POST. MIKROBIOL., 2003, 42, 4, 359–368 http://www.pm.microbiology.pl

ZASTOSOWANIE BIA£KA ZIELONEJ FLUORESCENCJI DO BADANIA DYNAMIKI REPLIKACJI I SEGREGACJI CHROMOSOMU BAKTERYJNEGO

Beata Ruban-Oœmia³owska, Jolanta Zakrzewska-Czerwiñska

1. Wprowadzenie. 2. Bia³ko zielonej fluorescencji. 3. Dynamika replikacji i segregacji chromosomów Visualization of bacterial chromosome dynamics with green fluorescent protein Abstract: Green fluorescent protein (GFP) from Aequorea victoria has several features that make it an attractive candidate for protein localization studies in bacteria. Visualization of specific chromosomal fragments using GFP fusion proteins has provided new and special opportunities for directly observing chromosome dynamics in vivo. Recent evidence for rapid oriC region movement suggests an active chromosome segregation mechanism in bacteria; the newly replicated origin regions migrate toward opposite cell poles, whereas the terminus remains at midcell. 1. Introduction. 2. Green fluorescent protein. 3. Dynamics of chromosome replication and segregation

1. Wprowadzenie Jeszcze 10 lat temu bia³ko zielonej fluorescencji GFP (ang. green flurescent protein) by³o prawie nikomu nieznane, chocia¿ odkryte zosta³o w 1962 przez S h i m o m u r a i wsp. [39]. Bia³ko GFP wystêpuje w meduzie (Aequorea victoria) ¿yj¹cej w zimnych wodach pó³nocno-zachodniego Oceanu Spokojnego. Strukturê tego bia³ka opisano w 1976 na podstawie analizy krystalograficznej [32, 47], a w 16 lat póŸniej ustalona zosta³a sekwencja cDNA genu gfp [36]. Prze³omowym doœwiadczeniem, które zapocz¹tkowa³o w 1994 roku „b³yskawiczna karierê” bia³ka GFP, by³a ekspresja genu gfp w komórkach zarówno prokariotycznych (Escherichia coli) jak i eukariotycznych (Caenorhabditis elegans). Szybko okaza³o siê, ¿e bia³ko to posiada szereg cech pozwalaj¹cych na wykorzystanie go do monitorowania (œledzenia) wielu procesów komórkowych in vivo. GFP jest stosunkowo niedu¿ym (25,9 kDa), stabilnym bia³kiem, nie wymagaj¹cym egzogennych substratów ani kofaktorów. Ponadto GFP nie jest toksyczne dla komórek pro- i eukariotycznych oraz nie zaburza w sposób istotny procesów ¿yciowych komórek. Detekcji GFP dokonuje siê za pomoc¹ mikroskopu fluorescencyjnego lub konfoklanego, cytometru przep³ywowego, a nawet bezpoœrednio go³y okiem (przy wysokim poziomie ekspresji genu gfp). Cechy bia³ka GFP jak i jego prosta detekcja sprawi³y, ¿e gfp wykorzystuje siê jako gen reporterowy do badania poziomu ekspresji promotorów 359

przy³¹czonych do tego genu oraz do lokalizacji bia³ek (w fuzji z GFP) w komórkach. Mo¿liwoœæ monitorowania bia³ka w czasie rzeczywistym pozwala na œledzenie migracji bia³ek fuzyjnych (oraz kompleksów, w sk³ad których one wchodz¹) w komórce. Bezpoœrednia obserwacja GFP umo¿liwia „podgl¹danie” dynamiki podstawowych procesów zachodz¹cych w ¿ywej komórce, np. replikacji i segregacji chromosomów do komórek potomnych. Prawie 90% prac, w których wykorzystano bia³ko GFP pochodzi z ostatnich czterech lat. Do niedawna ekspresjê genu gfp badano tylko w komórkach bakteryjnych i ni¿szych organizmach eukariotycznych. Ostatnio podjêto równie¿ próbê skonstruowania transgenicznych organizmów wy¿szych – roœlin kwiatowych oraz ssaków (mysz, królik) – których chromosomy zwieraj¹ gen gfp. W ubieg³ym roku doniesiono o narodzinach pierwszej transgenicznej ma³pki (Rhesus) „wzbogaconej” o gen gfp, którego obecnoœæ stwierdzono we wszystkich jej tkankach [7]. 2. Bia³ko zielonej fluorescencji Bia³ko GFP sk³ada siê z 238 aminokwasów [36]. Jest równie¿ stabilne w podwy¿szonych temperaturach (do 65°C) oraz w szerokim zakresie pH (3,5–12). Bia³ko to jest odporne na przed³u¿one dzia³anie takich substancji denaturuj¹cych jak 6 M chlorowodorek guanidyny, 8 M mocznik czy 1% SDS oraz wielu proteaz, np.: chymotrypsyny, pronazy, subtylizyny, trypsyny, mimo obecnoœci w GFP potencjalnych miejsc trawienia dla tych enzymów [38, 41, 48]. Na postawie wyników badañ rentgenograficznych, oraz innych danych uzyskanych z doœwiadczeñ fizykochemicznych, zaproponowano przestrzenn¹ strukturê bia³ka zielonej fluorescencji. Cz¹steczka GFP ma zwart¹ strukturê o kszta³cie cylindra (œrednica 24 Å, wysokoœæ 42 Å), który sk³ada siê z 11 $-harmonijek. Przez wnêtrze cylindra przechodzi "-helisa, do której jest przy³¹czony chromofor (heksapeptyd) po³o¿ony dok³adnie w œrodku cylindra [47]. Umiejscowienie chromoforu we wnêtrzu bia³kowego cylindra zapewnia jego niezwyk³¹ stabilnoœæ [37, 42, 48]. Chromofor powstaje w wyniku postranslacyjnej autokatalicznej reakcji cyklizacji trzech z szeœciu reszt aminokwasowych (Phe64-Ser-Tyr-Gly-Val-Gln69, t³ustym drukiem zaznaczono aminokwasy uczestnicz¹ce w reakcji cyklizacji). Mechanizm tworzenia chromoforu nie jest jeszcze dobrze poznany [13, 48]. Chromofor wystêpuje w ró¿nych stanach uprotonowania. Bia³ko GFP absorbuje szerokie pasmo œwiat³a z dwoma wyraŸnymi szczytami, przy d³ugoœci fali 398 nm i 475 nm, których stosunek intensywnoœci wynosi odpowiednio 4:1. Wzbudzenie œwiat³em o d³ugoœci 398 nm i 475 nm wyzwala emisjê fali o d³ugoœci odpowiednio 508 nm i 503 nm. Prawdopodobnie ró¿ne formy chromoforu absorbuj¹ œwiat³o przy ró¿nych d³ugoœciach fali; absorbcja przy 398 nm jest przypisywana neutralnej formie chromoforu, natomiast przy 475 nm formie anionowej [38, 41, 43, 48]. Stosowanie dzikiego bia³ka GFP ma szereg niedogodnoœci. Tworzenie postranslacyjne chromoforu GFP trwa doœæ d³ugo (2 h) [13] i dlatego bia³ko to (w fuzji 360

z badanym) nie nadaje siê do œledzenia dynamiki procesu replikacji i segregacji chromosomów. Ponadto, w wy¿szych temperaturach (37°C) dzikie bia³ko tworzy agregaty (ang. inclusion bodies) w komórkach bakteryjnych. Jednak zasadnicz¹ wad¹ GFP jest jego niski poziom fluorescencji. Dlatego skonstruowano szereg mutantów GFP, które wystêpuj¹ w formie rozpuszczalnej w komórce oraz charakteryzuj¹ siê znacznie wy¿sz¹ intensywnoœci¹ fluorescencji w stosunku do dzikiego bia³ka. Mutanty takie znalaz³y zastosowanie w doœwiadczeniach, w których gfp jako gen reporterowy jest pod kontrol¹ s³abego promotora lub gdy poziom badanego bia³ka w fuzji z GFP) w komórce jest niski. Najczêœciej stosowanym mutantem jest bia³ko EGFP (ang. enhanced GFP), w którego chromoforze wymieniono dwa aminokwasy: Phe64→Leu i Ser65→Thr [8, 9, 12, 41]. Dziêki pierwszej mutacji bia³ko jest produkowane w komórce w formie rozpuszczalnej w 37°C. Natomiast w wyniku drugiej mutacji chromofor bia³ka wystêpuje w formie anionu fenolowego, który jest wzbudzany œwiat³em o d³ugoœci fali 488 nm (pojedynczy szczyt) i charakteryzuje siê wysok¹ intensywnoœci¹ fluorescencji (ok. 35 razy wy¿sz¹ ni¿ dla dzikiego bia³ka GFP) w zakresie emisji fali (508 nm) zbli¿onej do fluoresceiny. W genie egfp wymieniono równie¿ 192 zasady wystêpuj¹ce w trzecich pozycjach kodonów uwzglêdniaj¹c czêstoœæ wykorzystania kodonów charakterystyczn¹ dla ludzkich komórek. Stosuje siê równie¿ mutanty GFP, które po wzbudzeniu emituj¹ œwiat³o o innym kolorze ni¿ zielony (np. niebieski, ¿ó³ty, czerwony) [14, 41, 48]. Zastosowanie „ró¿nokolorowych” bia³ek fuzyjnych umo¿liwia jednoczesn¹ lokalizacjê kilku bia³ek w komórce. 3. Dynamika replikacji i segregacji chromosomów Chromosom wiêkszoœci bakterii jest zamkniêt¹ kolist¹ cz¹steczk¹ DNA. Chromosom E. coli sk³ada siê z 43± 10 pêtli (domen), ka¿da o d³ugoœci ok. 100 kpz [34]. Wœród postulowanych czynników odpowiedzialnych za utrzymanie struktury domenowej chromosomu wymienia siê RNA, bia³ka histonopodobne takie jak HU (histon like), topoizomerazy. Bia³ka HU s¹ odpowiedzialne za upakowanie DNA w pêtlach. Bia³ka te nie wykazuj¹ swoistoœci sekwencyjnej i wi¹¿¹c siê z dwuniciowym DNA owijaj¹ go wokó³ siebie. Fuzja bia³ek histonopodobnych (HU, E. coli i Hbsu, Bacillus subtilis) z GFP umo¿liwi³a lokalizacjê tych bia³ek w komórkach [20, 46]. Obraz œwiec¹cych bia³ek HU w komórce pokrywa³ siê z obrazem chromosomu wybarwionego fluorescencyjnym odczynnikiem DAPI (4,6-diamidyno 2-fenyloindolu, po zawi¹zaniu siê z DNA i wzbudzeniu œwiat³em nadfioletowym silnie emituje œwiat³o o zabarwieniu niebieskim) [46]. Wynik tego doœwiadczenia potwierdza wczeœniejsze dane, które wskazywa³y, ¿e bia³ka HU s¹ strukturalnym elementem chromosomu bakteryjnego. Replikacja rozpoczyna siê w œciœle okreœlonym miejscu na chromosomie, zwanym oriC (origin of chromosomal replication) i postêpuje dwukierunkowo a¿ do miejsca terminacji (ter), w którym wide³ki replikacyjne s¹ zatrzymywane [22]. Do niedawna uwa¿ano, ¿e segregacja bakteryjnych chromosomów jest procesem 361

pasywnym, niewymagaj¹cym nak³adu energii. Prawie 40 lat temu, J a c o b i wsp. [19] przedstawili hipotezê, która zak³ada³a, ¿e chromosomy wi¹¿¹ siê z b³on¹ komórkow¹ lub œcian¹ komórkow¹, po czym rozdzielane s¹ w wyniku wzrostu komórki. Obecnie wiadomo, ¿e segregacja chromosomów do komórek potomnych u prokaryota zachodzi w sposób aktywny, co potwierdzono zarówno dla organizmów Gram-dodatnich (na przyk³adzie B. subtilis), jak i Gram-ujemnych (na przyk³adzie C. crescentus, E. coli). Segregacja chromosomów prokariotycznych jest procesem sprzê¿onym z inicjacj¹ replikacji; rozdzia³ nowozreplikowanych siostrzanych regionów oriC rozpoczyna siê tu¿ po inicjacji replikacji. Dziêki zastosowaniu bia³ek w fuzji z GFP mo¿liwa sta³a siê subkomórkowa lokalizacja poszczególnych regionów chromosomu w trakcie replikacji i podzia³u komórki bakteryjnej oraz œledzenie w czasie rzeczywistym migracji bia³ek uczestnicz¹cych w tych procesach [1, 40]. Jednym z pierwszych przyk³adów zastosowania bia³ka GFP do badania dynamiki segregacji chromosomów by³a konstrukcja mutantów, w których w ró¿ne regiony chromosomu wprowadzono powtórzone sekwencje operatorowe Olac (100–200 sekwencji w pojedyncze miejsce chromosomu) [11, 44]. Mutanty te dodatkowo zawiera³y plazmid z wklonowanym fuzyjnym genem gfp-lacI, który koduje represor operonu laktozowego LacI w po³¹czeniu z GFP. Zawi¹zanie siê fuzyjnego bia³ka GFP-LacI z sekwencjami operatorowymi wprowadzonymi w dany region chromosomu umo¿liwia wizualizacje tego regionu (rys.1). Mikroskopia fluorescencyjna wykaza³a, ¿e zarówno u E. coli jaki i B. subtilis fragmenty DNA zawieraj¹ce sekwencje operatorowe zlokalizowane w pobli¿u nowozreplikowanych regionów oriC s¹ przemieszczane z centrum w stronê przeciwleg³ych biegunów komórki; ogniska fluoroscensji by³y umiejscowione w pozycji ¼ i ¾ komórki. U B. subtilis obliczono, ¿e potomne regiony oriC przesuwaj¹ siê z prêdkoœci¹ 0,27 :m min–1 na odleg³oœæ 1,4 :m [44]. Natomiast po³o¿enie sekwencji Olac wprowadzonych do regionu terminacji replikacji (ter) ulega nieznacznej zmianie w trakcie replikacji chromosomu i po jej zakoñczeniu; sekwencje te pozostaj¹ w centrum komórki bakteryjnej. Centralne po³o¿enie regionu (ów) ter w komórce zosta³o potwierdzone dziêki konstrukcji szczepu B. subtilis, w którym zast¹piono gen koduj¹cy bia³ko RTP (ang. replication terminator protein), genem fuzyjnym rtp-gfp [24]. Bia³ko fuzyjne RTP-GFP, podobnie jak dzikie, wi¹¿e sekwencje terminatorowe zlokalizowane w regionie ter, zatrzymuj¹c w ten sposób ruch wide³ek replikacyjnych. Kompleksy bia³ka RTP-GFP z DNA regionu ter by³y widoczne jedynie w centrum komórki. Proces aktywnej segregacji chromosomów bakteryjnych przypomina wiêc mitozê w tym, ¿e regiony oriC powsta³e w trakcie replikacji chromosomu i pierwotnie umiejscowione w centrum (B. subtilis) lub na jednym z biegunów (E. coli, C. crescentus) komórki macierzystej s¹ przed podzia³em komórkowym aktywnie przemieszczane w przeciwnych kierunkach, w pobli¿e biegunów komórki – centrów przysz³ych komórek. System analogiczny do GFP-LacI – lacO zastosowano do wizualizacji eukariotycznych chromosomów. W systemie tym u¿yto bia³ko GFP w fuzji z represorem operonu tetracyklinowego (TetR-GFP), a powtórzone sekwencje operatorowe tetO (specyficznie wi¹zanie przez bia³ko TetR) wstawiano w ró¿ne regiony chromosomów [29]. 362

Rys. 1. Znakowanie okreœlonych fragmentów chromosomu za pomoc¹ systemu GFP-LacI-lacO

W przypadku B. subtilis [10, 25, 26] i C. crescentus [30, 31] zidentyfikowano jedne z elementów bior¹cych udzia³ w segregacji chromosomów do komórek potomnych. S¹ to 14–16-nukleotydowe palindromowe sekwencje parS, oraz para bia³ek: Soj, SpoOJ u B. subtilis i ParA, ParB u C. crescentus. Bia³ka te s¹ homologami dobrze scharakteryzowanych plazmidowych bia³ek (ParA, ParB) opowiedzianych za segregacjê plazmidów do komórek potomnych [2]. SpoOj (lub ParB) wi¹¿¹ siê specyficznie z sekwencjami parS zgrupowanymi wokó³ regionu oriC tworz¹c kompleks nukleoproteinowy, w sk³ad którego dodatkowo wchodzi bia³ko Soj (lub odpowiedno ParA). Konstrukcja szczepu B. subtilis, w którym gen spoOJ lub parB zosta³ zast¹piony odpowiednio fuzyjnym genem spoOJ-gfp, umo¿liwi³a wewn¹trzkomórkow¹ lokalizacjê kompleksów tych bia³ek z sekwencjami parS. Wykazano, podobnie jak w przypadku doœwiadczenia z u¿yciem bia³ka GFP-LacI i sekwencji lacO, ¿e po inicjacji replikacji kompleksy te przemieszczaj¹ siê razem z nowosyntetyzowanymi regionami oriC w okolice biegunów komórek [10, 17, 27, 31]. Bia³ko Soj oddzia³uje ze SpoOJ i ma aktywnoœæ ATP-azy [28]. W komórkach B. subtilis bia³ko fuzyjne Soj-GFP oscyluje pomiêdzy biegunami komórki. Przemieszczanie siê Soj z jednego bieguna komórki na drugi jest zale¿ne od SpoOJ. Ponadto, u mutantów delecyjnych soj stwierdzono zaburzenia w tworzeniu skupisk fluorescencyjnych SpoOJ-GFP. Sugeruje to udzia³ Soj w lokalizacji nukloproteinowego kompleksu SpoOJ-parS [28]. Oddzia³ywanie Soj z bia³kiem SpoOJ, zwi¹zanym z DNA jest niezbêdne do powstawania du¿ych nukleoproteinowych agregatów. W genomie E. coli nie zidentyfikowano homologów genów parA, parB, ani sekwencji homologicznych do sekwencji parS wystêpuj¹cych u innych bakterii. 363

Jednym z opisanych bia³ek, które prawdopodobnie uczestniczy w segregacji chromosomów u E. coli jest bia³ko SeqA. Pocz¹tkowo bia³ku temu przypisano jedynie rolê negatywnego regulatora czêstoœci inicjacji replikacji. Bia³ko to wi¹¿e hemimetylowane (metylacja adeniny w sekwencji GA*TC) oriC, uniemo¿liwiaj¹c inicjatorowemu bia³ku DnaA dostêp do miejsca inicjacji replikacji [3]. SeqA silnie wi¹¿e DNA jeœli dwie (lub wiêcej) sekwencje GA*TC s¹ zlokalizowane obok siebie; na chromosomie E. coli, oprócz regionu oriC, wystêpuje wiele takich miejsc, które wi¹¿¹ bia³ko SeqA z wysokim powinowactwem. Ostanie badania przy u¿yciu fuzyjnego bia³ka SeqA-GFP wskazuj¹, ¿e kompleksy tego bia³ka z nowosyntetyzowanymi niæmi DNA przemieszczaj¹ siê w pozycje ¼ i ¾ komórki [4]. Prawdopodobnie SeqA tworzy dwa bia³kowe kana³y, przez które przechodz¹ kolejno zreplikowane fragmenty chromosomów potomnych [15]. W przeciwieñstwie do C. crescentus [31], delecje genów soj i spoOJ B. subtilis nie daj¹ wyraŸnych efektów fenotypowych [18]. Zaburzenia w segregacji chromosomu dotycz¹ tylko nieznacznego odsetka komórek B. subtilis. Mo¿e to wskazywaæ, ¿e bia³ka te s¹ jedynie elementami wiêkszej maszynerii segregacyjnej. Sugeruje siê, ¿e ich rola ogranicza siê do prawid³owej lokalizacji regionu oriC po replikacji, a za transport chromosomu i jego kondensacjê odpowiadaj¹ bia³ka nale¿¹ce do rodziny SMC (ang. structural maintenance of chromosomes). Bia³ka te wystêpuj¹ zarówno u prokariontów jak i u eukariontów [5]. U E. coli funkcjonalnym odpowiednikiem bia³ek SMC s¹ bia³ka Muk. W komórkach B. subtilis, w których dziki gen smc zast¹piono genem fuzyjnym smc-gfp obserwowano jedno lub dwa skupiska fluorescencji w obszarze chromosomu. W mutantach delecyjnych genów smc u B. subtilis i C. crescentus, a tak¿e mukB u E. coli chromosomy nie ulegaj¹ kondensacji, czego konsekwencj¹ s¹ zaburzenia ich segregacji; obserwowano komórki pozbawione chromosomów. Dodatkowo potwierdzono, ¿e mutacje w genach mukB i smc zaburzaj¹ subkomórkow¹ lokalizacjê regionów oriC. Prawdopodobnie bia³ka SMC kondensuj¹c DNA u³atwiaj¹ zwi¹zanie siê bia³ka SpoOJ z sekwencjami parS zlokalizowanymi w okolicach regionu oriC. Dziêki wspó³dzia³aniu obu bia³ek tworzy siê nukleoproteinowy kompleks segregacyjny. Innym interesuj¹cym doœwiadczeniem z u¿yciem fuzyjnego bia³ka GFP by³a wizualizacja topoizomerazy IV (ParC-GFP, ParC podjednostka topoizomerazy IV – heterodimeru, ParC2ParE2) [16]. W szybko rosn¹cych komórkach B. subtilis, bia³ko ParC-GFP by³o widoczne g³ównie w okolicach biegunów komórki. Taka lokalizacja topoizomerazy IV sugeruje, ¿e enzym ten jest nie tylko opowiedziany za roz³¹czanie dwóch potomnych po³¹czonych ze sob¹ (tzw. katenaty) kolistych cz¹steczek DNA, ale jest równie¿ jednym z elementów maszynerii segregacyjnej. Zastosowanie bia³ek fuzyjnych z GFP umo¿liwi³o równie¿ lokalizacjê aparatu replikacyjnego (replisomu) w komórce. Do niedawna rozwa¿ano dwie hipotezy dotycz¹ce po³o¿enia replisomu w trakcie replikacji: „przemieszczaj¹cego siê aparatu replikacyjnego” (translocating replication factory) oraz „nieruchomego aparatu replikacyjnego” (fixed replication factory) [15]. Pierwsza hipoteza zak³ada, ¿e miejsce inicjacji replikacji oraz nowosyntetyzowane nici DNA wraz wide³kami replikacyjnymi s¹ stopniowo rozdzielane i przemieszczaj¹ siê w przeciwnych kierunkach. 364

Rys. 2. Przyk³ady zastosowania bia³ka zielonej fluorescencji do badania dynamiki replikacji i segregacji bakteryjnego chromosomu

Wed³ug drugiej, nowosyntetyzowane nici DNA przemieszczaj¹ siê w pozycje ¼ i ¾ komórki, a replisom pozostaje w centrum komórki (a¿ do terminacji replikacji) i jest si³¹ napêdow¹, „wyrzucaj¹c¹” nowosyntetyzowane fragmenty chromosomu w kierunku biegunów komórki. Dziêki zastosowaniu bia³ek w fuzji z GFP mo¿liwa sta³a siê weryfikacja obu hipotez. Ostatnie badania nad replikacj¹ chromosomu B. subtilis podwa¿aj¹ hipotezê „ruchomego aparatu replikacyjnego”. Skonstruowano szczep B. subtilis, w którym " podjednostka polimerazy DNA III (kodowana przez gen polC) wystêpuje w fuzji z bia³kiem GFP [23]. Dziêki temu mo¿liwa sta³a siê 365

subkomórkowa lokalizacja replisomu (w sk³ad którego wchodzi polimeraza DNA III) w ró¿nych stadiach replikacji chromosomu. Mikroskopia fluorescencyjna wykaza³a, ¿e podczas replikacji ca³ego chromosomu B. subtilis replisom pozostaje nieruchomy w centrum komórki. Natomiast wyniki badañ dotycz¹cych po³o¿enia replisomu w komórkach E. coli przemawiaj¹ za hipotez¹ „ruchomego aparatu replikacyjnego”. W tych doœwiadczeniach zastosowano fuzje podjednostki $ polimerazy DNA III (kodowanej przez gen dnaN) z bia³kiem GFP [21]. Stosuj¹c synchronizowane hodowle komórek E. coli zaobserwowano, ¿e replisom jest po³o¿ony w centrum komórki tylko w pocz¹tkowej fazie replikacji, po czym para wideùek replikacyjnych jest gwa³townie rozdzielana w kierunku biegunów komórki (pozycje ¼ i ¾ komórki). Sugeruje siê, ¿e zjawisko to mo¿e byæ nastêpstwem aktywnego procesu segregacji nowozreplikowanych regionów chromosomu. Dziêki zastosowaniu bia³ek w fuzji z GFP (rys. 2A) poznano dynamikê procesu replikacji i segregacji w komórce bakteryjnej. Pomimo ró¿nic pomiêdzy niektórymi mikroorganizmami w po³o¿eniu replisomu oraz ró¿nic w zestawie bia³ek odpowiedzialnych za separacjê siostrzanych chromosomów mo¿na zaproponowaæ wspólny mechanizm opisuj¹cy replikacjê i segregacjê chromosomu prokariotycznycznego (rys. 2B). Replikacja rozpoczyna siê poprzez specyficzne zwi¹zanie siê inicjatorowego bia³ka (DnaA) do sekwencji regionu oriC. Proces segregacji rozpoczyna siê ju¿ w tarkcie replikacji chromosomu zaraz po inicjacji replikacji. Do nowozreplikowanych regionów chromosomu wi¹¿¹ siê bia³ka odpowiedzialne za upakowanie (np. bia³ka typu HU) i kondensacjê DNA (SMC u B. subtilis i C. crescentus, MukB u E. coli) oraz segregacjê (Soj, SpoOJ u B. subtilis i ParA, ParB u C. crescentus, SeqA u E. coli). Powsta³e du¿e nukleoproteinowe kompleksy s¹ aktywnie przemieszczane w kierunku przeciwleg³ych biegunów komórki – centrów przysz³ych komórek. Replikacja siostrzanych chromosomów koñczy siê w regionie ter chromosomu, w którym wide³ki replikacyjne s¹ zatrzymywane. Praca finansowana przez KBN (projekt grantowy nr 3PO4A 07922) oraz “The British-Polish Joint Research Collaboration Programme” (The British Council – KBN).

Piœmiennictwo 1. Belmont A.S.: Visualizing chromosome dynamics with GFP. Trends Cell Biol. 11, 250–257 (2001) 2. Bignell C., Thomas C.M.: The bacterial ParA-ParB partitioning proteins. J. Biotechnol. 91, 1–34 (2001) 3. Brendler T., Austin S.: Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18, 2304–2310 (1999) 4. Brendler T., Sawitzke J, Sergueev K., Austin S.: A case for sliding SeqA tracts at anchored replication forks during Escherichia coli chromosome replication and segregation. EMBO J. 19, 6249–6258 (2000) 5. Britton R.A., Lin D.C., Grossman A.D.: Characterization of a prokaryotic SMC protein involved in chromosome partitioning. Genes Dev. 12, 1254–1259 (1998) 6. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent proteins as a marker for gene expression. Science, 263, 802–805 (1994)

366

7. Chan A.W.S., Chong K.Y., Martinovich C., Simerly C., Schatten G.: Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science, 291, 309–312 (2001) 8. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S.: FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene, 173, 33–38 (1996) 9. Cubbit A. B., Woolenweber L. A., Heim R.: Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. Methods Cell Biol. 58, 19–30 (1999) 10. Glaser P., Sharpe M. E., Raether B., Perego M., Ohlsen K., Errington J.: Dynamic, mitotic-like behavior of a bacterial protein required for accurate chromosome partitioning. Genes Dev. 11, 1160–1168 (1997) 11. Gordon G.S., Sitnikov D., Webb C.D., Teleman A., Straight A., Losick R., Murray A.W., Wright A.: Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell, 90, 1113–1121 (1997) 12. Heim R., Cubbit A.B. and Tsien R.Y.: Improved green fluorescence. Nature, 373, 663–664 (1995). 13. Heim R., Prasher D.C. and Tsien R.Y.: Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12501–12504 (1994) 14. Heim R., Tsien R.Y.: Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr. Biol. 6, 178–182 (1996) 15. Hiraga S.: Dynamic localization of bacterial and plasmid chromosomes. Annu. Rev. Genet. 34, 21–59 (2000) 16. Huang W.M., Libbey J.L., Van der Hoeven P., Xiaohong Yu S.: Bipolar localization of Bacillus subtilis topoisomerase IV, an enzyme required for chromosome segregation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 4652–4657 (1998) 17. Imai Y., Ogasawara N., Ishigo-oka D., Kadoza R., Daito T., Moriya S.: Subcellular localization of Dna-initiation proteins of Bacillus subtilis: evidence that chromosome replication begins at either edge of the nucleoids. Mol. Microbiol. 36, 1037–1048 (2000) 18. Ireton K., Gunther N.W., Grossman A.D.: spo0J is required for normal chromosome segregation as well as the initiation of sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 176, 5320–5329 (1994) 19. Jakob F.S., Brenner S., Cuzin F.: On the regulation of DNA replication in bacteria. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28, 329–348 (1963) 20. Köhler P., Marahiel M.A.: Association of the histone-like protein Hbsu with the nucleoid of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 179, 2060–2064 (1997) 21. Kongsuwan K., Dalrymple B.P., Wijffels G., Jennings P.A.: Cellular localization of the clamp protein during DNA replication. FEMS Microbiol. Lett. 216, 255–262 (2002) 22. Kornberg A., Baker T.: The DNA replication. Second edition. W. H. Freeman & Co., New York (1992) 23. Lemon K.P., Grossman A.D.: Localization of bacterial DNA polymerase: evidence for a factory model of replication. Science, 282, 1516–1519 (1998) 24. Lemon K.P., Kurtser I., Grossman A.D.: Effects of replication termination mutants on chromosome partitioning in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 211–217 (2001) 25. Lewis P.J., Errington J.: Direct evidence for active segregation of oriC regions of the Bacillus subtilis chromosome and co-localization with the SpoOJ partitioning protein. Mol. Microbiol. 25, 945–954 (1997) 26. Lin D.C., Grossman A.D.: Identification and characterization of a bacterial chromosome partitioning site. Cell, 92, 675–685 (1998) 27. Lin D. C.-H., Levine P.A., Grossman A.D. Bipolar localization of a chromosome partition protein in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4721–4726 (1997) 28. Marston A.L., Errington J.: Dynamic movement of the ParA-like Soj protein of B. subtilis and its dual role in nucleoid organization and developmental regulation. Mol. Cell. 4, 673–682 (1998) 29. Michaelis Ch., Ciosk R., Nasmyth K.: Cohesins: chromosomal proteins that prevent premature separation of sister chromatids. Cell, 91, 35–45 (1997) 30. Mohl D.A., Easter J., Jr., Gober J.W.: The chromosome partitioning protein, ParB, is required for cytokinesis in Caulobacter crescentus. Mol. Microbiol. 42, 741–755 (2001)

367

31. Mohl D.A., Gober J.W.: Cell cycle-dependent polar localization of chromosome partitioning proteins in Caulobacter crescentus. Cell 88, 675–684 (1997) 32. Morise H., Shimomura O., Johnson F.H., Winant J.: Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. Biochemistry, 13, 2656–2662 (1974) 33. Ormö M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien, R.Y., Remington S.J.: Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science, 273, 1392–1395 (1996) 34. Pettijohn D.E.: The nucleoid (w) Escherichia coli and Salmonella, red. F.C. Neidhardt, ASM Press Washington, D.C.1996, s.158 35. Phillips G.J.: Green fluorescent protein – a bright idea for the study of bacterial protein localization. FEMS Microbiol. Lett. 204, 9–18 (2001) 36. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J.: Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene, 11, 229–233 (1992) 37. Rao B., Kemple M.., Prendergast F.: Proton nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopic studies of segmental mobility in aequorin and a green fluorescent protein from aequorea forskalea. Biophys. J. 32, 630–632 (1980) 38. Remington S.J.: Structural basis for understanding spectral variations in GFP. Methods Enzymol. 305, 196–211 (2000) 39. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y.: Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp. Physiol. 59, 223–239 (1962) 40. Southward C.M., Surette M.G.: The dynamic microbe: green fluorescent protein brings bacteria to light. Mol. Microbiol. 45, 1191–1196 (2002) 41. Tsien R.Y.: The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509–544 (1998) 42. Ward W.W., Bokman S.H.: Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry, 21, 4535–4540 (1982) 43. Ward W.W., Prentice H.J., Roth A.F., Cody C.W., Reeves S.C.: Spectral perturbations of the Aequorea green-fluorescent protein. Photochem. Photobiol. 35, 803–808. (1982) 44. Webb C.D., Grumann P.L., Kahana J.A., Teleman A.A., Silver P.A., Losick R.: Use of time-lapse microscopy to visualize rapid movement of the replication origin region of the chromosome during the cell cycle in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 28, 883–892 (1998) 45. Webb C.D., Teleman A., Gordon S., Straight A., Belmont A., Lin D.C., Grossman, A.D.; Wright, A.; Losick, R. Bipolar localization of the replication origin regions of chromosomes in vegetative and sporulating cells of B. subtilis. Cell, 88, 667–674 (1997) 46. Wery M., Woldringh C.L., Rouviere-Yaniv J.: HU-GFP and DAPI co-localize on the Escherichia coli nucleoid. Biochimie, 83, 193–200 (2001) 47. Yang F., Moss L.G., Philips G.N.Jr.: The molecular structure of green fluorescent protein Nature Biotechnol. 14, 1246–1251 (1996) 48. Zimmer M.: Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chem. Rev. 102, 759–781 (2002) Instytut Immunologii i Terapii Doœwiadczalnej Polska Akademia Nauk ul. Rudolfa Weigla 12, 53-114 Wroc³aw

368

POST. MIKROBIOL., 2003, 42, 4, 369–384 http://www.pm.microbiology.pl

WYBRANE ASPEKTY MOLEKULARNE NOSICIELSTWA BAKTERYJNEGO W NOSOGARDZIELI CZ£OWIEKA

Ewa Sadowy

1. Wstêp. 2. Czynniki wp³ywaj¹ce na nosicielstwo. 3. Adhezja bakterii do komórek gospodarza. 3.1. Czynniki adhezji bakterii Gram-ujemnych. 3.2. Czynniki adhezji pneumokoków. 4. Zaburzanie funkcjonowania rzêsek nab³onka oddechowego. 5. Pobieranie sk³adników od¿ywczych. 6. Unikanie skutków dzia³ania uk³adu immunologicznego. 7. Regulacja ekspresji genów zwi¹zanych z kolonizacj¹. 8. Komunikacja wewn¹trz populacji bakterii kolonizuj¹cych i wymiana materia³u genetycznego. 9. Wzajemne oddzia³ywanie ró¿nych gatunków: symbioza i antagonizm. 10. Nosicielstwo nosogard³owe a rozwój choroby. 11. Podsumowanie Bacterial carriage in human nasopharynx: selected molecular aspects Abstract: many humans are symptomless carriers of such potentially pathogenic bacteria as Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Moraxella (Branhamella) catarrhalis. The frequency of carriage rates varies greatly among people, showing dependency from age, season, living conditions and opportunity to contact the carriers by a given person. Human organism possesses several mechanisms that counteract microbial colonization. To successfully colonize, bacteria must adhere to host epithelial cells, evade the activity of immune system and acquire nutrients indispensable for their growth. As human nasopharynx can host several strains and bacterial species, it is also a place of frequent genetic exchange and various interactions among microorganisms, both symbiotic and antagonistic in nature. The recent developments in genomics and related approaches already have contributed and soon will lead to better understanding the phenomena occurring during the carriage and factors promoting transition to the disease state. 1. Introduction. 2. Factors influencing bacterial carriage in humans. 3. Bacterial adhesion to host cells. 3.1. Adhesion factors: Gram-negative bacteria. 3.2. Adhesion factors: pneumococci. 4. Interference with the clearance activity of respiratory tract cilia. 5. Acquisition of nutrients. 6. Evasion of host immunological system. 7. Regulation of expression of the genes involved in colonization. 8. Communication within populations of colonizing bacteria and genetic material exchange. 9. Mutual relationships among species: symbiosis and antagonism. 10. Nasopharyngeal carriage and development of a disease. 11. Summary

1. Wstêp Nosogardziel cz³owieka mo¿e byæ siedliskiem bytowania bakterii ró¿nych gatunków, których obecnoœæ na powierzchni nab³onka nie powoduje ¿adnych objawów chorobowych [12]. Uwa¿a siê, ¿e kolonizuj¹ce drobnoustroje podlegaj¹ kontroli przez uk³ad immunologiczny, który nie dopuszcza do ich silniejszego wzrostu i rozprzestrzeniania. Z drugiej strony, bakterie dysponuj¹ szeregiem czynników, umo¿liwiaj¹cych im prze¿ycie w tym œrodowisku i ochronê przed zniszczeniem przez uk³ad immunologiczny gospodarza. Spoœród bakterii spotykanych w nosogardzieli 369

cz³owieka wiêkszoœæ nie wywo³uje ¿adnych schorzeñ u osób, których system immunologiczny funkcjonuje normalnie. Do tej grupy bakterii nale¿¹ np. Streptococcus mitis, S. oralis, Neisseria lactamica, N. mucosa, Haemophilus parainfluenzae. Jednak pewne gatunki typowo patogenne, takie jak Streptococcus pneumoniae (pneumokok), Neisseria meningitidis (meningokok), Haemophilus influenzae i Moraxella (Branhamella) catarrhalis równie¿ mog¹ kolonizowaæ nab³onek nosogardzieli. W niektórych przypadkach zasiedlenie tej niszy mo¿e stanowiæ wstêp do rozpoczêcia procesu patogenezy. Ponadto, etap kolonizacji stanowi dla tych organizmów okazjê do wymiany materia³u genetycznego, powoduj¹cej np. zmianê w³aœciwoœci antygenowych drobnoustroju lub nabywania nowych genów opornoœci na leki. Tym drobnoustrojom i molekularnym aspektom nosicielstwa przez nie powodowanego jest poœwiêcony niniejszy artyku³. 2. Czynniki wp³ywaj¹ce na nosicielstwo G³ównym, naturalnym rezerwuarem S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae i M. catarrhalis jest cz³owiek. Pomiêdzy poszczególnymi osobami bakterie te s¹ przenoszone drog¹ kontaktu bezpoœredniego oraz drog¹ powietrzno-kropelkow¹. Czêstoœæ nosicielstwa mo¿e byæ bardzo ró¿na i jest uwarunkowana ró¿norodnymi czynnikami, z których najistotniejszymi s¹ wiek osoby, czêstoœæ kontaktów z nosicielami, warunki socjoekonomiczne (od¿ywianie, sytuacja mieszkaniowa), dzia³anie czynników uszkadzaj¹cych nab³onek dróg oddechowych (czynne i bierne palenie, przebyte infekcje wirusowe), a tak¿e pora roku [84]. Przyk³adowo, M. catarrhalis kolonizuje 75–100% dzieci, lecz jest praktycznie niespotykana u doros³ych (1–3%) [58]. Z kolei N. meningitidis jest charakterystyczna przede wszystkim dla grupy wiekowej od piêtnastu do dwudziestu czterech lat, gdzie czêstoœæ kolonizacji wynosi 24–37% [84]. Pneumokoki s¹ spotykane u oko³o 60% dzieci do 5 roku ¿ycia oraz u oko³o 6–30% doros³ych przy czym, spoœród osób doros³ych, na skolonizowanie bardziej nara¿one s¹ osoby maj¹ce pod opiek¹ ma³e dzieci [42]. Czêstoœæ nosicielstwa mo¿e byæ równie¿ znacznie wy¿sza od przeciêtnej w specyficznych sytuacjach, takich jak pobyt w ¿³obku, przedszkolu, domu opieki, wiêzieniu czy koszarach, gdzie czêste kontakty miêdzy ludŸmi przebywaj¹cymi na stosunkowo ma³ej powierzchni sprzyjaj¹ rozprzestrzenianiu siê drobnoustrojów [84]. Okres kolonizacji mo¿e byæ bardzo ró¿ny i siêgaæ nawet wielu miesiêcy [1]. Drogi oddechowe cz³owieka s¹ wyposa¿one w szereg mechanizmów, które skutecznie zapobiegaj¹ osiedlaniu siê i rozmna¿aniu drobnoustrojów. Wyœcie³aj¹cy drogi oddechowe nab³onek wytwarza œluz, w którym wdychane bakterie zostaj¹ zatrzymane, a ci¹g³y ruch rzêsek nab³onka powoduje przesuwanie œluzu w stronê gard³a z prêdkoœci¹ 0,5–1 cm na minutê [56]. Aby przeciwdzia³aæ skutkom ci¹g³ej pracy rzêsek, bakterie musz¹ dokonaæ skutecznej adhezji do komórek gospodarza, czemu towarzyszy niejednokrotnie zaburzanie pracy rzêsek. Adhezja, a tak¿e uszkodzenia nab³onka powodowane przez kolonizuj¹ce drobnoustroje oraz uwalniane przez nie substancje (peptydoglikan, lipopolisacharydy oraz DNA zawieraj¹ce nie370

zmetylowane sekwencje CpG), stanowi¹ sygna³ dla uk³adu immunologicznego [85]. Jego dzia³anie, tzn. nieswoista, a nastêpnie swoista odpowiedŸ immunologiczna mo¿e prowadziæ do szybkiej eradykacji bakterii. Ponadto, istotnym czynnikiem limituj¹cym mo¿liwoœæ wzrostu bakterii kolonizuj¹cych jest dostêpnoœæ czynników od¿ywczych na powierzchni nab³onka, szczególnie ¿elaza. Zatem, aby dokonaæ skutecznej kolonizacji, drobnoustroje musz¹ dokonaæ adhezji do komórek nab³onka, zneutralizowaæ dzia³anie uk³adu immunologicznego i pozyskaæ sk³adniki niezbêdne im do wzrostu. W wype³nianie tych zadañ zaanga¿owane s¹ ró¿ne czynniki, przede wszystkim bia³ka, z których wiêkszoœæ jest zlokalizowana na powierzchni komórki bakteryjnej. Dla skutecznego prze¿ycia w drogach oddechowych, komórka musi w skoordynowany sposób produkowaæ niezbêdne bia³ka, transportowaæ je do miejsca przeznaczenia i utrzymywaæ we w³aœciwej konformacji. Z tego wzglêdu, liczne bia³ka regulatorowe, systemy transportu bia³ek przez os³ony komórkowe i tzw. bia³ka opiekuñcze (ang. chaperon proteins) s¹ równie¿ odpowiedzialne za w³aœciwy przebieg procesu zasiedlania dróg oddechowych cz³owieka przez drobnoustroje. 3. Adhezja bakterii do komórek gospodarza Omawiane w niniejszym artykule bakterie Gram-ujemne (N. meningitidis, H. influenzae, M. catarrhalis) s¹ wyposa¿one w innego rodzaju czynniki adhezji i rozpoznaj¹ inne receptory na powierzchni komórek gospodarza ni¿ bakterie Gram-dodatnie (S. pneumoniae), z tego wzglêdu te dwie grupy zostan¹ omówione oddzielnie. 3.1. Czynniki adhezji N. meningitidis, H. influenzae, M. catarrhalis Jednym z podstawowych czynników warunkuj¹cych adhezjê do komórek w przypadku N. meningitidis i H. influenzae s¹ pile. S¹ to d³ugie i cienkie powierzchniowe struktury, których bia³kiem strukturalnym jest pilina. N. meningitidis posiada pile typu IV [76]. Pilina PilE, wchodz¹ca w sk³ad tych pili, jest transportowana do przestrzeni periplazmatycznej bakterii i sk³adana przy udziale kompleksu znajduj¹cego siê w b³onie wewnêtrznej. Rosn¹ce w ten sposób pile wydostaj¹ siê na zewn¹trz przez pory w b³onie zewnêtrznej, zbudowane z bia³ka PilQ. Na koñcu pile s¹ zaopatrzone w bia³ko PilC, które bierze bezpoœredni udzia³ w adhezji, rozpoznaj¹c komórkowy receptor CD46 [47]. Pile H. influenzae ró¿ni¹ siê nieco struktur¹ i biogenez¹ od opisanych pili typu IV [31]. Cz¹steczki piliny HifA s¹ przenoszone do przestrzeni periplazmatycznej, a nastêpnie sk³adane na powierzchni b³ony zewnêtrznej przy udziale periplazmatycznego bia³ka opiekuñczego HifB i b³onowego bia³ka HifC, zwanego odŸwiernym (ang. usher). Podobnie jak w przypadku pili typu IV, na koñcu pili H. influenzae znajduje siê adhezyna (bia³ko HifE). Pozosta³e czynniki adhezji N. meningitidis i H. influenzae to przede wszystkim bia³ka zlokalizowane w zewnêtrznej b³onie komórkowej (ang. outer membrane proteins, OMP). U N. meningitidis rolê adhezyn pe³ni¹ OMP klasy 5 takie jak Opa 371

i Opc [88]. W genomie meningokoków wystêpuj¹ 3 lub 4 warianty genu opa i pojedynczy gen opc. Z kolei u H. influenzae jako adhezyny OMP dzia³aj¹ P2, najobficiej wystêpuj¹ce bia³ko b³ony zewnêtrznej, oraz P5, a tak¿e, u szczepów nietypowalnych, tzw. bia³ka o wysokiej masie cz¹steczkowej (ang. high molecular weight proteins, HMW) i ufosforylowana cholina po³¹czona z lipooligosacharydem (LOS) b³ony zewnêtrznej [30, 53]. Badania struktury przestrzenej adhezyn utrudnia fakt, ¿e s¹ to integralne bia³ka b³onowe. Do tej pory poznano jedynie strukturê adhezyny meningokokowej OpcA [65]. Zasadnicza czêœæ bia³ka, tkwi¹ca w b³onie, ma postaæ walca, zbudowanego z dziesiêciu wstêg beta. Hydrofobowe ³añcuchy boczne reszt aminokwasowych w obrêbie walca s¹ skierowane do zewn¹trz i oddzia³ywuj¹ z lipidami b³ony, zaœ ³añcuchy hydrofilowe znajduj¹ siê wewn¹trz walca i stabilizuj¹ konformacjê cz¹steczki bia³ka. Ponad powierzchniê b³ony wystaj¹ ruchome pêtle, które s¹ bezpoœrednio zaanga¿owane w wi¹zanie receptora gospodarza – witronektyny, obecnej w macierzy pozakomórkowej. Witronektyna z kolei oddzia³ywuje z integryn¹ na powierzchni komórek ludzkich [70, 89]. Jak dziœ wiadomo, proces adhezji N. meningitidis do komórek nab³onka sk³ada siê z kilku etapów [59, 66]. Pocz¹tkowo komórka bakteryjna wi¹¿e siê z komórkami gospodarza za poœrednictwem pili. Stanowi to sygna³ dla meningokoka do silniejszej transkrypcji locus pil, gdzie zlokalizowane s¹ geny zwi¹zane z biogenez¹ pili. Wzrost liczby pili na powierzchni komórki prowadzi do skupiania siê pili (ang. bundling) i umo¿liwia bakteriom silniejsz¹ adhezjê. Zachodz¹ce równoczeœnie podzia³y komórkowe prowadz¹ do powstania nieregularnych, wielowarstwowych skupisk bakterii na powierzchni nab³onka. Proces adhezji jest dodatkowo wspomagany przez zjawisko wci¹gania (retrakcji) pili z udzia³em cytoplazmatycznego bia³ka PilT. Bliski kontakt z komórk¹ gospodarza powoduje, ¿e wygasa ekspresja locus pil. Na tym etapie komórki trac¹ równie¿ otoczkê, co umo¿liwia adhezjê z udzia³em OMP. Po zakoñczeniu ca³ego procesu bakterie tworz¹ na powierzchni nab³onka pojedyncz¹, œciœle przylegaj¹c¹ warstwê [59, 66]. Niewiele do tej pory wiadomo na temat czynników warunkuj¹cych adhezjê M. catarrhalis do nab³onka. Sugeruje siê, ¿e pewn¹ rolê mog¹ pe³niæ pili, prawdopodobnie tak jak u N. meningitidis typu IV [28, 87]. Stwierdzono tak¿e, ¿e bia³ko UspA1, znajduj¹ce siê w zewnêtrznej b³onie komórkowej tych bakterii, bierze udzia³ w adhezji do ludzkich komórek nab³onkowych [48]. 3.2. Czynniki adhezji pneumokoków Podstawow¹ adhezyn¹ S. pneumoniae jest bia³ko CbpA/PspC (ang. choline-binding protein A/pneumococcal surface protein C), niezbêdne do dokonania skutecznej kolonizacji [4,70]. CbpA/PspC jest zlokalizowane na powierzchni komórki pneumokoka, zakotwiczone przy udziale jednej ze swych domen w œcianie komórkowej, gdzie oddzia³uje z cholin¹ wchodz¹c¹ w sk³ad œciany. CbpA/PspC rozpoznaje i wi¹¿e glikoproteiny obecne na powierzchni komórek nab³onka. Pneumolizyna, cytoplazmatyczne bia³ko uwalniane po autolizie pneumokoków, jest równie¿ 372

zaanga¿owane w proces kolonizacji, prawdopodobnie inicjuj¹c procesy zapalne w nosogardzieli, niezbêdne do ekspresji receptorów komórkowych [46]. Pomocnicz¹ rolê w adhezji pe³ni¹ równie¿ dwie neuraminidazy powierzchniowe, NanA i NanB, które usuwaj¹c kwas sialowy z powierzchni komórek nab³onkowych, powoduj¹ ods³oniêcie struktur wykorzystywanych jako receptory w procesie adhezji [82]. 4. Zaburzanie funkcjonowania rzêsek nab³onka oddechowego Wymiataj¹cy ruch rzêsek nab³onka prowadz¹cy do usuwania obcych obiektów, które wraz z wdychanym powietrzem przedosta³y siê do dróg oddechowych, pe³ni bardzo istotn¹ rolê w nieswoistej obronie organizmu przed drobnoustrojami. Bakterie kolonizuj¹ce powoduj¹ uszkodzenie rzêsek nab³onka (ciliostaza), przez co ulega os³abieniu mechaniczne usuwanie bakterii z dróg oddechowych. U S. pneumoniae rolê tê pe³ni wydzielanie nadtlenku wodoru oraz produkcja pneumolizyny [26, 67], u H. influenzae – zewn¹trzkomórkowe bia³ko D [45]. Oksydazê pirogronianow¹, enzym odpowiedzialny za produkcjê nadtlenku wodoru przez pneumokoki, zidentyfikowano jako jeden z czynników odgrywaj¹cych istotn¹ rolê w kolonizacji [77]. Zjawisko uszkadzania rzêsek nab³onka oddechowego zaobserwowano równie¿ w przypadku N. meningitidis [79], nie wiadomo jednak, jakimi czynnikami jest ono spowodowane. 5. Pobieranie sk³adników od¿ywczych Powierzchnia nab³onka oddechowego nie jest œrodowiskiem obfituj¹cym w sk³adniki niezbêdne do wzrostu bakterii, szczególnie istotn¹ rolê zaœ odgrywa bardzo ograniczona dostêpnoœæ ¿elaza, któr¹ uwa¿a siê za jeden z mechanizmów obrony gospodarza przed drobnoustrojami. Dwie trzecie ¿elaza w organizmie cz³owieka jest zlokalizowane w erytrocytach i niedostêpne dla bakterii kolonizuj¹cych. Na powierzchni nab³onka wystêpuj¹ œladowe iloœci kompleksów ¿elaza z bia³kami stanowi¹cych formy transportowe ¿elaza w organizmie: transferyny i laktoferyny, a tak¿e bardzo niewielkie iloœci hemu i wolnych jonów ¿elaza [72]. Ze wzglêdu na tak trudn¹ dostêpnoœæ ¿elaza, bakterie kolonizuj¹ce posiadaj¹ po kilka systemów jego transportu o bardzo podobnej specyficznoœci. Umo¿liwia to maksymalne wykorzystanie ¿elaza, a tak¿e przyczynia siê do zminimalizowania skutków dzia³ania uk³adu immunologicznego, jak opisano poni¿ej. Wszystkie trzy omawiane gatunki bakterii Gram-ujemnych pozyskuj¹ ¿elazo w bardzo podobny sposób [53, 72, 87]. W b³onie zewnêtrznej znajduj¹ siê po dwa kompleksy wi¹¿¹ce transferynê (TbpA i TbpB) i laktoferynê (LbpA i LbpB). Zwi¹zanie bia³ek transportowych powoduje tak¹ zmianê ich konformacji, ¿e dochodzi do uwolnienia jonów ¿elaza, przejêcia ich przez opisane bakteryjne kompleksy b³onowe i przekazanie do przestrzeni periplazmatycznej, gdzie bia³ko FbpA z kolei przekazuje ¿elazo do systemu transportu typu ABC w b³onie wewnêtrznej. W przypadku H. influenzae system pobierania ¿elaza 373

jest dodatkowo wzbogacony o cztery receptory hemu, którego pozyskanie jest szczególnie istotne dla tej bakterii ze wzglêdu na brak genów biosyntezy porfiryn [53]. Nie stwierdzono, ¿eby któryœ z omawianych gatunków produkowa³ siderofory, czyli zewn¹trzkomórkowe zwi¹zki chelatuj¹ce ¿elazo [18], natomiast analiza genomu N. meningitidis wykaza³a obecnoœæ receptorów dla sideroforów, co sugeruje, ¿e bakterie te mog¹ wykorzystywaæ siderofory produkowane przez inne gatunki bytuj¹ce w tym samym œrodowisku [72]. S. pneumoniae nie jest zdolny do wykorzystywania transferyny ani laktoferyny jako Ÿród³a ¿elaza [9]. W pobieraniu jonów ¿elaza i hemoglobiny uczestnicz¹ trzy b³onowe systemy transportu typu ABC, kodowane przez operony pia, piu i pit [9, 10]. Dwa pierwsze z nich maj¹ charakter tzw. wysp patogennoœci (ang. pathogenicity islands), czyli specyficznych obszarów genomu koduj¹cych czynniki zwi¹zane z patogenez¹ [32]. W pobieraniu jonów manganu przez pneumokoki bierze udzia³ transporter typu ABC kodowany przez operon psa [22]. O roli tego systemu œwiadczy fakt, ¿e jeden z jego sk³adników, PsaA, zanim poznano jego rolê w transporcie, by³ znany jako niezbêdny do kolonizacji i patogenezy i sugerowano, ¿e mo¿e pe³niæ rolê adhezyny. 6. Unikanie skutków dzia³ania uk³adu immunologicznego Obecnoœæ bakterii w nosogardzieli, adhezja do komórek gospodarza, a tak¿e uszkodzenie tkanek, jakie mo¿e towarzyszyæ kolonizacji, wywo³uje odpowiedŸ uk³adu immunologicznego gospodarza. Bakterie kolonizuj¹ce rozwinê³y szereg przystosowañ, umo¿liwiaj¹ce im prze¿ycie i zneutralizowanie dzia³ania tego uk³adu. Zaliczyæ tu nale¿y zarówno bezpoœrednie wp³ywanie na funkcjonowanie uk³adu immunologicznego, jak i produkcjê otoczek i innych struktur powierzchniowych, oraz zjawiska tzw. mimikry molekularnej i maskowania molekularnego, a tak¿e wysok¹ zmiennoœæ populacji kolonizuj¹cych bakterii i towarzysz¹c¹ mu dodatkowo zmiennoœæ antygenow¹ w trakcie zasiedlania dróg oddechowych. Za najwa¿niejsze dzia³anie bezpoœrednie na uk³ad immunologiczny gospodarza nale¿y uznaæ wydzielanie do œrodowiska proteazy specyficznej wobec przeciwcia³ wydzielniczych klasy IgA1. Chocia¿ proteazy omawianych tu gatunków bakterii kolonizuj¹cych nale¿¹ do ró¿nych klas, co sugeruje brak ich pokrewieñstwa ewolucyjnego, ich mechanizm dzia³ania jest bardzo zbli¿ony i polega na przeciêciu regionu zawiasowego ³añcucha ciê¿kiego przeciwcia³a pomiêdzy domen¹ sta³¹ Fc i domen¹ zmienn¹ Fab [64, 68]. Przeciwcia³a ludzkie klasy IgA2 s¹ pozbawione regionu zawiasowego i dziêki temu s¹ niewra¿liwe na dzia³anie proteinaz bakteryjnych. Wiadomo równie¿, ¿e pneumokoki powoduj¹ obni¿enie poziomu sk³adnika C3 dope³niacza, w czym prawdopodobnie rolê odgrywa pneumolizyna [2]. Otoczka wielocukrowa zapobiega opsonizacji komórek bakteryjnych, a przez to aktywacji uk³adu dope³niacza oraz fagocytozie przez makrofagi [53]. O ile jednak jej znaczenie dla przebiegu procesu patogenezy jest niekwestionowane, to jej rola podczas kolonizacji jest znacznie mniej jasna. Jak wykazano, otoczka jest niezbêdna 374

do kolonizacji przez pneumokoki [51] i jej typ ma wp³yw na wydajnoœæ tego procesu [46], jednak liczne izolaty N. meningitidis i H. influenzae pochodz¹ce z nosicielstwa s¹ pozbawione otoczki [1, 57] w zwi¹zku z brakiem ekspresji genów biosyntezy otoczki, a nawet ich utrat¹ [15]. Nie jest obecnie wiadomo, czy M. catarrhalis wytwarza otoczkê, chocia¿ wydaje siê to prawdopodobne [87]. Poza otoczk¹, równie¿ inne struktury powierzchniowe bakterii bior¹ udzia³ w ich ochronie przed uk³adem immunologicznym cz³owieka. Przy³¹czanie kwasu sialowego do LOS u N. meningitidis i H. influenzae przeciwdzia³a wi¹zaniu sk³adnika C3 dope³niacza i zapobiega lizie bakterii [24, 41]. Podobn¹ funkcjê pe³ni bia³ko PspA u pneumokoków [83]. Wspomniane wczeœniej zjawiska mimikry i maskowania molekularnego powoduj¹, ¿e bakterie staj¹ siê „niewidoczne” dla uk³adu immunologicznego. Mimikra molekularna polega na obecnoœci na powierzchni bakterii takich samych zwi¹zków, jak produkowane przez gospodarza, co uniemo¿liwia produkcjê skierowanych przeciw nim przeciwcia³. Przyk³adowo, otoczka N. meningitidis serogrupy B sk³ada siê z homopolimeru kwasu N-acetyloneuraminowego, wystêpuj¹cego równie¿ na powierzchni ludzkich neuronów [27]. Z tego wzglêdu niemo¿liwa jest produkcja skutecznej szczepionki zawieraj¹cej wielocukry otoczki serogrupy B, w przeciwieñstwie do innych serogrup meningokoków. Mimikrze molekularnej przypisuje siê równie¿ rolê przy adhezji, poniewa¿ umo¿liwia ona wykorzystanie receptorów komórkowych specyficznych dla ró¿nych cz¹steczek produkowanych przez gospodarza [52, 81]. Z kolei maskowanie molekularne polega na wi¹zaniu na powierzchni komórki bakteryjnej bia³ek i innych zwi¹zków produkowanych przez gospodarza, co pozwala na „ukrycie siê” przed uk³adem immunologicznym. Prawdopodobnie w tym celu pneumokoki wi¹¿¹ laktoferynê przy udziale powierzchniowego bia³ka PspA [33], mimo ¿e nie s¹ zdolne do pozyskiwania na tej drodze ¿elaza, jak wspomniano powy¿ej. Populacje bakterii kolonizuj¹cych nale¿¹ do bardzo zró¿nicowanych pod wzglêdem antygenów powierzchniowych. Ze wzglêdu na odmienny sk³ad wielocukrów otoczki u S. pneumoniae wyró¿niono co najmniej 90 ró¿nych serotypów [38], u H. influenzae znanych jest 6 serotypów [63], u N. meningitidis 13 serogrup [86]. Du¿¹ zmiennoœci¹ odznaczaj¹ siê równie¿ bia³ka powierzchniowe kolonizuj¹cych bakterii, np. PspA [40] i CbpA/PspC [8, 43] pneumokoków oraz OMP meningokoków [29]. Ponadto, u N. meningitidis i H. influenzae zaobserwowano zjawisko zmiennoœci antygenowej, które wi¹¿e siê z obecnoœci¹ krótkich powtórzeñ 1–8 par zasad w promotorach lub na pocz¹tku sekwencji koduj¹cych genów odpowiedzialnych za syntezê antygenów powierzchniowych (ang. contingency loci) [6]. Obecnoœæ sekwencji powtórzonych predestynuje te geny do wysokiej czêstoœci mutacji spontanicznych, co prowadzi do w³¹czenia lub wy³¹czenia ekspresji genów na poziomie transkrypcji (gdy sekwencje powtórzone znajduj¹ siê w promotorze) lub translacji (w przypadku sekwencji powtórzonych obecnych na pocz¹tku sekwencji koduj¹cych bia³ko). Zjawisko to okreœla siê jako zmianê fazy (ang. phase variation). Zmianie fazy podlegaj¹ m.in. gen siaD odpowiedzialny za syntezê otoczki oraz geny opa u N. meningitidis, geny koduj¹ce bia³ka zwi¹zane z pobieraniem ¿elaza, a tak¿e geny lic odpowiedzialne za biosyntezê LOS u H. influenzae. W tym ostatnim 375

przypadku rozmaite kombinacje ekspresji genów zlokalizowanych w kilku operonach umo¿liwiaj¹ kolejn¹ syntezê 32 ró¿nych typów LOS przez jeden kolonizuj¹cy szczep [6]. Zmianie fazy podlega równie¿ ekspresja genu koduj¹cego powierzchniowe bia³ko UspA1, pe³ni¹ce funkcjê adhezyny u M. catarrhalis [49]. Wydaje siê, ¿e zjawisko zmiany fazy mo¿e mieæ miejsce równie¿ w przypadku niektórych genów S. pneumoniae, np. genu pspA, dla którego zaobserwowano zmianê ekspresji podczas nosicielstwa wywo³anego eksperymentalnie u zdrowych ochotników [55]. Te same badania wykaza³y, ¿e obecnoœæ przeciwcia³ anty-PspA chroni cz³owieka przed skolonizowaniem, zaœ u osób, które uleg³y kolonizacji dochodzi do indukcji tych przeciwcia³ zarówno w klasie IgG jak i IgA. Silna presja ze strony uk³adu immunologicznego mo¿e prowadziæ do selekcjonowania komórek bakterii, u których dosz³o do czasowego wstrzymania ekspresji pspA. 7. Regulacja ekspresji genów zwi¹zanych z kolonizacj¹ Aby dosz³o do skutecznej kolonizacji gospodarza przez bakterie, bardzo istotna jest skoordynowana ekspresja genów zwi¹zanych z tym procesem. Jak stwierdzono, komórki S. pneumoniae i H. influenzae hodowane in vitro ró¿ni¹ siê profilem ekspresji genów od takich samych komórek znajduj¹cych siê in vivo [61, 81], ekspresja zaœ szeregu genów u N. meningitidis zale¿y od tego, z jakiego typu komórkami ludzkimi oddzia³ywuje ta bakteria [21]. W reagowaniu na warunki œrodowiska u bakterii czêsto s¹ zaanga¿owane dwusk³adnikowe systemy przekazywania sygna³u (ang. two-component signal transduction system), sk³adaj¹ce siê z b³onowego receptora o w³aœciwoœciach kinazy histydynowej i cytoplazmatycznego czynnika transkrypcyjnego. Aktywowany receptor fosforyluje czynnik transkrypcyjny, co prowadzi do aktywacji lub wy³¹czenia ekspresji okreœlonych genów. Spoœród dziewiêciu poznanych do tej pory u S. pneumoniae dwusk³adnikowych systemów przekazywania sygna³u, jeden, CiaRH, wydaje siê bardzo istotny w procesie kolonizacji [73], reguluj¹c geny zwi¹zane z biosyntez¹ œciany komórkowej, kompetencj¹ i autoliz¹ komórki [54]. Nie wiadomo, co stanowi sygna³ dla systemu CiaRH. Ponadto u S. pneumoniae zidentyfikowano RlrA, regulator transkrypcji niezbêdny w procesie kolonizacji, który aktywuje geny rrgA, rrgB, rrgC, koduj¹ce trzy bia³ka powierzchniowe, bior¹ce udzia³ w kolonizacji, oraz geny trzech sortaz (srtB, srtC, srtD) odpowiedzialnych za zakotwiczanie bia³ek Rrg w œcianie komórkowej [34, 35]. Nie jest jasne, jaki jest zwi¹zek dwusk³adnikowego systemu CiaRH z regulatorem RlrA, zw³aszcza, ¿e ten ostatni nie jest obecny we wszystkich szczepach pneumokoków [34, 35]. Komórki S. pneumoniae wystêpuj¹ zasadniczo w dwóch wyraŸnie ró¿ni¹cych siê postaciach, tzw. transparent, izolowanych z nosicielstwa [19, 91] oraz opaque, wystêpuj¹cych we krwi. Prze³¹czenie fazy (ang. phase switch), polegaj¹ce na przejœciu komórki typu transparent w formê opaque lub na odwrót, ma charakter spontaniczny i jest uwarunkowane obecnoœci¹ locus opacity w genomie. Komórki typu transparent posiadaj¹ szereg przystosowañ do kolonizowania nosogardzieli: 376

odznaczaj¹ siê stosunkowo cienk¹ otoczk¹ wielocukrow¹, wysok¹ zawartoœci¹ ufosforylowanej choliny w œcianie komórkowej, co stwarza mo¿liwoœæ zakotwiczania licznych bia³ek powierzchniowych, a tak¿e obecnoœci¹ autolizyny LytA (zob. poni¿ej) i adhezyny CbpA/PspC w œcianie komórkowej [70]; bia³ek tych jest znacznie mniej u charakterystycznych dla bakteriemii form opaque. 8. Komunikacja wewn¹trz populacji bakterii kolonizuj¹cych i wymiana materia³u genetycznego W obrêbie populacji wielu gatunków bakterii stwierdzono wystêpowanie zjawiska tzw. quorum sensing polegaj¹cego na zdolnoœci „wyczuwania” gêstoœci populacji przez poszczególne komórki i zmianie ekspresji odpowiednich genów w sytuacji wzrostu zagêszczenia. Mechanizm tego zjawiska wi¹¿e siê z produkowaniem drobnocz¹steczkowych autoinduktorów, których stê¿enie roœnie w miarê zagêszczania siê populacji, a¿ do osi¹gniêcia gêstoœci krytycznej, powy¿ej której zwi¹zanie siê autoinduktora z receptorem powierzchniowym stanowi sygna³ dla komórki. Spoœród gatunków omawianych w niniejszym artykule, najpe³niej zjawisko quorum sensing poznano u pneumokoków. Rolê autoinduktora u tych bakterii pe³ni 17-aminokwasowy peptyd stymuluj¹cy kompetencjê (ang. competence stimulating peptide, CSP) [37]. W przekazaniu sygna³u pochodz¹cego od CSP do komórki bierze udzia³ dwusk³adnikowy system przekazywania sygna³u ComDE [36], funkcjonuj¹cy w taki sam sposób jak opisany wy¿ej system CiaRH. W odpowiedzi na sygna³, wiêkszoœæ komórek wchodzi w stan kompetencji, w którym s¹ one zdolne do przyjmowania fragmentów DNA ze œrodowiska i ich rekombinacji z w³asnym chromosomem (transformacja bakterii). Równoczeœnie u czêœci komórek (5–20%) dochodzi do wzmo¿onej produkcji autolizyny LytA, co prowadzi do ich lizy i uwalniania DNA do otoczenia [78]. Poza pneumokokami, równie¿ inne gatunki kolonizuj¹ce nosogardziel zdolne s¹ do pobierania DNA ze œrodowiska [23]. Podczas transformacji preferowany jest DNA pochodz¹ce od w³asnego gatunku, ale przyjmowany mo¿e byæ równie¿ DNA gatunków spokrewnionych (np. od N. lactamica w przypadku transformacji N. meningitidis). Ta specyficznoœæ jest mo¿liwa dziêki obecnoœci w genomie bakteryjnym krótkich sekwencji powtórzonych, które s¹ rozpoznawane przez receptor na powierzchni komórki, zaanga¿owany w pobieranie DNA z otoczenia [20, 75]. Zjawisku spontanicznej kompetencji i transformacji przypisywano ró¿norodne funkcje, od naprawy w³asnego DNA komórki transformowanej, po dostarczanie jej sk³adników od¿ywczych. Z pewnoœci¹ transformacja przyczynia siê do zwiêkszenia plastycznoœci geno- i fenotypowej populacji kolonizuj¹cych bakterii poprzez nabywanie genów opornoœci na antybiotyki, genów zjadliwoœci, a tak¿e genów zmieniaj¹cych w³aœciwoœci antygenowe biorcy [16, 17]. Do tych ostatnich nale¿y zaliczyæ geny odpowiedzialne za biosyntezê otoczki, których wymiana prowadzi do zmiany serotypu (ang. serotype switch), opisywanego zw³aszcza u pneumokoków [16, 17, 60] i meningokoków [80]. W rozprzestrzenianiu siê genów opornoœci, zarówno 377

wewn¹trzgatunkowym, jak pomiêdzy ró¿nymi gatunkami zasiedlaj¹cymi nosogardziel, poza transformacj¹ istotn¹ rolê pe³ni koniugacja, szczególnie w przypadku genów opornoœci obecnych w obrêbie tzw. transpozonów koniugacyjnych [50]. Wydaje siê, ¿e wspólne bytowanie ró¿nych szczepów i gatunków w ludzkiej nosogardzieli stanowi dla nich istotn¹ sposobnoœæ wymiany materia³u genetycznego i w zwi¹zku z tym nabierania nowych cech, zwiêkszaj¹cych zdolnoœci adaptacyjne bakterii. 9. Wzajemne oddzia³ywanie ró¿nych gatunków: symbioza i antagonizm Nosogardziel skolonizowanego cz³owieka jest miejscem, gdzie ró¿ne gatunki oddzia³ywuj¹ na siebie, przy czym te oddzia³ywania mog¹ mieæ charakter zarówno korzystny dla innych zasiedlaj¹cych nosogardziel drobnoustrojów, jak i wi¹zaæ siê ze zwalczaniem konkuruj¹cych o podobn¹ niszê organizmów. Przyk³adem oddzia³ywania o charakterze symbiotycznym mo¿e byæ produkcja $-laktamaz przez wspó³czesne izolaty M. catarrhalis i H. influenzae, co, jak wykazano, chroni inne gatunki np. pneumokoki przed dzia³aniem penicyliny [11, 39]. Zjawisko to nosi miano patogenezy poœredniej, a w przypadku nosicielstwa utrudnia skuteczn¹ eradykacjê drobnoustroju z nosogardzieli. Produkcja $-laktamaz jest szczególnie czêsta u M. catarrhalis i dotyczy oko³o 95% izolatów [69, 93]. Gen kodowanej chromosomalnie $-laktamazy BRO, któr¹ po raz pierwszy wykryto u M. catarrhalis w 1976 r. [90], nale¿y prawdopodobnie do najskuteczniej rozprzestrzeniaj¹cych siê genów opornoœci nabytej u bakterii. Bakterie kolonizuj¹ce zajmuj¹ bardzo podobn¹ niszê ekologiczn¹, co powoduje wyst¹pienie konkurencji miêdzy nimi o miejsca adhezji i sk³adniki od¿ywcze. Przyk³adem antagonistycznego oddzia³ywania pomiêdzy ró¿nymi gatunkami mo¿e byæ wspomniana ju¿ wczeœniej produkcja nadtlenku wodoru przez pneumokoki przy udziale oksydazy pirogronianowej. Odgrywa ona rolê nie tylko przy zaburzaniu pracy rzêsek nab³onka, ale równie¿ dzia³a zabójczo i hamuje wzrost bakterii innych kolonizuj¹cych gatunków [62]. Przypuszcza siê, ¿e podobne znaczenie mo¿e mieæ produkcja neuraminidaz przez pneumokoki, co powoduje usuwanie kwasu sialowego z powierzchni N. meningitidis i H. influenzae i niszczenie tych bakterii przez dope³niacz [74]. 10. Nosicielstwo nosogard³owe a rozwój choroby Opisywane tutaj gatunki, poza zdolnoœci¹ do bezobjawowego i nieraz d³ugotrwa³ego kolonizowania nosogardzieli, mog¹ wywo³ywaæ ró¿norodne schorzenia, nieraz o ciê¿kim i zagra¿aj¹cym ¿yciu przebiegu. Si³¹ rzeczy pojawia siê wiêc pytanie o zwi¹zek miêdzy nosicielstwem a zachorowaniem. Wiadomo, ¿e skolonizowanie nosogardzieli stanowi dla omawianych gatunków warunek konieczny do wywo³ania choroby [3]. Ponadto, istnieje wyraŸna korelacja epidemiologiczna miêdzy czêstoœci¹ kolonizacji a czêstoœci¹ zachorowañ [25]. Z drugiej strony, choroba wystêpuje tylko u niewielkiego odsetka skolonizowanych i zale¿y zarówno od t³a genetycz378

nego i aktualnego statusu immunologicznego gospodarza, jak i od w³aœciwoœci kolonizuj¹cego szczepu bakteryjnego. Analizuj¹c izolaty N. meningitidis pochodz¹ce z nosicielstwa, stwierdzono, ¿e tylko ok. 10% z nich stanowi¹ klony inwazyjne [7], typowe dla bakteriemii i zapaleñ opon mózgowo-rdzeniowych, takie jak np. ET37 (powoduj¹cy oko³o 40% zachorowañ na meningokokowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych w Europie i Stanach Zjednoczonych), ET5, A4, III [14]. Badania przeprowadzone w Norwegii wykaza³y, ¿e zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych wyst¹pi³o u oko³o 1% nosicieli klonów ET37 i ET5 [13]. Wskazuje to na znaczenie zarówno w³aœciwoœci szczepu kolonizuj¹cego okreœlon¹ osobê, jak i od jej predyspozycji. Do tej pory poznano jedynie nieliczne czynniki gospodarza predestynuj¹ce do zachorowañ inwazyjnych. Jednym z nich, istotnym zarówno w przypadku meningokoków jak i pneumokoków, jest gen koduj¹cy lektynê wi¹¿¹c¹ mannozê (ang. mannose-binding lectin, MBL) [5, 71]. Bia³ko to, po zwi¹zaniu siê z powierzchni¹ bakterii powoduje ich niszczenie przez aktywacjê dope³niacza [44]. W przypadku inwazyjnych zachorowañ powodowanych przez pneumokoki dodatkow¹ rolê odgrywa anemia sierpowata, która zwiêksza czêstoœæ zachorowañ nawet stukrotnie [92]. 11. Podsumowanie Ludzka nosogardziel mo¿e byæ siedliskiem ¿ycia wielu ró¿nych drobnoustrojów, zarówno niepatogennych, jak i zdolnych do rozprzestrzeniania siê w organizmie i powoduj¹cych ró¿norodne schorzenia. Do tej ostatniej grupy drobnoustrojów nale¿¹ S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae i M. catarrhalis. Jak opisano powy¿ej, gatunki te cechuje szereg przystosowañ, umo¿liwiaj¹cych im bytowanie w tym œrodowisku. Obecny rozwój genomiki i pokrewnych dziedzin bêdzie mia³ w najbli¿szych latach decyduj¹cy wp³yw dla wyjaœnienia procesu kolonizacji, a tak¿e czynników decyduj¹cych o tym, ¿e w niektórych przypadkach dochodzi do rozprzestrzeniania siê bakterii poza nosogardziel i rozwoju choroby. Zrozumienie, co odgrywa istotn¹ rolê w tym procesie zarówno po stronie drobnoustroju jak i ludzkiego gospodarza, mo¿e mieæ w przysz³oœci istotne znaczenie dla tworzenia nowych szczepionek i leków skuteczniej dzia³aj¹cych przeciwko potencjalnie chorobotwórczym bakteriom powszechnie kolonizuj¹cym ludzk¹ nosogardziel. Piœmiennictwo 1. Ala’Aldeen D.A.A., Neal K.R., Ait-Tahar K., Nguyen-Van-Tam J.S., English A., Falla T.J., Hawkey P.M., Slack R.C.B.: Dynamics of meningococcal long-term carriage among university students and their implications for mass vaccination. J. Clin. Microbiol. 38, 2311–2316 (2000) 2. Alcantara R.B., Preheim L.C., Gentry-Nielsen M.J.: Pneumolysin-induced complement depletion during experimental pneumococcal bacteremia. Infect. Immun. 69, 3569–3575 (2001) 3. Austrian R.: Some aspects of the pneumococcal carrier state. J. Antimicrob. Chemother. 18, 35–45 (1986)

379

4. Balachandran P., Brooks-Walter A., Virolainen-Julkunen A., Hollingshead S.K., Briles D.E.: Role of pneumococcal surface protein C in nasopharyngeal carriage and pneumonia and its ability to elicit protection against carriage of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 70, 2526–2534 (2002) 5. Bax W.A., Cluysenaer O.J., Bartelink A.K., Aerts P.C., Ezekowitz R.A., van Dijk H.: Association of familial deficiency of mannose-binding lectin and meningococcal disease. Lancet, 354, 1094–1095 (1999) 6. Bayliss Ch.D., Field D., Moxon E.R.: The simple sequence contingency loci of Haemophilus influenzae and Neisseria meningitidis. J. Clin. Invest. 107, 657–662 (2001) 7. Bevanger L., Bergh K., Gisnås G., Caugant D.A., Frohålm L.O.: Identification of nasopharyngeal carriage of an outbreak strain of Neisseria meningitidis by pulsed-field gel electrophoresis versus phenotypic methods. J.Med. Microbiol. 47, 993–998 (1998) 8. Brooks-Walter A., Briles D.E., Hollingshead S.K.: The pspC gene of Streptococcus pneumoniae encodes a polymorphic protein, PspC, which elicits cross-reactive antibodies to PspA and provides immunity to pneumococcal bacteremia. Infect. Immun. 67, 6533–6542 (1999) 9. Brown J.S., Gilliland S.M., Holden D.W.: A Streptococcus pneumoniae pathogenicity island encoding an ABC transporter involved in iron uptake and virulence. Mol. Microbiol. 40, 572–585 (2001) 10. Brown J.S., Gilliland S.M., Ruiz-Albert J., Holden D.W.: Characterization of Pit, a Streptococcus pneumoniae iron uptake ABC transporter. Infect. Immun. 70, 4389–4398 (2002) 11. Budhani R.K., Struthers J.K.: Interaction of Streptococcus pneumoniae and Moraxella catarrhalis: investigation of the indirect pathogenic role of beta-lactamase-producing moraxellae by use of a continuous-culture biofilm system. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 2521–2526 (1998) 12. Casadevall A., Pirofski A.-L.: Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalisms, colonization, infection, and disease. Infect. Immun. 68, 6511–6518 (2000) 13. Caugant D.A., Høiby E.A., Magnus P., Scheel O., Hoel T., Bjune G., Wedege E., Eng J., Frohølm L.O.: Asymptomatic carriage of Neisseria meningitidis in a randomly sampled population. J. Clin. Microbiol. 32, 323–330 (1994) 14. Caugnant D.A.: Population genetics and molecular epidemiology of Neisseria meningitidis. APMIS, 106, 505–525 (1998) 15. Claus H., Maiden M.C., Maag R., Frosch M., Vogel U.: Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology, 148, 1813–1819 (2002) 16. Coffey T.J., Dowson C.G., Daniels M., Zhou J., Martin C., Spratt B.G., Musser J.M.: Horizontal transfer of multiple penicillin-binding protein genes, and capsular biosynthetic genes, in natural populations of Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 5, 2255–2260 (1991) 17. Coffey T.J., Enright M.C., Daniels M., Morona J.K., Morona R., Hryniewicz W., Paton J., Spratt B.G.: Recombinational exchange at the capsular polysaccharide biosynthetic locus lead to frequent serotype exchange among natural isolates of Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 27, 73–83 (1998) 18. Crosa J.H., Walsh Ch.T.: Genetics and assembly line enzymology of siderophore biosynthesis in bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 223–249 (2002) 19. Cundell D.R., Weiser J.N., Shen J., Young A., Tuomanen E.I.: Relationship between colonial morphology and adherence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 63, 757–761 (1995) 20. Deich R.A., Smith H.O.: Mechanism of homospecific DNA uptake in Haemophilus influenzae transformation. Mol. Gen. Genet. 177, 369–374 (1980) 21 Dietrich G., Kurz S., Hubner C., Aepinus C., Theiss S., Guckenberger M., Panzner U., Weber J., Frosch M.: Transcriptome analysis of Neisseria meningitidis during infection. J. Bacteriol. 185, 155–164 (2003) 22. Dintilhac A., Alloing G., Granadel C., Claverys J.P.: Competence and virulence of Streptococcus pneumoniae: Adc and PsaA mutants exhibit a requirement for Zn and Mn resulting from inactivation of putative ABC metal permeases. Mol. Microbiol. 25, 727–739 (1997) 23. Dubnau D.: DNA uptake in bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 53, 217–244 (1999)

380

24. Estabrook M.M., McLeod Griffiss J., Jarvis G.A.: Sialylation of Neisseria meningitidis lipooligosacharides inhibits serum bactericidal activity by masking lacto-N-neotetraose. Infect. Immun. 65, 4436–4444 (1997) 25. Faden H., Duffy L., Wasielewski R., Wolf J., Krystofik D., Tung Y.: Relationship between nasopharyngeal colonization and the development of otitis media in children. J. Infect. Dis. 175, 1440–1445 (1997) 26. Feldman C., Anderson R., Cockeran R., Mitchell T., Cole P., Wilson R.: The effects of pneumolysin and hydrogen peroxide, alone and in combination, on human ciliated epithelium in vitro. Respir. Med. 96, 580–585 (2002) 27. Finne J., Bitter-Suermann D., Goridis C., Finne U.: An IgG monoclonal antibody to group B meningococci crossreacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tissues. J. Immunol. 138, 4402–4407 (1987) 28. Finlay B.B., Falkow S.: Common themes in microbial pathogenicity revisited. Microb. Mol. Biol. Rev. 61, 136–169 (1997) 29. Frasch C.E., Zollinger W.D., Poolman J.T.: Serotype antigens of Neisseria meningitidis and a proposed scheme for designation of serotypes. Rev. Infect. Dis. 7, 504–510 (1985) 30. Geme J.W.St. III: Molecular and cellular determinants of non-typeable Haemophilus influenzae adherence and invasion. Cell. Microbiol. 4, 191–200 (2002) 31. Gilsdorf J.R., McCrea K.W., Marrs C.F.: Role of pili in Haemophilus influenzae adherence and colonization. Infect. Immun. 65, 2997–3002 (1997) 32. Groisman E.A., Ochman H. : Pathogenicity islands: bacterial evolution in quantum leaps. Cell, 87, 791–794 (1996) 33. Hammerschmidt S., Bethe G., Remane P., Chhatwal G.S.: Identification of pneumococcal surface protein A as a lactoferrin-binding protein of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 67, 1683–1687 (1999) 34. Hava D.L., Camilli A.: Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389–1406 (2002) 35. Hava D.L., Hemsley C.J., Camilli A.: Transcriptional regulation in the Streptococcus pneumoniae rlrA pathogenicity islet by RlrA. J. Bacteriol. 185, 413–21. (2003) 36. Havarstein L.S.: Identification of a competence regulon in Streptococcus pneumoniae by genomic analysis. Trends Microbiol. 6, 297–299 (1998) 37. Havarstein L.S., Coomaraswamy G., Morrison D.A.: An unmodified heptadecapeptide pheromone induces competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11140–11144 (1995) 38. Henrichsen J.: Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759–2762 (1995) 39. Hol C., van Dijke E.E., Verduin C.M., Verhoef J., van Dijk H.: Experimental evidence for Moraxella-induced penicillin neutralization in pneumococcal pneumonia. J. Infect. Dis. 170, 1613–1616 (1994) 40. Hollingshead S.K., Becker R., Briles D.E.: Diversity of PspA: mosaic genes and evidence for past recombination in Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 68, 5889–5900 (2000) 41. Hood D.W., Makepeace K., Deadman M.E., Rest R.F., Thibaut P., Martin A., Richards J.C., Moxon E.R.: Sialic acid in the lipoologosacharide of Haemophilus influenzae: strain distribution, influence on serum resistance and structural characterization. Mol. Microbiol. 33, 679–692 (1999) 42. Hoshino K., Watanabe H., Sugita R., Asoh N., Ntabaguzi S.A., Watanabe K., Oishi K., Nagatake T.: High rate of transmission of penicillin-resistant Streptoocccus pneumoniae between parents and children. J. Clin. Microbiol. 40, 4357–4359 (2002) 43. Ianelli F., Oggioni M.R., Pozzi G.: Allelic variation in the highly polymorphic locus pspC of Streptococcus pneumoniae. Gene, 284, 63–71 (2002) 44. Jack D.L., Jarvis G.A., Booth C.L., Turner M.W., Klein N.J.: Mannose-binding lectin accelerates complement activation and increases serum killing of Neisseria meningitidis serogroup C. J. Infect. Dis. 184, 836–845. (2001)

381

45. Janson H., Calen B., Cérvin A., Forgen A., Magnusdottir A.B., Lindberg S., Runer T.: Effects on the ciliated epithelium of protein D-producing and -nonproducing nontypeable Haemophilus influenzae in nasopharyngeal tissue cultures. J. Infect. Dis. 180, 737–746. 46. Kadioglu A., Taylor S., Ianelli F., Pozzi G., Mitchell T.J., Andrew P.W.: Upper and lower respiratory tract infection by Streptococcus pneumoniae is affected by pneumolysin deficiency and differences in capsule type. Infect. Immun. 70, 2886–2890 (2002) 47. Kallstrom H., Liszewski M.K., Atkinson J.P., Jonsson A.B.: Membrane cofactor protein (MCP or CD46) is a cellular pilus receptor for pathogenic neisseria. Mol. Microbiol. 25, 639–647 (1997) 48. Lafontaine E.R., Cope L.D., Aebi Ch., Latimer J.L., McCracken G.H., Jr., Hansen E.J.: The UspA1 protein and a second type of UspA2 protein mediate adherence of Moraxella catarrhalis to human epithelial cells in vitro. J. Bacteriol. 182, 1364–1373 (2000) 49. Lafontaine E.R., Wagner N.J., Hansen E.J.: Expression of the Moraxella catarrhalis UspA1 protein undergoes phase variation and is regulated at the transcriptional level. J. Bacteriol. 183, 1540–1551 (2001) 50. Luna V.A., Cousin S., Jr., Whittington W.L.H., Roberts M.C.: Identification of the conjugative mef gene in clinical Acinetobacter junii and Neisseria gonorrhoeae isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 2503–2506 (2000) 51. Magee A.D., Yother J.: Requirement for capsule in colonization by Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 69, 3755–3761 (2001) 52. Mandrell R.E., Apicella M.A.: Lipo-oligosacharides (LOS) of mucosal pathogens: molecular mimicry and host modifications of LOS. Immunobiology, 187, 382–402 (1993) 53. Marrs C.F., Krasan G.P., McCrea K.W., Clemans D.L., Gilsdorf J.R.: Haemophilus influenzae – human specific bacteria. Front. Biosci. 6, E41–E60 (2001) 54. Mascher T., Zahner D., Merai M., Balmelle N., De Saizieu A.B., Hakenbeck R.: The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J. Bacteriol. 185, 60–70 (2003) 55. McCool T.L., Cate T.R., Moy G., Weiser J.N.: The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 1–8 (2002) 56. Mims C.A., Nash A., Stephen J.: Mim’s pathogenesis of infectious disease. Wyd. V. Academic Press, London 2001, s. 21–25 57. Murphy T.F., Apicella M.A.: Nontypable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens and the human response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1–15 (1987) 58. Murphy T.F.: Branhamella catarrhalis: epidemiology, surface antigenic structure, and immune response. Microbiol. Rev. 60, 267–279 (1996) 59. Nassif X., Pujol C., Morand P., Eugene E.: Interactions of pathogenic Neisseria with host cells. Is it possible to assemble the puzzle? Mol. Microbiol. 32, 1124–1132 (1999) 60. Nesin M., Ramirez M., Tomasz A.: Capsular transformation of a multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in vivo. J. Infect. Dis. 177, 707–713 (1998) 61. Ogunniyi A.D., Giammarinaro P., Paton J.C.: The genes encoding virulence-associated proteins and the capsule of Streptococcus pneumoniae are upregulated and differentially expressed in vivo. Microbiology, 148, 2045–2053 (2002) 62. Pericone Ch.D., Overweg K., Hermans P.W.M., Weiser J.N.: Inhibitory and bactericidal effects of hydrogen peroxide production by Streptococcus pneumoniae on other inhabitants of the upper respiratory tract. Infect. Immun. 68, 3990–3997 (2000) 63. Pittman M.: Variation and type specificity in the bacterial species Haemophilus influenzae. J. Exp. Med. 53, 471–492 (1931) 64. Plaut A.G., Gilbert J.V., Wistar R., Jr.: Loss of antibody activity in human immunoglobulin A exposed to extracellular immunoglobulin A proteases of Neisseria meningitidis: extracellular enzyme cleaves human immunoglobulin A. Science, 190, 1103–1105 (1977) 65. Prince S.M., Achtman M., Derrick J.P.: Crystal structure of the OpcA integral membrane adhesin from Neisseria meningitidis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 3417–3421 (2002)

382

66. Pujol C., Eugene E., Marceau M., Nassif X.: The meningococcal PilT protein is required for induction of intimate attachment to epithelial cells following pilus-mediated adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4017–4022 (1999) 67. Rayner C.F., Jackson A.D., Rutman A., Sewar A., Mitchell T.J., Andrew P.W., Wilson R.: Interaction of pneumolysin-sufficient and deficient isogenic variants of Streptococcus pneumoniae with human respiratory mucosa. Infect. Immun. 63, 442–447 (1995) 68. Reinholdt J., Kilian M.: Comparative analysis of immunoglobulin A1 protease activity among bacteria representing different genera, species, and strains. Infect. Immun. 65, 4452–4459 (1997) 69. Richter S.S., Brueggemann A.B., Huynh H.K., Rhomberg P.R., Wingert E.M., Flamm R., Doern G.V.: A 1997–1998 national surveillance study: Moraxella catarrhalis and Haemophilus influenzae antimicrobial resistance in 34 US institutions. Int. J. Antimicrob. Agents, 13, 99–107 (1999) 70. Rosenow C., Ryan P., Weiser J.N., Johnson S., Fontan P., Ortqvist A., Masure H.R.: Contribution of novel choline-binding proteins to adherence, colonization and immunogenicity of Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 25, 819–829 (1997) 71. Roy S., Knox K., Segal S., Griffiths D., Moore C.E., Welsh K.I., Smarason A., Day N.P., McPheat W.L., Crook D.W., Hill A.V.S., and the Oxford Pneumococcal Surveillance Group: MBL genotype and risk of invasive pneumococcal disease: a case control study. Lancet, 359, 1569–1573 (2002) 72. Schryvers A.B., Stolijkovic I.: Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Mol. Microbiol. 32, 1117–1123 (1999) 73. Sebert M.E., Palmer L.M., Rosenberg M., Weiser J.N.: Microarray-based identification of htrA, a Streptococcus pneumoniae gene that is regulated by the CiaRH two-component system and contributes to nasopharyngeal colonization. Infect. Immun. 70, 4059–4067 (2002) 74. Shakhnovich E.A., King S.J., Weiser J.N.: Neuraminidase expressed by Streptococcus pneumoniae desialylates the lipopolisacharide of Neisseria meningitidis and Haemophilus influenzae: a paradigm for interbacterial competition among pathogens of human respiratory tract. Infect. Immun. 70, 7161–7164 (2002) 75. Smith H.O., Gwinn M.L., Salzberg S.L.: DNA uptake signal sequences in naturally transformable bacteria. Res. Microbiol. 150, 603–616 (1999) 76. Soto G.E., Hultgre S.J.: Bacterial adhesins: common themes and variations in architecture and assembly. J. Bacteriol. 181, 1059–1071 (1999) 77. Spellberg B., Cundell D.R., Sandros J., Pearce B.J., Idanpaan-Heikkila I., Rosenow C., Masure H.R.: Pyruvate oxidase, as a determinant of virulence in Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 19, 803–813 (1996) 78. Steinmoen H., Knutsen E., Havarstein L.S.: Induction of natural competence in Streptococcus pneumoniae triggers lysis and DNA release from a subfraction of the cell population. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 7681–7686 (2002) 79. Stephens D.S., Whitney A.M., Melly M.A., Hoffman L.H, Farley M.M., Frasch C.E.: Analysis of damage to human ciliated nasopharyngeal epithelium by Neisseria meningitidis. Infect. Immun. 51, 579–585 (1986) 80. Swartley J.S., Marfin A.A., Edupuganti S., Liu L.J., Cieslak P., Perkins B, Wenger J.D., Stephens D.S.: Capsule switching of Neisseria meningitidis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 271–276 (1997) 81. Swords W.E., Chance D.L., Cohn L.A., Shao J., Apicella M.A., Smith A.L.: Acylation of the lipooligosacharide of Haemophilus influenzae and colonization: an htrB mutation diminishes the colonization of human airway epithelial cells. Infect. Immun. 70, 4661–4668 (2002) 82. Tong H.H., McIver M.A., Fisher L.M., DeMaria T.F.: Effect of lacto-N-neotetralose, asialogangloside-GM1 and neuraminidase on adherence of otitis media-associated serotypes of Streptococcus pneumoniae to chinchilla tracheal epithelium. Microb. Pathog. 26, 111–119 (1999) 83. Tu A.-H.T., Fulgham R.L., McCrory M.A., Briles D.E., Szalai A.J.: Pneumococcal surface protein A inhibits complement activation by Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 67, 4720–4724 (1999) 84. van Deuren M., Brandtzaeg P., van der Meer J.M.W.: Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clin. Microbiol. Rev. 13, 144–166 (2000)

383

85. Vasselon T., Detmers P.A.: Toll receptors: a central element in innate immune responses. Infect. Immun. 70, 1033–1041 (2002) 86. Verdos N.A.: Development of meningococcal serogroup, w: Evolution of meningococcal disease, tom II (red. N.A. Vedrosa), CRC Press Inc., Boca Raton, FL, 1987, s. 33–37 87. Verduin C.M., Hol C., Fleer A., van Dijk H., van Belkum A.: Moraxella catarrhalis: from emerging to established pathogen. Clin. Microbial. Rev. 15, 125–144 (2002) 88. Virji M., Makepeace K., Ferguson D.J.P., Achtman M., Moxon E.R.: Meningococcal Opa and Opc proteins: their role in colonization and invasion of human epithelial and endothelial cells. Mol. Microbiol. 10, 499–510 (1993) 89. Virji M., Makepeace K., Moxon E.R.: Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions. Mol. Microbiol. 14, 173–184 (1994) 90. Wallace R.J., Jr., Steingrube V.A., Nash D.R., Hollis D.G., Flanagan C., Brown B.A., Labidi A., Weaver R.E.: BRO-beta-lactamases of Branhamella catarrhalis and Moraxella subgenus Moraxella, including evidence for chromosomal b-lactamase transfer by conjugation in B. catarrhalis, M. nonliquefaciens, and M. lacunata. Antimicrob. Agents Chemother. 33, 1845–1854 (1989) 91. Weiser J.N., Austrian R., Sreenivasan P.K., Masure H.R.: Phase variation in pneumococcal opacity: relationship between colonial morphology and nasopharyngeal colonization. Infect. Immun. 62, 2582–2589 (1994) 92. Wong W.-Y., Overturf G.D., Powars D.R.: Infection caused by Streptococcus pneumoniae in children with sickle cell disease: epidemiology, immunologic mechanisms, prophylaxis and vaccination. Clin. Infect. Dis. 14, 1124–1136 (1992) 93. Zhanel G.G., Karlowsky J.A., Low D.E., Hoban D.J.: Antibiotic resistance in respiratory tract isolates of Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis colleted from across Canada in 1997–1998. J. Antimicrob. Chemother. 45, 655–662 (2000) Ewa Sadowy Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Ul. Che³mska 30/34, 00-725 Warszawa tel. +22 841 33 67, e-mail: [email protected] Wp³ynê³o w marcu 2003

384

POST. MIKROBIOL., 2003, 42, 4, 385– 401 http://www.pm.microbiology.pl

CORYNEFORM BAKTERIE – ZNANE DROBNOUSTROJE, NIEZNANE PATOGENY?

Agnieszka Mikucka

1. Wstêp. 2. Coryneform bakterie – charakterystyka grupy. 3. Charakterystyka rodzajów. 3.1. Actinomyces. 3.2. Arcanobacterium. 3.3. Arthrobacter. 3.4. Aureobacterium. 3.5. Brevibacterium. 3.6. Cellulomonas. 3.7. Corynebacterium. 3.8. Dermabacter. 3.9. Exiguobacterium. 3.10. Microbacterium. 3.11. Oerskovia. 3.12. Propionibacterium. 3.13. Rothia. 3.14. Turicella. 4. Identyfikacja pa³eczek z grupy coryneform. 5. Metody oznaczania wra¿liwoœci coryneform na antybiotyki. 6. Czynniki wirulencji pa³eczek z grupy coryneform. 7. Podsumowanie Coryneform bacteria – known bacteria, unknown pathogens? Abstract: Coryneform bacteria are the heterogenic group of Gram-positive rods, which comprises fourteen genera. Many species, mostly from Corynebacterium genus belong to the human natural skin flora and mucous membranes. More and more often coryneform are isolated from clinical specimens and examined as aetiological factors of hospital infections. During the last few years, this problem is often undertaken in world literature, and almost not noticed in Poland. Coryneform are opportunistic bacteria, which should not be disregarded in the course of diagnostic procedure. From regard, that the evaluation of its role as a pathogenic factor still makes problem, thus cooperation of microbiologists and clinicians seems to be vital importance. The paper presents the history, occurrence and virulence factors of coryneform bacteria. Infections and resistance to antibiotics in coryneform bacteria are also described. 1. Introduction. 2. Coryneform group bacteria characterization. 3. Coryneform genera characterization. 3.1. Actinomyces. 3.2. Arcanobacterium. 3.3. Arthrobacter. 3.4. Aureobacterium. 3.5. Brevibacterium. 3.6. Cellulomonas. 3.7. Corynebacterium. 3.8. Dermabacter. 3.9. Exiguobacterium. 3.10. Microbacterium. 3.11. Oerskovia. 3.12. Propionibacterium. 3.13. Rothia. 3.14. Turicella. 4. Identification of coryneform bacteria. 5. Coryneform bacteria susceptibility testing. 6. Virulence properties of coryneform rods. 7. Conclusions

1. Wstêp Zaka¿enia mog¹ byæ wywo³ane przez drobnoustroje chorobotwórcze o jasno scharakteryzowanych czynnikach zjadliwoœci, oraz bakterie uznawane do niedawna tylko za zanieczyszczenie materia³ów diagnostycznych wynikaj¹ce z niew³aœciwego pobrania, transportu lub za zupe³nie nieszkodliwe komensale. Coraz czêœciej czynnikami etiologicznymi zaka¿eñ szpitalnych s¹ drobnoustroje oportunistyczne. Bakterie z rodzajów Enterococcus, Acinetobacter, Serratia, czy gronkowce koagulazo-ujemne (Coagulase-Negative Staphylococci, CNS) stanowi¹ obecnie realny problem epidemiologiczny. Ostatnio pod tym wzglêdem zwrócono uwagê na Gram-dodatnie maczugowate pa³eczki nazywane „coryneform bakterie” [39, 60]. Stosowane dotychczas okreœlenia 385

maczugowce, dyfteroidy czy nawet „corynebacterie” uwa¿ane s¹ za zbyt w¹skie dla tak zró¿nicowanej grupy, sugeruj¹ce podobieñstwo z Corynebacterium diphtheriae, które jest jedynie morfologiczne [60]. Natomiast Gram-dodatnie pa³eczki jest pojêciem zbyt szerokim. Okreœlenie coryneform bakterie u¿ywane powszechnie w piœmiennictwie zagranicznym, z pewnoœci¹ jest zrozumia³e dla specjalistów, dlatego nie ma potrzeby szukania odpowiednika w jêzyku polskim. Uwagê mikrobiologów na kliniczne znaczenie bakterii z grupy coryneform innych ni¿ C. diphtheriae zwróci³o opracowanie CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta) [39], gdzie umieszczono skrócon¹ identyfikacjê Corynebacterium sp. i wyszczególniono gatunki lipofilne (CDC grupa JK, D2), które wczeœniej opisywano jedynie jako lipofilne dyfteroidy [53, 84]. Od tego czasu pojawi³o siê wiele doniesieñ o izolacji coryneform z materia³ów klinicznych, g³ównie z rodzaju Corynebacterium [wg 39, wg 65]. 2. Coryneform bakterie – charakterystyka grupy W ostatnim wydaniu Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology [50], sekcja 15 obejmuje „Nieregularne, nieprzetrwalnikuj¹ce, Gram-dodatnie pa³eczki” nale¿¹ce do 23 rodzajów: Acetobacterium, Actinomyces, Agromyces, Arachnia, Arcanobacterium, Arthrobacter, Aureobacterium, Bifidobacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio, Caseobacter, Cellulomonas, Corynebacterium, Curtobacterium, Eubacterium, Gardnerella, Lachnospira, Microbacterium, Oerskovia, Propionibacterium, Renibacterium, Rothia, Thermoanaerobacter. Ze wzglêdów historycznych zawiera równie¿ gatunki Corynebacterium chorobotwórcze dla roœlin. Zestawiono tak ró¿norodne rodzaje bakterii tlenowych i beztlenowych, chorobotwórczych dla ludzi, zwierz¹t, roœlin oraz saprofity, g³ównie ze wzglêdów praktycznych. Podstaw¹ do umieszczenia ich w tej sekcji by³a wysoka zawartoœæ par zasad G+ C (~30–78 mol %) w komórce DNA. W 1990 roku C o y l e i L i p s k y [14] opisali coryneform pod k¹tem znaczenia klinicznego, przyznaj¹c, ¿e termin ten jest nieprecyzyjny, w³¹czyli 20 rodzajów: Actinomyces, Arachnia, Arcanobacterium, Arthrobacter, Bacterionema, Bifidobacterium, Brevibacterium, Cellulomonas, Corynebacterium, Erysipelotrix, Eubacterium, Jensenia, Kurthia, Listeria, Mycobacterium, Nocardia, Oerskovia, Propionibacterium, Rhodococcus, Rothia. Autorzy [39] obszernej publikacji zawieraj¹cej przegl¹d aktualnej wiedzy na temat coryneform zawêzili nieco termin i zdefiniowli bakterie nale¿¹ce do tej grupy jako rosn¹ce w warunkach tlenowych, nieprzetrwalnikuj¹ce, niekwasooporne, nieregularne pa³eczki Gram-dodatnie, z wysok¹ zawartoœci¹ par zasad guaniny i cytozyny (G+ C mol%), zwi¹zane z zaka¿eniami u cz³owieka, nale¿¹ce do rodzajów: Actinomyces, Arcanobacterium, Arthrobacter, Aureobacterium, Brevibacterium, Cellulomonas, Corynebacterium, Dermabacter, Exiguobacterium, Microbacterium, Oerskovia, Propionibacterium, Rothia, Turicella, „Corynebacterium aquaticum”. W 2000 roku zaproponowano umieszczenie „C. aquaticum” w nowo utworzonym rodzaju Leifsonia [25]. 386

Tabela I

Actinomyces

Arcanobacterium

Arthrobacter

Aureobacterium

Brevibacterium

Cellulomonas

Corynebacterium

Dermabacter

Exiguobacterium

Microbacterium

Oerskovia

Propionibacterium

Rothia

Turicella

Niektóre cechy ró¿nicuj¹ce g³ówne rodzaje coryneform [14, 39, 50]

55–69

48–52

59–70

67–70

60–64

71–76

46–74

62

47

69–75

71–75

57–68

47–53

65–72

Kwasy mykolowe

–

–

–

–

–

–

(C22–38)

–

–

–

–

–

–

–

Aminokwasy w peptydoglikanie

L-Liz, L-Orn

Liz

L-Liz

Orn

L-Liz

L-Liz

–

–

–

–

–

–

+

–

–

–

–

–

–

–

+/–

–

+

+

+

+

+

+

+

+/–

+

–

+

+

Charakterystyka

G + C (mol %)

Arabinolaktan Katalaza Ruch

m-DAP L-Orn

m-DAP m-DAP

L-Liz LL-DAP, L-Liz m-DAP

m-DAP

–

–

+/–

+/–

–

+

+/–

+/–

–

+/–

+/–

+/–

–

–

Hydroliza eskuliny

+/–

–

+/–

+/–

–

+

+/–

+

+

+

+

+/–

+

–

Hydroliza ¿elatyny

–

–

+

+

+

+

+/–

+

+/–

+/–

+

+/–

+/–

–

DNaza

–

+/–

+

+/–

+

+/–

+/–

+

?

+

+

–

–

–

O/F

F

F

O

O

F

F

O/F

F

F

F

F

F

F

O

+/–

odwrócony

–

–

–

–

+/–

–

?

–

–

+/–

–

+

CAMP test Inne w³aœciwoœci

$-Hly $-Hly + +/–

zapach hydrosera liza celulozy*

387

* – z wyj¹tkiem C. hominis Liz – lizyna, Orn – ornityna, m-DAP – kwas mezodwuaminopimelinowy, DAB – kwas diaminomas³owy, O – utlenianie, F – fermentacja, O/F – utlenianie/fermentacja, $-Hly – $-hemoliza, + – wynik dodatni, – – wynik ujemny, +/– – ró¿nie, ? – brak danych

Ze wzglêdu na sk³ad œciany komórkowej i obecnoœæ kwasów mykolowych niektóre rodzaje z grupy coryneform zaliczane s¹ do promieniowców (Actinomyces), b¹dŸ wykazuj¹ do nich podobieñstwo (Oerskovia, Rothia) lub zbli¿one s¹ do rodzaju Mycobacterium (Corynebacterium, Turicella, Dermabacter, Propionibacterium) (tab. I). 3. Charakterystyka rodzajów 3.1. Actinomyces S¹ to nitkowate pa³eczki, tworz¹ce rozga³êzienia. Rodzaj obejmuje gatunki katalazo-ujemne i katalazo-dodatnie. S¹ chorobotwórcze dla ludzi i zwierz¹t. A. naeslundii, A. odontolyticus oraz A. viscosus wchodz¹ w sk³ad mikroflory jamy ustnej i uczestnicz¹ w chorobach przyzêbia, próchnicy zêbów i zaka¿eniach ropnych jamy ustnej. Bezwzglêdnie beztlenowy gatunek A. israelii wywo³uje promienicê najczêœciej g³owy, szyi, klatki piersiowej, brzucha, niekiedy dróg rodnych [48]. A. radingae – A. turicensis complex (ART), poprzednio znany jako CDC grupa E lub A. pyogenes-like, stanowi florê jelitow¹. A. neuii subsp. neuii i A. neuii subsp. anitratus dawniej opisywano jako CDC grupê I „atypowe CDC grupa A-4”. Izolowano je od chorych z obni¿on¹ odpornoœci¹ z przypadków zapalenia ga³ki ocznej, zapalenia wsierdzia, posocznicy, zaka¿enia uk³adu moczowo-p³ciowego, zmian skórnych [41], ropni i zaka¿eñ w obrêbie jamy brzusznej [52]. Opisane szczepy Actinomyces sp. by³y wra¿liwe na $-laktamy, makrolidy, linkozamidy, ryfampicynê, tetracykliny, wankomycynê, œrednio wra¿liwe na cyprofloksacynê, gentamycynê [41]. 3.2. Arcanobacterium S¹ krótkimi, nieregularnymi pa³eczkami lub tworz¹ formy kokoidalne. Wystêpuj¹ u cz³owieka i zwierz¹t. A. haemolyticum (dawniej Corynebacterium haemolyticum) izolowano z przypadków zapalenia gard³a i migda³ków, ucha œrodkowego, zatok u m³odych ludzi [97]. Jak wynika z piœmiennictwa [18, 49] mog¹ wywo³ywaæ zmiany skórne, rzadko zapalenie wsierdzia, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, posocznicê (szczególnie dotyczy to chorych z mononukleoz¹), ropnie u pacjentów z guzem w obrêbie klatki piersiowej, zapalenie tkanki ³¹cznej. Czêsto izolowano je w hodowlach mieszanych ze Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Haemophilus parainfluenzae, Propionibacterium acnes, Fusobacterium sp. [27]. Z³uszczaj¹ce siê wysypki wystepuj¹ce w przebiegu zaka¿ania z udzia³em Arcanobacterium haemolyticum mylone bywaj¹ z zaka¿eniem S. pyogenes lub objawami wstrz¹su toksycznego. W 1997 roku [73] reklasyfikowano niektóre gatunki Actinomyces do rodzaju Arcanobacterium oraz opisano gatunek Arcanobacterium phocae. Arcanobacterium pyogenes (dawniej Actinomyces pyogenes, Corynebacterium pyogenes) by³ przyczyn¹ ropni koñczyn u m³odzie¿y szkolnej w Tajlandii. Prawdopodobnie by³o to zaka¿enie wtórne po infekcjach S. aureus i S. pyogenes, mia³o charakter endemii [3]. Gatunek ten u osób z obni¿on¹ odpornoœci¹ mo¿e byæ przyczyn¹ ropni, owrzo388

dzeñ, zapalenia pêcherza, zaka¿enia wewn¹trz jamy brzusznej, bakteriemii zwi¹zanej z zapaleniem wyrostka sutkowatego [wg 14], zapalenia wsierdzia [75]. Szczepy A. pyogenes wytwarzaj¹ hemolizynê oraz DNazê, proteazê i neuraminidazê [3, 27]. Bakterie te zwykle wra¿liwe s¹ na antybiotyki $-laktamowe i makrolidy oraz na tetracykliny i fluorochinolony [98]. Izolowano szczep A. haemolyticus oporny na makrolidy i linkozamidy [9]. 3.3. Arthrobacter (dawniej CDC grupa B-1, CDC grupa B-3) Bakterie te tworz¹ formy kokoidalne. Wystêpuj¹ powszechnie w œrodowisku, g³ównie w glebie. Rzadko izolowano je z materia³ów od ludzi. Opisano przypadki izolacji bakterii tego rodzaju z zaka¿enia skóry, krwi, uk³adu moczowego, zapalenia pochwy, zapalenia ga³ki ocznej [29, 95]. Jak dotychczas wiadomo, ¿e penicylina G wykazuje lepsz¹ aktywnoœæ ni¿ cefalosporyny [29]. 3.4. Aureobacterium Do rodzaju nale¿¹ nieregularne pa³eczki. Wystêpuj¹ w produktach mlecznych, œciekach, glebie, u owadów. Izolowano je z krwi w przebiegu bakteriemii u pacjenta z obni¿on¹ odpornoœci¹ [42]. Wra¿liwe s¹ na wiêkszoœæ antybiotyków, oporne na klindamycynê, cyprofloksacynê, gentamycynê [40]. W 1998 roku [30] opisano gatunek A. resistens, który by³ oporny na wankomycynê, natomiast wra¿liwy na teikoplaninê. 3.5. Brevibacterium (dawniej CDC grupa B-1, CDC grupa B-3) S¹ to krótkie, maczugowate, uk³adaj¹ce siê k¹towo pa³eczki. W starszych hodowlach kokopa³eczki. Wystêpuj¹ w produktach mlecznych [23] i na skórze cz³owieka [14]. Obecnie wyró¿nia siê gatunki, dla których optymaln¹ temperatur¹ wzrostu jest 20–30°C (B. linens, B. iodinum) oraz wymagaj¹ce do wzrostu temperatury 30–37°C (B. epidermidis, B. casei) [43]. Opisano przypadki zapalenia ucha œrodkowego, zapalenia otrzewnej zwi¹zanego z przewlek³¹ dializ¹ otrzewnow¹ (Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis, CAPD) z udzia³em Brevibacterium. Izolowano je równie¿ z krwi, p³ynu mózgowo-rdzeniowego, p³ynu stawowego, szpiku kostnego, p³ynu op³ucnowego, œledziony, moczu, z wymazu gard³a oraz dializatu [43, 44]. B. mebrellnerii wyosobniono z przypadku bia³ej piedry wraz z Trichosporon beigelli [wg 39], a B. avium ze zmian chorobowych od drobiu [69]. Opisane szczepy tego rodzaju by³y oporne na b-laktamy, makrolidy, linkozamidy, cyprofloksacynê, wra¿liwe na gentamycynê, tetracykliny, ryfampicynê i glikopeptydy [43, 44]. 3.6. Cellulomonas S¹ nieregularnymi pa³eczkami, czasem tworz¹ formy kokoidalne. Wystêpuj¹ w œrodowisku cz³owieka, g³ównie w glebie [21, 33], z wyj¹tkiem C. hominis (dawniej CDC grupa A-3). Szczepy tego gatunku izolowane z p³ynu mózgowo-rdzeniowego by³y wra¿liwe na ryfampicynê, tetracyklinê, wankomycynê, oporne na aminoglikozydy [33]. 389

3.7. Corynebacterium S¹ to maczugowate pa³eczki (gr. coryne – maczuga, gr. bakterion – ma³e pa³eczki). Rodzaj opisany w 1896 roku przez L e h m a n n a i N e u m a n a [wg 50], nie ma przynale¿noœci do rodziny. Istniej¹ca dawniej rodzina Corynebacteriaceae, która obejmowa³a rodzaje Corynebacterium, Listeria, Erysipelotrix nie wystêpuje ju¿ w wydaniu Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology z 1975 roku [wg 48]. Corynebacterium sp. s¹ to pleomorficzne, Gram-dodatnie lub wybarwiaj¹ce siê nierównomiernie, niekwasooporne, proste lub zakrzywione, drobne pa³eczki, kszta³tu wrzecionowatego lub maczugowatego, czasem elipsoidalne lub owalne, uk³adaj¹ce siê palisadowo lub k¹towo z metachromatycznymi ziarnistoœciami, nieprzetrwalnikuj¹ce, nieruchliwe, fakultatywne beztlenowce lub tlenowce, katalazo-dodatnie, chemoorganotrofy [50]. Bior¹c pod uwagê budowê peptydoglikanu, obecnoœæ kwasów mykolowych, fosfatydyloinozytolu, typ kwasów t³uszczowych i sk³ad zasad (G+C mol%) najwiêksze podobieñstwo z Corynebacterium wykazuje Caseobacter (51–60), Mycobacterium (62–70), Nocardia (64–69), Rhodococcus (60–69). Jednak wyniki rybotypowania (sekwencjonowanie 16S rRNA) wykaza³y wiêksze podobieñstwo Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus do grupy Actinoplanes ni¿ do Corynebacterium [50]. Stwierdzono, ¿e rodzaj Corynebacterium posiada charakterystyczn¹ budowê œciany komórkowej z typem peptydoglikanu Alg, w sk³ad którego wchodzi kwas mezodwuaminopimelinowy (mezo-DAP), cukry arabinoza i galaktoza (arabinolaktan), a tak¿e dwuwodorowe menachinony z 8 lub 9 jednostkami izoprenu: MK-8 (H2), MK-9 (H2) oraz fosfatydyloinozytol, obecny równie¿ u Mycobacterium, Propionibacterium i w komórkach Eucaryota. Œciana komórkowa Corynebacterium zawiera krótko³añcuchowe rozga³êzione kwasy t³uszczowe (proste nasycone, nienasysycone, rzadziej rozga³êzione), takie jak u bakterii z rodzaju Bacillus, Mycobacterium, Pseudomonas, Staphylococcus. U Corynebacterium sp. wystêpuje kwas mykolowy – korynemykolowy z krótkimi ³añcuchami zawieraj¹cymi 22–36 atomów wêgla [61]. Charakterystyczne dla maczugowców jest ³atwe odbarwianie w metodzie Grama (podobnie jak u Mycobacterium, Propionibacterium, Arthrobacter), które zale¿y od etapu cyklu podzia³owego i prawdopodobnie zwi¹zane jest z wyj¹tkow¹ wra¿liwoœci¹ na dzia³anie alkoholu etylowego przegrody podzia³owej w porównaniu z czêœci¹ cylindryczn¹ œciany komórkowej [61]. Rodzaj Corynebacterium stanowi bardzo zró¿nicowan¹ grupê bakterii, zarówno pod wzglêdem mo¿liwoœci wywo³ywania zaka¿eñ u ludzi, jak i wymagañ wzrostowych. Wiêkszoœæ wymaga pod³ó¿ wzbogaconych, optymalnej temperatury wzrostu 30–37°C. Typowym patogenem jest C. diphtheriae z 4 podgatunkami (mitis, belfanti, gravis, intermedius) [39] wytwarzaj¹cy fosfolipazê D oraz w wyniku konwersji lizogennej (fag $ nios¹cy gen tox) siln¹ egzotoksynê hamuj¹c¹ syntezê bia³ka [48]. C. pseudotuberculosis (dawniej C. ovis) i C. ulcerans mog¹ równie¿ wytwarzaæ fosfolipazê i ulegaæ lizogenizacji fagiem b. Szczepy tych gatunków s¹ patogenami zwierz¹t domowych. U ludzi wywo³uj¹ zaka¿enia odzwierzêce, takie jak serowate zapalenie wêz³ów ch³onnych (C. pseudotuberculosis), zapalenie gard³a, p³uc, guzki 390

p³ucne i choroby ziarniniakowe (C. ulcerans). Szczepy nietoksynotwórcze mog¹ byæ przyczyn¹ zaka¿eñ oportunistycznych [39]. Liczn¹, zró¿nicowan¹ i ci¹gle jeszcze poznawan¹ grupê stanowi¹ gatunki Corynebacterium inne ni¿ C. diphtheriae. Stanowi¹ one florê fizjologiczn¹ skóry i b³on œluzowych oraz wystêpuj¹ w otoczeniu cz³owieka. Odpowiedzialne s¹ za zaka¿enia oportunistyczne [14, 39, 56, 65]. 3.8. Dermabacter (dawniej CDC grupa 3, CDC grupa 5) Gatunek D. hominis opisany w 1988 roku przez J o n e s a i C o l l i n s a [51] wyizolowano ze skóry zdrowych ludzi. Bakterie tego gatunku wystêpuj¹ w postaci pa³eczek, ziarniakopa³eczek lub ziarniaków. Izolowano je z krwi, ropni, ran, zmian skórnych, torbieli limfatycznej u pacjentów po transplantacji nerek. Stwierdzono ich udzia³ w zapaleniu spojówek, posocznicy, zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych, zapaleniu j¹der u nosicieli HIV i w zaka¿eniu protezy naczyniowej [38]. Bakterie te s¹ wra¿liwe na cefalosporyny, ryfampicynê, glikopeptydy, œrednio wra¿liwe na cyprofloksacynê, klindamycynê, erytromycynê, tetracyklinê, czêsto oporne na aminoglikozydy [10, 38]. 3.9. Exiguobacterium Rodzaj opisany w 1983 roku [13] zawiera alkalofilny gatunek E. aurantiacum. Szczepy tego gatunku izolowano ze skóry, ran, p³ynu mózgowo-rdzeniowego [wg 39]. 3.10. Microbacterium (dawniej CDC grupa A-4, CDC grupa A-5) Pierwsze wzmianki o izolacji tych bakterii pochodz¹ z 1919 roku [wg 39]. Rodzaj opisany w 1983 roku [28] obecnie zawiera gatunki M. lacticum, M. laevaniformans, M. dextranolyticum, M. imperiale, M. arborescens, M. aurum. Izolowano je od pacjentów z zapaleniem ga³ki ocznej, zapaleniem wsierdzia i posocznic¹ zwi¹zan¹ z cewnikowaniem. Bakterie te s¹ wra¿liwe na wiêkszoœæ antybiotyków, zwykle oporne na aminoglikozydy [28]. Ostatnio zaproponowano by rodzaje Agromyces, Aureobacterium, Clavibacter, Curtobacterium, Microbacterium w³¹czyæ do rodziny Microbacteriaceae [wg 39]. 3.11. Oerskovia S¹ to ziarniakopa³eczki lub pa³eczki, tworz¹ce pseudomycelium. Dawniej zaliczane do bakterii podobnych do rodzaju Nocardia. Wystêpuj¹ w glebie, gnij¹cych roœlinach, œciekach z browarów [57]. Rodzaj obejmuje 2 gatunki: O. turbata i O. xanthineolytica (dawniej CDC grupa A-1, CDC grupa A-2). Z ich udzia³em opisano przypadki zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenia wsierdzia [76], zapalenia ga³ki ocznej, roponercza [15], zaka¿enia tkanek miêkkich, zgorzelinowego zapalenia pêcherzyka ¿ó³ciowego po endoskopii [32], bakteriemii zwi¹zanej z cewnikowaniem i ¿ywieniem pozajelitowym [58], zapalenia otrzewnej po CAPD [59], zaka¿enia endoprotezy [46]. U szczepów Oerskovia notowano zró¿nicowan¹ wra¿liwoœæ na antybiotyki [32]. Izolowano równie¿ szczep oporny na wankomycynê [71]. 391

3.12. Propionibacterium Rodzaj zawiera drobnoustroje, które mog¹ wystêpowaæ w materia³ach pochodz¹cych od ludzi i zwierz¹t oraz w œrodowisku cz³owieka. Wiêkszoœæ z nich wymaga do wzrostu atmosfery beztlenowej [50]. Gatunki zwi¹zane z zaka¿eniami u ludzi to P. acnes, P. avidum, P. granulosum, P. propionicum. P. acnes (dawniej Corynebacterium parvum) posiada w³aœciwoœci adiuwantowe, prawdopodobnie ma znaczenie w przebiegu choroby Kawasaki i sarkoidozie [20]. Wytwarza proteinazê, hialuronidazê, lipazê, neuraminidazê, fosfatazê alkaliczn¹, histaminê i trypaminê, które odgrywaj¹ rolê w patogenezie tr¹dzika [67]. Gatunki P. acnes, P. avidum i P. granulosum czêsto izolowane s¹ wraz z CNS (Coagulase-Negative Staphylococci) od pacjentów po zabiegach neurochirurgicznych z ropni mózgu, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, ropniaków pod- i nadtwardówkowych [74, 80]. U pacjentów z immunosupresj¹ opisano z ich udzia³em zapalenie ga³ki ocznej [72] zapalenie p³uc i oskrzeli [11], zapalenie wsierdzia [45], posocznicê [6], zapalenie koœci i szpiku [68], zapalenie stawów u pacjentów z endoprotez¹ i poddawanych sterydoterapii [88]. P. propionicum mo¿e byæ przyczyn¹ ropnego zapalenia kanalików i woreczków ³zowych u starszych kobiet i rzadko zapalenia p³uc [7]. Pa³eczki Propionibacterium sp. s¹ wra¿liwe na wiêkszoœæ antybiotyków [67], z wyj¹tkiem metronidazolu i aminoglikozydów [6, 82]. Szczepy P. acnes czêsto s¹ oporne na makrolidy, linkozamidy i tetracykliny [55]. 3.13. Rothia S¹ to nieregularne pa³eczki. Wystêpuj¹ w jamie ustnej. Szczepy gatunku R. dentocariosa (prawdopodobnie dawniej CDC grupa 4) mog¹ stanowiæ prawie 30% drobnoustrojów izolowanych z wymazów gard³a [93]. Rothia sp. izolowano z przypadków zropia³ej torbieli oko³ow³osowej, zapalenia p³uc [94], ropni mózgu [8, 47], zapalenia wsierdzia u doros³ych [1, 4, 54] i u dzieci [5], bakteriemii [70], zapalenia otrzewnej po CAPD [2, 24]. Ostatnio opisano gatunek R. nasimurium, który pochodzi³ od myszy [12]. Bakterie te s¹ wra¿liwe na wiêkszoœæ antybiotyków, oporne na kotrimoksazol i aminoglikozydy [8, 26]. 3.14. Turicella (dawniej Corynebacterium grupa ANF-1-like) S¹ to d³ugie pa³eczki lub kokopa³eczki, czêsto uk³adaj¹ce siê k¹towo [77]. Po raz pierwszy izolowane z wydzieliny w ostrym przebiegu zapalenia ucha œrodkowego i opisane w 1993 roku przez 2 niezale¿ne oœrodki [35, 83]. Obecnie rodzaj zawiera jeden gatunek T. otitidis. Opisano przypadek izolacji tych drobnoustrojów z ropy pacjenta z zapaleniem ucha œrodkowego [77]. Szczep by³ wra¿liwy na $-laktamy, oporny na erytromycynê i klindamycynê. 4. Identyfikacja pa³eczek z grupy coryneform W ostatnich 20 latach dokonano ogromnego postêpu w klasyfikacji Gram-dodatnich pa³eczek. Poznano sk³ad œciany komórkowej (aminokwasy, cukry, kwasy t³usz392

czowe i mykolowe), jak równie¿ chinony izoprenowe, cytochromy, sk³ad DNA [14, 39]. Wspó³czeœnie stosowane metody identyfikacji to hybrydyzacja kwasów nukleinowych (DNA-DNA), genotypowanie, np. sekwencjonowanie podjednostki 16S rRNA, ARDRA, PCR, HPLC, SDS-PAGE, PFGE [39]. Chemotaksonomia bêd¹ca podstaw¹ w identyfikacji coryneform przyczyni³a siê do reklasyfikacji wielu gatunków do innych lub nowo utworzonych rodzajów [14, 39], np.: obecnie dawniej Propionibacterium acnes Corynebacterium parvum Arcanobacterium haemolyticum Corynebacterium haemolyticum Rhodococcus equi Corynebacterium equi Jonesia denitrificans Listeria denitrificans Corynebacterium ammoniagenes Brevibacterium ammoniagenes Ogólnie panuj¹cy pogl¹d o celowoœci stosowania chemotaksonomii nie znajduje praktycznego zastosowania w mikrobiologicznych laboratoriach klinicznych, gdzie nie jest mo¿liwe przeprowadzenie tego typu szczegó³owych analiz. St¹d, bardzo pomocne w identyfikacji sta³y siê metody konwencjonalne [14]. Obecnie proponowany jest zmodyfikowany schemat Hollis’a i Weaver’a z 1981 roku [wg 39], który obejmuje wynik barwienia metod¹ Grama, ocenê wytwarzania katalazy, test fermentacji/utleniania glukozy, zdolnoœæ ruchu, redukcji azotanów, wytwarzania ureazy, hydrolizy eskuliny, kwaœnej fermentacji cukrów: glukozy, maltozy, sacharozy, mannitolu, ksylozy oraz test CAMP ze szczepem wzorcowym S. aureus ATCC 25923. Do oceny zdolnoœci fermentacyjnych i enzymatycznych s³u¿¹ testy komercyjne takie jak: 1. API Coryne (bio-Mérieux) s³u¿¹cy do identyfikacji 49 gatunków na podstawie 20 cech biochemicznych i enzymatycznych (po 24 godzinach inkubacji). Jest on alternatyw¹ w stosunku do konwencjonalnej metody probówkowej oceny cech biochemicznych drobnoustrojów (7 dni inkubacji). Cenny w rutynowej pracy wielu laboratoriów mikrobiologicznych [37]; 2. RapID CB Plus System (Remel, Lenexa, Kansas) panel do identyfikacji Corynebacterium sp. i innych pa³eczek Gram-dodatnich (4-godziny inkubacji), zawieraj¹cy 14 substratów dla enzymów i 4 testy do oceny utleniania cukrów [34]; 3. Biolog system (Biolog, Hazelwood, California) umo¿liwia ocenê zdolnoœci utleniania cukrów, w ci¹gu 4–24 godzin inkubacji [39]; 4. API ZYM (bio-Mérieux) pozwala okreœliæ wyniki 19 reakcji enzymatycznych po 4 godzinach inkubacji, stosowany jako test uzupe³niaj¹cy w identyfikacji coryneform [65]. W zwi¹zku z ogromnym zró¿nicowaniem grupy coryneform i faktem, ¿e wymienione testy oceniaj¹ reakcje podstawowe konieczne staje siê po³¹czenie ich z ocen¹ sk³adu œciany komórkowej, zawartoœci¹ kwasów t³uszczowych w komórce, a czêsto analiz¹ kwasów mykolowych i rybotypowaniem. Metody te powinny byæ dostêpne w laboratoriach referencyjnych. Do oceny sk³adu kwasów t³uszczowych w komórce s³u¿y Sherlock system (MIDI Inc., Newark) u¿ywany przez wiele laboratoriów na œwiecie [39]. Opracowany 393

ostatnio system MicroSeq 500 16S (Perkin-Elmer Biosystems, Foster City, California) pozwala zidentyfikowaæ drobnoustroje w czasie 15,5–18,5 godzin na podstawie analizy genu rRNA (sekwencjonowanie podjednostki 16S rRNA). Mo¿e on staæ siê najlepsz¹ metod¹ w ostatecznej identyfikacji coryneform [90]. 5. Metody oznaczania wra¿liwoœci coryneform na antybiotyki Dotychczas NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) nie opublikowa³ zaleceñ oznaczania wra¿liwoœci na antybiotyki dla Corynebacterium i innych Gram-dodatnich pa³eczek z grupy coryneform [39, 56]. Obecnie nie jest jasne jakie nale¿y stosowaæ inokulum i jakich pod³ó¿ u¿ywaæ w badaniu lekowra¿liwoœci coryneform. Jest to istotne szczególnie w przypadku wolnorosn¹cych, lipofilnych (wymagaj¹cych do wzrostu substancji t³uszczowych np. Tweenu 80) Corynebacterium sp. [39]. Dotychczas antybiogramy wykonywane s¹ wed³ug ogólnych zaleceñ NCCLS, a wyniki otrzymywane w ró¿nych metodach (kr¹¿kowo-dyfuzyjna, mikrorozcieñczenia, E-testy) s¹ porównywalne [62, 96, 99]. Najbardziej problematyczny jest dobór kryteriów interpretacji wyników antybiotykowra¿liwoœci. Ze wzglêdu na podobn¹ aktywnoœæ antybiotyków, najczêœciej stosowane s¹ kryteria przyjête dla Staphylococcus sp. [36, 87, 99], rzadziej jak dla Streptococcus sp., Enterococcus sp. [96]. Inni autorzy interpretuj¹ wyniki, szczególnie dla penicylin, przyjmuj¹c kryteria zalecane dla Listeria monocytogenes [56]. Zwykle za szczep kontrolny s³u¿y S. aureus ATCC 29213 lub ATCC 25923 i E. faecalis ATCC 29212. Najczêœciej stosowane jest pod³o¿e Mueller-Hintona wzbogacone 5% odw³óknion¹ krwi¹ barani¹ [36, 87]. Jako sk³adnik wzbogacaj¹cy stosowana jest te¿ odw³ókniona krew koñska [56], dwunukleotyd nikotynamidynowy adeniny [66], a dla gatunków lipofilnych czêsto Tween 80 [62]. Inkubacja prowadzona jest w atmosferze wzbogaconej CO2 lub tlenowej w temperaturze 35–37°C przez 24 godziny, a w przypadku szczepów wolnorosn¹cych 48 godzin [36, 87, 99]. Ró¿nice we wra¿liwoœci na antybiotyki u coryneform uzyskiwane przez poszczególnych autorów, mog¹ wynikaæ z odmiennych populacji analizowanych szczepów, ró¿nych czynników selekcjonuj¹cych szczepy oporne, ale te¿ mog¹ byæ zwi¹zane z odmiennymi warunkami wzrostu i kryteriami interpretacji wyników lekowra¿liwoœci. Coraz czêœciej wyra¿ane jest niezadowolenie z powodu braku zaleceñ NCCLS [14, 39, 56]. Byæ mo¿e nale¿a³oby, ze wzglêdu na heterogennoœæ grupy zindywidualizowaæ metodê dla poszczególnych coryneform [62, 99] i stosowaæ, np. dla niewymagaj¹cych gatunków takich jak C. striatum i C. minutissimum pod³o¿e Mueller-Hintona, dla C. amycolatum pod³o¿e Mueller-Hintona z 5% krwi¹ barani¹, a dla gatunków lipofilnych pod³o¿e Mueller-Hintona z Tweenem 80. Coryneform bakterie stanowi¹ heterogenn¹ grupê drobnoustrojów. Lekowra¿liwoœæ poszczególnych gatunków jest zró¿nicowana. Zwykle wra¿liwe s¹ na glikopeptydy i kwas fusydowy [36, 87], czêsto na fluorochinolony [62]. Opisano krzy¿ow¹ opornoœæ na makrolidy i linkozamidy [19, 78], ale wra¿liwe s¹ na ketolidy, z wyj¹tkiem szczepów wieloopornych [85, 86], pristinamycynê oraz chinupristinê/ 394

Tabela II Geny opornoœci na antybiotyki wykryte u Corynebacterium sp. oraz ich lokalizacja [17, 71, 78, 91, 92] Gen zlokalizowany na chromosomie, plazmidzie lub transpozonie

Gatunek

OpornoϾ na antybiotyki

erm Cd

C. diphtheriae, C. striatum Klindamycyna, erytromycyna

erm Cx

C. xerosis

Klindamycyna, erytromycyna

tetM

C. striatum

Tetracyklina

Nxr

C. glutamicum

Kwas nalidyksowy

pXZ10145

C. glutamicum

Chloramfenikol

pNG2

C. diphtheriae

Erytromycyna

pAG1

C. glutamicum

Tetracyklina

pCG4

C. glutamicum

Streptomycyna

pTP10 (Tn5432)

C. xerosis, C. glutamicum

Spektynomycyna, tetracyklina, chloramfenikol

pDG101

C. flaccumfaciens

Erytromycyna, streptomycyna

Tn5564

C. glutamicum

Arsenin, arsenian, antymon, chloramfenikol

dalfopristinê [66]. Wysoki jest odsetek szczepów opornych na tetracyklinê, natomiast zwykle wra¿liwe s¹ na doksycyklinê i minocyklinê. Fosfomycyna i nitrofurany, ze wzglêdu na powszechn¹ opornoœæ szczepów, stosowane s¹ w pod³o¿ach wybiórczych dla maczugowców [100]. Coryneform bakterie oporne s¹ równie¿ na mupirocynê i bardzo czêsto na kotrimoksazol [65]. Wœród coryneform izolowanych z materia³ów diagnostycznych s¹ szczepy wra¿liwe na wiêkszoœæ antybiotyków, ale i szczepy o wielorakiej opornoœci. Wielooporne najczêœciej s¹ szczepy gatunków C. urealyticum, C. jeikeium i C. amycolatum. Niewiele jest informacji na temat mechanizmów opornoœci na antybiotyki u coryneform. Najczêœciej opisane s¹ geny warunkuj¹ce opornoœæ na niektóre antybiotyki (tab. II) [17, 71, 78, 91, 92]. 6. Czynniki wirulencji pa³eczek z grupy coryneform Miar¹ chorobotwórczoœci bakterii jest wirulencja (zjadliwoœæ), na któr¹ sk³adaj¹ siê zakaŸnoœæ, inwazyjnoœæ i toksycznoœæ. Okreœlenie czynników zjadliwoœci jest trudne, szczególnie u bakterii oportunistycznych. W powstawaniu bakteryjnej zjadliwoœci mo¿e uczestniczyæ wiele procesów: adhezja, kolonizacja tkanek, inwazja, ewazja, wytwarzanie specyficznych czynników (struktury powierzchniowe, enzymy, toksyny, egzopolisacharydy), zdolnoœæ do utrzymania siê w organizmie. Siln¹ egzotoksynê (neurotoksynê) oraz fosfolipazê D, która hydrolizuje sfingomielinê komórek œródb³onkowych naczyñ krwionoœnych, mog¹ wytwarzaæ C. diphtheriae, C. ulcerans i C. pseudotuberculosis [48]. U szczepów Arcanobacterium haemolyticum opisano gen homologiczny z genem S. pyogenes koduj¹cym toksynê 395

erytrogenn¹, a u O. turbata neuraminidazê [wg 39]. Gatunki oportunistyczne coryneform wytwarzaj¹ fosfatazy, lipazy, esterazy, które umo¿liwiaj¹ rozk³ad lipidów skóry. Szczególnie gatunki lipofilne mog¹ os³abiaæ mechanizmy obronne skóry przez zu¿ywanie kwasu olejowego z b³ony powierzchniowej [53, 60]. Wytwarzanie sideroforów jest równie¿ wa¿nym czynnikiem sprzyjaj¹cym kolonizacji i namna¿aniu siê drobnoustrojów. Corynebacterium sp. posiadaj¹ siderofory o budowie katecholanów oraz hydroksamianów, których budowa chemiczna nie jest znana [89]. Wiele chorób bakteryjnych rozpoczyna siê od bezpoœredniego kontaktu miêdzy patogenem a nab³onkiem wyœcielaj¹cym drogi oddechowe, przewód pokarmowy czy uk³ad moczowy. Opisano ró¿ne czynniki fizyko-chemiczne, które przyczyniaj¹ siê do zapocz¹tkowania adhezji bakterii. Jest ona pierwszym etapem zaka¿enia [61]. W procesie adhezji wœród niespecyficznych interakcji wa¿n¹ rolê odgrywaj¹ w³aœciwoœci hydrofobowe powierzchni komórki bakteryjnej. W³aœciwoœci adhezyjne i hydrofobowe opisano u C. diphtheriae [16, 64]. Zwrócono uwagê na adhezjê do komórek nab³onkowych szczepów Corynebacterium sp. izolowanych z okolicy pachwin [79] oraz mo¿liwoœæ udzia³u maczugowców wystêpuj¹cych na skórze w zaka¿eniach zwi¹zanych z przyleganiem do biomateria³ów [22, 81]. Niewiele jest informacji na temat struktur warunkuj¹cych adhezjê u coryneform. Rolê tak¹ najprawdopodobniej spe³nia zewn¹trzkomórkowy œluz Brevibacterium sp. [wg 39] i Corynebacterium mucifaciens [31]. Dyskusyjny jest udzia³ fimbrii w przyleganiu tych bakterii do ró¿nych powierzchni [63]. W³aœciwoœci adhezyjne i hydrofobowe bakterii z grupy coryneform s¹ ró¿ne u poszczególnych gatunków i prawdopodobnie te¿ zale¿ne od warunków œrodowiska. Przysz³e badania poka¿¹ byæ mo¿e jak dalece powierzchnia bakterii namna¿aj¹cych siê w makroorganizmie (in vivo) ró¿ni siê od powierzchni tych samych szczepów hodowanych in vitro. Proces ten wymaga dalszych badañ ze wzglêdu na coraz wiêksze znaczenie oportunistycznych maczugowców w zaka¿eniach szpitalnych zwi¹zanych z kolonizacj¹ skóry i biomateria³ów. Prawdopodobnie najwiêksze znaczenie w wywo³ywaniu zaka¿eñ szpitalnych przez gatunki oportunistyczne ma ich opornoœæ na wiele antybiotyków i zdolnoœæ przetrwania w œrodowisku szpitalnym, a tak¿e antagonistyczny wp³yw na inne skórne drobnoustroje i mo¿liwoœæ intensywnej kolonizacji powierzchni skóry [60]. Wœród drobnoustrojów kolonizuj¹cych cewniki do¿ylne Corynebacterium sp. zwykle s¹ pod wzglêdem czêstoœci wystêpowania w kolejnoœci po koagulazo-ujemnych gronkowcach, Gram-ujemnych pa³eczkach, E. faecalis, Candida sp. [22, 81]. Zjawisko kolonizacji ró¿nych powierzchni przez bakterie czêsto poci¹ga za sob¹ niekorzystne skutki i utrudnia leczenie. Lepsze poznanie i zrozumienie tych procesów umo¿liwi byæ mo¿e skuteczne przeciwdzia³anie zaka¿eniom. 7. Podsumowanie „Obecnie uczeni nie twierdz¹ ju¿, ¿e postêp medyczny zapewni eliminacjê wszystkich chorób infekcyjnych... Zamiast lokowaæ ca³kowite zaufanie w zwalczanie zaka¿eñ, które ju¿ wyst¹pi³y, nale¿y próbowaæ okreœliæ czynniki sprzyjaj¹ce 396

pojawianiu siê i szerzeniu nowych zaka¿eñ” [Jeljaszewicz J. Zaka¿enia szpitalne. Nowa Medycyna. 11, 3, (1998)]. Coryneform bakterie nie s¹ nowymi drobnoustrojami, jednak ich rola w zaka¿eniach jest ci¹gle nie doceniana. Bakterie te niejednokrotnie traktowane s¹ jako zanieczyszczenie materia³u klinicznego wynikaj¹ce z niew³aœciwego pobrania. Pomijanie coryneform jako czynników etiologicznych zaka¿eñ mo¿e byæ spowodowane trudnoœciami zwi¹zanymi z ich hodowl¹ i identyfikacj¹ oraz brakiem zaleceñ NCCLS co do oceny lekowra¿liwoœci [39]. Szczepy Corynebacterium sp. mog¹ stanowiæ 0,5% wszystkich drobnoustrojów izolowanych z materia³ów klinicznych, a 20,8% izolowanych szczepów mo¿e byæ czynnikiem etiologicznym zaka¿enia [65]. Wed³ug F u n k e i wsp. [39] szczepy coryneform wyhodowane w monokulturze, a tak¿e jako drobnoustroje dominuj¹ce w hodowli mieszanej powinny byæ rozpatrywane jako przyczyna zaka¿enia. W zwi¹zku z problematycznoœci¹ zagadnienia szczególnie potrzebna jest wspó³praca mikrobiologa z klinicyst¹, co u³atwi okreœlenie udzia³u grupy coryneform w zaka¿eniach. Piœmiennictwo 1. Anderson M.D., Kennedy C.A., Walsh T.P., Bowler W.A.: Prosthetic valve endocarditis due to Rothia dentocariosa. Clin. Infect. Dis. 17, 945–946 (1993) 2. Bibashi E., Koholina E., Mitsopoulos E.: Peritonitis due to Rothia dentocariosa in a patient receiving continuous ambulatory peritoneal dialysis. Clin. Infect. Dis. 28, 696 (1999) 3. Billigton S.J., Jost B.H., Cuevas W.A., Bright K.R., Songer J.G.: The Arcanobacterium (Actinomyces) pyogenes hemolysin, pyolysin, is a novel member of the thiol-activated cytolysin family. J. Bacteriol. 179, 6100–6106 (1997) 4. Binder D., Zbinden R., Widmer U.: Native and prosthetic valve endocarditis caused by Rothia dentocariosa: diagnostic and therapeutic considerations. Infection, 25, 22–26 (1997) 5. Braden D.S., Feldman S., Palmer A.L.: Rothia endocarditis in a child. South. Med. J. 92, 815–816 (1999) 6. Branger C., Bruneau B., Goullet P.: Septicemia caused by Propionibacterium granulosum in a compromised patient. J. Clin. Microbiol. 25, 2405–2406 (1987) 7. Brazier J.S., Hall V.: Propionibacterium propionicum and infections of the lacrimal apparatus. Clin. Infect. Dis. 17, 892–893 (1993) 8. Broeren S.A., Peel M.M.: Endocarditis caused by Rothia dentocariosa. J. Clin. Pathol. 37, 1298–1300 (1984) 9. Carlson P., Korpela J., Walder M., Nyman M.: Antimicrobial susceptibilities and biotypes of Arcanobacterium haemolyticum blood isolates. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 18, 915–917 (1999) 10. Cartuyvels R., Verhaegen J., Peetermans W.E., Wauters G.: Report of a case of Dermabacter hominis bacteremia. Med. Microbiol. Lett. 5, 418–425 (1996) 11. Claeys G., Verschraegen G., de Potter C., Cuvelier C., Pauwels R.: Bronchopneumonia caused by Propionibacterium acnes. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13, 747–749 (1994) 12. Collins M.D., Hutson R.A., Baverud V., Falsen E.: Characterization of a Rothia-like organism from a mouse: description of Rothia nasimurium sp. nov. and reclassification of Stomatococcus mucilaginosus as Rothia mucilaginosa comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 3, 1247–1251 (2000) 13. Collins M.D., Lund B.M., Farrow J.A.E., Schleifer K.H.: Chemotaxonomic study of an alkalophilic bacterium, Exiguobacterium aurantiacum gen. nov., sp. nov. J. Gen. Microbiol. 129, 2037–2042 (1983)

397

14. Coyle M.B., Lipsky B.A.: Coryneform bacteria in infectious diseases: clinical and laboratory aspect. Clin. Microbiol. Rev. 3, 227–246 (1990) 15. Cruickhank J.G., Gawler A.H., Shaldon C.: Oerskovia species: rare opportunistic pathogens. J. Med. Microbiol. 12, 513–515 (1979) 16. Deacock S.J., Steward K.A., Crone HR.: The role of adherence in determining the site of infection by Corynebacterium diphtheriae. J. Hyg. 90, 415–424 (1983) 17. Deb J.K., Nath N.: Plasmids of corynebacteria. FEMS Microbiol. Lett. 175, 11–20 (1999) 18. Dobinsky S., Noesselt T., Rucker A., Maerker J., Mack D.: Three cases of Arcanobacterium haemolyticum associated with abscess formation and cellulitis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 18, 804–806 (1999) 19. Eady E.A., Coates P., Ross J.I., Ratyal A.H., Cove J.H.: Antibiotic resistance patterns of aerobic coryneforms and furazolidone-resistant Gram-positive cocci from the skin surface of the human axilla and fourth toe cleft. J. Antimicrob. Chemother. 46, 205–213 (2000) 20. Eady E.A., Ingham E.: Propionibacterium acnes – friend or foe? Rev. Med. Microbiol. 5, 163–173 (1994) 21. Elberson M.A., Malekzadeh F., Yazdi M.T., Kameranpour N., Noori-Daloii M.R., Matte M.H., Shahamat M., Colwell R.R., Sowers K.R.: Cellulomonas persica sp. nov. and Cellulomonas iranensis sp. nov., mesophilic cellulose-degrading bacteria isolated from forest soils. Int. Syst. Evol. Microbiol. 3, 993–996 (2000) 22. Elliott T.S.J., Moss H.A., Tebbs S.E., Wilson I.C., Bonser R.S., Graham T.R., Burke L.P., Faroqui M.M.: Novel approach to investigate a source of microbial contamination of central venous catheters. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16, 210–213 (1997) 23. Eppert I., Valdés-Stauber N., Götz H., Busse M., Scherer S.: Growth reduction of Listeria spp. caused by undefined industrial red smear cheese cultures and bacteriocin-producing Brevibacterium linens as evaluated in situ on soft cheese. App. Env. Microbiol. 63, 4812–4817 (1997) 24. Ergin C., Sezer M.T., Agalar C., Katirci S., Demirdal T., Yayli G.: A case of peritonitis due to Rothia dentocariosa in a CAPD patient. Perit. Dial. Int. 20, 242–243 (2000) 25. Evtushenko L.I., Dorofeeva L.V., Subbotin S.A., Cole J.R., Tiedje J.M.: Leifsonia poae gen. nov., sp. nov., isolated from nematode galls on Poa annua, and reclassification of “Corynebacterium aquaticum” Leifson 1962 as Leifsonia aquatica (ex Leifson 1962) gen. nov., nom. rev., comb. nov. and Clavibacter xyli Davis et al. 1984 with two subspecies as Leifsonia xyli (Davis et al. 1984) gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 371–380 (2000) 26. Ferraz V., McCarthy K., Smith D., Koornhof H.J.: Rothia dentocariosa and aortic root abscess. J. Infect. 37, 292–295 (1998) 27. Funk P.G., Staats J.J., Howe M., Nagaraja T.G., Chengappa M.M.: Identification and partial characterisation of an Actinomyces pyogenes hemolysin. Vet. Microbiol. 50, 129–142 (1996) 28. Funke G., Falsen E., Barreau C.: Primary identification of Microbacterium spp. encountered in clinical specimens as CDC coryneform group A-4 and A-5 bacteria. J. Clin. Microbiol. 33, 188–192 (1995) 29. Funke G., Hutson R.A., Bernard K.A., Pfyffer G.E., Wauters G., Collins M.D.: Isolation of Arthrobacter spp. from clinical specimens and description Arthrobacter cumminsii sp. nov. and Arthrobacter woluwensis sp. nov. J. Clin Microbiol. 34, 2356–2363 (1996) 30. Funke G., Lawson A.P., Nolte F.S., Weiss N., Collins M.D.: Aureobacterium resistens sp. nov. exhibiting vancomycin resistance and teicoplanin susceptibility. FEMS Microbiol. Lett. 158, 89–93 (1998) 31. Funke G., Lawson P.A., Collins M.D.: Corynebacterium mucifaciens sp. nov., an unusual species from human clinical material. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 952–957 (1997) 32. Funke G., Marty N.: Three strains of Oerskovia xanthineolytica from clinical specimens. Clin. Microbiol. Newsl. 17, 142–144 (1995) 33. Funke G., Pascual R.C., Collins M.D.: Identification of some clinical strains of CDC coryneform group A-3 and group A-4 bacteria as Cellulomonas species and proposal of Cellulomonas hominis sp. nov. for some group A-3 strains. J. Clin. Microbiol. 33, 2091–2097 (1995) 34. Funke G., Peters K., Aravena R.M.: Evaluation of the RapID CB plus system for identification of coryneform bacteria and Listeria spp. J. Clin. Microbiol. 36, 2439–2442 (1998)

398

35. Funke G., Pfyffer G.E., von Graevenitz A.: A hitherto undescribed coryneform bacterium isolated from patients with otitis media. Med. Microbiol. Lett. 2, 183–190 (1993) 36. Funke G., Pünter V., von Graevenitz A.: Antimicrobial susceptibility patterns of some recently established coryneform bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 40, 2874–2878 (1996) 37. Funke G., Renaud F.N.R., Freney J., Riegel P.: Multicenter evaluation of the updated and extended API (RAPID) Coryne database 2.0. J. Clin. Microbiol. 35, 3122–3126 (1997) 38. Funke G., Stubbs S., Pfyffer G.E., Marchiani M., Collins M.D.: Characteristics of CDC group 3 and group 5 coryneform bacteria isolated from clinical specimens and assignment to the genus Dermabacter. J. Clin. Microbiol. 32, 1223–1228 (1994) 39. Funke G., von Graevenitz A., Clarridge III J.E., Bernard K.A.: Clinical microbiology of coryneform bacteria. Clin. Microbiol. Rev. 10, 125–159 (1997) 40. Funke G., von Graevenitz A., Weiss N.: Primary identification of Aureobacterium spp. isolated from clinical specimens as “Corynebacterium aquaticum”. J. Clin. Microbiol. 32, 2686–2691 (1994) 41. Funke G., von Graevenitz A.: Infections due to Actinomyces neuii (former CDC coryneform group 1 bacteria). Infection, 23, 73–75 (1995) 42. Grove D.I., der Haroutian V., Ratcliff R.M.: Aureobacterium masquerading as “Corynebacterium aquaticum” infection: case report and review of the literature. J. Med. Microbiol. 48, 965–970 (1999) 43. Gruner E., Pfyffer G.E., von Graevenitz A.: Characterization of Brevibacterium spp. from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 31, 1408–1412 (1993) 44. Gruner E., Steigerwalt A.G., Hollis D.G., Weyant R.S., Weaver R.E., Moss C.W., Daneshvar M., Brown J.M., Brenner D.J.: Human infections caused by Brevibacterium casei, formerly CDC groups B-1 and B-3. J. Clin. Microbiol. 32, 1511–1518 (1994) 45. Günthard H., Hany A., Turina M., Wüst J.: Propionibacterium acnes as a cause of aggressive aortic valve endocarditis and importance of tissue grinding: case report and review. J. Clin. Microbiol. 32, 3034–3045 (1994) 46. Harrington R.D., Lewis C.G., Aslanzadeh J., Stelmach P., Woolfrey A.E.: Oerskovia xanthineolytica infection of a prosthetic joint: case report and review. J. Clin. Microbiol. 34, 1821–1824 (1996) 47. Isaacson J.H., Grenko R.T.: Rothia dentocariosa endocarditis complicated by brain abscess. Am. J. Med. 84, 352–354 (1988) 48. Jab³oñski L red.: Podstawy Mikrobiologii Lekarskiej. Pleszczyñska E. Pa³eczki Gram-dodatnie. PZWL Warszawa, 1986, 307–317 49. Jobanputra R.S., Swam C.P.: Septicaemia due to Corynebacterium haemolyticum. J. Clin. Pathol. 28, 798–800 (1975) 50. Jones D., Collins M.D.: Irregular, nonsporing gram-positive rods. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Williams and Wilkins Co. Baltimore. 1986. Md. Section 15. s. 1261–1286 51. Jones D., Collins M.D.: Taxonomic studies on some human cutaneous coryneform bacteria: description of Dermabacter hominis gen. nov., sp. nov. FEMS Microbiol. Lett. 51, 51–56 (1988) 52. Kacem C., Puisieux F., Kammoun A., Morched-Abdesselam M., Zaouche A.: Abdominal actinomycosis. Report of three cases and review of the literature. Ann. Med. Interne (Paris), 151, 243–247 (2000) 53. Kasprowicz A.: Maczugowce skórne, klasyfikacja i rola w ustroju ludzkim. Post. Mikrobiol. 14, 107–120 (1975) 54. Kong R., Mebaza A., Heitz B., de Briel D.A.: Case of triple endocarditis Rothia caused by Rothia dentocariosa and results of a survey in France. J. Clin. Microbiol. 36, 309–310 (1998) 55. Kurokawa I., Nishijima S., Kawabata S.: Antimicrobial susceptibility of Propionibacterium acnes isolated from acne vulgaris. Eur. J. Dermatol. 9, 25–28 (1999) 56. Lagrou K., Verhaegen J., Janssens M., Wauters G., Verbist L.: Prospective study of catalasepositive coryneform organisms in clinical specimens: identification, clinical relevance, and antibiotic susceptibility. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 30, 7–15 (1998) 57. Lechevalier H.A., Lechevalier H.P.: Genus Oerskovia. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2. Williams and Wilkins Co. Baltimore. 1986. Md. s. 1489–1491

399

58. LeProwse C.R., McNeil M.M., McCarty J.M.: Catheter – related bacteremia caused by Oerskovia turbata. J. Clin. Microbiol. 27, 571–572 (1989) 59. Lujan-Zilbermann J., Jones D., de Vincenzo J.: Oerskovia xanthineolytica peritonitis: case report and review. Pediatr. Infect. Dis. J. 18, 738–739 (1999) 60. Maibach H.I., Aly R.: Skin Microbiology. Springer-Verlag New York Inc. 1981 61. Markiewicz Z.: Struktura i funkcje os³on bakteryjnych. PWN Warszawa, 1993 62. Martínez-Martínez L., Ortega M.C., Suárez A.I.: Comparison of E-test with broth microdilution and disk diffusion for susceptibility testing of coryneform bacteria. J. Clin. Microbiol. 33, 1318–1321 (1995) 63. Marty N., Agueda L., Lapchine L., Clave D., Henry-Ferry S., Chabanon G.: Adherence and hemagglutination of Corynebacterium group D2. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 10, 20–24 (1991) 64. Mattos-Guaraldi A.L., Formiga L.C.D., Andrade A.F.B.: Cell Surface hydrophobicity of sucrose fermenting and nonfermenting Corynebacterium diphtheriae strains evaluated by different methods. Curr. Microbiol. 38, 37–42 (1999) 65. Mikucka A.: Oportunistyczne gatunki coryneform w zaka¿eniach szpitalnych. Akademia Medyczna. Bydgoszcz, 2001. Praca doktorska 66. Moore L.S., Schneider B., Holloway W.J.: Minimal inhibitory concentrations and minimal bactericidal concentrations of quinupristin/dalfopristin against clinical isolates of Corynebacterium jeikeium and Listeria monocytogenes. J. Antimicrob. Chemother. 39, 67–68 (1997) 67. Nishijima S., Kurokawa I., Katoh N., Watanabe K.: The bacteriology of acne vulgaris and antimicrobial susceptibility of Propionibacterium acnes and Staphylococcus epidermidis isolated from acne lesions. J. Dermatol. 27, 318–323 (2000) 68. Noble R.C., Overman S.B.: Propionibacterium acnes osteomyelitis: case report and review of the literature. J. Clin. Microbiol. 25, 251–254 (1987) 69. Pascual C., Collins M.D.: Brevibacterium avium sp. nov., isolated from poultry. Int. J. Syst. Bacteriol. 4, 1527–1530 (1999) 70. Plummer M., Schoch P.E.: Rothia dentocariosa bacteriemia. Clin. Microbiol. Newsl. 17, 22–24 (1995) 71. Power E.G.M., Abdulla Y.H., Talsania H.G., Spice W., Aathithan S., French G.L.: Van A genes in vancomycin-resistant clinical isolates of Oerskovia turbata and Arcanobacterium (Corynebacterium haemolyticum). J. Antimicrob. Chemother. 36, 595–606 (1995) 72. Rahman M.K., Holz E.R.: Alcaligenes xylosoxidans and Propionibacterium acnes postoperative endophthalmitis in a pseudophakic eye. Am. J. Ophthalmol. 129, 813–815 (2000) 73. Ramos C.P., Foster G., Collins M.D.: Phylogenetic analysis of the genus Actinomyces based on 16S r RNA gene sequences: description of Arcanobacterium phocae sp. nov., Arcanobacterium bernardiae comb. nov., and Arcanobacterium pyogenes comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 46–53 (1997) 74. Ramos J.M., Esteban J., Soriano F.: Isolation Propionibacterium acnes from central nervous system infections. Anaerobe, 1, 17–20 (1995) 75. Reddy I., Ferguson D.A. Jr, Sarubbi F.A.: Endocarditis due to Actinomyces pyogenes. Clin. Infect. Dis. 25, 1476–1477 (1997) 76. Reller L.B., Maddoux G.L., Eckman M.R., Pappas G.: Bacterial endocarditis caused by Oerskovia turbata. Ann. Intern. Med. 83, 664–666 (1975) 77. Renaud F.N.R., Grégory A., Barreau C., Aubel D., Freney J.: Identification of Turicella otitidis isolated from a patient with otorrhea associated with surgery: differentiation from Corynebacterium afermentans and Corynebacterium auris. J. Clin Microbiol. 34, 2625–2627 (1996) 78. Roberts M.C., Leonard R.B., Briselden A., Schoenknecht F.D., Coyle M.B.: Characterization of antibiotic-resistant Corynebacterium striatum strains. J. Antimicrob. Chemother. 30, 463–474 (1992) 79. Romero-Steiner S., Witek T., Balish E.: Adherence of skin bacteria to human epithelial cells. J. Clin. Microbiol. 28, 27–310 (1990) 80. Setz U., Frank U., Anding K., Garbe A., Daschner F.D.: Shunt nephritis associated with Propionibacterium acnes. Infection, 22, 99–101 (1994) 81. Sheretz R.J., Raad I.I., Belani A., Koo L.C., Rand K.H., Pickett D.L., Straub S.A., Fauerbach L.L.: Three-year experience with sonicated vascular catheter cultures in a clinical microbiology labolatory. J. Clin. Microbiol. 28, 76–82 (1990)

400

82. Shore K.P., Pottumarthy S., Morris A.J.: Susceptibility of anaerobic bacteria in Auckland: 1991–1996. N. Z. Med. J. 112, 424–426 (1999) 83. Simonet M., de Briel D., Boucot I., Minck R., Veron M.: Coryneform bacteria isolated from middle ear fluid. J. Clin. Microbiol. 31, 1667–1668 (1993) 84. Smith R.F.: Characterization of human cutaneous lipophilic diphtheroids. J. Gen. Microbiol. 55, 433–443 (1969) 85. Soriano F., Fernández-Roblas R., Calvo R., García-Calvo G., Pardeiro M., Bryskier A.: In-vitro antimicrobial activity of HMR 3004 (RU 64004) against erythromycin sensitive and resistant Corynebacterium spp. isolated from clinical specimens. J. Antimicrob. Chemother. 42, 647–649 (1998) 86. Soriano F., Fernández-Roblas R., Calvo R., García-Calvo G.: In vitro susceptibilities of aerobic and facultative non-spore-forming gram-positive bacilli to HMR 3647 (RU 66647) and 14 other antimicrobials. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 1028–1033 (1998) 87. Soriano F., Zapardiel J., Nieto E.: Antimicrobial susceptibilitis of Corynebacterium species and other non-spore-forming gram-positive bacilli to 18 antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 208–214 (1995) 88. Sulkowski M.S., Abolnik I.Z., Morris E.I., Granger D.L.: Infectious arthritis due to Propionibacterium acnes in a prosthetic joint. Clin. Infect. Dis. 19, 224–225 (1994) 89. Szarapiñska-Kwaszewska J., Mikucki J.: Wykorzystywanie przez gronkowce sideroforów wytwarzanych przez maczugowce i dyfteroidy. Med. Doœw. Mikrobiol. 49, 131–140 (997) 90. Tang Y.W., von Graevenitz A., Waddington M.G., Hopkins M.K., Smith D.H., Li H., Kolbert C.P., Montgomery S.O., Persing D.H.: Identification of coryneform bacterial isolates by ribosomal DNA sequence analysis. J. Clin. Microbiol. 38, 1676–1678 (2000) 91. Tauch A., Pühler A., Kalinowski J., Thierbach G.: TetZ, a new tetracycline resistance determinant discovered in gram-positive bacteria, shows high homology to gram-negative regulated efflux systems. Plasmid, 44, 285–291 (2000) 92. Tauch A., Zheng Z., Pühler A., Kalinowski J.: Corynebacterium striatum chloramphenicol resistance transpozon Tn5564: genetic organization and transposition in Corynebacterium glutamicum. Plasmid. 40, 126–139 (1998) 93. von Graevenitz A., Pünter-Streit V., Riegel P., Funke G.: Coryneform bacteria in throat cultures of healthy individuals. J. Clin. Microbiol. 36, 2087–2088 (1998) 94. Wallet F., Perez T., Roussel-Delvallez M.: Rothia dentocariosa two new cases of pneumonia revealing lung cancer. Scand. J. Infect. Dis. 29, 419–420 (1997) 95. Wauters G., Charlier J., Janssens M., Delmee M.: Identification of Arthrobacter oxydans, Arthrobacter luteolus sp. nov., and Arthrobacter albus sp. nov., isolated from human clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 38, 2412–2415 (2000) 96. Weiss K., Laverdière M., Rivest R.: Comparison of antimicrobial susceptibilities of Corynebacterium species by broth microdilution and disk diffusion methods. Antimicrob. Agents Chemother. 40, 930–933 (1996) 97. White C.B., Foshee W.S.: Upper respiratory tract infections in adolescents. Adolesc. Med. 11, 225–249 (2000) 98. Yoshimura H., Kojima A., Ishimaru M.: Antimicrobial susceptibility of Arcanobacterium pyogenes isolated from cattle and pigs. Zentr. Veterinarmed. B. 47, 139–143 (2000) 99. Zapardiel J., Nieto E., Gegundez I.M., Gadea I., Soriano F.: Problems in minimum inhibitory concentration determinations in coryneform organism. Diag. Microbiol. Infect. Dis. 19, 171–173 (1994) 100. Zapardiel J., Nieto E., Soriano F.: Urinary tract infections caused by beta-lactam-sensitive Corynebacterium urealyticum strains. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16, 174–175 (1997) Katedra i Zak³ad Mikrobiologii Akademii Medycznej w Bydgoszczy ul. M. Sk³odowskiej-Curie 9, 85-094 Bydoszcz, e-mail: [email protected] Wp³ynê³o w styczniu 2003 r.

401

POST. MIKROBIOL., 2003, 42, 4, 403–418 http://www.pm.microbiology.pl

ZNACZENIE CORYNEBACTERIUM SP. W ZAKA¯ENIACH SZPITALNYCH

Agnieszka Mikucka

1. Epidemiologia zaka¿eñ z udzia³em Corynebacterium sp. 2. Oportunistyczne gatunki Corynebacterium sp. o znaczeniu klinicznym. 2.1. Lipofilne gatunki Corynebacterium sp. 2.1.1. Corynebacterium jeikeium. 2.1.2. Corynebacterium urealyticum. 2.1.3. Corynebacterium lipophiloflavum. 2.2. Nielipofilne gavwnki Corynebacterium sp. 2.2.1. Corynebacterium xerosis. 2.2.2. Corynebacterium minutissimum. 2.2.3. Corynebacterium striatum. 2.2.4. Corynebacterium amycolatum. 2.2.5. Corynebacterium pseudodiphtheriticum. 2.2.6. Corynebacterium afermentans, Corynebacterium propinquum. 3. Podsumowanie Significance of Corynebacterium spp. in hospital infections Abstract: Corynebacterium species are widely distributed in the environment and are prominent members of the normal skin and mucous membrane flora. These organisms are often regarded as contaminants, with little or no capacity to cause human infections. Recent evidence suggests that the nondiphtherial corynebacteria cause a spectrum of clinical illnesses including skin, urinary tract infections, and endocarditis, sepsis, pneumonia, osteomyelitis, endophtalmitis. More and more often multiple resistante species are isolated, mostly C. urealyticum, C. jeikeium and C. amycolatum. Corynebacterium infections occurred mainly in patients hospitalized for a long period who are severly immunocompromised and elderly. A certain percentage of corynebacteria isolated from clinical specimens still represents undescribed taxa, and make problem with identification and susceptibility testing. However, the predominant of corynebacteria in material from normally sterile sites should be considered as a possible cause of disease. This review presents the species characteristic, which can have meaning in human infections. 1. Infections epidemiology of Corynebacterium spp. 2. Clinical significance of opportunistic Corynebacterium spp. 2.1. Lipophilic Corynebacterium spp. 2.1.1. Corynebacterium jeikeium. 2.1.2. Corynebacterium urealyticum. 2.1.3. Corynebacterium lipophiloflavum. 2.2. Nonlipophilic Corynebacterium spp. 2.2.1. Corynebacterium xerosis. 2.2.2. Corynebacterium minutissimum. 2.2.3. Corynebacterium striatum. 2.2.4. Corynebacterium amycolatum. 2.2.5. Corynebacterium pseudodiphtheriticum. 2.2.6. Corynebacterium afermentans., Corynebacterium propinquum 3. Conclusions

1. Epidemiologia zaka¿eñ z udzia³em Corynebacterium sp. Corynebacterium sp. inne ni¿ C. diphtheriae wystêpuj¹ powszechnie jako komensale skóry i b³on œluzowych oraz w œrodowisku cz³owieka. Uczestnicz¹ w zaka¿eniach oportunistycznych, tzn. wywo³uj¹ zaka¿enia u osób z os³abionym uk³adem odpornoœciowym. Grupê ryzyka stanowi¹ pacjenci hospitalizowani, a opisane czynniki predysponuj¹ce to d³ugi okres pobytu chorego w szpitalu, szerokozakresowa antybiotykoterapia, sterydo- i immunoterapia, wiek powy¿ej 55 lat, choroby podstawowe (choroba niedokrwienna serca, zastoinowa niewydolnoœæ serca, niewydolnoœæ nerek, 403

niewydolnoœæ oddechowa, cukrzyca), w tym choroby nowotworowe (bia³aczka, ch³oniak, szpiczak mnogi, niedokrwistoœæ aplastyczna, rak odbytu, rak przewodowy sutka, rak pêcherza moczowego), uraz wielonarz¹dowy, zaka¿enia wirusami HIV, CMV, wczeœniactwo. Zaka¿eniom sprzyja stosowanie inwazyjnych procedur diagnostycznych i leczniczych (amputacje, zabiegi urologiczne, transplantacje narz¹dów, szpiku kostnego, mechaniczna wentylacja, hemodializa, dializa otrzewnowa, wszczepianie protez naczyniowych, sztucznych zastawek) zwi¹zanych z przerwaniem ci¹g³oœci skóry i b³on œluzowych (kaniulacja ¿y³y centralnej, cewnikowanie pêcherza moczowego, serca, tracheostomia) [2, 9, 19, 29, 30, 60, 73, 82, 88, 89, 97]. Antybiotykoterapia jest g³ównym czynnikiem sprzyjaj¹cym selekcji szczepów opornych i zasiedlaniu przez nie powierzchni skóry, g³ównie pachwin, okolic krocza i odbytu. Stwierdzono, ¿e od pacjentów hospitalizowanych czêœciej izolowano szczepy Corynebacterium sp. o wielorakiej opornoœci na antybiotyki ni¿ od osób nie leczonych w szpitalu [29, 49, 85]. Nie jest znany mechanizm nabywania opornoœci przez coryneform bakterie. Prawdopodobnie ma to miejsce ju¿ w uk³adzie pokarmowym [49], gdzie pa³eczki Gram-ujemne przekazuj¹ geny opornoœci maczugowcom, które nastêpnie kolonizuj¹ skórê. S¹ to jedynie hipotezy. Opisano tak¿e szczepy S. epidermidis z identycznym profilem opornoœci jak izolowane w tym samym czasie od tego samego pacjenta wielooporne szczepy Corynebacterium sp. [97]. W zwi¹zku z powszechnym wystêpowaniem maczugowców na skórze i b³onach œluzowych cz³owieka zaka¿enia z ich udzia³em maj¹ najczêœciej charakter endogenny (zaka¿enia z udzia³em drobnoustrojów stanowi¹cych w³asn¹ florê pacjenta). Mo¿liwoœæ zaka¿eñ egzogennych (zaka¿enia z udzia³em drobnoustrojów pochodz¹cych od innego chorego lub personelu medycznego, a tak¿e z rezerwuaru szpitalnego) wieloopornymi szczepami coryneform budzi wiele kontrowersji. Wiadomo, ¿e szczepy Corynebacterium sp. mog¹ przetrwaæ w warunkach szpitalnych kilka miesiêcy [88]. Wielooporne szczepy o tym samym profilu opornoœci izolowano od pacjentów, z r¹k personelu medycznego oraz z przedmiotów i powietrza szpitalnego [44, 49]. Ju¿ w 1981 roku Young [97] sugerowa³ mo¿liwoœæ nabywania przez chorych, wieloopornych szczepów ze œrodowiska szpitalnego. W 1996 roku B r a n d e n b u r g i wsp. [9] izolowali wielooporne szczepy C. striatum z plwociny, krwi, wysiêku z rany od pacjentów leczonych w oddziale intensywnej terapii oraz z r¹k personelu medycznego, powietrza i powierzchni przedmiotów. W badaniach metod¹ RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) – amplifikacji polimorficznych fragmentów DNA stwierdzono, ¿e szczepy prezentowa³y ten sam wzór. 2. Oportunistyczne gatunki Corynebacterium sp. o znaczeniu klinicznym 2.1. Lipofilne gatunki Corynebacterium sp. S¹ to drobnoustroje zwykle wolnorosn¹ce, wymagaj¹ce do wzrostu substancji t³uszczowych, np. Tweenu 80. Po 48 godzinach hodowli w temperaturze 37°C na pod³o¿u z 5% krwi¹ barani¹ rosn¹ w postaci drobnych kolonii o œrednicy mniejszej 404

ni¿ 1 mm. Na pod³o¿ach p³ynnych wzbogaconych Tweenem 80 rosn¹ obficie, na sta³ych po 24–48 godzinach hodowli tworz¹ kolonie o œrednicy 2–4 mm [28, 68]. Opisywane wczeœniej jako skórne lipofilne dyfteroidy (LD) [43], dopiero niedawno zosta³y sklasyfikowane. S m i t h w 1969 roku [79] wyró¿ni³ VII grup biochemicznych LD, a M c G i n l e y i wsp. w 1985 roku [57] w zwi¹zku z obecnoœci¹ u wszystkich badanych szczepów kwasu dwuaminopimelinowego i korynemykolowego zaproponowali utworzenie, jednego gatunku C. lipophilicus. Zainteresowanie t¹ grup¹ drobnoustrojów zwi¹zane jest z gatunkami C. jeikeium i C. urealyticum, które obecnie maj¹ ju¿ ugruntowan¹ pozycjê jako wielooporne oportunistyczne coryneform bakterie [28, 48]. Lipofilne s¹ równie¿ gatunki C. accolens [61] (dawniej C. grupa G-1) izolowane z krwi od pacjentów z zapaleniem wsierdzia [14], C. macginleyi izolowane z wydzieliny oka [40, 71] oraz C. afermentans subsp. lipophilum [68] i C. lipophiloflavum [26]. R i e g e l [71] na podstawie hybrydyzacji DNA-DNA wyró¿ni³ wœród lipofilnych szczepów Corynebacterium sp. 5 grup DNA. 2.1.1. Corynebacterium jeikeium W 1970 roku J o h n s o n i K a y e [38] opisali przypadki izolacji dyfteroidów z zaka¿onej rany, ropni (w tym ropnia mózgu), zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenia wsierdzia na zmienionych reumatoidalnie i sztucznych zastawkach, bakteriemii. Szeœæ lat póŸniej H a n d e i wsp. [31] wyizolowali z krwi 4 pacjentów z posocznic¹ „nowe gatunki Corynebacterium”. W 1977 roku P e a r s o n [64] opisa³ 12 przypadków zaka¿eñ dyfteroidami u pacjentów po transplantacji szpiku, a w 1979 roku R i e l e y [72] scharakteryzowa³ cechy biochemiczne 95 wieloopornych szczepów Corynebacterium sp. i zaproponowa³ nazwê – grupa JK (Johnson-Kaye), CDC grupa JK. Od tego czasu przedstawiono szereg przypadków izolacji Corynebacterium grupy JK. W latach 1980–86 opisano zaka¿enia u pacjentów na oddzia³ach intensywnej terapii, posocznice u osób chorobami nowotworowymi, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u chorych z ch³oniakiem, zaka¿enia u osób z wszczepionym stymulatorem serca, zapalenie wsierdzia na zastawkach sztucznych, zapalenie otrzewnej po CAPD (Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis, przewlek³a dializa otrzewnowa) i zaka¿enie gwoŸdzia Künchera u pacjenta ze z³amaniem koœci piszczelowej [7, 14, 88]. W 1987 roku Jackman i wsp. [36] zaproponowali utworzenie gatunku C. jeikeium. S¹ to pleomorficzne, czasem maczugowate pa³eczki, tworz¹ce uk³ady k¹towe. Rosn¹ w warunkach œciœle tlenowych. Na pod³o¿u z krwi¹ barani¹ po 24 godzinach hodowli tworz¹ drobne, g³adkie, szarobia³e kolonie o œrednicy 0,5–1 mm [7, 72]. Wystêpuj¹ g³ównie w okolicach pachwinowych, pachowych i okolicy oko³oodbytniczej [85] Najczêœciej zaka¿enia dotycz¹ pacjentów z nowotworami krwi [88] ostr¹ bia³aczk¹ szpikow¹ i ostr¹ bia³aczk¹ limfatyczn¹, neutropeni¹ oraz chorych po transplantacji szpiku, ze sztucznymi zastawkami, z cewnikami do¿ylnymi. Mog¹ byæ przyczyn¹ zaka¿enia tkanek miêkkich, uk³adu moczowego, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, p³uc, otrzewnej, zapalenia wsierdzia, posocznicy, zapalenia koœci i stawów oraz zaka¿enia endoprotez [19, 24, 30, 45, 73, 76, 89, 94, 96, 99]. Opisano 405

przypadek grudkowatych wykwitów skórnych z ich udzia³em [41]. Zaka¿enia C. jeikeium najczêœciej dotycz¹ mê¿czyzn po 60 roku ¿ycia i kobiet w wieku pomenopauzalnym. Natomiast rzadko wystêpuj¹ u dzieci [88]. W 1994 R i e g e l [69] stosuj¹c metodê hybrydyzacji DNA-DNA wyró¿ni³ 4 grupy DNA (A, B, C, D), które ró¿ni³y siê opornoœci¹ na antybiotyki. Szczepy C. jeikeium zwykle s¹ oporne na wiêkszoœæ antybiotyków, z wyj¹tkiem glikopeptydów, na które s¹ wra¿liwe [72, 85]. 2.1.2. Corynebacterium urealyticum F r a n c o i s w 1914 roku [wg 2] opisa³ wystêpowanie z³ogów fosforanowych w ropnych owrzodzeniach œciany pêcherza i w nerkach, a C i f u e n t e s w 1947 roku [wg 82] izolowa³ ureazo-dodatnie maczugowate pa³eczki z moczu od pacjenta z zapaleniem pêcherza z obecnoœci¹ alkalicznych z³ogów. Przypadek zapalenia wsierdzia z udzia³em coryneform o profilu biochemicznym odpowiadaj¹cym CDC grupa D2 opisano w 1973 roku [wg 82], a zapalenia p³uc z udzia³em CDC grupa D2 w roku 1979 [37]. W 1981 roku Yo u n g [97] wyizolowa³ ureazo-dodatnie szczepy Corynebacterium sp. od pacjentów z oddzia³u intensywnej terapii. Od 1985 roku [2, 84] zaczê³y pojawiaæ siê doniesienia o zaka¿eniach dróg moczowych z udzia³em tych bakterii. W 1992 roku P i t c h e r [65] zaproponowa³ nazwê gatunku C. urealyticum. W latach 90. ubieg³ego stulecia [18, 74] uznano C. urealyticum za wa¿ny oportunistyczny czynnik etiologiczny zaka¿eñ szpitalnych, najczêœciej odpowiedzialny za zaka¿enia uk³adu moczowego [1, 33, 59, 60]. Opisano zaka¿enia ran, zapalenie p³uc, koœci i stawów, zapalenie otrzewnej po CAPD, zapalenie wsierdzia na zastawce wszczepionej oraz bakteriemie po transplantacji nerki [18, 59, 83, 95]. Zaka¿enia dotycz¹ najczêœciej osób z obni¿on¹ odpornoœci¹, cewnikowanych, z chorobami lub urazami w obrêbie uk³adu moczowego. Opisano przypadki bakteriemii nie zwi¹zanej z zaka¿eniem uk³adu moczowego [95], nekrotyczne zapalenie tkanek miêkkich u dzieci z neutropeni¹ [75] oraz torbieli nerki z udzia³em C. urealyticum u niehospitalizowanej, 87-letniej kobiety [63]. C. urealyticum mo¿e byæ odpowiedzialny za zaka¿enia uk³adu moczowego u zwierz¹t domowych [62]. Szczepy C. urealyticum na pod³o¿ach z krwi¹ po 24–48 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C rosn¹ w postaci ma³ych, szarobia³ych, b³yszcz¹cych, nieprzejrzystych, okr¹g³ych kolonii [74]. C. urealyticum wytwarza du¿e iloœci ureazy (hydroliza mocznika po 5 minutach na pod³o¿u Christensena) [26], alkalizuj¹c mocz przyczynia siê do powstawania z³ogów fosforanów magnezowo-amonowych (struwitu) w pêcherzu i nerkach [84]. C. urealyticum kolonizuje skórê cz³owieka g³ównie w okolicach pachwin, pach i fa³dów brzusznych [29, 82]. Podobnie jak C. jeikeium najczêœciej jest oporny na wiele antybiotyków [59, 82]. Rybotypowanie (16S rRNA) wykaza³o 98% homologii miêdzy tymi gatunkami [69]. 2.1.3. Corynebacterium lipophiloflavum W 1997 roku [26] wyosobniono z wydzieliny pochwy od pacjentki z bakteryjn¹ waginos¹ nowy lipofilny gatunek. C. lipophiloflavum daje identyczny jak C. urealy406

Gatunki Corynebacterium sp. znane do 1995 roku [wg 28, 71] Wed³ug Bergey’s Manual [39]

Gatunek

Tabela I

Rok opisu

Poprzednia nazwa

C. diphtheriae

C. variabile

1987

Arthrobacter variabilis

C. pseudotuberculosis

C. jeikeium

1987

CDC JK

C. xerosis

C. amycolatum

1988

CDC F-2, I-2

C. pseudodiphtheriticum

C. accolens

1991

CDC G-1

C. kutscheri*

C. urealyticum

1992

CDC D2

C. minutissimum

C. afermentans

1993

CDC ANF-1

C. striatum

C. propinquum

1993

CDC ANF-3

C. renale* C. cystitidis*

C. macginleyi

1995

CDC G-1

C. pilosum** C. mycetoides*

C. ulcerans

1995

„C. ulcerans”

C. matruchotii* C. flavescens*

C. argentoratense

1995

CDC ANF-1

C. vitarumen* C.glutamicum*

C. glucuronolyticum

1995

C. renale

C. callunae* C. bovis*

C. auris

1995

C. kutscheri

1995

CDC F-1

C. paurometabolum C. seminale (obecnie Tsukamurella paurometabola)

ticum profil biochemiczny w testach API Coryne (bio-Mérieux), jednak w odró¿nieniu od C. urealyticum wytwarza ¿ó³ty barwnik i powoli hydrolizuje mocznik (po 12 godzinach na pod³o¿u Christensena). 2.2. Nielipofilne gatunki Corynebacterium sp. 2.2.1. Corynebacterium xerosis W latach 80. i 90. XX wieku opisano szereg szczepów tego gatunku wyosobnionych od pacjentów po zabiegach chirurgicznych, immunosupresji, z nowotworami krwi [46, 51, 90]. Z udzia³em szczepów C. xerosis, w tym równie¿ o wielorakiej opornoœci na antybiotyki [51, 90], odnotowano zaka¿enia uk³adu oddechowego, koœci i stawów, zapalenia œródpiersia. Izolowano je równie¿ z krwi, ropy i z drenów [46, 66]. Obecnie jest to drobnoustrój rzadko wystêpuj¹cy w materia³ach klinicznych. C. xerosis charakteryzuje zró¿nicowanie wewn¹trzgatunkowe. Wœród szczepów referencyjnych wyró¿niono 6 grup DNA (A-F), przy czym grupa A by³a biochemicznie identyczna ze szczepem C. striatum [17]. Maczugowce te kolonizuj¹ skórê i b³ony œluzowe cz³owieka. Na pod³o¿u z krwi¹ barani¹ rosn¹ w postaci suchych, szorstkich, ¿ó³tawych kolonii przypominaj¹cych szybkorosn¹ce gatunki Mycobacterium sp. [28]. 2.2.2. Corynebacterium minutissimum Gatunek opisany przez C o l l i n s a w 1983 roku [16], izolowany w 1961 roku ze zmian skórnych pacjenta z ³upie¿em rumieniowym [77]. Zarówno zmiany na 407

Tabela II

Gatunki Corynebacterium sp. opisane po 1996 roku Gatunek

Rok opisu

Rodzaj materia³u/gospodarz, z którego izolowano pierwszy szczep

Piœmiennictwo podano pod tabel¹

C. durum

1997

Pop³uczyny oskrzelowe

[18]

C. mucifaciens

1997

Krew, p³yn stawowy, wymaz z rany

[12]

C. lipophiloflavum

1997

Wymaz z pochwy

[11]

C. mastitidis

1997

Mleko owcze

[7]

C. imitans

1997

Wymaz z gard³a

[10]

C. coyleae

1997

Krew, p³yn op³ucnowy

[15]

C. singulare

1997

Materia³ kliniczny

[19]

C. falsenii

1998

Krew, p³yn mózgowo-rdzeniowy

[20]

C. phocae

1998

Wymaz z jamy nosowej

[16]

C. kroppenstedtii

1998

Plwocina

[3]

C. thomssenii

1998

P³yn op³ucnowy

[25]

C. riegelli

1998

Mocz

[13]

C. confusum

1998

Krew, wymaz ze zmiany skórnej

[14]

C. camporealensis

1998

Wymaz z wymion owiec

[8]

C. sundsvalense

1999

Wk³adka wewn¹trzmaciczna, krew, wymaz z pachwiny

[2]

C. terpenotabidum

1999

Gleba

[21]

C. auriscanis

1999

Wymaz z ucha psa

[6]

C. simulans

2000

?

[22]

C .capitovis

2001

Skóra g³owy owcy

[4]

C. casei

2001

Powierzchnia sera

[1]

C. felinum

2001

Dziki kot

[5]

C. freneyi

2001

Materia³ kliniczny (3 szczepy)

[17]

C. mooreparkense

2001

Powierzchnia sera

[1]

C. testudinoris

2001

¯ó³w

[5]

C. appendicis

2002

Materia³ kliniczny

[23]

C. aurimucosum

2002

Materia³ kliniczny

[24]

C. efficiens

2002

Gleba, próbki warzyw

[9]

* nie zwi¹zane obecnie z zaka¿eniami u cz³owieka ** opisano zapalenie wsierdzia z udzia³em tego gatunku [80]

[1] Brennan N.M., Brown R., Goodfellow M., Ward A.C., Beresford T.P., Simpson P.J., Fox P.F., Cogan T.M.: Corynebacterium mooreparkense sp. nov. and Corynebacterium casei sp. nov., isolated from the surface of smear-ripened cheese. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 843–852 (2001); [2] Collins M.D., Bernard K.A., Hutson R.A., Sjöden B., Nyberg A., Falsen E.: Corynebacterium sundsvallense sp. nov., from human clinical specimens. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 361–366 (1999); [3] Collins M.D., Falsen E., Åkervall E., Sjöden B., Alvarez A.: Corynebacterium kroppenstedtii sp. nov., a novel Corynebacterium that does not contain mycolic acids. Int. J. Syst. Bacteriol. 48,

408

1449–1454 (1998); [4] Collins M.D., Hoyles L., Foster G., Sjoden B., Falsen E.: Corynebacterium capitovis sp. nov., from a sheep. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 857–860 (2001); [5] Collins M.D., Hoyles L., Hutson R.A., Fosterr G., Falsen E.: Corynebacterium testudinoris sp. nov., from tortoise, and Corynebacterium felinum sp. nov., from Scottish wild cat. Int. J. Syst. Bacteriol. 51, 1349–52 (2001); [6] Collins M.D., Hoyles L., Lawson P.A., Falsen E., Robson R.L., Foster G.: Phenotypic and phylogenetic characterization of a new Corynebacterium species from dogs: description of Corynebacterium auriscanis sp. nov. J. Clin Microbiol. 37, 3443–3447 (1999); [7] Fernandez-Garayzábal J.F., Collins M.D., Hutson R.A., Fernandez E., Monasterio R., Marco J., Dominguez L.: Corynebacterium mastitidis sp. nov., isolated from milk of sheep with subclinical mastitis. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 1082–1085 (1997); [8] Fernández-Garayzábal J.F., Collins M.D., Hutson R.A., Gonzales I., Fernández E., Domínguez L.: Corynebacterium camporealensis sp. nov., associated with subclinical mastitis in sheep. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 463–468 (1998); [9] Fudou R., Jojima Y., Seto A., Yamada K., Kimura E., Nakamatsu T., Hiraishi A., Yamanaka S.: Corynebacterium efficiens sp. nov., a glutamic-acid-producing species from soil and vegetables. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 1127–1131 (2002); [10] Funke G., Efstratiou A., Kukliñska D., Hutson R.A., de Zoysa A., Engler K.H., Collins M.D.: Corynebacterium imitans sp. nov. isolated from patients with suspected diphtheria. J. Clin. Microbiol. 35, 1978–1983 (1997); [11] Funke G., Hutson R.A., Hilleringmann M., Heizmann W.R., Collins M.D.: Corynebacterium lipophiloflavum sp. nov. isolated from a patient with bacterial vaginosis. FEMS Microbiol. Lett. 150, 219–224 (1997); [12] Funke G., Lawson P.A., Collins M.D.: Corynebacterium mucifaciens sp. nov., an unusual species from human clinical material. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 952–957 (1997); [13] Funke G., Lawson P.A., Collins M.D.: Corynebacterium riegelli sp. nov., an unusual species isolated from female patients with urinary tract infections. J. Clin. Microbiol. 36, 624–627 (1998); [14] Funke G., Osorio C.R., Frei R., Riegel P., Collins M.D.: Corynebacterium confusum sp. nov., isolated from human clinical specimens. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 1291–1296 (1998); [15] Funke G., Pascual R.C., Collins M.D.: Corynebacterium coyleae sp. nov., isolated from human clinical specimens. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 92–96 (1997); [16] Pascual C., Foster G., Alvarez N., Collins M.D.: Corynebacterium phocae sp. nov., isolated from the common seal (Phoca vitulina). Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 601–604 (1998); [17] Renaud F.N., Aubel D., Riegel P., Meugnier H., Bollet C.: Corynebacterium freneyi sp. nov., alpha-glucosidasepositive strains related to Corynebacterium xerosis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1723–1728 (2001); [18] Riegel P., Heller R., Prévost G., Jehl F., Monteil H.: Corynebacterium durum sp. nov., from human clinical specimens. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 1107–1111 (1997); [19] Riegel P., Ruimy R., Renaud F.N.R., Freney J., Prévost G., Jehl F., Christen R., Monteil H.: Corynebacterium singulare sp. nov., a new species for urease-positive strains related to Corynebacterium minutissimum. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 1092–1096 (1997); [20] Sjödén B., Funke G., Izquierdo A., Akervall E., Collins M.D.: Description of some coryneform bacteria isolated from human clinical specimens as Corynebacterium falsenii sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 69–74 (1998); [21] Takeuchi M., Sakane T., Nihira T., Yamada Y., Imai K.: Corynebacterium terpenotabidum sp. nov., a bacterium capable of degrading squalene. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 223–229 (1999); [22] Wattiau P., Janssens M., Wauters G.: Corynebacterium simulans sp. nov., a non-lipophilic, fermentative Corynebacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 347–353 (2000); [23] Yassin A.F., Steiner U., Ludwig W.: Corynebacterium appendicis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 1165–1169 (2002); [24] Yassin, A.F., Steiner U., Ludwig W.: Corynebacterium aurimucosum sp. nov. and emended description of Corynebacterium minutissimum Collins and Jones (1983). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 1001–1005 (2002); [25] Zimmermann O., Spröer C., Kroppenstedt R.M., Fuchs E., Köchel H.G., Funke G.: Corynebacterium thomssenii sp. nov., a Corynebacterium with N-acetyl-b-glucosaminidase activity from human clinical specimens. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 489–494 (1998)

409

Tabela III

LipofilnoϾ

O/F

Reduktaza azotanowa

Pyrazinamidaza

Fosfataza alkaliczna

Ureaza

Hydroliza eskuliny

Esteraza Tween 80

Fermentacja glukozy

Fermentacja maltozy

Fermentacja sacharozy

CAMP test

Ró¿nicowanie niektórych gatunków Corynebacterium sp. [28, 71]

C. accolens

+

F

+

+/–

–

–

–

+

–

–

+/–

–

C. afermentans subsp. afermentans subsp. lipophilum

– +

O O

– –

+ +

– +

– –

– –

– +

– –

– –

– –

+/– +/–

C. amycolatum

–

F

+/–

+

+

+/–

–

–

+

+/–

+/–

–

C. argentoratense

–

F

–

+

+/–

–

–

–

+

–

–

–

C. auris

–

O

–

+

+

–

–

–

–

–

–

+

C. coyleae

–

F

–

+

+

–

–

–

+/–

–

–

+

C. glucuronolyticum

–

F

+/–

+

–

+/–

+/–

+/–

–

+

+/–

+

C. jeikeium

–

O

–

+

+

–

–

+

+

+/–

–

–

C. macginleyi

+

F

+

–

+

–

–

+

+

–

+

–

C. minutissimum

–

F

–

+

+

–

–

+

+

+

+/–

–

C. propinquum

–

O

+

+

+/–

–

–

–

–

–

–

–

C. pseudodiphtheriticum

–

O

+

+

+/–

+

–

–

–

–

–

– –

Gatunek

C. striatum

–

F

+

+

+

–

–

+

+

–

+/–

C. urealyticum

+

O

–

+

+/–

+

–

+

–

–

–

–

C. xerosis

–

F

+/–

+

+

–

–

–

+

+

+

–

+ – wynik dodatni, – – wynik ujemny, +/– – ró¿nie, O – utlenianie, F – fermentacja

skórze, jak i wyizolowane maczugowce dawa³y pomarañczow¹ fluorescencjê w lampie Wooda. Obecnie nie wyklucza siê udzia³u C. minutissimum w ³upie¿u rumieniowym, ale kolejne doniesienia sugeruj¹ udzia³ ró¿nych gatunków drobnoustrojów. Fluoryzuj¹ce coryneform bakterie izolowano równie¿ ze zdrowej skóry i ze zmian skórnych nie zwi¹zanych z ³upie¿em rumieniowym, a szczepy prezentuj¹ce 8 typów biochemicznych odpowiada³y gatunkom: C. xerosis, C. bovis, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis i C. renale [81]. C. minutissimum na pod³o¿u z krwi¹ tworzy po 24 godzinach hodowli w temperaturze 37°C g³adkie, b³yszcz¹ce, wypuk³e kolonie, o œrednicy 1–1,5 mm [67]. Niewiele jest doniesieñ na temat zaka¿eñ szpitalnych z udzia³em C. minutissimum. Szczepy wra¿liwe na wiêkszoœæ antybiotyków izolowano z zapalenia ucha œrodkowego, uk³adu moczowego, ran, przetoki otrzewnej, têtniaków oraz cewnika do¿ylnego i cewnika do dializy otrzewnowej [98]. Opisano pojedyncze szczepy wielooporne wyizolowane z krwi [11], szczep wyosobniony 410

z martwaka koœci od chorego z przewlek³ym zapaleniem koœci i szpiku [49], a ostatnio z ropnia od pacjenta zaka¿onego HIV [4]. 2.2.3. Corynebacterium striatum Bakterie te opisa³ w 1889 roku v o n B e s s e r [wg 9] jako florê górnych dróg oddechowych. Nastêpnie wyizolowano je z przedsionka nosowego i opisano w 1901 roku jako Bacillus striatum [wg 9]. Ich obecnoœæ wykazano równie¿ w mleku krów z zapaleniem wymion [wg 39]. Szczepy tego gatunku s¹ szeroko rozpowszechnione w przyrodzie [93], s¹ komensalami skóry (czo³o, policzki, przednie nozdrza) i b³on œluzowych cz³owieka [91]. Na pod³o¿u z krwi¹ rosn¹ w postaci g³adkich, okr¹g³ych, szaro-bia³ych kolonii, przypominaj¹cych gronkowce koagulazo-ujemne [56]. Wokó³ g³êboko wrastaj¹cych kolonii mo¿e wyst¹piæ nieznaczna hemoliza [39]. Izolowano je z zapalenia ga³ki ocznej, ropnego zapalenia spojówek, zaka¿enia tkanek miêkkich, ran wysiêkowych, ropniaka, owrzodzenia, zapalenia b³on p³odowych po³¹czonych z zaka¿eniem uk³adu moczowego, zapalenia p³uc i op³ucnej, zapalenia wsierdzia, koœci i stawów, z zaka¿eñ uk³adu moczowego oraz z rurki tracheostomijnej, cewników i linii centralnych [6, 42, 53, 55, 58, 87, 91, 93]. Na uwagê zas³uguje fakt izolacji C. striatum od m³odej kobiety z ropnia klatki piersiowej [86], z p³ynu mózgowo-rdzeniowego od niemowl¹t i dzieci [35] oraz izolacje szczepów wieloopornych [wg 28, 58]. Opisano egzogenne zaka¿enia z udzia³em szczepu wytwarzaj¹cego br¹zowy barwnik u pacjentów na oddziale intensywnej terapii [50]. 2.2.4. Corynebacterium amycolatum Po raz pierwszy opisany przez C o l l i n s a w 1988 roku [15] jako nowy gatunek nie zawieraj¹cy kwasu mykolowego. Od 1996 roku z udzia³em C. amycolatum (dawniej „C. asperum”, CDC grupa F-2, CDC grupa I-2) opisano zapalenie wsierdzia, zapalenie otrzewnej, posocznicê, zapalenie koœci i stawów, przypadek wstrz¹su septycznego u noworodka. Izolowano je równie¿ z zaka¿eñ uk³adu moczowego, przetoki jamy brzusznej, z torbieli, ropnia, zaka¿onych ran pooperacyjnych oraz protezy [8, 20, 21, 23, 48]. Podobnie jak C. ulcerans, C. pseudotuberculosis i C. minutissimum, C. amycolatum izolowano z przypadków zapalenia wymion u byd³a [34]. W przesz³oœci bakterie te mylnie identyfikowano najczêœciej jako C. xerosis, C. minutissimum, C. striatum [27, 67, 92, 98]. Na pod³o¿u z krwi¹ barani¹ szczepy C. amycolatum po 24 godzinach hodowli w temperaturze 37°C rosn¹ w postaci ma³ych, suchych kolonii o œrednicy 0,5 mm, z nieregularnym brzegiem, o wygl¹dzie woskowym, przypominaj¹cym kolonie C. xerosis („xerosis-like”). Obecnie gatunek ten jest jednym z najczêœciej izolowanych maczugowców z materia³ów klinicznych. Czêsto oporny na wiele antybiotyków [wg 28, 58]. Czêstoœæ izolacji zale¿y od mo¿liwoœci identyfikacyjnych laboratoriów mikrobiologicznych [28]. W zwi¹zku z tym, ¿e metody genotypowania, okreœlania sk³adu kwasów t³uszczowych i profilu bia³kowego nie s¹ powszechnie dostêpne, a identyfikacja za pomoc¹ testu API Coryne (bio-Mérieux) nie jest wystarczaj¹ca (identyfikowane jako C. striatum/amycolatum lub C. jeikeium, C. grupa G, C. minutissimum, C. grupa I) [27, 58, 92, 98] proponowane s¹ dodatkowe testy ró¿nicuj¹ce (tab. IV). 411

Tabela IV Ró¿nicowanie gatunków C. amycolatum, C. minutissimum, C. striatum, C. xerosis [18, 27, 28, 92, 98] Gatunek C. amycolatum

Wzrost w FermenEsteraza Hydroliza Redukcja DNaza temperaturze tacja Tween 80 tyrozyny azotanów 20°C/3dni maltozy

Inne w³aœciwoœci

–

+(97%)

–

–

+/–

–

Oporny na 0/129*

C. minutissimum

–

+

+

+

–

+

UV (+)

C. striatum

+

–

–

–

C. xerosis

+

+

+

UV (+) ?

–

–

+

+ – wynik dodatni, – – wynik ujemny, +/– – ró¿nie, UV (+) – pomarañczowa fluorescencja w œwietle ultrafioletowym, UV (+) ? – prawdopodobnie pomarañczowa fluorescencja w œwietle ultrafioletowym, 0/129 – czynnik wibriostatyczny (2,4-diamino-6,7-diizopropylo-pterydyno-fosforan), * – wed³ug L a g r o u i wsp. [48] 37% szczepów wra¿liwych

2.2.5. Corynebacterium pseudodiphtheriticum Drobnoustrój wykryty przez H o f f m a n a i W e l l e n h o f a w 1888 roku [wg 52]. Wystêpuje u ludzi na b³onach œluzowych przedsionka nosowego i gard³a. Zaka¿enia dotycz¹ najczêœciej uk³adu oddechowego, przede wszystkim u osób z grup ryzyka (na³ogowe palenie papierosów, choroby uk³adu oddechowego, AIDS, immunosupresja, intubacja). Czasem objawy przypominaj¹ b³onicê [3, 10, 12, 25, 54]. Notowano przypadki zapalenia wsierdzia na naturalnych i sztucznych zastawkach, spowodowane prawdopodobnie przejœciow¹ bakteriemi¹ pochodz¹c¹ z górnych dróg oddechowych, jak równie¿ zaka¿enie przeszczepu skóry i zaka¿enie uk³adu moczowego u pacjenta po transplantacji nerki [32, wg 52]. Kolonie C. pseudodiphtheriticum (dawniej C. hoffmanii) po 48 godzinach hodowli w temperaturze 37°C s¹ suche i mog¹ mieæ œrednicê 1–2 mm. Dotychczas izolowane szczepy by³y wra¿liwe na wiêkszoœæ antybiotyków [3, 25]. 2.2.6. Corynebacterium afermentans Corynebacterium propinquum Corynebacterium grupa ANF (absolute nonfermenter, absolutnie niefermentuj¹ce) po raz pierwszy opisana w 1981 w CDC przez H o l l i s’ a i W e a v e r’ a [wg 13], zawiera izolowane od ludzi pa³eczki, które nie fermentuj¹ cukrów z wytwarzaniem kwasu i nie wytwarzaj¹ ureazy. W 1993 R i e g e l i wsp. [70] scharakteryzowali pod wzglêdem taksonomicznym C. ANF i zaproponowali obecnie obowi¹zuj¹ce nazwy. C. afermentans (dawniej C. grupa ANF-1) ró¿ni siê od C. propinquum (dawniej C. grupa ANF-3) brakiem reduktazy azotanowej [70]. Szczegó³owe badania chemotaksonomiczne oraz ró¿nice w zapotrzebowaniu na substancje t³uszczowe doprowadzi³y do wyró¿nienia w obrêbie C. afermentans podgatunku C. afermentans subsp. lipophilum i C. afermentans subsp. afermentans [68]. Doniesienia o ich izolacji z wysiêku w ostrym zapaleniu ucha œrodkowego u dzieci, a tak¿e skóry i krwi zwróci³y uwagê mikrobiologów na tê grupê drobnoustrojów. Wykazano 412

zwi¹zek C. afermentans subsp. lipophilum z przypadkiem zapalenia wsierdzia oraz z ropniem mózgu i w¹troby [22]. Szczepy tego gatunku, w tym o wielorakiej opornoœci na antybiotyki, wyosobniono równie¿ z wymazów z ran chirurgicznych, drenów i moczu [58]. Opisano posocznicê u chorego po zabiegu neurochirurgicznym i zaka¿enie linii centralnej z udzia³em C. afermentans subsp. afermentans [47]. C. propinquum izolowano od pacjentów z zaka¿eniem dróg oddechowych i zapaleniem wsierdzia [70]. Na agarze z krwi¹ barani¹ C. afermentans subsp. afermentans po 24-godzinnej inkubacji w 37°C tworzy kolonie o œrednicy 1–2 mm, szaro-bia³e, g³adkie. C. afermentans subsp. lipophilum na agarze z krwi¹ po 48-godzinnej hodowli w 37°C roœnie w postaci bardzo ma³ych kolonii, natomiast du¿e kolonie o œrednicy 2 mm tworzy na pod³o¿ach z dodatkiem Tween 80 [68]. C. propinquum na agarze z krwi¹ barani¹ tworzy obfity wzrost w warunkach tlenowych po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C, nie wymagaj¹c Tweenu 80. Kolonie s¹ matowe, o œrednicy 1–2 mm [13]. 3. Podsumowanie W piœmiennictwie polskim na temat Corynebacterium sp. s¹ pojedyncze doniesienia [43, 59, 78] a w laboratoriach mikrobiologicznych drobnoustroje te czêsto identyfikowane s¹ tylko z dok³adnoœci¹ do rodzaju i zwykle traktowane jako flora fizjologiczna, w zwi¹zku z tym nie wykonuje siê dla nich antybiogramów. Trudnoœci zwi¹zane z ocen¹ maczugowców jako patogenów wynikaj¹ zapewne z niewystarczaj¹cej znajomoœci Corynebacterium sp. innych ni¿ C diphtheriae oraz braku wspó³pracy klinicysta – mikrobiolog wyjaœniaj¹cej potrzebê przeprowadzenia dalszych badañ mikrobiologicznych. Brak dobrych systemów komercyjnych do identyfikacji utrudnia diagnostykê tych drobnoustrojów w laboratoriach klinicznych. Nie powinny byæ one jednak pomijane jako czynniki etiologiczne zaka¿eñ, gdy¿ mo¿e to byæ przyczyn¹ niepowodzeñ terapeutycznych, przed³u¿enia czasu hospitalizacji, wzrostu kosztów leczenia, czy nawet trwa³ych zmian w organizmie chorego. Jak sugeruj¹ F u n k e i wsp. [28], poznane i scharakteryzowane do tej pory gatunki prawdopodobnie stanowi¹ zaledwie „wierzcho³ek góry lodowej”. S¹ to drobnoustroje oportunistyczne, chorobotwórcze dla osób z obni¿on¹ odpornoœci¹, st¹d dla mikrobiologa ogromne znaczenie maj¹ informacje o pacjencie takie jak rozpoznanie kliniczne, miejsce pobrania materia³u do badañ mikrobiologicznych oraz stosowana dotychczasowa antybiotykoterpia.

Piœmiennictwo 1. Aguado J.M., Morales J.M., Salto E., Lumbreras C., Lizasoain M., Diaz-Gonzalez R., Martinez M.A., Andres A., Praga M., Noriega A.R.: Encrusted pyelitis and cystitis by Corynebacterium urealyticum (CDC group D2): a new and threatening complication following renal transplant. Transplantation, 56, 617–622 (1993)

413

2. Aguado J.M., Ponte C., Soriano F.: Bacteriuria with a multiply resistant species of Corynebacterium (Corynebacterium group D2): an unnoticed cause of urinary tract infection. J. Infect. Dis. 156, 144–150 (1987) 3. Ahmed K., Kawakami K., Watanabe K., Mitsushima H., Nagatake T., Matsumoto K.: Corynebacterium pseudodiphtheriticum: a respiratory tract pathogen. Clin. Infect. Dis. 20, 41–46 (1995) 4. Bandera A., Gori A., Rossi M.C., Degli-Esposti A., Ferrario G., Marchetti G., Tocalli L., Franzetti F.: A case of costochondral abscess due to Corynebacterium minutissimum in a HIV-infected patient. J. Infect. 41, 103–105 (2000) 5. Barreau C., Bimet F., Kiredjian M., Rouillon N., Bizet C.: Comparative chemotaxonomic studies of mycolic acid-free coryneform bacteria of human origin. J. Clin. Microbiol. 31, 2085–2090 (1993) 6. Batson J.H., Mukkamala R., Byrd R.P. Jr.: Pulmonary abscess due to Corynebacterium striatum. J. Tenn. Med. Assoc. 89, 115–116 (1996) 7. Bayston R., Higgins J.: Biochemical and cultural characteristics of „JK” coryneforms. J. Clin. Pathol. 39, 654–660 (1986) 8. Berner R., Pelz K., Wilhelm C., Funke A., Leititis J.U., Barndis M.: Fatal sepsis caused by Corynebacterium amycolatum in a premature infant. J. Clin. Microbiol. 35, 1011–1012 (1997) 9. Brandenburg A.H., van Belkum A., van Pelt C., Bruining H.A., Mouton J.W., Verbrugh H.A.: Patient-to-patient spread of a single strain of Corynebacterium striatum causing infections in a surgical intensive care unit. J. Clin. Microbiol. 34, 2089–2094 (1996) 10. Burke G.J., Malouf M.A., Glanville A.R.: Opportunistic lung infection with Corynebacterium pseudodiphtheriticum after lung and heart transplantation. M.J.A. 166, 362–364 (1997) 11. Cavendish J., Cole J.B., Ohl C.A.: Polymicrobial central venous catheter sepsis involving a multiantibiotic-resistant strain of Corynebacterium minutissimum. Clin. Infect. Dis. 19, 204–205 (1994) 12. Chiner E., Arriero J.M., Signes-Costa J., Marco J., Corral J., Gomez-Esparrago A., Ortiz de la Tabla V., Martin C.: Corynebacterium pseudodiphtheriticum pneumonia in an immunocompetent patient. Monaldi Arch. Chest. Dis. 54, 325–327 (1999) 13. Chudnicka A.M.: Charakterystyka cech morfologicznych, biochemicznych i immunogennych szczepów C. propinquum (ANF-3) izolowanych od chorych z zapaleniem b³on œluzowych nosa i gard³a. Akademia Medyczna. Lublin, 1995. Praca doktorska 14. Claeys G.C., Verschraegen G., Desmet L., Verdonk R., Claessens H.: Corynebacterium JK (Johnson-Kay Strain) infection of a Küntscher-nailed tibial fracture. Clin. Ortop. Rel. Res. 202, 227–229 (1986) 15. Collins M.D., Burton R.A., Jones D.: Corynebacterium amycolatum sp. nov., a new mycolic acidless Corynebacterium species from human skin. FEMS Microbiol. Lett. 49, 349–352 (1988) 16. Collins M.D., Jones D.: Corynebacterium minutissimum sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. 33, 870–871 (1983) 17. Coyle M.B., Leonard R.B., Nowowiejski D.J., Malekniazi A., Finn D.J.: Evidence of multiple taxa within commercially available reference strains of Corynebacterium xerosis. J. Clin Microbiol. 31, 1788–1793 (1993) 18. Coyle M.B., Lipsky B.A.: Coryneform bacteria in infectious diseases: clinical and laboratory aspect. Clin. Microbiol. Rev. 3, 227–246 (1990) 19. de Briel D., Langs J.C., Rougeron G., Chabot P., le Faou A.: Multiresistant corynebacteria in bacteriuria: a comparative study of the role of Corynebacterium group D2 and Corynebacterium jeikeium. J. Hosp. Infect. 17, 35–43 (1991) 20. de Miguel I., Rodriguez E., Martin A.M.: Corynebacterium amycolatum: sepsis in hematologic patients. Enferm. Infect. Microbiol. Clin. 17, 340–341 (1999) 21. de Miguel-Martinez I., Fernández-Fuertes F., Ramos-Macías A., Bosch-Benitez J.M., Martín-Sánchez A.M.: Sepsis due to multiply resistant Corynebacterium amycolatum. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 617–618 (1996) 22. Dykhuizen S.R., Douglas G., Weir J., Gould I.M.: Corynebacterium afermentans subsp. lipophilum: multiple abscess formation in brain and liver. Scand. J. Infect. Dis. 27, 637–639 (1995)

414

23. Esteban J., Nieto E., Calvo R., Fernández-Roblas R., Valero-Guillén P.L., Soriano F.: Microbiological characterization and clinical significance of Corynebacterium amycolatum strains. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect Dis. 18, 518–521 (1999) 24. Fosi-Mbantenkhu J., Orett FA.: Predisposition to Corynebacterium jeikeium infection in acute lymphoblastic leukemia: a report of two cases in Trinidad. Med. Pediatr. Oncol. 22, 350–354 (1994) 25. Freeman D.J., Smith J.H., Haines G.H., Hellyar A.G.: Seven patients with respiratory infections due to Corynebacterium pseudodiphtheriticum. Pathol. 26, 311–314 (1994) 26. Funke G., Hutson R.A., Hilleringmann M., Heizmann W.R., Collins M.D.: Corynebacterium lipophiloflavum sp. nov. isolated from a patient with bacterial vaginosis. FEMS Microbiol. Lett. 150, 219–224 (1997) 27. Funke G., Lawson P.A., Bernard K.A., Collins M.D.: Most Corynebacterium xerosis strains identified in the routine clinical laboratory correspond to Corynebacterium amycolatum. J. Clin. Microbiol. 34, 1124–1128 (1996) 28. Funke G., von Graevenitz A., Clarridge III J.E., Bernard K.A.: Clinical microbiology of coryneform bacteria. Clin. Microbiol. Rev. 10, 125–159 (1997) 29. Garcia-Bravo M., Aguado J.M., Morales J.M., Noriega A.R.: Influence of external factors in resistance of Corynebacterium urealyticum to antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother. 40, 497–499 (1996) 30. Greene K.A., Clark R.J., Zabramski J.M.: Ventricular csf shunt infections associated with Corynebacterium jeikeium: report of three cases and review. Clin. Infect. Dis. 16, 139–141 (1993) 31. Hande K.R., Witebsky F.G., Brown M.S., Schulman C.B., Anderson S.E. Jr, Levine A.S., MacLowery J.D., Chabner B.A.: Sepsis with a new species of Corynebacterium. Ann. Intern. Med. 85, 423–426 (1976) 32. Hemsley C., Abraham S., Rowland-Jones S.: Corynebacterium pseudodiphtheriticum – a skin pathogen. Clin. Infect. Dis. 29, 938–939 (1999) 33. Hertig A., Duvic C., Chretien Y., Jungers P., Grünfeld J.P., Rieu P.: Encrusted pyelitis of native kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 11, 1138–1140 (2000) 34. Hommez J., Devriese L.A., Vaneechoutte M., Riegel P., Butaye P., Haesebrouck F.: Identification of nonlipophilic corynebacteria isolated from dairy cows with mastitis. J. Clin. Microbiol. 37, 954–957 (1999) 35. Hoy C., Kerr K., Livingston J.H.: Cerebrospinal fluid – shunt infection due to Corynebacterium striatum. Clin Infect. Dis. 25, 1486–1487 (1997) 36. Jackman P.J.H., Pitcher D.G., Pelczynska S., Borman P.: Classification of corynebacteria associated with endocarditis (group JK) as Corynebacterium jeikeium sp. nov. Syst. Appl. Microbiol. 9, 83–90 (1987) 37. Jacobs N.F., Perlino C.A.: Diphtheroid pneumonia. Sout. Med. J. 72, 475–476 (1979). 38. Johnson WD, Kaye D.: Serious infections caused by diphtheroids. Ann. N. Y. Acad. Sci. 174, 569–576 (1970) 39. Jones D., Collins M.D.: Irregular, nonsporing gram-positive rods. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Williams and Wilkins Co. Baltimore. Md. 1986, Section 15. s. 1261–1286 40. Joussen A.M., Funke G., Joussen F., Herbertz G.: Corynebacterium macginleyi: a conjunctiva specific pathogen. Brit. J. Ophthalmol. 84, 1420–1422 (2000) 41. Jucgla A., Sais G., Moreno A., Moreno A., Fernandez-Sevilla A., Peyri J.: A papular eruption to infection with Corynebacterium jeikeium with histopathological features mimicking botrytomycosis. Brit. J. Dermatol. 133, 801–804 (1995) 42. Jurlink D.N., Borczyk A., Simor A.E.: Native valve endocarditis due to Corynebacterium striatum. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 963–964 (1996) 43. Kasprowicz A.: Maczugowce skórne, klasyfikacja i rola w ustroju ludzkim. Post. Mikrobiol. 14, 107–120 (1975) 44. Khabbaz R.F., Kaper J.B., Moody M.R., Schimpff S.C., Tenney J.H.: Molecular epidemiology of group JK Corynebacterium on a cancer ward: lack of evidence for patient-to-patient transmission. J. Infect. Dis. 154, 95–99 (1986)

415

45. Knudsen J.D., Nielsen C.J., Espersen F.: Treatment of shunt-related cerebral ventriculitis due to Corynebacterium jeikeium with vancomycin administered intraventricularly. Case report. APMIS, 102, 317–320 (1994) 46. Krish G., Beaver W., Sarubbi F., Verghese A.: Corynebacterium xerosis as a cause of vertebral osteomyelitis. J. Clin. Microbiol. 27, 2869–2870 (1989) 47. Kumari P., Tyagi A., Marks P., Kerr K.G.: Corynebacterium afermentans spp. afermentans sepsis in a neurosurgical patient. Clin. Infect. Dis. 23, 201–202 (1996) 48. Lagrou K., Verhaegen J., Janssens M., Wauters G., Verbist L.: Prospective study of catalasepositive coryneform organisms in clinical specimens: identification, clinical relevance, and antibiotic susceptibility. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 30, 7–15 (1998) 49. Larson E.L., McGinley K.J., Leyden J.J., Cooley M.E., Talbot G.H.: Skin colonization with antibiotic-resistant (JK group) and antibiotic-sensitive lipophilic diphtheroids in hospitalised and normal adults. J. Infect. Dis. 153, 701–705 (1986) 50. Leonard R.B., Nowowiejski D.J., Warren J.J., Finn D.J., Coyle M.B.: Molecular evidence of person-to-person transmission of a pigmented strain of Corynebacterium striatum in intensive care units. J. Clin. Microbiol. 32, 164–169 (1994) 51. Lortholary O., Buu-Hoï A., Fagon J.Y., Pierre J., Slama M., Gutmann L., Acar J.F.: Mediastinitis due to muliply resistant Corynebacterium xerosis. Clin. Infect. Dis. 16, 172 (1993) 52. Manzella P.J., Kellog J.A., Parsey S.K.: Corynebacterium pseudodiphtheriticum: a respiratory tract pathogen in adults. Clin. Infect. Dis. 20, 37–40 (1995) 53. Markowitz S.M., Coudron P.E.: Native valve endocarditis caused by an organism resembling Corynebacterium striatum. J. Clin. Microbiol. 28, 8–10 (1990) 54. Martaresche C., Fournier P.E., Jacomo V., Gainnier M., Boussuge A., Drancourt M.: A case of Corynebacterium pseudodiphtheriticum nosocomial pneumonia. Emerg. Infect. Dis. 5, 722–723 (1999) 55. Martínez-Martínez L., Suárez A.I., Ortega M.C., Rodríguez-Jiménez R.: Fatal pulmonary infection caused by Corynebacterium striatum. Clin. Infect. Dis. 19, 806–807 (1994) 56. Martínez-Martínez L., Suárez A.I., Winstanley J., Ortega M.C., Bernard K.: Phenotypic characteristics of 31 strains of Corynebacterium striatum isolated from clinical samples. J. Clin Microbiol. 33, 2458–2461 (1995) 57. McGinley K.J., Labows J.N., Zechman J.M., Nordstrom K.M., Webster G.F., Leyden J.J.: Analysis of cellular components, biochemical reactions, and habitat of human cutaneous lipophilic diphtheroids. J. Inv. Dermatol. 85, 374–377 (1985) 58. Mikucka A.: Oportunistyczne gatunki coryneform w zaka¿eniach szpitalnych. Akademia Medyczna. Bydgoszcz, 2001. Praca doktorska 59. Mikucka A., Gospodarek E., Paprzycka M.: Corynebacterium urealyticum w zaka¿eniach szpitalnych. Urol. Pol. 2, 188–198 (2000) 60. Nebreda-Mayoral T., Muñoz-Bellido J.L., Garcia-Rodríguez J.: Incidence and characteristics of urinary tract infections caused by Corynebacterium urealyticum (Corynebacterium group D2). Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13, 600–604 (1994) 61. Neubauer M., Sourek J., Ryc M., Bohacek J., Mara M., Mnukova J.: Corynebacterium accolens sp. nov., a gram-positive rod exhibiting satellitism, from clinical material. Syst. Appl. Microbiol. 14, 46–51 (1991) 62. Nieto E., Vindel A., Valero-Guillen P.L., Saez-Nieto J.A., Soriano F.: Biochemical, antimicrobial susceptibility and genotyping studies on Corynebacterium urealyticum isolates from diverse sources. J. Med. Microbiol. 49, 759–763 (2000) 63. Ohl C.A., Tribble D.R.: Corynebacterium group D2 infection of a complex renal cyst in a debilitated patient. Clin. Infect. Dis. 14, 1160–1161 (1992) 64. Pearson T.A., Braine H.G., Rathburn H.K.: Corynebacterium species in oncology patients. JAMA. 238, 1737–1740 (1977) 65. Pitcher D., Soto A., Soriano F., Valero-Guillén P.: Classification of coryneform bacteria associated with human urinary tract infection (group D2) as Corynebacterium urealyticum sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 42, 178–181 (1992)

416

66. Porschen R.K., Goodman Z., Rafai B.: Isolation of Corynebacterium xerosis from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 68, 290–293 (1977) 67. Renaud F.N.R., Dutaur M., Daoud S., Aubel D., Riegel P., Monget D., Freney J.: Differentiation of Corynebacterium amycolatum, C. minutissimum, and C. striatum by carbon substrate assimilation tests. J. Clin Microbiol. 36, 3698–3702 (1998) 68. Riegel P., de Briel D., Prévost G., Jehl F., Monteil H., Minck R.: Taxonomic study of Corynebacterium group ANF-1 strains: proposal of Corynebacterium afermentans sp. nov. containing the subspecies C. afermentans subsp. afermentans subsp. nov. and C. afermentans subsp. lipophilum sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 287–292 (1993) 69. Riegel P., de Briel D., Prévost G., Jehl F., Monteil H.: Genomic diversity among Corynebacterium jeikeium strains and comparison with biochemical characteristics and antimicrobial susceptibilities. J. Clin. Microbiol. 32, 1860–1865 (1994) 70. Riegel P., de Briel D., Prévost G., Jehl F., Monteil H.: Proposal of Corynebacterium propinquum sp. nov. for Corynebacterium group ANF-3 strains. FEMS Microbiol. Lett. 113, 229–234 (1993) 71. Riegel P., Ruimy R., de Briel D., Prévost G., Jehl F., Christen R., Monteil H.: Genomic diversity and phylogenetic relationships among lipid-requiring diphtheroids from humans and characterization of Corynebacterium macginleyi sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 128–133 (1995) 72. Rieley P.S., Hollis D.G., Utter G.B., Weaver R.E., Baker C.N.: Characterization and identification of 95 diphtheroid (group JK) cultures isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 9, 418–424 (1979) 73. RoŸdziñski E., Kern W., Schmeiser T., Kurrle E.: Corynebacterium jeikeium bacteremia et al tertiary care center. Infection, 4, 201–204 (1991) 74. Ryan M., Murray P.R.: Prevalence of Corynebacterium urealyticum in urine specimens collected at a University-Affiliated Medical Center. J. Clin Microbiol. 32, 1395–1396 (1994) 75. Saavedra J., Rodríguez J.N., Fernádez-Jurado A., Vega M.D., Pascual L., Prados D.: A necrotic soft-tissue lesion due to Corynebacterium urealyticum in a neutropenic child. Clin. Infect. Dis. 22, 851–852 (1996) 76. Sanchez-Porto A., Vergara-de-Campos A., Inigo M.A., Torres-Tortosa M., Rodriguez Inglesias M.: Bacteremia caused by Corynebacterium jeikeium in 2 AIDS patients without neutropenia. Enferm. Infect. Microbiol. Clin. 12, 31–33 (1994) 77. Sarkany I., Taplin D., Blank H.: The etiology and treatment of erythrasma. J. Invest. Dermatol. 283–290 (1961) 78. Sekura-Bander B., Dworak-Stelmaska E., Kukliñska D.: Przypadek bakteryjnego zapalenia wsierdzia (BZW) wywo³anego przez Corynebacterium grupy JK. Przeg. Epidemiol. 49, 395–397 (1995) 79. Smith RF.: Characterization of human cutaneous lipophilic diphtheroids. J. Gen. Microbiol. 55, 433–443 (1969) 80. Sobrino J., Marco F., Miro J.M., Martinez-Orozco F., Poch E., Bombi J.M., Ingelmo M.: Prosthetic valve endocarditis caused by Corynebacterium pilosum. Infection, 4, 247–249 (1991) 81. Somerville D.A.: A taxopnomic scheme for aerobic diphtheroids from human skin. J. Med. Microbiol. 6, 215–224 (1973) 82. Soriano F., Fernández-Roblas R.: Infections caused by antibiotic-resistant Corynebacterium group D2. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 7, 337–341 (1988) 83. Soriano F., Ponte C., Ruiz P., Zapardiel J.: Non-urinary tract infections caused by multiply antibiotic resistant Corynebacterium urealyticum. Clin. Infect. Dis. 17, 890–891 (1993) 84. Soriano F., Ponte C., Santamaria M., Fernández-Roblas R.: Struvite crystal formation by Corynebacterium group D2 in human urine and its prevention by acetohydroxamic acid. Eur. Urol. 13, 271–273 (1987) 85. Soriano F., Rodriguez-Tudela J.L., Fernández-Roblas R., Aguado J.M., Santamaria M.: Skin colonization by Corynebacterium groups D2 and JK in hospitalized patients. J. Clin Microbiol. 26, 1878–1880 (1988) 86. Stone N., Gillett P., Burge S.: Breast abscess due to Corynebacterium striatum. Brit. J. Dermatol. 137, 623–625 (1997)

417

87. Tattevin P., Crémieux A.C., Muller-Serieys C., Carbon C.: Native valve endocarditis due to Corynebacterium striatum: first reported case of medical treatment alone. Clin Infect. Dis. 23, 1330–1331 (1996) 88. Telander B., Lerner R., Palmblad R., Ringertz O.: Corynebacterium group JK in a hematological ward infections, colonization and environmental contamination. Scand. J. Infect Dis. 20, 55–61 (1988) 89. van der Lilie H., Leverstein-Van Hall M., Mertens M., van Zaanen H.C.T., van Oers R.H.J., Thomas B.L.M., von dem Borne A.E.G.K., Kuijper E.J.: Corynebacterium CDC group JK (Corynebacterim jeikeium) sepsis in haematological patients: a report of three cases and a systematic literature review. Scand. J. Infect. Dis. 27, 581–584 (1995) 90. Wallet F., Marquette C.H., Courcol R.J.: Multiresistant Corynebacterium xerosis as a cause of pneumonia in a patient with acute leukemia. Clin. Infect. Dis. 18, 845–846 (1994) 91. Watkins D.A., Chahine A., Creger R.J., Jacobs M.R., Lazarus H.M.: Corynebacterium striatum: a diphtheroid with pathogenic potential. Clin. Infect. Dis. 17, 21–25 (1993) 92. Wauters G., van Bosterhaut B., Janssens M., Verhaegen J.: Identification of Corynebacterium amycolatum and other nonlipophilic fermentative corynebacteria of human origin. J. Clin Microbiol. 36, 1430–1432 (1998) 93. Weiss K., Labbé C., Laverdiére M.: Corynebacterium striatum meningitis: case report and review of an increasingly important Corynebacterium species. Clin. Inf. Dis. 23, 1246–1248 (1996) 94. Williams D.Y., Selepak S.T., Gill V.J.: Identification of clinical isolates of nondiphtherial Corynebacterium species and their antibiotic susceptibility patterns. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 17, 23–28 (1993) 95. Wood C.A., Pepe R.: Bacteremia in a patient with non-urinary-tract infection due to Corynebacterium urealyticum. Clin. Infect. Dis. 19, 367–368 (1994) 96. Yildiz S., Yildiz H.Y., Çetin I., Uçar D.H.: Total knee arthroplasty complicated by Corynebacterim jeikeium infection. Scand. J. Infect. Dis. 27, 635–636 (1995) 97. Young V.M., Meyers W.F., Moody M.R., Schimpff S.C.: The emergence of coryneform bacteria as a cause of nosocomial infections in compromised hosts. Am. J. Med. 70, 646–650 (1981) 98. Zinkernagel A.S., von Graevenitz A., Funke G.: Heterogeneity within Corynebacterium minutissimum strains is explained by misidentified Corynebacterium amycolatum strains. Am. J. Clin. Pathol. 106, 378–383 (1996) 99. Zinner S.H.: Changing epidemiology of infections in patients with neutropenia and cancer: emphasis on gram-positive and resistant bacteria. Clin. Infect. Dis. 29, 490–494 (1999) Katedra i Zak³ad Mikrobiologii Akademii Medycznej w Bydgoszczy ul. M. Sk³odowskiej-Curie 9. 85-094 Bydoszcz e-mail: [email protected] Wp³ynê³o w styczniu 2003

418

POST. MIKROBIOL., 2003, 42, 4, 419–436 http://www.pm.microbiology.pl

MIKROSKOP SI£ ATOMOWYCH NOWYM NARZÊDZIEM BADAWCZYM W MIKROBIOLOGII

Anna Grzegorzewicz, Andrzej Gamian

1. Wstêp. 2. Zasada dzia³ania mikroskopu AFM. 3. Pomiar si³ miêdzycz¹steczkowych. 4. Przygotowanie próbek. 5. Mikroskop si³ atomowych w mikrobiologii. 6. Badanie ultrastruktury powierzchni i cech morfologicznych. 6.1. Komórka bakteryjna. 6.2. Biofilm bakteryjny. 6.3. Warstwy i sk³adniki bakteryjnych os³on komórkowych. 7. Obrazowanie DNA. 8. W³aœciwoœci fizyko-chemiczne. 8.1. Powierzchniowe si³y. 8.2. W³aœciwoœci mechaniczne. 9. Podsumowanie Atomic force microscope a new investigation tool in microbiology Abstract: Atomic force microscope (AFM) belongs to the family of scanning force microscopes, which are used for measuring of the surface properties of materials. Such microscope generates nanometer resolved, three-dimensional images. The ability of the AFM to image non-conductive surfaces in aqueous solutions allows the investigating of biological systems under near physiological conditions. For this reason AFM is being used increasingly in biology, especially in microbiology. In this review, after a short introduction to AFM technique and sample preparation protocol, we discuss the most common applications of this technique in microbiology. AFM has been used for visualizing the surface ultrastructure of microbial cell, surface layers and examining the morphology of bacterial biofilms. It allows imaging and micro-manipulation of such individual molecules as DNA or protein. AFM can also provide information on local surface properties such as viscoelasticity and surface forces. 1. Introduction. 2. The principles of working of AFM. 3. Measurments of intermolecular forces. 4. Sample preparation. 5. Application of AFM in microbiology. 6. Investigation of surface ultrastructure and morphology. 6.1. Microbial cell. 6.2. Bacterial biofilm. 6.3. Cell surface layers and theirs components. 7. Visualizing of DNA. 8. Physicochemical properties. 8.1. Surface forces. 8.2. Mechanical properties. 9. Summary

1. Wstêp Mikroskop si³ atomowych (atomic force microscope, AFM) nale¿y do rodziny mikroskopów z sond¹ skaningow¹ stosowanych do badañ powierzchni materia³ów. Punktem wyjœcia do jego konstrukcji by³o wynalezienie w roku 1981 przez Gerda B i n n i n g a i Heinricha R o h r e r a skaningowego mikroskopu tunelowego (scanning tunneling microscope, STM) [5]. Piêæ lat póŸniej ich wynalazek zosta³ uhonorowany Nagrod¹ Nobla w dziedzinie fizyki. W mikroskopie tunelowym badana próbka, jak równie¿ próbnik u¿ywany do skanowania powierzchni musz¹ przewodziæ pr¹d elektryczny, co uniemo¿liwia jego zastosowanie dla izolatorów. Ograniczenie to zosta³o ominiête w mikroskopie si³ atomowych, w którym wykorzystuje siê oddzia³ywania miêdzy atomami próbnika i próbki, dlatego mo¿e byæ stosowany zarówno do badañ przewodników, pó³przewodników jak te¿ izolatorów [6]. 419

Mikroskop si³ atomowych znalaz³ szerokie zastosowanie w naukach biologicznych. Jego ogromn¹ zalet¹ jest uzyskiwanie obrazów trójwymiarowych oraz wysoka rozdzielczoœæ, która w zale¿noœci od w³aœciwoœci badanej próbki mo¿e siê mieœciæ w zakresie od 0,1 do 1 nanometrów. Pomiary mog¹ byæ przeprowadzane przy ciœnieniu atmosferycznym, jak równie¿ w pró¿ni. Skanowana próbka mo¿e byæ sucha lub zanurzona w roztworach wodnych, co umo¿liwia obserwacjê wielu zjawisk biologicznych w czasie rzeczywistym. Oprócz uzyskiwania obrazu topografii powierzchni, mikroskop ten jest równie¿ u¿ywany do oceny wielkoœci si³y miêdzy próbnikiem a próbk¹. Takie pomiary mog¹ nam dostarczyæ informacji na temat lokalnych w³aœciwoœci fizyko-chemicznych badanych materia³ów i maj¹ ogromne znaczenie dla poznania procesów biologicznych w skali komórkowej i sub-komórkowej. 2. Zasada dzia³ania mikroskopu AFM Podstawowymi elementami sk³adowymi mikroskopu si³ atomowych s¹: sprê¿ynka z ig³¹, skaner zbudowany z materia³ów piezoelektrycznych, uk³ad elektroniczny fotodetektora oraz komputer. Powierzchnia próbki skanowana jest za pomoc¹ ostrej ig³y o d³ugoœci kilku mikronów i o œrednicy poni¿ej 10 nm. Ig³a wykonana zazwyczaj z azotku krzemu (Si3N4) jest umocowana na koñcu ma³ej, p³askiej sprê¿ynki (ramienia). W czasie gdy ostrze ig³y skanuje powierzchniê próbki, si³y wystêpuj¹ce miêdzy atomami ig³y i próbki, zale¿ne od odleg³oœci miêdzy nimi, powoduj¹ odchylenie sprê¿ynki. W wiêkszoœci mikroskopów si³ atomowych wykorzystuje siê do pomiaru odchyleñ ramienia system optyczny (rys. 1). Promieñ lasera odbija siê od tylniej czêœci sprê¿ynki i pada na œwiat³oczu³y detektor. Sam fotodetektor mo¿e mierzyæ przemieszczenia œwiat³a lasera równe 1 nm. Mo¿liwa jest jednak detekcja przesuniêæ rzêdu dziesiêtnych angstrema dziêki zale¿noœci jaka wystêpuje miedzy d³ugoœci¹ drogi przebytej przez œwiat³o lasera od sprê¿ynki do fotodetektora, a d³ugoœci¹ samej sprê¿ynki. Precyzyjne ruchy ig³y we wszystkich trzech kierunkach (X, Y, Z) s¹ mo¿liwe dziêki zastosowaniu piezoelektrycznych skanerów, które zmieniaj¹ swoje rozmiary pod wp³ywem przy³o¿onego pr¹du elektrycznego. Uk³ad elektroniczny, na zasadzie sprzê¿enia zwrotnego, utrzymuje ig³ê w takiej pozycji, aby jej odleg³oœæ lub si³a oddzia³ywañ z powierzchni¹ próbki pozostawa³y sta³e. Komputer tworzy wiêc obraz topografii próbki na podstawie zmian wartoœci napiêcia powoduj¹cego kurczenie lub rozszerzanie skanera. W mikroskopii si³ atomowych mierzone s¹ ró¿nego rodzaju oddzia³ywania, do najwa¿niejszych jednak nale¿y si³a van der Waalsa. W zale¿noœci od odleg³oœci miêdzy ig³¹ i próbk¹ mog¹ byæ mierzone si³y przyci¹gania lub odpychania. Pocz¹tkowo, gdy ig³a przybli¿a siê do powierzchni próbki jest do niej przyci¹gana. W miarê zmniejszania siê dystansu pomiêdzy pow³okami elektronów próbki i ig³y, si³y odpychania neutralizuj¹ si³y przyci¹gania i zaczynaj¹ dominowaæ [6]. Bior¹c pod uwagê rodzaj mierzonych si³ wyró¿niamy trzy techniki pomiaru: kontaktow¹ (contact mode), bez kontaktow¹ non-contact mode) i nieci¹g³¹ lub dotykow¹ (tapping mode). 420

Rys. 1. Schemat dzia³ania mikroskopu si³ atomowych. Otrzymano dziêki uprzejmoœci dr P. Russella oraz firmy Veeco Instruments

W metodzie kontaktowej mierzone s¹ si³y odpychania. Ig³a jest utrzymywana w odleg³oœci zaledwie kilku angstremów od powierzchni. Ze wzglêdu na bliski kontakt miêdzy próbk¹ i ig³¹ mog¹ zacz¹æ przewa¿aæ oddzia³ywania adhezyjne oraz elektrostatyczne, powoduj¹ce przyci¹gniêcie ig³y do próbki. Wynikiem tego zjawiska mo¿e byæ zniszczenie próbki oraz zafa³szowany obraz topografii powierzchni. Problem ten zosta³ rozwi¹zany w metodzie bez kontaktowej, w której odleg³oœæ miêdzy powierzchni¹ próbki a ig³¹ wynosi od kilku do dziesi¹tek nanometrów. Skanowanie powierzchni odbywa siê bez lub przy minimalnym kontakcie miêdzy ig³¹ i próbk¹. Uzyskiwana rozdzielczoœæ jest jednak ni¿sza ni¿ w pozosta³ych metodach [1]. W technice dotykowej (nieci¹g³ej, tapping) ig³a oscyluje przy swojej czêstotliwoœci rezonansowej i wchodzi w kontakt z powierzchni¹ próbki tylko na bardzo krótki okres w czasie swojego okresu oscylacji, dziêki czemu si³y tarcia s¹ mocno zredukowane i nie wp³ywaj¹ na jakoœæ pomiarów. Technika ta doskonale sprawdza siê przy próbkach miêkkich lub s³abo przyczepionych do pod³o¿a i pozwala na uzyskanie wysokiej rozdzielczoœci. Jej dodatkowym atutem jest uzyskiwanie tzw. obrazów fazowych, które dostarczaj¹ dodatkowych informacji na temat w³aœciwoœci próbki jednak interpretacja tych obrazów jest niezwykle trudna [32, 61]. 421

3. Pomiar si³ miêdzycz¹steczkowych Jak wczeœniej wspomniano pomiar oddzia³ywañ wystêpuj¹cych miêdzy próbk¹, a ig³¹ mo¿e nam dostarczyæ informacji na temat fizyko-chemicznych w³aœciwoœci próbki. Pomiar odchylenia sprê¿ynki, gdy ig³a jest przybli¿ana, a nastêpnie odci¹gana od powierzchni pozwala na wykreœlenie tzw. krzywej dla si³y wzglêdem odleg³oœci. Sprê¿ynka podlega ugiêciu zgodnie z prawem Hook’a F = – k · x, gdzie przy znanej sta³ej sprê¿ystoœci k odchylenie próbnika x (nm) mo¿e byæ przeliczone na si³ê F (nN). Na Rys. 2 pokazano przyk³ad krzywej dla si³y wzglêdem odleg³oœci. Sk³ada siê ona z dwóch czêœci, I – obrazuj¹cej przybli¿anie ig³y do próbki i II – odzwierciedlaj¹cej odrywanie ig³y. Pocz¹tkowo, przy doœæ du¿ej odleg³oœci miêdzy ig³¹ a próbk¹ nie wystêpuj¹ ¿adne oddzia³ywania (A). Jednak w miarê przybli¿ania siê tych dwóch powierzchni do siebie mo¿e nast¹piæ, w zale¿noœci od wystêpuj¹cej tam si³y odpychanie lub przyci¹ganie, czego wynikiem bêdzie wygiêcie sprê¿ynki odpowiednio w górê lub w dó³ (B). W momencie gdy si³y przyci¹gania równowa¿¹ si³y odpychania oraz sta³¹ sprê¿ystoœci próbnika, ig³a wchodzi w kontakt z powierzchni¹ próbki (C). Czêœæ I krzywej jest wykorzystywana do mierzenia si³ powierzchniowych w³¹czaj¹c w to si³y van der Waalsa, elektrostatyczne, solwatacji, jak równie¿ do oszacowania wielkoœci efektu sterycznego i mostkowego, których wystêpowanie jest zwi¹zane z obecnoœci¹ powierzchniowych polimerów [12, 15]. Ponadto wzrost si³y w regionie „kontaktu” (C, Rys. 2) dostarcza bezpoœrednich informacji na temat lepkoœci badanego materia³u. Przy odrywaniu próbki si³y adhezji przytrzymuj¹ ig³ê (od D do E). Ró¿nica wartoœci miêdzy punktem E i F odpowiada sile potrzebnej do oderwania ig³y od powierzchni próbki. Ta czêœæ wykresu (II) s³u¿y do pomiaru powierzchniowej energii cia³ sta³ych oraz umo¿liwia okreœlenie z jak¹ si³y wi¹¿¹ siê

Rys. 2. Przyk³ad krzywej dla si³y wzglêdem odleg³oœci

422

dwie cz¹steczki. Wiele zjawisk biologicznych jest zale¿nych od si³ rzêdu pikonewtonów i mog¹ byæ one mierzone za pomoc¹ AFM. Pomiary te s¹ najczêœciej przeprowadzane w œrodowisku wodnym, które wp³ywa na obni¿enie niekorzystnych si³ adhezji miêdzy próbk¹, a ig³¹ mog¹cych powodowaæ deformacjê próbki, a tym samym uniemo¿liwiæ uzyskanie wiarygodnych wyników. Œrodowisko wodne umo¿liwia równie¿ szybk¹ zmianê parametrów przy których dokonywany jest pomiar (pH, si³a jonowa), a przez to regulacjê si³ miêdzy próbk¹, a ig³¹ mikroskopu [39]. 4. Przygotowanie próbek Przygotowanie preparatów jest znacznie prostsze w porównaniu do procedury stosowanej dla preparatów przeznaczonych do analizy w mikroskopie elektronowym. Zwykle nie ma potrzeby utrwalania i odwadniania próbek, czy te¿ ich napylania metalami. Kluczowym elementem jest w³aœciwy wybór powierzchni, do której przytwierdza siê próbkê. Najczêœciej stosowanymi powierzchniami w mikroskopii si³ atomowych s¹ p³ytki grafitowe, silikonowe, z odprê¿onego z³ota, œwie¿o roz³upanej miki oraz szk³a. Pierwsze cztery powierzchnie s¹ p³askie, dlatego te¿ mog¹ byæ stosowane dla bardzo ma³ych cz¹stek np. DNA, którego szerokoœæ nie przekracza 2 nm. Próbka mo¿e byæ przytwierdzona do pod³o¿a poprzez fizyczn¹ adsorpcjê lub kowalencyjnie. Szk³o, mika oraz z³oto ³atwo ulegaj¹ modyfikacjom chemicznym. Najczêœciej pokrywa siê powierzchnie poli-L-lizyn¹ lub aminosilanizuje. Trwa³e przyczepienie próbki do powierzchni jest szczególnie wa¿ne w przypadku analizy próbek zanurzonych w roztworach wodnych. W niektórych przypadkach istotne jest równie¿ pokrycie powierzchni jednorodn¹ warstw¹ komórek bakteryjnych. W tym celu stosuje siê modyfikacje chemiczne komórek np. utrwalanie glutaraldehydem [43]. Udowodniono jednak, ¿e zabieg ten zmienia ultrastrukturê i w³aœciwoœci powierzchni komórki [8]. Niektórzy badacze stosuj¹ filtry poliwêglanowe o rozmiarach por nieznacznie mniejszych od badanych komórek. „Z³apane” w filtrze komórki s¹ zatem ogl¹dane w stanie natywnym [27]. 5. Mikroskop si³ atomowych w mikrobiologii Zastosowanie mikroskopu si³ atomowych w naukach biologicznych zosta³o podyktowane przede wszystkim jego w³aœciwoœci¹ obrazowania substancji nie przewodz¹cych pr¹du elektrycznego. Wyniki tych badañ zosta³y zawarte w licznych pracach doœwiadczalnych i przegl¹dowych [14, 24, 50, 60]. AFM okaza³ siê szczególnie przydatny w mikrobiologii. Zadecydowa³ o tym rozmiar komórki bakteryjnej nie przekraczaj¹cy 1 :m oraz znacznie sztywniejsze w porównaniu do komórek eukariotycznych os³ony komórkowe. Mikroskop si³ atomowych jest u¿ywany do analizy ultrastruktury zarówno ca³ej komórki bakteryjnej, jak i warstw os³on komórkowych i ich sk³adników w warunkach fizjologicznych. O ile dla ca³ych komórek uzyskuje siê zwykle rozdzielczoœæ jedynie rzêdu nm, to 423

w przypadku warstw os³on komórkowych mo¿e ona siêgaæ nawet angstremów. Zastosowanie mniejszego powiêkszenia pozwala na obserwacjê cech morfologicznych komórki (kszta³tu, organelli zewn¹trzkomórkowych) i biofilmu bakteryjnego. Umo¿liwia równie¿ analizê takich zjawisk, jak podzia³ i wzrost komórki. Pozwala równie¿ na bezpoœredni¹ obserwacjê wp³ywu antybiotyków czy detergentów na ultrastrukturê powierzchni komórki bakteryjnej [20]. Przy wiêkszym powiêkszeniu mo¿na obserwowaæ zmiany konformacyjne pojedynczych cz¹steczek buduj¹cych struktury komórkowe. Ponadto wiele wa¿nych zjawisk np. adhezja czy agregacja bakterii jest œciœle zwi¹zanych z si³ami wystêpuj¹cymi na powierzchni komórki bakteryjnej. Ze wzglêdu na niewielki rozmiar komórki bakteryjnej bezpoœredni pomiar tych si³ jest niezwykle trudny. Stosuj¹c mikroskop si³ atomowych mo¿na nie tylko mierzyæ si³y powierzchniowe, ale równie¿ okreœlaæ stopieñ elastycznoœci komórki bakteryjnej oraz cz¹steczek wchodz¹cych w jej sk³ad. 6. Badanie ultrastruktury powierzchni i cech morfologicznych 6.1. Komórka bakteryjna Mikroskopia si³ atomowych jest obecnie jedyn¹ metod¹ umo¿liwiaj¹c¹ obserwacjê z du¿¹ rozdzielczoœci¹ komórki bakteryjnej w czasie rzeczywistym w warunkach fizjologicznych. Technika ta jednak nie zawsze pozwala na ominiêcie chemicznego utrwalania preparatów stosowanego w celu przytwierdzenia komórki do pod³o¿a, a tym samym unikniêcia jej „zmiecenia” przez ig³ê w czasie skanowania. W pewnym stopniu problem ten mo¿e byæ ominiêty dziêki zastosowaniu wy¿ej wspomnianych filtrów poliwêglanowych, jednak mog¹ one byæ stosowane tylko dla komórek posiadaj¹cych sferyczny kszta³t [20]. Stosuj¹c niewielkie powiêkszenie, od 5000 do 30 000 razy, bez uprzedniej modyfikacji mikroorganizmów U m e d a i wsp. [54] zauwa¿yli ró¿nice w strukturze powierzchni komórki Gram-ujemnej i Gram-dodatniej. Powierzchnia pierwszych z nich by³a pofa³dowana, w przeciwieñstwie do raczej g³adkich bakterii Gram-dodatnich. Uzyskane powiêkszenie umo¿liwi³o równie¿ uwidocznienie flagelli. Z kolei v a n d e r M e i i wsp. [55] zaobserwowali rzêski na komórkach Streptococcus salivarius HB. Na komórce by³y widoczne linie uk³adaj¹ce siê w kierunku skanowania. Linie te nie by³y widoczne gdy pomiary by³y wykonywane przy wysokiej sile jonowej (0,1 M KCl), powoduj¹cej opadanie rzêsek. G o u l d i wsp. [23] ogl¹dali zaadsorbowane na szkle komórki Escherichia coli w stanie wysuszonym. W badaniach tych nie by³o potrzeby stosowania utrwalania lub specjalnego przytwierdzania bakterii do pod³o¿a. Komórki E. coli by³y równie¿ wizualizowane z zastosowaniem techniki nieci¹g³ej czyli tappingu [51]. W innych badaniach stosuj¹c ró¿ne techniki (kontaktow¹, nieci¹g³¹) wykazano znacz¹ce ró¿nice w wygl¹dzie powierzchni dwóch szczepów E. coli (JM 109 i K12 J62) [7]. AFM okaza³ siê niezwykle u¿ytecznym narzêdziem w badaniach promieniowców – grupy bakterii Gram-dodatnich szeroko rozpowszechnionej w przyrodzie 424

Rys. 3. Obrazy AFM Saccharopolyspora hirsuta PCM 2279 otrzymane technik¹ kontaktow¹ dla a) grzybni podstawowej b) grzybni powietrznej. Mikroskop si³ atomowych (Topometrix, USA)

w ró¿nych œrodowiskach i strefach klimatycznych. Promieniowce wykazuj¹ znaczny polimorfizm zarówno pod wzglêdem morfologicznym jak i fizjologicznym. Bakterie z tej grupy mog¹ tworzyæ grzybniê podstawow¹ i powietrzn¹, przyjmuj¹ formy kuliste poprzez krótkie lub d³u¿sze a niekiedy maczugowate pa³eczki, do wyd³u¿onych i rozga³êzionych nici [34]. Ze wzglêdu na ogromn¹ ró¿norodnoœæ promieniowców, ich identyfikacja nastrêcza wiele trudnoœci, dlatego wci¹¿ poszukuje siê nowych metod u³atwiaj¹cych prawid³owe rozpoznanie tych bakterii. Stosuj¹c mikroskop si³ atomowych (technikê kontaktow¹) uzyskano trójwymiarowe obrazy 425

Rys. 4. Obraz Saccharopolyspora hirsuta PCM 2279 uzyskany za pomoc¹ elektronowego mikroskopu skaningowego. Skaningowy mikroskop elektronowy (Jeol – 5800LV). Zdjêcia wykonano przy 25 kV. Powiêkszenie 15000x.

grzybni podstawowej i powietrznej szczepu Saccharopolyspora hirsuta (Rys. 3a i b). Grzybnia podstawowa zachowa³a swój rozga³êziony charakter. £añcuchy spor tworz¹ce grzybniê powietrzn¹ wystêpuj¹ najczêœciej w formie spirali. Dla porównania przedstawiono obraz S. hirsuta uzyskany za pomoc¹ skaningowego mikroskopu elektronowego (Rys. 4). Chemiczne utrwalanie niezbêdne do przygotowania preparatów przyczyni³o siê do rozpadu grzybni na pojedyncze komórki. Mikroskop si³ atomowych okaza³ siê równie¿ przydatny przy œledzeniu zmian cech morfologicznych. Ró¿nice w kszta³cie komórek Cellulomonas cellulans hodowanej przez 24 i 48 godzin s¹ wyraŸnie widoczne (Rys. 5a i b). Mikroskop si³ atomowych by³ równie¿ u¿ywany do analizy spor grzyba Phanerochaete chrysosporium. Spory w stanie wegetatywnym posiada³y na swojej powierzchni warstwy regularnych w³ókienek, powtarzaj¹cych siê z czêstotliwoœci¹ 10 ± 2nm. Powierzchnia spor kie³kuj¹cych charakteryzowa³a siê obecnoœci¹ granularnych struktur pokrywaj¹cych g³adk¹ powierzchniê [16]. Natomiast immobilizacja komórek Saccharomyces cerevisiae w 3% agarze umo¿liwi³a obserwacjê procesu wzrostu i p¹czkowania komórek przez 6–7 godzin [22]. Kilka prac odnosi siê do obrazowania wp³ywu ró¿nych zwi¹zków chemicznych na ultrastrukturê powierzchni komórki. Warstwa S Lactococcus helveticus by³a ogl¹dana przed i po traktowaniu jej LiCl. W badaniach tych osi¹gniêto rozdzielczoœæ równ¹ 2 nm [52]. B r a g a i wsp. [10] œledz¹c wp³yw cefodyzymu antybiotyku z grupy $-laktamów na komórkê E. coli, wykazali ró¿nice w zmianach zachodz¹cych na powierzchni tych bakterii wywo³ywanych przez dawki poni¿ej i powy¿ej progu wra¿liwoœci. Na powierzchni komórki szczepu Staphylococcus aureus (RN4220), wra¿liwego na wankomycynê stwierdzono obecnoœæ pojedynczego pierœcienia okalaj¹cego komórkê. Szczep niewra¿liwy (NJ) posiada³ dwa takie pierœcienie. 426

Rys. 5. Obrazy AFM Cellulomonas cellulans PCM 2385 otrzymane technik¹ kontaktow¹ dla bakterii hodowanych przez a) 24 i b) 48 godzin. Mikroskop si³ atomowych (Topometrix, USA).

427

Pod wp³ywem wankomycyny wra¿liwy szczep tworzy³ na swojej powierzchni dodatkowy pierœcieñ [9]. C a m e s a n o i wsp. [13], stosuj¹c technikê nieci¹g³¹ badali zmiany powierzchni komórek Burkholderia cepacia i Pseudomonas stutzeri zachodz¹ce pod wp³ywem traktowania ich czteroboranem dwusodowym, heparyn¹, lizozymem/EDTA, proteinaz¹ K, pirofosforanem sodu oraz Tweenem 20. Najbardziej znacz¹cy wp³yw na powierzchniê wywar³ lizozym/EDTA oraz czteroboran dwusodowy powoduj¹c znaczne sp³aszczenie komórki oraz nieregularnoœæ powierzchni. 6.2. Biofilm bakteryjny W œrodowisku bakterie rosn¹ czêsto w formie biofilmu, w którym komórki zanurzone s¹ w wyprodukowanej przez siebie zewn¹trzkomórkowej substancji polimerowej, najczêœciej polisacharydzie zewn¹trzkomórkowym (extracellular polysaccharide, EPS). Mikroskop si³ atomowych jest u¿ywany do œledzenia powstawania i rozwoju biofilmu oraz jego zmian wywo³ywanych dzia³aniem czynników zewnêtrznych. Jednoczeœnie analizuje siê wp³yw biofilmu bakteryjnego na strukturê materia³ów, na których powstaje. Wykorzystuj¹c AFM kontroluje siê procesy zwi¹zane z tworzeniem biofilmu, takie jak kolonizacja i korozja. Biofilm wielu szczepów bakteryjnych by³ badany z zastosowaniem ró¿nych technik mikroskopii si³ atomowych, ogl¹dany materia³ by³ suszony lub zanurzony w roztworach wodnych (bufory, pod³o¿a hodowlane). Ze wzglêdu na stosunkowo du¿¹ „miêkkoœæ” materia³u rozdzielczoœæ rzêdu nanometrów nie jest zwykle osi¹gana w tym przypadku [19]. Po raz pierwszy topografiê uwodnionego biofilmu, u¿ywaj¹c mikroskopu si³ atomowych obserwowa³ B r e m e r i wsp. [11]. W badaniach tych udowodniono, ¿e powstaj¹ce na powierzchni metali nad¿erki korozyjne, s¹ œciœle zwi¹zane ze wzrostem bakterii w tych miejscach. T e l e g d i i wsp. [53] obserwowali korozjê ¿elaza, miedzi i pirytu wywo³an¹ tworz¹cym siê na nich biofilmem. Wykazano, ¿e zjawisko korozji jest zale¿ne od procesów biochemicznych przeprowadzanych przez bakteriê oraz od budowy danego materia³u. W badaniach u¿yte zosta³y czyste lub mieszane kultury nastêpuj¹cych bakterii Desulfovibrio desulfuricans, T. ferrooxidans, Thiobacillus intermedius, Leptospirillum ferrooxidans. Inne badania prowadzono na Deinococcus geothermalis, który jest u¿ywany do tworzenia pierwszej warstwy biofilmu w maszynach do produkcji papieru. W badaniach tych wykazano, ¿e biofilm D. geothermalis nie jest intensywnie pokryty zewn¹trzkomórkowym polimerem, a za jego adhezjê odpowiadaj¹ struktury podobne do pseudopodiów. Obrazy fazowe ujawni³y, ¿e powierzchnia komórek D. geothermalis jest niejednorodna i wystêpuj¹ tam regiony ró¿ni¹ce siê elastycznoœci¹ i si³ami adhezji. [30]. Z kolei morfologia biofilmu Pseudomonas putida, rosn¹cego w warunkach wilgotnego powietrza by³a analizowana przez A u e r b a c h i wsp. [3]. 6.3. Warstwy i sk³adniki bakteryjnych os³on komórkowych Technika AFM pozwala zazwyczaj na osi¹gniêcie wysokiej rozdzielczoœci w przypadku badañ warstw os³on komórki bakteryjnej. Dla takich struktur jak b³ona 428

purpurowa czy warstwa S wynika to przede wszystkim z budowy tych warstw charakteryzuj¹cych siê du¿¹ sztywnoœci¹ oraz wysokim stopniem uporz¹dkowania. AFM daje jednak nie tylko mo¿liwoœæ obserwacji tych warstw z wysok¹ rozdzielczoœci¹ w warunkach fizjologicznych, ale za jego pomoc¹ bada siê równie¿ konformacjê buduj¹cych je cz¹steczek. Wystêpuj¹ca na powierzchni niektórych bakterii warstwa S zbudowana jest z bia³ek lub glikoprotein o masie cz¹steczkowej od 10 do 200 kDa i najczêœciej u danego gatunku sk³ada siê z jednego rodzaju bia³ka. Jej podstawow¹ jednostk¹ budulcow¹ s¹ monomery, tworz¹ce podjednostki. Ze wzglêdu na regularn¹ strukturê, warstwy S uwa¿a siê za parakrystaliczne lub nawet krystaliczne. Zewn¹trz- i wewn¹trzkomórkowa powierzchnia warstw S charakteryzuje siê zazwyczaj odmienn¹ struktur¹ [33]. W badaniach Bacillus coagulans wykonanych przez Hörber i wsp. [25] uwidoczniono warstwê S skanuj¹c powierzchniê ¿ywej komórki. Natomiast wyizolowana ze szczepu D. radiodurans warstwa S wykazuj¹ca heksagonaln¹ symetriê by³a adsorbowana na œwie¿o roz³upanej mice. W badaniach tych osi¹gniêto rozdzielczoœæ rzêdu 1 nm i wykazano, ¿e cytoplazmatyczna czêœæ warstwy S D. radiodurans zbudowana jest z podjednostek, sk³adaj¹cych siê z szeœciu monomerów otaczaj¹cych centralny otwór posiadaj¹cy dwie konformacje, otwart¹ i zamkniêt¹ [26]. Obserwowano przechodzenie jednej konformacji w drug¹ [36]. Warstwa S Corynebacterium glutamicum by³a badana w stanie natywnym oraz po trawieniu trypsyn¹. Adsorbowana na mice tworzy³a dwuwarstwê, któr¹ rozdzielono za pomoc¹ ig³y AFM, uzyskuj¹c dostêp do powierzchni zewn¹trz- i wewn¹trzkomórkowej. Lokalizacja uwolnionego za pomoc¹ trypsyny C-koñcowego fragmentu by³a mo¿liwa dziêki ró¿nicom w topografii warstwy S w stanie natywnym i po proteolitycznym trawieniu [49]. Przedmiotem intensywnych badañ za pomoc¹ AFM by³a równie¿ b³ona bakterii purpurowych, w sk³ad której wchodz¹ lipidy oraz jako jedyny sk³adnik bia³kowy bakteriorodopsyna. Gould i wsp. [23] ogl¹dali b³onê purpurow¹ zaadsorbowan¹ na szkle pokrytym poli-L-lizyn¹ oraz na œwie¿o roz³upanej mice. Otrzymano tak¿e obraz topografii powierzchni b³ony archebakterii Halobacterium salinarum z rozdzielczoœci¹ poni¿ej 1 nm [41]. Do rozró¿nienia czêœci zewn¹trz- i wewn¹trzkomórkowej zosta³y u¿yte przeciwcia³a skierowane przeciwko C-koñcowi bakteriorodopsyny zlokalizowanwemu po stronie cytoplazmatycznej. Pêtle bakteriorodopsyny ³¹cz¹ce "-helikalne odcinki transmembranowe by³y dobrze widoczne i przyjmowa³y ró¿ne konformacje w zale¿noœci od sposobu upakowania bakteriorodopsyny w dwuwarstwie lipidowej [35, 40]. AFM umo¿liwi³ równie¿ badania nad pojedynczymi cz¹steczkami buduj¹cymi os³ony komórkowe bakterii. Lipopolisacharyd (LPS) jest cz¹steczk¹ wchodz¹c¹ w sk³ad b³ony zewnêtrznej bakterii Gram-ujemnych i jest znany ze swojej aktywnoœci biologicznej [47]. A u r e l l i wsp. [4] obserwowali morfologiê i geometriê lipopolisacharydów Salmonella minnesota Re595, S. typhimurium i E. coli O111:B4. Badania by³y prowadzone w roztworze buforowym przy lub poni¿ej krytycznego stê¿enia micelarnego. Lipopolisacharydy badanych szczepów ró¿ni¹ce siê d³ugoœci¹ ³añcucha polisacharydowego tworzy³y agregaty o ró¿nej geometrii. Z kolei K a t o i wsp. [29] przeprowadzili analizê kryszta³ów lipopolisacharydu Re E. coli tworz¹cych siê po przechowywaniu ich w 1% roztworze trójetyloaminy. Za pomoc¹ 429

mikroskopu si³ atomowych wykazano, ¿e kryszta³y LPS tworz¹ monowarstwê, z³o¿on¹ z dwóch czêœci. Na jedn¹ z czêœci sk³ada³y siê ³añcuchy acylowe, zaœ na drug¹ kwas 3-deoksy-D-manno-oktulozonowy wraz z N-acetyloglukozamin¹ lipidu A. Poryny OmpF s¹ bia³kami b³ony zewnêtrznej bakterii Gram-ujemnych, o masie cz¹steczkowej miêdzy 28 a 48 kDa, tworz¹cymi kana³y dyfuzyjne s³u¿¹ce do transportu zwi¹zków o charakterze hydrofilowym [33]. S c h a b e r t i wsp. [48] badali topografiê tworz¹cych siê w obecnoœci lipidów dwuwymiarowych kryszta³ów OmpF. Uzyskano rozdzielczoœæ w p³aszczyŸnie poziomej rzêdu 1 nm i w p³aszczyŸnie pionowej 0,1 nm. Wykazano, ¿e wewn¹trz- i zewn¹trzkomórkowa powierzchnia poryn ró¿ni siê ultrastruktur¹. Ponadto zewn¹trzkomórkowa czêœæ poryn przyjmuje dwie odmienne konformacje. M ü l l e r i wsp. [38] przeprowadzili doœwiadczenia, w których bezpoœrednio wykazali, ¿e zmiany konformacji zewnêtrznych pêtli poryn s¹ zale¿ne od pH oraz przy³o¿onego napiêcia i s¹ zwi¹zane z otwarciem lub zamkniêciem kana³ów. Taki mechanizm prawdopodobnie zabezpiecza komórkê przed niekorzystnymi zmianami zachodz¹cymi w otaczaj¹cym je œrodowisku. U dro¿d¿y Saccharomyces cerevisiae bia³ko Fin 1 tworzy filament pomiêdzy dwoma p¹czkuj¹cymi komórkami. v a n H e m e r t i wsp. [56] zaobserwowali, ¿e wyizolowane bia³ko Fin 1 tworzy spontanicznie strukturê filamentu o szerokoœci 10 nm. Ponadto ultrastruktura hydrofobin, wydzielniczych bia³ek grzybów, pe³ni¹cych wiele funkcji we wzroœcie i rozwoju by³a równie¿ badana za pomoc¹ AFM, przez W ö s t e n i wsp. [57]. 7. Obrazowanie DNA Mikroskop AFM by³ równie¿ u¿ywany do analizy DNA; pojedynczej nici, podwójnej oraz kompleksów DNA-metale. Wiele prac zosta³o poœwiêconych oddzia³ywaniom miêdzy DNA a bia³kami m. in. w powi¹zaniu z takimi procesami jak replikacja czy transkrypcja. Mikroskop si³ atomowych umo¿liwi³ œledzenie inicjacji procesu transkrypcji w komórce bakteryjnej. R i p p e i wsp. [46] obserwowali strukturê poœrednich produktów transkrypcji przebiegaj¹cej z udzia³em RNA polimerazy F54E. coli. Wykazano, ze wielkoœæ zgiêcia DNA by³a zale¿na od przestrzennego u³o¿enia pomiêdzy DNA a polimeraz¹. Zastosowanie techniki nieci¹g³ej w œrodowisku wodnym pozwoli³o na bezpoœredni¹ analizê aktywnoœci polimerazy F54. Zaobserwowano, po dodaniu 5’-trójfosforanów rybonukleozydów, przesuwanie siê podwójnej nici DNA wzd³u¿ bia³ka [28]. 8. W³aœciwoœci fizyko-chemiczne powierzchni komórki bakteryjnej 8.1. Powierzchniowe si³y Proces adhezji bakterii do ró¿nych materia³ów sk³ada siê z dwóch zasadniczych etapów. Pocz¹tkowo dominuj¹c¹ rolê odgrywaj¹ niespecyficzne oddzia³ywania tj. 430

elektrostatyczne, van der Waalsa i hydrofobowe. Dopiero gdy komórka bakteryjna znajduje siê w bliskim kontakcie z powierzchni¹ materia³u znaczenia nabieraj¹ oddzia³ywania specyficzne (np. typu ligand-receptor). Pierwszy zatem etap procesu adhezji jest œciœle zale¿ny od w³aœciwoœci fizyko-chemicznych powierzchni komórki bakteryjnej i materia³u. Wa¿n¹ rolê odgrywa równie¿ œrodowisko, w którym odbywa siê proces. W badaniach adhezji bakterie mog¹ byæ immobilizowane do powierzchni lub te¿ do ig³y mikroskopu [45]. Zasadniczym warunkiem w tego typu doœwiadczeniach jest otrzymanie jednorodnej warstwy bakterii oraz ich trwa³a immobilizacja. W badaniach przeprowadzonych przez O n g i wsp. [43] mierzono oddzia³ywania wystêpuj¹ce pomiêdzy bakteriami E. coli immobilizowanymi na igle, a materia³ami ró¿ni¹cymi siê hydrofobowoœci¹. Jednorodna warstwa zosta³a uzyskana w wyniku adsorpcji komórek bakteryjnych utrwalonych glutaraldehydem na igle modyfikowanej polietylenoimin¹. Wykazano, ¿e adhezja bakterii jest silniejsza do powierzchni bardziej hydrofobowych. R a z a t o s i wsp. [44] mierzyli oddzia³ywania pomiêdzy ig³¹ a jednorodn¹ warstw¹ komórek, utworzon¹ przez mutanty E. coli ró¿ni¹ce siê budow¹ czêœci polisacharydowej lipopolisacharydu. Si³y adhezji by³y zale¿ne od d³ugoœci czêœci cukrowej oraz obecnoœci na powierzchni otoczkowego polisacharydu – kwasu kolanowego. F a n g i wsp. [21] wykazali, ¿e si³y adhezji pomiêdzy ig³¹ zbudowan¹ z azotku krzemu a warstw¹ bakterii by³y wiêksze w miejscach nagromadzenia polimeru zewn¹trzkomórkowego. Natomiast L o w e r i wsp. [31] studiowali interakcje wystêpuj¹ce pomiêdzy Shewanella oneidensis (bakteri¹ redukuj¹c¹ metale w procesie oddychania), a geotytem ("FeOOH). Si³y adhezji miêdzy komórkami S. oneidensis a minera³em wzrasta³y w warunkach beztlenowych, w których zachodzi transport elektronów. Zwiêkszona adhezja jest prawdopodobnie skutkiem pojawienia siê na powierzchni komórki bakteryjnej, w warunkach beztlenowych, bia³ek (w tym bli¿ej nieznanej reduktazy o masie cz¹steczkowej 150 kDa) reaguj¹cych specyficznie z minera³em. Si³y adhezji miêdzy metabolicznie aktywnymi komórkami S. cerevisiae a mik¹, silanowan¹ mik¹ i mik¹ pokryt¹ bia³kiem (BSA) by³y mierzone w œrodowisku wodnym. W badaniach tych pojedyncza komórka by³a immobilizowana na koñcu ig³y za pomoc¹ niewielkiej iloœci kleju i mikromanipulatora umo¿liwiaj¹cego w³aœciwe u³o¿enie komórki na koñcu ig³y. Si³y adhezji do powierzchni zmienia³y siê w zale¿noœci od fazy cyklu ¿yciowego, w którym znajdowa³y siê komórki Saccharomyces cerevisiae. W fazie stacjonarnej zaobserwowano wzrost si³ adhezji, skorelowany ze zwiêkszon¹ hydrofobowoœci¹. Wa¿nym parametrem w tych badaniach by³ czas, w którym komórka oraz powierzchnia materia³u pozostawa³y ze sob¹ w kontakcie [8]. Ró¿ni¹ce siê topografi¹ powierzchni spory grzyba Phanerochaete chrysosporium odznacza³y siê równie¿ odmiennymi w³aœciwoœciami adhezyjnymi. Spory znajduj¹ce siê w stanie generatywnym wykazywa³y znaczne si³y adhezji 9 ± 2 nN, których nie stwierdzono u spor wegetatywnych [16]. Wyniki te zosta³y powi¹zane z odmienn¹ funkcj¹ fizjologiczn¹ spor znajduj¹cych siê w ró¿nych stadiach cyklu ¿yciowego. Brak si³ adhezji wydaje siê byæ korzystny w przypadku spor wegetatywnych, które spe³niaj¹ rolê ochronn¹ i maj¹ przede wszystkim za zadanie rozprzestrzeniaæ siê w œrodowisku. Silne si³y adhezji wystêpuj¹ce u spor generatywnych s¹ prawdopodobnie zwi¹zane 431

z intensywniejsz¹ produkcj¹ polisacharydu u³atwiaj¹cego ich agregacjê. W dalszych etapach tych badañ mierzono si³y na sporach wegetatywnych za pomoc¹ ig³y modyfikowanej monowarstw¹ alkanotiolu zakoñczonego grup¹ hydroksylow¹ lub metylow¹. W obu przypadkach, podobnie jak w przypadku ig³y nie modyfikowanej, nie wykazano obecnoœci si³ adhezji. Na tej podstawie wysuniêto wniosek o hydrofilowym charakterze powierzchni spor w stanie wegetatywnym [17]. Kilku stopniowymi si³ami adhezji charakteryzowa³a siê powierzchnia Lactococcus lactis. Oderwanie ig³y od powierzchni komórki bakteryjnej nastêpowa³o gdy dystans miêdzy nimi wynosi³ 30 nm. Zjawisko to jest prawdopodobnie wynikiem tworzenia siê mostków przez ³añcuchy polisacharydu zewn¹trzkomórkowego [18]. Kilku stopniowe si³y adhezji zaobserwowano równie¿ gdy badano powierzchniê urzêsionego szczepu Streptococccus salivarius HB. Gdy badania by³y prowadzone w wodzie, si³y adhezji wystêpowa³y przy odleg³oœciach miêdzy ig³¹ a powierzchni¹ komórki równych ~ 50, ~ 100 i ~ 220 nm. Prawdopodobnie zaobserwowane oddzia³ywania s¹ wynikiem adhezji miêdzy ig³¹ a rzêskami ró¿nej d³ugoœci [55]. Si³y powierzchniowe by³y mierzone nie tylko dla ca³ych komórek, ale równie¿ dla wyizolowanych warstw os³on komórkowych. Badania przy u¿yciu ig³y pokrytej monowarstw¹ alkanotiolu zakoñczonego grup¹ metylow¹ lub hydroksylow¹ by³y prowadzone dla warstwy S szczepów B. coagulans E38-66 oraz Bacillus sphaericus CCM2177. W obu przypadkach zaobserwowano brak si³ adhezji oraz odpychanie przy przybli¿aniu ig³y do powierzchni komórki. Si³y odpychania pojawia³y siê przy odleg³oœci ~ 20 i ~ 60 nm, odpowiednio dla B. coagulans i B. sphaericus. Podobne wyniki uzyskano prowadz¹c badania w 0,1 M roztworze NaCl, dowodz¹c braku wp³ywu si³y jonowej na uzyskane wartoœci [18]. 8.2. W³aœciwoœci mechaniczne Do tej pory bardzo trudno by³o okreœliæ jak elastyczna jest komórka bakteryjna oraz jakie czynniki kszta³tuj¹ tê w³aœciwoœæ. A r n o l d i i wsp. [2] obserwowali wp³yw ciœnienia osmotycznego na mechaniczne w³aœciwoœci Gram-ujemnej bakterii Magnetospirillum gryphiswaldense. Wyznaczona eksperymentalnie wartoœæ sta³ej sprê¿ystoœci komórki M. gryphiswaldense wynosi³a 42 mN/m i nie zale¿a³a od osmolarnoœci buforu w którym dokonywano pomiaru. X u i wsp. [58] badali mechaniczne w³aœciwoœci pochewki bia³kowej metanogennej bakterii Methanospirillum hungatei. Wyizolowana pochewka by³a adsorbowana na p³ytce z do³kami. Natomiast ig³a AFM naciska³a na pochewkê w kierunku do³ka. Wyznaczona eksperymentalnie wartoœæ modu³u Younga wynosi³a od 2 do 4×1010 N/m2, wskazuj¹c na zdolnoœæ pochewki bia³kowej do wytrzymania ciœnienia wewnêtrznego od 300 do 400 atm. Na podstawie uzyskanych danych autorzy zasugerowali, ¿e pochewka bia³kowa dzia³a jak regulator ciœnienia rozci¹gaj¹c siê i kurcz¹c w wyniku jego zmian. Umo¿liwia to wydalanie metanu z komórki tylko gdy zostanie osi¹gniête jego odpowiednie ciœnienie wewn¹trz komórki. Podobny sposób przygotowania preparatu zastosowali Ya o i wsp. [59] do badañ w³aœciwoœci mechanicznych 432

sakulusów E. coli K12 i Pseudomonas aeruginosa PAO1. Spory grzyba Phanerochaete chrysosporium, w zale¿noœci czy by³y badane w stanie wegetatywnym czy generatywnym wykazywa³y ró¿nice we w³aœciwoœciach mechanicznych. Spory kie³kuj¹ce odznacza³y siê wiêksz¹ miêkkoœci¹ [17]. Odmiennymi mechanicznymi w³aœciwoœciami charakteryzowa³ siê urzêsiony i nie urzêsiony szczep Streptococcus salivarius. Na podstawie kszta³tu krzywej dla si³y wzglêdem odleg³oœci, wykazano ¿e szczep nie urzêsiony jest znacznie sztywniejszy ni¿ urzêsiony [55]. Za pomoc¹ AFM mo¿na równie¿ dokonywaæ pomiarów si³ zwi¹zanych z pojedyncz¹ cz¹steczk¹. Gdy ig³a mikroskopu jest odrywana od powierzchni makrocz¹steczki obserwuje siê kilku stopniowe si³y adhezji. Ich wystêpowanie jest zwi¹zane z rozci¹ganiem poszczególnych monomerów buduj¹cych makrocz¹steczkê [20]. Badania takie dostarczaj¹ informacji na temat mechanicznej stabilnoœci cz¹steczki. Bakteriorodopsyna by³a ekstrahowana z b³ony purpurowej za pomoc¹ ig³y. W wyniku ekstrakcji kolejne "-helisy wchodz¹ce w sk³ad cz¹steczki ulega³y rozfa³dowaniu. Si³y utrzymuj¹ce poszczególne "-helisy w b³onie mieœci³y siê w zakresie od 100 do 200 pikonewtonów [42]. Podobne doœwiadczenia by³y prowadzone dla warstwy S D. radiodurans. W tym wypadku uzyskiwano krzywe dla si³y wzglêdem odleg³oœci charakteryzuj¹ce siê 6-stopniowymi si³ami adhezji. Poszczególne stopnie odpowiada³y rozfa³dowaniu kolejnych monomerów buduj¹cych heksamer. Pomiar si³ wi¹za³ siê z ca³kowit¹ ekstrakcj¹ heksameru z warstwy S [36, 37]. 9. Podsumowanie Znaczenie metody AFM bêdzie coraz wiêksze. Poszerzaæ siê bêd¹ mo¿liwoœci techniki poprzez wprowadzanie ulepszeñ technicznych aparaturowych, a tak¿e ró¿nicowanie warunków przygotowania przedmiotu badania, czy to przez zastosowanie lektyn, enzymów, modyfikacji chemicznych, barwników, metali ciê¿kich, nowych reagentów. Technika znajdzie zastosowanie zarówno w laboratoriach badawczych jak te¿ w szerszej praktyce. Obni¿enie kosztów eksploatacyjnych niezmiernie przyczyni siê do upowszechniania tej techniki. Chocia¿ komórki bakteryjne s¹ dogodniejszym obiektem do badañ ni¿ tkankowe ze wzglêdu na sztywne œciany komórkowe, dlatego wielorakie aplikacje w mikrobiologii s¹ najliczniejsze, to jednak metodyka w odniesieniu do komórek organizmów wy¿szych bêdzie tak¿e siê doskonaliæ. O ile ka¿da metodyka ma swoje ograniczenia, tak i AFM nie jest technik¹ uniwersaln¹, jednak sta³a siê ju¿ kolejnym u¿ytecznym narzêdziem badawczym i analitycznym w arsenale metod do wyboru s³u¿¹cych badaczom. W podsumowaniu nale¿y podkreœliæ istotne cechy AFM, które stawiaj¹ tê metodê w poczet jednych z wa¿niejszych, mianowicie analiza materia³u biologicznego w warunkach fizjologicznych, mo¿liwoœæ badania ultrastruktury powierzchni komórkowej i jednoczeœnie pomiaru si³ uczestnicz¹cych w oddzia³ywaniach miêdzycz¹steczkowych.

433

Piœmiennictwo 1. Albrecht T.R., Grütter P., Horne D., Rugar D.: Frequency modulation detection using high-Q cantilevers for enhanced force microscope sensitivity. J. Appl. Phys. 69, 668–673 (1991) 2. Arnoldi M., Kacher C., Bäuerlein E., Radmacher M., Fritz M.: Elastic properties of the cell wall of Magnetospirillum gryphiswaldense investigated by atomic force microscopy. Appl. Phys. A, 66, 613–617 (1998) 3. Auerbach I.D., Sorensen C., Hansma H.G., Holden P.A.: Physical morphology and surface properties of unsaturated Pseudomonas putida biofilms. J. Bacteriol. 182, 3809–3815 (2000) 4. Aurell C.A., Hawley M.E., Wistrom A.O.: Direct visualization of gram-negative bacterial lipopolysaccharide self-assembly. Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 2, 42–46 (1999) 5. Binning G., Rohrer H., Gerber Ch., Weibel E.: Surface studies by scanning tunneling microscopy. Phys. Rev. Lett. 49, 57–61 (1982) 6. Binning G., Quate C.F., Gerber Ch.: Atomic force microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930–933 (1986) 7. Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Filonov A.S., Frolova O.Y., Lyubchenko Y.L., Yaminsky I.V.: Comparative studies of bacteria with an atomic force microscopy operating in different modes. Ultramicrosc. 86, 121–128 (2001) 8. Bowen W.R., Lovitt R.W., Wright C.J.: Atomic force microscopy study of the adhesion of Saccharomyces cerevisiae. J. Colloid Interface Sci. 237, 54–61 (2001) 9. Boyle-Vavra S., Hahm J., Sibener S.J., Daum R.S.: Structural and topological differences between a glycopeptide-intermediate clinical strain and glycopeptide-susceptible strains of Staphylococcus aureus revealed by atomic force microscopy. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3456–3460 (2000) 10. Braga P.C., Ricci D.: Atomic force microscopy: application to investigation of Escherichia coli morphology before and after exposure to cefodizime. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 18–22 (1998) 11. Bremer P.J., Geesey G.G., Drake B.: Atomic force microscopy examination of the topography of a hydrated bacterial biofilm on a copper surface. Curr. Microbiol. 24, 223–230 (1992) 12. Butt H.J.: Measuring electrostatic, van der Waals, and hydration forces in electrolyte solutions with an atomic force microscope. Biophys. J. 60, 1438–1444 (1991) 13. Camesano T. A., Natan M. J., Logan B.E.: Observation of changes in bacterial cell morphology using tapping mode atomic force microscopy. Langmuir, 16, 4563–4572 (2000) 14. Colton R.J., Baselt D.R., Dufrêne Y.F., Green J.B., Lee G.U.: Scanning probe microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 370–377 (1997) 15. Ducker W. A., Senden T. J., Pashley R. M.: Direct measurement of the forces on a colloid particle using an atomic force microscope. Nature, 353, 239–241 (1991) 16. Dufrêne Y.F., Boonaert C.J., Gerin P.A., Asther M., Rouxhet P.G.: Direct probing of the surface ultrastructure and molecular interactions of dormant and germinating spores of Phanerochaete chrysosporium. J. Bacteriol. 181, 5350–5354 (1999) 17. Dufrêne Y.F.: Direct characterization of the physicochemical properties of fungal spores using functionalized AFM probes. Biophys. J. 78, 3286–3291 (2000) 18. Dufrêne Y.F., Boonaert C.J.P., van der Mei H.C., Busscher H.J., Rouxhet P.G.: Probing molecular interactions and mechanical properties of microbial cell surfaces by atomic force microscopy. Ultramicrosc. 86, 113–120 (2001) 19. Dufrêne Y.F.: Application of atomic force microscopy to microbial surfaces: from reconstituted cell surface layers to living cells. Micron, 32, 153–165 (2001) 20. Dufrêne Y.F.: Atomic force microscopy, a powerful tool in microbiology. J. Bacteriol. 184, 5205–5213 (2002) 21. Fang H.H., Chan K.Y., Xu L.C.: Quantification of bacterial adhesion forces using atomic force microscopy (AFM). J. Microbiol. Methods, 40, 89–97 (2000) 22. Gad M., Ikai A.: Method for immobilizing microbial cells on gel surface for dynamic AFM studies. Biophys. J. 69, 2226–2233 (1995)

434

23. Gould S.A.C., Drake B., Prater C.B., Weisenhorn A.L., Manne S., Hansma H.G., Hansma P.K.: From atoms to integrated-circuit chips, blood cells and bacteria with the atomic force microscope. J. Vac. Sci. Techn. A, 8, 369–373 (1990) 24. Hansma H.G., Pietrasanta L.: Atomic force microscopy and other scanning probe microscopies. Curr. Opin. Chem. Biol. 2, 579–584 (1998) 25. Hörber J.K.H., Häberle W., Ohnesorge F., Binning G., Liebich H.G., Czerny C.P., Mahnel H., Mayr A.: Investigation of living cells in the nanometer regime with the scanning force microscope. Scan. Microsc. 6, 919–930 (1992) 26. Karrasch S., Hegerl R., Hoh J.H., Baumeister W., Engel A.: Atomic force microscopy produces faithful high-resolution images of protein surfaces in an aqueous environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 836–838 (1994) 27. Kasas S., Ikai A.: A method for anchoring round shaped cells for atomic force microscope imaging. Biophys. J. 68, 1678–1680 (1995) 28. Kasas S., Thomson N.H., Smith B.L., Hansma H.G., Zhu X., Guthold M., Bustamante C., Kool E.T., Kashlev M., Hansma P.K.: Escherichia coli RNA polymerase activity observed using atomic force microscopy. Biochem. 36, 461–468 (1997) 29. Kato N., Sugiyama T., Naito S., Arakawa Y., Ito H., Kido N., Ohta M., Sasaki K.: Molecular structure of bacterial endotoxin (Escherichia coli Re lipopolysaccharide): implications for formation of a novel heterogeneous lattice structure. Mol. Microbiol. 36, 796–805 (2000) 30. Kolari M., Schmidt U., Kuismanen E., Salkinoja-Salonen M.S.: Firm but slippery attachment of Deinococcus geothermalis. J. Bacteriol. 184, 2473–2480 (2002) 31. Lower S.K., Hochella M.F.Jr., Beveridge T.J.: Bacterial recognition of mineral surfaces: nanoscale interactions between Shewanella and alpha-FeOOH. Science, 292, 1360–1363 (2001) 32. Magonov S.N., Elings V., Whangbo M.H.: Phase imaging and stiffness in tapping-mode atomic force microscopy. Surf. Sci. Lett. 375, 385–391 (1997) 33. Markiewicz Z.: Struktura i funkcje os³on bakteryjnych. PWN, Warszawa, 1993, s. 179, 212. 34. Mordarska H., Szponar B., Paœciak M.: Promieniowce chorobotwórcze i bakterie promieniowcopodobne: problemy taksonomiczne, diagnostyczne i kliniczne. Mikrob. Med. 2, 3–10 (1999) 35. Müller D.J., Büldt G., Engel A.: Force-induced conformational change of bacteriorhodopsin. J. Mol. Biol. 249, 239–243 (1995) 36. Müller D.J., Baumeister W., Engel A.: Conformational change of the hexagonally packed intermediate layer of Deinococcus radiodurans monitored by atomic force microscopy. J Bacteriol. 178, 3025–3030 (1996) 37. Müller D.J., Baumeister W., Engel A.: Controlled unzipping of a bacterial surface layer with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13170– 13174 (1999) 38. Müller D.J., Engel A.: Voltage and pH-induced channel closure of porin OmpF visualized by atomic force microscopy. J. Mol. Biol. 285, 1347–1351 (1999) 39. Müller D.J., Fotiadis D., Scheuring S., Müller S.A., Engel A.: Electrostatically balanced subnanometer imaging of biological specimens by atomic force microscope. Biophys. J. 76, 1101–1111 (1999) 40. Müller D.J., Sass H.J., Müller S.A., Büldt G., Engel A.: Surface structures of native bacteriorhodopsin depend on the molecular packing arrangement in the membrane. J. Mol. Biol. 285, 1903–1909 (1999) 41. Müller D.J., Heymann J.B., Oesterhelt F., Möller C., Gaub H., Büldt G., Engel A.: Atomic force microscopy of native purple membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1460, 27–38 (2000) 42. Oesterhelt F., Oesterhelt D., Pfeiffer M., Engel A., Gaub H.E., Müller D.J.: Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science, 288, 143–146 (2000) 43. Ong Y-L., Razatos A., Georgiou G., Sharma M.M.: Adhesion forces between E. coli bacteria and biomaterial surfaces. Langmuir, 15, 2719–2725 (1999) 44. Razatos A., Ong Y-L., Sharma M.M., Georgiou G.: Molecular determinants of bacterial adhesion monitored by atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 11059–11064 (1998) 45. Razatos A.: Application of atomic force microscopy to study initial events of bacterial adhesion. Methods Enzymol. 337, 276–285 (2001)

435

46. Rippe K., Guthold M., von Hippel P.H., Bustamante C.: Transcriptional activation via DNA-looping: visualization of intermediates in the activation pathway of E. Coli RNA polymerase x sigma 54 holoenzyme by scanning force microscopy. J. Mol. Biol. 270, 125–138 (1997) 47. Roitt I., Brostoff J., Male D.: Odpornoœæ przeciwbakteryjna i przeciwgrzybicza (w) Immunologia, red. ¯eromski J. Wydawnictwo Medyczne S³otwiñski – Verlag, Brema, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2000, s. 229. 48. Schabert F.A., Henn C., Engel A.: Native Escherichia coli OmpF porin surfaces probed by atomic force microscopy. Science, 268, 92–94 (1995) 49. Scheuring S., Stahlberg H., Chami M., Houssin C., Rigaud J.L., Engel A.: Charting and unzipping the surface layer of Corynebacterium glutamicum with the atomic force microscope. Mol. Microbiol. 44, 675–684 (2002) 50. Shao Z., Mou J., Czajkowsky D.M., Yang J., Yuan J-Y.: Biological atomic force microscopy: what is achived and what is needed. Adv. Phys. 45, 1–86 (1996) 51. Shibata-Seki T., Watanabe W., Masai J.: Imaging of cells with atomic force microscopy operated at a „tapping” mode. J. Vac. Sci. Technol. B, 12, 1530–1534 (1994) 52. Sokolov Y., Firtel M., Henderson G.S.: In situ high-resolustion atomic force microscope imaging of biological surfaces. J. Vac. Sci. Technol. A, 3, 674–678 (1996) 53. Telegdi J., Keresztes Zs., Pálinkás G., Kálmán E., Sand W.: Microbially influenced corrosion visualized by atomic force microscopy. Appl. Phys. A, 66, 639–642 (1998) 54. Umeda A., Saito M., Amako K.: Surface characteristics of Gram-negative and Gram-positive bacteria in an atomic force microscopy image. Microbiol. Immunol. 42, 159–164 (1998) 55. van der Mei H.C., Busscher H.J., Bos R., de Vries J., Boonaert C.J., Dufrêne Y.F.: Direct probing by atomic force microscopy of the cell surface softness of a fibrillated and nonfibrillated oral streptococcal strain. Biophys. J. 78, 2668–2674 (2000) 56. van Hemert M.J., Lamers G.E., Klein D.C., Oosterkamp T.H., Steensma H.Y., van Heusden G.P.: The Saccharomyces cerevisiae Fin 1 protein forms cell cycle-specific filaments between spindle pole bodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5390–5393 (2002) 57. Wösten H.A.B., de Vocht M.L.: Hydrophobins, the fungal coat unravelled. Biochim. Biophys. Acta, 1469, 79–86 (2000) 58. Xu W., Mulhern P.J., Blackford B.L., Jericho M.H., Firtel M., Beveridge T.J.: Modeling and measuring the elastic properties of an archaeal surface, the sheath of Methanospirillum hungatei, and the implication of methane production. J. Bacteriol. 178, 3106–3112 (1996) 59. Yao X., Jericho M., Pink D., Beveridge T.: Thickness and elasticity of gram-negative murein sacculi measured by atomic force microscopy. J. Bacteriol. 181, 6865–6875 (1999) 60. You H.X., Yu L.: Atomic force microscopy imaging of living cell: progress, problems and prospects. Methods in Cell Science, 21, 1–17 (1999) 61. Zhong Q., Inniss D., Kjoller K., Elings V.B.: Tapping mode atomic force microscopy in liquid with an insulated. Surf. Sci. Lett. 290, 688–692 (1993) Praca zosta³a wykonana w ramach projektu KBN nr 3 P05A 142 22. Autorzy dziêkuj¹ dr Bengtowi Danielssonowi z Uniwersytetu w Lund za udostêpnienie mikroskopu AFM i dr Igorowi Budashov z Uniwersytetu im. £omonosowa w Moskwie za wprowadzenie do mikroskopii AFM oraz mgr Annie Kaminskiej z Politechniki Wroc³awskiej za wykonanie zdjêæ na SEM. Instytut Immunologii i Terapii Doœwiadczalnej, Polska Akademia Nauk ul. Weigla 12, 53-114 Wroc³aw Wp³ynê³o we wrzeœniu 2003 r.

436

Spis treœci B. R u b a n - O œ m i a ³ o w s k a, J. Z a k r z e w s k a - C z e r w i ñ s k a – Zastosowanie bia³ka zielonej fluorescencji do badania dynamiki replikacji i segregacji chromosomu bakteryjnego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. S a d o w y – Wybrane aspekty molekularne nosicielstwa bakteryjnego w nosogardzieli cz³owieka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. M i k u c k a – Coryneform bakterie – znane drobnoustroje, nieznane patogeny? . . . . . . . . . . A. M i k u c k a – Znaczenie Corynebacterium sp. w zaka¿eniach szpitalnych . . . . . . . . . . . . . . A. G r z e g o r z e w i c z, A. G a m i a n – Mikroskop si³ atomowych nowym narzêdziem badawczym w mikrobiologii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

359 369 385 403 419

Contents B. R u b a n - O œ m i a ³ o w s k a, J. Z a k r z e w s k a - C z e r w i ñ s k a – Visualization of bacterial chromosome dynamics with green fluorescent protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. S a d o w y – Bacterial carriage in human nasopharynx: selected molecular aspects . . . . . . A. M i k u c k a – Coryneform bacteria – known bacteria, unknown pathogens? . . . . . . . . . . . . A. M i k u c k a – Significance of Corynebacterium spp. in hospital infections . . . . . . . . . . . . . . A. G r z e g o r z e w i c z, A. G a m i a n – Atomic force microscope a new investigation tool in microbiology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

359 369 385 403 419