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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

k 2 151 338 kN´umero de solicitud: 009700491 kInt. Cl. : C12N 15/82

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˜ ESPANA

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SOLICITUD DE PATENTE

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71 Solicitante/s: INSTITUTO NACIONAL DE

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72 Inventor/es: Pe˜ na Garc´ıa, Leandro;

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74 Agente: Gonz´ alez Vacas, Eleuterio

22 Fecha de presentaci´ on: 05.03.1997

43 Fecha de publicaci´ on de la solicitud: 16.12.2000

43 Fecha de publicaci´ on del folleto de la solicitud:

16.12.2000

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´ Y TECNOLOG´IA INVESTIGACION AGRARIA Y ALIMENTARIA (INIA) Jos´ e Abascal, 56 28003 Madrid, ES INSTITUTO VALENCIANO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS (IVIA).

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Cervera Oca˜ na, Magdalena; Ju´ arez Rold´ an, Jos´ e; Navarro Lucas, Antonio; Ortega Calabuig, Carmen; Pina Lorca, Jos´ e Antonio; Dur´ an Vila, Nuria y Navarro Lucas, Luis

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k kResumen:

54 T´ıtulo: Procedimiento de transformaci´ on gen´ etica de plantas adultas de especies le˜ nosas.

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Procedimiento de transformaci´on gen´etica de plantas adultas de especies le˜nosas. El procedimiento se basa en la utilizaci´on, como material vegetal de partida para la transformaci´ on, de las primeras brotaciones resultantes del injerto de yemas de ´arboles adultos sobre portainjertos, la transformaci´on gen´etica de explantes procedentes de las brotaciones adultas mediante co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens en placas nodriza, y la obtenci´on de plantas le˜nosas adultas completas mediante microinjerto in vitro sobre portainjertos cultivados in vitro, de las yemas, ´apices o brotes transg´enicos regenerados a partir de los explantes. Con este procedimiento se evita el periodo juvenil y la alta heterozigosis que afecta a la mayor´ıa de las especies le˜nosas, se adelanta la floraci´on y la fructificaci´on de las plantas transg´enicas y permite la transformaci´ on gen´etica directa de variedades de inter´es comercial. De aplicaci´on en Agricultura.

Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION Procedimiento de transformaci´ on gen´etica de plantas adultas de especies le˜ nosas Campo de la invenci´ on Esta invenci´ on se refiere a un procedimiento para la transformaci´ on gen´etica de plantas adultas de especies le˜ nosas que comprende tanto la transformaci´ on gen´etica de dichas plantas a nivel celular como la regeneraci´on del material vegetal adulto. Antecedentes de la invenci´ on La ingenier´ıa gen´etica aplicada a las plantas cultivadas est´ a creando una nueva era en la agricultura. La 1a¯ generaci´on de plantas transg´enicas herb´aceas con genes de inter´es agron´ omico se encuentra ya en el mercado y se abren nuevas y mejores perspectivas para un futuro pr´ oximo. El potencial de la mejora gen´etica mediante transformaci´ on es incluso de mayor inter´es en el caso de las especies le˜ nosas, ya que la mayor´ıa de las variedades comerciales se propaga vegetativamente y son h´ıbridos de origen desconocido que b´ asicamente no se pueden mejorar mediante mejora gen´etica cl´asica debido a su elevada heterozigosis. Incluso cuando la mejora tradicional es posible, otro obst´ aculo importante es el largo periodo de tiempo que transcurre entre generaciones. La ingenier´ıa gen´etica permitir´ıa la inserci´on de genes espec´ıficos en el fondo gen´etico desconocido de las variedades comerciales, a˜ nadiendo caracteres deseables a estas plantas sin alterar otros caracteres de valor agron´omico. La mejora de las especies le˜ nosas mediante transformaci´ on gen´etica tendr´ a aplicaciones limitadas a menos que se consigan establecer procedimientos de transformaci´ on gen´etica y regeneraci´on de material vegetal adulto. Hasta ahora, los procedimientos de transformaci´on de plantas le˜ nosas se han restringido a tejido juvenil derivado de semillas como, por ejemplo embriones zig´oticos, cotiledones o hipocotilos (Referencias 1-15). Sin embargo, el pase por la v´ıa sexual hace que el genoma de las plantas procedentes de semilla se modifique completamente con lo que se alteran sus caracter´ısticas agron´omicas. En otros casos en los que se ha utilizado como material vegetal de partida c´elulas embriog´enicas de origen som´atico, embriones som´ aticos o tejido propagado vegetativamente, los explantes eran juveniles (Referencias 3, 7, 16-33) o se rejuvenec´ıan tras sucesivas micropropagaciones in vitro (Referencias 34-39). Si se utilizasen estos procedimientos y este tipo de material vegetal de partida para introducir genes de inter´es agron´ omico en especies le˜ nosas, las plantas transg´enicas regeneradas tendr´ıan caracteres juveniles y por tanto se requerir´ıa un periodo de varios anos para poder evaluar sus caracter´ısticas agron´omicas. Adem´ as, en caso de utilizar tejidos derivados de las semillas, las plantas transformadas no tendr´ıan las mismas caracter´ısticas gen´eticas agron´ omicas que las plantas originales. La evaluaci´on cuidadosa de las caracter´ısticas agron´omicas de las especies le˜ nosas adultas es un requisito para plantearse la explotaci´ on comercial de nuevas variedades en grandes extensiones de cultivo. Por tanto, existe la necesidad de disponer de 2

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un m´etodo de transformaci´ on gen´etica de especies le˜ nosas que supere los inconvenientes previamente se˜ nalados. Este objetivo se puede conseguir mediante el procedimiento objeto de esta invenci´on que comprende la transformaci´ on gen´etica directa de c´elulas procedentes de material vegetal adulto y la regeneraci´on de plantas le˜ nosas adultas completas, lo que permite transformar variedades comerciales con genes de inter´es agron´ omico y reducir dr´ asticamente el periodo de tiempo necesario para evaluar las caracter´ısticas agron´omicas de las nuevas variedades obtenidas mediante la tecnolog´ıa de transformaci´ on, con ello, se reducir´an los costes y tambi´en el periodo de tiempo en el que las nuevas variedades lleguen a manos de los agricultores y de los consumidores. Compendio de la invenci´ on El procedimiento de transformaci´ on gen´etica de plantas adultas de especies le˜ nosas objeto de esta invenci´on se basa en (i) la utilizaci´on, como material vegetal de partida para la transformaci´ on, de las primeras brotaciones resultantes del injerto de yemas de a´rboles adultos sobre portainjertos, (ii) la transformaci´ on gen´etica de explantes procedentes de las brotaciones adultas mediante el empleo de un vector adecuado que porta los genes que codifican los caracteres de inter´es, tal como un vector derivado de Agrobacterium tumefaciens, no oncog´enico, y co-cultivo de los explantes con dicho A. tumefaciens en placas nodriza, y (iii) la obtenci´ on de plantas le˜ nosas adultas completas mediante microinjerto in vitro sobre portainjertos, cultivados in vitro, de las yemas, ´apices o brotes transg´enicos regenerados a partir de los explantes. En el sentido utilizado en esta descripci´ on, la expresi´ on “transformaci´ on gen´etica de plantas adultas de especies le˜ nosas” incluye tanto la transformaci´ on gen´etica a nivel celular del material vegetal adulto como la regeneraci´on del material vegetal adulto transformado y la obtenci´ on de plantas transg´enicas adultas de especies le˜ nosas. Descripci´ on detallada de la invenci´ on El procedimiento de transformaci´ on gen´etica de plantas adultas de especies le˜ nosas objeto de esta invenci´on comprende las etapas generales siguientes: - inocular explantes de tejido adulto de especies le˜ nosas, procedentes de las primeras brotaciones de los injertos de yemas de plantas adultas de especies le˜ nosas sobre portainjertos, con vectores adecuados que portan los genes que codifican los caracteres de inter´es, bajo condiciones que permiten el desarrollo de brotes transg´enicos; y - microinjertar in vitro dichos brotes transg´enicos, sus yemas o ´apices, sobre portainjertos cultivados in vitro y, posteriormente, injertar las plantas microinjertadas resultantes sobre otros portainjertos que confieren vigor y dejar crecer los brotes prendidos para generar plantas transg´enicas adultas completas, o trasplantar directamente a suelo las plantas microinjertadas in vitro, para dar lugar a plantas transg´enicas adultas completas. En una realizaci´ on particular, el vector utilizado en la transformaci´on de los explantes deriva de un Agrobacterium tumefaciens no oncog´enico, opcionalmente modificado para contener adem´ as

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los genes que codifican los caracteres de inter´es. En este caso, el procedimiento proporcionado por la invenci´on comprende: - co-cultivar explantes de tejido adulto de especies le˜ nosas, procedentes de las primeras brotaciones de los injertos de yemas de plantas adultas de especies le˜ nosas sobre portainjertos, con un Agrobacterium tumefaciens no oncog´enico, opcionalmente modificado para contener adem´ as genes que codifican los caracteres de inter´es a insertar en la planta le˜ nosa, en placas nodriza, y posteriormente en un medio de cultivo que favorece la inducci´ on de brotes transg´enicos y permite la selecci´on de los mismos; - microinjertar in vitro dichos brotes transg´enicos, sus yemas o ´apices, sobre portainjertos cultivados in vitro; e - injertar las plantas microinjertadas in vitro resultantes sobre otros portainjertos que confieren vigor y dejar crecer los brotes prendidos o trasplantar directamente a suelo las plantas microinjertadas in vitro, para dar lugar a plantas transg´enicas adultas completas. Como puede apreciarse, el material vegetal de partida utilizado para la realizaci´on del procedimiento objeto de esta invenci´on es tejido adulto procedente de las primeras brotaciones resultantes del injerto de yemas de plantas adultas de especies le˜ nosas de variedades de inter´es que han sido injertadas sobre portainjertos, preferentemente, portainjertos que aportan vigor (portainjertos vigorosos). Los brotes adultos se recogen, se desinfectan, se lavan y, en condiciones est´eriles, se trocean obteniendo explantes de cualquier tipo, por ejemplo, del tipo de segmentos de hojas, peciolos, entrenudos, nudos, etc. El t´ermino primeras brotaciones, en el sentido utilizado en esta descripci´on, se refiere a las cinco primeras brotaciones. En una realizaci´ on particular, los explantes obtenidos se transforman gen´eticamente mediante inoculaci´on con un Agrobacterium tumefaciens no oncog´enico y co-cultivo en placas nodriza durante periodos variables de tiempo, desde unas pocas horas hasta varios d´ıas. El genoma del A. tumefaciens puede estar modificado a fin de contener los genes que codifican los caracteres de inter´es a insertar en la planta le˜ nosa. Las placas nodrizas se preparan vertiendo suspensiones celulares vegetales en fase de crecimiento sobre un medio de cultivo gelificado en recipientes de cultivo. Entre ambas capas, l´ıquido y gel, se depositan los explantes. Las placas nodriza act´ uan, por una parte, como activadores de la regi´ on de virulencia de A. tumefaciens y, por tanto, de la transferencia de genes a las c´elulas de los explantes y, por otra parte, incrementando la aptitud de las c´elulas de los explantes para que resulten transformadas. A continuaci´ on, los explantes se cultivan en otro medio de cultivo que contiene hormonas que favorecen la inducci´on de brotes transg´enicos a partir de las c´elulas trasformadas de los explantes y un marcador que permite la selecci´on de dichos brotes transg´enicos. Cultivando bajo las condiciones de luz, temperatura y humedad relativa adecuadas, al cabo de un periodo de tiempo que oscila desde unas semanas hasta varios meses, se obtienen los brotes transg´enicos. El

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tama˜ no de estos brotes oscila entre 1 mil´ımetro y varios cent´ımetros. Los brotes transg´enicos regenerados se escinden de los explantes y se microinjertan in vitro sobre portainjertos cultivados in vitro. El microinjerto in vitro de los brotes, o bien de sus a´pices o yemas, se puede realizar decapitando o no el portainjertos, en el interior de una incisi´ on o sobre la superficie de corte producida al decapitar. Los cotiledones del portainjertos se pueden eliminar y la ra´ız se puede acortar. Tras un periodo de tiempo variable, desde unas pocas semanas hasta varios meses, las plantas microinjertadas in vitro se vuelven a injertar sobre portainjertos vigorosos, que pueden ser iguales o no a los portainjertos utilizados para la obtenci´ on de los explantes, en invernaderos, y los brotes prendidos crecen hasta dar lugar a plantas transg´enicas adultas completas que, al cabo de un periodo de tiempo adecuado florecen y fructifican. Las plantas microinjertadas in vitro tambi´en pueden transplantarse directamente a suelo hasta dar lugar a plantas transg´enicas adultas completas. Mediante el procedimiento de transformaci´ on de plantas le˜ nosas adultas objeto de esta invenci´on se consigue evitar el largo periodo juvenil y la alta heterozigosis que afecta a la mayor´ıa de las especies le˜ nosas. Con este procedimiento se adelanta la floraci´on y la fructificaci´ on de las plantas transg´enicas en un n´ umero variable de a˜ nos dependiendo de las especies, que pueden ser de 20 a˜ nos en el caso de algunas variedades de c´ıtricos. Adicionalmente, este procedimiento permite la transformaci´on gen´etica directa de variedades de inter´es comercial sin alterar sus caracter´ısticas gen´eticas y agron´ omicas, salvo en lo que se refiere u ´ nica y exclusivamente al car´acter o caracteres aportados por el gen o los genes introducidos. A modo de ejemplo no limitativo del alcance de esta invenci´on, el procedimiento desarrollado se ha evaluado para la transformaci´ on gen´etica de plantas adultas de c´ıtricos, concretamente de naranjo dulce Pineapple. Ejemplo 1 Transformaci´ on gen´etica de plantas adultas de naranjo dulce Pineapple Como material de partida para la realizaci´ on de este Ejemplo se utilizan yemas de plantas adultas procedentes del Banco de Germoplasma de C´ıtricos del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, que se injertan sobre el portainjertos limonero Rugoso cultivado en invernadero. Para la obtenci´on de los explantes se cortan ramas, de unos 20 cm de longitud, procedentes de las tres primeras brotaciones despu´es del injerto, se eliminan las hojas y las espinas, se desinfectan durante 10 minutos en hipoclorito s´ odico al 2 %, se lavan 3 veces con agua est´eril. A continuaci´ on, se cortan transversalmente segmentos de entrenudo de aproximadamente 1 cm de longitud. Los explantes obtenidos se transforman gen´eticamente mediante inoculaci´on con Agrobacterium tumefaciens no oncog´enico (Referencias 26 y 27) durante un periodo de tiempo comprendido entre 15 y 30 minutos. A continuaci´ on, los explantes se secan sobre papel de filtro y se colocan en placas nodrizas de tomate, que se preparan 3

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pipeteando 2-3 ml de suspensiones celulares de 6-7 d´ıas sobre la superficie de medio de cultivo s´olido con las hormonas AIA (´ acido indolac´etico), 2-iP (2-isopentenil-adenina) y 2,4-D (´ acido 2,4diclorofenoxiac´etico) en placas Petri de 10 x 1,5 cm (di´ ametro x altura). Entre ambas capas se coloca papel de filtro est´eril. Tras el co-cultivo, se secan los explantes sobre papel de filtro est´eril y se transfieren a otro medio de cultivo que contiene la hormona BA (6-bencilaminopurina) inductora de brotes y los antibi´ oticos kanamicina, para seleccionar los brotes transg´enicos, y cefotaxima, con el fin de evitar contaminaciones por Agrobacterium. Los cultivos se mantienen en oscuridad y 26◦ C durante 15 d´ıas y luego se transfieren a 16 horas de fotoperiodo con 45 µEm−2 s−1 de iluminaci´ on, 26◦ C y 60 % de humedad relativa. Los explantes se subcultivan en medio fresco cada 4 semanas. Al cabo de unos meses regeneran brotes transg´enicos. Cuando los brotes transg´enicos alcanzan un tama˜ no comprendido entre 0,2 y 0,6 cm, se escinden de los explantes y se cortan en dos mitades. Con la mitad basal se hacen an´ alisis para verificar que los brotes son efectivamente transg´enicos. La mitad apical se microinjerta in vitro sobre el portainjertos citrange Troyer (Citrus sinensis L. Osbeck x Poncirus trifolia L. Raf.) cultivado in vitro. Las pl´ antulas de citrange Troyer se decapitan dejando 1-1,5 cm de los epicotilos, sus ra´ıces se acortan hasta 4-6 cm y se descartan los cotiledones y las yemas axilares. A continuaci´on, los brotes (o bien sus ´apices) regenerados se depositan sobre la superficie cortada de los epicotilos, en contacto con el anillo vascular. Despu´es de 3 semanas, las plantas microinjertadas in vitro se vuelven a injertar, esta vez en el invernadero, sobre portainjertos de 5 meses de edad de limonero Rugoso (Citrus jambhiri Lush.). Al cabo de 14 meses las plantas transg´enicas florecen y fructifican. Referencias Bibliogr´ aficas 1. McGranahan, G.H., Leslie, C.A., Dandekar, A.M., Uratsu, S.L. and Yates, I.E. 1993. Transformation of pecan and regeneration of transgenic plants. Plant Cell Rep. 12: 634-638. 2. Mullins, M.G., Tang, F.C.A and Facciotti, D. 1990. Agrobacterium mediated genetic transformation of grapevines: transgenic plants of Vitis rupestris Scheele and buds of Vitis vinifera L. Bio/Technology 8: 1041-1045. 3. Fitch, M.M.M., Manshardt, R.M., Gonsalves, D., and Slightom, J.L. 1990. Stable transformation of papaya via microprojectile bombardment. Plant Cell Rep. 9:189-194. 4. Hidaka, T., Omura, M., Ugaki, M., Tomiyama, M. Kato, A., Ohshima, M., and Motoyoshi, F. 1990. Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of Citrus spp. from suspension cells. Japan. J. Breed. 40: 199-207. 5. Mate, S. , Morgens, P. H. , Scorza , R . , Cordts, J.M. and Callahan, A.M. 1991. Agrobacterium-mediated transformation of plum (Prunus domestica L.) hypocotyl slices and regeneration of transgenic plants. Bio/Technology 9: 853-857. 6. Smigocki, A.C. and Hammerschlag, F.A. 1991. Regeneration of plants from peach embryo cells infected with a shooty mutant strain of Agro4

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REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento de transformaci´ on gen´etica de plantas adultas de especies le˜ nosas que comprende: - inocular explantes de tejido adulto de especies le˜ nosas, procedentes de las primeras brotaciones de los injertos de yemas de plantas adultas de especies le˜ nosas sobre portainjertos, con vectores adecuados que portan los genes que codifican los caracteres de inter´es, bajo condiciones que permiten el desarrollo de brotes transg´enicos; y - microinjertar in vitro dichos brotes transg´enicos, sus yemas o ´apices, sobre portainjertos cultivados in vitro y, posteriormente, injertar las plantas microinjertadas resultantes sobre otros portainjertos que confieren vigor y dejar crecer los brotes prendidos para generar plantas transg´enicas adultas completas, o trasplantar directamente a suelo las plantas microinjertadas in vitro, para dar lugar a plantas transg´enicas adultas completas. 2. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1, en el que el vector utilizado en la transformaci´on de los explantes deriva de un Agrobacterium tumefaciens no oncog´enico, opcionalmente modificado para contener adem´ as los genes que codifican los caracteres de inter´es. 3. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 2, que comprende: - co-cultivar explantes de tejido adulto de especies le˜ nosas, procedentes de las primeras brotaciones de los injertos de yemas de plantas adultas de especies le˜ nosas sobre portainjertos, con un Agrobacterium tumefaciens no oncog´enico, opcionalmente modificado para contener adem´ as genes que codifican los caracteres de inter´es a insertar en la planta le˜ nosa, en placas nodriza, y posteriormente en un medio de cultivo que favorece la inducci´ on de brotes transg´enicos y permite la selecci´on de los mismos; - microinjertar in vitro dichos brotes transg´enicos, sus yemas o ´apices, sobre portainjertos cultivados in vitro; e - injertar las plantas microinjertadas in vitro resultantes sobre otros portainjertos que confieren vigor y dejar crecer los brotes prendidos para dar lugar a plantas transg´enicas adultas completas, o trasplantar directamente a suelo las plantas microinjertadas in vitro, para dar lugar a plantas transg´enicas adultas completas. 4. Un procedimiento seg´ un una cualquiera de

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las reivindicaciones 1 o´ 3, en el que dichos brotes adultos destinados a la obtenci´ on de explantes proceden de las cinco primeras brotaciones resultantes de los injertos de yemas de ´arboles adultos sobre portainjertos. 5. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 3, en el que dichas placas nodriza act´ uan como activadores de los genes de virulencia de A. tumefaciens y estimulando la aptitud de las c´elulas de los explantes para su transformaci´on. 6. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 3, en el que dicho medio de cultivo que favorece la inducci´ on de brotes transg´enicos y permite la selecci´on de los mismos comprende hormonas que favorecen la inducci´on de dichos brotes transg´enicos y marcadores para su selecci´on. 7. Un procedimiento seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 ´o 3, en el que el microinjerto in vitro de a´pices, yemas o brotes transg´enicos sobre portainjertos cultivados in vitro se lleva a cabo decapitando el portainjertos. 8. Un procedimiento seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 ´o 3, en el que el microinjerto in vitro de a´pices, yemas o brotes transg´enicos sobre portainjertos cultivados in vitro se lleva a cabo sin decapitar el portainjertos. 9. Un procedimiento seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 ´o 3, en el que se eliminan los cotiledones del portainjertos, cultivado in vitro, usado para el microinjerto in vitro de ´apices, yemas o brotes transg´enicos. 10. Un procedimiento seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 ´o 3, en el que se acortan las ra´ıces del portainjertos, cultivado in vitro, utilizado para el microinjerto in vitro de a´pices, yemas o brotes transg´enicos. 11. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 3, en el que la planta le˜ nosa adulta a transformar es una planta de naranjo dulce Pineapple. 12. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 11, en el que el portainjertos para la obtenci´ on de explantes es un portainjertos de limonero Rugoso (Citrus jambhiri Lush.). 13. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 11, en el que el portainjertos utilizado para el microinjerto in vitro es un portainjerto citrange Troyer (Citrus sinensis L. Osbeck x Poncirus trifolia L. Raf.) cultivado in vitro. 14. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 11, en el que el portainjertos para injertar las plantas microinjertadas in vitro es un portainjertos de limonero Rugoso (Citrus jambhiri Lush.).

kES 2 151 338 kN. solicitud: 009700491 kFecha de presentaci´on de la solicitud: 05.03.1997 kFecha de prioridad:

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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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˜ ESPANA

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INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

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51 Int. Cl.7 :

C12N 15/82, A01H 1/00

DOCUMENTOS RELEVANTES Categor´ıa

Documentos citados

Reivindicaciones afectadas

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WO 9625504 A1 (SHELL INTERNATIONALE RESEARCH MAATSCHAPPIJ B.V.) 22.08.1996, todo el documento.

1-14

A

EP 0227264 A2 (CALGENE INC.) 01.07.1987, todo el documento.

1-14

A

WO 9407356 A1 (CORNELL RESEARCH FOUNDATION INC.) 14.04.1994, todo el documento.

1-14

A

˜ L. et al. ”Agrobacterium-mediated transformation of sweet PENA, orange and regeneration of transgenic plants”, PLANT CELL REPORTS, 1995, Vol. 14, p´aginas 616-619, todo el documento.

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Categor´ıa de los documentos citados X: de particular relevancia

on no escrita O: referido a divulgaci´

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la

on P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci´

misma categor´ıa A: refleja el estado de la t´ecnica

de la solicitud es de la fecha E: documento anterior, pero publicado despu´ de presentaci´ on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado × para todas las reivindicaciones Fecha de realizaci´ on del informe 31.10.2000

para las reivindicaciones n◦ : Examinador A. L´azaro Andr´es

P´ agina

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