Zellbiologie SS2004 Modul 2

Johannes A. Schmid Institut f. Gefäßbiologie und Thromboseforschung, Univ. Wien; Brunnerstr. 59, A-1235 Wien Tel.: (01) 4277-62555, Fax: (01) 4277-62550 Mail: [email protected] Internet: http://www.univie.ac.at/vascbio/schmid

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Themen der Vorlesung

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus Das Zytoskelett Zellkontakte und Zelladhäsion Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus) Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose) Mechanismen der Signaltransduktion Interzelluläre Kommunikation

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Literatur und Weblinks •

•

Molekulare Zellbiologie: Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore and Darnell: 4. Auflage (Spektrum, G. Fischer Verlag 2001, Übersetzung der 4. engl. Auflage) http://www.whfreeman.com/lodish/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=mcb.T OC Molecular Biology of the Cell: Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and James D. Watson. 1994. Garland Publishing http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=cell.TOC&depth=2

• •

Zellbiologie im Web: http://www.cellbio.com/ Datenbanken (Gene, Proteine, Literatur, Bücher): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/

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Kompartimentierung als Grundlage für Leben Eines der wesentlichsten Charakteristika aller bis jetzt gefundenen Lebensformen ist ihre Abgrenzung von der Umwelt; also die Kompartimentierung ihrer eigenen Organisationsform. Erst diese Abgrenzung ermöglicht das Auftreten von elektrochemischen Gradienten, und damit die Existenz energetischer Potentialdifferenzen. Die Tendenz zum Ausgleich dieser Differenzen in Form eines Fließgleichgewichts macht die Aufrechterhaltung eines höheren Ordnungszustandes innerhalb dieses Kompartiments möglich, und somit die temporär und räumlich begrenzte Reduktion des Entropiegrades (Negentropie).

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Prinzipielle Eigenschaften von Kompartimenten •Kompartimente sind Reaktionsräume •Diese Reaktionsräume sind normalerweise durch einen Lipid-Bilayer vom Außenraum abgegrenzt. •Hydophobe Substanzen und kleine ungeladene Moleküle (wie z.B. O2) können meist durch die Lipidbarriere diffundieren. Hydrophile oder geladene Moleküle, sowie die meisten Makromoleküle können nicht passiv durch die Membran diffundieren. •In die Membran eingebette Proteine (integrale Membranproteine) oder an die Membran assoziierte Proteine (periphere Membranproteine) können wesentliche Steuerungsfunktionen ausüben (wie etwa aktive Transportprozesse durch die Membran, Aufbau elektrochemischer Gradienten, Interaktionen mit anderen Makromolekülen etc.).

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Plasmatische und nicht-plasmatische Phasen von Eukaryonten •Die äußere Zellmembran trennt die cytoplasmatische Phase der Zelle von der extracytoplasmatischen Phase der Umgebung ab. Äquivalent dazu können die Innenräume intrazellulärer Kompartimente, die von einem einfachen Lipid-Bilayer umgeben sind, als nicht-plasmatische Phasen angesehen werden (ER, Golgi, sekretorische Vesikel, Endosomen, Lysosomen etc.). Ihr Inneres entspricht somit in gewisser Weise dem Extrazellulärraum. •Plasmatische Phasen der Zelle sind das Cytosol, sowie das Innere von Kompartimenten, die von einem doppelten Lipid-Bilayer umgeben sind (Zellkern, Mitochondrien, Chloroplasten). Die Zwischenräume zwischen den beiden Membranen dieser Kompartimente zählen zu den nichtplasmatischen Bereichen.

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Nicht-Plasmatische Räume: Schwarz Plasmatische Phasen: Weiß

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Eukaryontische Zelle

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Elektronenmikroskopie einer Eukaryontenzelle

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Der Zellkern • Funktionen: Replikation der DNA, Transkription, Splicing der RNA, Synthese der ribosomalen RNA in den Nucleoli. Stoffaustausch mit dem Zytosol über Kernporenkomplexe, durch die etwa Moleküle < ca. 30 kDa diffundieren können, während größere Moleküle aktiv transportiert werden müssen („nuclear import and nuclear export)

Zellkern eines Lymphozyten

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Johannes A. Schmid

Das Endoplasmatische Retikulum

•glattes ER: Lipidsynthese, Startpunkt des Transportweges sezernierter und lysosomaler Enzyme •rauhes ER: Ribosomen synthetisieren Proteine mit einer Signalsequenz cotranslational in das ERLumen), Glykosylierungen, Proteinfaltung, Ca2+Speicher etc.

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Der Golgi-Apparat •Funktionen: Modifikation von N-Glykanketten, proteolytische Reifung von Proteinen, Sortierung von sekretorischen und lysosomalen Proteinen. Sekretorische und lysosomale Proteine werden am ER synthetisiert und spezifisch zum Golgi transportiert. Dort erfolgt eine Sortierung in sekretorische Vesikel und Transportvesikel zu Lysosomen

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Endosomen und Lysosomen • Funktionen: Aufnahme und Hydrolisierung hochmolekularer Verbindungen, Internalisation von Rezeptoren; spezielle Aufgaben: z.B. Phagozytose von Fremdstoffen, Abwehrmechanismen wie etwa Antigen-Präsentation.

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Mitochondrien •Funktionen: Atmungskette (Synthese von ATP) Steuerung zellulärer Signalprozesse (z.B. Induktion von Apoptose durch Freisetzung con Cytochrom c)

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Das Zytosol und das Zytoskelett •Funktionen: Verschiedene Enzymreaktionen, Signalübertragungen, Dynamik und Stabilität der Zelle (über das Zytoskelett), Glykolyse...

Microtubuli

Microfilamente

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Die Zytoplasma-Membran •Kommunikation mit der Außenwelt (über Rezeptoren, Ionenkanäle...); Kommunikation mit Nachbarzellen (z.B. über „gap-junctions“); Konzentration verschiedener Protein- und Signalkomplexe, Verankerung mit dem Zytoskelett, Aufrechterhaltung der Polarität spezieller Zellen (z.B. Leberparenchymzellen) über sogenannte „tight junctions“ etc.

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Der multizelluläre Organismus Der Mensch besteht aus einer Vielzahl unterschiedlichster Zellen, die für ihre jeweiligen Aufgaben spezialisiert sind. Die meisten dieser Zelltypen können unter geeigneten Bedingungen auch außerhalb des Organismus kultiviert werden. > Der Organismus kann als „Staatensystem“ dieser Zellen angesehen werden.

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Beispiele für differenzierte Zellen: Haut

Epidermis (Keratinozyten)

Dermis (Fibroblasten in Bindegewebe)

Keratinozyt in der Zellkultur 18

Blutgefäße

Endothelzellen glatte Muskelzellen

adhärierender Leukozyt

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Blutzellen Lymphozyt

Erythrozyt Thrombozyt neutrophiler Granoluzyt

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Muskel Muskelzellen bilden durch Fusion mehrerer mononukleärer Zellen ein „Synzytium“ – lange Zellen mit mehreren Zellkernen

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Knochen eingelagerte Ca-Phosphate Kollagenfasern

Osteoblast

Knochenzelle (Osteozyt, Osteoblast)

Osteon

Haverskanal mit Blutgefäßen 22

Nerven

myelin-isoliertes Axon

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Epithelien (Beispiel: Dünndarm) apikale Oberfläche

tight junction

Desmosom

gap junction Pore Basalmembran

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Leber-Zellen apikale Oberfläche (Gallengang)

basolaterale Oberfläche (Blutkreislauf)

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Themen der Vorlesung

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus Das Zytoskelett Zellkontakte und Zelladhäsion Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus) Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose) Mechanismen der Signaltransduktion Interzelluläre Kommunikation

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Das Zytoskelett Mikrofilamente (Aktinfilamente)

Mikrotubuli

Intermediärfilamente

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Mikrofilamente Aufbau und Struktur:

aus Aktinmolekülen (im Menschen: 6 Isoformen: α1-α4 in Muskel, β- und γ-Aktin in Nichtmuskelzellen) G-Aktin: globuläres Aktin: Monomer ca. 40 kD

ADP/ATP Mg2+

Zusammenlagerung, Polymerisation zu F-Aktin (Ionen-abhängig): filamentöses Aktin Aktingehalt in normalen Zellen: 1 – 5 % (0.5 mM), in Muskelzellen: 10% der Proteine

7-9 nm

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Polarität und Vernetzung der Aktinfilamente Minus-Ende

Netzartige Verknüpfung Polymer: präferentiell in ADP-Form

Aktinfilament Filamin

Quervernetzende Proteine: Filamin Fascin Villin Spectrin α-Actinin Dystrophin

Faserartige Verknüpfung Aktinfilament Monomer: präferentiell in ATP-Form

Fascin

Plus-Ende 29

Funktionen der Mikrofilamente • Stabilität der Zellen und Quervernetzung mit der ZytoplasmaMembran • Zellbewegung: Ausbildung von Lamellipodien und Filopodien • Übergeordnete Bewegungsvorgänge: Muskelkontraktion • Stabilisierung von Zellausläufern (z.B. Mikrovilli im Dünndarm) • Verbindung des Zytoskeletts mit der Extrazellulär-Matrix über Membranproteine

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Zytoskelett von Erythrozyten Plasmamembran

Glykophorin Bande 3-Protein Ankyrin

Spectrin

Tropomyosin

Bande 4.1Protein Spectrin Adducin

Spectrin

kurzes Aktinfilament

Tropomodulin

Das Zytoskelett vermittelt eine flexible Stabilität, die vor allem in den engen Kapillaren essentiell ist. Hauptprotein: Spektrin: ist über kurze Aktinfilamente und Ankyrin an integrale Membranproteine verknüpft. 31

Filamentstrukturen: Bündel und Netzwerke Mikrofilamente eines Thrombozyten (Blutplättchen): Rolle bei der Blutgerinnung: Stabilisierung des Thrombus über Quervernetzung des Zytoskeletts mit dem extrazellulären Blutgerinnsel Glykoprotein Gp1b-IX

Fibrin-Gerinnsel

Filamin Aktin

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Dynamik der Mikrofilamente Keim

G-Aktin

Keim

Keim F-Aktin Keimbildung

MinusEnde

Gleichgewicht von Assoziation und Dissoziation

PlusEnde

Das Wachstum der Filamente ist am Plus-Ende ca. 5 – 10x schneller als am Minus-Ende. Die Konzentration an monomerem Aktin im Fließgleichgewicht des Filaments nennt man auch kritische Konzentration (Cc) = Konzentration ab der eine spontane Polymerisation eintritt. Durch „Capping“ (Blockieren des Minus oder des Plus-Endes) kann man die Cc für beide Enden bestimmen (in vitro): Plus-Ende: Cc = 0.1 µM Minus-Ende: Cc = 0.8 µM Bei einer normalen Aktin-Konz. von 0.5 mM müsste eigentlich fast das gesamte Aktin polymerisiert sein, tatsächlich sind aber nur etwa 60% in Form von Filamenten vorhanden. In vivo wird die Polymerisation durch Kofaktoren reguliert: Thymosin β4 hemmt z.B. die Polymerisation, während Profilin sie fördert. 33

Dynamik der Mikrofilamente II Die Stabilität der Mikrofilamente wird auch durch Proteine beeinflusst, die zu einer Fragmentierung führen (Gelsolin oder Cofilin), bzw. durch Proteine, die mit den Enden assoziieren („Capping“): Tropomodulin: blockiert die Minus-Enden CapZ: bindet an die Plus-Enden Der dynamische Auf- und Abbau von Aktin ist für verschiedene Bewegungsvorgänge in der Zelle verantwortlich, z.B. für die Ausstülpung von Membranfortsätzen. Polymerisation von Aktin in Gegenwart von Profilin induziert z.B. die Ausbildung des Leitsaumes (Lamellipodien) bei kriechenden Zellen und die Bildung von Filopodien (dünner Membranfortsätze).

Lamellipodien

Filopodien

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Motorproteine der Aktinfilamente: Myosine Myosine sind mechanochemische ATPasen, die die Energie von ATP in Konformationsänderungen (Bewegung) umwandeln. Sie haben 3 Domänen: Kopf: Aktin-Bindung, ATPase-Aktivität Hals: Bindung regulatorischer leichter Ketten Schwanz: spezifische Bindungsstellen, je nach Funktion. Myosin I und Myosin V sind an der Interaktion zwischen Aktinfilamenten und Membranen beteiligt (Plasmamembran oder Membranvesikel) – und haben Funktionen bei der Zellbewegung und beim vesikulären Transport. Myosin II ist verantwortlich für die Muskelkontraktion und die Teilung von Zellen (Cytokinese) 35

Aktinfilamente in quergestreiften Muskeln vielkernige Muskel-Zellen

Myofibrillen innerhalb einer Zelle Aufbau einer Myofibrille

A-Bande

Aktin-Filamente CapZ: Stabilisierung der Plus-Enden Myosin II - Oligomere

SchwanzDomänen

36 Tropomodulin:Stabilisierung der Minus-Enden

Regulation der Muskelkontraktion

Nerv

Ca2+Freisetzung aus Retikulum

Depolarisation

Verschiebung des Tropomyosins und Freisetzen der MyosinBindungsstellen

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Mechanismen der Muskelkontraktion ATP

ATP

Kopfgruppe dissoziiert vom Filament

Dissoziation von ADP

Hydrolyse Pi

Freisetzung von Pi > Kopfgruppe klappt zurück (Kraftschlag)

Kopfgruppe klappt nach vorn und bindet erneut

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Aufbau glatter Muskel

Einkernige Zellen enthalten unregelmäßig angeordnete AktinMyosin-Filamente, die über Proteinkomplexe (dense bodies) innerhalb der Zelle und Adäsionsstellen an der Zellmembran (adhesion plaques) verankert sind. Die Myosin-Aktin-vermittelt Kontraktion führt über diese Verankerungen zur Kraftübertragung. Glatte Muskel können weniger Maximalkraft übertragen, sind aber ausdauernder und können Spannungszustände über längere Zeit aufrechterhalten (bessere Energieversorgung)

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Funktionen von Aktin in Nichtmuskelzellen • Zellbewegung • Aktin und Myosin II bilden Bündel, die der Zelladhäsion dienen (z.B. in den Gürteldesmosomen der Epithelzellen) • Stressfasern sind kontraktile Filamente, die über Adhäsionsstellen (adhesion plaques) mit der Zelloberfläche verknüpft sind • Aktin und Myosin II sind essentiell bei der physischen Trennung der Tochterzellen im Verlauf der Zellteilung (Zytokinese) • Transport von Vesikel entlang von Aktin-Filamenten (Myosin I und V)

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Zellbewegung

Myosin II-Band

Aktin-Front (enthält auch Myosin I)

41

Verschiedene Signalwege beeinflussen das AktinSystem

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Mikrotubuli ... bestehen aus α-Tubulin und βTubulin-Einheiten (je ca. 55 kD), die sehr stabile Heterodimere bilden. An α-Tubulin ist irreversibel GTP gebunden, an β-Tubulin reversibel GDP oder GTP

α-Tubulin

β-Tubulin

8 nm

Protofilament

24 nm

Lineare Aneinanderreihung der Dimere führt zur Ausbildung von Protofilamenten, die sich wieder zu Singulet-, Doublet- oder TripletMikrotubuli anordnen können

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Das Mikrotubuli-Organisationszentrum Das Wachstum von Mikrotubuli beginnt am Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC, microtubuli organizing center, auch Centrosom), einer Struktur etwa in der Mitte der Zelle, in der γ-Tubulin konzentriert ist und in der in tierischen Zellen oft ein Centriolen-Paar (aus zwei kurzen Triplett-Mikrotubuli) sitzt. Ringkomplexe aus γTubulin wirken als Keim für die weitere Tubulin-Polymerisation. Mikrotubuli wachsen von dort in Richtung der Zellperipherie. Ihr wachsendes Ende wird als Plus-Ende bezeichnet, die dem Centrosom zugewandte Seite Minus-Ende

Centriolen

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Dynamik der Mikrotubuli Auf- und Abbau von Mikrotubuli erfolgt hauptsächlich am Plus-Ende. Wie bei den Aktin-Filamenten kommt es ab einer kritischen Konzentration an Monomeren zur Polymerisation.

Bildung von Protofilamenten

Zusammenlagerung zu Tubuli

Verlängerung der Tubuli 45

Die dynamische Instabilität der Mikrotubuli Die Stabilität der Mikrotubuli hängt von der lokalen Konzentration an GTP-Tubulin ab. Dies führt oft zu einem alternierendem Auf- und Abbau. GDP-Tubulin

GTP-Tubulin

Mikrotubulus

hohe Konzentration an GTP-Tubulin

niedrige Konzentration an freiem GTP-Tubulin

Dissoziation

stabil

instabil

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Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAP´s) Mikrotubuli-assoziierte Proteine vernetzen Mikrotubuli miteinander und mit anderen zellulären Strukturen. Sie haben einerseits eine Mikrotubuli-bindende Domäne und andererseits eine zweite funktionelle Domäne mit der sie entweder Intermediärfilamente, Zellmembranen oder andere Mikrotubuli binden können. Die Bindung von MAP´s an Mikrotubuli stabilisiert diese über Hemmung der TubulinDissoziation.

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Mikrotubuli-Motorproteine: Kinesine und Dyneine Kinesine sind Motorproteine, die über ATP-Hydrolyse in Richtung des Plus-Endes wandern (und transportieren).

superspiralisierte Halsregion mit Bindungsstelle für das Transportgut (e.g. Vesikel)

Kopfregion mit ATPase Aktivität Bindung an Mikrotubuli

Dyneine sind Motorproteine, die zum Minus-Ende wandern. Sie können alleine aber keine Substanzen transportieren - dafür müssen sie einen Komplex mit anderen Mikrotubuli-bindenden Proteinen bilden. 48

Die Rolle der Mikrotubuli beim intrazellulären Transport

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Spezielle Mikrotubuli-Strukturen: Cilien und Geißeln Bewegungen von Geißeln entstehen durch Gleitprozesse der äußeren DublettMikrotubuli, die von DyneinMolekülen initiiert werden

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Intermediärfilamente ...sind sehr stabile Filamente, die im Durchmesser zwischen Mikrotubuli und Mikrofilamenten liegen (d = 10 nm). Sie bestehen aus helikalen Untereinheiten, die sich zu Filamenten zusammenlagern. Im Gegensatz zu Aktin und Tubulin binden sie keine ATP- oder GTP-Nukleotide und es sind auch keine Motorproteine für sie bekannt. Ihre primäre Aufgabe dürfte in den meisten Fällen eine Stützfunktion sein. Intermediärfilament-Proteine sind z.B. die Keratine (in Keratinozyten der Haut und auch in verschiedenen Epithelien), Lamine (A, B und C), die das Filament-Netzwerk an der Innenseite der Kernmembran bilden, Vimentine, die Stützfilamente bilden, sowie Neurofilamente, die die langen Axone der Neuronen stabilisieren. 51

Genereller Aufbau der Intermediärfilamente

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Interaktionen zwischen Intermediär-Filamenten und Mikrotubuli

Verankerung der IntermediärFilamente an Desmosomen und Hemidesmosomen

Plektin (gelb) vernetzt Intermediärfilamente (blau) und Mikrotubuli (rot).

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Themen der Vorlesung

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus Das Zytoskelett Zellkontakte und Zelladhäsion Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus) Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose) Mechanismen der Signaltransduktion Interzelluläre Kommunikation

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Zellkontakte polarisierter Zellen

apikale Oberfläche Mikrovilli

zonula occludens

tight junctions (dichte Verbindungen)

zonula adhaerens

Adhäsionsgürtel laterale Oberfläche

Punktdesmosom gap-junction (offene Verbindung) Intermediärfilament

basale Oberfläche

Hemidesmosom Basallamina

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Schematische Darstellung der Zellkontakte und allgemeine Funktionen

Tight Junctions (zonula occludens) Gürtel-Desmosom (zonula adhaerens, Adhäsionsgürtel) Knopf-Desmosom mit Keratinfilamenten (macula adhaerens)

Gap Junction

Zellkontakte müssen vor allem bei polarisierten Zellen verschiedenste Aufgaben erfüllen: 1.

Es muss eine dichte Abgrenzung erreicht werden zwischen dem apikalen und dem basolateralen Extrazellulärraum

2.

Die Polarität muss aufrecht erhalten werden

3.

Der Zell-Layer muss mechanisch stabilisiert werden

4.

Die interzelluläre Kommunikation muss ermöglicht werden

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Pankreas-Azinuszellen als Beispiel polarisierter Zellen zentrales Kanälchen apikale Membran

sektretorische Vesikel tight junctions

basolaterale Membran

Azinuszelle: synthetisiert Verdauungsenzyme, die sich in sekretor. Vesikeln anreichern

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web.mit.edu (Lectures)

Struktur und Aufbau von „Tight Junctions“ I

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web.mit.edu (Lectures)

Struktur und Aufbau von „Tight Junctions“ II

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Molekulare Struktur und Aufgaben der „Tight Junctions“ •

•

Occludin und Claudin

•

•

Tight Junctions werden von Membranprotein-Komplexen gebildet (Occludin und Claudin), die benachbarte Zellen direkt miteinander verbinden Dadurch entsteht ein undurchlässiger Verschluss, der den Transport zwischen den Zellen hindurch (parazellulären Transport) verhindert. Membranproteine und Lipide werden an dieser Barriere ebenfalls aufgehalten und können nicht zum anderen Zellpol diffundieren Dadurch wird die funktionelle und strukturelle Polarität aufrechterhalten

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Gap Junctions (Verbindungskanäle) ... sind Verbindungsporen zwischen den Zellen, die aus Proteinkomplexen bestehen. Moleküle bis zu einem Durchmesser von 1.2 nm (etwa 2 kd) können durch diese Poren in Nachbarzellen diffundieren. Dazu zählen Ionen, Botenstoffe (second messenger wie Ca2+ oder cAMP), sowie Metabolite.

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Struktur der Gap Junctions : ca. 2 –3 nm

Gap Junctions werden von Kanälen aus Transmembranproteinen (ConnexinProteinen) gebildet, die als Hexamer eine Pore durch die Membran bilden (Connexon) – zwei dieser Connexone benachbarter Zellen bilden einen Kanal zwischen den Zellen (aus insgesamt 12 Connexinen). Bisher wurden 12 Gene der Connexinfamilie identifiziert. Hetero-Oligomere aus verschiedenen Vertretern können unterschiedliche Transporteigenschaften haben.

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Funktionen der Gap Junctions •

Stoffwechselkopplung (Metabolit-Transfer): z.B. von Nukleotiden

•

Interzelluläre Kommunikation über Botenstoffe: cAMP, Ca2+ etc: die Freisetzung dieses „Second Messenger“ in einer Zelle führt zur Stimulierung der Nachbarzellen: z.B. Erhöhung der Ca2+-Konzentration in Muskelzellen führt zur Stimulierung von Nachbarzellen und zur Synchronisation der Kontraktion.

•

elektrische Kopplung der Neuronen (elektrische Synapsen: Übertragungsgeschwindigkeit: wenige µsec; im Gegensatz dazu: chemischen Synapsen über Neurotransmitter: etwa 0.5 msec)

•

Modulierbarkeit der Funktion: Die Öffnung und Durchlässigkeit der Gap Junctions kann durch die Calcium-Konzentration in der Zelle beeinfusst werden.

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Beeinflussung der Gap Junctions durch die Ca2+Konzentration Außerhalb der Zellen ist eine relativ hohe Calcium-Konzentration (1 – 2 mM), in den Zellen ist sie unter 1 µM. Bei Verletzungen eines Epithels und Einfließen extrazellulären Calciums schließen sich die Gap Junctions, um Nachbarzellen abzuschotten. In ähnlicher Weise können Änderungen der intrazellulären Calcium-Konzentration auch im physiologischen Bereich, die Durchlässigkeit der Kanäle modulieren.

Ca2+

Modell der Ca2+-abhängigen Konformationsänderung der Gap Junctions

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Funktion der „Gap Junctions“ in elektrischen Synapsen elektrische Kopplung verbundener Neuronen

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Adhäsionsgürtel ... sind Bereiche der lateralen Zellmembran (meist knapp unterhalb der tight junctions), wo die Zellen über ein Band quervernetzter Proteine (Cadherine) stabilisiert werden. Über Adapterproteine (Catenine, Vinculine) sind diese Bänder mit dem Aktin-Filamentnetzwerk verknüpft.

Cadherine

Adapterproteine (α- und β-Catenin)

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Desmosomen ... sind Haftstellen benachbarter Zellen (15 – 20 nm dick), wo Transmembran-Proteine der Cadherin-Familie (Desmoglein und Desmocollin) mit knopfförmigen Proteinkomplexen aus Plakoglobin (dem β-Catenin verwandt) verknüpft sind. Diese wiederum sind mit den Intermediärfilamenten (Keratinfilamenten) verbunden und bilden funktionell ein suprazelluläres Netzwerk. Schema eines Knopf-Desmosoms: Zellmembranen benachbarter Zellen

Keratinfilamente

cytoplasmatisches Plaque (Plakoglobin) Cadherine (Desmoglein)

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Elektronenmikroskopie von Desmosomem Detailbild des Desmosoms mit den Intermediärfilamenten

web.mit.edu (Lectures)

from: Mol. Biol. of the Cell, 1995

zahlreiche Desmosomen im stratum spinosum der Epidermis zur Stabilierung der äußersten Hautschicht.

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Hemi-Desmosomen „Halb-Desmosomen“, an denen die Intermediärfilamente der Zellen nicht mit Nachbarzellen, sondern mit einer Basalschicht (der Basal-Lamina) verknüpft sind.

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Spezifische, temporäre Zell-Zellkontakte In einigen Fällen treten temporäre Zellkontakte auf, wie z.B. bei der Bindung der Transmigration von Leukozyten durch das Endothel (beim Übertritt vom Blut ins Gewebe):

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Zelladhäsionsmoleküle (Cell Adhesion Molecules, CAM´s)

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Integrine ... sind dimere TransmembranProteine, die aus α- und β-Ketten bestehen. Es gibt etwa 17 verschiedene α-Ketten und 8 unterschiedliche β-Ketten und 22 bekannte Kombinationen von Heterodimeren. Diese erkennen unterschiedliche extrazelluläre Liganden (wie etwa Kollagene, Laminine, Fibronectine sowie spezifische Adhäsionsmoleküle wie etwa ICAM-1 oder VCAM-1). Integrine und ihre Liganden zeigen eher eine schwache Wechselwirkung (KD ca. 10-6), wodurch eine gute Feinregulation (über die Zahl der Bindungsstellen) und Flexibilität ermöglicht wird. 72

Integrine vermitteln den Kontakt von Zellen mit der Extrazellulärmatrix

Fokalkontakte: Stellen an denen Aktinfilamente über Integrine mit extrazellulärem Fibronektin verknüpft sind.

Hemidesmosomen: Stellen an denen Intermediärfilamente aus Keratinen über Integrine (α6β4)mit Laminin in der Basallamina verknüpft sind. 73

Fokalkontakte am Ende von Stressfasern

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Extrazelluläre Matrix Im Gewebe sind viele Struktur- und Stützkomponenten außerhalb der Zellen; diese Strukturkomponenten sind einerseits multimere, faserartige Protein-Verbindungen (wie etwa Kollagen), oder auch Proteoglykane mit hohem Glykan-Anteil. Kollagene: 16 verschiedene Typen; Typ I, II und III bilden lange Fibrillen, Typ IV bildet Netzstrukturen; Kollagene werden hauptsächlich von Fibroblasten (Bindegewebszellen) gebildet, aber auch von bestimmten Epithelzellen.

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Struktur des Kollagens OH

OH

1.5 nm OH

OH

Triplehelix (300 nm lang) aus α-Ketten

Gal Glc

Quervernetzte Triplehelices (um je 67 nm versetzt) Jede α-Kette besteht aus 1050 Aminosäuren mit hohem Anteil an Glycin, Prolin und Hydroxyprolin.

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Synthese, Sekretion und Zusammenbau des Kollagens

Synthese und Glykosylierung im ER als Prokollagen mit endständigen Propeptiden

Fibrillenbildung erst außerhalb der Zelle nach Abspaltung der Propeptide Quervernetzung

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Animierte Darstellung der Kollagensynthese

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Fibronectine ... lösliche Multiadhäsionsproteine in der extrazellulären Matrix, die an Integrine Binden und der Anheftung von Zellen an Kollagenfibrillen (Typ I, II, III und V), sowie Fibrin (Bestandteil der Blutgerinnsel) dienen. Fibronectine sind Dimere; jede Kette besteht aus etwa 2500 Aminosäuren. Durch alternatives Spleißen existieren viele Variationen. Fibronectine haben auch eine wichtige Funktion bei der Wanderung und Differenzierung von Zellen.

Integrin-bindende RGD-Schleife

....

....

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Proteoglykane ... sind stark glykosylierte Proteine mit einem Polypeptide-Kern, der von zahlreichen Glykanen umgeben ist. Die Zuckerreste sind hauptsächlich Glykosaminoglykane (GAG´s) und Uronsäuren, häufig mit Sulfatresten. Dadurch entsteht eine stark negative Ladung und Hydrophilität. Proteoglykane sind sowohl an Zelloberflächen (z.B. Syndecan), als auch in der Extrazellulären Matrix, wo sie z.B. Bestandteil der Knorpelmasse sind (als Aggrecan).

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Proteoglykane in der extrazellulären Matrix In Knorpeln oder ähnlichen Strukturen sind Proteoglykan-Monomere (aus dem Polypeptidkern und vielen Oligosaccharidketten) über Hyaluronsäure (einem langen Oligosaccharid aus Glucuronsäure und NAcetylglykosaminresten) miteinander vernetzt.

Proteoglykan-Monomer Hyaluoronsäure n bis zu 50 000

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Proteoglykane an der Zelloberfläche Bei ZelloberflächenProteoglykanen weist der Polypeptid-Kern eine Transmembranregion auf, sowie eine zytosolische Domäne, die meist mit dem Zytoskelett (Aktinfilamenten) oder Signalmolekülen wie PKC interagieren kann. Der stark glykosylierte Extrazellulärteil bindet meist an Komponenten der extrazellulären Matrix.

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Proteoglykane als Bindungsstellen von Wachstumsfaktoren Proteoglykane (extrazelluläre oder membranständige) können auch meist Wachstumsfaktoren (wie etwa FGF, fibroblast growth factor, oder TGFβ, transforming growth factor-β) binden. Bei manchen Faktoren ist diese Bindung nötig, damit der Faktor auf dem korrespondierenden Rezeptor ein Signal induzieren kann („Präsentation des Wachstumsfaktors“). Außerdem stellen die gebundenen Faktoren einen Vorrat an Wachstumsfaktoren dar, weil sie in der gebunden Form nicht so rasch abgebaut werden.

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Die Basallamina ... etwa 60 – 100 nm dickes Netzwerk aus Kollagen Typ IV, das über Laminin (einem kreuzförmigen trimeren Proteinkomplex mit 820 kDa), sowie Entactin und dem Proteoglykan Perlecan quervernetzt ist. Laminin bindet auch an sulfatierte Lipide, und gemeinsam mit Typ IV-Kollagen an Integrine in der Zytoplasmamembran. Die Basallamina hat wichtige Stütz- und Regulatorfunktionen.

Zelllayer Basallamina Bindegewebe

Laminin Entactin

Perlecan Typ IVKollagen

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Themen der Vorlesung

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus Das Zytoskelett Zellkontakte und Zelladhäsion Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus) Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose) Mechanismen der Signaltransduktion Interzelluläre Kommunikation

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Video-Darstellung des Zellzyklus (Drosophila-Embryonen; Mikrotubuli grün und DNA blau gefärbt)

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Grundlagen der Zellteilung Säugetier-Zellen teilen sich etwa 1x in 24 h (Hefezellen ca. 1x in 90 min) durch eine genau regulierte Aufeinanderfolge von Teilprozessen, die in ihrer Gesamtheit als Zellzyklus bezeichnet werden. Die wichtigsten Phasen dieses Zyklus und ihre ungefähre Dauer in Säugerzellen sind: 1.

G1-Phase (Gap 1, 9 h): Unterbrechungsphase zwischen der physischen Teilung der Zelle und dem Beginn der nächsten DNA-Replikation

2.

S-Phase (Synthesephase, 10 h): DNA-Synthese, Replikation der Chromosomen

3.

G2-Phase (Gap 2, 4.5 h): Unterbrechungsphase zwischen der DNA-Synthese und der Phase der physischen Trennung der Chromosomen und der Zellen.

4.

M-Phase (Mitose-Phase, 30 min): wird in folgende Stadien unterteilt: 4.1. Prophase: Kondensation der Chromosomen (durch Verdrillung) 4.2. Metaphase: Ausrichtung der Chromosomen in der Zellmitte 4.3. Anaphase: Trennung der Schwesterchromatiden zu den gegenüberliegenden Polen des Spindelapparates 4.4. Telophase: Teilung der Zellen (Cytokinese) 87

Schematische Darstellung des Zellzyklus M-Phase: Mitose

G2-Phase: Vorbereitung der Mitose

S-Phase: DNASynthese

ChromosomenKondensation und Trennung

Cytokinese (Zellteilung)

Tochterzellen G0-Phase: dauerhaftes Ruhestadium ohne Zellteilung G1-Phase: Vorbereitung der S-Phase 88

Chronologie der Zellzyklus-Erforschung: 1. Biochemische Untersuchungen an Froscheiern Oocyten des Frosches Xenopus laevis verharren in ihrer Entwicklung 8 Monate lang in der G2-Phase und wachsen dabei stetig. Normalerweise wird die weitere Zellteilung durch Progesteron-Ausschüttung induziert. Wenn man jedoch das Cytosol von Eiern, die in der Metaphase sind (im Stadium der 2. Meiose), in G2-arretierte Zellen injiziert kommt es zur Induktion der Zellteilung (durch Übertragung eines maturation promoting factors, oder mitosis promoting factors MPF – dieser enthält Cyclin B/Cdk) – damit konnte erstmals ein für die Zellteilung essentieller Faktor nachgewiesen werden. Mikroinjektion

Cytosol von MPhase Zelle

G2-arretierte Zelle

MPF

Zellteilung 89

Die Menge an Cyclin B und die Aktivität des Cyclin B/Cdk-Komplexes schwanken im Rhythmus des Zellzyklus Weitere biochemische Experimente zeigten, dass der Cyclin B-Spiegel vor der Mitose ansteigt und in der Mitte der Mitosephase plötzlich abfällt. Dabei werden zuerst PolyUbiquitin Ketten kovalent an Cyclin B angefügt und dieses dann in großen ProteaseKomplexen (den Proteasomen) abgebaut.

90

Ubiquitinylierung mitotischer Cycline „Destruction box“ einiger Cycline Eine Ubiquitin-Einheit: 76 AS Arg-(Thr,Ala)-(Val,Ala)-Leu-Gly-X-Ile-Gly

Anaphase Promoting Complex

Proteasom

E3 (APC) E2

E1

n-Zyklen

zu Peptiden abgebautes Cyclin

E2

n Ubiquitin

Poly-Ubiquitinkette 91

SCF-Komplexe als E3-Ligasen der Ubiquitinylierung

• Substrat-Spezifität erfolgt über das F-Box Protein • Die E3-Ligase Aktivität erfolgt über das RING-box Protein Rbx1 (RING finger Domäne, Zn-bindend) • RING finger Proteine können auch außerhalb von SCF Komplexen auftreten • andere E3-Ligasen: HECT Proteine

92

Abbau durch Proteasomen Ubiquitinylierte Proteine werden spezifisch durch Proteasomen abgebaut. Proteasomen bestehen aus einem zentralen Zylinder (20S-Partikel) mit sehr kleinen Öffnungen an den Enden und Protease-Aktivitäten im Inneren. An den Enden befinden sich ProteasomAktivator-Komplexe: PA700 oder 19S-Aktivator, bzw. PA28 oder 11S-Aktivator (bei Interferon-induzierten Proteasomen). Der PA700-Aktivator erkennt spezifisch ubiquitinylierte Proteine. Durch ATPase-Einheiten des Aktivators wird das Substratprotein entfaltet und durch die enge Öffnung des zentralen Zylinders geschleust, wo es abgebaut wird. α7 β7 β7 α7

15 nm

12 nm

ATPasen Ubiquitin-Bindung

1.3 nm Öffnung

Raummodell des 20SZylinders

26S Proteasom

Protease Aktivität 93

Raumstruktur eines Proteasoms mit einem 11S-Aktivator nach Röntgenstruktur-Analyse

20S_PA26 Trypanosome 1FNT.pdb

94

Autoregulatorischer Abbau des Cyclin B hohe Cyclin B-Spiegel und somit MPF-Aktivität (in der Metaphase) aktivieren durch Phosphorylierung die Ubiquitinylierungsaktivität der E3-Ligase (des APCKomplexes) und führen somit zum Abbau von Cyclin B. Die Proteinkinase-Einheit (cyclindpendent kinase, Cdk) verliert dadurch ihre Aktivität bis wieder neues Cyclin B in der Interphase synthetisiert wird.

95

2. Genetische Untersuchungen mit S. pombe Die Identifizierung der katalytischen Einheit des MPF (der cyclin-abhängigen Kinase) gelang durch genetische Untersuchungen an S. pombe. Temperatur-sensitive Mutanten wurden generiert, die abnorme Längen aufwiesen. Durch Komplementierung mit Wildtyp-cDNA´s konnten entscheidende Faktoren identifiziert werden. Die Kinase-Einheit des MPF wurde Cdc2 genannt, das zu Cyclin B homologe Protein Cdc13. In Säugerzellen hat die Kinase-Einheit den Namen Cdk1 96

3. Genetische Untersuchungen an S. cerevisae Bäckerhefe teilt sich durch Knospung. Die Knospen entstehen in der G1-Phase. Zum Restriktionszeitpunkt (in der Hefe: START genannt) wird der irreversible Übergang zur S-Phase eingeleitet. Nach der DNA-Synthese kommt es in der G2-Phase zur Kernwanderung in die Teilungszone, und in der M-Phase zur Ausbildung des Spindelapparates (innerhalb des Kerns, ohne Auflösung der Kernmembran), Trennung der Chromosomen und Cytokinese. Genetische Untersuchungen zeigten, dass das S. cerevisiae-Gen cdc28 die gleiche Aufgabe erfüllt, wie cdc2 in S. pombe.

Während cdc2 in der Spalthefe vor allem für den Übergang von G2 in die MPhase wichtig ist, ist cdc28 vor allem für den G1-S Übergang essentiell

97

Komplementierungsstudien führten zur Identifizierung der G1-Cycline Temperatursensitive Cdc28-Mutanten weisen oft eine reduzierte Affinität der Cdc28 Kinase zu seinem Cyclin-Bindungspartner auf. Durch Überexpression von Cyclin-Genen kann diese reduzierte Affinität kompensiert werden. Auf diese Weise wurden die G1-Cycline in der Hefe identifiziert: CLN1, CLN2 und CLN3. Der Komplex aus Cdc28 und G1-Cyclinen induziert den Übergang in die S-Phase, indem er einen S-Phase-Inhibitor (Sic1) phosphoryliert, was zu dessen Ubiquitinylierung führt (über Cdc34 als E2-Enzym und einem SCF-Komplex als E3-Ligase) und seinen Abbau induziert.

98

Raumstruktur eines Cyclin/Cdk-Komplexes

aktives Zentrum

Threoninrest, der phosphor. wird

Cyclin A Cdk2 ohne Cyclin A

Cdk ohne Cyclin: aktives Zentrum durch eine Peptidschleife blockiert. Änderung der Raumstruktur der Cdk durch Bindung an Cyclin, weitere Änderung durch Phosphorylierung (durch Cdk-aktivierende Kinasen, CAK) > Zunahme der Cdk-Aktivität.

99

Abbau der Kernhülle in der frühen Mitose-Phase Mitotische Cyclin B/Cdk Komplexe führen zur Phosphorylierung der Lamine (Intermediärfilamente) der Kernmembran und somit zu ihrer Depolymerisation

Cyclin B/Cdk

P P

P P P

P

P P

quervernetzte Lamin-Filamente Depolymerisation und Dissoziation

100

2 nm

Kondensation der Chromosomen in der Prophase der Mitose ... durch einen Proteinkomplex namens Condensin: führt zur Superspiralisierung der DNA unter Hydrolyse von ATP.

11 nm 30 nm

300 nm

700 nm

1400 nm 101

Wirkungen des Anaphase-fördernden Komplexes (APC) Der Cyclin B/Cdk-Komplex aktiviert den APC; dieser ubiquitinyliert den AnaphaseInhibitor, der die Trennung der Schwesterchromatiden blockiert. Nach Abbau dieses Inhibitors wir die Anaphase und die Chromosomentrennung induziert; danach führt der APC zur Ubiquitinylierung und zum Abbau von Cyclin B.

102

Zusammenbau der Kernhülle in der Telophase Subporenkomplexe teilw. dekondensiertes Chromosom Vesikel der Kernhülle

Anheftung der Vesikel ans Chromosom Fusion der Vesikel und Bildung der Kernporen Kernpore

Karyomer (Minikern) Fusion der Karyomere Neubildung der Kernlamina 103

Säugerzellen Viele Zellen höherer Organismen unterbrechen den Zellzyklus in der G1-Phase und treten in einen dauerhaften Ruhezustand, die G0-Phase. Zugabe bestimmter Wachstumsfaktoren lässt sie wieder in den Zellzyklus eintreten, indem die Expression zweier Genklassen induziert wird: 1. Gene der schnellen Reaktion (early response genes): Expression durch bereits vorhandene Transkriptionsfaktoren – kann nicht durch Proteinsynthese-Inhibitoren blockiert werden (z.B. Expression von c-Fos und c-Jun) 2. Gene der verzögerten Reaktion (delayed response genes): werden durch Transkriptionsfaktoren induziert, die in der schnellen Reaktion gebildet wurden. Zu diesen Genen gehören z.B. Cyclin D und E, Cdk2, -4 und –6, sowie der Transkriptionsfaktor E2F, der viele essentielle Proteine des Zellzyklus induziert. 104

Signalwege zur Initiierung des Zellzyklus in Säugerzellen Die Expression von Genen der schnellen und der verzögerten Reaktion wird durch komplexe Signalwege induziert, die durch Zelloberflächen-Rezeptoren initiiert werden. Rezeptor-Tyrosin Kinasen (RTK´s): binden Wachstumsfaktoren wie FGF oder EGF

Bindung des Liganden an den Rezeptor induziert dessen Dimerisierung und autokatalytische TyrosinPhosphorylierung. Phosphotyrosin-Reste sind eine Bindungsstelle für Adapterproteine mit sogenannten SH2-Domänen (z.B. GRB2) – diese können das Signal über andere Bindungsregion weiterleiten, z.B. über eine SH3Domäne an das nächste Molekül: Sos. Dieses wiederum ist ein Guanin-Austauschfaktor (guanine nucleotide exchange factor, GEF) für die GTPase Ras. Dadurch wird Ras in den aktiven GTP-Zustand übergeführt, was die Aktivierung weiterer Signalwege induziert.

105

Die Signalübertragung von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen auf die GTPase Ras

GDP inaktives Ras

aktives Ras

Dimerisierung, Autophosphorylierung der RTK > Bindung von GRB2 und Sos > Rekrutierung und Aktivierung von Ras

aktives Ras aktiviert weitere Signalwege: MAPK-Weg (Mitogen activated Protein Kinase) 106

Übertragung des Signals von Ras auf Mitogenaktivierte Protein Kinasen (MAPK) aktives Ras bindet und aktiviert die Serin-Kinase Raf, wird selbst wieder in inaktives GDP-Ras überführt, während Raf wieder eine Kinase aktiviert (MEK).

Raf Ras

MEK

aktive MEK MAPK Aktive MEK phosphoryliert und aktiviert wiederum eine MAPK, die in den Zellkern wandert und dort Transkriptionsfaktoren aktiviert, die für den Zellzyklus essentiell sind. generelles Schema:

aktive MAPK

MAPKKK (MEKK) MAPKK (MEK) MAPK

107

Aktivierung von Transkriptionsfaktoren über den RTK-Ras-MAPK-Signalweg

108

Cyclin/Cdk-Komplexe im Zellzyklus von Säugerzellen Cdk1/Cyclin B Cdk1/Cyclin A

G2

G0

M

S Cdk2/Cyclin A

Restriktionspunkt

G1

Cdk4/Cyclin D Cdk6/Cyclin D

Cdk2/Cyclin E

109

Überschreiten des Restriktionspunktes (G1/S-Übergang) in Säugerzellen durch Cyclin D/Cdk4 (6)-vermittelte Aktivierung von E2F Der Transkriptionsfaktor E2F ist essentiell für die Expression verschiedener Zellzyklus-Proteine (wie etwa Cyclin A und E, sowie Cdk2 usw.). E2F ist normalerweise durch Bindung an Retinoblastoma-Proteine (Rb, p107, p130) inaktiviert. Cyclin D/Cdk-Komplexe führen zu einer Phosphorylierung von Rb, einem Abdissoziieren des Inhibitors und Aktivierung von E2F. Die von E2F induzierten Proteine Cdk2 und Cyclin E phosphorylieren ebenfalls Rb, was zu einer weiteren Verstärkung der E2F-Aktivierung führt. Rb bleibt bis zum Ende des Zellzyklus phosphoryliert, bis es dann in der nächsten G0/G1-Phase durch die geringe Menge Cyclin/Cdk dephosphoryliert wird und wieder E2F hemmt.

110

Weitere wichtige Cyclin/Cdk Komplexe • Cyclin A/Cdk2 induziert die DNA-Synthese > Einleitung der DNA-Replikation an den in der frühen G1-Phase gebildeten Präreplikationskomplexen und Hemmung der Bildung neuer Präreplikationskomplexe (um sicherzustellen, dass die DNA nur einmal repliziert wird).

• Cyclin A (B)/Cdk1 reguliert den Übergang zur M-Phase (G2/M-Transition)

111

Cyclin-Kinase Inhibitoren steuern die Aktivität der Cdk´s in Säugerzellen Es gibt 2 Klassen von Cdk-Inhibitoren 1. Familie der CIP-Proteine (Cdk-Inhibitor Proteine), die alle Cyclin/Cdk-Komplexe hemmen (p21, p27, p57). 2. INK4-Proteine (Inhibitoren der Kinase 4- Proteine, z.B. p16, p19): hemmen spezifisch Cyclin D/Cdk4 und Cyclin D/Cdk6. Diese Proteine hemmen die Phosphorylierung von Rb und somit die Aktivierung von E2F. Deshalb werden sie auch als Tumorsuppressor-Gene angesehen. Außerdem haben sie wichtige Funktionen bei der Embryonalentwicklung und bei der Steuerung der Differenzierung von Zellen.

112

Zellzyklus-Kontrollpunkte Um Fehler im Zellzyklus zu vermeiden gibt es viele Regulationsmechanismen: 1.

Nicht replizierte DNA verhindert den Beginn der Mitose

2.

Fehler im Aufbau des Spindelapparates halten den Zellzyklus in der Anaphase an.

3.

DNA-Schäden führen zur Expression von Tumorsuppressor-Genen und dem Anhalten des Zellzyklus in der G1- oder der G2-Phase

113

Das Tumorsuppressor-Gen p53 DNA-Schäden führen zur Stabilisierung eines Proteins, das normalerweise nur in geringer Menge vorhanden ist: p53. Dieses Protein ist ein Transkriptionsfaktor, der die Expression der Cdk-Inhibitoren p21 und p27 induziert und zu einem G1oder G2-Arrest führt. Dadurch hat die Zelle Zeit den Schaden wieder zu reparieren – gelingt dies, kann der Zellzyklus fortgesetzt werden, wenn es nicht gelingt, wird in vielen Fällen der programmierte Zelltod (Apoptose) induziert. Die Menge von p53 wird durch komplexe Regulationsmechanismen mittels Ubiquitinylierung (über das Protein Mdm2) und proteasomalen Abbau gesteuert. Mutationen von p53 sind bei den meisten Krebsarten vorzufinden.

114

Aktuelles Modell des Zellzyklus

10 Ubiquitinylierung und Abbau der M-Cycline (APC-Weg)

9 Ubiquitinylierung des Anaphase-Inhibitors über den APC-Weg und Abbau durch Proteasomen

Telophase und Cytokinese

1 Anaphase

8

G1/CdK

3

G2

M/CdK Metaphase

2

G1

M

S

Restriktionspunkt

7

S/CdK

4

Inhibit.

5 S/CdK Komplex aus Cyclin und Cyclinabhängiger Kinase (CdK, Cyclindependent Kinase) der entsprechenden Zellzyklus-Phase (G1, S, M)

6

DNA-Replikation

Ubiquitinylierung über den Cdc34-Weg und Abbau durch Proteasomen

115

Die wichtigsten Teilprozesse des Zellzyklus 1.

Entstehen von DNA-Präreplikationskomplexen

2.

G1-Cyclin/CdK inaktiviert den APC (Anaphase-Promoting Complex)

3.

G1-Cyclin/CdK aktiviert die Transkription von S/CdK-Komponenten

4.

G1-Cyclin/CdK phosphoryliert den S/CdK-Inhibitor und markiert ihn zum Abbau

5.

Ubiquitinylierung des S-Cyclin/CdK-Inhibitors über den Cdc34-Weg und Abbau durch Proteasomen

6.

Aktivierung der DNA-Präreplikationskomplexe durch S-Cyclin/CdK

7.

M-Cyclin/CdK aktiviert die Chromosomenkondensation, den Zerfall der Kernhülle und den Aufbau des Spindelapparates. Gleichzeitig Zerfall von ER und Golgi in kleine Vesikel.

8.

Aktivierung des APC durch M-Cyclin/CdK

9.

Ubiquitinylierung und Abbau des Anaphase-Inhibitors durch Proteasomen (APC-Weg)

10. Ubiquitinylierung und Abbau der M-Cycline Auf dem APC-Weg

116

Mikrotubuli in der M-Phase des Zellzyklus

117

Der Spindelapparat in Säugerzellen Funktion: Exakte Trennung der Schwesterchromatiden und Verteilung auf die Tochterzellen Struktur: 1)

Zentraler Spindelapparat: a) Pol-Mikrotubuli: vom Centrosom in die Mitte (überlappend) b) Kinetochor-Mikrotubuli: vom Centrosom zu den Chromosomen

2)

Asteren: Astralmikrotubuli: vom Centrosom zum Cortex

118

Rolle der Mikrotubuli 1.

Die Polmikrotubuli: übertragen Druckkräfte nach außen zum Auseinanderdrücken der Pole

2.

Die Kinetochor-Mikrotubuli binden an die Chromosomen und halten sie am Centromer

3.

Die Astralmikrotubuli vermitteln Zugkräfte nach außen und dienen zur Positionierung des Spindelapparates und zur Festlegung der Trennebene zwischen den Zellen 119

Übergang von der Metaphase in die Anaphase durch Inaktivierung der Cohesine Der Anaphase-Inhibitor wird ubiquitinyliert und in Proteasomen abgebaut, dadurch wird der CohesinKomplex, der die Schwesterchroamtiden zusammenhält aufgelöst und die Chromatiden können auseinandergezogen werden

120

Duplikation und Wanderung der Centrosomen Die Centrosomen beginnen bereits in der G1-Phase mir der Verdopplung; die volle Länge erreichen die Centriolen in der G2-Phase (sie sind jedoch immer noch in einem Centrosom). Danach trennen sie sich und wandern auf gegenüberliegende Seiten der Zelle (in der frühen M-Phase). Diese Trennung wird über Motorproteine (Kinesin Related Proteins, KRP´s) vollzogen.

121

Der mitotische Spindelapparat ist viel dynamischer als Interphase-Mikrotubuli Interphase-Mikrotubuli sind rel. lang und stabil (mittlere Lebensdauer: 10 min); die in der Mitose gebildeten Spindel- und Asterenmikrotubuli sind deutlich kürzer und instabiler (Lebensdauer in der Spindel: etwa 30 sec !). Diese dynamische Instabilität dient dem „Einfangen“ der Chromosomen und dem dynamischen Aufbau des Spindelapparates

122

Dynamik der Kinetochor-Mikrotubuli Wenn die Kinetochor-Mikrotubuli die Chromosomen nicht mit dem Ende zuerst kontaktieren, transportieren Motorproteine des Kinetochors das Chromosom zum Ende des Mikrotubulus – dort stabilisiert der Kinetochor-Komplex das Mikrotubulus-Ende

Durch dynamische Verlängerung und Verkürzung der Mikrotubuli, sowie Motorproteine am Kinetochor werden die Chromosomen im Zell-Äquator ausgerichtet (in der Prometaphase) 123

Anaphase A In der Anaphase A verkürzen sich die Kinetochor-Mikrotubuli durch Depolymerisation an den Plus-Enden, während die Chromosomen entlang der Mikrotubuli polwärts wandern

... dies kann experimentell durch Ausbleichen fluoreszenz-markierter Mikrotubuli des Spindelapparates und Untersuchung des Fluoreszenzverlaufs gezeigt werden.

124

Anaphase B In der Anaphase B verlängern sich die Pol-Mikrotubuli durch Polymerisation an den Plus-Enden und Kinesin-ähnliche Motorproteine drücken die Pole auseinander. Gleichzeitig kann von den Astralmikrotubuli aus eine Zugkraft ausgeübt werden (über Minus-gerichtete Motor-Proteine, die am Cortex liegen).

125

Themen der Vorlesung

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus Das Zytoskelett Zellkontakte und Zelladhäsion Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus) Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose) Mechanismen der Signaltransduktion Interzelluläre Kommunikation

126

Apoptose und Nekrose

Apoptose (programmierter Zelltod): Membran bleibt intakt

Änderung der Eigenschaften von: Membran Mitochondrien Kern Cytoplasma

Nekrose: Membran wird undicht

127

Nekrose Nekrose kann durch Toxine entstehen oder auch durch eine mangelnde Versorgung mit Nährstoffen. In vielen Fällen wird dadurch der Energiehaushalt der Zellen unterbunden, es kommt zum Zusammenbruch der Mitochondrienfunktion, zum Verlust von ATP und zum Sinken des cytosolischen pH-Wertes. ATP-abhängige Ionenpumpen arbeiten nicht mehr, es kommt zur Änderungen des osmotischen Drucks, zum Einströmen von Wasser (Anschwellen der Zellen) und zum Platzen von Lysosomen. Dadurch geraten verschiedene Enzyme und Hydrolasen in den Extrazellulärraum und es kommt zu entzündlichen Prozessen und zur unkontrollierten Autolyse. Im Körper gibt es 2 Hauptformen von Nekrose: 1. die koagulative Nekrose: durch Abschneiden bestimmter Gewebebereich von der Blutversorgung aufgrund von Blutgerinnseln (z.B. Herzinfarkt, Schlaganfall...). In diesem Fall bleibt die Gewebe- und Zellarchitektur großteils erhalten 2. Die lytische Nekrose: Auflösung der Zellen durch Autolyse, wenn größere Mengen lytischer Enzyme freiwerden; z.B. bei der Abwehr bakterieller Infektionen durch neutrophile Granulzyten (Phagozyten), die lytische Enzyme freisetzen (Eiter: abgestorbene Granulozyten und Hydrolasen). Gangräne: Kombinationen von koagulativen und lytischen Nekrosen (trocken: mehr koagulativ, feuchte Gangrän: mehr lytisch) 128

Beispiele nekrotischer Veränderungen koagulative Nekrose des Herzens

lytische Nekrose im Gehirn

Gangrän von Zehen

129

Morphologie der Apoptose I

apoptotische HeLa Zellen (nach TNFα-Behandlung)

130

Morphologie der Apoptose II Schrumpfung der Zelle; Änderung der Membranzusammensetzung (Umklappen von Phosphatidylserin-Resten auf die Außenseite); Verdichtung und Trennung des Chromatins

Fragmentierung des Zellkerns, Bildung von Blasen an der Zelloberfläche („membrane blebbing“), Fragmentierung der Zelle Phagozytose durch Makrophagen oder Granulozyten „apoptotisches Körperchen“ (apoptotic body) Phagozyt apoptosis.mht 131

Die Rolle der Apoptose bei der Entwicklung: Genetische Untersuchungen an C. elegans abgestorbene Zellen (in einer Larve, bei der die Phagozytose blockiert wurde)

Der Wurm Caenorhabditis elegans wurde als Modellorganismus gewählt, weil er eine klar definierte Entwicklung hat: im Verlauf dieser werden genau 1090 Körperzellen gebildet, von denen 131 durch Apoptose absterben. Durch Mutationen konnte man dafür essentielle Gene identifizieren: Ced-3 und Ced-4: notwenig für die Apoptose (Säuger-Homologe: Caspasen und Apaf-1) Ced-9: Regulator, der die Apoptose hemmt (Säuger-Homolog: Bcl-2)

132

Caspasen Cystein-Proteasen, die nach Aspartat-Resten in bestimmten Sequenzen spalten: sind meist als inaktive Proformen in der Zelle. Initiator-Caspasen: aktivieren sich autokatalytisch (autoproteolytisch) nach best. Signalen, die Substrate dieser Caspasen sind die: Effektor-Caspasen: werden von Initiator-Caspasen aktiviert und spalten dann bestimmte Substrate inaktives Pro-Enzym

Spaltung bei Caspase Spaltstellen aktive Caspase (Tetramer aus 2 großen und 2 kleinen Untereinheiten) 133

Caspasen 1-12 in Säugerzellen

134

Substrate der Effektor-Caspasen •Signalproteine der Überlebensmechanismen (z.B. NF-κB und dessen Regulatoren) •Proteine, die für die Funktionalität der Mitochondrien und der Atmungskette wichtig sind •DNA-Reparatur-Mechanismen (z.B. PARP: Poly-ADP-Ribose Polymerase, die DNAStrangbrüche markiert) •Kernlamina: zur Fragmentierung des Kerns •Cytoskelett-Komponenten •Enzyme, die nach Caspase-vermittelter Aktivierung DNA spalten (DNAFragmentierung genau zwischen den Histonen > Leiter-Effekt in der Elektrophorese)

Endonuclease-Spaltung 135

Zusammenbruch des Cytoskeletts bei der Apoptose

Intermediärfilamente (Cytokeratine) bei normalen Zellen

bei apoptotischen Zellen

Carla Fiorentini et al. 136

Induktion der Apoptose über Mitochondrien Verschiedene zelluläre Stress-Situationen können zu einer Veränderung der Permeabilität der äußeren Mitochondrien-Membran führen. Dadurch wird Cytochrom c aus dem Intermembranraum ins Cytosol freigesetzt, das gemeinsam mit Apaf-1 (Apoptosis Protease Activating Factor 1) an Procaspase 9 bindet und dessen autokatalytische Aktivierung induziert. Caspase 9 führt dann zur Aktivierung von Effektor-Caspasen, wie Caspase 3. Parallel dazu bricht die mitochondriale Atmungskette zusammen und das mitochondriale Membranpotential Procaspase 9

bcl-xL Apaf1

Caspase 9

ATP

Caspase 3

Cytochrom c

„permeability transition pore“

137

Regulation der Mitochondrien-vermittelten Apoptose Mitglieder der Bcl-2 Protein-Familie können pro- oder anti-apoptotisch wirken. Es wird vermutet, dass sie durch Di- oder Oligomerisierung Poren bilden können und durch Heterodimerisierung sich gegenseitig regulieren können. Bcl-2 und Bcl-xL wirken anti-apoptotisch; Bax, Bcl-XS oder Bad pro-apototisch

Bcl-2

P

14-3-3: bindet an Phospho-Serinreste von Bad und hält es im Cytosol

Bad Dephosphorylierung von Bad > Bindung an Bcl-2 und Inaktivierung von Bcl-2 Bax

Diablo/Smac: binden und inaktivieren CaspaseInhibitoren Caspase-Inhibitoren (IAP´s inhibitors of apoptosis) Cytochrom C/Apaf1

Caspase 9 Aktivierung

138

ApoptoseInduktion über DNASchäden und p53

139

Regulation der Apoptose II Abwesenheit von Überlebensfaktoren

Anwesenheit von Überlebensfaktoren trophischer Faktor NGF

Rezeptor

Procaspase3

Caspase 3

PI-3 Kinase 14-3-3

Caspase 9

Akt

Bad

Cytochrom c

Ionen 140

Induktion der Apoptose durch Rezeptoren an der Zelloberfläche und Vernetzung mit dem mitochondrialen Weg TNFR1

TNFR1 FADD

TNFR... FADD... TRADD ... TRAF...

TRADD TRAF2

Procaspase 8

Tumor necrosis factor receptor Fas associated death domain protein TNFR associated death domain protein TNFR associated factor

Überlebenssignale Caspase 8

Bid

prozessiertes Bid geht an die MitochondrienMembran und induziert die Freisetzung von Cytochrom c

Apoptose

141

Balance zwischen Apoptose und Überlebenssignalen TNFα

TNFα TNFR1

TNFR1 FADD

TNFR2

Procaspase 8 Caspase 8

Apoptose TNFR... FADD... TRADD ... TRAF... NEMO... MEKK1... NIK... IKK... IκB... NF-κB...

MEKK1

NIK

P

Caspase 3, 6, 7 JNK

TRAF2

TRADD TRAF2

TNFR2

MEKK1

TRAF1 NIK

PKC P

IKK1 IKK2

Tumor necrosis factor receptor Fas associated death domain protein IκB P TNFR associated death domain protein TNFR associated factor NF-κB p50 p65 NF-κB essential modulator MAPK/ERK kinase kinase 1 NF-κB inducing kinase IκB kinase Inhibitor of NF-κB AP-1 p50 p65 Nuclear transcription factor κB

TAK1/TAB1 PKR XIAP

TRAF6-med. ubiquitination

Caspase 3, 6, 7 NEMO Caspase 3, 6, 7 ubiquitination Caspase 3, 6, 7

Transkription

Abbau in Proteasomen Caspase Inhibitoren (IAP´s) anti-apoptotische Gene Proliferationsfaktoren (Cycline) 142

Induktion der Apoptose durch cytotoxische TZellen

MHC Molekül

Fas

T-Zellrezeptor

FasL cytotoxische T-Zelle

Zellen, die „entartet“ sind (Tumorzellen oder Virus-befallene Zellen) werden durch cytotoxische T-Zellen zur Apoptose „gezwungen“ durch Bindung des Fas-Liganden an den Fas-Rezeptor in Verbindung mit T-Zell-Rezeptor und einem Molekül das fremdartige Antigene präsentiert (MHC... major histocompatibility complex)

T-Zellen werden in den Lymphknoten darauf geschult, normale Zellen nicht anzugreifen. T-Zellen, die statt entarteter Zellen gesunde Körperzellen erkennen würden, werden dort zur Apoptose gezwungen. 143

Fas-mediierte Apoptose

144

Cytotoxische T-Zellen haben auch andere Wege um Zellen zur Apoptose zu zwingen Sekretion von Granzyme B und Perforin führt zur „Durchlöcherung“ der Zielzelle und der Aktivierung der Apoptose-wege, indem Granzyme B die Procaspasen spaltet und aktiviert.

145

146

Themen der Vorlesung

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus Das Zytoskelett Zellkontakte und Zelladhäsion Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus) Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose) Mechanismen der Signaltransduktion Interzelluläre Kommunikation

147

Signalübertragung über Botenstoffe 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Synthese des Botenstoffes: lipophile meist im Cytoplasma, Peptidhormone und hydrophile Botenstoffe meist im ER Freisetzung (Sekretion): lipophile durch Diffusion durch die CytoplasmaMembran, hydrophile durch sekretorische Granula Transport zur Zielzelle: a) über den Blutkreislauf b) durch Diffusion Bindung an spezifische Rezeptoren: a) an der Zelloberfläche b) intrazellulär (z.B. Transkriptionsfaktoren) Aktivierung eines intrazellulären Signals: oft über Adapterproteine, sekundäre Botenstoffe, Signalkaskaden Ausschalten des Signals (und Entfernung des Botenstoffes): a) Endozytose und Abbau von Rezeptor und/oder Ligand b) Enzymatische Inaktivierung des Botenstoffs oder Deaktivierung von Signalmolekülen (z.B. Dephosphorylierung, Spaltung von GTP bei GProteinen...)

148

Formen der Signalübertragung •

•

Blutgefäß

endokrin: Der Signalstoff wird von endokrinen Organen (z.B. Drüsen) freigesetzt, die nicht direkt neben den Zielzellen liegen (Übertragung meist über den Blutkreislauf)

endokrine Drüse

Zielzellen

parakrin: Der Signalstoff wirkt auf benachbarte Zellen (Übertragung meist über Diffusion) sezernierende Zelle

•

•

autokrin: Der Signalstoff wirkt auf die Zelle, die ihn sezerniert hat.

benachbarte Zielzelle

Zielorte auf der gleichen Zelle

direkter Zellkontakt: Der Signalstoff ist membrangebunden und bindet an einen Rezeptor einer anderen Zelle (z.B. immunologische Synapse). signalisierende Zelle

empfangende Zelle

149

Botenstoffe I: Hormone •

lipophile Hormone: z.B. Steroide wie Progesteron (durchdringen die Zellmembran durch Diffusion und binden an intrazelluläre „Rezeptoren“ z.B. Transkriptionsfaktoren) Progesteron

•

Retinsäure

hydrophile Peptid-Hormone: können nicht durch die Membran diffundieren und binden an Zelloberflächen-Rezeptoren: z.B. Insulin, Glucagon, Wachstumsfaktoren: werden oft aus einer inaktiven Proform gebildet

150

Weitere Hormone •

kleine hydrophile Hormone: z.B. Adrenalin, Serotonin, Histamin

Serotonin (5-Hydroxytryptamin)

•

Histamin

lipophile Hormone mit zelloberflächen-Rezeptoren: z.B. Prostaglandine, Thromboxane und Leukotriene.

151

Überblick über Rezeptoren •

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (z.B. Adrenalin- oder Serotonin-Rezeptoren)

Rezeptor G-Protein

•

Ionenkanalrezeptoren (z.B. Acetylcholinrezeptor)

•

Tyrosin-Kinase gekoppelte Rezeptoren (z.B. Interferon-Rezeptoren): aktivieren intrazelluläre Tyrosin-Kinasen

•

Rezeptoren mit eigener Enzymaktivität: z.B. Rezeptor-Tyrosinkinasen

152

Sekundäre Botenstoffe (Second Messenger) werden meist intrazellulär gebildet oder freigesetzt, wenn bestimmte Botenstoffe entsprechende Rezeptoren und Signalwege aktivieren. Übertragen oder verstärken das Signal intrazellulär: • • • • •

cAMP: cyclisches Adenosin-3‘,5‘ monophosphat cGMP: cyclisches Guanosin-3‘,5‘ monophosphat DAG: 1,2-Diacylglycerin IP3: Inositol-1,4,5-triphosphat Ca2+ ....

153

GTPasen als „Schaltproteine“ 1. trimere G-Proteine

binden an G-Protein gekoppelte Rezeptoren und übertragen das Signal an Effektorproteine (z.B. Adenylatzyklasen)

2. Kleine GTPasen (Ras-ähnlich) 6 Familien: Ras, Rho, Rab, Ran, ARF und RGK: aktive Form: GTP-gebunden, inaktive: GDP GEF: guanine nucleotide exchange factors: tauschen GDP gegen GTP GAP: GTPase Aktivierende Proteine

blau: α cyan: β grün: γ gelb: GDP

154

Adapterproteine ... haben keine eigene Enzymaktivität, können aber an Rezeptoren oder Signalenzyme (z.B. Kinasen) binden und dadurch das Signal weiterleiten oder regulieren. ... haben meist Interaktionsdomänen: z.B.: SH2oder PTB-Domänen (binden an phosphorylierte Tyrosinreste), SH3- und WW-Domänen (binden an prolinreiche Sequenzen), PH-Domänen binden an Phosphoinoside.... Die Kombination von Adapterdomänen mit Enzymaktivitäten (z.B. Kinasedomänen) bietet eine sehr hohe Flexibilität der Signalübertragung.

Prolin-reiche Sequenz

SH2-Domäne von Grb-2

SH3-Domäne

P-Tyrosin-Peptid

155

Bindung von Botenstoffen an Rezeptormoleküle folgt den normalen Gleichgewichtsgesetzen: R + H (R ... Rezeptor, H... Hormon).

RH

KD entspricht der Konzentration des Liganden bei Halbsättigung des Rezeptors. Meist ist die Hormonkonzentration im Blut im Bereich der Dissoziationskonstanten > kleine Konzentrationsänderungen führen zu deutlichen Änderungen der Rezeptorbindung.

156

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR)

Membranproteine mit 7 TransmembranRegionen. Liganden: meist kleine hydrophile Botenstoffe (binden zwischen den Helices). Intrazelluläre Bindungspartner: trimere GProteine (binden an C3, C2-Schleifen und CTerminus). Funktionen: Glucose-Metabolismus (durch Adrenalin etc. geregelt), schnelle Signalübertragungen (Muskelkontraktion, Herzfrequenz.. 157

Signalübertragung über G-Proteine I Ligand (z.B. Hormon)

GPCR (Rezeptor)

beta-subunit

alphasubunit

GDP bzw. GTP liegen in einer „Tasche“ zwischen den einzelnen Einheiten des trimeren G-Proteins. Bindung an den Rezeptor (GPCR) induziert die Dissoziation von GDP und die Bindung von GTP (das in der Zelle in höherer Konzentration vorliegt). Diese Bindung induziert eíne deutliche Strukturänderung und die Dissoziation der α-Kette von Gβγ

GDP/GTP

158

Signalübertragung über G-Proteine II

Gγ G β

Gsα Effektor enzym

5. das Hormon dissoziiert vom Rezeptor, durch GTP-Hydrolyse löst sich Gsα vom Effektorenzym und bindet wieder an Gβγ

1. Hormonbindung induziert eine Konformationsänderung des Rezeptors

4. Gsα bindet an das Effektorenzym (Adenylatzyklase) und aktiviert es (zur cAMP-Synthese)

2. G-Protein bindet über Gsα an den Rezeptor

3. durch die Bindung an den Rezeptor ändert sich die Struktur des Gsα und GDP wird durch GTP ersetzt, Gsα dissoziiert von Gβγ ab.

159

Signalübertragung über G-Proteine III Oft sind Effektorenzyme ebenso wie G-Protein gekoppelte Rezeptoren Membranproteine mit mehreren Transmembranregionen. Da die G-Proteine selbst über Lipidketten in der Membran verankert sind, sind die Diffusionsstrecken zwischen GPCR und dem Effektorenzym gering. Schematische Darstellung der Adenylatzyklase Durch die enzymatische Aktivität und die Bildung vieler sekundärer Botenstoffe (cAMPMoleküle) kommt es zu einer deutlichen Signalverstärkung

Es gibt stimulatorische und inhibitorische G-Protein (Gs und Gi)

160

Rezeptor-Tyrosinkinasen ... dimerisieren nach Bindung des Liganden (z.B. einem Wachstumshormon), wodurch es zur gegenseitigen Phosphorylierung von Tyrosinresten auf der cytoplasmatischen Domäne kommt und zur Bindung von Adapterproteinen an die P-Tyr-Reste über SH2-Domänen (Grb2 – Sos). Dadurch werden weitere Signalmoleküle aktiviert (GTPase Ras) und das Signal wird an weitere Signalwege weitergeleitet (MAPKKaskade)

161

Serin/Threonin-Kinasen (MAP-Kinasen) ERK/MAPK-Weg (Proliferation)

JNK-Weg

p38-Weg

(Stress Response)

RTK‘s Grb2/Sos GTPase

Ras

Rac/Cdc42

„Scaffold proteins“ („Gerüst-Proteine“) bringen die verschiedenen Kinasen in räumliche Nähe zueinander

PAK‘s MAPKKK

Raf

MEKK1-3

TAK1

MAPKK

MEK1 MEK2

MEK4 MEK7

MEK3 MEK5

MAPK

ERK1 ERK2

JNK/SAPK

p38 162

Effekte sekundärer Botenstoffe: cAMP Verstärkung des Eingangssignals durch eine Signalkaskade

Aktivierung cAMP-abhängiger Kinasen (PKA, Protein Kinase A): im Ruhezustand als Tetramer inaktiv (2 regulatorische, 2 katalytische Einheiten), Bindung von cAMP (kooperativ) an die regulatorischen Einheiten führt zur Dissoziation und Aktivierung der katalytischen Einheiten

163

Sekundäre Botenstoffe: Phosphatidylinosit-Derivate

cytosol. Seite der ZytoplasmaMembran

Membranständige PI-Kinasen bilden die PI-Derivate PIP und PIP2, Spaltung von PIP2 durch das Signalenzym Phopholipase C (PLC) führt zur Bildung der second messenger IP3 (Inositol 1,4,5-Triphosphat) und DAG (Diacylgyzerin) 164

Wirkung von IP3 auf den Calcium-Spiegel

Rekrutierung von PKC an die Zellmembran

PLC kann durch HormonBindung an GPCR über trimere G-Proteine aktiviert werden. Dies führt zur Freisetzung von IP3 ins Cytosol und Bindung von IP3 an Calciumkanäle des ER, die dadurch geöffnet werden. Das ausströmende Calcium fördert wiederum das Öffnen von Calciumkanälen an der Zelloberfläche (Verstärkungseffekt). Die Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration führt zur Fixierung Ca-abhängiger Proteinkinase C-Formen (PKC) an die Zellmembran, wo es durch DAG aktiviert wird und Rezeptoren oder andere Substrate phosphoryliert. 165

Calcium/Calmodulin Calmodulin ist ein kleines Ca2+-bindendes Protein (16.7 kD) mit 4 Bindungstellen für Calcium. Wenn alle Bindungsstellen besetzt sind nimmt es eine gestreckte helikale Konformation ein, bei niedrigeren Konzentrationen oder gebunden an andere Proteine, kann es eine globuläre Form einnehmen.

Calmodulin bei voller CalciumBeladung

Calmodulin gebunden an eine Peptidhelix 166

NO (Stickstoffmonoxid) und cGMP als sekundäre Botenstoffe Acetylcholine führt in Endothelzellen über Ca/Calmodulin zur Bildung von NO (aus Arginin). Dieses diffundiert zu benachbarten glatten Muskelzellen des Blutgefäßes, wo es an der Membran eine Guanylatzyklase aktiviert. Der Anstieg des cGMP in den Zellen führt zu einer Muskelrelaxation und Erweiterung der Blutgefäße. Guanylatzyklase: NO bindet an die Hämgruppe und aktiviert das Enzym

167

Signalübertragung von der Zellmembran in den Zellkern: PKA/CREB-Weg ... die katalytischen Einheiten der aktivierten PKA wandern in den Kern und phosphorylieren, bzw. aktivieren den Transkriptionsfaktor CREB (cAMP-responsive element binding protein), der gemeinsam mit einem Kofaktor (CBP, CREB binding protein) and Promoterelemente bindet (CRE, cAMP responsive elements) und die Transkription bestimmter Gene induziert.

168

Signalübertragung von der Zellmembran in den Zellkern II: RTK-Ras-MAPK-Weg ... aktivierte MAP-Kinasen wandern als Dimere in den Kern und aktivieren dort durch Phosphorylierung verschiedene Transkriptionsfaktoren (Jun, Fos, ATF-2, TCF, SRF...)

169

Signalübertragung von der Zellmembran in den Zellkern III: NF-κB Signalweg Phosphorylierung des Inhibitors IκB über Signalkinasen führt zu dessen Ubiquitinylierung und Abbau. Der Transkriptionsfaktor NF-κB wird dadurch freigesetzt und kann an entsprechende Promoterregionen binden

170

Themen der Vorlesung

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Die Eukaryontenzelle und der multizelluläre Organismus Das Zytoskelett Zellkontakte und Zelladhäsion Die Teilung von Zellen (Zellproliferation und Zellzyklus) Der Tod von Zellen (Apoptose und Nekrose) Mechanismen der Signaltransduktion Interzelluläre Kommunikation und Nervenreizleitung

171

Beispiele interzellulärer Kommunikation • Kommunikation über Zellverbindungen – z.B. in Epithelien • Komunikation über Adhäsionsmoleküle: z.B. Bindung von Leukozyten an das Endothel und Transmigration • Kommunikation über Rezeptoren – z.B. Immunologische Synapse • Zell-Zell Interaktionen bei Entwicklungsvorgängen • Kommunikation über Membranpotential-Änderungen oder chemische Transmitter: Nervenreizleitung

172

Kommunikation über Zellverbindungen: Ausbildung von Adhäsionsgürteln Gegenseitige Berührung von Zellen im Verlauf von Proliferation und Wachstum induziert bestimmte Signalwege, die zum Abschalten des Zellzyklus führen, sowie zur Ausbildung spezifischer Zellverbindungen und bei bestimmten Zellen zur Polarisierung in apikale und basolaterale Bereiche

Video: adhesion junction

173

Kommunikation über Zellverbindungen (Gap Junctions) Sekundäre Botenstoffe (second messenger) wie Ca2+ oder cAMP können über offene Zellverbindungen in Nachbarzellen diffundieren und dort das zelluläre Signal weiterleiten. Allerdings wird das Signal durch die Verdünnung abgeschwächt und wirkt deshalb oft nur in einem begrenzten Areal.

Video: Calcium-Signalübertragung 174

Komunikation über Adhäsionsmoleküle Beispiel: Leukozytenbindung und Transmigration P-Selectin auf der Endothelzell-Membran, das durch die Aktivierung der Endothelzellen (EC) exprimiert wurde, bindet an Glykane an der Oberfläche von Leukozyten und es kommt zur losen Assoziation („leukocyte rolling“), die Bindung wird durch PAF (platelet activating factor – auf EC) und PAF-Rezeptor (auf den Leukozyten) verstärkt und durch Interaktion von Integrinen der Leukozyten mit ICAM-1 auf den EC kommt es zur festen Bindung, sowie zur Transmigration

Video: leukocyte rolling Video: lymphocyte homing

175

Kommunikation durch Chemotaxis Bakterielle Moleküle (wie z.B. bestimmte Peptide: formyl-Met-Leu-Phe) wirken als chemische Lockstoffe für Leukozyten, binden an spezifische Rezeptoren und induzieren eine gerichtete Zellbewegung (über Lamellipodien und Aktinfilamente) in Richtung des chemischen Gradienten.

Pipette mit Chemoattractant neutrophiler Granulozyt

Bakterien neutrophiler Granulozyt

Videos: neutrophil chemotaxis 1 and 2

176

Kommunikation über Rezeptoren Beispiel: Immunologische Synapse Bei der Immunantwort kommt es zur spezifischen Kommunikation zwischen Antigenpräsentierenden Zellen (z.B. dendritischen Zellen) und Lymphozyten (z.B. T-Zellen). Dabei wird das Antigen über den MHC-Komplex präsentiert und vom T-Zellrezeptor erkannt, wobei andere Membranproteine wesentliche akzessorische Rollen spielen. Der T-Zellklon, dessen Rezeptor das Antigen erkennt wird aktiviert und zur klonalen Expansion stimuliert. ICAM-3

DC-SIGN ICAM-1

dendritische Zelle

LFA-1

MHC

TCR

CD83/CD86

CD28

LFA-1

CD2

T-Zelle 177

Mechanismen der Nervenreizleitung Unterschiedliche Neuronen-Typen: a)

Multipolare Interneuronen

b)

Motorneuronen

c)

Sensorische Neuronen

178

Elektrische Signalübertragung Ein Nervenimpuls (Aktionspotential) entsteht durch eine kurze Depolarisation der Zellmembran, gefolgt von einer Repolarisation auf das Ruhepotential. Das Signal bewegt sich mit etwa 100 m/sec am Axon entlang. An dessen Ende induziert es an der Verbindung zum nächsten Neuron (der Synapse) entweder die Freisetzung von Neurotransmittern oder die Weiterleitung des elektrischen Signals über gap junctions.

179

Arten von Neuronen-Ionenkanälen

a) ruhende K+-Kanäle erzeugen das Ruhepotential, b) Spannungsgesteuerte Na+-Kanäle leiten das Aktionspotential weiter, c) Neurotransmitter-gesteuerte Kanäle öffnen nach Bindung des Transmitters, d) G-Protein gesteuerte Kanäle öffnen nach Aktivierung durch trimere G-Proteine, die ihrerseits von Neurotransmitter-Rezeptoren aktiviert werden.

180

Modell der Wirkungsweise spannungsgesteuerter Na+-Kanäle

181

Die passive Ausbreitung der Depolarisation hängt vom Durchmesser und der „Isolierung“ der Axone ab

Aufgrund des K+-Flusses durch die ruhenden K+-Kanäle nimmt die Depolarisation mit zunehmender Entfernung vom Depolarisationsort ab. Diese Abnahme ist geringer, wenn das Axon durch vielschichtige Myelinscheiden isoliert ist.

182

Bildung der isolierenden Myelinscheiden durch Schwann´sche Zellen Schwannsche Zellen wickeln ihre Cytoplasmamembran mehrmals um ein oder mehrere Axone; das Cytoplasma wird zwischen den Membranen herausgedrückt und die Membranschichten werden reißverschlussartig miteinander verknüpft

183

Ranvier´sche Schnürringe unterbrechen die isolierenden Myelinscheiden und leiten das Aktionspotential weiter

Weiterleitung des Aktionspotentials sprunghaft von einem Schnürring zum nächsten 184

Elektrische Synapsen Übertragung des elektrischen Impulses von einem Axon zum nächsten Neuron über

gap junctions

185

Chemische Synapsen: Übertragung durch Neurotransmitter

Neurotransmitter sind in sekretorischen Granula gespeichert, die von der Depolarisation zur Fusion mit der Zytoplasma-Membran angeregt werden. Der freigesetzte Neurotransmitter diffundiert durch den synaptischen Spalt zur Zielzelle und induziert dort ein Aktionspotential (oder ein anderes Signal) 186

Die wichtigsten Neurotransmitter

187

Zyklus der Neurotransmitter-Freisetzung

188

Übertragung der Signale von Motorneuronen auf Muskelzellen die Ankunft eines Aktionspotentials am Ende eines Motorneurons induziert die Öffnung von Calcium-Kanälen (1) und dadurch die Sekretion von Acetylcholin. Der freigesetzte Transmitter induziert die Öffnung von Acetylcholingesteuerten Na+-Kanälen (2) und die resultierende lokale Depolarisation induziert das Öffnen spannungsgesteuerter Na+-Kanäle (3). Durch die nun verstärkte Depolarisation öffnen sich spannungsgesteuerte Ca2+-Kanäle des ER, es kommt zur Freisetzung von Calcium aus dem ER und zur Muskelkontraktion (durch Verschiebung des Tropomyosins und Freigabe der Aktin-Myosin-Bindungsstellen)

189