menin L.: Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates. Immunol. Rev. 198, 169–184 (2004)   8. Caaveiro J.M., Molina A., Gonzalez-Manas J.M., Rodriguez-Palenzuela P., Garcia-Olmedo F., Goni F.M.: Differential effects of five types of antipathogenic plant peptides on model membranes. FEBS Lett. 410, 338–342 (1997)   9. Carratelli R.C., Mazzola N., Paolillo R., Sorrentino S., Rizzo A.: Toll-like receptor-4 (TLR4) mediates human beta-defensin-2 (HBD-2) induction in response to Chlamydia pneumoniae in mononuclear cells. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 57, 116–124 (2009) 10. Chaly Y.V., Paleolog E.M., Kolesnikova T.S., Tikhonov II, Petratchenko E.V., Voitenok N.N.: Neutrophil alpha-defensin human neutrophil peptide modulates cytokine production in human monocytes and adhesion molecule expression in endothelial cells. Eur. Cytokine Netw. 11, 257–266 (2000) 11. Colilla F.J., Rocher A., Mendez E.: Gamma-Purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm. FEBS Lett. 270, 191–194 (1990) 12. Crouch M.L., Becker L.A., Bang I.S., Tanabe H., Ouellette A.J., Fang F.C.: The alternative sigma factor sigma is required for resistance of Salmonella enterica serovar Typhimurium to anti-microbial peptides. Mol. Microbiol. 56, 789–799 (2005) 13. Daher K. A., Lehrer R. I., Ganz T., Kronenberg M.: Isolation and characterization of human defensin cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7327–7331 (1988)

Defensyny – peptydy o aktywności przeciwbakteryjnej

14. de Leeuw E., Li C., Zeng P., Diepeveen-de Buin M., Lu W.Y., Breukink E., Lu W.: Functional interaction of human neutrophil peptide-1 with the cell wall precursor lipid II. FEBS Lett. 584, 1543–1548 (2010) 15. Diamond G., Zasloff M., Eck H., Brasseur M., Maloy W.L., Bevins C.L.: Tracheal antimicrobial peptide, a cysteine-rich peptide from mammalian tracheal mucosa: peptide isolation and cloning of a cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 3952–3956 (1991) 16. Duits L.A., Ravensbergen B., Rademaker M., Hiemstra P.S., Nibbering P.H.: Expression of beta-defensin 1 and 2 mRNA by human monocytes, macrophages and dendritic cells. Immunology, 106, 517–525 (2002) 17. Ericksen B., Wu Z., Lu W., Lehrer R.I.: Antibacterial activity and specificity of the six human {alpha}-defensins. Antimicrob. Agents. Chemother. 49, 269–275 (2005) 18. Frick I.M., Akesson P., Rasmussen M., Schmidtchen A., Bjorck L.: SIC, a secreted protein of Streptococcus pyogenes that inactivates antibacterial peptides. J. Biol. Chem. 278, 16561–16566 (2003) 19. Fujii G., Selsted M.E., Eisenberg D.: Defensins promote fusion and lysis of negatively charged membranes. Protein. Sci. 2, 1301–1312 (1993) 20. Gallo R.L., Nizet V.: Endogenous production of antimicrobial peptides in innate immunity and human disease. Curr. Allergy Asthma Rep. 3, 402–409 (2003) 21. Ganz T.: Defensins: antimicrobial peptides of vertebrates. C. R. Biol. 327, 539–549 (2004) 22. Gao L-Y., Laval F., Lawson E.H., Groger R.K., Woodruff A., Morisaki J.H., Cox J.S., Daffe M., Brown E.J.: Requirement for kasB in Mycobacterium mycolic acid biosynthesis, cell wall impermeability and intracellular survival: implications for therapy. Mol. Microbiol. 49, 1547–1563 (2003) 23. Garcia A.E., Osapay G., Tran P.A., Yuan J., Selsted M.E.: Isolation, synthesis, and antimicrobial activities of naturally occurring theta-defensin isoforms from baboon leukocytes. Infect. Immun. 76, 5883–5891 (2008) 24. Gorter A.D., Hiemstra P.S., de Bentzmann S., van Wetering S., Dankert J., van Alphen L.: Stimulation of bacterial adherence by neutrophil defensins varies among bacterial species but not among host cell types. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 28, 105–111 (2000) 25. Groisman E.A., Parra-Lopez C., Salcedo M., Lipps C.J., Heffron F., Resistance to host antimicrobial peptides is necessary for Salmonella virulence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11939–11943 (1992) 26. Guani-Guerra E., Santos-Mendoza T., Lugo-Reyes S.O., Teran  L.M.: Antimicrobial peptides: general overview and clinical implications in human health and disease. Clin. Immunol. 135, 1–11 (2010) 27. Guo L., Lim K.B., Gunn J.S., Bainbridge B., Darveau R.P., Hackett M., Miller S.I.: Regulation of lipid A modifications by Salmonella typhimurium virulence genes phoP-phoQ. Science, 276, 250–253 (1997) 28. Han S.H., Kim Y.E., Park J.A., Park J.B., Kim Y.S., Lee Y., Choi  I.G., Kwon H.J.: Expression of human beta-defensin-2 gene induced by CpG-DNA in human B cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 443–448 (2009) 29. Hill C.P., Yee J., Selsted M.E., Eisenberg D.: Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimer: mechanisms of membrane permeabilization. Science, 251, 1481–1485 (1991) 30. Hoover D.M., Chertov O., Lubkowski J.: The structure of human beta-defensin-1: new insights into structural properties of beta-defensins. J. Biol. Chem. 276, 39021–39026 (2001) 31. Hughes A.L.: Evolutionary diversification of the mammalian defensins. Cell. Mol. Life. Sci. 56, 94–103 (1999)

233

32. Ichinose M., Sawada M.: Enhancement of phagocytosis by calcitonin gene-related peptide (CGRP) in cultured mouse peritoneal macrophages. Peptides, 17, 1405–1414 (1996) 33. Ishikawa T., Kanda N., Hau C.S., Tada Y., Watanabe S.: Histamine induces human beta-defensin-3 production in human keratinocytes. J. Dermatol. Sci. 56, 121–127 (2009) 34. Jenssen H., Hamill P., Hancock R.E.: Peptide antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev. 19, 491–511 (2006) 35. Jin T., Bokarewa M., Foster T., Mitchell J., Higgins J., Tarkowski A.: Staphylococcus aureus resists human defensins by production of staphylokinase, a novel bacterial evasion mechanism. J. Immunol. 172, 1169–1176 (2004) 36. Joly S., Maze C., McCray P.B., Jr., Guthmiller J.M.: Human beta-defensins 2 and 3 demonstrate strain-selective activity against oral microorganisms. J. Clin. Microbiol. 42, 1024–1029 (2004) 37. Kagan B.L., Selsted M.E., Ganz T., Lehrer R.I.: Antimicrobial defensin peptides form voltage-dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 210–214 (1990) 38. Kawsar H.I., Ghosh S.K., Hirsch S.A., Koon H.B., Weinberg A., Jin G.: Expression of human beta-defensin-2 in intratumoral vascular endothelium and in endothelial cells induced by transforming growth factor beta. Peptides. 31, 195–201 (2010) 39. Lopez-Solanilla E., Gonzalez-Zorn B., Novella S., Vazquez-Boland J.A., Rodriguez-Palenzuela P.: Susceptibility of Listeria monocytogenes to antimicrobial peptides. FEMS Microbiol. Lett. 226, 101–105 (2003) 40. Mader J.S., Hoskin D.W.: Cationic antimicrobial peptides as novel cytotoxic agents for cancer treatment. Expert. Opin. Investig. Drugs. 15, 933–946 (2006) 41. Mason K.M., Munson R.S., Jr., Bakaletz L.O.: A mutation in the sap operon attenuates survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a chinchilla model of otitis media. Infect. Immun. 73, 599–608 (2005) 42. McCoy A.J., Liu H., Falla T.J., Gunn J.S.: Identification of Proteus mirabilis mutants with increased sensitivity to antimicrobial peptides. Antimicrob. Agents. Chemother. 45, 2030–2037 (2001) 43. Melo M.N., Ferre R., Castanho M.A.: Antimicrobial peptides: linking partition, activity and high membrane-bound concentrations. Nat. Rev. Microbiol. 7, 245–250 (2009) 44. Michaelson D., Rayner J., Couto M., Ganz T.: Cationic defensins arise from charge-neutralized propeptides: a mechanism for avoiding leukocyte autocytotoxicity? J. Leukoc. Biol. 51, 634–639 (1992) 45. Miyasaki K.T., Lehrer R.I.: Beta-sheet antibiotic peptides as potential dental therapeutics. Int. J. Antimicrob. Agents. 9, 269–280 (1998) 46. Moranta D., Regueiro V., March C., Llobet E., Margareto J., Larrate E., Garmendia J., Bengoechea J.A.: Klebsiella pneumoniae capsule polysaccharide impedes the expression of beta-defensins by airway epithelial cells. Infect. Immun. 78, 1135–1146 (2010) 47. Nguyen T.X., Cole A.M., Lehrer R.I.: Evolution of primate theta-defensins: a serpentine path to a sweet tooth. Peptides, 24, 1647–1654 (2003) 48. Niyonsaba F., Someya A., Hirata M., Ogawa H., Nagaoka I.: Evaluation of the effects of peptide antibiotics human beta-defensins-1/-2 and LL-37 on histamine release and prostaglandin D(2) production from mast cells. Eur. J. Immunol. 31, 1066–1075 (2001) 49. Oppenheim J.J., Biragyn A., Kwak L.W., Yang D.: Roles of antimicrobial peptides such as defensins in innate and adaptive immunity. Ann. Rheum. Dis. 62, 17–21 (2003)

234

Monika Żyłowska, Agnieszka Wyszyńska, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka

50. Otvos L., Jr., OI., Rogers M.E., Consolvo P.J., Condie B.A., Lovas S., Bulet P., Blaszczyk-Thurin M.: Interaction between heat shock proteins and antimicrobial peptides. Biochemistry, 39, 14150–14159 (2000) 51. Pardi A., Zhang X.L., Selsted M.E., Skalicky J.J., Yip P.F.: NMR studies of defensin antimicrobial peptides. 2. Three-dimensional structures of rabbit NP-2 and human HNP-1. Biochemistry, 31, 11357–11364 (1992) 52. Pazgier M., Hoover D.M., Yang D., Lu W., Lubkowski J.: Human beta-defensins. Cell. Mol. Life. Sci. 63, 1294–1313 (2006) 53. Peschel A., van Strijp J.A. i wsp.: Staphylococcus aureus resistance to human defensins and evasion of neutrophil killing via the novel virulence factor MprF is based on modification of membrane lipids with l-lysine. J. Exp. Med. 193, 1067–1076 (2001) 54. Peschel A., Otto M., Jack R.W., Kalbacher H., Jung G., Gotz F.: Inactivation of the dlt operon in Staphylococcus aureus confers sensitivity to defensins, protegrins, and other antimicrobial peptides. J. Biol. Chem. 274, 8405–8410 (1999) 55. Powers J.P., Hancock R.E.: The relationship between peptide structure and antibacterial activity. Peptides, 24, 1681–1691 (2003) 56. Poyart C., Pellegrini E., Marceau M., Baptista M., Jaubert F., Lamy M.C., Trieu-Cuot P.: Attenuated virulence of Streptococcus agalactiae deficient in D-alanyl-lipoteichoic acid is due to an increased susceptibility to defensins and phagocytic cells. Mol. Microbiol. 49, 1615–1625 (2003) 57. Robey M., O’Connell W., Cianciotto N.P.: Identification of Legionella pneumophila rcp, a pagP-like gene that confers resistance to cationic antimicrobial peptides and promotes intracellular infection. Infect. Immun. 69, 4276–4286 (2001) 58. Rodriguez de la Vega R.C., Possani L.D.: On the evolution of invertebrate defensins. Trends. Genet. 21, 330–332 (2005) 59. Salzman N.H., Bos N.A. i wsp.: Enteric defensins are essential regulators of intestinal microbial ecology. Nat. Immunol. 11, 76–83 (2009) 60. Sato H., Feix J.B.: Peptide-membrane interactions and mechanisms of membrane destruction by amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides. Biochim. Biophys. Acta, 1758, 1245–1256 (2006) 61. Schutte B.C., Mitros J.P., Bartlett J.A., Walters J.D., Jia H.P., Welsh M.J., Casavant T.L., McCray P.B., Jr.: Discovery of five conserved beta-defensin gene clusters using a computational search strategy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 2129–2133 (2002) 62. Schwaab M., Gurr A., Hansen S., Minovi A.M., Thomas J.P., Sudhoff H., Dazert S.: Human beta-Defensins in different states of diseases of the tonsilla palatina. Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 267, 821–830 (2010) 63. Seebah S., Suresh A., Zhuo S., Choong Y. H., Chua H., Chuon D., Beuerman R., Verma C.: Defensins knowledgebase: a manually curated database and information source focused on the defensins family of antimicrobial peptides. Nucleic. Acids. Res. 35, D265–268 (2007) 64. Semple F., Webb S., Li H.N., Patel H.B., Perretti M., Jackson I.J., Gray M., Davidson D.J., Dorin J.R.: Human beta-defensin 3 has immunosuppressive activity in vitro and in vivo. Eur. J. Immunol. 40, 1073–1078 (2010) 65. Shafer W.M., Qu X., Waring A.J., Lehrer R.I.: Modulation of Neisseria gonorrhoeae susceptibility to vertebrate antibacterial peptides due to a member of the resistance/nodulation/division efflux pump family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1829–1833 (1998) 66. Sorensen O.E., Cowland J.B., Theilgaard-Monch K., Liu L., Ganz T., Borregaard N.: Wound healing and expression of

antimicrobial peptides/polypeptides in human keratinocytes, a  consequence of common growth factors. J. Immunol. 170, 5583–5589 (2003) 67. Sperandio B., Regnault B., Guo J., Zhang Z., Stanley S.L., Jr., Sansonetti P.J., Pedron T.: Virulent Shigella flexneri subverts the host innate immune response through manipulation of antimicrobial peptide gene expression. J. Exp. Med. 205, 1121–1132 (2008) 68. Starner T.D., Swords W.E., Apicella M.A., McCray P.B., Jr.: Susceptibility of nontypeable Haemophilus influenzae to human beta-defensins is influenced by lipooligosaccharide acylation. Infect. Immun. 70, 5287–5289 (2002) 69. Stegemann C., Tsvetkova E.V., Aleshina G.M., Lehrer R.I., Kokryakov V.N., Hoffmann R.: De novo sequencing of two new cyclic theta-defensins from baboon (Papio hamadryas) leukocytes by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 24, 599–604 (2010) 70. Tanabe H., Ayabe T., Bainbridge B., Guina T., Ernst R.K., Darveau R.P., Miller S.I., Ouellette A.J.: Mouse paneth cell secretory responses to cell surface glycolipids of virulent and attenuated pathogenic bacteria. Infect. Immun. 73, 2312–2320 (2005) 71. Tang Y.Q., Yuan J., Osapay G., Osapay K., Tran D., Miller C.J., Ouellette A.J., Selsted M.E.: A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated alpha-defensins. Science, 286, 498–502 (1999) 72. Thomma B.P., Cammue B.P., Thevissen K.: Plant defensins. Planta, 216, 193–202 (2002) 73. Tran D., Tran P., Roberts K., Osapay G., Schaal J., Ouellette A., Selsted M.E.: Microbicidal properties and cytocidal selectivity of rhesus macaque theta defensins. Antimicrob. Agents. Chemother. 52, 944–953 (2008) 74. Valore E.V., Ganz T.: Laboratory production of antimicrobial peptides in native conformation. Methods Mol. Biol. 78, 115–131 (1997) 75. Valore E.V., Ganz T.: Posttranslational processing of defensins in immature human myeloid cells. Blood, 79, 1538–1544 (1992) 76. van den Berg R.H., Faber-Krol M.C., van Wetering S., Hiemstra P. S., Daha M.R.: Inhibition of activation of the classical pathway of complement by human neutrophil defensins. Blood, 92, 3898–3903 (1998) 77. Van Wetering S., Mannesse-Lazeroms S.P., Dijkman J.H., Hiemstra P.S.: Effect of neutrophil serine proteinases and defensins on lung epithelial cells: modulation of cytotoxicity and IL-8 production. J. Leukoc. Biol. 62, 217–226 (1997) 78. Visser L.G., Hiemstra P.S., van den Barselaar M.T., Ballieux P.A., van Furth R.: Role of YadA in resistance to killing of Yersinia enterocolitica by antimicrobial polypeptides of human gra­ nulocytes. Infect. Immun. 64, 1653–1658 (1996) 79. Weinberg A., Krisanaprakornkit S., Dale B.A.: Epithelial anti­ microbial peptides: review and significance for oral applications. Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 9, 399–414 (1998) 80. Wiechula B.E., Tustanowski J.P., Martirosian G.: Antimicrobial peptides. Wiad. Lek. 59, 542–547 (2006) 81. Wimley W.C., Selsted M.E., White S.H.: Interactions between human defensins and lipid bilayers: evidence for formation of multimeric pores. Protein. Sci. 3, 1362–1373 (1994) 82. Xie C., Prahl A., Ericksen B., Wu Z., Zeng P., Li X., Lu W.Y., Lubkowski J., Lu W.: Reconstruction of the conserved beta-bulge in mammalian defensins using D-amino acids. J. Biol. Chem. 280, 32921–32929 (2005) 83. Yang D., Biragyn A., Kwak L.W., Oppenheim J.J.: Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal. Trends Immunol. 23, 291–296 (2002)

WIRUS ODRY – REAKCJE ODPORNOŚCIOWE ZWIĄZANE Z NATURALNYM ZAKAŻENIEM ORAZ ODPOWIEDZIĄ POSZCZEPIENNĄ

POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 3, 235–245 http://www.pm.microbiology.pl

Agnieszka Częścik*1, Agnieszka Trzcińska1, Joanna Siennicka1 1

Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny ul. Chocimska, 24 00-791 Warszawa Wpłynęło w marcu 2011 r.

1. Wiadomości ogólne i klasyfikacja wirusa odry. 2. Przebieg kliniczny odry. 3. Budowa wirusa odry i funkcje białek. 4. Białka receptorowe i mechanizm zakażenia. 5. Odpowiedź immunologiczna w przebiegu naturalnego zakażenia wirusem odry. 5.1. Odpowiedź wrodzona. 5.2. Odpowiedź humoralna. 5.3. Odpowiedź komórkowa. 5.4. Immunosupresja związana z zakażeniem MeV. 5.5. Pamięć immunologiczna. 6. Problemy związane ze szczepieniem przeciwko odrze. 6.1. Szczepionka przeciwko odrze. 6.2. Odpowiedź indukowana w wyniku szczepienia. 7. Podsumowanie Measles Virus - immune response to natural infection and vaccination Abstract: Despite the development of an effective vaccine, measles, a highly contagious disease, is still an important cause of morbidity and mortality, especially in developing countries. This paper presents the characteristics of the immune response in the course of natural measles virus infection and the response induced by vaccination. The elements of innate, humoral and cellular response, as well as immunosuppression due to infection with MeV and mechanisms for the acquisition of immune memory are described. Particular attention is paid to the determinants of postvaccination response rates. We focus also on the problem of passive transfer of antibodies during pregnancy and the consequences of inadequate immunization of infants born to mothers vaccinated against measles 1. General information and classification of measles virus. 2. The clinical course of measles. 3. Structure and function of measles virus proteins. 4. Receptor proteins and the mechanism of infection. 5. The immune response in the course of natural infection with measles. 5.1. Innate Response. 5.2. Humoral response. 5.3. Cellular response. 5.4. Immunosuppression due to infection MeV. 5.5. Immunological memory. 6. Problems associated with vaccination against measles. 6.1. Measles vaccine. 6.2. Postvaccination response. 7. Summary Słowa kluczowe: Wirus odry, odporność, odpowiedź poszczepienna Key words: Measles virus, immunity, postvaccination response

1.  Wiadomości ogólne i klasyfikacja wirusa odry Odra jest wysoce zaraźliwą chorobą wysypkową wieku dziecięcego. Pomimo opracowania skutecznej szczepionki nadal jest jedną z głównych przyczyn zachorowań i zgonów u dzieci w krajach rozwijających się. W 1954 r. A n d e r s i P e e b l e s dokonali pomyślnej izolacji wirusa będącego przyczyną tych zachorowań [14]. Wirus pochodził z materiału pobranego od 11-letniego chłopca z USA, Davida Edmonstona, od nazwiska którego pochodzi nazwa prototypowego szczepu wirusa odry. Wirus odry (MeV) należy do rodziny Paramyxoviridae, podrodziny Paramyxovirinae, rodzaju Morbillivirus. W odróżnieniu od innych paramyksowirusów MeV nie posiada neuraminidazy [42]. Filogenetycznie MeV jest najbliżej spokrewniony z wirusem księgosuszu bydła (Rinderpest Virus – RPV), z którego prawdopodobnie wyewoluował w wyniku bliskich kontaktów człowieka z udomowionym bydłem [24]. Wirus odry (MeV) jest antygenowo stabilny i wszystkie jego szczepy należą do jednego serotypu. Różnicowanie odbywa się na podstawie cech genetycznych.

Do tej pory wyróżniono 8 grup (A-H) obejmujących 23 genotypy [78]. Analiza sekwencyjna końca COOH genu nukleoproteiny, stanowi podstawę do zakwalifikowania izolatu klinicznego do jednego z nich. Niektóre z genotypów (B1, E, F, G1, D1) określa się jako nieaktywne, co oznacza, że szczepy reprezentatywne dla nich nie były izolowane od co najmniej 15 lat. Wszystkie szczepy szczepionkowe MeV należą do genotypu A. W Europie krążą szczepy należące do genotypów D4, D5 i D6 [78]. Nie stwierdzono istnienia biologicznych różnic pomiędzy wirusami różnych genotypów –  ani w  klinicznym przebiegu choroby, ani rodzaju powikłań. Różnicowania genetyczne MeV ma znaczenie dla śledzenia jego transmisji i stanowi ważne narzędzie epidemiologii molekularnej [78]. 2. Przebieg kliniczny odry Do zakażenia wirusem odry dochodzi na drodze kropelkowej. Okres inkubacji, od momentu zakażenia do wystąpienia typowych objawów trwa zwykle 9–14 dni.

*  Autor korespondencyjny: Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny; 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24; tel. (22) 542 12 30; e-mail: [email protected]

236

Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Joanna Siennicka

Pierwotnie wirus zakaża komórki układu oddechowego, po czym 5–7 dnia od zakażenia dochodzi do wiremii. W  okresie inkubacji mogą wystąpić objawy prodromalne takie jak kaszel, katar, gorączka. W wyniku wiremii dochodzi do rozprzestrzenienia się wirusa w organizmie i wystąpienia wysypki. W  początkowej fazie choroby wysypka ma charakter gruboplamisty. Wykwity skórne są różowe, zlewające się, zlokalizowane na twarzy i czole, które z czasem obejmują całą powierzchnię ciała. Po kilku dniach wysypka zmienia kolor na ceglasty i łuszczy się. [20, 24]. Objawem patognomonicznym odry jest pojawienie się na błonie śluzowej policzków na wysokości dolnych zębów trzonowych białawych przebarwień tzw. plamek Koplika. Zakaźność chorego pojawia się na około dwa dni przed wystąpieniem objawów i utrzymuje do czwartego dnia po wystąpieniu wysypki. Powikłania w przebiegu odry występują rzadko i dotyczą w  szczególności osób z niedoborami odporności. Do najczęstszych powikłań należą zapalenia płuc będące wynikiem nadkażeń bakteryjnych oraz zapalenie mózgu (1 na 1 000 przypadków zachorowań), a także zapalenie mięśnia sercowego i ucha środkowego. Najcięższym a jednocześnie najrzadszym (1 na 1 000 000 przypadków zachorowań) powikłaniem jest podostre stwardniające zapalenie mózgu (SSPE), które może wystąpić nawet po 15 latach od momentu zakażenia [27, 59, 60]. 3. Budowa wirusa odry i funkcje białek Genom wirusa odry zbudowany jest z jednoniciowego, niesegmentowanego RNA o ujemnej polarności. Genom o długości od 15 do 19 kpz zawiera 6 ułożonych liniowo genów [42]. Organizację genomu MeV przedstawiono na rys. 1. Wielkość pleomorficznej cząs­

Rys. 1. Organizacja genomu wirusa odry

teczki wirusa odry określono na 100–300 nm. Wirion zbudowany jest z  nukleokapsydu, na który składa się kwas nukleinowy wirusa z owiniętym spiralnie wokół niego białkiem – nukloproteiną (N). Z nukleokapsydem związane są dwa inne białka – fosfoproteina  (P) i  duże białko  (L). Nukleokapsyd otoczony jest leżącym bezpośrednio pod osłonką białkiem rdzenia – matrix (M). W osłonce umiejscowione są dwie glikoproteiny powierzchniowe: hemaglutynina (H) i białko fuzyjne  (F). Schemat budowy cząsteczki wirusa odry przedstawiono na rys. 2. W wyniku fuzji osłonki wirusa z błoną komórkową, nukleokapsyd wraz z polimerazą RNA jest uwalniany do cytoplazmy, gdzie ma miejsce cykl replikacyjny wirusa. Pierwszym etapem replikacji jest synteza mRNA na

Rys. 2. Budowa cząsteczki wirusa odry

matrycy genomowego RNA. Jako pierwsze jest transkrybowane białko N, które razem z białkami L i P tworzy kompleks replikacyjny. Pomimo tego, że białko P, będące kofaktorem polimerazy, jest wydajnie syntetyzowane w zakażonej komórce, to jedynie niewielka jego ilość wchodzi w skład budowy wirionu. Gen białka P zawiera informacje kodujące co najmniej dwa inne białka – C i V. Jakkolwiek ani białko C ani V nie są niezbędne do replikacji wirusa, to stwierdzono, że oba, poprzez inter­ akcje z białkami komórkowymi mają wpływ na regulację transkrypcji i replikacji. Składniki osłonki wirionu, hemaglutynina (H) i białko fuzyjne (F), są syntetyzowane na rybosomach, transportowane poprzez retikulum endoplazmatyczne, glikozylowane w aparacie Golgiego i stają się integralnymi białkami błony plazmatycznej. Białko  M jest syntetyzowane na rybosomach cytoplazmatycznych i transportowane do błony komórkowej [30]. W  dalszym etapie replikacji, w  wyniku akumulacji nowozsyntetyzowanych białek wirusowych następuje replikacja genomowego RNA. Najpierw zachodzi synteza komplementarnego RNA o dodatniej polarności, który następnie stanowi matrycę dla genomowego RNA o ujemnej polarności. Białko rdzenia (M) poprzez interakcję z glikoproteinami powierzchniowymi ma wpływ na proces zlewania się zakażonych komórek, oraz uwalniania dojrzałych wirionów. Białko fuzyjne (F) odpowiada za fuzję wirusa z błoną komórki gospodarza, penetrację i hemolizę. Pośrednicząc w zlewaniu się zakażonych komórek i tworzeniu syncytiów, odgrywa istotną rolę w rozprzestrzenianiu się zakażenia. Główną funkcją hemaglutyniny (H) jest udział w procesie adsorpcji w wyniku interakcji z receptorami komórkowymi [42]. 4. Białka receptorowe i mechanizm zakażenia Zidentyfikowano co najmniej dwa białka komórkowe będące receptorami dla wirusa odry: CD46 i  CD150. CD46 wykazuje ekspresję na wszystkich komórkach jądrzastych człowieka, szczególnie licznie występując

   WIRUS ODRY – REAKCJE ODPORNOŚCIOWE ZWIĄZANE Z NATURALNYM ZAKAŻENIEM ORAZ ODPOWIEDZIĄ POSZCZEPIENNĄ

237

Rys. 3. Efekt cytopatyczny wirusa odry (MeV), szczep Edmonston. A) komórki VeroSlam niezakażone, B) komórki VeroSlam po 24 h od zakażenia MeV, C) komórki VeroSlam po 354 h od zakażenia MeV, D) komórki VeroSlam po 48 h od zakażenia MeV (zdjęcia autorów)

w części wierzchołkowej komórek nabłonkowych. Trzy z pięciu domen tego białka wykazują zdolność wiązania komponenty C3b lub C4b układu dopełniacza, natomiast dwie, najbardziej zewnętrznie położone, wykazują powinowactwo do hemaglutyniny wirusa odry. Białko CD150/SLAM (Signaling Lymphocyte Activation Molecule) jest obecne na powierzchni komórek immunologicznie czynnych. Hemaglutynina wirusa odry oddziaływuje z jedną z dwóch wysoce glikozylowanych domen molekuły SLAM. Badania nad różnymi receptorami wykazały, że podczas gdy większość szczepów szczepionkowych MeV efektywnie wykorzystuje CD46 jako białko receptorowe, to szczepy dzikie z reguły nie czynią tego [16, 99]. Późniejsze badania dowiodły, że większość hemaglutynin może wiązać zarówno CD46 jak i CD150, jakkolwiek powinowactwo H w stosunku do CD150 jest wyższe [46]. Związanie hemaglutyniny (H) z receptorem komórkowym indukuje zmiany w budowie konformacyjnej zarówno białka H jak i białka fuzyjnego F. Hydrofobowy peptyd fuzyjny znajdujący się wewnątrz F ulega ekspozycji i włączany jest do błony komórkowej. Wynikiem tego procesu jest zmniejszenie dystansu między osłonką wirusa i błoną komórkową, co umożliwia ich fuzję [100]. Zakażenie MeV skutkuje również fuzją błon sąsiadujących komórek, w wyniku czego powstają wielojądrzaste komórki olbrzymie, syncytia, dające charakterystyczny dla wirusa odry obraz efektu cytopatycznego (rys. 3).

5. Odpowiedź immunologiczna w przebiegu naturalnego zakażenia wirusem odry Odra u osób immunokompetentnych w większości przypadków kończy się eliminacją wirusa z organizmu. Eliminacja (clearance) jest możliwa dzięki efektywnemu działaniu wielu elementów odpowiedzi immunologicznej. Całkowita eliminacja patogenu jest jednak procesem długotrwałym, trwającym kilka tygodni. Świadczy o tym chociażby fakt, że o ile zakaźne cząstki wirusa udaje się wyizolować jedynie w okresie trwania wysypki, to wirusowe RNA jest wykrywane nawet po kilku tygodniach od jej ustąpienia [89]. Za skuteczność reakcji odpornościowej odpowiedzialne są zarówno jej elementy swoiście rozpoznające patogen, jak i te związane z  odpowiedzią nieswoistą. Znanym fenomenem zakażenia MeV jest związana z nim im­munosupresja. 5.1. Odpowiedź wrodzona Pierwszymi elementami reakcji odpornościowej aktywowanymi w efekcie zakażenia MeV są te, związane z odpowiedzią nieswoistą. Jak we wszystkich infekcjach rozprzestrzeniających się drogą kropelkową, działanie różnego rodzaju barier zapewne ma znaczenie, jakkolwiek w przypadku MeV pierwszoplanową rolę przypisuje się takim czynnikom jak interferony (IFN), układ

238

Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Joanna Siennicka

dopełniacza, komórki NK oraz reakcje związane z pobudzeniem receptorów Toll-like. Zakażenie wirusem odry, podobnie jak inne zakażenia wirusowe, skutkuje produkcją interferonów. W  badaniach in vitro stwierdzono, że dzikie szczepy MeV słabiej stymulują syntezę IFN niż szczepy szczepionkowe [57]. In vivo obserwowano znaczny wzrost poziomu IFN w  surowicy między 8 a  11  dniem po podaniu szczepionki [71], przy czym nie obserwowano takiego wzrostu w  przebiegu naturalnego zakażenia [82]. Kolejnym ważnym elementem wczesnej odpowiedzi immunologicznej są komórki NK. Opisywano jednak, że w przypadku zakażenia wirusem odry ich udział w reakcjach obronnych może być mniejszy niż ma to miejsce w innych zakażeniach wirusowych [23]. Należy jednak zauważyć, że badania in vivo dotyczące udziału IFN i komórek NK były przeprowadzane na próbkach pozyskanych od osób chorych na odrę w okresie trwania wysypki. W  związku z tym nie można wykluczyć dużego znaczenia tych elementów reakcji odpornościowej we wcześniejszych fazach zakażenia [24]. Ważną rolę w reakcji przeciwzakaźnej pełni układ dopełniacza. Stwierdzono, że podczas zakażenia MeV dochodzi do jego aktywacji drogą alternatywną, to jest niezależną od przeciwciał [84], a w procesie tym bierze udział białko fuzyjne F wirusa [10]. Z kolei reakcja związana ze stymulacją receptora/rów Toll-like (TLR) może prowadzić do jednego z ciekawszych zjawisk związanych z zakażeniem MeV, a mianowicie immunosupresją [28]. Spośród cytokin indukowanych w wyniku pobudzenia TLRs, IL-12 jest kluczową cytokiną związaną z przesunięciem odpowiedzi w kierunku fenotypu Th1, natomiast IL-10 pełni funkcje supresyjne i jest jedną z głównych cytokin odpowiedzi typu Th2. Stwierdzono, że w  trakcie odry przeważa odpowiedź typu Th2, wyrażona poprzez wydłużoną obecność zwiększonego poziomu IL-10 w surowicach osób chorych na odrę, trwającego nawet przez kilkanaście tygodni po ustąpieniu wysypki [51]. Nie jest wykluczone, że do zwiększonej produkcji IL-10 dochodzi na skutek pobudzenia TLR4 [26]. 5.2. Odpowiedź humoralna Wirusowo swoiste przeciwciała obecne są na wykrywalnym poziomie w momencie pojawienia się wysypki. Wraz z rozwojem choroby ich poziom znacznie wzrasta. Po 72 godzinach od pojawienia się wysypki u 77% chorych wykrywa się anty-MeV IgM. Natomiast w 11 dniu choroby 100% pacjentów wykazuje ich obecność. Podwyższony poziom przeciwciał klasy IgM utrzymuje się przez około 3 tygodnie [24]. Anty-MeV IgG wykrywane są w stosunku do przeciwciał klasy IgM nieco później (rys. 4). Szczyt ich produkcji przypada na 3–4 tydzień trwania choroby i po przebyciu naturalnego zakażenia obecne są w surowicach ozdrowieńców do końca życia.

Rys. 4. Dynamika odpowiedzi immunologicznej na zakażenie wirusem odry

Wiadomo, że przechorowanie odry i nabyta w jej trakcie odporność daje trwałą ochronę. Świadczą o tym obserwacje poczynione w trakcie epidemii mającej miejsce na Wyspach Owczych w 1846 r. Na odrę zachorowało wtedy blisko 100% izolowanej od reszty świata społeczności, wśród której nie notowano epidemii od 65  lat. Nie zachorowały jedynie osoby w wieku powyżej 65 lat, odporne na odrę w wyniku jej przechorowania w trakcie poprzedniej epidemii [59]. Wszystkie białka wirusowe wykazują właściwości antygenowe, jednak większość anty-MeV IgG skiero­wana jest przeciwko nukleoproteinie (N). Silne właści­wości immunogenne wykazują również białka powierzchniowe wirusa: hemaglutynina (H) i białko fuzyjne (F), natomiast niewielkie – białko rdzenia (M). Stwierdzono przy tym, że odpowiedź ze strony IgG i IgA jest wyższa dla białka fuzyjnego niż dla hemaglutyniny [13]. Właściwości neutralizujące zakaźność cząstek wirusa posiadają przeciwciała dla H i w mniejszym stopniu dla F [45], a poziom przeciwciał (IgM, IgG i IgA) swoistych dla H i F koreluje z poziomem dla nukleoproteiny [13]. Pomiaru poziomu przeciwciał neutralizujących można dokonywać przy użyciu takich testów jak np. łysinkowy test neutralizacji (PRN, plaque reduction neutralizing assay), odczyn zahamowania hemaglutynacji (OZHA) bądź testy ELISA. Te ostatnie, pod warunkiem zastosowania jako frakcji antygenowej białek warunkujących syntezę przeciwciał neutralizujących, lub odpowiednie wystandaryzowanie testu w  stosunku do standardu międzynarodowego [94]. Zgodnie z danymi WHO, za chroniący przed zakażeniem poziom swoistych przeciwciał neutralizujących przyjmuje się 200 mIU/ml [94]. W najczęściej, używanych w  rutynowej diagnostyce testach ELISA, frakcję antygenową stanowią białka otrzymane z supernatantu bądź lizatu uzyskanego w wyniku namnażania wirusa w hodowli komórkowej. W tak skonstruowanych testach pomiarowi podlegają przeciwciała swoiste dla wszyst-

   WIRUS ODRY – REAKCJE ODPORNOŚCIOWE ZWIĄZANE Z NATURALNYM ZAKAŻENIEM ORAZ ODPOWIEDZIĄ POSZCZEPIENNĄ

kich, strukturalnych i niestrukturalnych białek wirusa. Dlatego też w celu ustalenia poziomu ochronnego przeciwciał należy dokonać standaryzacji testu [31]. Jakość odpowiedzi humoralnej związana jest z awidnością przeciwciał oraz podklasami IgG. W ostrej fazie zakażenia wirusem odry dochodzi głównie do produkcji przeciwciał podklas IgG1 i IgG3. W późniejszym okresie obserwuje się stopniowy zanik IgG3, które stają się praktycznie niewykrywalne w fazie ozdrowieńczej, przy jednoczesnym wzroście IgG4 [13]. Zdolności neutralizujące przeciwciał związane są głównie ze swoistymi dla hemaglutyniny wirusa przeciwciałami IgG1 i IgG3 [57]. Wysoka awidność jest związana z lepszą ochroną. Stwierdzono, że przeciwciała anty-MeV osiągają wysokie powinowactwo w procesie dojrzewania zachodzącym w okresie 3–6  miesięcy od zakażenia [13]. Poza możliwością neutralizowania zakaźności cząstek wirusa, równie istotną cechą przeciwciał jest ich awidność. 5.3. Odpowiedź komórkowa Podczas gdy obecność wirusowo swoistych przeciwciał redukuje ryzyko zakażenia, to sprawne działanie odpowiedzi komórkowej jest niezbędne dla efektywnej eliminacji wirusa z zakażonego organizmu. O roli odpowiedzi komórkowej w  przebiegu odry świadczą obserwacje dotyczące dzieci z  agammaglobulinemią, które skutecznie eliminowały zakażenie i ustanawiały odporność. Natomiast u dzieci z anomaliami w zakresie funkcjonowania limfocytów T przebieg odry był cięższy i znacznie częściej związany z powikłaniami [6, 56]. Pojawienie się swoistej odpowiedzi odpornościowej zbiega się w  czasie z wystąpieniem charakterystycznych dla odry objawów klinicznych: wysypki, gorączki, zapalenia spojówek [25] (rys. 4). W obrębie komórek nabłonkowych w zmianach skórnych stwierdzane są nacieki limfocytów T, zarówno CD4+ jak i CD8+ [70]. Izolacja zakaźnych cząstek wirusa z komórek krwi obwodowej (PBMC) praktycznie jest możliwa jedynie w  okresie trwania wysypki. Po upływie kilku dni wiremia jest eliminowana, ale wirusowe RNA pozostaje obecne na wykrywalnym poziomie (w PBMC, komórkach układu oddechowego, moczu) nawet kilka tygodni po wyzdrowieniu [76]. Pierwszoplanową rolę w procesie eliminacji wirusa przypisuje się limfocytom T. Stwierdzono, że zmniejszenie CD8+ u makaków skutkuje wydłużeniem okresu wiremii i obecnością wirusa na wyższym poziomie [70]. Po eliminacji zakaźnego wirusa liczba aktywowanych komórek CD8+ oraz poziom IFNγ gwałtownie się obniżają. Znacznie wolniej zanikają wirusowo swoiste CD4+ [25, 34, 63]. We wczesnej fazie reakcji odpornościowej obserwuje się przewagę cytokin charakterystycznych dla profilu Th1 (IFNγ, IL-2). W  późniejszym okresie następuje przesunięcie odpowiedzi w kierunku Th2, co wyraża się wzmożoną

239

syntezą takich cytokin jak, IL-4, IL10, IL-13. Dominację profilu Th2 obserwuje się przez kilka tygodni po eliminacji wirusa i ustąpieniu wysypki [23, 25, 51]. Przy braku sprawnie działającej odpowiedzi komórkowej nie obserwuje się wysypki a zakażenie wirusem odry może prowadzić do śmiertelnych postaci zapalenia płuc lub mózgu [24]. 5.4. Immunosupresja związana     z zakażeniem MeV Odra była pierwszą chorobą, w trakcie której zaobserwowano zwiększoną wrażliwość na inne zakażenia. Na związek odry z immunosupresją zwrócono uwagę w  kontekście wykonywania prób tuberkulinowych. W  czasie trwania epidemii odry zaobserwowano, że reakcje związane z testem skórnym są zahamowane i występują dopiero po kilku tygodniach od ustąpienia wysypki i całkowitym wyzdrowieniu [25]. Stwierdzono również, że przyczyną zgonów dzieci chorych na odrę było głównie zapalenie płuc na tle zakażeń powodowanych przez takie patogeny jak adenowirusy, herpeswirusy i bakterie z rodzaju Klebsiella i Pseudomonas. U dzieci tych, częściej niż u innych, obserwowano limfopenię i ograniczenie warstwy korowej węzłów chłonnych i  śledziony [5]. Obecnie uważa się, że główną przyczyną zwiększonej wrażliwości na nadkażenia jest związana z MeV immunosupresja, której przejawami są limfopenia, zahamowanie proliferacji limfocytów obwodowych oraz wspomniane już przesunięcie profilu cytokin w kierunku Th2 [25, 79]. Limfopenia obserwowana w czasie trwania wysypki może być związana z interakcją między wirusem a jego receptorem – cząsteczką CD150/SLAM i aktywowaną w  ten sposób apoptozą [64, 92]. Natomiast przyczyn obniżonej proliferacji limfocytów upatruje się w  niedostatecznej produkcji IL-2. Dodanie rekombinowanej IL-2 do hodowli limfocytów pobranych od pacjentów chorych na odrę wywołuje spontaniczną proliferację i  poprawia odpowiedź na działanie mitogenów [22]. Zahamowanie proliferacji limfocytów  T wiązane jest również z bezpośrednim wpływem białek powierzchniowych wirusa (H i F) na zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G0/G1 [25, 80]. Duży wkład w poznanie zjawiska immunosupresji związanej z zakażeniem wirusem odry może wnieść opracowany model zwierzęcy –  myszy SLAM knock-in, u  których jedną z  domen cząsteczki SLAM zastąpiono odpowiednią domeną cząsteczki ludzkiej. U  zwierząt tych, krzyżowanych z  myszami knock-out w zakresie genu dla receptora interferonu i zakażanych MeV, obserwowano obecność zjawisk analogicznych do tych występujących u ludzi: limfopenię, zahamowanie proliferacji limfocytów  T i produkcji przeciwciał, zwiększoną syntezę IL-4 i IL-10 oraz supresję kontaktowej nadwrażliwości [36].

240

Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Joanna Siennicka

5.5. Pamięć immunologiczna Komórki pamięci generowane w wyniku zakażenia posiadają potencjał do wytworzenia silnej reakcji w przypadku ponownego zetknięcia się z patogenem. Populacja limfocytów T pamięci jest heterogenna a różnice dotyczą zarówno fenotypu, funkcji oraz dystrybucji w  tkankach. Ponadto komórki te mogą podlegać różnorodnym zmianom w trakcie fazy spoczynkowej [90, 29]. W  przebiegu odry, podobnie jak w innych ostrych zakażeniach wirusowych, generowane limfocyty  T posiadają silne właściwości efektorowe, dzięki którym następuje eliminacja wirusa. Wytwarzane są również komórki pamięci mające zapewnić długotrwałą ochronę. Odmiennie wygląda to w przypadku zakażeń chronicznych, gdzie limfocyty T tracą swoje efektorowe właściwości przed wytworzeniem komórek pamięci [29]. Opracowanie nowych technik takich jak metoda ograniczonych rozcieńczeń (Limiting dilution analysis), ELISPOT (Enzyme-linked immunospot assay), technika wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin (Intracellular cytokine staining) czy metoda tetramerów (Peptide – MHC class I tetramer staining) pozwoliło na pełniejsze poznanie procesów związanych z generowaniem pamięci immunologicznej [93, 87]. N a n a n i wsp. [56] opisali metodę ilościowego oznaczania swoistych dla wirusa odry limfocytów T pamięci. W układzie autologicznych komórek: APC (unieśmiertelnione limfocyty B i komórki dendrytyczne zakażone MeV) i PBMC oznaczano populacje limfocytów CD4 i CD8 reagujące syntezą INFγ. Stwierdzono, że liczebności komórek pamięci dla MeV po naturalnym zakażeniu były porównywalne z  tymi obserwowanymi dla wirusów wywołujących zakażenia chroniczne i latentne (EBV, CMV, HIV), co potwierdza istnienie długotrwałej pozakaźnej pamięci immunologicznej [56]. Stosując równie czułe metody do wykrywania rzadkich populacji komórek pamięci, O v s y a n n i k o v a i wsp. [65] oceniali zdolność osób w wieku 15–25 lat, seronegatywnych i seropozytywnych w  wyniku szczepienia przeciwko odrze, do odpowiedzi na MeV poprzez określenie proliferacji wirusowo-swoistych limfocytów  T. Chociaż stwierdzono, że odsetek komórek CD4 jak i CD8 był znacząco niższy u  osób seronegatywnych to potwierdzono obecność wirusowo-swoistej odpowiedzi komórkowej będącej wynikiem szczepienia u  osób seronegatywnych [65]. Z drugiej strony stwierdzono, że liczba MeV-swoistych poszczepiennych CD4 ulega z czasem obniżeniu, przy niezmienionym poziomie przeciwciał i komórek CD8 [58]. Zaobserwowano również, że osoby po naturalnym zakażeniu wykazują wyższy odsetek MeV-swoistych CD4 w porównaniu z osobami szczepionymi [58]. Biorąc pod uwagę, że komórki CD4 pełnią kluczową rolę w procesie syntezy przeciwciał jak również generowania i podtrzymywania funkcji cytotoksycznych limfo-

cytów CD8 to pozostaje zagadką jak przeciwciała i CD8 są utrzymywane po obniżeniu się liczby limfocytów pamięci CD4 [29]. 6. Problemy związane ze szczepieniem przeciwko odrze Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) odra jest jedną z głównych przyczyn zgonów wśród dzieci na świecie. W wyniku wprowadzenia szczepień osiągnięto znaczący spadek liczby przypadków śmiertelnych – o 77% na przestrzeni lat 1999–2008 [95]. Odnotowano również ograniczenie liczby zachorowań. I tak na przykład w Polsce, wprowadzenie szczepień ochronnych skutkowało spadkiem zachorowań o  99,95% w  okresie od 1974 do 2002  roku. Sukcesy osiągnięte w  wyniku wprowadzenia szczepień leżały u  podstaw wdrożenia przez WHO planu strategicznego, który zakładał eliminację zachorowań na odrę w państwach Regionu Europejskiego do roku 2010. Pomimo spektakularnej poprawy sytuacji epidemiologicznej, epidemie odry w Europie nadal mają miejsce. W latach 2006–2007 odnotowano ponad 12 tysięcy zachorowań, z czego większość (85%) zgłoszeń pochodziła z pięciu państw: Rumunii, Niemiec, Wielkiej Brytanii, Szwajcarii i Włoch [54]. Znacząca większość tych przypadków powodowana była przez rodzime szczepy wirusa odry, natomiast źródłem ponad 60% pozostałych zakażeń były szczepy zawleczone z innych krajów europejskich [4]. Chociaż większość przypadków odry dotyczy osób nieszczepionych, to zachorowania odnotowywane są również wśród osób z udokumentowaną historią szczepień. W 2006 r. w Polsce na 120 zarejestrowanych przypadków, 44 dotyczyło osób szczepionych – 26 jedną dawką i  18  dwiema dawkami [9]. Analizując różnorodne przyczyny nieskuteczności szczepienia nie można jednoznacznie wykluczyć wpływu zmienności wirusa, pomimo, że wirus odry uważany jest za antygenowo stabilny patogen. W  latach 2005–2006 w  Europie odnotowano krążenie szczepów wirusa należących do 9 różnych genotypów z czego wynika, że różnorodność szczepów izolowanych w Europie jest wysoka. 6.1. Szczepionka przeciwko odrze Opracowanie żywej atenuowanej szczepionki przeciwko odrze nastąpiło wkrótce po izolacji wirusa. W 1963 r. żywa, atenuowana szczepionka zawierająca szczep Edmonston B uzyskany przez E n d e r s a i wsp. [15] na drodze wielokrotnego pasażowania wirusa odry w  różnych hodowlach komórkowych, została zareje­ strowana w USA. Podanie tej szczepionki bardzo często jednak wiązało się z wystąpieniem niepożądanych odczynnów poszczepiennych – NOPS (wysypka i  go-

   WIRUS ODRY – REAKCJE ODPORNOŚCIOWE ZWIĄZANE Z NATURALNYM ZAKAŻENIEM ORAZ ODPOWIEDZIĄ POSZCZEPIENNĄ

rączka przekraczająca 39,5°C). Odsetek NOPS malał przy jednoczesnym podaniu małych dawek swoistej immunoglobuliny [37, 38]. W tym samym roku zarejestrowano w USA zabitą szczepionkę przeciwko odrze, którą opracowano na drodze inaktywacji wirusa odry formaliną [7]. Szczepionka inaktywowana miała jednak liczne wady. U 15% osób przy zetknięciu z dzikim szczepem dochodziło do zakażenia prowadzącego do rozwoju odry o atypowym przebiegu, który charakteryzował się wyższą i dłużej trwającą gorączką, nietypowymi zmianami skórnymi, zapaleniem płuc o ciężkim przebiegu w porównaniu z odrą u osób nieszczepionych [55]. Uzys­kiwana w wyniku szczepienia odporność była krótkotrwała, poziom przeciwciał spadał gwałtownie, a osoby szczepione ponownie stawały się wrażliwe na zakażenie [17, 74]. Wśród wielu hipotez dotyczących wyjaśnienia patogenezy atypowej odry wymienia się między innymi brak produkcji przeciwciał dla białka fuzyjnego (F), co prowadziło do niekontrolowanego rozprzestrzeniania się wirusa z komórki do komórki pomimo produkcji przeciwciał dla hemaglutyniny  (H) [48]. Badania na rezusach wykazały, że szczepionka inaktywowana nie indukowała odpowiedzi ze strony cytotoksycznych komórek  T, a  syntetyzowane przeciwciała o  niskiej awidności nie mogły neutralizować zakażenia dzikim szczepem wirusa odry [72]. W 1967 r. zaprzestano stosowania tej szczepionki w USA, a potem w Europie [33]. W połowie lat 60-tych w USA, Japonii, Jugosławi, ZSRR i Chinach opracowano nowe szczepy szczepionkowe. Otrzymano je poprzez dalszą atenuację szczepu Edmonston (AIK-C), szczepu Edmonston A (Schwarz) i  szczepu Edmonston  B (Moraten i  EdmonstonZagreb) lub niezależnych izolatów wirusa odry: Tanabe (CAM-70), Leningrad (Leningrad-16) i Shanghai (Shanghai-191) [81, 88, 94]. Większość obecnie używanych na świecie szczepionek przeciwko odrze wywodzi się ze szczepu Edmonston, w  tym zarejestrowana w  1965  r. szczepionka ze szczepem Schwarz i zarejestrowana w  1968  r. szczepionka ze szczepem Moraten [33, 77]. Stosowane obecnie żywe, atenuowane szczepionki przeciwko odrze należą do szczepionek bezpiecznych. Wirus szczepionkowy nie jest wydalany do środowiska, a  NOPS o  ile występują, mają łagodny charakter [33]. Oprócz szczepionki monowalentnej w chwili obecnej powszechniej stosuje się szczepionki skojarzone, szczególnie w krajach rozwiniętych, gdzie na stałe zostały one umieszczone w kalendarzu szczepień. Szczepionki skojarzone zawierają oprócz atenuowanego szczepu wirusa odry, atenuowane szczepy wirusa różyczki i świnki lub wirusa różyczki i ospy wietrznej. Stosowane schematy szczepień różnią się w poszczególnych krajach. W Polsce po raz pierwszy szczepienia przeciwko odrze wprowadzono w 1974 roku [31, 61]. Zgodnie z obowiązującym kalendarzem szczepień szcze-

241

pionkę podaje się dzieciom w 13–14 miesiącu życia. Od 1991 r. wprowadzono 2 dawkę szczepionki podawaną dzieciom w wieku 7 lat. W 2005 r. zastąpiono monowalentną szczepionkę przeciwko odrze szczepionką skojarzoną (odra-świnka-różyczka) i przesunięto podanie 2  dawki z  7 na 10  rok życia. Obecnie w ramach Programu Szczepień Ochronnych w Polsce stosowane są wyłącznie szczepionki skojarzone. Otrzymanie skutecznej i bezpiecznej szczepionki przeciwko odrze nie zakończyło prac nad szczepionkami tzw. „nowej generacji”. Celem tych prac jest wyeliminowanie problemów związanych z obecnie stosowaną szczepionką, takich jak: 1) niska skuteczność u dzieci poniżej 12 miesiąca życia, spowodowana niedojrzałością systemu immunologicznego i interakcji z przeciwciałami matczynymi [18, 91]; 2) obecność tzw. „okienka immunologicznego” czyli wrażliwości na zakażenie wirusem w  okresie pomiędzy utratą przeciwciał matczynych a nabyciem odporności w wyniku szczepienia [50]; 3) niemożność podania szczepionki osobom z obniżoną odpornością ze względu na wysokie ryzyko powikłań; 4) niski poziom swoistych przeciwciał klasy IgA indukowanych w wyniku podania szczepionki, który nie zabezpiecza przed namnażaniem się dzikiego szczepu wirusa w błonach śluzowych górnych dróg oddechowych; 5) konieczność zachowania łańcucha chłodniczego zarówno przed, jak i po rozpuszczeniu szczepionki (szczepionka atenuowana, szczególnie po rozpuszczeniu traci swoje właściwości immunogenne w podwyższonej temperaturze) [50]. Do tej pory opracowano wiele nowych eksperymentalnych szczepionek różnego typu: szczepionki DNA, tzw. „szczepionki genowe” [35, 67, 68]; szczepionki rekombinowane i podjednostkowe, zawierające np. peptydy z białek H i F [12] lub białko H [96]; szczepionki wektorowe, np. wirus krowianki z ekspresją białek H, F i/lub N wirusa odry [12]. Opracowanie nowej szczepionki, która nie wymagałaby zachowania tzw. łańcucha chłodniczego, a  jej podanie nie wymagałoby igły i strzykawki, oraz która mogłaby być z powodzeniem stosowana u  dzieci poniżej 6 miesiąca życia mogłoby usprawnić i wzmocnić kontrolę nad odrą w wielu częś­ ciach świata. 6.2. Odpowiedź indukowana w wyniku szczepienia Odpowiedź immunologiczna po podaniu szczepionki zabitej była inna niż po podaniu szczepionki atenuowanej, ponieważ w procesie inaktywacji ulegała zniszczeniu immunogenność białka fuzyjnego F (patrz 6.1). Szczepionka atenuowana indukuje zarówno odpowiedź ze strony przeciwciał neutralizujących, jak i odpowiedź komórkową, jakościowo podobną do tej indukowanej w wyniku naturalnego zakażenia, chociaż poziomy wytworzonych przeciwciał są niższe [39, 65],

242

Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Joanna Siennicka

a odporność jest mniej trwała niż ta uzyskana w wyniku naturalnego zakażenia [52, 53, 73]. Przeciwciała klasy IgM pojawiają się w  surowicy osób szczepionych w 2 tygodniu po szczepieniu i utrzymują się do 4 tygodnia, osiągając szczyt w 3 tygodniu. Przeciwciała klasy IgG pojawiają się również w 2 tygodniu, osiągając szczyt w  3–4  tygodniu po szczepieniu, ale poziom ich wraz z  upływem czasu ulega obniżeniu [33]. Utrata przeciwciał jest szybsza w przypadku immunizacji później opracowanymi szczepionkami niż w przypadku pierwszych atenuowanych szczepionek przeciwko odrze czy po naturalnym zakażeniu [40]. Również odpowiedź komórkowa indukowana po szczepieniu jest słabiej wyrażona niż ta po naturalnym zakażeniu wirusem odry. W  pierwszym etapie aktywowane są komórki CD8, ważne dla procesu eliminacji wirusa z organizmu, a następnie komórki CD4, które zanikają z czasem [58]. Istnieje wiele czynników determinujących poszczepienną odpowiedź odpornościową: • Wiek osoby szczepionej – prawdopodobieństwo uzyskania serokonwersji oraz poziom indukowanych przeciwciał są determinowane przez poziom istniejących przeciwciał matczynych i dojrzałość układu odpornościowego dziecka w chwili szczepienia [19, 75]. Wyniki badań przeprowadzonych przez Janaszek i Ślusarczyka [32] sugerują, że poziom przeciwciał przekazywanych przez matkę jest uzależniony od tego w jaki sposób matka uzyskała przeciwciała, tzn. czy w  wyniku naturalnego zakażenia wirusem odry (matki urodzone przed rokiem 1969) czy w wyniku szczepienia (urodzone po 1975 roku). Poziom przeciwciał u  osób szczepionych jest niższy niż u  osób, które uzyskały przeciwciała w  wyniku naturalnego zakażenia [41]. Niższy poziom przeciwciał przeciwko odrze u kobiet szczepionych ma znaczący wpływ na zanik odporności u nieszczepionych niemowląt [44, 83]. Wynika z tego jeden z problemów związanych ze szczepieniem przeciwko odrze, a mianowicie wysoki odsetek zachorowań wśród niemowląt poniżej pierwszego roku życia. Sytuacja taka miała miejsce w Polsce podczas epidemii w latach 1997–1998, kiedy to zapadalność na odrę wśród dzieci poniżej 1 roku życia była 4,5 razy wyższa niż w populacji ogólnej [32]. Zachorowania wśród małych dzieci są dość niebezpieczne i  zwiększają ryzyko rozwoju podostrego stwardniającego zapalenia mózgu w późniejszym okresie życia [1, 49]. Rekomendowany wiek szczepienia różni się regionalnie i jest wynikiem wypracowanej równowagi pomiędzy optymalnym wiekiem dla uzyskania serokonwersji a prawdopodobieństwem zakażenia wirusem odry przed okresem szczepienia [8]. • Droga podania szczepionki – pozaparenteralne podanie szczepionki (np. donosowo w  postaci aerozolu) mogłoby pozwolić na lokalną replikację wirusa szczepionkowego w  nabłonku układu oddechowego bez

interakcji z matczynymi przeciwciałami, tym samym stwarzając możliwość obniżenia wieku immunizacji. Stwierdzono, że podanie szczepionki w postaci aerozolu jest skuteczne w podwyższaniu istniejącej odpowiedzi immunologicznej (przeciwciała), stymuluje powstanie przeciwciał wydzielniczych IgA, ale jednocześnie pierwotna odpowiedź immunologiczna na szczepionkę podaną w takiej postaci jest niższa niż po podaniu podskórnym [43, 97, 98]. • Współistniejące choroby, np. ostre zachorowania, immunosupresja, choroby wieku dziecięcego, zakażenie HIV, ciężkie upośledzenie odpowiedzi komórkowej. Szczepionka atenuowana nie jest zalecana u osób z  niską liczbą komórek CD4 z powodu możliwości rozwinięcia progresywnego zakażenia [3, 21, 85, 86]. • Cechy osobnicze – genetyczne uwarunkowania mające wpływ na odpowiedź immunologiczną w zakresie rozpoznawania antygenów przez limfocyty, sygnali­za­cji międzykomórkowej, produkcji cytokin, procesu przełączania między izotypami przeciwciał [58]. W stosunku do zakażenia wirusem odry stwierdzono związek polimorfizmu genów dla HLA, cytokin, receptorów cytokinowych i receptorów komórkowych dla MeV z  poziomem wirusowo-swoistych przeciwciał i poziomem limfoproliferacji [11, 65]. • Dawka – wielkość i ilość dawek. Skuteczność pojedynczej dawki szczepionki przeciwko odrze u dzieci jest szacowana na 80–95% [19]. Podanie drugiej dawki powoduje znaczny wzrost poziomu przeciw­ciał IgG (booster) przy jednoczesnym braku lub nieznacznej odpowiedzi ze strony przeciwciał IgM [66, 69]. Dwukrotne szczepienie ma na celu zmniejszenie odsetka dzieci nie zaszczepionych oraz osób, u których nie stwierdzono serokonwersji po pierwszym szczepieniu. Badania wykazały, że zapobieganie transmisji endemicznej odry nie jest możliwe w krajach, w których w programie szczepień przewidziano tylko jedną dawkę szczepionki, nawet jeżeli wyszczepialność populacji osiągnęłaby 100%. Niski odsetek osób, które pozostają wrażliwe na zakażenie wirusem odry (w  wyniku niepowodzenia 1  szczepienia) z  czasem ulegałby kumulacji [47]. Każda dawka obecnie stosowanych szczepionek zawiera nie mniej niż 1000 dawek zakaźnych (103TCID50) silnie osłabionego wirusa odry. Stosowana w przeszłości szczepionka o wysokim mianie (>104,7TCID50), zawierająca atenuowany szczep Edmonston-Zagreb, charakteryzowała się wysokim odsetkiem uodparnianych niemowląt w wieku 4–6 miesięcy i uzyskała rekomendację WHO do stosowania u dzieci w 6 miesiącu życia lub nieco starszych w tych krajach, gdzie duża liczba zgonów dzieci przed 9 miesiącem życia była związana z odrą. W krótkim okresie zaobserwowano jednak związek pomiędzy immunizacją szczepionką o wysokim mianie a  zwiększoną umieralnością wśród szczepionych dzieci na skutek

   WIRUS ODRY – REAKCJE ODPORNOŚCIOWE ZWIĄZANE Z NATURALNYM ZAKAŻENIEM ORAZ ODPOWIEDZIĄ POSZCZEPIENNĄ

powszechnie występujących infekcji (malaria, biegunka, zakażenia górnych dróg oddechowych). Zjawisko to tłumaczono immunosupresją powodowaną przez szczep szczepionkowy o wysokim mianie [1]. Z tego powodu szczepionka tego typu została zdyskwalifikowana i utraciła rekomendacje WHO. 7. Podsumowanie Mimo opracowania skutecznej szczepionki przeciwko odrze oraz wdrożenia przez WHO planu eliminacji odry, epidemie nadal zdarzają się w wielu krajach. Niepowodzenie planu zakładającego eliminację do 2010  r. zachorowań na odrę w regionie europejskim ma wiele przyczyn, m.in. związanych z charakterem odpowiedzi immunologicznej na to zakażenie. W październiku 2010 r., organizacja FAO ogłosiła eradykację wirusa księgosuszu (Rinderpest-Virus) [62]. Jest to wiadomość bardzo znacząca dla powodzenia planu eliminacji wirusa odry, ponieważ wirus księgosuszu, podobnie jak wirus odry, należy do rodzaju Morbillivirus. Mając na uwadze bliskie pokrewieństwo obu tych wirusów, informacja ta sugeruje, że eliminacja wirusa odry jest również możliwa. Praca finansowana w ramach projektu MNiSW NN 404 107938

Piśmiennictwo   1. Aaby P., Anderson M., Knudsen K.: Excess mortality after early exposure to measles. Int. J. Epidemiol. 22, 156–162 (1993)   2. Aaby P., Jensen H., Simondon F., Whittle H.: High-titer measles vaccination before 9 months of age and increased female mortality: do we have an explanation? Semin. Pediatr. Infect. Dis. 14, 220–232 (2003)   3. Angel J.B., Walpita P., Lerch R.A., Sidhu M.S., Masurekar M., DeLellis R.A., Noble J.T., Snydman D.R., Udem S.A.: Vaccine-associated measles pneumonitis in an adult with AIDS. Ann. Intern. Med. 129,104–106 (1998)   4. European Centre for Disease Prevention and Control.: Annual epidemiological report on communicable diseasses 2009, ECDC, Stockholm, 2009.   5. Beckford A.P., Kaschula R.O., Stephen C.: Factors associated with fatal cases of measles. A retrospective autopsy study. S. Afr. Med. J. 68, 858–63 (1985)   6. Burnet F.M.: Measles as an index of immunological function. Lancet, 292, 610–613 (1968)   7. Carter C.H., Conway T.J., Cornfeld D., Iezzoni D.G., Kempe C.H., Moscovici C., Rauh L.W., Vignec A.J., Warren J.: Serologic response of children to in-activated measles vaccine. JAMA, 179, 848–853 (1962)   8. Cutts F.T., Grabowsky M., Markowitz L.E.: The effect of dose and strain of live attenuated measles vaccines on serological responses in young infants. Biologicals, 23, 95–106 (1995)  9. Czarkowski P., Cielebąk E., Dacka P., Kondej B.: Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce w 2006 roku. Wydawnictwo NIZP-PZH, Warszawa, 2007. 10. Devaux P, Christiansen D, Plumet S, Gerlier D.: Cell surface activation of the alternative complement pathway by the fusion protein of measles virus. J. Gen. Virol. 85, 1665–1667 (2004)

243

11. Dhiman N., Ovsyannikova I.G., Cunningham J.M., Vierkant R.A., Kennedy R.B., Pankratz V.S., Poland G.A., Jacobson R.M.: Associations between measles vaccine immunity and single-nucleotide polymorphisms in cytokine and cytokine receptor genes. J. Infect. Dis. 195, 21–29 (2007) 12. El Kasmi K.C., Muller C.P.: New strategies for closing the gap of measles susceptibility in infants: towards vaccines compatible with current vaccination schedules. Vaccine, 19, 2238–2244 (2001) 13. El Mubarak H.S., Ibrahim S.A., Vos H.W., Mukhtar M.M., Mustafa O.A., Wild T.F., Osterhaus A.D., de Swart R.L.: Measles virus protein-specific IgM, IgA, and IgG subclass responses during the acute and convalescent phase of infection. J. Med. Virol. 72, 290–298 (2004) 14. Enders J.F., Peebles T.C.: Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86, 277–286 (1954) 15. Enders J.F.: Measles virus: historical review, isolation and behavior in various systems. Am. J. Dis. Child. 103, 282–287 (1962) 16. Erlenhöfer C., Duprex W.P., Rima B.K., ter Meulen V., Schnei­der-Schaulies J.: Analysis of receptor (CD46, CD150) usage by measles virus. J. Gen. Virol. 83, 1431–1436 (2002) 17. Fulginiti V., Kempe C.H.: Measles exposure among vaccine recipients. Am. J. Dis. Child. 106, 62–73 (1963) 18. Gans H.A., Arvin A.M., Galinus J., Logan L., DeHovitz R., Maldonado Y.: Deficiency of the humoral immune response to measles vaccine in infants immunized at age 6 months. JAMA, 12, 527–532 (1998) 19. Gans H.A., Yasukawa L.L., Alderson A., Rinki M., DeHovitz R., Beeler J., Audet S., Maldonado Y., Arvin A.M.: Humoral and cell-mediated immune responses to an early 2-dose measles vaccination regimen in the United States. J. Infect. Dis. 190, 83–90 (2004) 20. Gershon A.A.: Measles Virus (w) Principles and practice of infectious diseases., red. G.L. Mandell, J.E. Bennett, R. Dolin, Elsevier Churchill Livingstone, Philadelphia, 2005, s. 2031. 21. Goon P., Cohen B., Jin L., Watkins R., Tudor-Williams G.: MMR vaccine in HIV-infected children – potential hazards? Vaccine, 19, 3816–3819 (2001) 22. Griffin D.E., Moench T.R., Johnson R.T., Lindo de Soriano I., Vaisberg A.: Peripheral blood mononuclear cells during natural measles virus infection: cell surface phenotypes and evidence for activation. Clin. Immunol. Immunopathol. 40, 305–312 (1986) 23. Griffin D.E., Ward B.J., Jauregui E., Johnson R.T., Vaisberg A.: Natural killer cell activity during measles. Clin. Exp. Immunol. 81, 218–224 (1990) 24. Griffin D.E.: Measles Virus (w) Fields Virology, red. D.M. Knip, P.M. Howley, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Baltimore, New York, London, Buenos Aires, Hong Kong, Sydney, Tokyo, 2007, s. 1552. 25. Griffin D.E.: Measles virus-induced suppression of immune responses. Immunol. Rev. 236, 176–189 (2010) 26. Gringhuis S.I, den Dunnen J., Litjens M., van Het Hof B., van Kooyk Y., Geijtenbeek T.B.: C-type lectin DC-SIGN modulates Toll-like receptor signaling via Raf-1 kinase-dependent acetylation of transcription factor NF-kappaB. Immunity, 26, 605–616 (2007) 27. Gut W., Naruszewicz-Lesiuk D.:Analysis of the correlation between measles and subacute sclerosis panencephalitis (SSPE) before and after introduction of vaccination in Poland. Przegl. Epidemiol. 46, 295–301 (1992) 28. Hahm B.: Hostile communication of measles virus with host innate immunity and dendritic cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 330, 271–287 (2009) 29. Halwani R., Doroudchi M., Yassine-Diab B., Janbazian L., Shi Y., Said E.A., Haddad E.K., Sékaly R.P.: Generation and

244

Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Joanna Siennicka

maintenance of human memory cells during viral infection. Springer Semin. Immunopathol. 28, 197–208 (2006) 30. Horikami S.M, Moyer S.A.: Structure, transcription, and replication of measles virus (w) Measles virus, red. V. ter Meulen, M.A. Billeter, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona, Budapest, 1995, s. 35. 31. Janaszek W., Gut W., Gay N.J.: The epidemiology of measles in Poland: prevalence of measles virus antibodies in the population. Epidemiol. Infect. 125, 385–392 (2000) 32. Janaszek W., Ślusarczyk J.: Immunity against measles in populations of women and infants in Poland. Vaccine, 21, 2948–2953 (2003) 33. Janaszek-Seydlitz W.: Szczepionka przeciwko odrze (w) Wakcynologia, red. W. Magdzik, D. Naruszewicz-Lesiuk, A. Zieliński, α-medica press, Bielsko-Biała, 2007, s. 412 34. Jaye A., Herberts C.A., Jallow S., Atabani S., Klein M.R, Hoogerhout P., Kidd M., van Els C.A., Whittle H.C.,: Vigorous but short-term gamma interferon T-cell responses against a dominant HLA-A*02-restricted measles virus epitope in patients with measles. J. Virol. 77, 5014–5016 (2003) 35. Kaslow D.C.: A potential disruptive technology in vaccine development: gene-based vaccines and their application to infectious diseases. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 98, 593–601 (2004) 36. Koga R, Ohno S, Ikegame S, Yanagi Y.: Measles virus-induced immunosuppression in SLAM knock-in mice. J. Virol. 84, 5360–5367 (2010) 37. Krugman S., Giles J.P., Jacobs A.M., Friedman H.: Studies with live attenuated measles-virus vaccine. Comparative clinical, antigenic, and prophylactic effects after inoculation with and without gamma-globulin. Am. J. Dis. Child. 103, 353–363 (1962) 38. Krugman S., Giles J.P., Jacobs A.M., Friedman H.: Studies with a further attenuated live measles-virus vaccine. Pediatrics, 31, 919–928 (1963) 39. Krugman S.: Present status of measles and rubella immunization in the United States: a medical progress report. J. Pediatr. 78, 1–16 (1971) 40. Krugman S.: Present status of measles and rubella immunization in the United States: a medical progress report. J. Pediatr. 90, 1–12 (1977) 41. Krugman S.: Further-attenuated measles vaccine: characteris­ tics and use. Rev. Infect. Dis. 5, 477–481 (1983) 42. Lamb R.A., Griffin D.E.: Paramyxoviridae: the viruses and their replication (w) Fields Virology, red. D.M. Knip, P.M. Howley, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Baltimore, New York, London, Buenos Aires, Hong Kong, Sydney, Tokyo, 2007, s. 1552. 43. Low N., Kraemer S., Schneider M., Restrepo A.M.: Immunogenicity and safety of aerosolized measles vaccine: systematic review and meta-analysis. Vaccine, 26, 383–398 (2008) 44. Maldonado Y.A., Lawrance E.C., de Hovitz R., Hartzell A., Albrecht P.: Early loss passive measles antibody in infants of mothers with vaccine-induced immunity. Pediatrics, 96, 447–450 (1995) 45. Malvoisin E., Wild F.: Contribution of measles virus fusion protein in protective immunity: anti-F monoclonal antibodies neutralize virus infectivity and protect mice against challenge. J. Virol. 64, 5160–5162 (1990) 46. Massé N., Barrett T., Muller C.P., Wild T.F., Buckland R.: Identification of a second major site for CD46 binding in the hemagglutinin protein from a laboratory strain of measles virus (MV): potential consequences for wild-type MV infection. J. Virol. 76, 13034–13038 (2002) 47. Meissner H.C., Strebel P.M., Orenstein W.A.: Measles vaccines and the potential for worldwide eradication of measles. Pediatrics, 114, 1065–1069 (2004)

48. Merz D.C., Scheid A., Choppin P.W.: Importance of antibodies to the fusion glycoprotein of paramyxoviruses in the prevention of spread of infection. J. Exp. Med. 151, 275–288 (1980) 49. Miller C., Farrington C.P., Harbert K.: The epidemiology of subacute sclerosing panacephalitis in England and Wales 1970–1989. Int. J. Epidemiol. 21, 998–1006 (1992) 50. Mitragotri S.: Immunization without needles. Nat. Rev. Immunol. 5, 905–916 (2005) 51. Moss W.J., Ryon J.J., Monze M., Griffin D.,E.: Differential regulation of interleukin (IL)-4, IL-5, and IL-10 during measles in Zambian children. J. Infect. Dis. 186, 879–887 (2002) 52. Mossong J., Nokes D.J., Edmunds W.J., Cox M.J., Ratnam S., Muller C.P.: Modeling the impact of subclinical measles transmission in vaccinated populations with waning immunity. Am. J. Epidemiol. 150, 1238–1249 (1999) 53. Mossong J., O’Callaghan C.J., Ratnam S.: Modelling antibody response to measles vaccine and subsequent waning of immunity in a low exposure population. Vaccine, 19, 523–529 (2000) 54. Muscat M., Bang H., Wohlfahrt J., Glismann S., Mølbak K.: Measles in Europe: an epidemiological assessment. Lancet, 373, 383–389 (2009) 55. Nader P.R., Horwitz M.S., Rousseau J.: Atypical exanthem following exposure to natural measles: eleven cases in children previously inoculated with killed vaccine. J. Pediatr. 72, 22–28 (1968) 56. Nanan R., Rauch A., Kämpgen E., Niewiesk S., Kreth H.W.: A novel sensitive approach for frequency analysis of measles virus-specific memory T-lymphocytes in healthy adults with a childhood history of natural measles. J. Gen. Virol. 81, 1313– 1319 (2000) 57. Naniche D., Yeh A., Eto D., Manchester M., Friedman R.M, Oldstone M.B.: Evasion of host defenses by measles virus: wildtype measles virus infection interferes with induction of Alpha/ Beta interferon production. J. Virol. 74, 7478–7484 (2000) 58. Naniche D., Garenne M., Rae C., Manchester M., Buchta R., Brodine S.K., Oldstone M.B.: Decrease in measles virus-specific CD4 T cell memory in vaccinated subjects. J. Infect. Dis. 190, 1387–1395 (2004) 59. Naniche D.: Human Immunology of Measles Virus Infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 330, 151–171 (2009) 60. Naruszewicz-Lesiuk D., Iwińska-Buksowicz B., Wieczorkiewicz M., Kulczycki J., Gut W.: Subacute sclerosing panencephalitis (SSPE) in Poland in 1996–1999. Phase VII of epidemiologic studies. Neurol. Neurochir. Pol. 5, 877–885 (2000) 61. Naruszewicz-Lesiuk D.: Odra (w) Choroby zakaźne i ich zwalczanie na ziemiach polskich w XX wieku, red. J. Kostrzewski, W. Magdzik, D. Naruszewicz-Lesiuk, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2001, s. 281. 62. Normie D.: Rinderpest, deadly for cattle, joins smallpox as vanquished disease. Science, 330, 435 (2010) 63. Ohga S., Miyazaki C., Okada K., Akazawa K., Ueda K.: The inflammatory cytokines in measles: correlation between serum interferon-gamma levels and lymphocyte subpopulations. Eur. J. Pediatr. 151, 492–496 (1992) 64. Okada H., Kobune F., Sato T.A., Kohama T., Takeuchi Y., Abe T., Takayama N., Tsuchiya T., Tashiro M.: Extensive lymphopenia due to apoptosis of uninfected lymphocytes in acute measles patients. Arch. Virol. 145, 905–920 (2000) 65. Ovsyannikova I.G., Dhiman N., Jacobson R.M., Vierkant R.A., Poland G.A.: Frequency of measles virus-specific CD4+ and CD8+ T cells in subjects seronegative or highly seropositive for measles vaccine. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 411–416 (2003) 66. Ozanne G., d’Halewyn M.A.: Secondary immune response in a vaccinated population during a large measles epidemic. J. Clin. Microbiol. 30, 1778–1782 (1992)

   WIRUS ODRY – REAKCJE ODPORNOŚCIOWE ZWIĄZANE Z NATURALNYM ZAKAŻENIEM ORAZ ODPOWIEDZIĄ POSZCZEPIENNĄ

67. Pan C.H., Nair N., Adams R.J., Zink M.C., Lee E.Y., Polack F.P., Singh M., O’Hagan D.T., Griffin D.E.: Dose-dependent protection against or exacerbation of disease by a polylactide glycolide microparticle-adsorbed, alphavirus-based measles virus DNA vaccine in rhesus macaques. Clin. Vaccine Immunol. 15, 697–706 (2008) 68. Pasetti M.F., Resendiz-Albor A., Ramirez K., Stout R.,Papania M., Adams R.J., Polack F.P., Ward B.J., Burt D., Chabot  S., Ulmer J., Barry E.M., Levine M.M.: Heterologous prime-boost strategy to immunize very young infants against measles: pre-clinical studies in rhesus macaques. Clin. Pharmacol. Ther. 82, 672–685 (2007) 69. Pebody R.G., Gay N.J., Hesketh L.M., Vyse A., Morgan-Capner P., Brown D.W., Litton P., Miller E.: Immunogenicity of second dose measles-mumps-rubella (MMR) vaccine and implications for serosurveillance. Vaccine, 20, 1134–1140 (2002) 70. Permar S.R., Klumpp S.A., Mansfield K.G., Kim W.K., Gorgone D.A., Lifton M.A., Williams K.C., Schmitz J.E., Reimann K.A., Axthelm M.K., Polack F.P., Griffin D.E., Letvin N.L.: Role of CD8(+) lymphocytes in control and clearance of measles virus infection of rhesus monkeys. J. Virol. 77, 4396–4400 (2003) 71. Petralli J.K., Merigan T.C., Wilbur J.R.: Circulating interferon after measles vaccination. N. Engl. J. Med. 273, 198–201 (1965) 72. Polack F.P., Hoffman S.J., Crujeiras G., Griffin D.E.: A role for nonprotective complement-fixing antibodies with low avidity for measles virus in atypical measles. Nat. Med. 9, 1209–1213 (2003) 73. Pütz M.M., Bouche F.B., de Swart R.L., Muller C.P.: Experimental vaccines against measles in a world of changing epidemiology. Int. J. Parasitol. 33, 525–545 (2003) 74. Rauh L.W., Schmidt R.: Measles immunization with killed virus vaccine. serum antibody titers and experience with exposure to measles epidemic. Am. J. Dis. Child. 109, 232–237 (1965) 75. Redd S.C., King G.E., Heath J.L., Forghani B., Bellini W.J., Markowitz L.E.: Comparison of vaccination with measles-mumps-rubella vaccine at 9, 12, and 15 months of age. J. Infect. Dis. 189, 116–122 (2004) 76. Riddell M.A., Moss W.J., Hauer D., Monze M., Griffin D.E.: Slow clearance of measles virus RNA after acute infection. J. Clin. Virol. 39, 312–317 (2007) 77. Rota J.S., Wang Z.D., Rota P.A., Bellini W.J.: Comparison of sequences of the H, F, and N coding genes of measles virus vaccine strains. Virus Res. 31, 317–330 (1994) 78. Rota P.A., Featherstone D.A., Bellini W.J.: Molecular epidemiology of measles virus. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 330, 129–150 (2009) 79. Schneider-Schaulies S., Schneider-Schaulies J.: Measles virus-induced immunosuppression. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 330, 243–69 (2009) 80. Schnorr J.J., Seufert M., Schlender J., Borst J., Johnston I.C., ter Meulen V., Schneider-Schaulies S.: Cell cycle arrest rather than apoptosis is associated with measles virus contact-mediated immunosuppression in vitro. J. Gen. Virol. 78, 3217–3226 (1997) 81. Schwarz A.J.: Immunization against measles: development and evaluation of a highly attenuated live measles vaccine. Ann. Paediatr. 202, 241–252 (1964) 82. Shiozawa S., Yoshikawa N., Iijima K., Negishi K.: A sensitive radioimmunoassay for circulating alpha-interferon in the plas­ma of healthy children and patients with measles virus infection. Clin. Exp. Immunol. 73, 366–369 (1988) 83. de Serres G., Joly J.R., Fauvel M., Meyer F., Mâsse B., Boulianne N.: Passive immunity against measles during the first 8 months of life of infants born to vaccinated mothers or to mothers who sustained measles. Vaccine, 5, 620–623 (1997) 84. Sissons J.G., Oldstone M.B., Schreiber R.D.: Antibody-independent activation of the alternative complement pathway by

245

measles virus-infected cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 559–562 (1980)   85. de Swart R.L., Kuiken T., Fernandez-de Castro J., Papania M.J., Bennett J.V., Valdespino J.L., Minor P., Witham C.L., Yüksel S., Vos H., van Amerongen G., Osterhaus AD.: Aerosol measles vaccination in macaques: preclinical studies of immune responses and safety. Vaccine, 24, 6424–6436 (2006)   86. de Swart R.L., LiCalsi C., Quirk A.V., van Amerongen G., Nodelman V., Alcock R., Yüksel S., Ward G.H., Hardy J.G., Vos H., Witham C.L., Grainger C.I., Kuiken T., Greenspan B.J., Gard T.G., Osterhaus A.D.: Measles vaccination of macaques by dry powder inhalation. Vaccine, 25, 1183–1190 (2007)   87. Turlej E.: Współczesne metody detekcji cytokin – real time PCR, ELISPOT oraz technika wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin. Post. Hig. Med. Dośw. 63, 213–224 (2009)   88. Ueda S.: Development of measles vaccines in Japan. Vaccine, 27, 3230–3231 (2009)   89. van Binnendijk R.S., van den Hof S., van den Kerkhof H., Kohl R.H., Woonink F., Berbers G.A., Conyn-van Spaendonck M.A., Kimman T.G.: Evaluation of serological and virological tests in the diagnosis of clinical and subclinical measles virus infections during an outbreak of measles in The Netherlands. J. Infect. Dis. 188, 898–903 (2003)  90. Verhoeven D., Teijaro J.R., Farber D.L.: Heterogeneous memory T cells in antiviral immunity and immunopathology. Viral Immunol. 21, 99–113 (2008)   91. de Vries R.D., Stittelaar K.J., Osterhaus A.D., de Swart R.L.: Measles vaccination: new strategies and formulations. Expert. Rev. Vaccines, 7, 1215–1223 (2008)   92. Vuorinen T., Peri P., Vainionpää R.: Measles virus induces apoptosis in uninfected bystander T cells and leads to granzyme B and caspase activation in peripheral blood mononuclear cell cultures. Eur. J. Clin. Invest. 33, 434–442 (2003)   93. Walker J.M., Slifka M.K.,: Longevity of T-cell memory following acute viral infection. Adv. Exp. Med. Biol. 684, 96–107 (2010)  94. World Health Organization: Module 7: Measles (w) Global Programme for Vaccines and Immunization. Expanded Programme on Immunization. The Immunological Basis for Immunization Series, WHO, Genewa 1993.  95. World Health Organization: Global reductions in measles mortality 2000–2008 and he risk of measles resurgence. Weekly Epidemiol. Record, 84, 505–516 (2009)   96. Webster D.E., Cooney M.L., Huang Z., Drew D.R., Ramshaw I.A., Dry I.B., Strugnell R.A., Martin J.L., Wesselingh S.L.: Successful boosting of a DNA measles immunization with an oral plant-derived measles virus vaccine. J. Virol. 76, 7910–7912 (2002)   97. Wong-Chew R.M., Islas-Romero R., García-García M.de L., Beeler J.A., Audet S., Santos-Preciado J.I., Gans H., Lew-Yasukawa L., Maldonado Y.A., Arvin A.M., Valdespino-Gómez J.L.: Induction of cellular and humoral immunity after aerosol or subcutaneous administration of Edmonston-Zagreb measles vaccine as a primary dose to 12-month-old children. J. Infect. Dis. 189, 254–257 (2004)   98. Wong-Chew R.M., Islas-Romero R., García-García M. de L., Beeler J.A., Audet S., Santos-Preciado J.I., Gans H., Lew-Yasukawa L., Maldonado Y.A., Arvin A.M., Valdespino-Gómez J.L.: Immunogenicity of aerosol measles vaccine given as the primary measles immunization to nine-month-old Mexican children. Vaccine, 24, 683–690 (2006)   99. Yanagi Y., Ono N., Tatsuo H., Hashimoto K., Minagawa H.: Measles virus receptor SLAM (CD150). Virology, 299, 155–161 (2002) 100. Yanagi Y., Takeda M., Ohno S., Seki F.: Measles virus receptors and tropism. Jpn. J. Infect. Dis. 95, 1–5 (2006)

P U B L I K A C J E   M E TO DYC Z N E   I   S TA N DA R DY POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 3, 247–255 http://www.pm.microbiology.pl

Znaczenie przemysłowe drożdży z rodzaju Pichia Paweł Satora1*, Michał Wiśniewski1

1

Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej, Uniwersytet Rolniczy, ul. Balicka 122, 30-149 Kraków Wpłynęło w marcu 2011 r.

1. Wstęp. 2. Pichia pastoris jako producent białek rekombinowanych. 3. Biosynteza wybranych związków i enzymów przez szczepy Pichia. 4. Znaczenie drożdży z rodzaju Pichia w produkcji bioetanolu z surowców ligninocelulozowych. 5. Drożdże Pichia w procesie fermentacji wybranych produktów spożywczych. 6. Znaczenie i wykorzystanie toksyn killerowych wytwarzanych przez różne gatunki drożdży Pichia. 7. Wykorzystanie modyfikowanych szczepów Pichia pastoris do produkcji ludzkich glikoprotein. 8. Podsumowanie Industrial significance of Pichia yeasts Abstract: In this article, significance and possibile applications of Pichia yeasts are presented. High diversity of Pichia species contributes to their widespread use in different branches of traditional as well as modern industry. For the sake of relatively rapid growth, easiness of post-translational modification and low immunogenicity, Pichia strains are applied in various domains of biotechnology. Low nutritional requirements, possibility of control of protein secretion by modification of carbon source as well as relatively simple purification of obtained products mates Pichia strains very good recombinant protein producers. Thanks to xylose and L-arabinose fermentation ability, strains of Pichia genus along with other yeasts are applied for efficient bioethanol production from plant materials. In the food industry, they are used in the spontaneous fermentation of different products, such as cacao and olives. Pichia yeasts can synthesize aroma compounds and antioxidants which delay oxidation of lipids. Killer toxins secreted by some species of Pichia are utilised in the elimination of food and raw material spoilage caused by other mycotoxic fungi, and of their carcinogenic metabolites. In the pharmaceutical industry Pichia yeasts are used for antimicrobial production. They facilitate either the synthesis of human glycoproteins or drugs based on these compounds. Of course it is only part of this genus potential. Still a number of research is being carried out to improve the known processes and to find new application for these microorganisms. 1. Introduction. 2. Pichia pastoris as recombinant protein producer. 3. Biosynthesis of selected compounds and enzymes by Pichia strains. 4. Pichia yeasts application for the bioethanol production using lignocellulosic materials. 5. Pichia yeast application in the fermentation processes of selected food. 6. Significance and application of killer toxins secreted by different Pichia strains. 7. Applications of modified strains of Pichia pastoris for human glycoprotein production. 8. Summary Słowa kluczowe: Pichia, białka rekombinowane, bioetanol, toksyny killerowe Key words: Pichia, recombinant proteins, bioethanol, killer toxins

1. Wstęp Rodzaj Pichia jest drugim, co do wielkości rodzajem drożdży, obejmującym ponad 100 gatunków tych mikroorganizmów. Jest silnie zróżnicowany zarówno filogenetycznie, jak i fenotypowo, należą do niego gatunki wykształcające spory w kształcie kapelusza, część szczepów jest w stanie asymilować azotany jako źródło azotu, wszystkie zawierają ubichinon typu  7,8 lub 9 [15, 27]. Bardzo długo drożdże należące obecnie do rodzaju Pichia nie były jednoznacznie sklasyfikowane, używano wielu synonimów na określenie ich nazwy m.in. Hansenula, Endomyces, Saccharomyces, Mycoderma. Było to spowodowane zróżnicowaniem genetycznym rodzaju

i poszczególnych szczepów. Dopiero dokładniejsze badania nad sekwencją podjednostek 18S i 26S rRNA oraz 26S rDNA, a także przeprowadzenie elektroforetycznego kariotypowania pozwoliły zakwalifikować poszczególne szczepy do jednego rodzaju [27]. Drożdże z rodzaju Pichia naturalnie wystepują w wielu środowiskach, najczęściej można ja znaleźć na rozkładających się roślinach, owocach, ziarnach zbóż oraz produktach spożywczych z  wysoką zawartością cukru. Mogą żyć w symbiozie z  owadami bytującymi na roślinach. Często spotyka się je także w  surowym mleku i serach [31]. Pod względem budowy Pichia są typowymi drożdżami, ich komórki mogą mieć różnorodną wielkość oraz okrągły, owalny lub szpiczasty kształt w zależności

*  Autor korespondencyjny: Uniwersytet Rolniczy; ul. Balicka 122, 30-149 Kraków; tel.: +48 12 662 47 97; fax: +48 12 662 47 98; e-mail: [email protected]

248

Paweł Satora, Michał Wiśniewski

od gatunku. Mogą rozmnażać się zarówno wegetatywnie przez pączkowanie, jak i generatywnie przez wytwarzanie askospor [15]. Drożdże z rodzaju Pichia mają zdolność przeprowadzania fermentacji alkoholowej, zarówno w środowisku tlenowym, jak i beztlenowym. Mogą brać udział w fermentacji różnych napojów i produktów spożywczych. Podczas wyżej wymienionego procesu produkują dużo związków odpowiedzialnych za aromat. Jednym z nich jest octan etylu, nadający octowy posmak. Niewielka ilość lotnych związków pozytywnie wpływa na aromat, a sam octan etylu ma właściwości przeciwgrzybiczne. Jednak zbyt duże nagromadzenie powstałych aromatów pogarsza smak i zapach fermentowanego produktu. Niektóre gatunki drożdży z rodzaju Pichia, jak P. stipitis mają zdolność fermentacji ksylozy do etanolu. Pentoza ta to główny składnik biomasy roślinnej, która jako obfita, tania i łatwo odnawialna, stanowi świetny surowiec do produkcji etanolu [11, 15, 31, 32]. Zdecydowana większość drożdży z rodzaju Pichia to mezofile, a ich optymalna temperatura wzrostu, w  zależności od gatunku zawiera się pomiędzy 24, a 40°C. Do tej grupy możemy zaliczyć jeden ze szczepów Pichia anomala, którego optimum temperaturowe wynosi 35–37°C. Wśród wielu gatunków drożdży Pichia można znaleźć także psychrofile i termofile. Przykładem gatunku zimnolubnego może być Pichia membranifaciens, drożdże które często spotkać można w żywności przechowywanej w warunkach chłodniczych, natomiast gatunek P. polymorpha zaliczany jest do termofili, ponieważ jego optymalna temperatura wzrostu przekracza 50°C. Optymalne pH dla drożdży z rodzaju Pichia mieści się pomiędzy 4,5, a 5,5, podobnie jak w przypadku większości drożdży, choć przy tak dużej ilości gatunków są i takie których optimum pH jest zupełnie inne. Dobrym tego przykładem jest P. membranifaciens, który może rozwijać się nawet w zakresie pH 1,3–1,7 [15]. Liczne gatunki z rodzaju Pichia mają zdolność wytwarzania toksyn killerowych. Mechanizm ich tworzenia i działania może być różny uzależniony od szczepu. Toksyny te najczęściej te działając na ścianę komórkową innych mikroorganizmów powodują powstanie w niej porów, następnie wyciek materiału komórkowego, a w konsekwencji śmierć komórki. Toksyny killerowe zapewniają drożdżom Pichia ochronę i zmniejszają konkurencję ze strony innych mikroorganizmów [22, 29, 36, 37]. 2. Pichia pastoris jako producent białek rekombinowanych Wraz z rozwojem nowoczesnej technologii mikroorganizmy są coraz częściej wykorzystywane w  wielu dziedzinach. Jedną z najbardziej dynamicznie rozwija-

jących się dziedzin nauk jest biotechnologia, zajmująca się m.in. produkcją białek rekombinowanych, w których wytwarzaniu biorą udział bakterie i drożdże. Druga grupa mikroorganizmów jest stosowana znacz­nie częściej, ponieważ łączy zalety zarówno prokariotycznych, jak i eukariotycznych systemów ekspresyjnych. Drożdże charakteryzują się dość szybkim wzrostem oraz osiągają większą, niż bakterie biomasę. Kolejnym aspektem przemawiającym na ich korzyść jest zdolność do przeprowadzania posttranslacyjnych modyfikacji białek, co u niektórych z nich jest warunkiem ich prawidłowego funkcjonowania. Ponadto drożdże w przeciwieństwie do bakterii mają zdolność do sekrecji wytworzonych białek. Jest to bardzo ważne, ponieważ pozwala ominąć niektóre etapy produkcji, takie jak śmierć komórek producenta czy oczyszczanie otrzymanego białka [14, 46]. Obecnie jednym z najczęściej wykorzystywanych w produkcji białek rekombinowanych gatunków drożdży jest szczep Pichia pastoris. Jego optimum temperaturowe wynosi około 30°C, jest metylotrofem (organizmem zdolnym do wykorzystywania metanolu jako jedynego źródła węgla i energii). Jedną z najważniejszych zalet P. pastoris jest bardzo wydajny system ekspresyjny. W porównaniu z najczęściej stosowanymi w przemyśle drożdżami Saccharomyces cerevisiae zapewnia nawet do 100 razy wyższy poziom ekspresji klonowanych genów. Ponadto tworzy trwałe rekombinatny, ma zdolność przeprowadzania modyfikacji posttranslacyjnych, takich jak glikozylacja, tworzenie mostków disiarczkowych oraz przyłączanie kwasów tłuszczowych. Łatwo przeprowadza się na nim manipulacje genetyczne, ma stabilne wektory plazmidowe, a sekrecja wytworzonych w komórkach białek jest bardzo wydajna, niekiedy może przekraczać nawet 10 g/l pożywki pohodowlanej [12]. Fakt, że P. pastoris może wzrastać także na innych substratach niż metanol, umożliwia kontrolę ekspresji klonowanego genu poprzez zmianę źródła węgla w pożywce na której są one hodowane, a dzięki temu także nadzór rozpoczęcia wytwarzania przez nie białka. Produkowane białko jest zazwyczaj toksyczne dla komórek i  ogranicza ich wzrost, dlatego możliwość wpływania na to kiedy zacznie ono być produkowane pozwala na swobodny przyrost biomasy drożdży nim rozpocznie się jego synteza. Metabolizm metanolu przeprowadzany w  komórkach drożdży P. pastoris wymaga obecności enzymów katalizujących jego poszczególne etapy. Najważniejsze z nich to oksydaza alkoholowa AOX1 (katalizująca przemianę metanolu do formaldehydu), dehydrogenaza mrówczanowa FLD1 (katalizujące utlenianie formaldehydu do kwasu mrówkowego) oraz syntaza dihydroksyacetonu DHAS (katalizująca kondensację aldehydu mrówkowego z ksylulozo-5-fosforanem). Pod kontrolę promotorów regulujących produkcję wyżej wymienionych enzymów wprowadzane są geny mające

Znaczenie przemysłowe drożdży z rodzaju Pichia

ulec ekspresji, co umożliwia także kontrolę ekspresji genu klonowanego poprzez zmianę źródła węgla w po-­ żywce [12, 31, 46]. Produkcja białek rekombinowanych z udziałem P.  pa­s­toris jest prowadzona w reaktorach okresowych. Wyróżniamy dwa typy szczepów P. pastoris, które różnią się własnościami biochemicznymi (kinetyką utylizacji metanolu) i  w  związku z tym hodowane są na różne sposoby. W  przypadku szczepu wolno metabolizującego metanol (Muts) używana jest mieszanina glicerolu (główne źródło węgla i  energii) i metanolu (induktor ekspresji genu białka), a stężenie metanolu jest utrzymywane na niskim poziomie. Jeżeli natomiast mamy do czynienia ze szczepem szybko metabolizującym metanol (Mut+), wtedy jest on głównym źródłem węgla i energii dla komórek (aktualnie ten typ służy do produkcji ponad 400  różnych białek). Produkcja białek rekombinowanych najczęściej składa się z czterech etapów. Pierwszy służy uzyskaniu jak największej biomasy komórek. W  etapie tym produkcja białka jest zatrzymywana, aby nie przeszkadzało ono we wzroście drożdży. W tym celu prowadzi się hodowlę na glicerolu jako źródle węgla. W kolejnej fazie produkcji nadal dostarcza się glicerolu, w celu jeszcze większego przyrostu masy komórek, jednocześnie wprowadza się metanol, który jest induktorem. Z czasem zmniejsza się ilość podawanego glicerolu, a zwiększa stężenie metanolu. Ostatnia faza to faza, w której jest produkowane najwięcej białka rekombinowanego, co wymaga ciągłego dostarczania metanolu. Wytworzone białko jest wydalane przez drożdże na zewnątrz komórki, więc nie ma problemu z jego późniejszym izolowaniem i oczyszczaniem [9, 47]. P. pastoris jest doskonałym układem do produkcji białek rekombinowanych. Jedyną wadą tych drożdży jest optimum temperaturowe wzrostu na poziomie 30°C, a w przypadku syntezy niektórych białek (głównie ssaków i ludzi) korzystniejsza może być nieco wyższa temperatura (ok. 36°C) [46]. 3. Biosynteza wybranych związków i enzymów przez szczepy Pichia Kolejnym zastosowaniem przedstawicieli rodzaju Pichia jest synteza różnego rodzaju związków, takich jak cukry czy enzymy, których produkcja na drodze chemicznej lub enzymatycznej wymaga dużych kosztów. Jedną z substancji biosyntezowanych przez drożdże Pichia jest arabitol. Jest to rozpuszczalny w wodzie poliol, o wzorze C5H12O5, jego masa molowa wynosi 152,14 g/ mol, temperatura topnienia 103°C. Arabitol ze względu na swoje właściwości może być stosowany w przemyśle spożywczym jako niskokaloryczny i dobrze tolerowany przez diabetyków słodzik. Ponadto może być wykorzystywany jako składnik jadalnych polew, stabilizator wil-

249

gotności lub w przemyśle farmaceutycznym jako komponent leków. Mimo swojego szerokiego zastosowania arabitol był używany tylko w niewielkim stopniu, ze względu na trudną dostępność i wysokie koszty produkcji. Arabitol metodą chemiczną otrzymuje się poprzez transformacje arabinozy w obecności katalizatora Ru/C, w temperaturze 250°C i ciśnieniu wodoru w wysokości 100 barów. Są to warunki drastyczne, źle wpływające na jakość powstałego związku, a  dodatkowo użycie rutenowego katalizatora powoduje wzrost i tak bardzo wysokich kosztów produkcji. Przemiany komórkowe arabinozy prowadzone przez różne mikroorganizmy są dużo tańsze niż metody chemiczne, jednak w ich końcowej fazie nie zawsze otrzymujemy arabitol (może wchodzić do cyklu Krebsa lub ulegać przemianie do etanolu). Jednymi z niewielkiej grupy organizmów zdolnych do syntezy arabitolu są dwa gatunki drożdży z  rodzaju Pichia – P. guilliermondii i  P. stipitis, z  czego pierwszy mikroorganizm wykazuje większą wydajność w  produkcji tego związku –  odpowiednio 0,43 i  0,33  g·g–1. Sama biosynteza jest bardzo prosta. Rozpoczyna się od L-arabinozy (cukru wchodzącego w skład hemiceluloz), która w komórkach drożdży pod wpływem enzymu – reduktazy aldozy, przekształcana jest do L-arabitolu. Następnie jest on wydzielany przez komórki do środo­wiska hodowlanego. W przypadku szczepu P. guilliermondii NRRL Y-2075 proces ten przebiega z zadowalającą wydajnością (w temperaturze 34°C i pH 4,0–0,71 g·g–1) i przy niskim nakładzie kosztów [25, 35]. Drożdże z rodzaju Pichia uczestniczą również w produkcji proteinazy K. Ma ona zdolność do rozkładu keratyny, o  czym informuje litera „K” w  nazwie związku. Proteinaza K rozkłada białka niespecyficznie, odcinając najczęściej reszty aminokwasów hydrofobowych i aromatycznych. Hydroliza białka najlepiej zachodzi przy pH 7,5–12, w obecności dużych stężeń jonów wapniowych. Enzym działa zarówno w niskich, jak i wysokich temperaturach (do 70°C) oraz w środowisku detergentów i związków denaturujących. Ze względu na zdolność do hydrolizy białek i braku aktywności nukleolitycznej, jest szeroko stosowany podczas izolowania i oczyszczania DNA i RNA. Mikroorganizmem wykorzystywanym do produkcji proteinazy K jest P. pastoris. Gatunek ten nie ma jednak naturalnej zdolności do biosyntezy tego związku, dlatego gen odpowiedzialny za wytwarzanie enzymu wprowadza się do jego systemu ekspresji białek na drodze biotechnologicznej. Gen ten został zamplifikowany techniką łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), a następnie wklonowany do odpowiednich plazmidów ekspresyjnych, które zostały użyte do transformacji P. pastoris. Rekombinowane szczepy drożdży hoduje się w bioreaktorach z pożywką zawierającą YNB (Yeast Nitrogen Base), metanol lub glicerol oraz niezbędne aminokwasy, przy silnym napowietrzaniu w  30°C. Po około 4–5 dniach hodowli osiąga się maksymalną ilość

250

Paweł Satora, Michał Wiśniewski

rekombinowanego enzymu. Otrzymaną proteinazę  K oddziela się od komórek drożdży Pichia, oczyszcza przy użyciu chromatografii jonowymiennej, a następnie zagęszcza metodami ultrafiltracji lub diafiltracji. Badania właściwości enzymu produkowanego przez szczep P. pastoris wykazały, że nie różni się on od tego samego preparatu dostępnego na rynku, otrzymanego innymi metodami. Zarówno aktywność, jak i termostabilność rekombinowanej proteinazy K w porównaniu z innymi enzymami tego typu stosowanymi w przemyśle była identyczna [7]. Drożdże z rodzaju Pichia mają także swój udział w produkcji termostabilnej β-D-galaktozydazy, enzymu katalizującego rozpad wiązań O-glikozydowych [45]. Najczęściej stosuje się go do hydrolizy wiązań β-1,4glikozydowych w  laktozie. Rozpad tego disacharydu prowadzi do powstania D-glukozy i D-galaktozy. β-Dgalaktozydazę wykorzystuje się głównie w  przemyśle mleczarskim do produkcji mleka o  niskiej zawartości laktozy, idealnego produktu dla osób nie tolerujących tego dwucukru. Ponadto mleko z rozłożoną na cukry proste laktozą stosuje się w produkcji jogurtów, ponieważ przyspiesza to fermentacje i eliminuje konieczność ich słodzenia. Swoje zastosowanie mleko bezlaktozowe znajduje także w  produkcji lodów, gdzie pozwala na wyeliminowanie tzw. piaszczystości, której powodem jest krystalizacja laktozy. β-D-galaktozydazę stosuje się w  produkcji twarogu, ponieważ skraca ona czas potrzebny na skrzepnięcie mleka [13, 45]. Również sery wyprodukowane z surowca z dodatkiem tego enzymu charakteryzują się szybszym czasem dojrzewania. Wiele organizmów ma zdolność do syntezy β-D-galaktozydazy. W  zależności od tego skąd pochodzi może różnić się masą cząsteczkową, optymalnym pH czy też temperaturą, stabilnością itp. Najlepszym źródłem tego enzymu są mikroorganizmy, które produkują β-D-galaktozydazę o różnych właściwościach, a niektóre nawet syntezują kilka jej odmian. Przewaga drożdży Pichia w stosunku do innych mikroorganizmów polega na możliwości łatwej modyfikacji ich genów oraz możliwości stworzenia rekombinowanego szczepu zdolnego do wytwarzania termostabilnej β-D-galaktozydazy. Zdolność tą ma bardzo mało mikroorganizmów, które w większości są termofilami. Termostabilna β-D-galaktozydaza charakteryzuje się zwartą strukturą cząstek, ułatwiającą jej immobilizację na złożu stałym, co pozwala na stosowanie jej w procesach ciągłych. Ponadto zastosowanie termostabilnego enzymu pozwala na jednoczesne wytwarzanie produktu i jego cieplną obróbkę, co jest bardzo pożądane w  przemyśle spożywczym. Modyfikacji systemu ekspresyjnego poddawany jest szczep P. pastoris, a wprowadzany gen pochodzi od hipertermofilnego mikroorganizmu Pyrococcus woesei. Zabieg ten pozwala na uzyskanie rekombinowanego gatunku P. pastoris zdolnego do biosyntezy termostabilnej

β-D-galaktozydazy, z dużo większą wydajnością, niż w przypadku bakterii od której pochodzi gen. Po wyizolowaniu enzym oczyszcza się i zagęszcza po czym jest gotowy do użycia w przemyśle [45]. 4. Znaczenie drożdży z rodzaju Pichia w produkcji bioetanolu z surowców ligninocelulozowych Wraz z rozwojem cywilizacyjnym rośnie zapotrzebowanie na energię. Zmniejszenie zasobów paliw naturalnych oraz coraz większy popyt na ten surowiec powodują, że jego cena stale rośnie. Największe zapotrzebowanie jest na paliwa płynne, wykorzystywane jako źródło energii w większości maszyn i urządzeń stosowanych w gospodarce. Czynniki te powodują poszukiwanie łatwo dostępnych i odnawialnych surowców do produkcji paliw płynnych oraz coraz większe zainteresowanie metodami ich przetwarzania w  celu otrzymania taniego źródła energii. Takim właśnie źródłem są surowce rolnicze, które mogą służyć do produkcji biopaliwa i  bioetanolu. Paliwo roślinne w  niedalekiej przyszłości może zastąpić olej napędowy pozyskiwany z  ropy naftowej, której zasoby bardzo szybko maleją, powodując szybki wzrost jej cen. Także etanol roślinny obecnie stosowany jako dodatek do benzyny, już niedługo może je całkowicie zastąpić. Nic więc dziwnego, że poszukuje się nowych i bardziej wydajnych metod ich wytwarzania. Jedną z takich metod jest otrzymywanie bioetanolu z surowców roślinnych. Zdecydowaną większość, bo aż 93% etanolu otrzymuje się dzięki fermentacji mikrobiologicznej. Głównym składnikiem biomasy roślinnej oprócz skrobi jest ligninoceluloza, składająca się z  celulozy, hemiceluloz oraz ligniny. Po obróbce wstępnej celuloza scukrzana jest do β-D-glukozy, natomiast hemicelulozy rozkładane są zarówno do heksoz, jak i  do pentoz. Niestety większość z mikroorganizmów przetwarza na etanol tylko cukry sześciowęglowe, nie posiadając zdolności fermentacji pentoz, takich jak ksyloza i L-arabinoza, co powoduje, że cały proces jest mało ekonomiczny [17, 40, 41]. Idealnym rozwiązaniem byłby gatunek zdolny do fermentacji wszystkich składników biomasy roślinnej i odporny na powstały produkt, niestety w środowisku naturalnym taki mikroorganizm nie istnieje. Szczep P. stipitis ma zdolność fermentacji ksylozy i L-arabinozy do etanolu, niestety jest mało odporny na jego duże stężenie w otoczeniu (powyżej 40 g/dm3), co jest czynnikiem ograniczającym pełne wykorzystanie tego mikroorganizmu [1]. Z kolei inne drożdże bardzo często używane do produkcji alkoholu etylowego – S. cerevisiae, nie mają zdolności rozkładu pentoz. W celu uzyskania na tyle wydajnej metody wytwarzania bioetanolu, by mógł on konkurować z paliwami otrzymywanymi z ropy naftowej próbuje się stosować dwie strategie.

Znaczenie przemysłowe drożdży z rodzaju Pichia

Pierwsza z nich jest częściej stosowana i polega na genetycznej modyfikacji drożdży S. cerevisiae, poprzez wprowadzanie genów odpowiedzialnych za fermentację pentoz [4]. Geny pochodzą od szczepu P. stipitis. Pierwszy z nich XYL1 koduje ksylulozoreduktazę, która redukuje ksylozę do ksylitolu, drugi natomiast o nazwie XYL2 odpowiada za wytwarzanie dehydrogenazy ksylitolu, przekształcającą ksylitol do ksylulozy. W ten sposób dzięki genom pochodzącym od drożdży z rodzaju Pichia otrzymujemy rekombinowany szczep S. cerevisiae zdolny do fermentacji cukrów pięcio- i  sześciowęglowych w warunkach ograniczonego natleniania. W badaniach porównujących efektywność fermentacji przez mutanty i tradycyjne szczepy wykazano, że gatunek zmodyfikowany genetycznie był lepszy od tradycyjnych drożdży, produkując 0,65 g/dm3/h etanolu, podczas gdy szczep nie modyfikowany tylko 0,37 g/dm3/h. Mimo zadowalających wyników, nadal trwają prace nad zwiększeniem efektywności fermentacji modyfikowanego szczepu drożdży S. cerevisiae [10, 26, 41]. Drugą strategią jest zastosowanie kultury mieszanej drożdży S. cerevisiae oraz P. stipitis, które razem fermentują pentozy i heksozy [10, 18, 33]. Wydawać by się mogło, że jest to idealne połączenie, prowadzące do prostej i wydajnej produkcji etanolu z surowca roślinnego. Niestety, proces ten napotyka na różne trudności. Po pierwsze, zastosowane drożdże nie mogą działać na siebie antagonistycznie oraz wytwarzać toksyn killerowych, które były by szkodliwe dla drugiej z kultur. Po drugie, szczep P. stipitis do wzrostu potrzebuje odpowiedniej ilości tlenu. Niestety większą jego część wykorzystuje szczep S. cerevisiae, który bardzo szybko buduje swoją biomasę, co w rezultacie prowadzi do zahamowania rozwoju drożdży Pichia i eliminacji ich z hodowli. Trzecim problemem jest diauksyczny wzrost P. stipitis, oznaczający sekwencyjne wykorzystanie cukrów z  pożywki – w pierwszej kolejności do zwiększenia swojej biomasy wykorzystywane są heksozy, a dopiero po ich wyczerpaniu rozpoczyna się fermentację pentoz. Połączenie tego faktu z bardzo szybkim przyrostem szczepu S. cerevisiae sprawia, że drożdże Pichia są wypierane z hodowli zanim zdążą przetworzyć znajdujące się w  podłożu cukry pięciowęglowe [28]. Przeprowadzone badania wykazały, że szczepy nie hamują wzajemnego wzrostu i  nie wytwarzają toksyn killerowych, co daje możliwość swobodnego łączenia obu gatunków. Rozwiązanie pozostałych problemów wymagało jednak ingerencji człowieka w  przeprowadzany proces. Dzięki mutagenizacji zmniejszono znacząco szybkość wzrostu drożdży S. cerevisiae w warunkach tlenowych. Mikroorganizmy te hodowano na pożywce zawierającej YPG oraz bromek etydyny. Etydyna to związek chemiczny stosowany do interkalacji DNA (tworzenie się stabilnych kompleksów pomiędzy DNA, a  planarnymi ligandami). Bromek etydyny ma

251

mutagenny wpływ na mitochondrialne DNA, odpowiedzialne za syntezę enzymów biorących udział w procesie oddychania tlenowego. W rezultacie wyhodowano szczepy upośledzone oddechowo, które w porównaniu z  wyjściowym gatunkiem charakteryzowały się dużo wolniejszym przyrostem biomasy, ale szybkim wykorzystywaniem glukozy z  pożywki. Wystarczyło to do uzyskania stabilnego wzrostu drożdży S. cerevisiae, równomiernie ze szczepem P. stipitis w warunkach odpowiedniego dla nich natlenienia. Ponadto dość szybkie wykorzystanie heksoz z podłoża, wymusiło wykorzys­ tanie przez drożdże Pichia ksylozy jako podstawowego źródła węgla, a co za tym idzie zwiększenie wydajności jej fermentacji [24]. 5. Drożdże Pichia w procesie fermentacji wybranych produktów spożywczych Fermentację produktów spożywczych z  udziałem drożdży stosuje się od bardzo dawna. Z  biegiem lat proces ten był poddawany modyfikacjom i udoskonalany w celu zwiększenia jego wydajności. Zdolność do fermentacji posiada wiele gatunków drożdży, ale tylko niektóre z nich stosowane są w przemyśle. Większość win produkowanych na świecie to wynik działalności szczepów szlachetnych, które charakteryzują się dość dużą odpornością na powstały etanol oraz wytwarzają mniejszą ilość ubocznych produktów fermentacji. Drożdże z rodzaju Pichia to mikroorganizmy dzikie, naturalnie bytujące na owocach i posiadające zdolność przeprowadzania procesu fermentacji alkoholowej. Nic więc dziwnego, że są one zaangażowane w  naturalną fermentację zacierów i moszczów owocowych. Szczepy Pichia szczególną aktywność wykazują na początku procesu, wraz z innymi drożdżami spoza rodzaju Saccharomyces rozpoczynają fermentację. Ich aktywność w miarę upływu czasu maleje, ze względu na coraz większe stężenie etanolu, na który są wrażliwe. W zależności od szczepu, podczas fermentacji drożdże z rodzaju Pichia produkują podwyższone ilości związków tiolowych [2], fenolowych [34] oraz inne substancje odpowiedzialne za aromat, takie jak octan etylu [16]. Generalnie przyjmuje się, że obecność w winach poniżej 150 mg/l octanu etylu pozytywnie wpływa na aromat wina [38], jednocześnie związek ten wykazuje działanie przeciwgrzybiczne. Zbyt duże stężenie octanu etylu powoduje pojawienie się nieprzyjemnego octowego posmaku. Dlatego pomimo, że w  niektórych krajach (np. Indie) dzikie szczepy z rodzaju Pichia stosowane są w tradycyjnej fermentacji win owocowych, to w Europie, w przemysłowej jego produkcji są raczej uważane za mikroorganizmy dzikie i niepożądane [8, 16, 39]. Drożdże z rodzaju Pichia posiadają również zdolność do wytwarzania toksyn killerowych. W ostatnich

252

Paweł Satora, Michał Wiśniewski

latach tego typu organizmy coraz częściej stosowane są w winiarstwie. Wykorzystuje się zdolność ich toksycznego działania na drożdże dzikie, zapewniając stabilność biologiczną powstającemu produktowi. Znajdują one także zastosowanie jako kultury starterowe do produkcji wina i piwa, a ich właściwości pozwalają skutecznie zwalczać zakażenia spowodowane przez szkod­ liwą mikroflorę [42]. Szczepy Pichia wykorzystywane są podczas tradycyjnej fermentacji kakao. Należą one do naturalnej mikroflory ziaren kakaowca, a co za tym idzie uczestniczą także w  procesie ich przetwarzania. Strączki kakao są zbierane i rozłamywane, aby wydobyć z nich osadzone w miąższu ziarna. Na początku są one jałowe, ale w momencie rozłamywania zostają zakażone różnorodnymi mikroorganizmami z owadów, rąk robotników, środków transportu itp. Otaczający ziarna miąższ poddawany jest procesowi fermentacji, którego celem jest wydobycie związków odpowiedzialnych za barwę i  smak. Początkowe warunki beztlenowe, niskie pH i  wysokie stężenie cukru w  miąższu sprzyjają działalności drożdży (m.in. z rodzaju Pichia) oraz bakterii mlekowych, które fermentują zawarte w nim cukry odpowiednio do alkoholu etylowego i kwasu mlekowego oraz innych komponentów. Powstały w  ten sposób etanol, w miarę powstawania warunków tlenowych, utleniany jest przez bakterie octowe do kwasu octowego. Oprócz drożdży z rodzaju Pichia, w procesie tym biorą udział także inne gatunki drożdży, m.in. S. cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida krusei oraz Kloeckera apiculata. Podczas fermentacji drożdże rozmnażają się dosyć gwałtownie i  są w  stanie przetrwać dalsze etapy, takie jak suszenie lub przechowywanie. Późniejsza obróbka ziarna polega na jego czyszczeniu, a następnie ogrzewaniu w celu oddzielenia łuski. W wywołanej tym procesem wysokiej temperaturze dochodzi do zmniejszenia liczby pozostałych jeszcze na ziarnie mikroorganizmów, głównie drożdży i innych grzybów. Następnie ziarna są oddzielane od łusek i poddawane procesowi palenia. Upalone ziarna mieli się na masę kakaową [23]. Innym produktem spożywczym, w którego naturalnej fermentacji uczestniczą drożdże z rodzaju Pichia są oliwki stołowe. Podobnie jak w przypadku kakao, fermentacja oliwek przebiega z  udziałem mikroorganiz­ mów naturalnie na nich występujących. Owoce surowe charakteryzują się dość ostrym smakiem, przeznaczone do bezpośredniego spożycia zrywa się z drzewa oliwnego jeszcze w stanie niedojrzałym, a  następnie poddaje procesowi fermentacji (przebiegającej w  słonej zalewie) w celu złagodzenia smaku oraz nadania pożądanej barwy. Pomimo, że w przemysłowej fermentacji oliwek, główne znaczenie mają szlachetne szczepy głównie S. cerevisiae, drożdże z  rodzaju Pichia pełnią inne ważne role. Udowodniono, że wyizolowany podczas fermentacji szczep P. anomala produkuje bioaktywne

antyoksydanty, przyczyniając się do opóźnienia procesu utleniania substancji tłuszczowych. Ponadto drożdże z rodzaju Pichia ze względu na aktywność killerową oraz dość dobrą przeżywalność w wodnych roztworach NaCl (do 8%) wykorzystuje się jako naturalny czynnik kontroli fermentacji oraz eliminacji szkodliwych mikroorganizmów. Jest to bardzo ważne w technologii spożywczej, ponieważ pozwala na częściowe ograniczenie dodatku soli i konserwantów [3]. 6. Znaczenie i wykorzystanie toksyn killerowych wytwarzanych przez różne gatunki drożdży Pichia Niektóre gatunki drożdży mają zdolność wytwarzania tzw. toksyn killerowych, białek które ułatwiają szczepom w zasiedlaniu nowych środowisk, a także w walce o  składniki odżywcze. Odkrycie tego zjawiska miało miejsce na początku lat 60-tych w drożdżach S. cerevisiae, wkrótce cechę killerową wykryto także u innych rodzajów, m.in. Candida, Hansenula, Kloeckera, Kluyveromyces, Rhodotorula, Sporidiobolus, Torulopsis oraz Zygosaccharomyces. Toksyny wydzielane przez poszczególne gatunki różnią się między sobą rozmiarem cząs­ tek, strukturą kodujących je genów, mechanizmem działania i uśmiercania komórek wrażliwych, a  także odpornością na enzymy proteolityczne oraz substancje chemiczne. Stwierdzono także różnice u poszczególnych szczepów w mechanizmie oporności na produkowaną przez siebie toksynę [29]. Zjawisko killerowe odkryto także u drożdży z  rodzaju Pichia. Dokładny mechanizm ich tworzenia i działania nie jest jeszcze do końca poznany. Stwierdzono, że toksyny działają na ścianę komórkową ofiary, powodując powstawanie w  niej otworów, wyciek materiału komórkowego, a  co za tym idzie śmierć mikroorganizmu. Każdy element ściany komórkowej może stać się potencjalnym receptorem dla białek killerowych. Przyjmuje się, że niektóre toksyny produkowane przez przedstawicieli rodzaju Pichia, wykazują aktywność β-1,3-glukanazy i powodują hydrolizę β-1,3-glukanów znajdujących się w ścianach komórkowych wrażliwych szczepów drożdży. Prowadzi to do powstania porów w  ścianie komórkowej, wycieku zawartości komórki i jej śmierci [22]. Produkowane przez różne szczepy Pichia toksyny killerowe charakteryzują się odmiennymi właściwoś­ ciami, a ich produkcja uzależniona jest również od składu pożywki hodowlanej. Toksyny produkowane przez szczep P. anomala charakteryzują się dość dużą termo stabilnością i są aktywne w szerokim zakresie pH. Optymalnie działają w środowisku kwaśnym (ok. 4,5), a dezaktywacji ulegają dopiero w pH ponad 7. Natomiast białka killerowe wydzielane przez drożdże P. membranifaciens, wykazują dużo mniejszą odporność na zmiany

Znaczenie przemysłowe drożdży z rodzaju Pichia

środowiska. Udowodniono, że ich optimum temperaturowe wynosi 20°C, ale już przy 25°C ich aktywność maleje, nawet o 70%. Podobnie zjawisko dotyczy odczynu pH, toksyny killerowe tego gatunku bardzo dobrze działają przy pH 4, lecz już przy 4,5 następuje drastyczny spadek ich aktywności. Przy pH 6 białka nie wykazują już żadnego działania [36]. Toksyny killerowe produkowane przez szczep Pichia i  inne drożdże znajdują coraz szersze zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu. W technologiach spożywczych drożdże produkujące tego typu białka mogą służyć do sterowania procesem fermentacji, mogą być wykorzystywane jako kultury starterowe w produkcji wina lub piwa, a  także zwalczać zakażenia mikro­ biologiczne. Ponadto wykorzystuje się je w produkcji win musujących, w  celu przyspieszenia autolizy komórek drożdży podczas wtórnej fermentacji. W medycynie białka killerowe znajdują zastosowanie jako leki przeciwgrzybiczne [29]. Coraz częściej szczepy drożdży killerowych stosuje się podczas przechowywania warzyw i owoców, które są szczególnie narażone na zakażenia mikrobiologiczne oraz do ochrony roślin przed chorobami spowodowanymi zakażeniami grzybowymi. Do zwalczania pleśni najczęściej stosuje się środki chemiczne tzw. fungicydy. Niektóre gatunki grzybów mikroskopowych są jednak odporne na powyższe substancje, czego przykładem mogą być niektóre szczepy grzyba Botrytis cinerea, okreś­lanego mianem „szarej pleśni”. Jak niedawno odkryto, grzyb ten jest jeednak wrażliwy na toksyny killerowe wytwarzane przez drożdże z rodzaju Pichia, w tym najbardziej na te wydzielane przez P. stipitis. Spośród 18 szczepów różnych szczepów drożdży użytych przez Wa g n e r a [43] do zwalczania „szarej pleśni” na owocach jabłoni, po 5 dniach hodowli najlepsze rezultaty uzyskano właśnie z udziałem szczepu P. stipitis. Hamował on rozwój grzyba, aż o 98,5%. Pozostałe testowane szczepy również wykazywały dość wysoki poziom ochrony, jednakże tylko w początkowej fazie badań. Po 10  dniach działanie ochronne drożdży malało, choć nadal hamowały one rozwój martwicy owoców i wzrost grzybni. Wciąż najsilniej oddziaływał szczep P. stipitis, w którego przypadku plamy nekrotyczne były mniejsze od kontrolnych o 82%. W  pozostałych kombinacjach hamowanie nekrozy wynosiło od 35 do 43 %, a na plamach pojawiała się pleśń [37, 44]. Innym poważnym problemem zagrażającym ludziom, którego źródłem może być żywność są mikotoksyny. Najgroźniejsze z nich to aflatoksyny, wytwarzane przez pleśnie z  rodzaju Aspergillus, głównie szczepy A. flavus i A. parasiticus. Aflatoksyny mogą pojawiać się na roślinach jeszcze przed zbiorem. Zakażenie może również nastąpić później jeśli dopuści się do zawilgocenia, które jest idealnym środowiskiem do rozwoju pleśni wytwarzających te mikotoksyny. Aflatoksyny mają silne

253

działanie kancerogenne, ponadto mogą powodować poważne uszkodzenia nerek, wątroby oraz centralnego układu nerwowego. Obecnie nie ma całkowicie skutecznej metody zapobiegającej rozwojowi pleśni produkujących aflatoksyny, dlatego wiele państw wprowadziło rygorystyczne normy odnośnie ich zawartości w żywności oraz paszach [30]. Toksyczne właściwości mikotoksyn produkowanych przez pleśnie z rodzaju Aspergillus oraz brak skutecznej strategii eliminującej zagrożenie występowania ich w wielu produktach, zmusiły naukowców do badań nad metodą chroniącą surowce i żywność przed tymi substancjami. Rozwiązaniem tego problemu mogą okazać się drożdże z gatunku P. anomala. Badania wykazały, że szczep ten skutecznie hamuje rozwój grzyba A. flavus, który jest głównym producentem aflatoksyn. Obserwacje wykazały, że drożdże P. anomala już w stosunkowo niewielkiej ilości (1:1) hamują wzrost pleśni o  70,6%, natomiast gdy są obecne w przewadze (50:1) ograniczają rozrost grzybni A. flavus w porównaniu z próbą kontrolną, nawet o 99,5%. Wstępne testy tej metody, przeprowadzane poza laboratorium, dały niezwykle obiecujące rezultaty. Spryskanie drzew pistacjowych żywymi komórkami P. anomala pozwoliło na zmniejszenie ilości patogennego grzyba żyjącego na zebranych później pistacjach, aż o 97% w stosunku do owoców nie poddanych opryskowi. Wykorzystanie drożdży Pichia w walce z pleś­ nią A. flavus – głównym producentem aflatoksyn, daje więc bardzo obiecujące wyniki i możliwe, że już w niedługim czasie będzie stosowane na szerszą skalę [20, 21]. 7. Wykorzystanie modyfikowanych szczepów Pichia pastoris do produkcji ludzkich glikoprotein Drożdże z rodzaju Pichia stały się ostatnio bardzo ważne w przemyśle farmaceutycznym, wiąże się z nimi duże nadzieje w zakresie nowoczesnej, taniej produkcji wielu zaawansowanych leków. Wszystko to za sprawą szczepu P. pastoris, który, jak niedawno odkryto, po odpowiedniej modyfikacji ma zdolność wytwarzania ludzkich glikoprotein [5]. Glikoproteiny to białka związane kowalencyjnie z oli­gosacharydami. Licznie występują u roślin, zwierząt i ludzi, gdzie mogą pełnić wiele ważnych funkcji. Wchodzą w skład płynów ustrojowych i  białek błonowych, mogą pełnić także funkcję receptorów na powierzchni komórek i brać udział w przekazywaniu sygnałów z i do komórki. Głównymi przedstawicielami glikoprotein są przeciwciała i substancje grupowe krwi, białka surowicy, różne enzymy (np. glukoamylaza) oraz hormony białkowe. Ze względu na liczne funkcje jakie mogą pełnić w organizmie są głównymi składnikami wielu ważnych farmaceutyków jak np. leki przeciwzakrzepowe, hormonalne, wspomagające odporność czy szczepionki [5, 43].

254

Paweł Satora, Michał Wiśniewski

Dotychczas ludzkie glikoproteiny wytwarzane były tylko laboratoryjnie, przez komórki ssaków, ponieważ tylko w nich dochodziło do prawidłowej ich syntezy. Był to proces skomplikowany i  kosztowny, ze względu na sposób późniejszego izolowania powstałych glikoprotein. Najłatwiejszą i najbardziej opłacalną metodą ich otrzymywania była by więc produkcja przy udziale zmodyfikowanych mikroorganizmów – bakterii lub drożdży. Problem w tym, że te pierwsze nie mają zdolności syntezy glikoprotein, a drożdże wytwarzają ludzkie białko, ale w  sposób inny niż organizm ludzki, dołączają do niego cukry. Problem został rozwiązany poprzez modyfikację drożdży P. pastoris. Wyłączono ich własny system odpowiedzialny za przyłączanie oligosacharydów do produkowanych białek, a  do ich komórek wszczepiono fragmenty DNA odpowiedzialne za syntezę pięciu enzymów. Enzymy te nadzorowały przyłączanie cukrów do białek, w taki sposób, że w efekcie otrzymywaliśmy glikoproteiny identyczne do produkowanych przez organizm ludzki. Dodatkową zaletą tej metody, jest fakt, że szczep P. pastoris wytwarza bardzo duże ilości gliko­ pro­tein – z jednego litra hodowli można uzyskać nawet kilka gramów leku. Ponadto rosną one na najprostszych pożywkach, a produkowane białko wydzielają na zewnątrz komórek do podłoża na którym są hodowane. Dzięki temu izolacja i oczyszczanie otrzymanych glikoprotein jest niezwykle łatwa, co sprawia, że proces ten jest o wiele tańszy. Jeżeli metodę tą uda się zastosować na szerszą skalę, to niektóre leki na bazie ludzkich glikoprotein mogą stać się tańsze nawet kilkadziesiąt razy [5, 6, 19]. 8. Podsumowanie Celem pracy było przedstawienie znaczenia i sposobów wykorzystania drożdży z rodzaju Pichia. Okazuje się, że ich ogromna różnorodność gatunkowa, sprawia, że znajdują one zastosowanie w wielu gałęziach tradycyjnego i nowoczesnego przemysłu. Świetnie sprawdzają się w różnych dziedzinach biotechnologii, ze względu na dużą szybkością wzrostu, łatwość prowadzonych z ich udziałem modyfikacji posttranslacyjnych, niską immunogennością. Niskie wymagania pokarmowe, możliwość kontroli wytwarzanego białka poprzez modyfikowanie źródła węgla oraz stosunkowo proste oczyszczanie otrzymanego produktu, sprawiają, że są z powodzeniem stosowane do produkcji białek rekombinowanych. Dzięki zdolności do fermentacji ksylozy i L-arabinozy, szczepy Pichia wspólnie z innymi drożdżami wykorzystuje się do wydajnej fermentacji bioetanolu z surowców roślinnych. W przemyśle spożywczym biorą udział w naturalnej fermentacji różnych produktów, jak kakao czy oliwki. Mają zdolność wytwarzania związków odpo-

wiedzialnych za aromat, rybonukleotydów i nukleotydów stosowanych jako wzmacniacze smaku oraz antyoksydantów opóźniających proces utleniania tłuszczy. Można z  ich pomocą sterować procesem fermentacji oraz walczyć ze szkodliwą mikroflorą żywności. Dzięki zdolności do wytwarzania toksyn killerowych, drożdże z rodzaju Pichia stosuje się do eliminacji szkodliwych pleśni mikotoksynotwórczych, a pośrednio ich kancerogennych metabolitów. W przemyśle farmaceutycznym wykorzystywane są do produkcji leków antybakteryjnych i przeciwgrzybicznych. Dzięki przedstawicielom rodzaju Pichia łatwiejsza stała się również produkcja glikoprotein i leków wytwarzanych na ich bazie. To wszystko tylko mała część możliwości drożdży z rodzaju Pichia. Wciąż trwają badania mające na celu udoskonalenie już znanych i znalezienie nowych zastosowań dla tych mikroorganizmów. Wiąże się z nimi wiele nadziei w zakresie nowoczesnych technologii w różnych gałęziach światowego przemysłu. Praca badawcza finansowana w ramach tematu „Wykorzystanie toksyn killerowych drożdży z rodzaju Pichia do zwalczania zakażeń grzybowych w winiarstwie” (nr N N312 211336) w latach 2009–2011 jako projekt badawczy.

Piśmiennictwo   1. Agbogbo F.K., Coward-Kelly G., Torry-Smith M., Wenger K., Jeffries T.W.: The Effect of Initial Cell Concentration on Xylose Fermentation by Pichia stipitis. Appl. Biochem. Biotechnol. 137–140, 653–662 (2007)   2. Anfang N., Brajkovich M., Goddard M.: Co-fermentation with Pichia kluyveri increases varietal thiol concentrations in Sauvig­ non Blanc. Aust. J. Grape Wine Res. 15, 1–8 (2009)   3. Arroyo-López F.N., Querol A., Bautista-Gallego J., Garrido-Fernández A.: Role of yeasts in table olive production. Int. J. Food Microbiol. 128, 189–196 (2008)  4. Bengtsson O., Hahn-Hägerdal B., Gorwa-Grauslund M.F.: Xylose reductase from Pichia stipitis with altered coenzyme preference improves ethanolic xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels, 2, 9 (2009)   5. Bretthauer RK.: Genetic engineering of Pichia pastoris to humanize N-glycosylation of proteins. Trends Biotechnol. 21, 459–462 (2003)   6. Bretthauer R.K., Castellino F.J.: Glycosylation of Pichia pastoris – derived proteins. Biotechnol. Appl. Biochem. 30, 193–200 (1999)   7. Burkiewicz A., Dąbrowski S., Barski P.: Polska rekombinowana proteinaza K. Post. Biochem. 53, 327–328 (2007)  8. Chavan P., Mane S., Kulkarni G., Shaikh S., Ghormade V., Nerkar D.P., Shouche Y., Deshpande M.V.: Natural yeast flora of different varieties of grapes used for wine making in India. Food Microbiol. 26, 801–808 (2009)  9. Chen Ch., Wu P., Huang Ch., Cheng K.: A Pichia pastoris fermentation strategy for enhancing the heterologous expression of an Escherichia coli phytase. Enzyme Microb. Tech. 35, 315–320 (2004)

Znaczenie przemysłowe drożdży z rodzaju Pichia

10. Chandrakant P., Bisaria V.S.: Simultaneous bioconversion of cellulose and hemicellulose to ethanol. Crit. Rev. Biotechnol. 18, 295–331 (1998) 11. Chmielewska J., Dziuba E.: 2003. Respiratory deficient mutants of xylose-fermenting yeast – obtainment and features. Electron. J. Pol. Agric. Univ. 6 (02), #1. 12. Cieśliński H., Filipowski P., Kur J., Lass A., Wanarska M.: Hodowla mikroorganizmów rekombinowanych – produkcja białek w komórkach drożdży Pichia pastoris. (w) Podstawy mikrobiologii przemysłowej. Ćwiczenia laobratoryjne, red. H. Cieśliński, P. Filipowski, J. Kur, A. Lass, M. Wanarska, Wyd. Politechniki Gdańskiej, Gdańsk, 2007, s. 52–58. 13. Dagbagli S., Goksungur Y.: Optimization of β-galactosidase production using Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 by response surface methodology. Electron. J. Biotechnol. 11, (2008) 14. Daly R., Hearn M.T.W.: Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engi­ neering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119–138 (2005) 15. Deak T.: Classification of Yeasts (w) Handbook of Food Spoilage Yeast. Taylor & Francis Group, New York, 2008, s. 13–36. 16. Fredlund E., Druvefors U.A., Olstorpe M.N., Passoth V., Schnürer J.: Influence of ethyl acetate production and ploidy on the anti-mould activity of Pichia anomala. FEMS Microbiol. Lett. 238, 133–137 (2004) 17. Grajek W., Gumienna M., Lasik M., Czarnecki Z.: Perspektywy rozwoju technologii produkcji bioetanolu z surowców skrobiowych. Przem. Chem. 87, 1094–1101 (2008) 18. Grootjen D.R.J., Meijlink L.H.H.M., van der Lans R.G.J.M., Luyben K.Ch.A.M.: Cofermentation of glucose and xylose with immobilized Pichia stipitis and Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb. Tech. 12, 860–864 (1990) 19. Hamilton S.R., Bobrowicz P., Bobrowicz B., Davidson R.C., Li H., Mitchell T., Nett J.H., Rausch S., Stadheim T.A., Wischnewski H., Wildt S., Gerngross T.U.: Production of complex human glycoproteins in yeast. Science, 29, 1244–1246 (2003) 20. Hua S.S.T., Brandl M.T., Hernlem B., Eng J.G., Sarreal S.B.L.: Fluorescent viability stains to probe the metabolic status of aflatoxigenic fungus in dual culture of Aspergillus flavus and Pichia anomala. Mycopathologia, 24, 26–32 (2010) 21. Hua S.S.T.: Progress in prevention of aflatoxin contamination in food by preharvest application of a yeast strain, Pichia anomala WRL-076, (w) Modern Multidisciplinary Applied Micro­biology: Exploiting Microbes and Their Interactions, red. A. Mendez-Vilas, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Niemcy, 2008, s. 322–326. 22. İzgü F., Altınbaya D., Acun T.: Killer toxin of Pichia anomala NCYC 432; purification, characterization and its exo-β-1,3glucanase activity. Enzyme Microb. Tech. 39, 669–676 (2006) 23. Jespersen L., Nielsen D.S., Honholt S., Jakobsen M.: Occurrence and diversity of yeasts involved in fermentation of West African cocoa beans. FEMS Yeast Res. 5, 441–453 (2005) 24. Kordowska-Wiater M., Targoński Z.: Wykorzystanie upośledzonych oddechowo mutantów Saccharomyces cerevisiae do łącznej fermentacji glukozy i ksylozy wspólnie z drożdżami Pichia stipitis. Biotechnologia, 39, 94–102 (1997) 25. Kordowska-Wiater M., Targoński Z., Jarosz A.: Biotransformacja L-arabinozy do arabitolu przez drożdże z rodzaju Pichia i Candida. Biotechnologia, 80, 177–188 (2008) 26. Kulikowska D., Klimowski K.: Produkcja bioetanolu z odpadów lignocelulozowych – możliwości i ograniczenia. Gaz, Woda i Technika Sanitarna, 2, 24–28 (2008) 27. Kurtzman C.P., Fell J.W.: The yeasts, a taxonomic study. Elsevier Science. Amsterdam, 1998. 28. Laplace J.M., Delgenes J.P., Moletta R. Navarro J.M.: Effects of culture conditions on the co-fermentation of a glucose and

255

xylose mixture to ethanol by a mutant of Saccharomyces diastaticus associated with Pichia stipitis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 39, 760–763 (1993) 29. Marquina D., Santos A., Peinado J. M.: Biology of killer yeasts. Int. Microbiol. 5, 65–71 (2002) 30. Michałek M.: Mikotoksyny – zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Oddział Laboratoryjny Higieny Żywności i Żywienia, Kraków, 2009. 31. Mishra S., Singh R.: Yeast Genetics and Biotechnological Applications (w) Yeast Biotechnology: Diversity and Applications, red. T. Satyanarayana, G. Kunze, Springer Verlag, New York, 2009, s. 324–355 32. Passoth V., Fredlund E., Druvefors U., Schnürer J.: Biotechnology, physiology and genetics of the yeast Pichia anomala. FEMS Yeast Res. 6, 3–13 (2005) 33. Rouhollah H., Iraj N., Giti E., Sorah A.: Mixed sugar fermentation by Pichia stipitis, Sacharomyces cerevisiae, and an isolated xylose fermenting Kluyveromyces marxianus and their cocultures. Afr. J. Biotechnol. 6, 1110–1114 (2007) 34. Sáez J.S., Lopes C.A., Kirs V.C., Sangorrín M.P.: Enhanced volatile phenols in wine fermented with Saccharomyces cerevisiae and spoiled with Pichia guilliermondii and Dekkera bruxellensis. Lett. Appl. Microbiol. 51, 170–176 (2010) 35. Saha B. C., Bothast R. J.: Production of L-arabitol from L-arabinose by Candida entomaea and Pichia guilliermondii. Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 299–306 (1996) 36. Santos A., Marquina D.: Killer toxin of Pichia membranifaciens and its possible use as a biocontrol agent against grey mould disease of grapevine. Microbiology, 150, 2527–2534 (2004) 37. Santos A., Sanchez A., Marquina D.: Yeasts as biological agents to control Botrytis cinerea. Microbiol. Res. 159, 331–338 (2004) 38. Satora P., Sroka P., Duda-Chodak A., Tarko T., Tuszyński T.: The profile of volatile compounds and polyphenols in wines produced from dessert varieties of apples. Food Chem. 111, 513–519 (2008) 39. Satora P., Tuszyński T., Walczyk W.: Ogólna charakterystyka wybranych szczepów drożdży i pleśni wyizolowanych z sadu śliwkowego. XXXIII Sesja Naukowa KTiChŻ PAN, Lublin 2002. 40. Sybirny A., Sybirny W., Puchalski C.: Biopaliwowy etanol z  lignocelulozy (biomasy roślinnej): osiągnięcia, problemy, perspektywy. Post. Nauk Rolniczych, 4, 15–23 (2007) 41. Sybirny W., Puchalski C., Sybirny A.: Metaboliczna inżynieria drobnoustrojów do konstruowania wydajnych producentów bioetanolu z lignocelulozy. Biotechnologia, 79, 38–54 (2007) 42. Tood B. E. N., Fleet G. H., Henschke P. A.: Promotion of Autolysis Through the Interaction of Killer and Sensitive Yeasts: Potential Application in Sparkling Wine Production. Am. J. Enol. Viticult. 51, 65–72 (2000) 43. Vaalburg W., Hendrikse N.H., Elsinga P.H., Bart J., van Waarde  A.: P-glycoprotein activity and biological response. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207, 257–260 (2005) 44. Wagner A., Kordowska-Wiater M., Hetman B.: Wpływ wybranych szczepów drożdży na rozwój szarej pleśni na owocach jabłoni. Post. Ochron. Roślin, 46, 625–628 (2006) 45. Wanarska M., Kur J.: β-D-galaktozydazy – źródła, właściwości i zastosowanie. Biotechnologia, 71, 46–62 (2005) 46. Wanarska M., Hildebrandt P., Kur J.: Drożdżowe systemy ekspresyjne jako narzędzie nowoczesnej mikrobiologii przemysłowej. Post. Mikrobiol. 47, 249–256 (2008) 47. Zhang W., Hywood Potter K.J., Plantz B.A., Schlegel V.L., Smith L.A., Meagher M.M.: Pichia pastoris fermentation with mixed-feeds of glycerol and methanol: growth kinetics and production improvement. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 210–215 (2003)

XXVII Zjazd Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów 5–8 września 2012 r. Lublin W dniach 5–8.09.2012 r. odbędzie się XXVII Zjazd Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów organizowany przez Lubelski Oddział Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów. Miejsce obrad: Uniwersytet Medyczny w Lublinie. Collegium Maius Lublin ul. Jaczewskiego 4. Szczegółowe informacje dotyczące Zjazdu ukażą się na stronie internetowej www.microbiology.pl i w Postępach Mikrobiologii W imieniu Komitetu Organizacyjnego XXVII Zjazdu Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów prof. dr hab. Maria Kozioł-Montewka

INFORMACJA DLA AUTORÓW o opłatach za prace publikowane w Postępach Mikrobiologii Uprzejmie informujemy PT Autorów PM, że zgodnie z decyzją Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów z dnia 6 lutego 2007 roku oraz z dnia 2 marca 2011 r. wprowadzono zasady płatności za prace przyjmowane do druku w naszym piśmie. Autorzy manuskryptów proszeni są o wnoszenie opłat w wysokości 250 PLN + VAT 23% – razem 307,50 PLN za każdy artykuł na konto Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów: Bank Pekao S.A. 18 1240 5992 1111 0000 4774 7434. Opłatę można wnosić indywidualnie, po otrzymaniu informacji po zaakceptowaniu pracy do druku. W imieniu Autorów opłatę może wnosić sponsorująca instytucja, fundacja itp. Wtedy Autorzy zobowiązani są do złożenia w Redakcji wraz z manuskryptem pisemnego zobowiązania się do opłaty za publikację po otrzymaniu faktury VAT. Należy dodatkowo: l

Przesyłać dane do wystawienia faktury VAT (NIP, nazwa i adres instytucji lub osoby fizycznej) na nr faksu (022) 841-29 49, lub drogą pocztową na adres siedziby Zarządu PTM: 00-725 Warszawa ul. Chełmska 30/34. l Do dowodu wpłaty lub zobowiązania zapłaty dołączać informacje zawierające tytuł pracy i nazwisko autora korespondencyjnego.

ERRATA Prawidłowy tytuł pracy Ł. Dziewita i D. Bartosika opublikowanej w zeszycie 2 (tom 50) 2011 na stronie 87–96 powinien brzmieć: „Genomy prokariotyczne w świetle analiz genomicznych” Na str. 92, II kolumna, wiersz 16 od góry jest: ranspozony, powinno być transpozony Autorów i Czytelników przepraszamy

SPIS TREŚCI J. M. Ł o ś, G. W ę g r z y n – Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 S. R y n a n s, T. D z i e c i ą t k o w s k i, G. M ł y n a r c z y k – Zakażenia ludzkimi poliomawirusami osób poddanych immunosupresji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191 B. D e r a - T o m a s z e w s k a – Plazmidy i bakteriofagi występujące u bakterii Salmonella . . . . . . . . . . . . . . 201 M. M i z e r s k a - D u d k a, M. A n d r e j k o, M. K a n d e f e r - S z e r s z e ń – Przeciwwirusowe peptydy kationowe człowieka i owadów . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B. T o k a r z - D e p t u ł a, T. Miller, W. D e p t u ł a – Cytokiny z rodziny interleukiny 1 . . . . . . . . . . . . . . . . 217 M. Ż y ł o w s k a, A. W y s z y ń s k a, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – Defensyny – peptydy o aktyw- ności przeciwbakteryjnej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 A. C z ę ś c i k, A. T r z c i ń s k a , J . S i e n n i c k a – Wirus odry – reakcje odpornościowe związane z naturalnym zakażeniem oraz odpowiedzią poszczepienną . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 P. S a t o r a, M. W i ś n i e w s k i – Znaczenie przemysłowe drożdży z rodzaju Pichia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247

CONTENTS J. M. Ł o ś, G. W ę g r z y n – Enterohemorrhagic strains of Escherichia coli (EHEC) and Shiga toxin- encoding bacteriophages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 S. R y n a n s, T. D z i e c i ą t k o w s k i, G. M ł y n a r c z y k – Polyomavirus diseases of immuno- suppressed patients . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191 B. D e r a - T o m a s z e w s k a – Plasmids and bacteriophages harboured by Salmonella . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 M. M i z e r s k a - D u d k a, M. A n d r e j k o, M. K a n d e f e r - S z e r s z e ń – Antiviral cationic peptides from human and insects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B. T o k a r z - D e p t u ł a, T. Miller, W. D e p t u ł a – The interleukin-1 family of cytokines . . . . . . . . . . . . . 217 M. Ż y ł o w s k a, A. W y s z y ń s k a, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – Antimicrobial peptides – defensins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 A. C z ę ś c i k, A. T r z c i ń s k a , J . S i e n n i c k a – Measles Virus - immune response to natural infection and vaccination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 P. S a t o r a, M. W i ś n i e w s k i – Industrial significance of Pichia yeasts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247