R ZEC ZPO SPO LITA POLSKA

(12) OPIS PATENTOWY (19)PL 297945

(21) Numer zgłoszenia:

(11) 175143 (13) B1 (5 1 ) IntCl6:

C12N 15/63 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

(54)

(22) Data zgłoszenia:

04.03.1993

Konstrukty wektora ekspresyjnego do ekspresji antysensownego RNA (73)

Uprawniony z patentu:

BAYER AKTIENGESELLSCHAFT, Leverkusen, DE (72) (43)

Zgłoszenie ogłoszono: 05.09.1994 BUP 18/94

(45)

O udzieleniu patentu ogłoszono:

Twórcy wynalazku:

Axel Kretschmer, Bergisch Gladbach, DE Horst-Peter Antonicek, Bergisch Gladbach, DE Jörg Baumgarten, Wuppertal, DE Antonius Loebberding, Wuppertal, DE Burkhard Mielke, Leverkusen, DE Wolfgang Springer, Wuppertal, DE Udo Stropp, Wuppertal, DE Mark-Michael D. Struck, Bern, DE Lothar Biesert, Farnkfurt, DE Helga Rübsamen-Waigmann, Bad Soden, DE Hary Suhartono, Frankfurt, DE Thomas-Peter Hausner, Leverkusen, DE

30.11.1998 WUP 11/98

(74)

Pełnomocnik:

Kossowska Janina, PATPOL Spółka z 0.0.

PL 175143

B1

(57)

1. Konstrukty wektora ekspresyjnego do ekspresji antysensownego RNA, znamienne tym, że zawierają a) sekwencje silnego konstytutywnego promotora wybranego spośród promotora metalotioneiny i promotora CMV albo sekwencje hybrydowego promotora obejmującego wymienione silne promotory lub jeden z wymienionych silnych promotorów i promotor HIV-1 LTR oraz b)wirusowy DNA w orientacji antysensownej.

FIG. 1

Konstrukty wektora ekspresyjnego do ekspresji antysensownego RNA Zastrzeżenia

patentowe

1. Konstrukty wektora ekspresyjnego do ekspresji antysensownego RNA, znamienne tym, że zawierają a) sekwencje silnego konstytutywnego promotora wybranego spośród promotora metalotioneiny i promotora CMV albo sekwencje hybrydowego promotora obejmującego wymienione silne promotory lub jeden z wymienionych silnych promotorów i promotor HIV-1 LTR oraz b)wirusowy DNA w orientacji antysensownej. 2. Konstrukty według zastrz. 1, znamienne tym, że zawierają subgenomowe sekwencje genowe patogennego wirusa w orientacji 3' —> 5' (orientacja antysensowna), pod kontrolą promotora ekspresji antysensownego RNA, którego sekwencja zasad nukleinowych jest komplementarna do mRNA patogennego wirusa. 3. Konstrukty według zastrz. 1, znamienne tym, że zawierają prowirusowy, subgenomowy DNA w orientacji antysensownej z retrowirusów takich jak HIV-1 albo HTV-2, onkowirusów. takich jak HTLY-I, HTLV-II, albo onkogenów takich jak abl, erb A, erb B, fms, fos, myb, myc, ras, sis, src. 4. Konstrukty według zastrz. 1, znamienne tym, że zawierają sekwencje promotora lub promotora hybrydowego, oraz prowirusowy DNA HTV-1 w orientacji antysensownej nukleotydów 7514 474, albo 5786 474, albo 2096 474, albo 3825 681, albo 5786 4158, albo 5746 -> 4648, albo 2369 -> 1635, albo 3227 3003, albo 2099 678, albo 3829 2099, albo 4647 4157, albo 4157 3830. 5. Konstrukty według zastrz. 1, znamienne tym, że zawierają subgenowe, prowirusowe sekwencje genowe albo sekwencje onkogenowe w orientacji 3' —> 5', dla ekspresji krótszych transkryptów antysensownego RNA. 6. Konstrukty według zastrz. 5, znam ienne tym, że zawierają prowirusowe sekwencje genowe z H IV -1, nukleotydów 605 —> 155, albo 670 —> 440, albo 825 —> 535, albo 6070 5800, albo 5640 -> 5020, albo 5600 5040, albo 8690 -> 8300, albo 9160 -> 8800. 7. Konstrukty według zastrz. 1, znamienne tym, że zawierają dwie, trzy lub więcej sekwencji subgenomowych z jednego wirusa albo z kilku wirusów. * * * Przedmiotem wynalazku są konstrukty wektora ekspresyjnego do ekspresji antysensownego RNA. Wektory ekspresyjne według wynalazku służą do wytworzenia opornych na HI V komórek ludzkich do celów terapeutycznych. Wynalazek dotyczy celowanego blokowania informacji genetycznej i replikacji wirusa (na przykład HIV) w wirusowym informacyjnym kwasie rybonukleinowym (mRNA) w transfekowanych komórkach krwiotwórczych, przy pomocy specjalnych systemów ekspresyjnych, które wywołują ekspresję komplementarnego "antysensownego" RNA. W szczególności wynalazek dotyczy wektorów ekspresyjnych, kodujących sekwencje antysensownego RNA, które w przeciwieństwie do stanu techniki, dają całkowite hamowanie replikacji HIV-1 i wyraźnie hamują replikację HIV-2 w ludzkich komórkach zmodyfikowanych przy pomocy inżynierii genetycznej. Opisane tu jednostki genetyczne wektorów ekspresyjnych są przeznaczone szczególnie do somatycznej terapii genowej schorzeń HIV/AIDS, ponieważ chronią one komórki krwiotwórcze przed indukowanymi HIV efektami cytopatycznymi. W ten sposób można uniknąć niewydolności immunologicznej u osób zakażonych HIV. Namnażanie się wirusa w zakażonej komórce jest sterowane przez geny genomu wirusowego. W tym procesie z wirusowych genów powstają poprzez transkrypcję i translację, produkty

175 143

3

regulatorowe i białka strukturalne do budowy zakaźnych cząstek wirusowych do namnażania się wirusa. Istotnym pośrednikiem w tym procesie jest informacyjny kwas rybonukleinowy (mRNA), który przekazuje informację o budowie białek regulatorowych i strukturalnych. Blokowanie informacyjnego kwasu rybonukleinowego w sposób wysoce swoisty, który opiera się całkowicie na swoistości struktury molekularnej wirusowego mRNA, a mianowicie na swoistej dla wirusa sekwencji zasad nukleinowych tej cząsteczki można uzyskać za pomocą kwasu rybonukleinowego o komplementarnej sekwencji zasad. Przez swoiste dla sekwencji parowanie zasad nukleinowych, jak to opisano dla kwasu dezoksyrybonukleinowego, pierwotnie jednoniciowy mRNA zostaje skompleksowany w RNA dwuniciowy i informacja genetyczna zawarta w sekwencji zasad nukleinowych staje się częściowo niedostępna dla biosyntezy białka. Drugi etap ekspresji genu, translacja, jest tym samym zahamowany. Komplementarny kwas rybonukleinowy określa się jako RNA antysensowny. Mechanizm hamowania ekspresji genu przez wzajemne oddziaływanie antysensownego RNA z docelowym mRNA jest złożony i w dużym stopniu nie wyjaśniony. Jednym wyjaśnieniem jest hamowanie cięcia i składania RNA i obróbki RNA w jądrze komórkowym, jednak dokładne badania na ten temat nie są znane. Opisana jest wymiana adenozyna - inozyna w dwuniciowym RNA i sugeruje się, że hamowanie translacji jest następstwem tej wymiany. Hamowanie transportu RNA przez błonę jądrową do miejsca biosyntezy białka oraz maskowanie wzajemnego oddziaływania rybosomów i RNA przez dwuniciowy RNA mogą być dalszą przyczyną hamowania ekspresji genów przez antysensowny RNA. Opisano hamowanie procesów metabolicznych przez antysensowny RNA w naturalnie występujących układach biologicznych, takich jak bakterie i niektóre eukariotyczne organizmy wielokomórkowe (K.M. Takayamai M. Inouye, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 25,155 (1990), jak również w otrzymanych sztucznie przez transfer genów organizmach transgenicznych (J. Mol. i in. FEBS Letters 268 (1990)). Donoszono również o próbach wytworzenia opornych na wirus organizmów roślinnych (M.Cuozzo i in., Biotechnology 6,549 (1988) i zwierzęcych (T. Riiden i E. Golboa, J. Virol. 63, 677 (1989)), po wprowadzeniu genu kodującego antysensowny RNA. Jak podają sami autorzy tych publikacji, nie ma jednak przekonujących, naukowo stwierdzonych, zależności między ekspresją antysensownego RNA i opornością na wirus. W szczególności w przypadku plazmidów, które wprowadza się przez mikroiniekcję, warunkujących ekspresję antysensownego RNA z ekspresją przejściową, działanie przeciwwirusowe jest słabe albo nie daje się zdecydowanie ocenić (K. Rittner i in., Nucleic Acids Research 19, 1421 (1991)). Doniesiono także o zastosowaniu wektorów retrowirusowych, warunkujących ekspresję antysensownego RNA, do wytwarzania komórek opornych na wirus (R. Y-L., To i in. w: Gene Regulation: Biology of antisense RNA and DNA, wyd. R.P. Ericskon i J.G. Izant, Raben Press Ltd., New York 1992). Te retrowirusowe wektory niosą ryzyko wywołania złośliwego wzrostu nowotworowego, ponieważ zawierają sekwencje genów podobnych do onkogenów i istnieją liczne dowody na onkogenezę zależną od retrowirusów. W przeciwieństwie do publikowanych prac na temat antysensownego RNA w regulacji replikacji wirusa, w niniejszym wynalazku opisane są konstrukty ekspresyjne, które odznaczają się szczególnym rodzajem konstrukcji promotora w kombinacji ze specjalnie wybranymi regionami wirusowego DNA w orientacji antysensownej, i przez to wykazują działania przeciwwirusowe, które jakościowo i ilościowo są zaskakujące i daleko wykraczają poza dotychczas znany zakres. Kombinacja składników wektora ekspresyjnego: sekwencjaflankująca 5' DNA, promotor, wstawka/antysensowny DNA i 3' - sekwencje sygnałowe obróbki po raz pierwszy dała w zakażeniach retrowirusowych dającą się pewnie oznaczyć i wyraźnie wyrażoną oporność na wirus w transfekowanych komórkach wykazujących ekspresję antysensownego RNA. Natomiast według stanu techniki, z innymi systemami wektorowymi do endogennej ekspresji antysensownego RNA związane są słabe, tylko nieznaczne efekty przeciwwirusowe, pojawiające się przejściowo (na przykład T. Riiden i E. Gilboa, J. Virol., 63, 677 (1989)), opis patentowy EP 252 940, G. Sczakiel i in., Biochem. Biophys. Res. Com. 169, 643 (1990), O.i. Mirosknichenko i in., Gene 84, 83 (1989), T. Shimada i in., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 2, (1991), G. Sczakiel i in. J. Virol. 66, 5576 (1992) albo są one obarczone wyżej

4

175 143

wspomnianym ryzykiem (transfer genu retrowirusowego), albo są niepraktyczne ponieważ wymagają mikroiniekcji. Wynalazek dotyczy konstruktów wektora ekspresyjnego do ekspresji antysensownego DNA, które zawierają a) sekwencje silnego konstytutywnego promotora wybranego spośród promotora metalotioneiny i promotora CMV albo sekwencje hybrydowego promotora obejmującego wymienione silne promotory lub jeden z wymienionych silnych promotorów i promotor HIV-1 LTR oraz b)wirusowy DNA w orientacji antysensownej. Są to korzystnie takie konstrukty wektora ekspresyjnego, które zawierają subgenomowe sekwencje genowe patogennego wirusa w orientacji 3' —> 5' (orientacja antysensowna), pod kontrolą promotora ekspresji antysensownego RNA, którego sekwencja zasad nukleinowych jest komplementarna do mRNA patogennego wirusa. Bardzo korzystne są takie konstrukty, które zawierają prowirusowy, subgenomowy DNA w orientacji antysensownej z retrowirusów takich jak HI V-1 albo HI V-2, onkowirusów, takich jak HTLV-I, HTLV-II, albo onkogenów takich jak abl, erb A, erb B, fms, fos, myb, myc, ras, sis, src. Korzystne są konstrukty wektora ekspresyjnego, które zawierają sekwencje promotora lub promotora hybrydowego, oraz prowirusowy DNA HIV-1 w orientacji antysensownej nukleotydów 7514 -> 474, albo 5786 -> 474, albo 2096 -> 474, albo 3925 -> 681, albo 5786 -> 4158, albo 5746 -> 4648, albo 2369 -> 1635, albo 3227 -> 3003, albo 2099 -> 678, albo 3829 -> 2099, albo 4647 ->4157, albo 4157 -> 3830. Korzystne są również konstrukty wektora ekspresyjnego, które zawierają subgenowe, prowirusowe sekwencje genowe albo sekwencje onkogenowe w orientacji 3' —>5', dla ekspresji krótszych transkryptów antysensownego RNA. Korzystne są również takie konstrukty wektora ekspresyjnego, które zawierają prowirusowe sekwencje genowe z HIV-1, nukleotydów 605 -> 155, albo 670 -> 440, albo 825 -> 535, albo 6070 -> 5800, albo 5640 -> 5020, albo 5600 -> 5040, albo 8690 -> 8300, albo 9160 -> 8800. Korzystne są konstrukty wektora ekspresyjnego, które zawierają dwie, trzy lub więcej sekwencji subgenomowych z jednego wirusa albo z kilku wirusów. Konstruktem według wynalazku można transfekować komórki. Konstrukty wektorów ekspresyjnych nadają się też do wytwarzania środków leczniczych, w których substancję czynną stanowi jeden lub więcej konstruktów według wynalazku. Stosując opisane tu konstrukty wektora ekspresyjnego w odpowiednich ludzkich komórkach gospodarza wykazano działanie przeciwwirusowe w stosunku do replikacji HIV-1, które zapewniało całkowitą ochronę przed replikacją HIV-1 w komórkach ludzkich przez ponad 60 dni, a prócz tego w sposób istotny hamowało replikację HIV-2. Konstrukty wektora ekspresyjnego według wynalazku wytwarzają w transfekowanych komórkach jako transkrypt informacyjny kwas rybonukleinowy, który jest komplementarny do sekwencji mRNA niepożądanych genów wirusowych, na przykład genów GAG, POL, VIF, REV, TAT i VPU ludzkiego wirusa niedoboru odporności, HIV-1 (W.A. Haseltine i in., Scientific American USA, 1988, 34 do 42). Ponadto opisana sekwencja antysensownego RNA jest wystarczająco homologiczna wobec HIV-2 (na przykład izolatu HIV-2 D 194, w: Human retroviruses and AIDS, wyd. Myers i in., Los Alamos National Lab., 1992, oraz EMBL nr depozytu X52223) w zakresie genów GAG, POL i VIF, aby wywierać działanie przeciwwirusowe także na izolaty HIV-2. Konstrukty wektora ekspresyjnego według wynalazku wyróżniają się szczególnym rodzajem uszeregowania wybranych sekwencji promotora i sekwencji promotora hybrydowego (na przykład CMV-IE/metalotioneina I), z subgenowymi fragmentami DNA HIV-1 w orientacji antysensownej (3' —>5'), co daje w wyniku kilku transkryptów, antysensownych RNA, przez konstytutywne lub indukowane cięcie i łączenie RNA. Tak utworzone transkrypty antysensownego RNA wykazują nieoczekiwanie drastyczne albo całkowite hamowanie replikacji HIV-1 w komórkach ludzkich (HUT 78, U 937, na przykład). Stwierdzono także wyraźne hamowanie replikacji HIV-2. HIV-2 wykazuje w opisywanych tu konstruktach wektora ekspresyjnego wystarczającą homologię sekwencji RNA, tak że dochodzi do hamowania replikacji wirusa przez antysensowny RNA. Stosując zatem konstrukty według wynalazku hamuje się replikację retrowirusów, np. HIV-1 i HIV-2, chroniąc w ten sposób komórki krwiotwórcze - a więc ważne komórki ludzkiej komórkowej reakcji odpornościowej (np. limfocyty T,

175 143

5

monocyty) - przed szkodliwym i niszczącym komórki namnażaniem się wirusa, przez określony sposób ekspresji działającego przeciwwirusowo antysensownego RNA. Następująca procedura eksperymentalna została przeprowadzona w celu nadania komórkom układu odpornościowego oporności na uszkadzające działanie namnażania się retrowirusów, znane z zakażenia HIV-1 i HIV-2, za pomocą ekspresji przeciwwirusowego antysensownego RNA. Promotory: Skonstruowano wektory ekspresyjne, zawierające promotory, które w komórkach krwiotwórczych powinny zapewniać konstytutywną i wydajną ekspresję, jak na przykład promotor IE wirusa cytomegalii (CMV-EE). Ponadto, skonstruowano także przez fuzję sekwencji kwasów nukleinowych, takie promotory, które przy inwazji wirusa powinny dodatkowo indukować amplifikowaną ekspresję. W szczególności składnikiem tych promotorów hybrydowych jest fragment promotora CMV-IE-metalotioneiny oraz fragment kwasu nukleinowego HI V-1 LTR od nukleotydów 289 do 474 albo 289 do 532 (numeracja nukleotydów: UWGCG GENEMBL Data Bank, File: HIVHXB2CG. VIRAL 25 września 1987), który przyczynia się do amplifikowanej, ewentualnie dającej się transaktywować, dodatkowej aktywności promotora. Fragmenty antysensownego kwasu nukleinowego. Dodatkowo konstrukty wektorów zawierają, pod kontrolą opisanych promotorów, subgenomowe prowirusowe fragmenty DNA w orientacji antysensownej, to znaczy nić (+) DNA ulega transkrypcji w kierunku 3' —> 5'. Ze względu na bezpieczeństwo nie stosuje się kompletnego prowirusowego genomowego fragmentu DNA retrowirusa. Stosuje się jednak raczej dłuższe, subgenomowe prowirusowe fragmenty DNA, a nie krótkie, subgenowe prowirusowe fragmenty DNA, głównie ponieważ większe jest prawdopodobieństwo cięcia i składania RNA w dłuższych transkryptach RNA i w ten sposób z prowirusowych fragmentów DNA można oczekiwać większej liczby transkryptów antysensownego RNA, zgodnie z wynalazkiem, co w wymienionych przykładach rzeczywiście stwierdzono. (Rodzaj i liczba transkryptów antysensownego mRNA po całkowitej obróbce, których można oczekiwać dla zastosowanych sekwencji HIV w orientacji antysensownej jest nie do przewidzenia, ponieważ nie ma wystarczająco zgodnych sekwencji do składania mRNA, które pozwoliłyby na zdecydowane przewidywanie). Wraz ze wzrastającą liczbą transkryptów antysensownego RNA, z przynależnymi im cechami, jak na przykład eksport z jądra albo stabilność w cytoplazmie, wzrasta również prawdopodobieństwo wytworzenia transkryptu antysensownego RNA o silnym działaniu przeciwwirusowym. Wynalazek dotyczy konstruktów wektora ekspresyjnego, które zawierają sfuzowany fragment genu ulegającego transkrypcji do antysensownego RNA pod kontrolą silnego promotora. Sfuzowany fragment genu składa się z subgenomowych fragmentów DNA z dwu lub kilku różnych patogennych wirusów, na przykład HIV-1 i HIV-2. Stosując takie sfuzowane fragmenty genowe, które kodują transkrypt RNA zawierający kolejno kilka regionów sekwencji antysensownego RNA komplementarnych do regionów sekwencji mRNA z różnych wirusów, można skonstruować wektory ekspresyjne o szerszym działaniu przeciwwirusowym. Słuszność tej zasady potwierdzają przykłady I, IV, V, X i XII. Na przykład konstrukty wektora ekspresyjnego KTX 11, pSXK1 i pSXK2 zawierają fragmenty antysensowego DNA z HIV-1 LAV/BRU, które ze swej strony zawierają krótsze odcinki, które są także komplementarne do mRNA z HIV-2 D194 (naprzykład nukleotydy 620-660 albo 837-899, albo 4868-5044). W ten sposób antysensowny RNA z KTX11, pSXK1 i pSXK2 jest przeciw wirusowy także wobec HIV-2. Można teraz kodującą antysensowny RNA sekwencję tych wektorów dodatkowo poddać fuzji z fragmentami prowirusowego DNA z innych wirusów w orientacji antysensownej (na przykład izolaty HIV-2, inne izolaty HIV-1) tak, że w wyniku segmentowo zoptymalizowanej komplementarności antysensownego RNA do sekwencji innych wirusów, można osiągnąć równocześnie lepsze lub całkowite hamowanie różnych wirusów jednym konstruktem wektora ekspresyjnego.

6

175 143

Terminację transkryptów antysensownego RNA uzyskuje się przy pomocy sygnału poliadenylacji (na przykład z SV 40 albo z bydlęcego hormonu wzrostu), a celu wygenerowania wysoce stabilnego mRNA. Ponadto wektory zawierają pełny operon dla ekspresji odpowiedniego markera selekcyjnego. W przytoczonych przykładach wykorzystano oporność na antybiotyki TNR 5 neo (neomycyna, genetycyna, G 418, kanamycyna) w celu wyselekcjonowania komórek, które po transfekcji zawierają konstrukt genetyczny dla ekspresji antysensownego DNA. Ten marker selekcyjny okazał się przydatny dla ludzkich komórek krwiotwórczych. Można było zastosować także inne markery selekcyjne, jak na przykład puromycynę albo higromycynę albo metotreksat, w połączeniu z transfekcją genu dla reduktazy dihydrofolianowej. Szczególnie przydatne jako antysensowne sekwencje nukleotydowe są sekwencje z regionu POL/VIF genu HIV, między nukleotydami 2100-5800. Zwłaszcza antysensowne sekwencje nukleotydów 5786-4158 wykazały wyróżniającą się aktywność przeciwwirusową. Można również stosować inne fragmenty z tego regionu, na przykład 5746 -> 4648 albo 4647 -> 4157, albo 5880 -> 3880, albo 5850 -> 4158, albo 5150 -> 3200. W celu wykazania działania przeciwwirusowego antysensownego RNA, na przykład przeciw HIV-1 linie komórek ludzkich, które mogą być zakażone HI V-1, transfekowano wyżej wspomnianymi konstruktami wektora ekspresyjnego. Celem było wykazanie na szeregu typów ludzkich komórek krwiotwórczych, że endogenna ekspresja antysensownego RNA prowadzi do zahamowania replikacji wirusa w komórkach, które biorą szczególny udział w komórkowej reakcji immunologicznej. To niszczenie komórek układu odpornościowego w końcowej fazie choroby AIDS pozostaje w związku przyczynowym ze zwiększoną częstością zakażeń oportunistycznych, które wtedy mają często przebieg śmiertelny. Dlatego celem prac z komórkami krwiotwórczymi a najpierw ciągłymi liniami komórkowymi, jak na przykład HUT 78, MOLT 4, U 937, Jurkat, CEM-CM3 (wszystkie według American Type Culture Collection ATCC, Bethesda, Maryland, USA) po transfekcji wektorem, klonowaniu i genetycznym scharakteryzowaniu, w doświadczeniach nad zakażeniem odpowiednimi izolatami HTV-1 i HIV-2 było zbadanie "oporności na wirus" tych transfekowanych linii komórkowych. Wykazana ekspresja działającego przecwiwirusowo antysensownego RNA w tych komórkach wskazuje na użyteczność konstruktów ekspresyjnych w komórkach krwiotwórczych i w końcu także na ich zastosowanie do transformacji komórek tkanki krwiotwórczej szpiku kostnego dla celów terapeutycznych. Włączenie genów do limfocytów krwi obwodowej i komórek szpiku w celach leczniczych zostało opisane w innym miejscu (K.W. Culver i in., Transplant Proc. 23,170-177 (1991) i w zasadzie powinno być możliwe do zastosowania w odniesieniu do wymienionych tu konstruktów do ekspresji antysensownego RNA. P r z y k ł a d I. Konstrukt wektora ekspresyjnego KTX 11. (Jeśli nie podano inaczej, cała numeracja nukleotydów odnosi się poniżej do sekwencji wirusa ludzkiego niedoboru odporności typu 1 (HXB2), WUGCG, GENENBL Data Bank, file: HTVHXB2CG VIRAL, od 25 września 1987). W celu endogennej ekspresji działającego przeciwwirusowo antysensownego RNA po transfekcji komórek, które mogą ulec zakażeniu HI V-1, skonstruowano następujący wektor ekspresji. Mysi promotor metalotioneiny I (1600 par zasad EcoRI Bgl II fragment (N. Glanville i in., Nature 292,267-269 (1982)) zligowano w miejscu cięcia Sal I (nukleotydów 5786) regionem 3' prowirusowej sekwencji DNA HIV-1 po ligacji z adaptorowym RNF Bgl Ii-Xho I, uzyskując w efekcie modyfikację miejsc cięcia Bgl II, Xho I i Sal I. Region 5' prowirusowego DNA HIV-1 w miejscu cięcia Bgl II (nukleotyd 474) poddano ligacji z miejscem cięcia Bam HI, do którego przyłączona jest sekwencja sygnału poliadenylacji SV 40 (nukleotydy 2564 do 4713 z delecją sekwencji z UWGCG GenEMBL file SV 40XX). Tę samą sekwencję poliadenylacji z SV 40 zastosowano w kierunku 3' —> 5' dla terminacji TRN5NEO (marker selekcyjny neomycyna (fosfotransacetylaza), nukleotydy 1-1286 TRN5NEO BACTERIA, UW GCG GenEMBL). Ekspresja genu oporności na neomycynę jest inicjowana przez wczesny promotor SV 40 (nukleotydy 5171-371), UWGCG GenEMBL SV 40XX). W innym przypadku wektor zawiera także pBR 322 DNA (nukleotydy 2067-4363, WUGCG, GenEMBL File PBR 322) pochodzenia bakteryjnego oraz gen oporności na ampi-

175 143

7

cylinę, aby można było go użyć jako wektor wahadłowy (Shuttle) dla E. coli i komórek zwierzęcych. Mapa genowa tego wektora KTX 11 jest przedstawiona na fig. 1. P r z y k ł a d II. Konstrukt wektora ekspresyjnego KTX 12. Wektor ekspresyjny KTX 12 antysensownego RNA HIV-1 jest skonstruowany tak samo jak wektor KTX 11 (przykład I). Zawiera on jednak podlegający indukcji promotor hybrydowy, a nić matrycy DNA HI V-1 rozciąga się w orientacji 3' —> 5' poza ten promotor hybrydowy, od nukleotydów 7514 —> 474. Dla otrzymania promotora hybrydowego, fragment promotora LTR HIV-1, nukleotydy 289 do 532, poddano fuzji z nukleotydem 368 promotora metalotioneiny (UW GCG File MYSMETI.RO). Mapa restrykcyjna tego wektora KTX 12 jest przedstawiona na fig. 2. P r z y k ł a d III. Konstrukt wektora ekspresyjnego KTX 15. Wektor ekspresyjny KTX 15 antysensownego RNA HIV-1 jest skonstruowany podobnie jak wektor KTX 12 (przykład II). Jednakże fragment DNA nici matrycy HIV-1 ( w orientacji 3' - 5') jest istotnie skrócony i rozciąga się od nukleotydu 2096 do nukleotydu 474, obejmując tym samym sekwencję GAG, sekwencję lidera, sekwencję U5 oraz część sekwencji R. Dalszą ważną cechą wektora KTX jest delecja sekwencji TAR, z delecją nukleotydów 474-532 promotora hybrydowego HI V-LTR. W ten sposób powinna nadal być możliwa aktywacja promotora hybrydowego w przypadku zakażenia HIV, ale bez obecności białka TAT HIV-1 nie powinna zachodzić terminacja transkrypcji, kodowanej przez TAR (S.Y. Kao i in., Nature 330, 489 (1987)). Ten promotor hybrydowy odznacza się zatem szczególnie wysoką konstytutywną transkrypcją pod kontrolą sekwencji promotora LTR HI V-1. Mapa restrykcyjna wektora KTX 15 jest przedstawiona na fig. 3. P r z y k ł a d IV. Wektor ekspresyjny PSXK1 antysensownego RN A HIV -1 przygotowano celem wykazania ekspresji antysensownego RNA pod kontrolą innego silnego promotora warunkującego wydajną i konstytutywną ekspresją, w tym przykładzie promotora wirusa cytomegalii. Fragment genu HIV-1, nukleotydy 681-3825, wprowadzono w orientacji 3' —>5', do miejsca restrykcji Hind III przy nukleotydzie 891 (wektor pRc/CMV, numer katalogu V 750-20, Invitrogen, San Diego CA 92121, USA). Sygnał poliadenylacji pochodzi z genu bydlęcego hormonu wzrostu (BGH). W innym przypadku wektor jest skonstruowany jako wektor wahadłowy, w ten sposób jak wektor KTX 11 (przykład I) z neomycynowym markerem selekcji i fragmentem DNA pBR322 dla replikacji i selekcji w E.coli. Mapa restrykcyjna wektora pSXK 1jest przedstawiona na fig. 4. P r z y k ł a d V. Konstrukt wektora ekspresyjnego pSXK 2. Wektor ekspresyjny pSXK 2 antysensownego RNA HIV-1 różni się od wektora pSXK 1 (przykład IV) tym, że posiada sekwencje promotora zawierające nukleotydy 209-865 promotora CMV (patrz przykład IV) sfuzowane z nukleotydami 150-369 promotora metalotiotioneiny (UWGCG GenEMBL file MUSMETI.RO), a więc jest promotorem hybrydowym. Ponadto, prowirusową sekwencję DNA nukleotydów 4158-5786 wstawiono w orientacji 3' —> 5' jako matrycę dla ekspresji antysensownego RNA, pod kontrolą promotora hybrydowego CMV/metalotioneina. Mapa restrykcyjna wektora pSXK 2 jest przedstawiona na fig. 5. P r z y k ł a d VI. Konstrukty wektorów ekspresyjnych pHTT 1, 4, 6, 10, 12 i 15. Wektory ekspresyjne pHTT 1,4, 6,9,10,12 i 15 antysensownego RNA HIV-1 przygotowano w sposób podobny jak wektor pSXK 1 (przykład IV, fig. 4). Wszystkie fragmenty genowe HIV-1 wstawione do wektorów pHTT klonowano w orientacji 3' —> 5' do wektora pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA 92121, nr katalogu V 750-20, 1991), pod kontrolą promotora cytomegalowirusa warunkującego konstytutywną ekspresję. Wektory pHTT są podane niżej: (a) pHTT 1: fragment genu HI V-1 (nukleotydy 4648-5746) wbudowano do miejsca cięcia Not I (nukleotyd 966) wektora pRc/CMV. (b) pHTT 4: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 1635-2639) wbudowano do miejsca cięcia Xba I (nukleotyd 985) wektora pRc/CMV. (c) pHTT 6: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 3003-3227) wbudowano do miejsca cięcia Xba I jak opisano pod (b). (d) pHTT 9: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 678-2099) wbudowano do miejsca cięcia Xba I jak opisano pod (b).

8

175 143

(e) pHTT 10: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 2099-3829) wbudowano do miejsca cięcia Xba I jak opisano pod (b). (f) pHTT 12: fragment genu HIV-1 (nukleotydy 4157-4647) wbudowano do miejsca cięcia Xba I jak opisano pod (b). (g) pHTT 15: fragment genu HI V-1 (nukleotydy 3830-4157) wbudowano do miejsca cięcia Xba I jak opisano pod (b). Ogólny wykres fragmentów genowych HIV-1, które są wprowadzone w orientacji antysensownej 3' —>5' w wektorach z przykładów I do VI jest przedstawiony na fig. 6. P r z y k ł a d VII. Transfekcja i klonowanie limfocytów ludzkich wektorami dla ekspresji antysensownego RNA. Jako przykłady transfekowanych linii ludzkich komórek krwiotwórczych, które wykazują oporność na wirus w wyniku endogennej ekspresji antysensownego RNA przeciw HIV-1, wybrano rosnącą w zawiesinie monocytopodobną linię komórkową U 937 oraz tak samo rosnącą linię T limfocytów HUT 78. Obie linie komórkowe otrzymano z American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852-1776, USA. Linie komórkowe hodowano w pożywce zalecanej przez ATCC. Transfekcję wektorem przeprowadzono różnymi sposobami, przy czym najlepsze wyniki dała elektroporacja: 1. Metoda z fosforanem wapnia: Modyfikacja metody Wiglera i in., 1977, Cell 11, 223. Transfekcję przeprowadza się precypitatami wapniowymi DNA. Różne ilości DNA od 0,05 do 20 μg rozpuszczono w 0,25 ml w 250 mM CaCl2i wolno wkroplono do 0,25 ml buforu HEPES X 2. Transfekcję otrzymano dodając całą mieszaninę precypitatu do 10 ml hodowli komórkowej. 15 godzin później usunięto podłoże przed odessanie. Komórki poddano szokowi DMSO. Na 10 ml hodowli dodano 3 ml 25% roztworu DMSO w jałowym PBS. Po 4 minutach odessano płyn a komórki przemyto 5 ml PBS. Następnie komórki zawieszono w 10 ml pożywki DMEM. 2. DEAE dekstran Dzień przed transfekcją sporządzono zawiesinę komórek o gęstości 3-4 x 105 na ml pożywki wzrostowej. 2-4 godziny przed transfekcją komórki odwirowano i zawieszono w świeżej porcji pożywki. 0,5 do 20 μ g DNA zmieszano z 1070 μl PBD i dodano 120 μ g roztworu DEAE (roztwór transfekcyjny). Przed transfekcją odwirowano 40 ml zawiesiny komórek, zawieszono je w 10 ml PBS i ponownie wirowano. Osad komórek zawieszono w roztworze pBS-DEAE dekstran i inkubowano 30 minut. Następnie komórki poddano szokowi przez dodanie 0,8 ml zimnego roztworu DMSO (25% TBS). Po 3 minutach dodano 10 ml TBS i wirowano. Komórki przemyto pożywką wzrostową RPMI i zawieszono w 40 ml tej pożywki 3. Fuzja (metoda Sanari-Goldin) Rosnące wykładniczo komórki (1 x 107/ml) odwirowano i raz przemyto pożywką RPMI. Do osadu komórek dodano 2 ml zawiesiny protoplastów E.coli (2 x 103/ml) w 10% sacharozie w 10 mM MgCl2. Protoplasty z transfekującym plazmidem wytworzono według Sanari-Goldin i in., Po 8 minutach inkubacji wirowano i ostrożnie w ciągu 2 minut dodano roztwór PEG (glikol polietylenowy 4000, 45% roztwór w RPMI). Po 1 minucie inkubacji w ciągu 7 minut dodano 10 ml pożywki RPMI bez FCS. Komórki odwirowano, przemyto pożywką RPMI i zawieszono w 10 ml. 4. Elektroporacja Elektroporację (EP) przeprowadzono w aparacie Gene Pulser and Capacitance Extender, firmy Bio Rad. Komórki w wykładniczej fazie wzrostu doprowadzono do gęstości 1 x 107/ml, raz przemyto w PBS i zawieszono w pożywce RPMI bez FCS z 10 mM dekstrozą i 0,1 mM ditiotreitolem. 0,4 ml zawiesiny komórek umieszczono w kuwecie do EP i dodano 10-20 μg DNA. DNA rozpuszczono do stężenia 1 μ g na 1 μl TE. Warunki elektroporacji wahały się, jak następuje: Pojemność: 260-960 (μF; napięcie : 150-300 V; odległość elektrod 0,2/0,4 cm; oporność: 100 -∞omów.

175 143

9

Przed i po elektroporacji komórki inkubowano 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym zawieszono w 10 ml pożywki wzrostowej + PCS. Selekcja transfektantów: Selekcję transfektantów przeprowadzono w każdym przypadku na podstawie oporności przeciw G 418. 1. Selekcja na podłożu półpłynnym Transfekowane komórki najpierw inkubowano w pożywce wzrostowej zawierającej G 418 tak długo, aż nie stwierdzono dalszego wzrostu. Następnie wysiewano na podłoże półpłynne. Do zestalenia środowiska służył agar (Gibco) albo metyloceluloza. Wstępnie wyselekcjonowane komórki wysiewano na płytkę do hodowli tkanek (10 cm) i dodano 10 ml pożywki selekcyjnej (RPMI plus 1 mg/ml G 418) i 2 ml 2% upłynnionego roztworu agaru. Po ochłodzeniu agaru, inkubowano w cieplarce w 37°C. W wariancie tego doświadczenia agar zastąpiono metylocelulozą. 2. Selekcja i klonowanie w komorze do hodowli komórek Transwell TM, firmy Costar 48 godzin po transfekcji komórki wysiewano na 96-studzienkową płytkę mikrotitracyjną, przy gęstości 1 x 105 komórek na studzienkę 0,2 ml. Dodano G 418 do stężenia 0,7 mg/ml dla komórek U 937 i 1,0 mg/ml dla HUT 78. Gdy tylko pożywka została zużyta dodawano 1/2 objętości studzienki i pożywki; w przypadku U 937 dodawano tylko 0,5 mg/ml G 418. Inkubację prowadzono tak długo, aż w poszczególnych studzienkach narosły komórki oporne. Te klony mieszane uzupełniano do większej objętości i następnie klonowano. Stosowano do tego celu specjalne komory hodowlane firmy Costar (Transwell TM, nr katalogu 3425, 205, Broadway, Cambridge, MA 02139, USA). Komórki w zawiesinie o niewielkiej gęstości (50 do 200 komórek na 6 ml) wysiewano do miękkiego agaru zawierającego G 418 (patrz selekcja w środowisku półpłynnym), a 6 ml umieszczano w komorze centralnej (przedział górny). Komora jest oddzielona błoną od bardzo gęsto rosnącej płynnej hodowli zaopatrującej U 937 względnie HUT 78 (20 000 komórek/ml) w dolnym przedziale. Płynną pożywkę w miarę zużycia częściowo wymieniano, aby umożliwić dalszy wzrost komórek. Gdy w miękkim agarze pojawiły się kolonie oporne na G 418, izolowano je pipetą Pasteurowską i namnażano. W ten sposób z użyciem wektorów KTX 11, KTX 12, KTX 15, pSXK 1 i pSXK 2 sklonowano po około 10 niezależnych, transfekowanych linii komórek U 937 i HUT 78, które zbadano dalej dla wykazania ekspresji antysensownego RNA i oporności na HIV-1. Ponadto, z użyciem wektorów pHTT1, pHTT4, pHTT9 i pHTT10 generowano linie komórek HUT 78 i sprawdzono je w próbie zakażenia HIV. P r z y k ł a d VIII. Transformacja komórek szpiku wektorem ekspresji KTX 15. Jako przykład, podstawowe postępowanie do badania transformacji pierwotnych komórek szpiku na modelu myszy przebiegało następująco: Pierwotne komórki szpiku otrzymano z kości udowych myszy C57 w wieku od sześciu do dziesięciu tygodni. Komórki pobrano w pożywce McCoy (firmy Flow) i wysiano na szalki Petriego, po zmieszaniu z interleukiną 3 i GM-CSF (czynnik stymulujący kolonie granulocytów-monocytów - Granulocyte-monocyte colony stimulating factor, firmy Genzyme) w stężeniu 2,5 μg/ml, oraz z agarem (Bacto Agar firmy Difco, końcowe stężenie 0,3%), w stężeniu 1 x 105 komórek na ml, w obecności lub bez obecności toksycznego antybiotyku G 418 (neomycyna). Transfekcję przeprowadzono bezpośrednio po pobraniu komórek szpiku, przed wysianiem w agarze. Następnie komórki hodowano przez szereg dni w cieplarni z przepływem CO 2 (7,5%) w 37°C. W różnych odstępach czasu liczbę transformowanych kolonii (co najmniej 50 komórek) lub skupisk komórek (clusters, 10 do 50 komórek) liczono w każdym przypadku pod mikroskopem. W podanych warunkach doświadczenia, większość kolonii były to kolonie mieszane granulocytów/monocytów albo kolonie granulocytów, rzadko obserwowane "wybuchy" komórek erytroidalnych, w jednym przypadku stwierdzono megakariocyty. Typy komórek w koloniach identyfikowano przez barwienie May-Griinewald. Warunki transfekcji zostały zoptymalizowane. Pomyślne transfekcje komórek pierwotnych szpiku otrzymano w następującym układzie: 800 μl zawiesiny komórek szpiku (5 x 106 komórek w płynie do elektroporacji, jak opisano w przykładzie VII), 5 μg KTX15, elektroporacja przy 300 V, 100 Ω , 250 μFD, 6 ms.

10

175 143

Po elektroporacji (aparat Gene Pulser and Capacitance Extender firmy Bio Rad) komórki poddano selekcji w opisanej pożywce hodowlanej w obecności 500 μg/ml G 418 (neomycyna). Oporność na G-418 wskazywała na udaną transfekcję zdolnych do propagacji komórek pierwotnych szpiku. P r z y k ł a d IX. Wykazanie integracji nienaruszonych konstruktów wektorów ekspresyjnych oraz wykazanie ekspresji antysensownego RNA. Transfekowane linie komórkowe U 937 i HUT 78 poddano dezintegracji i DNA i RNA z tych linii komórkowych izolowano standardowymi metodami stosując wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu (L.G. Davis i in., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, Nowy Jork 1986). Dowód na integrację nienaruszonych konstruktów wektora ekspresyjnego antysensownego RNA przeprowadzono przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR Technology Principles and Application of DNA Amplification, wyd. Henry A. Erlich, M. Stockton Press, Nowy Jork 1989), stosując primery oligonukleotydowe, które amplifikowały zachodzące na siebie fragmenty DNA sekwencji promotora, sekwencji insertu i sekwencji terminacji. Następnie, amplifikowany DNA identyfikowano metodą analizy Southern Blot (Davis i in., patrz wyżej) używając sond genowych dla wstawek DNA. Przykłady wyników analizy są przedstawione na fig. 7, 8 i 9. Dla wektorów KTX 11, KTX 12 i KTX 15, na przykład, zastosowano flankujące primery 5'-CAA ACC CTT TGC GCC CG-3' albo 5'-ACT CGT CCA ACG ACT AT-3' z sekwencji promotora i 5'-TTT TTT CAC TGC ATT CTA CTT-3' z sekwencji poliadenylacji. W przypadku wektorów ekspresyjnych z wektorem pRc-CMV na przykład, zastosowano flankujący primer 5'CTT TCC AAA ATG TCG TAA CAA CTCC-3' dla sekwencji promotora i 5'-ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT-3' dla sekwencji terminacji. We wstawce (sekwencja HIV) wybrano sekwencje primera, które zależnie od wybranej pary primerów dawały produkty PCR o około 500 do 2100 par zasad. Ekspresję antysensownego RNA wykazano przeprowadzając analizę Northern Blot (Davis i in., patrz wyżej) RNA z klonowanych, transfekowanych linii komórek. Przykład wyniku analizy wykazujący antysensowny RNA HIV-1 w transfekowanej linii komórek U 937 przedstawia fig. 10. P r z y k ł a d X. Wykazanie oporności na wirus transfekowanych klonowanych linii komórkowych krwiotwórczych. Klonowane linie komórkowe, w których zachodzi ekspresja antysensownego RNA, otrzymane i scharakteryzowane według przykładów VII i IX, badano w porównawczych próbach zakażenia HIV-1 (L. Ratner i in., Nature 313, 277, 1985) albo HIV-2 194 (H. Kühnei i in., Nucleic Acids Research 1990,18,6142) razem z wyjściowymi liniami komórek HUT 78 i U 937 jako kontrolnymi, na ekspresję oporności przeciwwirusowej. 1. Zakażenie HUT 78 i U 937 wirusem HIV-1 (kontrola) Wykonanie Porcje po 10 ml zawiesiny komórek traktowano przez 60 minut różnymi rozcieńczeniami płynu z hodowli HUT 78 (HUT-1)około 104 PFU/ml w hodowlach PBL, aktywność RT zamrożonego roztworu macierzystego 650 000 cmp/ml). Następnie komórki odwirowano i trzykrotnie przemyto, w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusa u białek wirusowych. Na koniec w każdym przypadku komórki zawieszano w 10 ml pożywki i hodowano w cieplarce. Co 30-40 dni badano 200 μl wolnego od komórek płynu z hodowli na obecność antygenów HIV. Stosowano test wychwytywania antygenu firmy Organon Technika. Dla podtrzymania komórek za każdym razem usuwano 5 ml zawiesiny komórek i zastępowano 5 ml pożywki. 2. Zakażenie HI V-1 komórek HUT 78 i U 937 wykazujących ekspresję antysensownego RNA. Wykonanie W każdym przypadku 10 ml zawiesiny komórek (około 4 x 105komórek na ml) traktowano przez 60 minut rozcieńczonym płynem z hodowli HUT 78/HIV-1 (około 10 PFU/ml w hodowlach PBL, aktywność RT zamrożonego roztworu macierzystego 650 000 cpm/ml); końcowe rozcieńczenie roztworu macierzystego wirusa wynosiło 1:1000 dla komórek HUT 78 i 1:50 dla komórek U 937. Następnie komórki odwirowano i czterokrotnie ostrożnie przemyto w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusa i białek wirusowych. Na koniec, komórki w

175 143

11

każdym przypadku zawieszano w 10 ml pożywki (RPMI 1640 + 16% FCS) i hodowano przez 60 dni w cieplarce. Co 3-4 dni 160 μ l wolnego od komórek płynu hodowlanego badano na obecność antygenów HIV, stosując test wychwytywania antygenu, firmy Organon Technika z odpowiednim czytnikiem płytek mikrotitracyjnych. Dla podtrzymania komórek w każdym przypadku co 3-4 dni usuwano 5 ml zawiesiny komórek i zastępowano 5 ml świeżej pożywki. Jako wynik reprezentatywny dla innych linii komórkowych wykazujących ekspresję antysensownego RNA można wymienić dwie serie doświadczeń z trzema transfektantami HUT 78 (HUT K14-KTX11, SSHUTTK16/2-SXK1, SSHUTK1/1-SXK2, patrz fig. 11) i z trzema transfektantami U 937 (ssUK 20/4-KTX1 la, ssUK 3/1-SXK2 i ssUK 20/15-KTX1 1b, patrz fig. 12). Po zakażeniu w ciągu inkubacji do 60 dni, zarówno w pomiarach aktywności odwrotnej transkryptazy (RT), jak również w oznaczeniach antygenu VIF te hodowle komórek wykazujące ekspresję antysensownego RNA i zawierające wektory ekspresji pSCK1 i pSXK2, nie wykazały żadnych oznak namnażania się HI V. Natomiast w kontrolnej linii komórek namnażanie się HIV można było wyraźnie oznaczyć. Ponadto stwierdzono opóźniony wzrost replikacji wirusa w transfektantach o słabszej ekspresji wektora KTX11. Wynik jest przedstawiony na fig. 11 i 12. Dla sprawdzenia, że zakażenie HIV-1 nastąpiło w liniach komórek SSU K3/1-SXK2, SSHUT K16/2-SXK1 i SSHUT K1/1-SXK2, które po inkubacji przez 60 dni nie wykazywały antygenu HIV-1 ani aktywności RT, dodatnie zakażenie wykazało na przykład przez reakcję PCR sekwencji genu HI V-1 TAT i sekwencji genów otoczki w inkubowanych przez 60 dni liniach komórek SSHUT K16/2-SXK1 i SSHUT K1/1-SXK2 (fig. 13). Zastosowano w tym celu primer PCR 5'-ATG GAG CCA GTA GAT CCT-3' i 5'-TCT ACC ATG TCAT-3' do generowania fragmentu PCR o długości 690 par zasad. Wektory ekspresyjne pSXK1 i pSXK2 nie zawierają tych sekwencji i dlatego nie mogą dać fałszywie dodatniego produktu PCR. P r z y k ł a d XI. Doświadczenia kontrolne. Transfekcja wektorów z przykładów I do VI, bez wstawek prowirusowego DNA HIV-1 w orientacji antysensownej, nie prowadziła w liniach do powstania komórek U 937 i HUT 78 do linii komórkowych, w których replikacja wirusa była zahamowana. Jednak doświadczenia kontrolne z wektorami z przykładów I do VI, w których są wstawki prowirusowego fragmentu DNA HI V-1 w orientacji sensownej, nie zostały przeprowadzone, ponieważ odpowiednie sensowne transkrypty mogą wiązać białka regulatorowe replikacji HIV, jak np. TAT i REV i dlatego mogą konkurencyjnie hamować replikację wirusa (G.J. Graham i in. PNAS 87, 5817, 1990) i dlatego okazują się nieprzydatne w doświadczeniach kontrolnych. P r z y k ł a d XII. Zakażenie HIV-2 linii komórek HUT 78 i U 937 wykazujących ekspresję antysensownego RNA. Próby zakażenia przeprowadzono z izolatem HIV-2 D194 /H. Kϋhnle i in., Nucleic Acids Res. 18, 6142,1990/. Zawiesinę wirusa o aktywności RT 2,14 x 105 cpm/ml i stężeniu antygenu (w rozcieńczeniu 1:1000) 0,249 OD450 nm (próbka 160 μl ) przechowywano w -80°C. Z tej zawiesiny wirusa do zakażenia 2 x 106 komórek HUT 78 pobrano 50 μl, dodano do 4 ml podłoża i inkubowano przez 3 godziny. Komórki U 937 zakażono (2 x 106) 100 μl zawiesiny wirusa w 4 ml podłoża i inkubowano przez 24 godziny. Następnie niezwiązane cząstki wirusa usunięto w hodowli przez przemywanie. W odstępach 3-4 dni hodowlę komórek podtrzymywano i pobierano supernatant do ilościowego oznaczania antygenu HIV, używając testu wychwytywania antygenu HIV firmy Organon Technika w połączeniu w odpowiednim fotometrem płytek mikrotitracyjnych. Przebieg replikacji HIV-2 D 194 w kontrolnych liniach komórek HUT 78 i U 937, które nie zawierają wektorów ekspresji antysensownego RNA jest porównany na fig. 14 i 15 z transfekowanymi liniami komórek, które przez ekspresję antysensownego RNA wykazują opóźnione namnażanie się HIV-2. Wyniki Stosując wektory ekspresji KTX 11, KTX 12, KTX 15, pSXK 1, pSXK 2, pHTT 1, pHTT 4, pHTT 6, pHTT 9, pHTT 10, pHTT 12 i pHTT 15 (przykłady I do VI), w ludzkich liniach komórek krwi po transfekcji genu i klonowaniu transfekowanych linii komórek (przykład VII) stwierdzo-

12

175 143

no endogenne wytwarzanie antysensownego RNA przeciw HIV-1 (przykład IX) i wykazano jego działanie przeciwwirusowe (przykłady X, XII). Nieoczekiwanie stwierdzono wyraźne hamowanie replikacji retrowirusa HIV-1 w transfekowanych liniach komórek. Podobnie przy użyciu HIV-1 specjalnie adaptowanego do transfekowanych komórek, można było wykazać oporność na wirus komórek z ekspresją antysensownego RNA (fig. 11, 12). Obserwowano również wyraźne cechy przeciwwirusowe antysensownego RNA przeciw HIV-2 (fig. 14,15). Wyniki te są przykładem, że odpowiednie promotory ekspresji cząsteczek antysensownego RNA i oczywiście rodzaj sekwencji antysensownego RNA, prowadzą w genetycznie zmienionych komórkach do wytworzenia oporności na zakażenie retrowirusem. W przykładzie IX wykazano, że w związku z dotychczas nieznanym procesem cięcia i składania RNA HI V-1, transkryptów nici /+/ prowirusowego DNA w orientacji 3' —> 5', powstało kilka cząsteczek mRNA, które prowadzą do efektu przeciwwirusowego. Prace doświadczalne, które opisano w przykładach I do XII, wykazały, że stosując odpowiednie konstrukty wektorów ekspresyjnych z fragmentami DNA retrowirusa, kodującymi antysensowny RNA, można otrzymać w komórkach właściwości przeciwretrowirusowe, które chronią przed zakażeniem retrowirusowym. Z fig. 11 do 13 widać, że linie komórek SSHUT K16/2-SXK1 i SSHUT K1/1-SXK2 po 60 dniach od zakażenia HIV są dodatnie w analizie PCR prowirusowego DNA HI V, chociaż oznaczanie antygenu HI V jest ujemne. Wynik ten pozwala wnosić, że po zakażeniu komórek HIV-1, wprawdzie w pierwszym etapie cyklu replikacyjnego HIV powstaje jeszcze prowirusowy DNA w transfekowanych liniach komórek HUT 78, ale antysensowny RNA zapobiega transkrypcji/translacji prowirusowego DNA i nie wytwarza się białko HIV do replikacji wirusa w dających się oznaczyć ilościach. W DNA linii komórkowej SSU K3/1-SXK2 w 60 dni po zakażeniu HIV-1, we wszystkich próbach testowych nie można było wykryć wytwarzania białek HIV względnie prowirusowego DNA HIV ani testem na antygeny ani analizą PCR. Ten wynik może oznaczać, że w linii komórek SSU K3/1-SXK2 wytworzony antysensowny RNA nie tylko zapobiega drugiemu etapowi cyklu replikacyjnego HIV (transkrypcja i translacja prowirusowego DNA) ale także hamuje już pierwszy etap cyklu replikacyjnego. Antysensowny RNA może najwyraźniej zapobiegać tworzeniu się prowirusowego DNA z genomowej nici /+/ RNA przez proces odwrotnej translacji. To działanie antysensownego RNA przyjęto spekulatywnie, jednak dotychczas nie zostało ono wykazane (R. Y.L. To i P.E. Neiman, Gene Regulation, Biology of antisense RNA and DNA, wyd. R.P. Erickson i J.G. Izant, Raven Press Ltd., Nowy Jork 1992), ponieważ dotychczas nie znaleziono odpowiednio wydajnych konstruktów wektorów ekspresyjnych. Opisy figur Figura 1 Wektor ekspresyjny KTX 11, do ekspresji antysensownego RNA HIV-1. Promotor metalotioneiny (MTI) uruchamia transkrypcję antysensownego RNA z prowirusowego fragmentu DNA HIV-1, obejmującego nukleotydy 5786 —> 474 (numeracja: UWGCG GENEMBL DATA BANK File; HIV HXB2CG.VIRAL). Terminacja transkryptów antysensownego RNA następuje przez sekwencję poliadenylacji SV 40. Transkrypcja genu oporności na neomycynę TRN5neo jest zainicjowana przez wczesny promotor SV 40. Wektor wahadłowy zawiera także początek pBR322 oraz gen ampicyliny (pBr 322-amp). Dalsze szczegóły opisano w przykładzie I. Figura 2 Wektor ekspresyjny KTX 12, do ekspresji antysensownego RNA H IV-1 pod kontrolą promotora hybrydowego metalotioneiny LTR HIV-1. Szczegóły budowy wektora są opisane w przykładzie II. Figura 3 Wektor ekspresyjny KTX 15, do ekspresji antysensownego RNA HIV-1 pod kontrolą promotora hybrydowego metalotioneiny LTR HIV-1, w którym jest delecja sekwencji TAR

175 143

13

HIV-1 dla osiągnięcia maksymalnej ekspresji bez obecności białka transaktywatora TAT. Szczegóły budowy wektora opisano w przykładzie III Figura 4 Wektor ekspresyjny pSXK 1, do ekspresji antysensownego RNA HIV-1 pod kontrolą promotora wirusa cytomegalii (CMV). Szczegóły budowy wektora są opisane w przykładzie IV. Figura 5 Wektor ekspresyjny pSXK 2, do ekspresji antysensownego RNA HIV-1 pod kontrolą promotora cytomegalowirusa (CMV). Prowirusowy fragment DNA HI V-1 ze środkowego regionu genomu HIV obejmuje w tym przykładzie nie sekwencje z regionu 5' jak w przykładach I do IV, ale sekwencję z regionu POL/VIF. Szczegóły budowy wektora opisano w przykładzie V. Figura 6 Orientacyjny digram dla przygotowania fragmentów genowych HIV-1, które w antysensownej orientacji 3' —>5' (kierunek strzałki) są zawarte w wektorach ekspresyjnych antysensownego RNA, z oznaczeniami podanymi w kolumnie 1. Promotor odpowiedniego wektora ekspresyjnego jest podany w kolumnie 2, w kolumnie 3 numeracja nukleotydów sekwencji HI V według UWGCG GENEMBL DATA BANK file: HIVHXB2CG.VIRAL. Figura 7 Analiza Southern Blot, po amplifikacji PCR, chromosomowego DNA z klonowanego transfektanta U 937, który zawiera wektor ekspresyjny pSXK1 zintegrowany w chromosomowym DNA. Wielkość fragmentu produktów PCR, oraz hybrydyzacja z sondą genową HIV, która nie zawiera sekwencji primera produktów PCR, wskazują na nienaruszony charakter sekwencji promotor/insert. 1. Wektor próby kontrolnej, połączenie 5', fragment z 887 par zasad 2. Wektor próby kontrolnej, połączenie 3', fragment z 775 par zasad 3. Chromosomowy DNA, połączenie 5', fragment z 887 par zasad 4. Chromosomowy DNA, połączenie 3', fragment z 775 par zasad. Dalsze szczegóły podano w przykładzie IX. Figura 8 Wykrywanie fragmentu genu HIV-1 w chromosomowym DNA z klonowanych transfektantów HUT 78, przy pomocy amplifikacji PCR. Reakcję PCR rozdzielono na żelu agarozaTAE i po barwieniu bromkiem etydyny fotografowano w świetle UV. Produkt PCR obejmuje 561 par zasad i odpowiada fragmentowi genu HIV-1(nukleotydy 699-1305), który jest również składnikiem wektora pSXK1, Produkt PCR o długości 561 bp pokazuje strzałka. M = standard długości DNA, pokazane są 516 bp i 1018 1 = kontrola ujemna, DNA nie dodano do reakcji PCR 2 = chromosomowy DNA z komórek U 937 (typ dziki) 3 = chromosomowy DNA z komórek HUT 78 (typ dziki) 4 = kontrola ujemna, DNA nie dodano do reakcji PCR 5 = kontrola dodatnia 6 = chromosomowy DNA z transformantów HUT 78 (SSHUT 6/1 107-9/1) 7 = chromosomowy DNA z transformantów HUT 78 (SSHUT 6/1 107-9/1) 8 = chromosomowy DNA z transformantów HUT 78 (SSHUT 6/1 107-9/1) 9 = chromosomowy DNA z transformantów HUT 78 (SSHUT 6/1 107-9/1) Figura 9 Wykrywanie fragmentu genu HIV-1 (nukleotydy 4158-5792) w chromosomowym DNA w monocytów U 937 i limfocytów T HUT 78, przy pomocy amplifikacji PCR. Komórki uprzednio transfekowano wektorem pSXK2. Reakcję PCR rozdzielono na żelu agaroza TAE i po barwieniu bromkiem etydyny fotografowano w świetle UV. Produkt PCR obejmuje cały fragment genu HIV-1 w pSXK2 (nukleotydy 4158-5792) i ma długość 1811 bp. Strzałka pokazuje produkt PCR o długości 1811 bp. M = standard długości DNA, 1635 bp i 2036 bp są pokazane 1 = kontrola ujemna, DNA nie dodano reakcji PCR

14

175 143

2 3 4 5

= chromosomowy DNA z komórek U 937 (typ dziki) = chromosomowy DNA z komórek HUT 78 (typ dziki) = chromosomowy DNA z transformantów HUT 78 (SSUK 3/1 107-12/1) = chromosomowy DNA z transformantów U 937 (SSUK 3/1 107-12/1) Figura 10 Analiza Northern Blot dla oznaczenia szeregu transkryptów antysensownego RNA w transfekowanej, klonowanej linii komórek U 937, która zawiera wektor ekspresji KTX 11 w linii komórek SSUK 20/15-KTX1 1b. Przy pomocy sondy genowej, która odpowiada wstawce DNA wektora KTX 11, w RNA linii komórek opornych na wirus (pasmo 1) można stwierdzić co najmiej trzy transkrypty antysensownego RNA, o długości 800,1200 i 3200 bp. Pasmo 2 zawiera RNA z nie transfekowanej linii komórek U 937 (kontrola ujemna). Pasmo 3 zawiera standardy ciężaru cząsteczkowego. Figura 11 Przebieg wytwarzania antygenu HIV-1 w ciągu 60 dni po zakażeniu (w dniu zero) linii komórek HUT 78 izolatem HIV-1 LAV/BRU. Na osi rzędnych podano gęstości optyczne przy 450 nm (OD450nm) wyników testu ELISA HIV z płynem z hodowli komórek. Przy gęstości optycznej > 2 ,0 płyn z hodowli rozcieńczano i podaną wartość wyliczano z rozcieńczenia. Wartość odciętej przedstawia granicę wykrywalności oznaczenia antygenu HIV. W liniach komórek SSHUT K 16/2-SXK1 i SSHUT K1/1-SXK2, wykazujących ekspresję antysensownego RNA, replikacja HIV jest całkowicie zahamowana w okresie 60 dni. W linii komórek HUT K14-KTX11 początek replikacji HIV jest opóźniony w porównaniu z nietransfekowaną linią komórek typu dzikiego HUT 78. Figura 12 Przebieg wytwarzania antygenu HIV-1 w okresie 60 dni po zakażeniu (w dniu zero) linii komórek U 937 izolatem HIV-1 LAV/BRU. Na osi rzędnych podano gęstość optyczną przy 450 nm (OD450nm) wyników testu ELISA HIV z płynem z hodowli komórek. Przy gęstości optycznej > 2,0 płyn z hodowli rozcieńczano i podaną wartość wyliczano z rozcieńczenia. Wartość odciętej przedstawia granicę wykrywalności oznaczenia antygenu HIV. W linii komórek SSUK 3/1-SXK2, wykazującej ekspresję antysensownego RNA, replikacja HIV jest w zakresie 60 dni całkowicie zahamowana, pozostałe transfekowane linie komórek wykazują opóźnienie replikacji HIV w porównaniu z linią komórek typu dzikiego (U 937). Figura 13 Analiza PCR celem oznaczenia DNA HIV-1 w liniach komórek, które zawierają wektory ekspresyjne antysensownego RNA i były badane 60 dni po zakażeniu HIV. Barwiona bromkiem etydyny elektroforeza w żelu agarozowym pokazuje produkty PCR chromosomowego DNA z podanych niżej linii komórek. Przy pomocy pary primerów 5'-ATG GAG CCA GTA GAT CCT-3' i 5'-TCT GT TCT ACC ATG TCAT, w komórkach zakażonych HI V poddano amplifikacji fragment PCR długości 702 par zasad z regionu genu TAT-ENV. Dla porównania z wynikiem PCR, w nawiasie podano wynik testu na antygen HIV odpowiednich próbek hodowli komórek. Pasmo M : standard ciężaru cząsteczkowego, zaznaczono 600 bp Pasmo 1 : HUT K14-KTX11, 702 bp dodatni (test antygenowy dodatni) Pasmo 2 : SSHUT K16/2-SXK1, 702 dodatni (test antygenowy ujemny) Pasmo 3 : Produkt PCR z równoległego doświadczenia z zakażeniem jak w paśmie 2 Pasmo 4 : Produkt PCR z równoległego doświadczenia z zakażeniem jak w paśmie 2 Pasmo 5 : SSHUT K1/1-SXK2, 702 dodatni (test antygenowy ujemny) Pasmo 6 : Produkt PCR z równoległego doświadczenia z zakażeniem jak w paśmie 5 Pasmo 7 : Równoległe doświadczenie z zakażeniem jak w paśmie 5 Pasmo 8 : HUT 78, kontrola dodatnia Pasma 9-11: Hodowle SSUK3/1-SXK2 - produkt PCR 702 bp niewykrywalny (test antygenowy ujemny)

175 143

15

Figura 14 Przebieg wytwarzania antygenu HIV w ciągu 30 dni po zakażeniu (w dniu zero) linii komórek HUT 78 izolatem D 194 HIV-2. Na osi rzędnych podano gęstość optyczną przy 450 nm (OD450nm) wyników testu ELIS A HIV z płynem z hodowli komórek. Przy gęstości optycznej > 2,0 płyn z hodowli rozcieńczano i podaną wartość OD wyliczano z rozcieńczenia. Wartość odciętej przedstawia granicę wykrywalności oznaczenia antygenu HI V. W linii komórek SSHUT K1/1-SXK2, wykazującej ekspresję antysensownego RNA replikacja HIV jest w okresie 14 dni całkowicie zahamowana, pozostałe transfekowane linie komórek wykazują opóźnienie replikacji HIV w porównaniu z linią komórek typu dzikiego (HUT 78). Figura 15 Przebieg wytwarzania antygenu HIV w ciągu 30 dni po zakażeniu (w dniu zero) linii komórek U 937 izolatem D 194 HIV-2. Na osi rzędnych podano gęstość optyczną przy 450 nm (OD 450nm) wyników testu ELIS A HIV z płynem z hodowli komórek. Przy gęstości optycznej > 2,0 płyn z hodowli rozcieńczano i podaną wartość OD wyliczano z rozcieńczenia. Wartość odciętej przedstawia granicę wykrywalności oznaczenia antygenu HI V. W linii komórek SSHUT K3/1-SXK2, wykazującej ekspresję antysensownego RNA, replikacja HIV jest w okresie 30 dni całkowicie zahamowana, pozostała transfekowana linia komórek wykazuj ą opóźnienie replikacji HIV w porównaniu z linią komórek typu dzikiego (U 937).

FIG. 2

175 143

FIG. 3

175 143

FIG. 4

175 143

FIG. 5

175 143

175 143

F IG. 6

175 143

FIG.7

175 143

FIG. 9a

FIG.10

FIG.9 b

175 143

FIG. 11

175 143

FIG. 12

175 143

FIG.13

175 143

F IG. 14

175 143

FIG. 15

175 143

FIG. 1