1. Proteinnachweis mit Bradford-Farbreagenz Man benötigt: 96-well-Platte Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml) Pipetten (10, 20 und 200 µl) Pipettenspitzen Proteinvorratslösung (1 mg/ml Albumin in destillierten Wasser) Destilliertes Wasser Bradford Farbreagenz (vorher 1:5 verdünnt) Aufgaben: Eichgerade erstellen, zeichnen und auswerten. Die Konzentration der Proteine in der unbekannten Probe bestimmen. Durchführung:  Fünf Eppendorf-Reagiergefäße für die Standardreihe vorbereiten und beschriften.  In das erste Gefäß 0 µl der Proteinvorratslösung geben.  In das zweite Gefäß 5 µl der Proteinvorratslösung geben.  In das dritte Gefäß 10 µl der Proteinvorratslösung geben.  In das vierte Gefäß 15 µl der Proteinvorratslösung geben.  In das fünfte Gefäß 20 µl der Proteinvorratslösung geben.  Jedes der Gefäße mit destillierten Wasser auf 40 µl auffüllen und gut mischen.  Jeweils 20 µl der Standardreihe in je ein well einer 96-well-Platte pipettieren.  20 µl der unbekannten Probe in zwei wells pipettieren.  Zu der Standardreihe und der Probe jeweils 200 µl der Bradford Farbreagenz zugeben (alle zugleich!).  Die Platte für 15 Minuten auf Raumtemperatur inkubieren.  Die Platte im Photometer (Platereader) bei 595 nm vermessen.  Eichgerade zeichnen und auswerten (x-Achse = mg/ml Protein; y-Achse = Extinktion).  Mithilfe der Eichgerade die Konzentration der unbekannten Probe bestimmen (in mg/ml Protein).

Beispiel einer Eichgerade

1

2. Blutzuckermessung Man benötigt: Blutzuckermessgerät Blutzuckermesstreifen Lanzetten Stechhilfe Aufgabe: Bestimmung des Glucosegehaltes des Bluts (vor und nach dem Essen) Durchführung:  Hände gründlich waschen  Messstreifen in Messgerät stecken  Warten bis das Gerät einen blinkenden Blutstropfen anzeigt  Lanzette in die Stechhilfe einspannen und Schutz entfernen  Mithilfe der Stechhilfe in die Fingerkuppe stechen  Einen Blutstropfen auf die Spitze des Messstreifens geben  Warten bis das Gerät den Messwert anzeigt (in mg/dl)  Lanzette und Messstreifen in verschließbaren Behälter entsorgen (Verletzungsgefahr!)

2

3. Triglyceridnachweis aus Plasma Man benötigt: 96-well-Platte Lanzetten Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml) Pipetten (10µl, 200µl, 1000µl) Pipettenspitzen Box mit Eis 0,5 M EDTA 0,9% NaCl-Lösung Triglycerid-Reagenz (Infinity Triglycerides) 4mM Glycerin Aufgaben: Gewinnung von Plasma aus einer Blutprobe Die Konzentration der Triglyceride im Blutplasma bestimmen. Durchführung:  In ein Regiergefäß 5 µl der 0,5 M EDTA-Lösung geben.  Mit Lanzette in Fingerkuppe stechen und Blut in das Reagiergefäß rinnen lassen (ca. 50 µl).  Reagiergefäß gut mischen und auf Eis stellen.  Blutprobe bei 3500 rpm für 10 Minuten abzentrifugieren.  Die klare Flüssigkeit (= Plasma) vorsichtig abpipettieren und in neues Reagiergefäß geben.  Plasmaprobe auf Eis stellen, der Rest kann entsorgt werden.  Sechs Eppendorf-Reagiergefäße für die Standardreihe vorbereiten und beschriften.  In das erste Gefäß 5 µl der 4mM Glycerinlösung geben.  In das zweite Gefäß 5 µl der 4mM Glycerinlösung geben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen.  In das dritte Gefäß werden 5µl aus dem zweiten Gefäß gegeben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen.  In das vierte Gefäß werden 5µl aus dem dritten Gefäß gegeben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen.  In das fünfte Gefäß werden 5µl aus dem vierten Gefäß gegeben + 5 µl 0,9% NaCl; gut mischen.  In das sechste Gefäß werden 5µl der 0,9% NaCl-Lösung gegeben (Nullwert).  Jeweils 2 µl der Standardreihe in ein well einer 96-well-Platte pipettieren (auf Eis!).  2 µl vom Blutplasma in ein well pipettieren.  Zu der Standardreihe und der Probe jeweils 200 µl des Triglycerid-Reagenz geben (alle zugleich!!!).  Die Platte für 10 Minuten auf 37°C inkubieren.  Die Platte im Photometer (Platereader) bei 500 nm vermessen.  Eichgerade zeichnen und auswerten (x-Achse = mg/ml Glycerin; y-Achse = Extinktion).  Mithilfe der Eichgerade die Konzentration des Blutplasmas bestimmen (in mg/ml Glycerin).

3

4. pH-Wert einer Urinprobe bestimmen Man benötigt: Spritzflasche mit destillierten Wasser Urinprobe Kalibrierlösungen für pH-Meter (pH 4,01; 7,00 und 10,01) Aufgaben: Kalibrieren des pH-Meters Bestimmung des pH-Werts einer Urinprobe Durchführung:  pH-Messgerät einschalten.  Zur Kalibrierung auf „CAL“ drücken.  Geeigneten Puffer auswählen und „CAL“ drücken, nicht verwendete Puffer ausschalten.  Elektrode aus dem Lagerpuffer holen und gründlich mit destillierten Wasser spülen.  Elektrode in die zu messende Pufferlösung tauchen.  Auf dem Bildschirm „Kalibrier“ auswählen und „CAL“ drücken.  Den Anweisungen auf dem Bildschirm folgen.  Nach dem Kalibrieren die Elektrode gründlich mit destillierten Wasser spülen.  Elektrode in die Probelösung tauchen und Messwert vom Bildschirm ablesen.  Nach dem Gebrauch Elektrode nochmals gründlich mit destillierten Wasser spülen.  Elektrode zurück in den Lagerpuffer geben.  pH-Messgerät ausschalten.

4

5. SDS-Page mit Proteinen Man benötigt: Pipetten (10 µl, 100µl und 1000 µl) Messzylinder (1000 ml) Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml) Stripetten (25 ml) Pipettierhilfe Proteinprobe Petrischale 20x MOPS Running Buffer Gel für die Elektrophorese (4-12% Bis-Tris-Gel mit 15 wells) 4x LDS Sample Buffer Proteinstandard 0,5 M DTE Antioxidans-Lösung Simply Blue Safe Stain (Coomassie dye) Aufgaben: Auftrennen einer Proteinprobe über Gelelektrophorese. Sichtbarmachen der Proteinbanden am Gel. Durchführung:  In ein Reagiergefäß werden die gewünschte Menge an Protein + 7,5 µl 4x LDS Sample Buffer + 1 µl 0,5 M DTE gegeben und mit destillierten Wasser auf 25 µl aufgefüllt.  Den Ansatz für 10 Minuten auf 70°C inkubieren.  In einem Reagiergefäß den Proteinstandard vorbereiten: 15 µl destilliertes Wasser + 10 µl Protein Standard + 5 µl 4x LDS Sample Buffer.  30 ml vom 20x MOPS Running Buffer in den 1000 ml Messzylinder geben und mit destillierten Wasser auf 600 ml auffüllen.  Das Gel aus der Verpackung nehmen, mit Wasser spülen und vorsichtig den Kamm sowie den weißen Streifen entfernen.  Gele mit der Schrift nach außen in die Elektrophoresekammer einspannen (darauf achten das sie sich auch richtig schließen lässt!).  Den MOPS-Buffer in den Zwischenraum zwischen den zwei Gelen schütten (bis über die Slots des Geles; es muss dicht sein!) und 500 µl der Antioxidans-Lösung dazugeben.  Den restlichen Buffer in die Elektrophoresekammer schütten.  Die Slots der Gele mit der Bufferlösung durchspülen (mit Pipette auf- und abpipettieren).  Den Standard und die Proteinproben vorsichtig und langsam in die Gelslots pipettieren (darf nicht in ein anderen Slot gelangen!). In leerbleibende Slots 15µl destilliertes Wasser + 5 µl 4x LDS Sample Buffer pipettieren.  Elektrophoresekammer verschließen und die Elektrophorese für 1 Stunde bei 175 Volt laufen lassen.  Nach der Gelelektrophorese das Plastik um das Proteingel vorsichtig öffnen und das Gel in eine Petrischale legen.  Ca. 20 ml des Simply Blue Safe Stains zum Gel geben.  Das Gel für 1 Stunde auf einem Schüttler mit geringen rpm geben.  Nach der Stunde sind die Proteinbanden am Gel sichtbar.

5

6. DNA-Isolation aus Bakterienzellen Man benötigt: Pipetten (100µl und 1000 µl) Pipettenspitzen Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml) Becherglas Destilliertes Wasser P1 Buffer (50mM Tris-HCl pH 8,0; 10 mM EDTA; 100µg/ml RNase A) TENS Buffer (50 mM NaOH; 5 mM HCL; 0,5% SDS) 3 M Natriumacetat pH 5,2 100% Ethanol 70% Ethanol Aufgaben: Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen Durchführung:  1,5 ml der Bakterienkultur werden in ein Reagiergefäß gegeben und bei 5000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert.  Der Überstand wird abgeschüttet oder abpipettiert (vorsichtig damit das Pellet nicht mitentsorgt wird)  Das Pellet wird in 50 µl des P1 Buffers gelöst (auf- und abpipettieren)  Zur Lösung werden 300 µl des TENS Buffers gegeben und wird durch fünfmaliges invertieren des Reagiergefäßes durchmischt.  Danach werden 100 µl des 3 M Natriumacetatlösung zur Probe gegeben und erneut gemischt.  Erneut bei 5000 rpm für 5 Minuten zentrifugieren.  Der Überstand wird in ein neues Reagiergefäß überführt (vorsichtig pipettieren).  Zum Überstand wird 1 ml eiskalter 100% Ethanol gegeben.  Erneut bei 5000 rpm für 5 Minuten zentrifugieren.  Der Überstand wird abpipettiert und das Pellet wird mit 0,5 ml 70% Ethanols gewaschen (vorsichtig invertieren).  Das Ethanol wird nach dem Waschen vorsichtig abpipettiert (es muss sämtliche Flüssigkeit entfernt werden) und das Pellet wird für 10 Minuten bei geöffneten Reagiergefäß luftgetrocknet.  Das luftgetrocknete Pellet wird in 30 µl destillierten Wassers gelöst (auf- und abpipettieren).  Bei dem gelösten Pellet handelt es sich um die Plasmid-DNA (Ansatz A).

6

7. Schneiden von Plasmiden mit Enzymen Man benötigt: Pipetten (2µl und 20 µl) Pipettenspitzen (mit Filter) Eppendorf-Reagiergefäße (1,5 ml) Box mit Eis Plasmid-DNA Restriktionsenzyme Buffer für die Enzyme (CutSmart Buffer und NEBuffer 3.1) Aufgaben: Schneiden des HisMax C Plasmids mit zwei Restriktionsenzymen. Durchführung:  Jeweils 1 µg der Plasmid-DNA in zwei Reagiergefäß (Ansätze B und C) pipettieren und auf 16 µl mit destillierten Wasser auffüllen.  2 µl vom Enzymbuffer sowie zum Ansatz B 1µl eines Restriktionsenzyms und zum Ansatz C jeweils 1 µl von zwei Restriktionsenzymen dazu pipettieren (Enzyme mit Filterspitzen langsam „einrühren“).  Ansätze bei 37°C in ein Wasserbad für 30 Minuten inkubieren.  Nach den 30 Minuten ist die Plasmid-DNA geschnitten und kann auf ein Agarosegel aufgetragen werden.

7

8

8. Gelelektrophorese mit DNA Man benötigt: Pipetten (10 µl und 100 µl) Pipettenspitzen Erlmeyerkolben Messzylinder DNA-Probe 1x TAE-Buffer Agarose 6x Loading Dye DNA-Farbstoff DNA-Standard (GeneRuler Laddermix) Aufgaben: Auftrennung und Sichtbarmachung von DNA. Durchführung:  Die Gelkammern sowie die Gussform für das vorbereiten.  Für ein 140 ml 1%iges Agarosegel mit 20 Slots werden 1,4 g Agarose eingewogen.  Die Agarose wird in einen Erlmeyerkolben gegeben und es werden 140 ml 1x TAE-Buffer dazugegeben.  Der Buffer wird nun bis zum Aufkochen erhitzt (die Lösung muss klar sein).  Danach werden 12 µl des DNA-Farbstoffes zur Agaroselösung gegeben.  Die Lösung in die Gussform schütten und sichergehen das keine großen Luftblasen vorhanden sind.  Die „Kämme“ für die Slots im Gel einsetzen.  Das Gel aushärten lassen (dauert circa 30 Minuten)  In der Zwischenzeit zu der vorher im Punkt 6 gewonnenen DNA (Ansatz A) 5 µl des 6x Loading Dye geben. Zu der in Punkt 7 geschnittenen Plasmid-DNA (Ansätze B und C) jeweils 3,3 µl des 6x Loading Dye geben. Zusätzlich als Kontrolle 1 µg des ungeschnittenen Plasmids aus Punkt 7 in neues Reagiergefäß pipettieren und auf 20 µl mit destillierten Wasser auffüllen (Ansatz D). Zum Ansatz D ebenfalls 3,3 µl des 6x Loading Dye geben.  Nachdem das Gel ausgehärtet ist, vorsichtig die Kämme entfernen und es in die Elektrophoresekammer geben.  Die Elektrophoresekammer mit 1x TAE-Buffer auffüllen bis das Gel komplett in der Flüssigkeit eingetaucht ist.  Vorsichtig den DNA-Standard sowie die DNA-Proben (Ansätze A, B, C und D) in die Slots pipettieren (darf nicht in die anderen Slots gelangen).  Das Gel für 45 Minuten bei 110 Volt laufen lassen.  Danach kann man unter UV-Licht (Augen schützen!) die DNA-Banden erkennen.

9