Aus der Chirurgischen und Gynäkologischen Kleintierklinik der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München Vorstand: Prof. Dr. Dr. habil. U. Matis

Arbeit angefertigt unter der Leitung von Prof. Dr. Dr. habil. R. Köstlin und Prof. Dr. habil. C. A. Deeg

Zum Sudden Acquired Retinal Degeneration Syndrome (SARDS) beim Hund Inaugural-Dissertation zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwürde der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München

von Barbara Katharina Braus aus Marburg

München 2008

Gedruckt mit Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig Maximilians Universität München

Dekan:

Univ.-Prof. Dr. J. Braun

Referent:

Prof. Dr. R. Köstlin

Korreferent:

Jun. Prof. Dr. C. Deeg

Tag d. mündl. Prüfung:

18.7.2008

2

Meinen lieben Eltern

3

Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... 5 I. Einleitung ............................................................................................................... 6 II. Literaturübersicht................................................................................................. 8 2.1. Klinik ......................................................................................................................... 8 2.2. Ätiologie .................................................................................................................... 8 2.2.1. Toxische Ursachen ............................................................................................................... 9 2.2.2. Genetische Ursache ............................................................................................................. 9 2.2.3. Stoffwechselbedingte Ursache ............................................................................................. 9 2.2.4. Autoimmunität und SARDS ................................................................................................ 10

2.3. Diagnose ..................................................................................................................10 2.4. Differenzialdiagnosen .............................................................................................11 2.5. Histologische Untersuchungen an SARDS-Augen ...............................................11 2.6. Therapie ...................................................................................................................12 2.7. Retinale Antigene ....................................................................................................12 2.7.1. Autoantigene....................................................................................................................... 12 2.7.2. Epitop Spreading ................................................................................................................ 12 2.7.3. Molekulares Mimikry ........................................................................................................... 13 2.7.4. Bystander Activation ........................................................................................................... 13 2.7.5. Autoantigene retinaler Erkrankungen ................................................................................. 14 2.7.6. Studien über das Vorkommen von Autoimmunreaktionen bei SARDS-Patienten ............. 15

III. Veröffentlichung Nr. 1 ....................................................................................... 16 IV. Veröffentlichung Nr. 2....................................................................................... 34 V. Diskussion .......................................................................................................... 49 VI. Zusammenfassung............................................................................................ 60 VII. Summary........................................................................................................... 61 VIII. Literaturverzeichnis ........................................................................................ 62 IX. Danksagung....................................................................................................... 68

4

Abkürzungsverzeichnis ALT

Alanin-Aminotransferase

AP

Alkalische Phosphatase

APC

Antigenpräsentierende Zelle

AST

Aspartat-Aminotransferase

CAR

Cancer Associated Retinopathy

CRALBP

Cellular Retinaldehyde Binding Protein

CT

Computertomographie

ECL

Enhanced Chemiluminescence

ERG

Electroretinogram

HSC

Hitzeschockprotein

IRBP

Interphotoreceptor Binding Protein

ISEL

in situ- end-labelling technique

IVIG

Intravenöse Immunoglobuline

kDa

Kilodalton

MALDI

Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation

MRT

Magnetresonanztomographie

MS

Multiple Sklerose

MSDB

Mass Spectrometry Protein Sequence Database

MOWSE

Molecular Weight Search

NO

Nitric Oxid

NSE

Neuron Specific Enolase

PBS-T-PVP

PBS-Tween Polyvinylpyrrolidone

RPE

Retinales Pigmentepithel

SARDS

Sudden Acquired Retinal Degeneration Syndrome

TMEV-IDD

Theiler´s murine encephalomyelitis virus-induced disease

TNF

Tumor-Nekrose-Faktor

TOF

Time of Flight

I. Einleitung

I. Einleitung „Das typische an der Erkrankung ist, dass der Hund nichts sieht, der Ophthalmologe aber auch nichts!“ (Grußendorf, 2006). Das Sudden Acquired Retinal Degeneration Syndrome (SARDS) ist eine äußerst seltene und dramatisch verlaufende Erkrankung des Hundes, die mit bilateraler Erblindung einhergeht (Acland und Aguirre 1986). Die Erblindung tritt plötzlich-, innerhalb weniger Tage bis Wochen auf. Am Auge sind keine Veränderungen sichtbar, die eine Erblindung erklären könnten, auch die Netzhaut erscheint ophthalmoskopisch

zunächst

völlig

unauffällig

(Vanisi

et

al.

1983).

Eine

elektroretinographische Überprüfung (ERG) zeigt aber eine fehlende retinale Funktion. SARDS wurde erstmals 1983 beschrieben. Damals wurde eine Vergiftung der betroffenen Hunde als Ursache vermutet und die Krankheit daher „toxic metabolic retinopathy“ genannt (Vanisi et al. 1983). Andere Autoren vermuteten ein autoimmun bedingtes Geschehen (Bellhorn et al. 1988) oder einen Zusammenhang zwischen einem Hyperadrenokortizismus und SARDS (Mattson et al. 1992). Ätiologie und Pathogenese konnten aber bis heute nicht geklärt werden. Die wenigen Studien, die es über SARDS gibt, wurden überwiegend mit einer geringen Probandenzahl durchgeführt. Drei Studien (Bellhorn et al. 1988; Gilmour et al. 2006; Keller et al. 2006)

die

sich

mit

der

Immunpathogenese

beschäftigten,

kamen

zu

unterschiedlichen Ergebnissen hinsichtlich der Bedeutung einer fehlgeleiteten Immunreaktion bei SARDS. Mit

der

vorliegenden

Dissertationsschrift

wurde

daher

ein

neuer

Untersuchungsansatz verfolgt, um einen Beitrag zur Klärung der Ätiologie des SARDS zu leisten: 1. In einer Literaturstudie wurden die Forschungsergebnisse über SARDS zusammengestellt. Eigene Untersuchungsergebnisse wurden nachfolgend mit diesen Ergebnissen verglichen, Gemeinsamkeiten oder Abweichungen diskutiert. 6

I. Einleitung

2. Eine retrospektive Untersuchung der Patientendaten aus der Chirurgischen Tierklinik zeigte die Besonderheiten von SARDS-Patienten im Vergleich zu gesunden Tieren hinsichtlich Rasse, Alter und Geschlecht. 3. Eine Nachuntersuchung der SARDS-Patienten ermöglichte eine Beurteilung des Zustands der Netzhaut. Detaillierte Verlaufsuntersuchungen der Retina von erkrankten Patienten fehlten bislang in der Literatur. Durch die fotografische Dokumentation der retinalen Veränderungen konnte der Verlauf der Erkrankung dargestellt werden. 4. Durch ein Autoantikörperscreening wurde die These überprüft, dass SARDS eine Autoimmunerkrankung ist. Mit Hilfe eines Western Blots wurden potenzielle

Autoantigene

identifiziert,

um

zu

überprüfen,

Autoimmunreaktionen bei Hunden mit SARDS nachweisbar sind.

7

ob

II. Literaturübersicht

II. Literaturübersicht 2.1. Klinik Die

Symptome

des

SARDS

werden

von

Autoren

verschiedener

Studien

übereinstimmend geschildert. Kennzeichnend ist die Trias aus plötzlich eintretender Blindheit innerhalb weniger Tage bis einiger Wochen, einem ophthalmoskopisch unauffälligen oder nur leicht veränderten Fundus-, sowie einem erloschenen ERG (Acland et al. 1984; Acland und Aguirre 1986; Gränitz 2001; Mattson et al. 1992; Miller et al. 1998; Parshall 1989; van der Woerdt et al. 1991). Typischerweise sind die betroffenen Tiere mittleren bis hohen Alters und oft weiblich-kastrierten Geschlechts (O'Toole et al. 1992). Alle Rassen können betroffen sein, obwohl von einer Häufung der Fälle bei Dackeln berichtet wird (van der Woerdt et al. 1991). Viele Tiere sind leicht übergewichtig. Die Besitzer berichten oft von Polyurie, Polydipsie und Polyphagie, manchmal auch von Nyctalopie. Das Allgemeinbefinden der Hunde ist nicht gestört. Serologische Untersuchungen zeigen erhöhte Blutwerte: Bei ungefähr der Hälfte der Tiere sind bei Diagnosestellung Alkalische Phosphatase (AP) (Vanisi et al. 1983), Kortisol, Aspartat-Aminotransferase (AST) (Chastain et al. 1985) und Cholesterol (Acland und Aguirre 1986) erhöht. Bei Krankheitsbeginn ist der Fundus unauffällig oder zeigt allenfalls leichte Veränderungen in Form einer geringgradigen Hyperreflexie des Tapetum lucidums oder einer Attenuation der retinalen Gefäße. Er verändert sich erst einige Monate nach der Diagnose (Vanisi et al. 1983) dahingehend, dass sich die Blutgefäße der Netzhaut verringern oder vollständig verschwinden und eine vermehrte Reflexion des Tapetum lucidums auftritt. Der Fundus ähnelt dann dem Fundus eines Hundes mit weit fortgeschrittener progressiver Retinaatrophie (Dziezyc 2004).

2.2. Ätiologie SARDS wurde erstmals 1977 auf der Midwest Veterinary Ophthalmology Conference in Columbus, Ohio, von Wolf und Vanisi vorgestellt (Vanisi et al. 1983). Sie wählten die Bezeichnung „toxic metabolic retinopathy“, da sie von einer Vergiftung der Hunde ausgingen. Eine andere Bezeichnung stammt von O’Toole et al. (1992), der das 8

II. Literaturübersicht trügerisch unauffällige Bild der Funduskopie deskriptiv „silent retina syndrome“ nannte (O'Toole et al. 1992). Seit der Erstbeschreibung wird die ungeklärte Ursache des SARDS in jeder Veröffentlichung erwähnt und diskutiert (Acland und Aguirre 1986; Acland et al. 1984; Curtis 1988; Mattson et al. 1992; Millichamp 1990; van der Woerdt et al. 1991; Vanisi et al. 1983). Zur Klärung der Ätiologie gibt es bislang aber nur wenige Ansätze.

2.2.1. Toxische Ursachen Zunächst wurde vermutet, dass ein defekter Fettmetabolismus für die Entstehung von SARDS verantwortlich sein könnte (Vanisi et al. 1983). Demnach würden freie Lipidradikale toxisch auf die Stäbchen und Zapfen wirken. Diese nicht näher untersuchte Hypothese entstand, da bei laborchemischen Untersuchungen etwa die Hälfte

der

Alkalische

Patienten

erhöhte

Phosphatase-

(AP)

Cholesterol-, und

Alanin-Aminotransferase-

(ALT),

Aspartat-Aminotransferase-Werte

(AST)

aufwiesen. Drei Tiere wurden mit dem Coombs-Test auf antinukleäre Antikörper untersucht, zusätzlich wurde der rheumatoide Faktor bestimmt, um einen Hinweis auf eine eventuell vorliegende autoimmune Genese zu erhalten. Alle Parameter waren bei den Tieren aber im Referenzbereich (Vanisi et al. 1983). Histologische Untersuchungen ließen ebenfalls auf ein toxikologisches Geschehen schließen, da bei der Untersuchung zweier Augen ein massiver und selektiver Verlust der äußeren Segmente der Stäbchen und Zapfen vorlag. (O'Toole et al. 1992).

2.2.2. Genetische Ursache Das gehäufte Auftreten von SARDS beim Dackel wurde von zwei Autoren beschrieben und daraufhin ein genetischer Zusammenhang vermutet, nicht aber näher untersucht (Gränitz 2001; van der Woerdt et al. 1991).

2.2.3. Stoffwechselbedingte Ursache Bei der Diagnosestellung zeigen typischerweise etwa die Hälfte der Patienten Anzeichen eines Hyperadrenokortizismus. Die Besitzer berichten von Polydipsie, Polyurie und Polyphagie. Alkalische Phosphatase (AP) (Vanisi et al. 1983), Kortisol, Aspartat-Aminotransferase (AST) (Chastain et al. 1985) und Cholesterol (Acland und 9

II. Literaturübersicht Aguirre 1986) sind ebenfalls bei ungefähr der Hälfte der Tiere zu diesem Zeitpunkt erhöht.

Daher

wurde

1992

ein

SARDS-Patient

auf

das

Vorliegen

eines

Hyperadrenokortizismus untersucht (Mattson et al. 1992). Es wurde ein Low-Dose Dexamethason Suppressionstest, eine CT der Nebenniere und der Hypophyse durchgeführt. Der Verdacht eines Hyperadrenokortizismus bestätigte sich aber nicht.

2.2.4. Autoimmunität und SARDS Bislang wurden drei Arbeiten über SARDS und eine mögliche autoimmune Ätiologie veröffentlicht (Bellhorn et al. 1988; Gilmour et al. 2006; Keller et al. 2006). In den Studien wurden Hundeseren auf das Vorhandensein von antiretinalen Antikörpern mittels ELISA und Western Blot untersucht. In zwei

Studien wurden antiretinale

Antikörper sowohl bei den gesunden-, als auch bei den erkrankten Hunden nachgewiesen (Gilmour et al. 2006; Keller et al. 2006). Unterschiede in der Spezifität oder Reaktivität beider Gruppen waren nicht feststellbar. Diese Ergebnisse stehen im Widerspruch zu einer dritten Studie (Bellhorn et al. 1988), in der antiretinale Antikörper in den Seren von fünf SARDS-Patienten mittels ELISA und Western Blot nachgewiesen werden konnten, jedoch nicht bei den drei gesunden Kontrolltieren.

2.3. Diagnose Typischerweise werden SARDS-Patienten mit akuter Blindheit vorgestellt. Der Verlust der Sehfähigkeit entsteht innerhalb weniger Tage bis einiger Wochen (Acland et al. 1984; Vanisi et al. 1983). Eine Nachtblindheit wird anfangs von manchen Besitzern beobachtet (Acland et al. 1984). Der Fundus sieht unauffällig oder zumindest nahezu unauffällig aus. Veränderungen sind im Sinne einer leichten Hyperreflexie des Tapetum lucidums oder einer Attenuation der retinalen Gefäße zu sehen (Vanisi et al. 1983). Sie erklären das fehlende Sehvermögen jedoch nicht. Der Pupillarreflex ist erloschen oder nur reduziert auslösbar (Acland et al. 1984; O'Toole et al. 1992; Venter 1995). Um SARDS von einer Neuritis nervi optici zu unterscheiden, ist es essenziell, dass ein ERG abgeleitet wird (Acland und Aguirre 1986). Das erloschene ERG schließt eine Neuritis aus. Prinzipiell ist bei der Diagnostik von SARDS nur ein kurzes ERG Protokoll notwendig, dass eine ja/nein Antwort über die Funktionalität der Retina liefert (Narfstrom 2002). 10

II. Literaturübersicht Bei

40-60%

der

SARDS-Patienten

werden

zusätzlich

systemische

Krankheitsanzeichen und veränderte Laborwerte gefunden. Etwa die Hälfte der Tiere haben einen erhöhten alkalischen Phosphatase-

und Cholesterinwert und leiden

unter Polyphagie, Polydipsie und Polyurie (Acland und Aguirre 1986).

2.4. Differenzialdiagnosen Eine plötzlich auftretende Blindheit kann durch eine akut erworbene, bilaterale Fehlfunktion in einem der vier folgenden Bereiche entstehen: 1.

Plötzliche Trübung der durchsichtigen Medien des Auges

2.

Störung der retinalen Funktion

3.

Dysfunktion der reizweiterleitenden Strukturen

4.

Zentrale Blindheit

Die verschiedenen Differenzialdiagnosen wurden bereits in der hier eingefügten eigenen Publikation (Tierärztliche Praxis, Kleintiere 2008, 36 1: 26-46) ausführlich erläutert (s.S. 36-37).

2.5. Histologische Untersuchungen an SARDS-Augen Bislang wurden erst drei histologische Untersuchungen publiziert, in denen insgesamt 15 Augen (zwei, sechs und sieben) untersucht wurden (Acland et al. 1984; Miller et al. 1998; O'Toole et al. 1992). Alle Studien zeigten eine völlige Degeneration der Außensegmente der Stäbchen und Zapfen. Die Innensegmente der Stäbchen und Zapfen waren bei akut erblindeten Tieren noch vorhanden. In der Interphotorezeptor Matrix, die den Raum zwischen den Photorezeptoren und dem retinalen

Pigmentepithel

(RPE)

ausfüllt,

konnten

zahlreiche

Phagozyten

nachgewiesen werden (Acland et al. 1984; O'Toole et al. 1992). Die innenliegenden Schichten der Retina (Ganglienzellschicht, innere plexiforme Schicht und innere Körnerschicht), die Choroidea und das retinale Pigmentepithel waren unverändert. (Acland et al. 1984). Mit Hilfe der „in situ- end-labeling technique“ (ISEL) konnte nachgewiesen werden, dass bei akut an SARDS erblindeten Tieren in der äußeren Körnerschicht viele apoptotische Zellen vorlagen (Miller et al. 1998). Länger erkrankte Tiere 11

II. Literaturübersicht präsentierten dementsprechend eine Ausdünnung der äußeren Körnerschicht (O'Toole et al. 1992). Die ISEL-Technik färbt fragmentierte DNA an und weist so apoptotische Zellen nach. Unklar ist trotzdem, ob die apoptotischen Vorgänge aufgrund eines anderen, vorangehenden Stimulus einsetzen oder ob die Apoptose die auslösende Ursache von SARDS ist (Miller et al. 1998).

2.6. Therapie Für die Behandlung von SARDS ist bislang keine erfolgreiche Therapie bekannt (Acland und Aguirre 1986; Mattson et al. 1992; Parshall 1989).

2.7. Retinale Antigene 2.7.1. Autoantigene Jede körperfremde Substanz, die eine Immunreaktion induzieren kann, ist ein Antigen. Unter einem Autoantigen versteht man einen natürlichen Bestandteil des Körpers, der sich wie ein Antigen verhält (Tizard 2000). Erkennt das Immunsystem seine eigenen Proteine als fremd, resultiert eine Immunantwort gegen eigene Zellen und Gewebe. Die Krankheiten, die aus diesem Fehlverhalten resultieren, werden als Autoimmunerkrankungen bezeichnet. Zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen gibt es momentan vor allem drei Theorien:

2.7.2. Epitop Spreading Ein Epitop ist eine antigenetische Determinante oder ein Teil einer Oberfläche eines antigenetischen Moleküls, an das ein einzelner Antikörper bindet. Jedes Antigen besitzt verschiedene Epitope, die mit Antikörpern reagieren können. Unter dominanten Epitopen versteht man jene Epitope, auf die ein Tier initial reagiert, wenn es mit einem Protein oder infektiösen Agens konfrontiert wird. Durch die molekulare Struktur der Proteine sind manche Epitope versteckt (kryptisch), das heißt, dass sie aufgrund ihrer Lokalisation nicht mit interagierenden Antikörpern oder Lymphozyten in Berührung kommen. Deshalb kommt es weder zu einer Immunantwort gegen sie, noch zu einer Toleranzentwicklung (Powell und Black 2001).

12

II. Literaturübersicht Durch das Epitop Spreading entwickeln sich Immunantworten gegen neue, unterschiedliche Epitope und nicht gegen das initial fokussierte, dominante Epitop. Dieser Vorgang entsteht vor allem durch die Gewebeschädigung bei der Erkrankung und führt dazu, dass versteckte Epitope plötzlich für das Immunsystem freiliegen und zu einer autoaggressiven Reaktion führen. Richtet sich die Autoimmunantwort gegen unterschiedliche Epitope desselben Proteins spricht man vom intramolekularen Epitop Spreading, wenn sie sich gegen Epitope anderer Proteine richten, spricht man vom intermolekularen Epitop Spreading (Vanderlugt und Miller 2002). Studien über Multiple Sklerose (MS), experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis und Theiler`s murine encephalomyelitis virus-induced demyelinating disease (TMEVIDD)

zeigten,

dass

Epitope

Spreading

eine

pathologische

Rolle

in

der

Aufrechterhaltung der jeweiligen Erkrankung spielt (McMahon et al. 2005).

2.7.3. Molekulares Mimikry Molekulares Mimikry tritt auf, wenn Peptide eines Infektionserregers Ähnlichkeiten mit Sequenzen oder Strukturen von Autoantigenen haben. Werden diese Peptide dem MHC-Komplex präsentiert, können dadurch autoreaktive T-Zellen aktiviert werden (Karlsen und Dyrberg 1998). Die Immunantwort richtet sich durch die kreuzreaktive Immunreaktion zunächst gegen den Infektionserreger und später gegen körpereigenes Gewebe (Oldstone 1998). Die Pathogenese der autoimmunen Myocarditis (Wilkie et al. 2006), der Multiplen Sklerose (Libbey et al. 2007) oder der durch

B3

Coxsackie

Viren

verursachten

Myocarditis

(Huber

2006)

wird

beispielsweise mit einer Infektion durch verschiedene Pathogene erklärt, die den körpereigenen Antigenen ähnlich sehen.

2.7.4. Bystander Activation Bystander Activation heißt wörtlich übersetzt „Zuschauer Aktivierung“ und ist ein weiterer Mechanismus der Entstehung von Autoimmunerkrankungen, der während einer viralen Infektion auftreten kann. Virusinfektionen führen zu einer signifikanten Aktivierung

von

antigenpräsentierenden

Zellen

(APC).

Die

aktivierten

antigenpräsentierenden Zellen können wiederum autoreaktive T-Zellen aktivieren, die im aktivierten Zustand eine Autoimmunerkrankung auslösen (Libbey et al. 2007). 13

II. Literaturübersicht Anders ausgedrückt werden spezifische T-Zellen, die gegen das Antigen „Y“ gerichtet sind, während einer Immunantwort gegen das Antigen „X“ aktiviert, weil sie in der Nähe der „X“-spezifischen Zellen liegen (Ehl et al. 1997). Zusätzlich können auch virusspezifische T-Zellen eine Bystander Activation initiieren. Sie migrieren zu den Bereichen einer Virusinfektion, zum Beispiel zum Herz, Pankreas oder in das ZNS. Hier begegnen sie den virusinfizierten Zellen, die virale Peptide präsentieren. CD8+ T-Zellen erkennen die infizierten Zellen und geben zytotoxische Granula ab, die den Tod der infizierten Zelle bewirken. Die absterbenden Zellen, die CD8+ T-Zellen und die Makrophagen geben Zytokine ab, wie den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), TNF-β, Lymphotoxin und Nitric Oxid (NO). Diese Zytokine führen zu einer Vernichtung der unifizierten Nachbarzellen (Duke 1989; Libbey et al. 2007; Smyth und Sedgwick 1998).

2.7.5. Autoantigene retinaler Erkrankungen Das Vorkommen von Autoimmunreaktionen bei retinalen Erkrankungen wurde unter anderem bei einer Uveitis und einer Cancer Associated Retinopathy (CAR) beschrieben. Die Uveitis ist eine Entzündung des inneren Auges, die sowohl beim Menschen als auch beim Pferd mit rezidivierenden Entzündungsschüben einhergeht und unbehandelt zur Erblindung führt. Als Autoantigene bei einer Uveitis wurden unter anderem S-Antigen (Wacker 1977), Cellular Retinaldehyde Binding Protein (CRALBP) (Deeg et al. 2006), sowie Interphotoreceptor Binding Protein (IRBP) (Caspi et al. 1988) beschrieben. Die Cancer Associated Retinopathy (CAR) ist eine paraneoplastische Retinopathie, die bilateral mit einem plötzlichen oder progressiven Visusverlust beim Menschen einhergeht. Das ERG der Patienten ist stark verändert oder ausgelöscht. CAR ist mit einem Lungenkarzinom assoziiert (Khan et al. 2006). Gefundene Autoantigene, die für CAR verantwortlich gemacht werden sind Alpha Enolase (Dot et al. 2005), Hitzeschockprotein (HSC 70) (Maeda et al. 2001) und Recoverin. Gegen Recoverin werden Antikörper gebildet, die auch an das Recoverin der Retina binden und hier zur Apoptose der Photorezeptoren und damit zur Erblindung führen (Thirkill et al. 1992).

14

II. Literaturübersicht

2.7.6. Studien über das Vorkommen von Autoimmunreaktionen bei SARDS-Patienten Insgesamt gibt es drei Studien über das Vorkommen antiretinaler Antikörper bei SARDS-Patienten (Bellhorn et al. 1988; Gilmour et al. 2006; Keller et al. 2006). 1988 wurden die Seren von 5 Patienten mit SARDS und drei augengesunden Tieren mittels ELISA und Western Blot untersucht (Bellhorn et al. 1988). Im Gegensatz zu den Negativkontrollen reagierten alle SARDS-Patienten sowohl im ELISA-, als auch im Western Blot positiv auf das aufgetrennte Retinagemisch. In der Studie wird allerdings nicht näher darauf eingegangen, welches Molekulargewicht die markierten Antigene hatten. Aus diesem Grund kann keine Aussage über die möglichen Antigene gemacht werden. Nur eine Abbildung zeigt eine positive Reaktion gegen eine Bande auf Höhe von 65 kDa bei SARDS-Patienten, auf die die Kontrolltiere nicht reagierten. Aktuell wurden zwei weitere Studien durchgeführt (Gilmour et al. 2006; Keller et al. 2006), die zu einem anderen Ergebnis kamen. Die Experimente wurden mit 13 SARDS-Patienten und 5 gesunden Hunden (Keller et al. 2006) bzw. mit 17 SARDSPatienten, 57 klinisch gesunden Tieren und 53 Tieren mit Neoplasien (Gilmour et al. 2006) durchgeführt. In beiden Studien zeigten sowohl gesunde-, als auch kranke Tiere im ELISA und Western Blot Reaktionen auf verschiedene Proteine im aufgetrennten Retinalysat.

15

III. Veröffentlichung Nr. 1

III. Veröffentlichung Nr. 1 Titel:

“Neuron Specific Enolase Antibodies in Patients with Sudden Acquired Retinal

Autoren:

Degeneration Syndrome

Barbara K Braus, Stefanie M Hauck, Barbara Amann, Christine Heinrich, Jens Fritsche, Roberto Köstlin, Cornelia A Deeg

Zeitschrift:

Veterinary Immunology and Immunopathology, in press (http://www.sciencedirect.com/science/journal/01652427

16

III. Veröffentlichung Nr. 1

Neuron Specific Enolase Antibodies in Patients with Sudden Acquired Retinal Degeneration Syndrome Barbara K Braus*, Stefanie M Hauck**, Barbara Amann***, Christine Heinrich

****,

Jens

Fritsche*****, Roberto Köstlin*, Cornelia A Deeg*** * Department for Small Animal Surgery and Ophthalmology, Ludwigs Maximilians University München (LMU) Munich, Veterinärstr 13, D-80539 Munich. ** Institute of Human Genetics (GSF), Research Center for Environment and Health, Ingolstädter Landstr. 1, D-85764 Neuherberg. *** Institute for Animal Physiology, Ludwigs Maximilians University München (LMU) Munich, Veterinärstr. 13, D-80539 Munich. **** Willows Referral Service, 78 Tanworth Lane, Shirley, Solihull, West Midlands B90 4DF Great Britain. ***** Tierärztliche Praxis für Augenheilkunde, Kreuzhofstraße 10, D-81476 Munich.

Correspondence address: Cornelia A Deeg, Institute for Animal Physiology, Ludwigs Maximilians University München (LMU) Munich, Veterinärstr. 13, D-80539 Munich, Germany. E-mail: [email protected], Telephone: +49 89 2180 1630, Fax: +49 89 2180 2554. abstract Sudden Acquired Retinal Degeneration Syndrome (SARDS) is a disease characterised by sudden and bilateral vision loss of dogs. Previous studies failed to identify the underlying cause (Mattson et al., 1992; Van der Woerdt et al., 1991) and earlier investigations about the occurrence of anti-retinal antibodies in SARDS patients showed inconsistent results. To provide a novel approach to those findings we designed a more detailed study. Autoantibodies of SARDS patients and normal controls were tested against the purified autoantigens S-antigen and Cellular Retinaldehyde Binding Protein (CRALBP) that play a role in human autoimmune uveitis. Next we tested the autoantibody binding pattern to whole retinal lysate. No difference in the incidence of autoantibodies could be found between SARDS patients and healthy controls while testing the well known autoantigens S-antigen 17

III. Veröffentlichung Nr. 1 and CRALBP. Potential novel, yet unknown autoantigens were identified by a screening test using the retinal proteome as autoantigenic source. In SARDS patients and normal controls, several retinal proteins were bound by IgG antibodies, but one band was strongly marked by SARDS patients. That band was excised, subjected to mass-spectrometry (MALDI/TOF-TOF) and identified as Neuron Specific Enolase. Binding of the IgG autoantibodies of SARDS affected dogs to this protein was verified using purified NSE, revealing 25% of NSE autoantibody-positive SARDS patients and 0% of negative controls. Our findings indicate that at least some dogs with SARDS have autoantibodies against NSE, although it is unclear whether these play a causative role in SARDS or whether they are the result of retinal destruction by another mechanism. keywords: retinal degeneration, autoantibodies, NSE, retina, blindness, SARDS abbreviations: CAR: Cancer Associated Retinopathy CRALBP: Cellular Retinaldehyde-binding Protein ECL: Enhanced Chemiluminescence ERG: Electroretinogram IVIG: Intravenous Immunoglobulins MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation MSDB: Mass Spectrometry Protein Sequence Database MOWSE: Molecular Weight Search NSE: Neuron Specific Enolase PBS-T-PVP: PBS-Tween Polyvinylpyrrolidone SARDS: Sudden Acquired Retinal Degeneration Syndrome TOF: Time of Flight

18

III. Veröffentlichung Nr. 1 1. introduction Sudden Acquired retinal degeneration syndrome (SARDS) is a blinding disease in dogs. It was first described in 1977 (Vanisi et al., 1983). Since this time the occurrence of SARDS was reported several times in the United States, as well as in Africa and Europe (Acland et al., 1984; Granitz, 1994; Venter and Petrick, 1995). Patients with SARDS are presented with acute bilateral vision loss, mydriatic pupils and with little or no pupillary response to bright light. The fundus of acutely affected animals shows no or only subtle changes (Vanisi et al., 1983). Considerable changes like hyperreflectivity of the tapetum and attenuated retinal vessels are only seen several months after the onset of SARDS. Clinical confirmation is based on an extinguished electroretinogram (ERG) (Acland et al., 1984). Affected dogs are often middle aged to old and of female sex. Van der Woerdt reported a higher incidence in dachshunds (1991), but several breeds can be affected. About one third (Van der Woerdt et al., 1991) to one half (Acland et al., 1984; Parshall, 1989) of the SARDS affected dogs are presented with polydipsia and polyuria during the onset of the disease. Blood analysis revealed elevated amounts of Alkaline Phosphatase (AP), Cholesterol or Aspartat Aminotransferase (AST) in about 40 to 50 % of presented dogs (Acland and Aguirre, 1986; O'Toole et al., 1992; Parshall, 1989; Van der Woerdt et al., 1991; Vanisi et al., 1983). Histological examinations showed a selective loss of the photoreceptor layer in affected animals. In situ end-labeling technique demonstrated numerous apoptotic nuclei overwhelmingly located in the outer nuclear layer in dogs with SARDS (Acland et al., 1984; Miller et al., 1998). The aetiology of SARDS remains still unclear. Possible causes include a toxic effect to the rods and cones, mediated by an unknown toxin or by free lipid radicals (Vanisi et al., 1983). Several studies focused on SARDS as an autoimmune disorder (Bellhorn et al., 1988; Gilmour et al., 2006; Keller et al., 2006), but showed controversial findings. In 1988 five dogs with SARDS were examined that had demonstrable serum antibodies specific to pooled bovine retinal antigen contrary to three healthy dogs. Because of these findings SARDS was suspected as an autoimmune disease (Bellhorn et al., 1988). New investigations about SARDS and the occurrence of autoantibodies were made in 2006. Two studies detected autoantibodies against proteins of 25 and 50 kDa (Keller et al., 2006) or against a protein of 48 kDa (Gilmour et al., 2006) in healthy as well as in diseased dogs, but no qualitative or quantitative differences between both groups could be identified. SARDS as an autoimmune 19

III. Veröffentlichung Nr. 1 disease appears questionable after those findings. However, an anecdotal report of two cases of SARDS describes a successful treatment with intravenous immunoglobulin

(IVIg)

(http://www.iastate.edu/~nscentral/news/2007/may/blind.shtml). IVIg is a well known therapy for immune mediated diseases (Sorensen et al., 1998). Those findings made it seem reasonable to provide a novel approach by testing SARDS sera with purified autoantigens and to search for autoantigens in whole retinal lysate. 2. materials and methods 2.1. animals Serum was obtained from 24 dogs diagnosed with SARDS and 14 normal controls. Inclusion criteria for the SARDS group were: clinical signs (sudden blindness and an ophthalmoscopically normal or nearly normal fundus that could not explain blindness) and an extinguished ERG. The diagnosis was made directly after the onset of blindness. One third of the dogs showed signs of polydipsia, polyuria and polyphagia. Approximately 40% had elevated levels of alkaline phosphatase (AP), alanine aminotransferase (ALT) and Cholesterol. Blood samples were taken immediately after SARDS onset in 13 animals, after 1-4 years in 8 animals and after 5 to 8 years from 3 animals. The control group included ophthalmological healthy dogs that were gender and breed matched. Serum analysis revealed normal findings in these dogs. A complete ophthalmic examination was performed on all animals including a slit lamp examination, a direct and indirect ophthalmoscopy and a tonometry (TonoVet, Acri.Tec, Hennigsdorf). Serum was stored at -20°C until usage. 2.2. western blots A SDS-PAGE procedure followed by Western blot was used to screen serum samples for antiretinal antibodies and was done as described by Laemmli (Laemmli 1970). 20 µg of purified recombinant human CRALBP (Deeg et al., 2006), purified bovine S-Antigen (Deeg et al., 2001), porcine whole retina lysate and purified NSE (Biomol, Hamburg) was respectively applied to the polyacrylamide gel. The conformance of used proteins between the different species (dog/human and dog/bovine) were 91.4 % (CRALBP), 91.9% (S-Antigen) and 98.7% (Sorensen et al.). One part of the gel was cut off and used for silver- as well as colloidal Coomassie (Pierce, Bonn) staining. Blotting was performed on Hybond ECL (GE-Healthcare, 20

III. Veröffentlichung Nr. 1 Freiburg). The membrane was cut into 0.4 cm strips, blocked with PBS-Tween Polyvinylpyrrolidone (PBS-T-PVP) for one hour and incubated in the patient or normal control serum (S-Ag 1:10000, CRALBP 1:5000, retinal lysate 1:2000, NSE 1: 50000) overnight. Strips were washed in PBS-T followed by incubation of rabbit antidog IgG POD antiserum (1:50000) (Sigma, Deisenhofen) for one hour. Enhanced chemiluminescence (ECL) (self made with solution A, consisting of Tris-HCl and Luminol, solution B consisting of para-Hydroxycoumarinsäure and Dimethylsulfoxide, and solution C consisting of H2O2) was used for detection of autoantibody reaction. Exposure to an X-ray film (GE Healthcare, Freiburg) enabled the documentation of the reaction. 2.3. mass spectrometry The selected band was cut from silver-stained gels, destained, dehydrated in 100 µl of 40% acetonitrile (3 x 15 min), and subjected to overnight tryptic proteolysis in 5–10 µl of 1 mMTris- HCl, pH 7.5, containing 0.01 µg/µl trypsin (Promega, Mannheim). MALDI-TOF/TOF peptide mass fingerprints were obtained on a Bruker Reflex III mass spectrometer (Bruker, Bremen) as described before (Deeg et al., 2006). Briefly samples were cocrystallized with a matrix consisting of 2,5-dihydroxybenzoic acid (Sigma, Deisenhofen) (20 mg/ml in 20% acetonitrile, 0.1% TFA) and 2-hydroxy-5methoxybenzoic acid (Fluka, Neu Ulm) (20 mg/ml in 20% acetonitrile, 0.1% TFA) in a 9:1 ratio (v/v) on 400-µm AnchorChip targets (Bruker, Bremen). Database searches were performed using the Mascot software package (Matrix Science, London, UK) allowing one miscleavage and 100-ppm mass accuracy in all mammalian entries in the Mass Spectrometry Protein Sequence Database (MSDB). Score is given as probability based MOWSE (Molecular weight Search) scores and considered as significant if protein score were greater than 58 (p0.05) or CRALBP (p>0.05). Since no difference in autoantibody frequency was detectable to the known retinal autoantigens S-Antigen and CRALBP we next tested the autoantibody binding pattern to the retinal proteome (Figure 2). Both groups, SARDS patients and normal controls showed many reactions to different retinal proteins. One band at 47 kDa was strongly detected by SARDS patients. This protein was unambiguous localized on silver stained gel, excised and afterwards identified by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. Spectrometric investigation identified it as Neuron Specific Enolase (Sorensen et al.). The positive reactions were verified with western blot analysis using purified (recombinant) NSE (Figure 3). Validation of the immune response with purified NSE confirmed the reaction of 25% SARDS patients to NSE (Figure 4). SARDS patient number 18, 19 and 21 are exemplary shown for positive reactions (Figure 3). Statistical significance was proven by fisher´s exact test. A positive correlation between SARDS and reaction to NSE (p