Miscellanea
Zastosowanie technologii interferencji RNA w medycynie Application of RNA interference in medicine Marta Gabryelska1, Eliza Wyszko1, Stanis³aw Nowak2, Ryszard ¯ukiel2, Jan Barciszewski1 z Instytutu Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu 1
2
z Katedry i Kliniki Neurochirurgii i Neurotraumatologii A.M. im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu kierownik: prof. dr Stanis³aw Nowak
Streszczenie
Interferencja RNA nale¿y do technik anty-mRNA adaptowanych do celów terapeutycznych. Ma potencjalne zastosowanie w leczeniu chorób wirusowych, nowotworowych, neurodegeneracyjnych i innych. Wykorzystanie RNAi zale¿y od trwa³oci wyciszenia docelowego genu, ³atwoci dostarczenia siRNA do chorej tkanki z zachowaniem jej aktywnoci oraz brakiem efektów ubocznych. Obecnie prowadzone s¹ liczne badania kliniczne sprawdzaj¹ce skutecznoæ i bezpieczeñstwo terapii opartej na tej technologii. Wiele firm farmaceutycznych i biotechnologicznych pracuje nad komercjalizacj¹ zastosowañ RNAi.
Summary
RNA interference is one of anty-mRNA techniques, adapted for a therapeutic purpose. It can be used for treatment of cancer, viral, neurodegenerative or other diseases. Therapeutic applications of RNAi depend on persistent gene silencing and lack of side effects. Clinical trials are in progress, checking an effectiveness and safety of RNAi. Many pharmaceutical and biotechnological companies are seeking for commercial application of that technology. S³owa kluczowe: interferencja RNA, inhibicja ekspresji genów, badania kliniczne, gen docelowy, efekty uboczne Key words: RNA interference, gene epression inhibition, gene - target, side effects
Wstêp
Organizmy eukariotyczne maj¹ naturalny mechanizm obronny w postaci interferencji RNA (ang. RNA interference, RNAi). Jest to proces, w którym d³ugie odcinki dwuniciowych RNA ulegaj¹ hydrolizie do krótkich dupleksów RNA o d³ugoci 21 do 28 nukleotydów oraz indukuj¹ swoist¹ degradacjê jednoniciowych RNA (ang. single stranded RNA, ssRNA), takich jak mRNA lub egzo-
genny RNA, np. wirusowy (18). Dlatego w³anie RNAi mo¿e funkcjonowaæ jako specyficzny stra¿nik genomu oraz regulator ekspresji genów (18). Zjawisko interferencji RNA badano u A. thaliana, S. pombe, S. cerevisiae, D. melanogaster, C. elegans, N. crassa, M. musculus, H. sapiens oraz wielu innych organizmach (1). Mimo wielu podobieñstw wystêpuj¹ drobne ró¿nice miedzy organizmami. Dotycz¹ one roli tego procesu w komórkach, rozprzestrzeniania siê sygna³u wyciszania, obecnoci okrelonych komponentów maszynerii RNAi oraz mo¿liwoci ich wykorzystania (18, 19). W 2001 roku przeprowadzono pierwsze eksperymenty z wykorzystaniem siRNA w komórkach ssaków, a tak¿e pojawi³y siê doniesienia o efektach ubocznych tej techniki (62). Nie zmieni³o to jednak faktu, ¿e interferencja RNA jest bardzo obiecuj¹c¹ metod¹ wyciszania genów ciesz¹c¹ siê wielkim zainteresowaniem zarówno w badaniach podstawowych jak i w biotechnologicznych zastosowaniach.
Terapia chorób wirusowych i nowotworów
Konwencjonalne metody terapeutyczne maj¹ na celu zahamowanie syntezy lub aktywnoci biologicznej danej cz¹steczki, bia³ka strukturalnego, enzymu lub receptora. Wp³yw dowolnego terapeutyku na komórkê mo¿e dotyczyæ transkrypcji docelowego genu, etapu potranskrypcyjnego lub potranslacyjnego. Prze³omem w poszukiwaniu nowych preparatów medycznych okaza³y siê wykonane 30 lat temu badania antysensownych kwasów nukleinowych. Nieco póniej pojawi³y siê trójniciowe kompleksy (3), rybozymy oraz aptamery i 10 lat temu interferencja RNA. Systematyczne wyciszanie kolejnych produktów genów przy pomocy RNAi mo¿e byæ pomocne w znalezieniu genu krytycznego dla wzrostu komórek rakowych, a mniej istotnego dla proliferacji komórek zdrowych (39). Jego identyfikacja u³atwi zaprojektowanie
Neuroskop 2006, nr 8
143
Miscellanea Tabela 1. Charakterystyka kwasów nukleinowych wykorzystywanych do inhibicji mRNA (5). PNA ang. peptide nucleic acid, LNA ang. locked nucleic acid. Charakterystyka kwasów nukleinowych do inhibicji mRNA
Antysensowne oligonukleotydy
siRNA
Oligonukleotydy
DNA lub RNA
RNA
Struktura
Jednoniciowe; 16-30 nukleotydów
Dwuniciowe; 19-21 nukleotydów z dwunukleotydowymi niesparowaniami na koñcach
Mo¿liwe modyfikacje chemiczne
Wi¹zanie fosforotioatowe, 2-O-metoksyetyl, 2-O-metyl, PNA, LNA, morpholino
Koniugacja z cholesterolem, LNA, 2-deoxy-2-fluorourydyna, 2-fluoropirymidyna
Udzia³ prekursorów w syntezie
Nie
Tak (poprzez dzia³anie Dicer)
Rodzaj hydrolizy mRNA
RNaza H
RISC
Standardowa dawka efektywna in vitro
50-400 nmol/l
5-100 nmol/l
Pierwsze wykorzystanie in vivo
1991
2002
Badania kliniczne
Liczne fazy kliniczne 1-3 w toku; lokalna lub ogólna aplikacja
Lokalna aplikacja
RNAi, które mo¿e byæ wykorzystane przeciwko dowolnemu czynnikowi patologicznemu, zarówno endogennemu jak i egzogennemu. W odniesieniu do chorób o zdefiniowanej etiologii przeprowadzono badania z wykorzystaniem RNAi in vitro i in vivo w organizmach modelowych. Interferencyjny RNA obok rybozymów, deoxyrybozymów i antysensownych oligonukleotydów zalicza siê do technologii anty-mRNA (tab. 1). Antysensowne oligonukleotydy (ang. antisense-oligodeoxynucleotides, AS-ON), s¹ to ³añcuchy (10-20 nukleotydowe) komplementarne do docelowego mRNA (38). Wiêkszoæ z nich aktywuje RNazê H, która hydrolizuje niæ RNA w utworzonych heterodupleksach DNA-RNA. Inne AS-ON, nie aktywuj¹ce RNazy H, powoduj¹ zahamowanie translacji poprzez blokowanie rozpoznania przez rybosom (38). Dotychczas tylko jeden lek oparty na AS-ON (Vitravene) wykorzystywany jest w leczeniu choroby oczu wywo³anej przez cytomegalowirusy (CMV) u pacjentów z AIDS (38, 56). Jednak nowsza metoda leczenia AIDS HAART (ang. Highly Active Anti-Retroviral Therapy) skutecznie zapobiega zapaleniom siatkówki i popyt na lek DNA jest ograniczony (66). Innym terapeutykiem typu AS-ON jest preparat Genasense, obni¿aj¹cy poziom bia³ka Bcl-2 (56). Rybozymy s¹ katalitycznymi cz¹steczkami RNA, które swoicie hydrolizuj¹ mRNA i uniemo¿liwiaj¹ syntezê kodowanego przez niego bia³ka. Praktyczne zastosowanie rybozymów zosta³o poddane w w¹tpliwoæ, poniewa¿ rybozymowy lek na ¿ó³taczkê typu C wywo³a³ u do-
144
wiadczalnej ma³py lepotê, prawdopodobnie z powodu zbyt wysokich dawek, natomiast inny lek z tej grupy nie hamowa³ rozwoju nowotworu u chorych z zaawansowanym rakiem piersi (66). Dotychczas ¿aden lek oparty na katalitycznych RNA nie zosta³ wprowadzony do praktyki medycznej i zatwierdzony przez FDA (ang. Food and Drug Administration) (56). Etap badañ klinicznych osi¹gnê³y dotychczas preparaty Angiozyme (Faza II) oraz Herzyme (Faza I) (38). Pierwsze zastosowania RNAi wzbudzi³y wielki entuzjazm, jakiego naukowcy nie dowiadczyli wczeniej w przypadku innych metod (39). Jednak¿e jej powodzenie jako nowej techniki terapeutycznej bêdzie zale¿a³o g³ównie od mo¿liwoci wprowadzenia nie zdegradowanego leku do chorych komórek, który musi byæ wystarczaj¹co trwa³y, aby wyciszyæ mRNA (66). Ka¿dy lek oparty o RNAi musi byæ zatem stabilny, selektywny, nietoksyczny, móc pokonaæ barierê w postaci b³on komórkowych i nie powodowaæ negatywnego wp³ywu na organizm (64).
Zastosowania interferencji RNA
Oczywistym celem ograniczenia ekspresji genów z wykorzystaniem technologii RNAi s¹ wirusy stanowi¹ce powa¿ne zagro¿enie dla cz³owieka, miedzy innymi wirus HIV (ang. human immunodeficiency virus), wirusy grypy (ang. influenza virus), wirusowego zapalenia w¹troby typu B (ang. hepatitis B virus, HBV) i C (HCV), wirusy polio (ang. poliovirus), brodawczaka (ang. human papilloma virus, HPV), wirusy herpes (ang. herpes simplex virus, HSV),
Neuroskop 2006, nr 8
Miscellanea Tabela 2. Wybrane przyk³ady inhibicji infekcji wirusowych za pomoc¹ interferencji RNA. NP bia³ko nukleokapsydu, PA sk³adnik transkryptazy RNA wirusa grypy, bia³ko 94 kDa, U38 - polimeraza DNA, UL27 - glikoproteina, UL29 bia³ko wi¹¿¹ce DNA, UL54 polimeraza DNA, Env poliproteina otoczki wirusa, Tat transaktywator transkrypcji, Rev bia³ko regulatorowe, Zta czynnik transkrypcyjny, TRS sekwencja reguluj¹ca transkrypcjê, Spike bia³ko otoczki, PBMCs - ang. peripheral blood mononuclear cells, jednoj¹drzaste komórki krwi obwodowej (limfocyty, monocyty). Nazwa choroby
Czynnik etiologiczny
Cz¹steczka RNAi
Gen docelowy
Efekt interferencji RNA
Lit.
AIDS
HIV-1
siRNA
Env
52
siRNA
Tat, Rev
lhRNA (plazmid)
Nef
Inhibicja replikacji wirusa w kom. krwi, PBMCs Inhibicja replikacji wirusa w kulturach kom. Inhibicja replikacji wirusa w kulturach kom.
10 37
Roseola infantum, Exanthem subitum
herpesvirus-6B (HHV-6B)
siRNA
U38
Inhibicja replikacji wirusa w linii kom.
76
Opryszczka narz¹dów p³ciowych
Herpes simplex virus 2 (HSV-2)
siRNA
UL27, UL29
Ochrona myszy przed letaln¹ infekcj¹
51
Cytomegalia
CMV
siRNA
UL54
Inhibicja replikacji wirusa w linii kom.
72
Mononukleoza zakana
EpsteinBarr virus (EBV)
siRNA (plazmid pSuper)
Zta
Inhibicja replikacji wirusa w linii kom.
6
Zapalenie w¹troby typu B
HBV
siRNA (plazmid pSilencer)
Regiony Inhibicja replikacji wirusa zachowawcze w linii kom.
80
Grypa, Ptasia grypa
influenza virus (wirus grypy)
siRNA (plazmid pEGFP)
NP, PA
Inhibicja replikacji wirusa w linii kom. Zapobieganie i leczenie infekcji u myszy
41
Ciê¿ki ostry zespó³ oddechowy
SARS coronavirus (SCV)
siRNA
TRS, 3'-UTR, Spike
Inhibicja replikacji wirusa w linii kom.
74
Zapobieganie i leczenie infekcji u Macaca mulatta
40
siRNA
rotawirusy, RSV (ang. respiratory syncytial virus), cytomegalowirusy (ang. human cytomegalovirus, HCMV), wirus West Nile i wiele innych (64). Wiele badañ in vitro oraz in vivo, maj¹cych na celu inhibicjê ekspresji wirusowych genów, przynios³o jednoznaczne wyniki wskazuj¹ce na mo¿liwoæ hamowania replikacji wirusów (tab. 2). Jako geny docelowe u wirusów wymienia siê te zaanga¿owane w replikacjê i sk³adanie cz¹stek wirusowych, specyficzne sekwencje ich genomów oraz transkrypty komórkowe gospodarza u³atwiaj¹ce inwazjê lub patogen-
21
noæ takie jak specyficzne receptory komórkowe czy czynniki transkrypcyjne (64). G³ównym problemem w leczeniu chorób infekcyjnych jest opornoæ na stosowane leki. Dotyczy to zw³aszcza szybko mutuj¹cych wirusów. Wydaje siê zatem, ¿e inhibicja wirusa wieloma interferuj¹cymi RNA jednoczenie skierowanymi przeciwko ró¿nym regionom genomu zmniejsza jego szanse na unikniêcie efektu RNAi poprzez spontaniczne mutacje (64). Ludzkie wirusy wykszta³ci³y pewn¹ formê ochrony genomu przed efektem RNAi, opart¹ o oddzia³ywania
Neuroskop 2006, nr 8
145
Miscellanea Tabela 3. Wybrane przyk³ady terapii chorób nowotworowych za pomoc¹ RNAi. E6, E7 regulatory replikacji wirusa, EGFR receptor czynnika wzrostu naskórka, XIAP zwi¹zany z chromosomem X inhibitor apoptozy, K-ras regulator cyklu komórkowego, COX-2 - cyclooksygenaza-2, Bcr-abl bia³aczkowy gen fuzyjny. Nazwa choroby
Czynnik etiologiczny
Cz¹steczka RNAi
Gen docelowy
Efekt interferencji RNA
Lit.
Rak szyjki macicy
human papillomavirus (HPV)
shRNA (wektor lentiwirusowy)
E6, E7
Komórki rakowe (HeLa) wra¿liwe na chemioterapiê
53
Rak p³uc
wiele czynników
dsRNA
EGFR
Zmniejszenie iloci EGFR w linii kom., inhibicja wzrostu guza u myszy
78
Rak piersi
wiele czynników
siRNA
Kinaza cholinowa XIAP
Redukcja proliferacji, indukcja ró¿nicowania w linii kom. Inhibicja proliferacji, pobudzenie apoptozy w linii kom.
22
siRNA (plazmid)
81
Rak trzustki
wiele czynników
siRNA
K-ras
Zwiêkszenie odpowiedzi apoptotycznej w linii kom.
71
Rak okrê¿nicy
wiele czynników
siRNA
COX-2
Zmniejszenie iloci COX-2 w linii kom.
7
Bia³aczka szpikowa
wiele czynników
siRNA
Bcr-abl
Znaczne obni¿enie ekspresji Bcr-abl, inhibicja proliferacji linii kom.
70
Guzy mózgu
wiele czynników
shRNA (plazmid)
EGFR
Zmniejszenie iloci EGFR w kulturach tk. oraz u myszy, zwiêkszenie prze¿ywalnoci myszy
82
pomiêdzy kapsydem a genomem (58). Nukleokapsyd wirusa miêsaka Rousa (ang. Rous sarcoma virus) os³ania wprowadzany wirusowy RNA przed degradacj¹, a koñcowy efekt RNAi zale¿y od wybranego docelowego fragmentu RNA (64). Podobny rodzaj supresji RNAi jest obserwowany w przypadku wirusa RSV (ang. respiratory syncytial virus), gdzie genom mo¿e byæ niedostêpny dla siRNA z powodu utworzenia kompleksu z bia³kiem (45). Podobna sytuacja dotyczy innych wirusów, np. HIV. Z tego powodu proces degradacji docelowego RNA musi rozpocz¹æ siê w odpowiednim momencie cyklu rozwojowego wirusa, kiedy jego genom bêdzie dostêpny. Do g³ównych markerów biochemicznych zaanga¿owanych w powstawanie nowotworów zalicza siê receptor bia³kowej kinazy tyrozynowej (ang. protein tyrosine kinase, PTK), gruczolakowatej polipowatoci coli (ang. adenomatous polyposis coli, APC), onkogen Gli (ang. glioma-associated oncogene, Gli), fosfoinozytolow¹ kinazê 3 (ang. phosphoinisitide 3-kinase, PIK3), szlak transdukcji bia³ek SMAD, czynnik transkrypcyjny indukuj¹cy niedotlenienie (ang. hypoxia-inducible transcription factor, HIF), retinoblastoma (ang. retinoblastoma, Rb) oraz szlak
146
apoptozy (APOP) (50). Wród wyciszanych genów znajduj¹ siê geny wirusowe, onkogeny, geny fuzyjne, geny opornoci wielolekowej (ang. multidrug resistance, MDR) (32), regulatory proliferacjii i inne (tab. 3). Obecnoæ mechanizmu RNAi potwierdzono tak¿e u Trypanosoma brucei, Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii, Paramecium, Leichmania donovanii (1). Jest to istotne poniewa¿ pierwotniaki s¹ ród³em wielu chorób (64). Wyzwanie dla interferencji RNA stanowi¹ tak¿e choroby wywo³ane przez takie czynniki jak cukrzyca, czy oty³oæ (tab. 4), choroby wywo³ane przez mutacje punktowe, choroby neurodegeneracyjne oraz zwi¹zane ze zmienn¹ liczb¹ powtórzeñ mikrosatelitarnych. Du¿a dok³adnoæ i skutecznoæ dzia³ania siRNA umo¿liwia leczenie chorób wywo³anych przez mutacje punktowe, insercje czy delecje zidentyfikowanych genów (18). Olbrzymim wyzwaniem s¹ choroby, u których pod³o¿a le¿y alternatywny splicing, który w oko³o 70%-90% prowadzi do powstania bia³ek o zmienionych funkcjach (20). Do chorób tych zaliczane s¹ miêdzy innymi demencja czo³owo-skroniowa (ang. frontotemporal dementia), parkinsonizm zwi¹zany z chromosomem 17, niedobór hormonu wzrostu i inne (20).
Neuroskop 2006, nr 8
Miscellanea Tabela 4. Terapia innych chorób za pomoc¹ RNAi; berghepain-1 i 2 proteaza cysteinowa, DHODH dehydrogenaza dihydroorotowianu, PEPCK karboksykinaza fosfoenolo-pirogronianowa, AGRP - agouti-related peptide, SOD1 dysmutaza ponadtlenkowa, Htt - IT15, huntingtyna. Nazwa choroby
Czynnik etiologiczny
Cz¹steczka RNAi
Gen docelowy
Efekt interferencji RNA
Malaria
Plasmodium sp.
siRNA
berghepain-1 i 2
dsRNA
DHODH
Obni¿enie poziomu mRNA paso¿yta u myszy Obni¿enie tempa namna¿ania siê paso¿yta
Lit. 48 46
Cukrzyca
wiele czynników
(wektor)
PEPCK
Obni¿enie poziomu cukru we krwi, poprawiona tolerancja glukozy u myszy.
23
Pl¹sawica Huntingtona
wzrost iloci powtórzeñ CAG w genie htt
shRNA (wektor AAV)
zmutowany htt
Poprawa zachowania i nieprawid³owoci neuropatologicznych u myszy
27
Oty³oæ
wiele czynników
siRNA, shRNA (wektor pSUPER)
AGRP
Przyspieszony metabolizm, redukcja masy cia³a myszy.
43
Stwardnienie zanikowe boczne (ALS)
mutacja w genie SOD1
shRNA (wektor lentiwirusowy)
SOD1
Opónienie objawów i postêpu choroby u myszy
54
Terapeutyczne RNAi
Jak podkrelono wczeniej terapeutyczne zastosowanie RNAi zale¿y od trwa³oci wyciszenia, ³atwoci rozprzestrzeniania siê siRNA w obrêbie chorej tkanki, ich aktywnoci biologicznej, a tak¿e brak efektów ubocznych. siRNA uwa¿a siê za skuteczny, je¿eli w stê¿eniu 1-20 nM prowadzi do efektywnego i specyficznego wyciszenia 90% (47). Ró¿nice w efektywnoci siRNA, skutecznoci transfekcji, rodzaju wykorzystanej linii komórkowej i stabilnoci bia³ek mog¹ wp³ywaæ na osi¹gniêty efekt RNAi (45). Nale¿y pamiêtaæ, ¿e rezultaty uzyskane w badaniach in vitro nie ³atwo przek³adaj¹ siê na wyniki otrzymane in vivo. Rolê induktora wyciszania (ang. trigger) w przypadku ssaków skutecznie spe³niaj¹ dwuniciowe shRNA (ang. short hairpin RNA) lub siRNA (ang. short interfering RNA) o d³ugoci 20 do 23 nukleotydów, zawieraj¹ce niesparowane 2 nukleotydy przy koñcu 3' (60). U ssaków d³ugie cz¹steczki dsRNA indukowa³y interferon (60). W przypadku innych grup organizmów oraz niektórych linii komórkowych (np. ES, P19) mo¿liwe jest u¿ycie dsRNA bez indukcji odpowiedzi immunologicznej (68). Dowiadczenia z komórkami linii embrionalnej (ang. embryonic stem cells, ES) czy linii potworniakorakowej P19 (ang. teratocarcinoma cells) s¹ trudne ze wzglêdu na opornoæ na transfekcjê (68). siRNA charakteryzuje siê wysok¹ efektywnoci¹ wprowadzenia do komórki oraz mo¿liwoci¹ osi¹gniêcia tam wysokiego stê¿enia. Zastosowanie takich
cz¹steczek jest ograniczone ze wzglêdu na nietrwa³y efekt wyciszenia, który zale¿y od tempa podzia³ów komórkowych, komórki ssaków nie maj¹ systemu powielania RNAi (jak w przypadku C. elegans i rolin) (26). W badaniach procesu interferencji RNA istotna jest odpowiednia linia komórkowa, je¿eli dowiadczenia na ¿ywym organizmie s¹ utrudnione lub niemo¿liwe. Komórki takie musz¹ byæ ³atwe w hodowli, ³atwo ulegaæ transfekcji oraz posiadaæ nisk¹ wra¿liwoæ na ewentualne modyfikacje chemiczne dostarczanych cz¹steczek siRNA. Bardzo czêsto wykorzystuje siê komórki nowotworowe ze wzglêdu na ich ³atwe namna¿anie (tab. 5), chocia¿ nie wszystkie typy schorzeñ s¹ reprezentowane przez wymienione linie komórkowe. Przylegaj¹ce do pod³o¿a linie komórkowe, takie jak HeLa i U2OS umo¿liwiaj¹ ³atwy, efektywny sposób wprowadzenia cz¹steczek interferencyjnego RNA oraz szybki, silny wzrost w dobrze zorganizowanych pojedynczych warstwach, co u³atwia obserwacjê mikroskopow¹ (15). Wtórne linie komórkowe nie s¹ odpowiednikami ludzkich komórek chorobowych i dlatego trudno porównywaæ badania na nich wykonywane. Efektywnoæ transfekcji pierwotnych linii komórkowych wynosi mniej ni¿ kilka procent. Skutecznoæ zale¿y nie tylko od typu komórek, ale tak¿e od liczby pasa¿y i stopnia konfluencji komórek (45). Wiele linii komórkowych wykazuje tak¿e genetyczn¹ niestabilnoæ, co prowadzi do utraty klonal-
Neuroskop 2006, nr 8
147
Miscellanea Tabela 5. Linie komórkowe wykorzystywane w badaniach wyciszania genów przez siRNA (68, 63). Linia komórkowa
Tkanka ród³owa
A-431 A549 BV173 C-33A CA46 Caco2 CHO COS-7 F5 H1299 HaCaT HEK 293 HeLa Hep3B HUVEC IMR-90 K562 Karpas 299 MCF-7 MDA-MB-468 MV-411 NIH/3T3 P19 SDI SKBR3 T98G U2OS
Ludzki rak skóry Ludzki rak p³uc Ludzki prekursor B bia³aczki Rak szyjki macicy HPV-negatywny Ludzki ch³oniak Burkitta Ludzkie komórki nab³onka okrê¿nicy Jajnik chiñskiego chomika Nerka afrykañskiej ma³py Fibroblasty szczura Ludzkie niema³e komórki raka p³uc Ludzkie keratynocyty Ludzka embrionalna nerka Rak szyjki macicy HPV-pozytywny Ludzki rak komórek w¹trobowych Ludzkie komórki nab³onka ¿y³y pêpkowej Ludzki diploidalny fibroblast Ludzka przewlek³a bia³aczka szpikowa Ludzki ch³oniak limfocytów T Ludzki rak piersi Ludzki rak piersi Ludzka ostra bia³aczka monocytowa Fibroblasty myszy Embrionalny rak u myszy Ludzka ostra bia³aczka limfoblastyczna Ludzki rak piersi Ludzkie komórki glioblastomy Ludzkie komórki miêsaka kostnego
noci oraz zmian kariotypu i fizjologii (15). W zale¿noci od podatnoci komórek na transfekcjê proponowane s¹ ró¿ne rozwi¹zania metodyczne (ryc. 1). Wstêpne badania skutecznoci interferencji RNA w uk³adach komórkowych pozwalaj¹ oceniæ stosowane cz¹steczki siRNA lub shRNA. Zaproponowano dwufunkcjonaln¹ konstrukcjê siRNA-DNA zwan¹ crook siRNA (34). Umo¿liwia ona wykrywanie bardzo niskiego poziomu siRNA efektywnego dla RNAi, pobranej przez komórki iloci siRNA, lokalizacji komórkowej, rozprowadzenia do tkanek, a tak¿e farmakokinetyki. W crook siRNA do koñca 3 sensownej nici siRNA do³¹czona jest struktura DNA typu spinka do w³osów odporna na dzia³anie nukleaz (34). Umo¿liwia to zarówno efektywne wyciszanie genów jak i amplifikacjê PCR, przy minimalnej wykrywanej iloci siRNA 8 nM (34). Dla skutecznego zastosowania lub efektywnego badania procesu interferencji niezbêdny jest wybór odpowiedniego celu molekularnego (mRNA) o znanej sekwencji. Jego wyciszenie powinno daæ widoczny lub mo¿liwy do obserwacji efekt. W niektórych dowiadczeniach in vitro pokazano efekty uboczne zwi¹zane z wielokierunkowym dzia³aniem siRNA. Dla ich unikniêcia dany gen nie powinien zawieraæ wielu sekwencji homologicznych. Celowe jest skorzystanie z baz danych sekwencji genomowych BLAST (NCBI Unigene, EST, Celera) dla weryfikacji poprawnoci celu RNAi (47). Dostêpne s¹ algorytmy u³atwiaj¹ce projektowanie skutecznych siRNA (tab. 6). Wprowadzaj¹c tam numer dostêpu (ang. accession number) lub sekwencjê genu koduj¹cego cel terapeutyczny, otrzymujemy listê kompatybilnych oligonukleotydów. Wielu skutecznych siRNA nie mo¿na jednak przewidzieæ tylko na podstawie analizy in silico. Wszystkie mo¿liwe sekwencje okrelonej d³ugoci powinny byæ analizowane w liniach komórkowych dla upewnienia, czy wszystkie siRNA zosta³y zidentyfikowane (67). Jest to bardzo kosztowne. £atwiejsz¹ alternatywê stanowi stworzenie genowospecyficznej biblioteki siRNA poprzez przygotowanie
Rycina 1. Schemat interferencji RNA w zale¿noci od podatnoci komórek na transfekcjê oraz trwa³oæ wyciszenia (59).
148
Neuroskop 2006, nr 8
Miscellanea Tabela 6. Adresy internetowe wybranych algorytmów do projektowania siRNA. URL
Nazwa
http://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/rnai.html http://www.rnaiweb.com/RNAi/siRNA_Design/index.html http://hydra1.wistar.upenn.edu/Projects/siRNA/siRNAindex.htm https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai?op=help http://jura.wi.mit.edu/siRNAext/ http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html http://i.cs.hku.hk/~sirna/software/sirna.php http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html http://www.dharmacon.com/sidesign/ https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/ http://203.199.182.73/gnsmmg/databases/sirna/dstho.html http://codex.cshl.org/scripts/newmain.pl http://itb1.biologie.hu-berlin.de/~nebulus/sirna http://sirna.cgb.ki.se
RNAi OligoRetriever The RNAi Web siRNA Design siRNA selector siRNA Target Finder WI siRNA Selection Program siRNA Target Finder siRNA Design Software The siRNA user guide Dharmacon siDESIGN Center BLOCK-iT RNAi Designer DSTHO RNAi codex HuSiDa siRNAdb
mieszaniny cz¹steczek o mo¿liwej sekwencji, ekspresji w liniach komórkowych, selekcji wybranych fenotypów i na tej podstawie identyfikacji skutecznej sekwencji siRNA (67).
Efekty uboczne
Warunkiem bezpiecznego wykorzystania RNAi w terapii jest brak efektów ubocznych (ang. off-target effects). siRNA mo¿e funkcjonowaæ jako miRNA i na odwrót, wykazuj¹c wieloraki wp³yw na ekspresjê genów (33). Wykorzystanie ró¿nych siRNA dla jednego docelowego mRNA mo¿e powodowaæ uzyskanie ró¿nych niespecyficznych wzorców ekspresji dla ka¿dej z u¿ytych cz¹steczek. Mimo ¿e jedn¹ z cech RNAi jest specyficznoæ, efekty off-target stanowi¹ potencjalny problem. Nadal nieznane s¹ parametry okrelaj¹ce minimalny poziom homologii niezbêdny do efektywnego i bezpiecznego wyciszania genów (69). Efektów ubocznych nie obserwowano, gdy wprowadzano dsRNA do organizmów prymitywnych. Wydaje siê, ¿e siRNA powstaj¹ce z dsRNA s¹ dok³adnie wybierane przez Drosha i Dicer oraz inne komponenty endogennej maszynerii RNAi, które mog¹ mieæ aktywnoæ korekcyjn¹, która zabezpiecza przed niespecyficznym wyciszaniem (14). siRNA powstaj¹cy z prekursora dsRNA w wyniku dzia³ania kompleksów enzymatycznych w komórkach ssaków indukuje niespecyficzne efekty w znacznie mniejszym stopniu. Wi¹¿e siê to w tym przypadku z odpowiedzi¹ interferonow¹ (14). D³ugie dsRNA efektywnie wyciszaj¹ geny w komórkach owadów i komórkach embrionalnych ssaków, nie aktywuj¹c uk³adu immunologicznego (68). Do dojrza³ych komórek ssaków wprowadziæ mo¿na wy³¹cznie siRNA
o d³ugoci poni¿ej 30 par zasad (60). W przypadku d³u¿szych cz¹steczek mo¿liwa jest aktywacja odpowiedzi interferonowej, prowadz¹cej do apoptozy. Nastêpuje aktywacja szlaku Jak-Stat (ang. Janus kinase - signal transducers and activators of transcription) oraz wzrostu poziomu ekspresji genów stymulowanych interferonem (interferon-stimulated genes, ISGs) (63). Transfekcja siRNA swoistego dla GAPDH powodowa³a co najmniej dwukrotny wzrost ekspresji 52 genów ISG (63). W wiêkszoci przypadków poziom ekspresji zale¿ny by³ od iloci dostarczonego siRNA, przy stê¿eniu 100 nM powoduj¹c ponad dziesiêciokrotny wzrost ekspresji. D³ugi RNA o strukturze spinki do w³osów (ang. long-hairpin RNA, lhRNA), ulegaj¹cy ekspresji w komórkach ssaków z wektora plazmidowego nie indukowa³ odpowiedzi immunologicznej (37). Aktywacja uk³adu immunologicznego przez siRNA i zwi¹zana z tym toksycznoæ s¹ zale¿ne od sekwencji nukleotydowej (35). Zidentyfikowano immunostymuluj¹ce motywy bogate GU, co pozwala na zaprojektowanie siRNA, który mo¿e wyciszaæ gen, jednoczenie indukuj¹c minimaln¹ odpowied interferonow¹ (35). Przypuszcza siê, ¿e stymulacja odpowiedzi immunologicznej wywo³ana obecnoci¹ obcego RNA zachodzi z udzia³em dwóch typów bia³ek: transmembranowych receptorów TLR (ang. Toll-like receptor) oraz cytoplazmatycznych receptorów typu PKR (ang. protein kinase R) i produktu genu RIG-1 (ang. retinoic acid-inducible gene 1), (ryc. 2) (61). TLR znajduj¹ siê na b³onie komórkowej oraz w innych wewn¹trzkomórkowych kompartmentach. W endosomach siRNA zawieraj¹cy motyw immunostymuluj¹cy aktywuje TLR3, TLR7, TLR8 i TLR9, co prowadzi do uaktywnienia czynników transkrypcyjnych NF-ê ,
Neuroskop 2006, nr 8
149
Miscellanea
Rycina 2. Odpowied komórki na wprowadzenie ró¿nych typów dsRNA. A. Wektor wirusowy zawieraj¹cy sekwencjê shRNA integruje z genomem i ulega transkrypcji. Powsta³y shRNA jest transportowany do cytoplazmy przez eksportynê-5, hydrolizowany przez Dicer do siRNA zawieraj¹cego niesparowane koñce i prowadzi do specyficznej degradacji docelowego mRNA. Odpowied immunologiczna nie ma miejsca, gdy¿ zosta³y wykorzystane naturalne mechanizmy RNAi. B. Syntetyczny siRNA dostarczony do organizmu w zawiesinie liposomalnej, dostaje siê do endosomu, gdzie aktywuje receptory TRL, co prowadzi do transdukcji sygna³u do j¹dra komórkowego i ekspresji genów cytokin zapalnych i interferonu. siRNA zawieraj¹cy dwa niesparowane nukleotydy przy koñcu 3 mo¿e wejæ na szlak RNAi, a siRNA ze sparowanymi koñcami aktywuje odpowied immunologiczn¹. C. Wprowadzony do komórki d³ugi dsRNA aktywuje kinazê bia³kow¹ PKR i RNazê L, co prowadzi do degradacji RNA i zablokowania inicjacji translacji, a w konsekwencji do apoptozy. TLR ang. Toll-like receptor, PKR kinaza bia³kowa zale¿na od dsRNA, RIG-1 ang. retinoic acidinducible gene I, EIF2 podjednostka czynnika inicjacji translacji.
IRF-3 oraz IRF-7, które stymuluj¹ ekspresjê genów IFN. Helikazowa domena bia³ka RIG-1 w cytoplazmie rozpoznaje dsRNA, a pozosta³e domeny aktywuj¹ szlak prowadz¹cy do syntezy interferonu i cytokin zapalnych (61). siRNA zawieraj¹cy dwa niesparowane nukleotydy przy koñcu 3 nie aktywuje bia³ka RIG-1, w odró¿nieniu od siRNA nie zawieraj¹cego niesparowanych koñców (44). Tak¿e shRNA ulegaj¹ce ekspresji z wektora nie aktywuj¹ odpowiedzi interferonowej. Natomiast reakcjê tê stymuluje syntetyczny siRNA dostarczony za pomoc¹ nonika lipidowego (55). Modyfikacja chemiczna siRNA mo¿e utrudniæ rozpoznanie przez TLR, co u³atwi³oby stosowanie siRNA bez wzbudzania odpowiedzi immunologicznej (61). Aktywacja kinazy bia³kowej PKR nastêpuje po zwi¹zaniu dsRNA. Hamuje ona translacjê na skutek fosforylacji podjednostki czynnika inicjacji translacji EIF2 , co
150
prowadzi do ca³kowitego zablokowania syntezy bia³ka. Komórka kierowana jest na drogê apoptozy. Wi¹zanie dsRNA przez syntazê 2',5'-oligoA powoduje jej aktywacjê i syntezê oligonukleotydów adenylowych (pppA(2p5A)n), które aktywuj¹ RNazê L, powoduj¹c¹ degradacjê RNA (45). Chemiczne cechy dsRNA, poziom ekspresji lub dawki oraz sposób dostarczenia RNA do komórki mog¹ wp³ywaæ na poziom aktywacji odpowiedzi interferonowej (63). Istnieje mo¿liwoæ wspó³zawodnictwa egzogennych siRNA z endogennymi miRNA o dostêp do RISC (ang. RNA-induced silencing complex). miRNA odgrywaj¹ rolê regulatorów ekspresji genów. Zaburzenie ich funkcjonowania mo¿e powodowaæ komplikacje terapeutyczne. W niektórych przypadkach nadekspresja genów miR mo¿e prowadziæ do onkogenezy, z kolei w komórkach nowotworowych obserwowano zredukowany poziom
Neuroskop 2006, nr 8
Miscellanea niektórych miRNA (69). Obni¿enie iloci stosowanego siRNA mo¿e przyczyniæ siê do obni¿enia ryzyka wyst¹pienia efektów niespecyficznych (28). siRNA wykazuj¹cy pe³n¹ komplementarnoæ do docelowego genu mo¿e powodowaæ, oprócz degradacji w³aciwego mRNA, tak¿e spadek poziomu bia³ek w komórce (18). Zaprojektowany siRNA, zawieraj¹cy trzy do czterech nukleotydów niesparowanych z nukleotydami transkryptu docelowego inhibitora 1A kinazy zale¿nej od cyklin (ang. cyclindependent kinase inhibitor 1A, CDKN1A), wp³ywa³ g³ównie na poziom bia³ek, w sposób podobny do miRNA (33). Badano wp³yw d³ugotrwa³ego wysokiego poziomu ekspresji shRNA na w¹troby doros³ych myszy zbadano stosuj¹c 49 ró¿nych wektorów AAV/shRNA, unikalnych pod wzglêdem d³ugoci i sekwencji przeciwko szeciu genom docelowym (24). 36 sporód nich powodowa³o powa¿ne uszkodzenia w¹troby zale¿ne od stosowanej dawki, z czego 23 ostatecznie prowadzi³y do mierci ponad 150 zwierz¹t w ci¹gu 2 miesiêcy (12, 24). Zachorowalnoæ by³a zwi¹zana z obni¿eniem iloci endogennych miRNA, wskazuj¹c na prawdopodobn¹ konkurencjê pomiêdzy miRNA i egzogennymi shRNA o ograniczon¹ iloæ czynników komórkowych zaanga¿owanych w funkcjonowanie RNAi (24). Elementem ograniczaj¹cym funkcjonowanie miRNA jest eksportyna-5, ulegaj¹ca wysyceniu przez shRNA (17, 24).
Wprowadzanie cz¹steczek siRNA do komórek
siRNA mo¿na otrzymaæ in vitro, metod¹ syntezy chemicznej, transkrypcji in vitro oraz poprzez trawienie d³ugich dsRNA enzymami RNazaIII/Dicer. Mo¿liwa jest tak¿e ich ekspresja in vivo. Regulacja ekspresji genów za pomoc¹ siRNA jest przemijaj¹ca i czêsto trwa przez 3-5 dni w linii komórkowej (2). Dla wyciszania genów w komórkach embrionalnych Drosophila melanogaster najefektywniejsz¹ cz¹steczk¹ wyciszaj¹c¹ jest siRNA o d³ugoci 21 nukleotydów i dwoma niesparowanymi nukleotydami przy koñcu 3 (16). Dalsze badania wykaza³y, ¿e skutecznoæ cz¹steczek siRNA wzrasta wraz z d³ugoci¹ dupleksu a¿ do 27pz (36). D³u¿sze cz¹steczki charakteryzuje mniejsza skutecznoæ (2). W mechanizmie interferencji RNA, dsRNA jest rozpoznawany i hydrolizowany przez Dicer w odpowiedniej odleg³oci od koñca helikalnego (42). Mo¿na wykorzystaæ Dicer do wyboru i wyciêcia najbardziej efektywnej cz¹steczki siRNA z wprowadzonej do komórki nici shRNA lub dsRNA. Istnieje mo¿liwoæ zaprojektowania disRNA (ang. Dicersubstrate siRNA), który po hydrolizie przez Dicer dawa³by specyficzne siRNA o d³ugoci 21 nukleotydów. Uzyskane cz¹steczki disRNA powodowa³y maksymaln¹ inhibicjê ekspresji genów przy ni¿szych stê¿eniach, a wyciszenie trwa³o d³u¿ej (2). Spowodowane jest to prawdopodobnie rozpoznaniem i hydroliz¹
przez Dicer oraz efektywniejszym wprowadzeniem do RISC (2). Istnieje zale¿noæ skutecznoci disRNA od wyciszanego genu. dsRNA o d³ugoci oko³o 200 nukleotydów skutecznie wycisza³ gen tenascyny-C (TN-C) in vitro i in vivo (84). Strategiê oparto na za³o¿eniu, ¿e Dicer wi¹¿e i hydrolizuje dsRNA do dupleksów o d³ugoci 21-25 nukleotydów, które po wprowadzeniu do RISC mog¹ zwielokrotniæ efekt wyciszenia, poprzez wi¹zanie siê do wielu miejsc mRNA wiêkszej iloci cz¹steczek (84). Na podobnej zasadzie projektowano d³ugi RNA o strukturze spinki do w³osów (long-hairpin RNA, lhRNA) w celu wyciszenia genów wirusa HIV (37). Ekspresja lhRNA prowadzi do powstania siRNA skierowanych przeciwko wielu regionom genu nef, co powodowa³o wydajniejsz¹ inhibicjê namna¿ania patogenu (37). W wektorach ekspresyjnych siRNA wykorzystywane s¹ g³ównie promotory polimerazy RNA III (Pol III) oraz II (Pol II). Ze wzglêdu na obfitoæ komórkowych niekoduj¹cych RNA transkryptów Pol III, czêsto wykorzystuje siê promotory dla tej polimerazy w badaniach nad RNAi w komórkach ssaków. Promotory te umo¿liwiaj¹ produkcjê cz¹steczek RNA o cechach charakterystycznych dla siRNA nie zawieraj¹cych struktury cap przy koñcu 5' oraz poliadenylowanego koñca 3'. Wród promotorów Pol III do produkcji siRNA in vivo wykorzystuje siê promotor U6 genu ma³ych j¹drowych RNA (ang. small nuclear RNA, snRNA) oraz promotor H1 genu RNazy P (77). W przypadku promotora H1, istotn¹ zalet¹ jest uzyskiwanie transkryptów zawieraj¹cych niesparowane koñce 3'. Wykorzystywane s¹ równie¿ promotory typu II. W kilku przypadkach okaza³o siê, ¿e s¹ one efektywniejsze od promotorów typu III oraz prowadz¹ do zagêszczenia siRNA w cytoplazmie. Cz¹steczki ulegaj¹ce ekspresji z wykorzystaniem promotorów U6 wystêpuj¹ g³ównie w j¹drze komórkowym. Dicer wykazuje wy¿sz¹ aktywnoæ w cytoplazmie i przetwarzanie shRNA w aktywny siRNA mo¿e byæ tam bardziej efektywne (77). Wykorzystanie promotorów Pol II poza pewnymi typami komórek jest jednak bardzo ograniczone. Pol II uczestniczy w transkrypcji genów koduj¹cych bia³ka. Transkrypty maj¹ typowe modyfikacje koñców 3' i 5', takie jak struktura cap czy poli(A) Nie odpowiada to strukturalnym wymaganiom siRNA. Z wyj¹tkiem kilku typów komórek d³ugie dsRNA uzyskane dziêki promotorom Pol II, s¹ natychmiast transportowane do cytoplazmy, gdzie indukuj¹ odpowied interferonow¹ (77). Uda³o siê uzyskaæ efekt wyciszenia z u¿yciem wektorów, zawieraj¹cych promotory Pol II. Ekspresja dwuniciowych RNA w komórkach mo¿liwa jest na dwóch drogach. Pierwsza oparta jest o syntezê dwóch komplementarnych nici siRNA o d³ugoci 21-23 nukleotydów z dwóch ró¿nych promotorów U6, z kaset zlokalizowanych tandemowo na tym samym wektorze
Neuroskop 2006, nr 8
151
Miscellanea Tabela 7. Mechanizmy indukcji ekspresji shRNA. DSE - ang. distal sequence element; Dox - doksycyklina; GAL4 - Nkoñcowy fragment transkrypcyjnego aktywatora dro¿d¿y; KRAB - rodzina transkrypcyjnych represorów zwi¹zanych z Kruppel box; PSE - ang. proximal sequence element; RXR - receptor Retinoidu X; tetO - operator tetracyklinowy; tTR - bia³ko represorowe tetracykliny; VgEcR - zmodyfikowany receptor ekdyzonu, neo - neomycyna. System
Promotor Pol III
Charakterystyka
Lit.
Plazmid, indukowany tetracyklin¹
U6, 7SK, H1
Sekwencja tetO zlokalizowana bezporednio poni¿ej TATA box. W nieobecnoci Dox, tTR wi¹¿e siê do tetO i hamuje transkrypcjê shRNA. Dodanie Dox powoduje dysocjacjê tTR, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji shRNA.
13
Plazmid, indukowany doksycyklin¹
U6
Wiele sekwencji tetO znajduje siê pomiêdzy elementami promotora Pol III DSE i PSE oraz TATA box. Taka budowa poprawia kooperatywne wi¹zanie tTR do sekwencji tetO i jednoczenie blokuje komunikacjê pomiêdzy ka¿dym z tych elementów. Dox powoduje dysocjacjê tTR, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji shRNA
8
Lentiwirus, indukowany tetracyklin¹
H1
U¿ycie bia³ka hybrydowego tTR-KRAB, kontrolowanego tetracyklin¹. W nieobecnoci Dox, tTR-Krab wi¹¿e siê do tetO i hamuje transkrypcjê shRNA. Dodanie Dox powoduje dysocjacjê tTR-KRAB, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji shRNA
73
Wirus Moloney Murine Leukemia (MoMLV), indukowany ekdyzonem
U6
Obejmuje trzy wektory retrowirusowe: ekspresja dwóch z nich prowadzi do syntezy dwóch czynników transkrypcyjnych VgEcR i RXR, a trzeciego do syntezy produktu genu po³¹czonego Gal4, bêd¹cego porednim aktywatorem, pozostaj¹cego pod kontrol¹ indukowalnego promotora. Ekdyzon powoduje dimeryzacjê czynników transkrypcyjnych i wi¹zanie siê ich do indukowalnego promotora, co aktywuje aktywator poredni GAL4. £¹czy siê on do czterech miejsc wi¹zania GAL4 w DNA, aktywuj¹c promotor U6, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji shRNA
25
System LoxP-Cre
U6
U myszy transgeniczej nie dochodzi do ekspresji U6-ploxPneo-Fgfr2 i wyciszenia genu Fgfr2. Promotor U6 jest nieaktywny z powodu insercji sekwencji neo. Po skrzy¿owaniu z mysz¹, u której w linii komórek rozrodczych dochodzi do ekspresji Cre, dochodzi do wyciêcia neo i promotor U6 jest aktywny.
11
Plazmid indukowany IPTG
H1
Promotor H1 ma wprowadzony operator lac. Zastosowanie w transgenicznych liniach komórkowych, w których ekspresji ulega represor lac. Po zastosowaniu IPTG, represor lac oddysocjowuje i mo¿liwa jest transkrypcja.
29
lub na dwóch ró¿nych plazmidach (77). Drugi sposób wymaga u¿ycia jednego promotora, aby uzyskaæ ekspresjê siRNA o strukturze spinki do w³osów (shRNA), przy czym koniec 3' 19- do 21-nukleotydowej sekwencji po³¹czony jest z koñcem 5' komplementarnej sekwencji tej samej d³ugoci poprzez pêtlê zawieraj¹c¹ 3 do 9 nukleotydów (77). W obu przypadkach powstaj¹ dwuniciowe cz¹steczki siRNA, przy czym drugi sposób wymaga zaanga¿owania przez komórkê enzymu Dicer. Istnieje mo¿liwoæ uzyskania ekspresji shRNA zwi¹zanych z tRNA przy koñcu 3, co zwiêksza efektywnoæ dostarczenia cz¹steczek do cytoplazmy (2). Wykazano,
152
¿e tRNA-shRNA, ulegaj¹cy ekspresji z wykorzystaniem promotora ludzkiego genu dla tRNAVal prowadzi do specyficznej inhibicji ekspresji genu fuzyjnego PML-RAR zarówno in vitro jak i in vivo (49). Badania wyciszania genów zwi¹zanych z cyklem komórkowym, apoptoz¹ i rozwojem s¹ bardzo trudne. Hydroliza mRNA krytycznego dla organizmu na danym etapie rozwoju mo¿e prowadziæ do zaburzeñ i uniemo¿liwiæ uzyskanie wyników na kolejnych etapach. Aby temu zapobiec mo¿na stosowaæ wektory, zawieraj¹ce promotory warunkowe (ang. conditional promoters) (tab. 7, ryc. 3). W tym celu wykorzystano promotory Pol III, pomimo ich
Neuroskop 2006, nr 8
Miscellanea
Rycina 3. Zale¿noæ syntezy siRNA od tetracykliny (Tet) lub doksycykliny (Dox). TetR represor tetracyklinowy; TetO operator tetracyklinowy.
mniejszej wszechstronnoci w porównaniu z Pol II. Tego typu konstrukcje cile reguluj¹ transkrypcjê siRNA w komórkach, w których zachodzi przejciowa lub stabilna ekspresja represora Tet (TetR) (77). Sekwencja operatora tertracyklinowego TetO umieszczona jest powy¿ej sekwencji promotorów H1, U6 lub 7SK. Przy³¹czenie siê represora do operatora hamuje transkrypcjê. Tetracyklina lub doksycyklina powoduj¹ dysocjacjê kompleksu, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji interferuj¹cego RNA. Wektory tego typu umo¿liwiaj¹ kontrolê poziomu docelowego bia³ka poprzez regulacjê stê¿enia czynnika indukcyjnego. Trwaj¹ prace nad wykorzystaniem wektorów, w których ekspresja interferencyjnego RNA zale¿na jest od dwóch czynników kontrolnych ekdyzonu oraz produktu genu Gal4 (25). Promotory warunkowe Pol III umo¿liwiaj¹ regulacjê ekspresji shRNA tkankowo- lub komórkowospecyficznej poprzez ekspresjê aktywatora GAL4 pozostaj¹cego pod kontrol¹ tkankowospecyficznych promotorów (47). Wektory maj¹ce promotory warunkowe uda³o siê zastosowaæ w dowiadczeniach in vitro. Pokazano kontrolowane wy³¹czenie genu DMNT1 (DNA metylotransferaza-1) w ludzkich komórkach rakowych, prowadz¹ce do zahamowania ich wzrostu, wyciszenia genu CXCR4 (receptor CXC4, zwi¹zany z ruchliwoci¹) w komórkach raka piersi, znacznego zahamowania ich przemieszczania; oraz do wy³¹czenia genu -kateniny w komórkach raka okrê¿nicy, uzyskuj¹c zahamowanie cyklu komórkowego i wzrostu (47). Opisany system indukcyjny zosta³ tak¿e sprawdzony in vivo u myszy, u której wystêpowa³y przerzuty nowotworu, przy czym ekspresja siRNA nie podlega³a w tym przypadku tak cis³ej regulacji jak w przypadku badañ in vitro na wyselekcjonowanych komórkach (77). W wiêkszoci przypadków plazmidy ulegaj¹ przejciowej ekspresji z wytworzeniem siRNA. Drugi typ noników wykorzystywanych do uzyskania wyciszenia docelowych genów stanowi¹ wektory wirusowe. W celu dostarczenia do komórek ekspresyjnych kaset siRNA mo¿na wykorzystaæ trzy rodziny cz¹steczek wirusowych: oparte na retrowirusach (zarówno onkowirusy jak i lentiwirusy), adenowirusach oraz wirusach AAV (ang. adeno-associated viruses) (77), które do replikacji potrzebuj¹ wirusa wspomagaj¹cego (adenowirusa lub herpeswirusa). Zastosowa-
nie wektorów wirusowych daje mo¿liwoæ uzyskania stabilnego wyciszenia docelowego genu, w zwi¹zku z mo¿liwoci¹ integracji genomu wirusa z genomem gospodarza i d³ugotrwa³ej transkrypcji wyciszaj¹cego RNA. Wektory wirusowe ró¿ni¹ siê miêdzy sob¹ typem preferowanych komórek docelowych, ³atwoci¹ zastosowania in vitro i in vivo, zdolnoci¹ do integracji z genomem gospodarza lub jej brakiem, poziomem immunogennoci oraz maksymalnym mo¿liwym rozmiarem insertu. Kontrola procesu interferencji RNA mo¿e byæ zrealizowana w przypadku po³¹czenia cech wektorów wirusowych i systemów ekspresji siRNA opartych na promotorach warunkowych. W przeprowadzonych dowiadczeniach in vitro, równoczesna infekcja wektorem adenowirusowym, zawieraj¹cym system ekspresji siRNA pozostaj¹cy pod kontrol¹ promotora H1, zale¿nego od doksycykliny oraz wektorem adenowirusowym koduj¹cym represor tetracyklinowy, doprowadzi³a do inhibicji ekspresji genów p53 i c-Myc w sposób zale¿ny od doksycykliny i dawki wirusa (30). W ten sposób uda³o siê uzyskaæ podwójny system kontroli. dsRNA mo¿e zostaæ wprowadzony do komórki na drodze elektroporacji, mikroiniekcji, zanurzania organizmu w roztworze dsRNA, drog¹ pokarmow¹ lub z wykorzystaniem wektorów plazmidowych lub wirusowych. Metody te by³y stosowane w stosunku do ró¿nych organizmów (1). Podanie myszy o wadze 20 g zastrzyku roztworu siRNA o objêtoci 1ml odpowiada iniekcji 3,5 l roztworu pacjentowi o wadze 70 kg (5). Istnieje mo¿liwoæ wprowadzenia siRNA do organizmu drog¹ inhalacji. Wprowadzony w ten sposób siRNA u myszy zahamowa³ infekcjê wywo³an¹ wirusami RSV (ang. respiratory syncytial virus) oraz PIV (ang. parainfluenza virus) (4, 79). Dla lokalnego dostarczania cz¹steczek RNAi istotny jest wybór powierzchni wnikania terapeutyku. B³ony luzowe s¹ miejscem wnikania wielu czynników infekcyjnych, dlatego wydaj¹ siê byæ doskona³ym celem dla RNAi (59). Istnieje szansa na stworzenie leku opartego na technologii RNAi bez koniecznoci wykonywania zastrzyków, ale poprzez kontakt z b³on¹ luzow¹ dróg oddechowych, rozrodczych, czy uk³adu pokarmowego.
Badania kliniczne
Badania wyciszania genów RNAi wkroczy³y na etap badañ klinicznych. W fazie I eksperymentalny lek jest testowany po raz pierwszy na ma³ej grupie ludzi (20-80 osób), w celu okrelenia bezpiecznej dawki leku oraz identyfikacji efektów ubocznych. W fazie II badaniu podlega wiêksza liczba osób stosuj¹cych dany lek (100-300). Celem tego etapu jest sprawdzenie efektywnoci preparatu oraz dalsze sprawdzanie jego bezpieczeñstwa. Eksperymentalny rodek podawany wiêkszej grupie ludzi (1000-3000) charakteryzuje fazê III badañ klinicznych.
Neuroskop 2006, nr 8
153
Miscellanea Tabela 8. Badania kliniczne RNAi (5, 17). AMD ang Age-related macular degeneration, degeneracja plamki ¿ó³tej, DMO Diabetic macular oedema, cukrzycowy obrzêk plamki ¿ó³tej, IND proba do FDA o pozwolenie na testowanie nowego leku na ludziach. Firma
Produkt
Choroba/ okolicznoæ
Etap badañ
Acuity Pharmaceuticals (www.acuitypharma.com)
Cand5 Bevasiranib
AMD AMD, DMO
Faza I kliniczna od X 2004 Faza II od 2006
Sirna Therapeutics (www.sirna.com)
Sirna-027
AMD
Faza I kliniczna od XI 2004
Alnylam (www.alnylam.com)
Ocular siRNA Tx RSV siRNA Tx
AMD Infekcja RSV
Faza I kliniczna od 2005 Faza I kliniczna od 2006
Benitec (www.benitec.com)
BLT-HCV
Faza I kliniczna 2005/2006
RNAi HIV Tx
Wirusowe zapalenie w¹troby typu C HIV I AIDS
Genesis R&D (www.genesis.co.nz)
RNAi
Astma
Faza I kliniczna od 2006
ToleroTech (www.tolerotech.com)
ToleroVax
Odrzucanie przeszczepów
Wniosek IND 2005
PTC Therapeutics (www.ptcbio.com)
PTC-299
VEGF
Faza I kliniczna od 2006
Atugen (www.atugen.com)
atuRNAi
Cukrzyca
Wniosek IND 2005/2006
Jej celem jest potwierdzenie jego efektywnoci, monitorowanie efektów ubocznych, porównanie z powszechnie stosowanymi lekami oraz zbieranie informacji umo¿liwiaj¹cych w przysz³oci bezpieczne jego stosowanie. W fazie IV zbierane s¹ dodatkowe informacje, ju¿ po wprowadzeniu leku na rynek. Badania te dotycz¹ ryzyka stosowania leku, korzyci oraz dawki optymalnej (75). Chorobotwórczy gen ApoB (apoliproteina B) zosta³ wyciszony u ma³p poprzez wprowadzenie siRNA do krwiobiegu (9). siRNA specyficzny wobec ApoB w postaci cz¹stek SNALP (ang. stable nucleic acid lipid particles) podany w wysokiej dawce (1 i 2.5 mg kg1) akumulowa³ siê w w¹trobie po 48 godzinach powoduj¹c wyciszenie ponad 90% (83). Efekt utrzyma³ siê przez 11 dni, nie zaobserwowano efektów toksycznych dla organizmu (9). Wprowadzenie systemiczne siRNA do zwierz¹t naczelnych okaza³o siê skuteczne i bezpieczne, co daje nadziejê na podobny efekt u ludzi. Firmy biotechnologiczne rozpoczê³y lub planuj¹ rozpoczêcie badañ klinicznych leków opartych na technologii RNAi (tab. 8). Badania dotycz¹ terapii chorób wirusowych jak i wieloczynnikowych. Dotychczas prace badawcze obejmuj¹ pierwsz¹ fazê badañ klinicznych. Kilka firm skupia siê na terapii degeneracji plamki ¿ó³tej (ang.
154
Faza I kliniczna od 2006
age-related macular degeneration, AMD) poprzez inhibicjê ekspresji genu VEGF (ang. vascular endothelial growth factor). Obecnie w stanie nieuleczalnym AMD jest 1.65 milionów Amerykanów (57). Acuity Pharmaceuticals sugeruje, ¿e na wiecie w roku 2013 na AMD bêdzie chorowaæ 11 milionów ludzi (57). Badania przeprowadzone na grupie 129 pacjentów wskazuj¹, ¿e wstrzykniêty do oka Bevasiranib redukuje wzrost naczyñ krwiononych, co nieznacznie poprawia wzrok (57). Przy niskich dawkach efekt utrzymywa³ siê przez kilka miesiêcy, przy wy¿szych o wiele d³u¿ej. Nie obserwowano szkodliwych efektów ubocznych z wyj¹tkiem przewidywanej opuchlizny i stanu zapalnego w miejscu wstrzykniêcia leku (57). Niewykluczone, ¿e Bevasiranib jak i inne podobne terapeutyki bêd¹ stosowane ³¹cznie z lekami przeciwnowotworowymi, które tak¿e blokuj¹ efekty VEGF. Pierwsze wyniki badañ klinicznych wydawa³y siê zgodne z teori¹. Pod wp³ywem leku dochodzi³o do efektywnej redukcji rozmiarów nowotworów oraz iloci cz¹stek wirusowych u pacjentów (56). Dok³adna analiza wyników wykazuje, ¿e uzyskane rezultaty spowodowane by³y raczej wzrostem produkcji interferonu przez uk³ad immunologiczny w odpowiedzi na obcy RNA, ni¿ specyficznym wyciszeniem docelowych genów (56).
Neuroskop 2006, nr 8
Miscellanea Aspekty komercyjne RNAi
Od czasu opisania istoty RNAi pod koniec ubieg³ego wieku, technologia ta zosta³a szybko zaadaptowana w laboratoriach badawczych. Interferencja RNA w odró¿nieniu od innych metod terapeutycznych wykorzystuje naturalne elementy maszynerii komórkowej. siRNA w swym dzia³aniu przypominaj¹ katalizatory jedna cz¹steczka mo¿e wyciszyæ wiele cz¹steczek mRNA. Zapewnia to wysok¹ efektywnoæ dzia³ania. Od 1998 roku roczna liczba publikacji na temat RNAi wzros³a z kilkunastu do kilkuset (31). Aby RNAi by³o skuteczn¹ metod¹ terapeutyczn¹, nale¿y przezwyciê¿yæ trudnoci natury technicznej oraz finansowej, co oznacza produkcjê leku przy racjonalnych kosztach (56). Interferencja RNA nie zosta³a jeszcze wykorzystana jako metoda terapeutyczna, ale ju¿ teraz technologie RNAi przynosz¹ du¿e zyski. Rynek produktów opartych na RNAi w tym siRNA, oligonukleotydy RNA i wektory DNA, koduj¹ce siRNA przyniós³ dochód w roku 2003 w wysokoci 38 milionów dolarów (dane wed³ug Front Line Strategic Consulting, San Meteo, USA) (31) (ryc. 4). Rozmiary
rynku odzwierciedlaj¹ czas zaadaptowania danej techniki. Pierwsz¹ opracowan¹ metod¹ by³y oligonukleotydy RNA, nastêpnie techniki oparte o wektory. Wzglêdnie nowy obszar stanowi lecznictwo, obejmuj¹ce zastosowanie RNAi do odkrywania nowych leków. Przewiduje siê, ¿e dochód zwi¹zany z technologi¹ RNAi bêdzie systematycznie wzrasta³, osi¹gaj¹c w 2008 roku 185 milionów dolarów. Szacuje siê, ¿e technologia RNAi obejmie oko³o 10% rynku leków, co oznacza miliardy dolarów zysków. Pomimo tego, ¿e zastosowanie RNAi budzi nadzieje w kilku przypadkach, wielu obserwatorów twierdzi, ¿e nie przejd¹ one pomylnie prób klinicznych i nie zostan¹ zatwierdzone w USA przez FDA przed rokiem 2008 lub, co bardziej prawdopodobne, przed 2013 (31). Odkrycie mo¿liwoci zastosowania interferencji RNA jako technologii terapeutycznej silnie zaanga¿owa³o przemys³. W badania RNAi w³¹czy³o siê ju¿ ponad 100 firm (66). Czêæ z nich dostarcza odczynniki i rozwi¹zania metodyczne niezbêdne do wykonania dowiadczeñ, reszta to firmy biotechnologiczne lub farmaceutyczne poszukuj¹ce komercyjnych zastosowañ RNAi (tab. 9).
Tabela 9. Firmy biotechnologiczne wykorzystuj¹ce technologiê RNAi (31). Firma
Data Za³o¿yciele za³o¿enia i doradcy
Technologia
Acuity Pharmaceuticals (Filadelfia, USA)
2002
Michael Tolentino i Samuel RNAi przeciwko Reich (Univerity czynnikowi wzrostu of Pennsylvania) ródb³onka naczyñ w chorobach oczu
Leki przeciwko starczemu zwyrodnieniu plamki i retinopatii cukrzycowej
Alnylam Holding Company (Cambridge, USA) 2003, fuzja Alnylam i Ribopharma AG
2002
Phil Sharp (MIT), David Bartel (The Whitehead), Paul Schimmel (Scripps Institute), Tom Tushl (Rockefeller University) i Phillip Zamore (U. Mass Medical School), Roland Kreutzer i Stefan Limmer (za³o¿yciele Ribopharma)
Terapeutyczne zastosowanie RNA dostarczonego do komórek i doros³ych ssaków
Leki przeciwko chorobom wirusowym, nowotworowym, metabolicznym, chorobom centralnego uk³. nerwowego i chorobom autoimmunogennym
SR Pharma (Berlin, Niemcy)
1998
Zwi¹zana z Ribozyme Pharmaceuticals (obecnie Sirna Therapeutics)
Wy³¹czna licencja na odkryte cele dla RNAi firmy Sirna oraz technologie zatwierdzone
Leki przeciwnowotworowe, analizy cie¿ek i zatwierdzanie celów
Avocel (Sunnyvale, USA)
2003
Mark Kay (Stanford University)
Wy³¹czna licencja Leki przeciwko na ekspresjê RNAi przewlek³ej ¿ó³taczce u ssaków z pominiêtypu B i C ciem embrionów (Stanford Univeristy) oraz wspó³-wy³¹czna licencja na dostarczanie RNAi do ssaków z pominiêciem embrionów
Neuroskop 2006, nr 8
Zakres dzia³añ
155
Miscellanea Firma
Data Za³o¿yciele za³o¿enia i doradcy
Technologia
Benitec (Queensland, Australia)
1997
Qeensland Department of Primary Industries
RNAi kierowane przez Leki przeciwko nowotwoDNA (ang. DNA-directed rom, chorobom RNAi, ddRNAi) autoimmuno-gennym, HIV/AIDS i przewlek³ym chorobom wirusowym
Cenix BioScience (Dresden, Niemcy)
1999
Christophe Echeverri, Pierre Gonczy, Anthony Hyman (European Molecular biology, Heidelberg, Niemcy; Max Planck Labolatory, Dresden, Niemcy)
Zastosowanie RNAi na skalê genomow¹
Projektowanie na zamówienie bibliotek RNAi na du¿¹ skalê (proponowane przez Ambion), odkrywanie i zatwierdzanie celów
CytRx (Los Angeles, USA)
2002
Fuzja z Global Genomics, zmiana zainteresowañ firmy na RNAi
Licencja U Masss Medical School na wyciszanie genów w przypadku specyficznych chorób
Leki przeciwko oty³oci, cukrzycy typu 2 oraz stwardnienie zanikowe boczne
Devgen (Ghent, Belgia)
1997
Thieryy Bogaert (MRC, Cambridge, Wlk. Bryt.), Michael Hengartner (University of Zurich)
Biblioteka RNAi C. elegans na skalê genomow¹
Leki przeciwko chorobom metabolicznym i centralnego uk³. nerwowego
Intradigm (Rockville, USA)
2001
Martin Woodle (Novartis, Cambridge, USA)
Dostarczanie genów Leki przeciwko oraz wektory terapii nowotworom genowej rozbudowywane w Genetic Therapy z u¿yciem RNAi (przedsiêbiorstwo zale¿ne Novartis)
Nucleonics (malvern, USA)
2001
C. Satishchandran i Catherine Pachuk (Thomas Jefferson Univerity, Filadelfia, USA)
Ekspresyjny d³ugi interferuj¹cy RNA (ang. expressed long interfering RNA, eiRNA)
Leki na podstawie interferuj¹cego RNA
Polgen 2000 (Cambridge, Wlk. Bryt.), wydzia³ Cyclacel (Dundee, Wlk. Bryt.)
David Glover (University of Cambridge, Cambridge, Wlk. Bryt.)
Identyfikacja celów zwi¹zanych z cyklem komórkowym z badañ przesiewowych genomu z u¿yciem RNAi w liniach komórkowych u Drosophila
Cele nowotworowe i szlaki; fenotypowa charakteryzacja po wy³¹czeniu genu i u¿yciu ma³ych inhibitorów cz¹steczkowych
Sequitur (Natick, USA) (Firma zosta³a nabyta w listopadzie 2003 przez firmê Invitrogen (Carlsbad, USA)
Tod Woolf, Craig Mello (U. Mass Medical School) oraz Richard Wagner (Phylos, Lexington, USA)
Zastrze¿ona tajemnicza technologia RNAi (ang. stealth RNAi technology)
Leki przeciwko niewydolnoci w¹trobowej, RSV (ang. respiratory syncytial virus), astmie i rakowi piersi
156
1996
Neuroskop 2006, nr 8
Zakres dzia³añ
Miscellanea Firma
Data Za³o¿yciele za³o¿enia i doradcy
Technologia
Zakres dzia³añ
Sirna Therapeutics (dawniej Ribozyme Phermaceuticals) (boulder, USA)
1992
Terapeutyczne zastosowanie RNAi i ekspresja siRNA w komórkach (Max Planck, MIT, U Mass Medical School, Whitehead). Chemicznie zmodyfikowane siRNA i RNA. Synteza i produkcja przemys³owa RNA
Leki przeciwko ¿ó³taczce typu C, starczemu zwyrodnieniu plamki (szlak VEGF), onkologia, stany zapalne, choroby metaboliczne i centralnego uk³. nerwowego
Ralph Chris Christoffersen (Morgenthaler Ventures, Boulder, USA)
8. Chen Y., Stamatoyannopoulos G., Song C.Z.: Downregulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 2003, 63, 4801-4804 9. Choi C.: RNAi works in monkeys. 2006, www.the-scientist.com/ news/display/ 23250/
Rycina 4. Obszary rynku zwi¹zane z technologi¹ RNAi (31).
Z mo¿liwych do wyró¿nienia trzech typów technik anty-mRNA, obejmuj¹cych jednoniciowe antysensowne oligonukleotydy, rybozymy i interferencjê RNA, ta ostatnia wydaje siê mieæ najlepsze perspektywy. O nieop³acalnoci technologii opartej na rybozymach mo¿e wiadczyæ firma Sirna Therapeutics, która powsta³a z Ribozyme Pharmaceuticals, po tym jak kilka zaprojektowanych leków nie spe³nia³o oczekiwañ. Przemiana firmy na skraju bankructwa, posiadaj¹cej jedynie 2 miliony dolarów w gotówce, przynios³a w ci¹gu 18 miesiêcy a¿ 72 miliony dolarów od nowych inwestorów. Nawet je¿eli tylko niewielka czêæ projektów opartych na RNAi znajdzie terapeutyczne zastosowanie, technologia ta mo¿e prowadziæ do miliardów dolarów zysku z nowych leków (65).
Pimiennictwo
1. Agrawal N., Dasaradhi P.V.N., Mohmmed A., Malhotra P., Bhatnagar R.K., Mukherjee S.K.: RNA interference: biology, mechanizm, and applications. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003, 67, 657-685 2. Amarzguioui M., Rossi J.J., Kim D.: Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 2005, 579, 5974-5981 3. B¹k D.: RNAi interferencja RNA skuteczny sposób na ciszê. Postêpy Biochem. 2003, 49, 136-146 4. Bitko V., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S.: Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA, Nat. Med. 2005, 11, 50-55 5. Cejka D., Losert D., Wacheck V.: Short interfering RNA (siRNA): tool or therapeutic? Clin. Sci. 2006, 110, 47-58 6. Chang Y., Chang S.S., Lee H.H., Doong S.L., Takada K., Tsai C.H.: Inhibition of the Epstein-Barr virus lytic cycle by Zta-targeted RNA interference. J. Gen. Virol. 2004, 85, 1371-1379 7. Charames G.S., Bapat B.: Cyclooxygenase-2 knockdown by RNA interference in colon cancer. Int. J. Oncol. 2006, 28, 543-549
10.Coburn G.A., Cullen B.R.: Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by RNA interference. J. Virol. 2002, 76, 9225-9231 11.Coumoul X., Shukla V., Li C., Wang R.H., Deng C.X.: Conditional knockdown of Fgfr2 in mice using Cre-LoxP induced RNA interference. Nucleic Acids Res. 2005, 33, e102 12.Couzin J.: RNAi safety comes under scrutiny, Science, 2006, 312, 1121 13.Czauderna F., Santel A., Hinz M., Fechtner M., Durieux B., Fisch G., Leenders F., Arnold W., Giese K., Klippel A., Kaufmann J.: Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic Acids Res. 2003, 31, e127 14.Dillon C.P., Sandy P., Nencioni A., Kissler S., Rubinson D.A., Van Parijs L.: RNAi as an experimental and therapeutic tool to study and regulate physiological and disease processes. Annu. Rev. Physiol. 2005, 67, 147-173 15.Echeverri C.J., Perrimon N.: High-throughput RNAi screening in cultured cells: a users guide. Nat. Rev. Genet. 2006, 7, 373-384 16.Elbashir S.M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W., Tuschl T.: Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J. 2001, 20, 6877-6888 17.Frantz S.: Safety concerns raised over RNA interference. Nat. Rev. Drug Discov. 2006, 5, 528-529 18.Gabryelska M., Nowak S., ¯ukiel R., Barciszewski J.: Interferencja RNA nowa technologia w leczeniu nowotworów. Neuroskop 2005, 7, 27-38 19.Gabryelska M., Nowak S., ¯ukiel R., Barciszewski J.: Uniwersalna metoda inhibicji ekspresji genów interferencja RNA. Na pograniczu chemii i biologii 2005, Tom XII, 235-267 20.Gaur R.K.: RNA interference: a potential therapeutic tool for silencing splice isoforms linked to human diseases. Biotechniques, 2006, 40, 15-22 21.Ge Q., Filip L., Bai A., Nguyen T., Eisen H.N., Chen J.: Inhibition of influenza virus production in virus infected mice by RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 8676-8681 22.Glunde K., Raman V., Mori N., Bhujwalla Z.M.: RNA interferencemediated choline kinase suppression in breast cancer cells induces differentiation and reduces proliferation. Cancer Res. 2005, 65, 11034-11043 23.Gomez-Valades A.G., Vidal-Alabro A., Molas M., Boada J., Bermudez J., Bartrons R., Perales J.C.: Overcoming diabetes-induced hyperglycemia through inhibition of hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) with RNAi. Mol. Ther. 2006, 13, 401-10
Neuroskop 2006, nr 8
157
Miscellanea 24.Grimm D., Streetz K.L., Jopling C.L., Storm T.A., Pandey K., Davis C.R., Marion P., Salazar F., Kay M.A.: Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature 2006, 441, 537-541 25.Gupta S., Schoer R.A., Egan J.E., Hannon G.J., Mittal V.: Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 1927-1932 26.Hannon G.J., Rossi J.J.: Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature 2004, 431, 371-378 27.Harper S.Q., Staber P.D., He X., Eliason S.L., Martins I.H., Mao Q., Yang L., Kotin R.M., Paulson H.L., Davidson B.L.: RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntingtons disease mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 5820-5825 28.Heidenreich O.: Oncogene suppression by small interfering RNAs. Curr. Pharm. Biotechnol. 2004, 5, 349-354 29.Higuchi M., Tsutsumi R., Higashi H., Hatekeyama M.: Conditional gene silencing utilizing the lac repressor reveals a role of SHP-2 in cagA-positive Helicobacter pylori pathogenicity. Cancer Sci. 2004, 95, 442-447 30.Hosono T., Mizuguchi H., Katayama K., Xu Z., Sakurai F., Ishii-Watabe A., Kawabata K., Yamaguchi T., Nakagawa S., Mayumi T., Hayakawa T.: Adenovirus vector-mediated doxycycline-inducible RNA interference. Hum. Gene Ther. 2004, 15, 813-819 31.Howard K.: Unlocking the money-making potential of RNAi. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 1441-1446 32.Hua J., Mutch D.G., Herzog T.J.: Stable suppression of MDR-1 gene using siRNA expression vector to reverse drug resistance in a human uterine sarcoma cell line. Gynecol. Oncol. 2005, 98, 31-38 33.Jackson A.L., Linsley P.S.: Noise amidst the silence: off-target effects of siRNAs? Trends Genet. 2004, 20, 521-524 34.Jiang M., Arzumanov A.A., Gait M.J., Milner J.: A bi-functional siRNA construct induces RNA interference and also primes PCR amplification for its own quantification. Nucleic Acids Res. 2005, 33, e151 35.Judge A.D., Sood V., Shaw J.R., Fang D., McClintock K., MabLachlan I.: Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA. Nat. Biotechnol. 2005, 23, 457-462 36.Kim. D.H., Longo M., Han Y., Lundberg P., Cantin E., Rossi J.J.: Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 321-325 37.Konstantinova P., de Vries W., Haasnoot J., ter Brake O., de Haan P., Berkhout B.: Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 by RNA interference using long-hairpin RNA. Gene Ther. 2006, 13, 1403-13 38.Kurreck J.: Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. J. Biochem. 2003, 270, 1628-1644 39.Lau N.C., Bartel D.P.: Cenzorzy genów. wiat Nauki, 2003, 145, 34-41 40.Li B., Tang Q., Cheng D., Qin C., Xie F.Y., Wei Q., Xu J., Liu Y., Zheng B., Woodle M.C., Zhong N., Lu P.Y.: Using siRNA in prophylactic and therapeutic regimans against SARS coronavirus in Rhesus macaque. Nat. Med. 2005, 11, 944-951 41.Li Y.C., Kong L.H., Cheng B.Z., Li K.S.: Construction of influenze virus siRNA expression vectors and their inhibitory effects on multiplication of influenza virus. Avian Dis. 2005, 49, 562-573 42.MacRae I.J., Zhou K., Li F., Repic A., Brooks A.N., Cande W.Z., Adams P.D., Doudna J.A.: Structural Basis for Double-Stranded RNA Processing by Dicer. Science 2006, 311, 195-198 43.Makimura H., Mizuno T.M., Mastaitis J.W., Agami R., Mobbs C.V.: Reducing hypothalamic AGRP by RNA interference increases metabolic rate and decreases body weight without influencing food intake. BMC Neurosci. 2002, 3:18
158
44.Marques J.T., Devosse T., Wang D., Zamanian-Daryoush M., Serbinowski P., Hartmann R., Fujita T., Behlke M.A., Williams B.R.: A structural basis for discriminating between self and nonself double-stranded RNAs in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 559-565 45.McManus M.T., Sharp P.A.: Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat. Rev. Genet. 2002, 3, 737-747 46.McRobert L., McConkey G.A.: RNA interference (RNAi) inhibits growth of Plasmodium falciparum. Mol. Biochem. Parasitol. 2002, 119, 273-278 47.Mittal V.: Improving the efficiency of RNA interference in mammals, Nat. Rev. Genet. 2004, 5, 355-365 48.Mohmmed A., Dasaradhi P.V., Bhatnagar R.K., Chauhan V.S., Malhotra P.: In vivo gene silencing in Plasmodium berghei-a mouse malaria model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 309, 506-511 49.Oshima K., Kawasaki H., Soda Y., Tani K., Asano S., Taira K.: Maxizymes and small hairpin-type RNAs that are driven by a tRNA promoter specifically cleave a chimeric gene associated with leukemia in vitro and in vivo. Cancer Res. 2003, 63, 6809-6814 50.Pai S.I., Lin Y.Y., Macaes B., Meneshian A., Hung C.F., Wu T.C.: Prospects of RNA interference therapy for cancer. Gene. Ther. 2006, 13, 464-477 51.Palliser D., Chowdhury D., Wang Q.Y., Lee S.J., Bronson R.T., Knipe D.M., Liberman J.: An siRNA-based microbicide protects mice from lethal herpes simplex virus 2 infection. Nature 2006, 439, 89-94 52.Park W.S., Hayafune M., Miyano-Kurosaki N., Takaku H.: Specific HIV-1 gene silencing by small interfering RNAs in human peripheral blood mononuclear cells. Gene Ther., 2003, 10, 2046-2050 53.Putral L.N., Bywater M.J., Gu W., Saunders N.A., Gabrielli B.G., Leggatt G.R., McMillan N.A.J.: RNAi against HPV oncogenes in cervical cancer cells results in increased sensitivity to cisplatin. Mol. Pharmacol. 2005, 68, 1311-1319 54.Raoul C., Abbas-Terki T., Bensadoun J., Guillot S., Haase G., Szulc J., Henderson C.E., Aebischer P.: Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat. Med. 2005, 11, 423-428 55.Robbins M.A., Li M., Leung I., Li H., Boyer D.V., Song Y., Behlke M.A., Rossi J.J.: Stable expression of shRNAs in human CD34+ progenitor cells can avoid induction of interferon responses to siRNAs in vitro. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 566-571 56.Robinson R.: RNAi Therapeutics: How likely, how soon? PloS Biol. 2004, 2, 0018. 57.Ruttimann J.: RNA therapy tackles eye disease. Nature 2006, www.nature.com/ news/2006/060605/pf/060605-4.html 58.Saksela K.: Human viruses under attack by small inhibitory RNA. Trends Microbiol. 2003, 11, 345-347 59.Sandy P., Ventura A., Jacks T.: Mammalian RNAi: a practical guide. Biotechniques 2005, 39, 215-224 60.Scherr M., Eder M.: RNAi in functional genomics. Curr. Opin. Mol. Ther. 2004, 6, 129-135 61.Sioud M.: RNA interference below the immune radar. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 521-522. 62.Skipper M.: RNA interference. Have our dreams been shattered? Nat. Rev. Genet. 2003, 4, 671 63.Sledz C.A., Holko M., de Veer M.J., Silverman R.H., Williams B.R.: Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat. Cell Biol. 2003, 5, 834-839 64.Stevenson M.: Therapeutic potential of RNA interference. N. Engl. J. Med. 2004, 351, 1772-1777
Neuroskop 2006, nr 8
Miscellanea 65.Stipp D.: Biotechs billion dollar breakthrough. A technology called RNAi has opened the door to major new drugs. Already its revolutionizing gene research. Fortune 2003, 147, 96 66.Stix G.: Kto wy³¹czy geny? wiat Nauki 2004, 159, 72-75 67.Syhan A.A., Vlassov A.V., Ilves H., Egry L., Kaspar R.L., Kazakov S.A., Johnston B.H.: Complete, gene-specific siRNA libraries: production and expression in mammalian cells, RNA 2005, 11, 837-46 68.Tuschl T., Borkhardt A.: Small interfering RNAs: a revolutionary tool for the analysis of gene function and gene therapy. Mol. Interv. 2002, 2, 158-166 69.Uprichard S.L.: The therapeutic potential of RNA interference. FEBS Lett. 2005, 579, 5996-6007 70.Wang S., Chai Y.B., Liu F., Zhang X.Y., Jia W., Xie X., Yu W.Q., Shang Z.C., Jin B.Q., Sun B.Z.: Effect of specific siRNA targeting against bcr-abl chimeric gene on chronic myelogenous leukemia cells. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2005, 85, 198-202 71.Wang W., Wang C.Y., Dong J.H., Chen X., Zhang M., Zhao G.: Identification of effective siRNA against K-ras in human pancreatic cancer cell line MiaPaCa-2 by siRNA expression cassette. World J. Gastroentero. 2005, 7, 2026-2031 72.Wiebusch L., Truss M., Hagemeier C.: Inhibition of human cytomegalovirus replication by small interfering RNAs. J. Gen. Virol. 2004, 85, 179-184 73.Wiznerowicz M., Trono D.: Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J. Virol. 2003, 77, 8957-8961
79.Zhang W., Yang H., Kong X., Mohapatra S., Juan-Vergara H.S., Hellermann G., Behera S., Singam R., Lockey R.F., Mohaptra S.S.: Inhibition of respiratory syncytial virus infection with intranasal siRNA nanoparticles targeting the viral NS1 gene. Nat. Med. 2004, 11, 56-62 80.Zhang X.N., Xiong W., Wang J.D., Hu Y.W., Xiang L., Yuan Z.H.: siRNA-mediated inhibition of HBV replication and expression. World J. Gastroenterol. 2004, 10, 2967-2971 81.Zhang Y., Wang Y., Gao W., Zhang R., Han X., Jia M., Guan W.: Transfer of siRNA against XIAP induces apoptosis and reduces tumor cells growth potential in human breast cancer in vitro and in vivo. Breast Cancer Res. Treat. 2006, 96, 267-277 82.Zhang Y., Zhang Y.F., Bryant J., Charles A., Boado R.J., Pardridge W.M.: Intravenous RNA interference gene therapy targeting the human epidermal growth factor receptor prolongs survival in intracranial brain cancer. Clin. Cancer Res. 2004, 10, 3667-3677 83.Zimmerman T.S., Lee A.C.H., Akinc A., Bramlage B., Bumcrot D., Fedoruk M.N., Harborth J., Heyes J.A., Jeffs L.B., John M., Judge A.D., Lam K., McClintock K., Nechev L.V., Palmer L.R., Racie T., Rohl I., Seiffert S., Shanmugam S., Sood V., Soutschek J., Toudjarska I., Wheat A.J., Yaworski E., Zedalis W., Koteliansky V., Manoharan M., Vornlocher H.P., MacLachlan I.: RNAi-mediated gene silencing in nonhuman primates. Nature 2006, 441, 111-114 84.¯ukiel R., Nowak S., Wyszko E., Rolle K., Gawroñska I., Barciszewska M.Z., Barciszewski J.: Suppression of human brain tumor with interference RNA specific for Tenascin-C. Cancer Biol. Ther. 2006, 5, 1002-1007
74.Wu C.J., Huang H.W., Liu C.Y., Hong C.F., Chan Y.L.: Inhibition of SARS-CoV replication by siRNA. Antiviral Res. 2005, 65, 45-48 75.www.clinicaltrials.gov 76.Yoon J.S., Kim S.H., Shin M.C., Hong S.K., Jung Y.T., Khang I.G., Shin W.S., Kim C.C., Paik S.Y.: Inhibition of herpesvirus-6B RNA replication by short interference RNAs, J. Biochem. Mol. Biol. 2004, 37, 383-385. 77.Zentilin L., Giacca M.: In vivo transfer and expression of genes coding for short interfering RNAs. Curr. Pharm. Biotechnol. 2004, 4, 341-347 78.Zhang M., Zhang X., Bai C.X., Song X.R., Chen J., Gao L., Hu J., Hong Q.Y., West M.J., Wei M.Q.: Silencing the epidermal growth factor receptor gene with RNAi may be developed as a potential therapy for non small lung cancer. Genet. Vaccines Ther. 2005, 30, 3-5
Adres do korespondencji: Katedra i Klinika Neurochirurgii i Neurotraumatologii A.M. im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu ul. Przybyszewskiego 49, 60-355 Poznañ
Neuroskop 2006, nr 8
159
