Wie funktioniert der FORT Test (Free Oxygen Radicals Test) mit dem

FORM Analysator (Free Oxygen Radicals Monitor) ?

Einführung zur Thematik der freien Radikale Normalerweise verfügen alle Stoffe über eine äußere Elektronenschale mit Elektronenpaarbindung. Sobald ein Elektron unter den verschiedensten Einflüssen aus der äußeren Schale entfernt wird oder ein neues hinzukommt, entsteht ein freies Radikal. Freie Radikale können elektrisch neutral, positiv oder negativ geladen sein. Radikale, speziell jene mit niedrigem Molekulargewicht, sind hochgradig reaktiv und kurzlebig. Infolge ihrer Instabilität sind freie Radikale extrem reaktionsfreudig und attackieren nahezu alle Biomoleküle in ihrer Umgebung. Seit die Rolle der freien Radikale für den Alterungsprozess und die Pathogenese zahlreicher Erkrankungen wissenschaftlich allgemein anerkannt ist, gewann dieses Forschungsgebiet zunehmend an Bedeutung. Als Risikofaktoren können die freien Radikale nicht länger ignoriert werden. In biologischen Systemen sind sie hauptsächlich als reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vertreten, die das Hydroxylradikal (OH°), das Superoxidradikal (O2° ), das Hydrogenperoxid (H2O2) und den 1 Singulettsauerstoff ( O2°) mit einschließen. Obgleich der Großteil der freien Radikale potentiell gefährlich ist, sind andere wiederum für intrazelluläre Stoffwechselreaktionen erforderlich und stellen ein wichtiges Instrument für die phagozytierenden Zellen zur Abtötung von Fremdorganismen dar. Damit brauchen wir letztendlich freie Radikale und gleichzeitig stellen sie unseren gesundheitlichen Ruin dar. Wie freie Radikale entstehen Es gibt verschiedene Möglichkeiten wie freie Radikale, speziell Sauerstoffradikale in lebenden Organismen gebildet werden können. Aus rein chemischer Sicht ist die am häufigsten stattfindende Reaktion die Anlagerung eines Elektrons an molekularen Sauerstoff, wobei das Superoxidradikal entsteht. 02 + e

 O2-°

Normalerweise ist diese Reaktion an einen Elektronenverlust der Elektronentransportkette gekoppelt, speziell bei jener, die im Endoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien abläuft. Das Superoxidradikal (O2-°) wird auch bei verschiedenen enzymatischen Reaktionen gebildet, z. B. bei solchen, die durch die Flavinoxidase und die Xanthinoxidase katalysiert werden oder bei der Autoxidation verschiedener Thiole (z. B. Glutathion) und Semichinone (z. B. Coenzym Q). Eine andere Möglichkeit für die in vivo Entstehung von Superoxidradikalen stellt der "respiratory burst" dar, der in den Zellen des Immunsystems (Neutrophile Granulozyten, Monozyten und Makrophagen) und bei entzündlichen und infektiösen Prozessen stattfindet. Freien Radikalen misst man eine fundamentale Rolle bei all diesen Prozessen bei. Die körpereigenen Verteidigungsmechanismen gegen eindringende Fremdorganismen sind von der Funktionstüchtigkeit dieser Zellen abhängig, die nach der Phagozytose dem "respiratory burst" unterworfen sind, bei welchem vermehrt Sauerstoff umgesetzt wird. Superoxid und hypochlorige Säure (beides Radikalspezies) werden daraufhin vermehrt freigesetzt. Weiterhin können Superoxidradikale auch durch die Autoxidation reduzierter Übergangsmetalle generiert werden: Fe

2+

+ O2



Fe3+ + O2 -°

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Obgleich das Superoxidradikal selbst nicht sehr reaktiv ist, kann es in biologischen Systemen in hochreaktive und gefährliche Hydroxylradikale überführt werden. Wenn das Superoxidradikal erst einmal entstanden ist, kann es in vivo durch die Reaktion mit Eisenionen in das Hydroxylradikal (OH°) umgewandelt werden (Haber-Weiss-Reaktion): O2-° + Fe3+  O2 + Fe2+ Fe2+ + H2O2  OH° + OH- + Fe3+ ____________________________________ O2-° + H2O2  OH° + OH- + O2 Das Hydroxylradikal selbst ist extrem reaktiv und wird als Hauptursache für die Strukturschädigung von Zellen betrachtet. Die am weitesten verbreitete Schädigung, die durch diese Radikale induziert wird, ist die Lipidperoxidation, welche die Ursache für die Bildung von Substanzen wie den Hydroperoxiden darstellt, die wiederum als Indikator für den oxidativen Stress im FORM Diagnostik System herangezogen werden können. Malondialdehyd (MDA) kann während der Lipidperoxidation gebildet werden, aber nur wenn das endogen antioxidative Potential völlig aufgezehrt ist. Damit wird deutlich, dass mit der Bestimmung des MDA ein später Indikator des oxidativen Stresses in biologischen Systemen erfasst wird. Lipidperoxidation In lebenden Organismen ist die oxidative Modifizierung der Lipide unter der Bezeichnung Lipidperoxidation bekannt, einem autokatalytischen Prozess in dessen Verlauf mehrfach ungesättigte Fettsäuren und Phospholipide durch eine Kettenreaktion geschädigt werden, bei der Lipidhydroperoxide (ROOH) in Zellmembranen und Körperflüssigkeiten gebildet werden. Ein einziges freies Radikal kann die Bildung Hunderter von Lipidperoxiden zur Folge haben, bevor die radikalische Kettenreaktion unterbrochen wird. (Abbildung 1). Da die zelluläre Membran hochempfindlich gegen die durch freie Radikale verursachte Lipidperoxidationen ist, kann dieser Vorgang zur Akkumulation einer Reihe von Nebenprodukten - u. a. Hydroperoxiden - führen. In der Folge kommt es zu einer massiven Schädigung der Zellmembranen und der intrazellulären Komponenten. Diese Prozesse können das Absterben der Zellen zur Folge haben.

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Abbildung 1: Bildung von Hydroperoxiden aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren

Die Hydroperoxide (ROOH), die in der Abbildung 1 wiedergegeben sind, werden mit dem FORM System bestimmt. Die radikalische Kettenreaktion findet in erster Linie in den Lipidmembranen statt, kann aber auch an anderen Biomolekülen wie den Aminosäuren, den Proteinen oder den Nukleotiden ablaufen. Die Stoffwechselreaktionen können folgendermaßen zusammengefasst werden: Das erste aus dem Kohlenwasserstoffstoff freigesetzte freie Radikal kann durch Reaktion mit Hydroxylradikalen (OH°) gebildet werden: RH + OH°  R° + H2O Das Kohlenstoffradikal reagiert mit Sauerstoffmolekülen, die zur Bildung von Peroxidradikalen führen: R° +

O2

 ROO°

Daraufhin reagiert das Peroxidradikal mit einem intakten Kohlenwasserstoff und generiert Hydroperoxide und ein neues Kohlenstoffradikal. Das Hydroperoxid, welches daraufhin gebildet wird, ist ein reaktiver Sauerstoffmetabolit (ROM).

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ROO°

+

R1H  ROOH + R1°

Wie bereits erwähnt, kommt zur oxidativen Modifikation der Fette durch Sauerstoffradikale auch noch eine hohe Rate an oxidativen Schäden der DNA hinzu. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass die Bildung von 8-Hydroxy-2`- Deoxyguanosin als ein Marker für die oxidative Schädigung der DNA betrachtet werden kann. Wie freie Radikale inaktiviert werden können Obgleich freie Radikale in großen Mengen in allen Zellen gebildet werden, gibt es zahlreiche natürliche Verteidigungssysteme um ihre Bildung zu verhindern oder sie nach ihrer Freisetzung zu inaktivieren. Die natürlichen Verteidigungsmechanismen gegen freie Radikale können in vier Hauptgruppen unterteilt werden, die auf verschiedenen Mechanismen beruhen: Antioxidative Enzyme, wie z. B. Katalase, Superoxiddismutase (SOD) und Glutathionreduktase Metallbindende Proteine: Coeruloplasmin, Ferritin, Hämoglobin etc. Allgemeine Antioxidantien: Bilirubin, Carotinoide, Flavonoide, Vitamine (A,C,E) Andere Antioxidantien: Glutathion (GSH), Selen Diese sind in der Lage freie Radikale zu neutralisieren, aber unter einer Vielzahl von Einflüssen steigt die Produktion von freien Radikalen dramatisch an und diese reagieren dann mit den Biomolekülen an den Orten der Entstehung. Sämtliche Zellstrukturen können von den freien Radikalen attackiert werden, obgleich nicht alle Zellen in gleichem Maß empfindlich reagieren. Fette bilden beispielsweise die häufigsten Targetmoleküle der freien Radikale - sie sind am stärksten gefährdet.

Wie man freie Radikale messen kann Da freie Radikale hoch reaktiv und instabil sind, ist es sehr schwierig sie zu messen. Das gilt vor allem für die Bestimmung in biologischen Systemen wie Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten. Es gibt einige wenige Messmethoden, um freie Radikale direkt zu messen, z. B. die wissenschaftlich anerkannte Elektronenspinresonanzspektroskopie (ESR), die unter Einbezug von spin traps und Chemolumineszenz erfolgt. Die ESR-Methode nutzt das magnetische Moment, welches durch die rotierende Ladung eines Elektrons hervorgerufen wird. Diese Methode kann speziell bei komplexen biologischen Systemen gut angewendet werden, aber die Hauptschwierigkeit dieser Methode besteht in deren Komplexität und in den hohen apparativen Kosten. Diese Messmethodik ist daher selbst für gut ausgestattete Labors für eine Routinekontrolle ungeeignet. Freie Radikale, die in biologischen Systemen freigesetzt werden, reagieren mit vielen Biomolekülen Proteine, DNA und mehrfach ungesättigte Fettsäuren miteingeschlossen. Die zuletztgenannte Reaktion mit Fetten, die Lipidperoxidation ist eine autokatalysierte, durch freie Radikale hervorgerufene Oxidationsreaktion, welche die Bildung zahlreicher, von den Hydroperoxiden ausgehenden, Nebenprodukten zur Folge hat und dann, am Ende des Abbauprozesses, zur Produktion von Malondialdehyd führt. Malondialdehyd kann mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Hilfe von Thiobarbitursäure gemessen werden. Dieses Produkt gilt allerdings als später Indikator des oxidativen Stresses, da MDA als Endprodukt der Lipidperoxidation der Zellmembranen gebildet wird. Hydroperoxide (ROOH) stellen ein Zwischenprodukt im Rahmen der Lipidperoxidation dar, welches in der Reaktionsfolge vor der Bildung von MDA auftritt. Da die Hydroperoxide in den Zellen freigesetzt werden, sind sie in biologischen Flüssigkeiten zu finden und können als stabiler Indikator für den oxidativen Stress bestimmt werden. Hydroperoxide können, chemisch betrachtet, ihre oxidative Kapazität beibehalten und neue Kettenreaktionen induzieren, die durch Übergangsmetalle (u. a. Eisen) in Körperflüssigkeiten katalysiert werden: 2 ROOH



ROO° +

RO°

+

H2O 4/5

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In dieser o. e. Reaktion hat das Hydroperoxidmolekül zur Bildung zweier verschieden reaktiver Radikalspezies geführt: einem Peroxyl - und einem Alkoxylradikal (RO°), die wiederum zwei neue Kettenreaktionen in Gang setzen. Hydroperoxide sind daher als Indikatoren für den oxidativen Stress von grundlegender Bedeutung. Unter Berücksichtigung dieses Aspektes wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe Hydroperoxide in biologischen Flüssigkeiten bestimmt werden können.

Der FORM Diagnostik Test Mit Hilfe des FORM Diagnostik Systems kann man die Hydroperoxidspiegel (ROOH) - eine Gruppe reaktiver Sauerstoffmetabolite (ROMs) in biologischen Proben (z. B. Blut) ermitteln. Das Testprinzip beruht auf der Fähigkeit von Übergangsmetallen (z. B. Eisen) die Bildung von freien Radikalen aus Hydroperoxiden zu katalysieren. Im Plasma vorhandenes, an Protein gebundenes Eisen wird freigesetzt und dient als Katalysator für die genannte Reaktion. Dem Testprinzip liegt die FENTON-Reaktion zugrunde: R-OOH + Fe

2+

 R-O° + OH-

+

Fe3+

Das bedeutet, dass zweiwertiges Eisen mit dem Hydroperoxid reagiert, wobei dreiwertiges Eisen und das Alkoxylradikal (RO°) freigesetzt wird R-OOH

+ Fe3+  R-OO°

+

H+

+ Fe2+

Das dreiwertige Eisen reagiert mit dem Hydroperoxid und führt zur Freisetzung von zweiwertigem Eisen und dem Peroxidradikal. Im FORM Diagnostik System werden sowohl die gebildeten Alkoxyl- als auch die Peroxylradikale (RO° und ROO°) - deren Quantität ist direkt proportional zur Menge an vorhandenen Hydroperoxiden im Blut - chemisch durch Reaktion mit N,N-diethyl-para-phenylendiamin gemessen. Das hat die Bildung eines gefärbten Komplexes zur Folge, der mit Hilfe des FORM-Photometers detektiert wird.

Abbildung 2: Reaktion zur Farbentwicklung

Die oben beschriebene Reaktion kann folgendermaßen zusammengefasst werden: RO° + ROO° + 2ANH2  RO- + ROO- + 2 [A-NH2°]+ Die Bezeichnung 2ANH2 steht für das Chromogen und der Ausdruck [A-NH2°]+ für das kationische Radikal des Chromogens.

Der FORT Test wurde von der Universität Modena (Italien) mit der ESR-Methode zur Erfassung der Aktivität von freien Radikalen gegen getestet. 5/5 © MICRO-MEDICAL Instrumente GmbH, D-61462 Königstein / Ts., Telefon: +49 (0) 61 74/29 96-0 , Fax: +49 (0) 61 74/2 32 03, www.micromedical.de