Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce

21. Bioprinting 3D Bioprinting 3D Wojnarowska Wiktoria Katedra Fizyki i Inżynierii Medycznej, Wydział Matematyki i Fizyki Stosowanej, Politechnika Rzeszowska im. Ignacego Łukasiewicza Opiekun naukowy: dr hab. Tomasz Więcek, prof.. PRZ Wojnarowska Wiktoria: [email protected] Słowa kluczowe: druk narządów, biodrukarka, biotusz, zastosowania

Streszczenie Praca dotyczy zagadnień związanych z bioprintingiem 3D, czyli drukiem 3D za pomocą żywych komórek. Jest to innowacyjny sposób druku 3D tkanek miękkich. Jego historia sięga lat’80. XX wieku. Po krótce została opisana historia biodruku. Przedstawiono proces biodrukowania oraz główne technologie wykorzystywane. Zwrócono uwagę na poszczególne komponenty. Na podstawie dostępnej literatury opisano poszczególne zastosowania oraz projekty. W podsumowaniu zwrócono uwagę na wady i zalety biodruku. 1.

Wstęp

Historia druku 3D sięga lat 70. XX wieku, kiedy to Charles Hull opatentował pierwszą oficjalną metodę druku przestrzennego. Założył również pierwszą firmę produkującą drukarki 3D oraz stworzył STL – unikalny format zapisu projektów 3D. Obecnie jedną z najczęściej stosowanych technologii w druku 3D jest FDM (Fused Deposition Modeling), czyli nanoszenie warstwa po warstwie roztopionego filamentu, który łączy się ze sobą. Drukarki 3D pozwalają na wydruk z materiałów twardych takich jak plastiki, metale, żywice. W roku 2000 amerykański bioinżynierii Thomas Boland wpadł na pomysł, aby drukować za pomocą żywych komórek. Zmodyfikował ona własną drukarkę biurową 2D – pojemnik na atrament wypełnił kolagenem i na kartce papieru wydrukował tekst. Udało mu się otrzymać idealne litery. Następnie zaczął drukować żywymi komórkami i otrzymał równie dobry efekt. W 2003 roku Boland opatentował metodę drukowania żywymi komórkami. Zmodyfikował następnie swój projekt, co umożliwiło platformie drukarki poruszanie się w górę i w dół. To umożliwiło druk żywymi komórkami warstwa po warstwie i tak narodził się 3D bioprinting (Wilson i Boland, 2003). 2.

Opis zagadnienia

3D bioprinting jest technologią dość nową i niezbyt jeszcze znaną. Przy drukowaniu 3D żywymi komórkami generalnie wyróżnia się trzy podstawowe kroki czyli prebioprinting, bioprinting i post-bioprinting (Shafiee i Atala, 2016). Zanim interesująca nas tkanka będzie mogła zostać wydrukowana, potrzebne są dane o tym jak tkanka ma wyglądać. Jest to przygotowanie do druku, czyli pre-bioprinting. Należy wtedy wykonać obrazowanie medyczne danej tkanki. Zazwyczaj używa się do tego tomografii komputerowej lub rezonansu magnetycznego. Uzyskane dane należy następnie poddać procesowi obróbki cyfrowej. Wykonuje się model 3D tkanki lub narządu i zapisuje w formacie STL. Po przygotowaniu do druku następuje najważniejszy element, czyli drukowanie. Do biodrukowania potrzebna jest specjalna biodrukarka, bioatrament oraz podłoże, na którym będzie wykonywany druk. W druku 3D żywymi komórkami są stosowane głównie trzy technologie, które zostały przedstawione na poniższej grafice. Laser-assisted bioprinting wykorzystuje do druku pulsującą wiązkę lasera. Wiązka pada na płytkę, która jest wykonana np. ze złota. Laser ogrzewa płytkę i kropelki atramentu spadają z ogrzanego miejsca. Metoda ta stosowana jest m. in. do druku skóry i naczyń krwionośnych.

131 | S t r o n a

Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce Inkjet bioprinting czyli drukowanie kropla po kropli. Komórki są nakładane warstwa po warstwie. Drukarki te można podzielić ze względu na mechanizm generowania kropel: termiczny lub piezoelektryczny. Termiczny sposób generowania kropel działa poprzez generowanie ciepła wewnątrz komory bioatramentowej, co powoduje skok ciśnienia, który uwalnia krople. Natomiast w drugim mechanizmie wykorzystywany jest kryształ piezoelektryczny. W komorze bioatramentowej generowane są fale akustyczne, które wyrzucają przez dyszę drukarki krople bioatramentu. Stosuje się m. in do druku chrząstki ucha i nosa, naczyń krwionośnych, mięśni (ArslanYildiz et al., 2015).

Rys. 3. Podstawowe kroki w procesie bioprintingu.

Rys. 4. Główne technologie używane do bioprintingu: (A) Laser-assisted bioprinting, (B) Inkjet bioprinting, (C) Microextrusion bioprinting. Microextrusion bioprinting to tzw. wytłaczanie, które jest jednym z tańszych systemów. Składa się z systemu dozującego oraz zautomatyzowanego trzyosiowego robotycznego ramienia, sterowanego przez sterownik. Do osadzania bioatramentu na podłożu stosowany jest dozownik mechaniczny (tłok lub śruba) lub pneumatyczny. Metoda stosowana m. in. do druku nerwów, chrząstek, mięśni (Murphy i Atala, 2014). Kolejnym ważnym komponentem w biodruku jest bioatrament. Znalezienie idealnego atramentu jest kluczowe dla dobrych wydruków. Obecnie trwają poszukiwania takiego, który będzie mógł służyć do druku bardziej złożonych struktur i tkanek. Bioatrament jest to mieszanka komórek, hormonów (czynniki wzrostu), polimerów. Komórki macierzyste pobierane są od pacjenta podczas biopsji. Następnie umieszczane są w mieszance, gdzie dzięki czynnikom wzrostu zwielokrotniają swoją objętość. Wykorzystywane są różne mieszanki. Jednym z ostatnio opracowanych jest biotusz, który zawiera dwa składniki polimerowe: naturalny pobierany z alg i sztuczny, który przy wzroście temperatury zmienia się z cieczy w ciało stałe. Inne wykorzystywane materiały to fibryna, żelatyna, PEG, PCL czy PLGA. Substancje te stanowią rodzaj lepiszcza, dzięki któremu komórki są w stanie zachować zaprojektowany przez naukowców kształt. Rusztowanie zostaje na stałe i nadaje tworzonej

132 | S t r o n a

Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce tkance określone cechy lub jest usuwane (białka są trawione przez enzymy) (Arslan-Yildiz et al., 2015). Nadruk jest wykonywany na biopapierze, czyli podłożu hydrożelowym. Stanowi ono rusztowanie dla komórek. Podłoże to musi spełniać różne warunki, aby mogły się na nim rozwijać komórki. Materiał taki musi być biokompatybilny. Umieszczone na nim komórki różnicują się i dojrzewają. W zależności od tkanki czas dojrzewania jest różny. Może to być nawet trzy tygodnie. Dojrzałe tkanki gotowe są do implementacji lub do przeprowadzania na nich testów (Mandrycky et al., 2015).

Rys. 5. Najczęściej stosowane biodrukarki przy wydrukach żywymi komórkami. Tab. 5. Podsumowanie dla metod wydruku 3D tkanek. Laser bioprinting

Inkjet bioprinting

Microextrusion bioprinting

Czas przygotowania

Średni-wysoki

Niski

Niski-średni

Szybkość wydruku

średnio

Szybko

Wolno

Kontrola wydruku pojedynczej kropli

wysoka

Niska

niska

Koszt

Wysoki

Niski

średni

Rys. 6. Proces bioprintingu 3D: (A) Pozyskiwanie kkomórek i wytwarzanie biotuszu, (B) Biodruk, (C) Sieciowanie, (D) Dojrzewanie tkanki. 133 | S t r o n a

Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce 3.

Przegląd literatury

Tkanki do badań wytwarzane są już od dawna metodami konwencjonalnymi. Jest możliwe wytworzenie tkanek o strukturze 3D. Jednakże wytwarzanie tkanek w ten sposób jest czasochłonne i proces ten nie jest do końca kontrolowany. Nie jest możliwe wytworzenie tkanek o takiej samej architekturze bądź porowatości, co tkanka odwzorowywana. Inaczej jest przy bioprintingu 3D. Tutaj możemy otrzymać tkankę, którą wcześniej zaprojektujemy w oprogramowaniu CAD (Kumar i Han, 2016). Tkanki wytwarzane technologią druku 3D żywymi komórkami znajdują coraz nowsze zastosowania. Coraz więcej ośrodków uniwersyteckich, badaczy i prywatnych firm zajmuje się technologią bioprintingu. Większość z nich zajmuje się konkretnymi projektami.

Rys. 7. Zastosowania bioprintingu 3D. Kości. Każdego roku ponad 2.2 miliony ludzi na całym świecie potrzebuje przeszczepu kości. Aktualnie wykorzystuje się połączenie kości własnej pacjenta wraz z syntetycznym cementem. Nie jest to jednak rozwiązanie idealne ze względu na to, że materiały takie nie mają odpowiedniej integralności mechanicznej lub nie pozwalają na tworzenie nowej tkanki. Dlatego też na Uniwersytecie w Swansea działa zespół, który zajmuje się wytwarzaniem matryc kostnych. Matryce te dokładnie odwzorowują kształt kości pacjenta. Do wytworzenia tych matryc używa się biokompatybilnego materiału, który nie tylko jest trwały ale umożliwia regenerację kości. Wydrukowane matryce wszczepia się pacjentowi i przez kilka miesięcy łączą się one z kośćmi pacjenta. W końcu tkanka pacjenta zastępuje całkowicie wszczepioną matrycę. Badania nad drukiem kości trwają też w innych ośrodkach m. in. na Uniwersytecie w Nottingham. Ich wydruki to kopie kości, które mają zostać zastąpione, czyli tzw. scaffoldy. Gotowy wydruk jest wszczepiany pacjentowi i po około trzech miesiącach jest zastąpiony przez nową kość (Sawkins et al., 2015). Skóra. Przy obszernych poparzeniach przeszczepia się skórę z innego fragmentu ciała poparzonego, jednak nie we wszystkich przypadkach jest to wystarczające. Badacze w Wake Forest School of Medicine zaprojektowali, zbudowali i przetestowali drukarkę, która precyzyjnie aplikuje żywe komórki skóry bezpośrednio na ranę. Jedną z podstawowych zalet tego systemu jest to, że nie jest ograniczony przez rozmiar rany. Najpierw rana jest skanowana, aby system wiedział jak jest duża 134 | S t r o n a

Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce i głęboka. Informacje są przesyłane do drukarki i może nastąpić drukowanie. W przeciwieństwie do tradycyjnego przeszczepu, potrzebna jest dużo mniejsza łata skóry. Technologia jest jeszcze w fazie eksperymentalnej, ale według badaczy ma być dostępna do powszechnego użytku w ciągu kilku lat (Binder et al., 2010). Organovo również pracuje nad drukowaną skórą. W 2016 roku ten koncern nawiązał współpracę z L’Oreal. Ten znany producent kosmetyków będzie przeprowadzał testy bezpieczeństwa i skuteczność swoich produktów na wydrukowanej skórze. Laboratorium będzie mogło przeprowadzać testy na różnych typach skóry. Włosy. Wspomniana już wcześniej firma L’Oreal nawiązała także w 2016 roku współpracę z Poietis w celu wydrukowania komórek mieszka włosowego, który odpowiada za wytwarzanie włosów. Do tej pory nie było prób druku mieszków włosowych, ale L’Oreal spodziewa się, że dopracowanie metody zajmie co najmniej trzy lata. Najpier mieszki włosowe będą wykorzystywane do testowania kosmetyków, jednak koncerny liczą na to, że będzie możliwość przeszczepiania ich osobom, które utraciły własne owłosienie. Firma Poietis wykorzystuje laserową technologie bioprintingu. Naczynia krwionośne. Organovo w 2013 roku ogłosiło, że rozpoczyna regularną produkcję ludzkich naczyń krwionośnych. Zapowiedzieli również, że tak wyhodowane by-passy będą wszczepiać pacjentom (Li et al., 2016).

Rys. 8. Schemat przedstawia opracowaną przez naukowców Organovo metodę druku 3D żył: (A) Przygotowanie podłoża, (B) Nadruk tuszu na podłożu hydrożelowym, (C) Nadbudowanie kolejnych warstw, (D) Połączenie tkanki i zanikanie warstw rozdzielających, (E) Dalsze zrastanie tkanki, (F) Powstanie gotowego wycinka naczynia krwionośnego. Wątroba. W 2012 roku Organovo wydrukowało plaster wątroby, który zachował swoje funkcje przez 40 dni. Tak wydrukowany fragment wątroby reagował na paracetamol i inne lekarstwa tak jak normalna wątroba. Wydrukowane tkanki nazwano exVive 3D Liver. Na razie tak wydrukowana tkanka jest używana do badań leków, które według Organovo są szybsze, a przez to tańsze. W przyszłości planują wykorzystywać drukowane tkanki do naprawy wątroby (Shafiee i Atala, 2016). Nerka. Nad jej wydrukiem pracują naukowcy z Organovo a także z wspomnianego wcześniej Wake Forest. Projekty obu grup są w fazie początkowej, a więc dalekie od funkcjonalnych (Murphy i Atala, 2014). Komórki nerwowe. Na Uniwersytecie Technologicznym w Michigan jest zespół, który pracuje nad wytworzeniem komórek nerwowych 3D. Miałyby one być wykorzystywane m. in. do regeneracji nerwów u pacjentów z urazami rdzenia kręgowego. Jednak w tym momencie naukowcy pracują nad odpowiednim biotuszem. Natomiast naukowcy z Centre of Excellence for Electromaterials Science pracują nad „benchtop brain”, który miałby być wydrukowany za pomocą wymyślonej przez nich biodrukarki 3D. „Benchtop brain” miałby odwzorowywać strukturę ludzkiego mózgu. Ucho. Naukowcy z Princeton pracują nad bionicznym uchem, które zawierałoby elementy elektroniczne. Stworzyli oni ucho, które dzięki specjalnemu przewodzącemu polimerowi, składającemu się z napromieniowanych nanocząstek srebra. Pozwoliło to na hodowlę chrząstki in vitro wokół anteny indukcyjnej w uchu, która następnie umożliwia odczyt sygnałów sprzężonych indukcyjnie z elektrod ślimakowych. Udało im się scalić funkcje biologiczne i nanoelektroniczne poprzez drukowanie 3D (Manoor et al., 2013).

135 | S t r o n a

Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce Organoidy. Są to miniaturowe organy takie jak serce i wątroba.. Zostały one już wydrukowane prze naukowców z Wake Forest. Ich rozmiar jest zbliżony do szerokości włosa, a organy te naśladują pracę swoich dużych odpowiedników. Organoidy mają w przyszłości służyć do testów leków, a przez to wspomóc a nawet ograniczyć testy na zwierzętach. Ich utworzenie może się również przyczynić do wytworzenia organów w wymiarze 1:1 w stosunku do ludzkich. Biodruk 3D jest wykorzystywany do lepszego poznania nowotworów. Za pomocą bioprintingu można zapoczątkować proces wzrostu nowotworu. Drukuje się zdrową tkankę z kilkoma komórkami nowotworowymi. Z upływem czasu nowotwór wzrasta a naukowcy mogą ten proces obserwować. Sprawdza się również jak wpływają warunki środowiskowe na wzrost tego nowotworu. Jest to tani model guza, który służy do obserwacji wzrostu, migracji komórek i angiogezy. Taki model służy również do badań jak dany lek wpływa na rozwój takiego guza. Do nowotworu podaje się substancje lecznice i obserwuje ich wpływ na rozwój (Knowlton et al., 2015). Biodrukowane modele nowotworu są idealnym kandydatem do zastąpienia testów na zwierzętach bądź do wsparcia takich testów przed sprawdzeniem nowego leku na człowieku. Poza nowotworami bioprinting daje również możliwość badań medycznych, badań nad lekami i ich bezpieczeństwa. Tkanki drukowane mają wspólne cechy z tkankami wytworzonymi naturalnie. Dzięki temu naukowcy mogą zbadać wpływ różnych chorób, postępu choroby i możliwych sposobów leczenia w rodzimym środowisku. Może to wspomóc szybsze sprawdzenie toksyczności i wpływu nowego leku na organizm ludzki (Varkey i Atala, 2015). Wspomniana wcześniej tkanka nerwowa, która naśladuje strukturę tkanki mózgowej może zostać wykorzystana do testowania nowych produktów i leków na tkankach, które dokładnie odzwierciedlają ludzką tkankę mózgową, a nie zwierzęcą. Leki podczas badania na zwierzętach mogą wywołać inną reakcję niż na tkance ludzkiej. Tak wydrukowana tkanka może zostać wykorzystana do badań nad zaburzeniami mózgu takimi jak schizofrenia czy choroba Alzheimera. 4.

Podsumowanie i wnioski

Podsumowując bioprinting jest technologią, która jest obecnie aktywnie rozwijana. Mimo tego, że bioprinting posiada także wady, to wobec licznych zalet są one nikłe. Naukowcy mają wielkie oczekiwania wobec tej technologii, a także liczne pomysły na jej zastosowanie. Jeżeli chodzi o wady to bioprinting nie jest jeszcze technologią dopracowaną i jest narażony na błędy. Organy póki co były wszczepiane tylko małym organizmom i brak jest jeszcze takich testów na ludziach. Wydrukowanie organu wielkości 1:1 dla człowieka jest jeszcze problemem. Niestety potrzeba jeszcze wielu lat, żeby stało się to możliwe. Do tego wszystkiego dochodzi jeszcze koszt wszystkich komponentów. Jest to jeszcze technologia droga, ponieważ jest dość nowa. Natomiast jeżeli chodzi o zalety to jedną głównych jest to, że czas oczekiwania na organy skróciłby się do zaledwie kilku tygodni. Ocaliłoby to życie wielu ludzi, którzy obecnie na przeszczep czekają latami. Poza tym organ byłby spersonalizowany, czyli wykonany z komórek pacjenta i nie powinien zostać odrzucony. Pacjenci nie musieliby po przeszczepie zażywać leków zapobiegających odrzuceniu przeszczepu. Do tego, mimo, że komponenty takie jak drukarka są drogie to produkt wytworzony jest o wiele tańszy niż wytwarzanie metodami konwencjonalnymi. Jest to także metoda dużo szybsza niż ręczne tworzenie tkanek. Ponadto drukowanie tkanek zmniejszyłoby zdecydowanie testy na zwierzętach. Można nawet przewidywać, że zaprzestano by takich testów całkowicie. Oczywiście rodzą się także pytania o aspekty etyczne wykorzystania w jakikolwiek sposób żywych ludzkich komórek. Trzeba mieć pewność, że Ci którzy wykorzystują tą technologię nie użyją jej w sposób nieetyczny. Jednakże trzeba sobie uświadomić, że dzięki drukowaniu żywymi komórkami będzie można ocalić wiele żyć ludzkich, których dziś nie da się uratować. 5.

Literatura:

Arslan-Yildiz Ahu, Assal Rami El, Chen Pu et al.(2015) Towards artificial tissue models:past, present, and future of 3D bioprinting, Biofabrication 8(1):014103. Binder KW, Zhao W, Aboushwareb T et al. (2010), In situ bioprinting of the skin for burns. J. Am. Coll. Surg. 211(3), S76.

136 | S t r o n a

Badania i Rozwój Młodych Naukowców w Polsce Knowlton S, Onal S, Yu CH et al. (2015), Bioprinting for cancer research, Trends in Biotechnology 33(9): 504-513. Kumar A, Han SS (2016) Emergence of Bioprinting in Tissue Engineering: A mini Review, Advances in Tissue Engineering and Regenerative Medicine Open Access 1(3): 00013. DOI: 10.15406/atroa.2016.01.00013 Li J, Chen M, Fan X et al., (2016) Recent advances in bioprinting techniques: approaches, applications and future prospects, Journal of Translational Medicine 14: 271. Mandrycky, C, Wang Z, Kim K et al. (2015), 3D bioprinting for engineering complex tissues, Biotechnol Adv vo. 34(4): 422-434. Manoor MS, Jiang Z, James T et al. (2013) 3D Printed Bionic Ears, Nano Lett 13(6): 2634-2639. Murphy Sean V., Atala Anthony (2014) 3D Bioprinting of Tissues and Organs, Nature Biotechnology 32 (8): 773-785. Sawkins MJ, Mistry P, Brown BN et al. (2015) Cell and protein compatible 3D bioprinting of mechanically strong constructs for bone repair, Biofabrication 7(3):035004 Shafiee Ashkan, Atala Anthony (2016) Printing Technologies for Medical Application, Trends in Molecular Medicine 22(3): 254-265. Varkey M, Atala A. (2015) Organ Bioprinting: a closer look at ethics and policies. Wake Forest Journal of Law & Policy (5):275-531. Wilson WC, Boland Thomas (2003) Cell and organ printing 1:Protein and Cell printers, The Anatomical Record 272(2):491-496.

137 | S t r o n a