20.05.2005

9:06 Uhr

Seite 55

Radikalfangende Wirkung von Pflanzeninhaltsstoffen Radical capturing effects of plant constituents Institut für Strahlenbiologie Wolf Bors

W

arum ist die mediterrane Küche so gesund? Ihre Hauptbestandteile sind pflanzliche Nahrungsmittel wie Gemüse, Salate und Olivenöl, denen man eine antioxidative oder radikalfangende Schutzwirkung zuschreibt. Auch in der traditionellen und alternativen Medizin macht man sich diese Schutzwirkung durch Pflanzenstoffe mittlerweile zunutze. Ein wichtiger Aspekt hierbei ist, dass der Schutz nicht durch eine – möglicherweise sogar synthetische – Einzelsubstanz erzielt wird, sondern durch das Zusammenwirken verschiedener Komponenten der Nahrung oder der Arznei. Das wiederum führt auch zu einer Erhöhung der jeweiligen Bioverfügbarkeit. Die antioxidative Schutzwirkung beruht dabei meist auf dem Gehalt an polyphenolischen Inhaltsstoffen wie Flavonole, Flavanole und Tannine. Unter Polyphenolen versteht man Verbindungen, bei denen sich mindestens zwei benachbarte Hydroxygruppen an einem aromatischen Ring befinden. Dies können sowohl Phenolsäuren sein als auch das inzwischen recht populäre Resveratrol, eine aktive Komponente in Traubenkernen und -schalen. Von besonderem Interesse sind Flavonoide und Tannine, die komplexe Strukturen mit kondensierten Ringsystemen und einer Vielzahl von aktiven Hydroxygruppen enthalten. Da die Polyphenole eine große Strukturvielfalt – allein über 5000 Flavonoide sind derzeit bekannt – aufweisen, ist es schwierig, die jeweiligen aktiven Komponenten zu identifizieren. Doch dank der enormen Fortschritte in der analytischen Chemie sind viele Naturstoffe inzwischen isoliert und bis

W

hy is Mediterranean cuisine so healthy? The main constituents are from plants that are thought to have an antioxidant or ‘radical capturing’ protective action – like vegetables, salad, and olive oil. These days both traditional and alternative medicine make use of this protective action of plant substances. One important aspect is that the protective effect is not provided by a single substance, which might even be prepared synthetically, but is the result of the combined effects of various components that are present as a mixture in the food or medicinal preparation. This combination also helps increase the bioavailability of the active substance(s). The antioxidant protective mechanisms are mostly based on the content of polyphenols like flavonols, flavanols, and tannins. Polyphenols are compounds in which there are at least two neighbouring hydroxyl groups on an aromatic ring. They include, for example, phenolic acids and the now very popular resveratrol, an active component found in grape seeds and skins. The flavonoids and tannins, complex structures with condensed ring systems and a large number of hydroxyl groups, are of particular interest Polyphenols have a great diversity of structures – there are already more than 5000 known flavonoids alone – and it is very difficult to identify the particular active form in a substance. However, thanks to the enormous advances that have been made in analytical chemistry, many natural substances have been isolated and defined

Aktuelle Themen

055_060_isb_akt.qxd

GSF  55

055_060_isb_akt.qxd

20.05.2005

9:06 Uhr

Seite 56

up to and including their stereo configuration using nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). Using these results, it is now possible to identify the active components in foodstuffs or medicinal preparations, even though they are mostly mixtures of substances.

hin zu ihrer Stereokonfiguration mittels kernmagnetischer Resonanz-Spektroskopie (NMR) identifiziert. Aufbauend auf diesen Ergebnissen ist es nun möglich, die aktiven Komponenten in den meist als Gemischen vorliegenden Nahrungs- oder Arzneimitteln festzustellen.

Antioxidantien in Naturstoffen Das Leben in einer Sauerstoffatmosphäre wird von der Natur optimal genutzt, indem sie das hohe Oxidationspotenzial des Sauerstoffs als „ultimativen“ Elektronenakzeptor für viele physiologische Reaktionen des Stoffwechsels einsetzt. So wird Sauerstoff von vielen Enzymen der Klasse Oxidoreduktasen beim Aufbau von Stützskeletten in Polymerisationsreaktionen benutzt. Auch schützt sich der Körper gegen Eindringlinge durch spezifische Enzyme, die Sauerstoff zu reaktiven Radikalen aktivieren (reactive oxygen species, ROS) und damit diese Fremdstoffe zerstören. Zwei physiologisch bedeutsamen Radikalen werden dagegen aufgrund ihrer geringen chemischen Reaktivität wichtige Signalfunktionen zugeschrieben: dem Stickstoffmonoxid (NO) und dem Superoxidanion (O2.–). Unter ungünstigen Bedingungen kann das Überangebot an ROS jedoch zu ,oxidativem Stress’ führen oder, anders ausgedrückt, zu einem Entgleisen des Redoxgleichgewichts. Ein Beispiel derartiger pathologischer Reaktionen sind Entzündungen, bei denen ROS körpereigenes Gewebe zerstören. Auch bei vielen degenerativen Krankheiten wie Parkinson oder Alzheimer wird die Beteiligung von oxidativem Stress diskutiert. Entsprechend den Darwin’schen Kriterien hat sich die Natur mit der Verwendung des Sauerstoffs auch von Anfang auf dessen Schadwirkung eingestellt und parallel dazu Kontrollsysteme entwickelt, sogenannte ,Antioxidantien’, die von niedermolekularen Substanzen bis zu enzymatischen Systemen reichen.

Abfangen von Radikalen als Prinzip der antioxidativen Wirkung Die radikalfangende Wirkung einer Substanz beruht prinzipiell auf der Bereitschaft, mit der eine Hydroxygruppe eines Polyphenols

56  GSF

a) Struktur von Quercetin OH HO

O

OH OH

OH O

b) Mechanismus der antioxidativen Wirkung eines Modellcatechols Asc

R

AscH

OH

R

OH

RH

Catechol

O R

OH

Semichinon

Abb. 1: a) Struktur des Pentahydroxyflavonols Quercetin: Hervorgehoben sind die Strukturprinzipien für eine optimale antioxidative Wirkung mit der Catecholgruppe im B-Ring für den Radikalangriff, der 2,3-Doppelbindung und 4-Ketogruppe für eine effiziente Elektronendelokalisation zur Stabilisierung des Quercetinradikals. b) Mechanismus der antioxidativen Wirkung eines Modellcatechol: Der Angriff des Primärradikals R• führt zur Bildung des Semichinons, das bei Anwesenheit eines Reduktans wie dem Ascorbat zurück zur Ausgangsverbindung reduziert wird. Das Ascorbatradikal ist harmlos, da es noch reaktionsträger ist und enzymatisch entfernt werden kann. Bei hohen Radikalkonzentrationen können zwei Semichinonmoleküle disproportionieren unter Rückbildung der Hälfte als Catechol und der anderen Hälfte zur oxidierten Form des Chinons. Diese wiederum können pro-oxidative Eigenschaften haben und sind auch bei der Bräunungsreaktion in Pflanzen beteiligt.

20.05.2005

9:06 Uhr

Seite 57

ein Wasserstoffatom an primär gebildetete Radikale abgeben kann. Diese Primärradikale werden dabei zu harmlosen inaktiven Substanzen umgewandelt. So wird zum Beispiel aus dem hochreaktiven Hydroxylradikal (•OH) ein Wassermolekül (H2O). Das aus dem Antioxidans (Polyphenol) gebildete Phenoxylradikal ist reaktionsträge genug, um nicht in einer Kettenreaktion weitere Radikale zu bilden. Verschiedenste polyphenolische Strukturen sind in den vergangenen Jahren im Labor ,Pulsradiolyse/Freie Radikale’ untersucht worden. Dabei wurden bereits 1990 bestimmte Strukturprinzipien für die antioxidative Wirkung von Flavonoiden aufgestellt, die ideal durch das Pentahydroxyflavonol Quercetin repräsentiert sind (Abb. 1). Über die Jahre sind verschiedene Messmethoden entwickelt worden, bei denen stabile Radikale mit potentiellen Antioxidantien reagierten. Dabei wurde das beobachtete Verschwinden der stabilen Radikale im Verhältnis zur Wirkung bekannter Antioxidantien gesetzt. Diese Methoden sind bevorzugt bei komplexen Gemischen einsetzbar, ergeben jedoch keinerlei Hinweis auf die jeweiligen Mechanismen einzelner Substanzen. Für letztere kann optimal die Pulsradiolyse (PR) und die ElektronenspinresonanzSpektroskopie (ESR) eingesetzt werden.

Untersuchungen strukturell unterschiedlicher Polyphenole

www.Bjbug.com

Die Forscher untersuchten die Inhaltsstoffe des Baikal-Helmkraut (Scutellaria baicalensis), einem wichtigen Bestandteil der Tradi-

Abb. 2: Scutellaria baicalensis.

tionellen Chinesischen Medizin (Abb. 2). Die Wirkung der sogenannten KampoMedizin beschränkt sich dabei nicht nur auf die in Humanexperimenten bestätigten antiinflammatorischen, antibakteriellen und antiviralen Wirkungen. Scutellarein und Baicalein, die zuckerfreien Hauptinhaltsstoffe von S. baicalensis, haben abweichend von den normalen Flavonen mit fehlender 6-Hydroxygruppe eine ungewöhnliche Pyrogallolstruktur im A-Ring (Abb. 3a). Ferner untersuchten die Wissenschaftler Kaffeesäure, Rosmarinsäure und deren Oligomere, die sich durch bis zu vier Catecholeinheiten im Molekül (Abb. 3b) auszeichnen. Es handelt sich hierbei um hochaktive, aber nur in geringen Mengen vorliegende Inhaltsstoffen von Salbei (Salvia officinalis), einem verbreiteten Gewürz und bereits im Mittelalter verwendeten Heilkraut mit vielfältiger Wirkung. Wie erwartet, spiegeln die unterschiedlichen Strukturprinzipien sich in den Mechanismen der antioxidativen Wirkung wider. Bei den PR-Experimenten wurden vorab die Differenzspektren vom ultravioletten bis sichtbaren Bereich hinsichtlich des Verbrauchs an Substrat und der Bildung der Phenoxylradikalen analysiert, ferner die Reaktionskonstanten der Reaktionen mit den oxidierenden elektrophilen Hydroxylund Azidradikalen. In wenigen Fällen wurden auch Fettsäureperoxylradikale als Modelllipide untersucht. Die Zerfallskonstanten der jeweiligen Phenoxylradikale galten dabei als Maß ihrer Stabilität. In vielen Fällen wurden komplexere Bildungs- und Zerfallskinetiken beobachtet, die von einem Aufbau der Signale nach pseudo-erster Ordnung und einem Zerfall zweiter Ordnung abwichen. Deshalb wurden zusätzlich die theoretisch möglichen Reaktionen mittels Computersimulation berücksichtigt. Da die Absorptionsspektren allein wenig Aussagekraft über die Struktur der Radikale bieten, sind in jedem Fall ergänzend die ESR-Spektren gemessen worden, und zwar sowohl nach Oxidation mit Peroxidase/Wasserstoffperoxid oder nach Autoxidation in alkalischem Medium. Die auf diese Weise ermittelten experimentellen isotropen Kopplungskonstanten ergaben noch keine Zuordnung zu bestimmten Wasserstoff-

Aktuelle Themen

055_060_isb_akt.qxd

GSF  57

055_060_isb_akt.qxd

20.05.2005

9:06 Uhr

Seite 58

atomen der aromatischen Ringe. Daher wurden ergänzend quantenchemische Berechnungen, die auf der Dichtefunktionstheorie (DFT) basieren, zur Spindichte und der Kopplungskonstanten durchgeführt. Allerdings waren sie nur im Fall der Kaffeesäureoligomere erfolgreich.

Die von uns aufgestellten Strukturprinzipien für die antioxidative Wirkung von Flavonoiden erwiesen sich bei den jetzt untersuchten Flavonen als nicht zutreffend. Gerade beim Vergleich von Scutellarein und Baicalein, die sich nur durch eine zusätzliche Hydroxygruppe im B-Ring unterscheiden, waren deutliche Unterschiede in den pKWerten, den Reaktionsgeschwindigkeiten und möglichen mesomeren Grenzstrukturen Strukturen der untersuchten Verbindungen festzustellen. Die ESR-Spektren deuteten a) Flavone jedoch auf zwei ähnlich strukturierte Radiscutellarein baicalein kale hin. Eine Strukturaktivitätsbeziehung OH (QSAR) konnte auch beim Vergleich weiterer Verbindungen mit Catechol- und PyrocateB HO O HO O cholstrukturen nicht beobachtet werden. Die A C hierbei geprüften Parameter hatten bei den HO HO früheren Untersuchungen deutliche AbhänOH O OH O gigkeiten von den jeweiligen Strukturen ergeben. Drei weitere Strukturparameter können für die radikalfangende Wirkung von b) Kaffesäure und Oligomere Bedeutung sein: die univalenten ReduktionsKaffeesäure potenziale, die Orbitalenergien (HOMO/ O LUMO-Werte: highest occupied and lowest HO OH unoccupied molecular orbitals) und die Bindungsenergien der Wasserstoffbindung HO der Hydroxygruppen. Erstere sind nur in Rosmarinsäure komplexen kinetischen Analysen messbar, O OH OH wofür aber die Substanzmengen nicht O ausreichten. Die HOMO/LUMO-Werte zeigten HO OH O keine Korrelation. HO Insgesamt gesehen waren die QSARUntersuchungen bei Kaffeesäure und ihren Oligomeren weit erfolgreicher. So konnte Salvianolinsäure K O OH OH bei Kaffeesäure durch kinetische Simulation O der Pulsradiolysedaten die Bildung von zwei HO HO OH O OH unterschiedlich stabilen SemichinontautoHO meren bestimmt werden und dies durch O Spinstabilisierung bei den ESR-Spektren O bestätigt werden. Die DFT-Berechnungen OH ergaben mit einer Elektronendelokalisation Abb. 3: a) Struktur der Flavone Baicalein über das gesamte Molekül eine weitgehen(5,6,7-Trihydroxyflavon) und Scutellarein de Mesomerie eines der Semichinone, (5,6,7,4’-Tetrahydroxyflavon) während das instabilere Semichinon nur in b) Struktur von Kaffeesäure, Rosmarinsäure, einer Form vorlag. Von besonderer Bedeuund Salvianolinsäure K: tung war dabei die Feststellung, dass die Die aktiven Zentren sind die einzelnen CatecholMesomeren Vorstufen von Oligomeren sein gruppen, die durch aliphatische Seitenketten voneinander getrennt sind. Die Klammern zeigen konnten und somit eine Analogie zu den die Zahl der jeweiligen Kaffeesäurebruchstücke Mechanismen der Lignin-Biosynthese an. Im Gegensatz zu den Tanninen findet die besteht. In letzterem Fall konnte die SpeKopplung also nicht an einem Ring, sondern zifität der Kopplungsreaktionen durch Teilzwischen einem Ring-Sauerstoff und der Seitennahme eines „dirigent protein“ nachgewiekette statt, wie sie auch bei der Ligninbiosynthese beobachtet wird. sen werden, während die Oxidase-Enzyme

58  GSF

20.05.2005

9:06 Uhr

Seite 59

für die Biosynthese der Kaffeesäure-Oligomere noch unbekannt sind.

Aktuelle Themen

055_060_isb_akt.qxd

Phenolische Kopplungsreaktionen OH

Paradigmenwechsel bei den Mechanismen polyphenolischer Antioxidantien Unter in vivo-Bedingungen findet durch die Anwesenheit von reduzierenden Stoffen wie Ascorbat, dem Salz der Ascorbinsäure, allein aufgrund des Reaktionsproduktes die Reduktion des Semichinons zur Ausgangsverbindung statt, die damit wieder für das Abfangen eines Radikals zur Verfügung steht. Unter den Bedingungen der PR mit hohen Radikalkonzentrationen zerfallen die Aroxylradikale von Flavonen und Flavonolen fast ausschließlich nach zweiter Ordnung unter Rückbildung der Ausgangsverbindung und des entsprechenden Chinons. In keinem Fall wird eine Kopplung zweier Semichinone oder eines Semichinons mit der Ausgangsverbindung beobachtet. Bei Flavonolen kann das Vorhandensein der 3-Hydroxygruppe zudem zur Bildung von Chinonmethiden mit pro-oxidativen Eigenschaften führen. Mittlerweile ist bereits eine nukleophile Addition von Glutathion an Quercetinchinon beschrieben worden. Nukleophile Additionsreaktionen sind die phenolischen Kopplungsreaktionen, die bei der Biosynthese der Tanninoligomere vorausgesetzt werden, obwohl auch hier – im Gegensatz zu chemischen Reaktionen – bis heute noch kein Enzym bekannt ist, das diese Reaktionen katalysiert. Die Frage, ob hier ähnlich wie bei der Ligninbiosynthese ein zusätzliches „dirigent protein“ notwendig ist, klingt zumindest plausibel. Bei kondensierten Tanninen können in intermolekularen Reaktionen aus den Flavanolen Catechin und/oder Epicatechin Ketten mit über 10 Einheiten gebildet werden, wie sie in grünem Tee oder in Kakao vorkommen (Abb. 4). Die verschiedenen Kopplungsmöglichkeiten an allen freien Wasserstoffbrücken können bedingt durch NMR-Spektroskopie unterschieden werden. Für alle beschriebenen Kopplungsreaktionen gibt es chemische Analoga, und da immer starke Oxidantien die Reaktion stimulieren, gehen wir davon aus, dass die bei

8

O

O 2'

6 4

O

OH

O

+

OH

O

OH

OH OH HO

O

OH OH

OH HO

OH

O

OH OH

OH Abb. 4: Phenolische Kopplungsreaktion bei kondensierten Tanninen am Beispiel des Flavanols Epicatechin. Ein Molekül des Flavanols reagiert mit einer oxidierten (chinoiden) Form unter intermolekularer Bildung eines Dimers, wobei alle aromatischen Gruppen wieder reduziert sind und für neue Radikalangriffe zur Verfügung stehen. Neben der abgebildeten 4,8-Kopplung sind auch solche an anderen freien Wasserstoffen möglich, also in 6’-, 2’- oder 5’-Position. Diese Ketten können bis über 10 Einheiten fortgesetzt werden, wobei die Löslichkeit der limitierende Faktor ist. Eine analoge intramolekulare Kopplung findet bei hydrolysierbaren Tanninen (Gallound Ellagitanninen) statt: Aus zwei Molekülen Gallensäureester entsteht ein dimeres Molekül, die sogenannte Hexahydroxydiphensäure.

der antioxidativen Reaktion gebildeten Chinone Dimere bilden, entsprechend der im Überschuss vorhandenen Ausgangsverbindung. Von entscheidender Bedeutung ist hierbei, dass diese Dimere nun die doppelte Zahl an aktiven Hydroxygruppen enthalten und somit die radikalfangende Wirkung erhöht ist – mit weiterer Potenzierung bei erneuter Radikalbildung und Kopplungsreaktion.

GSF  59

055_060_isb_akt.qxd



20.05.2005

9:06 Uhr

Seite 60

Ausgewählte Veröffentlichungen

Bors, W., Heller, W., Michel, C. and Saran, M.: Flavonoids as antioxidants: determination of radical scavenging efficiencies. Meth. Enzymol. 186, 343-354 (1990) Bors, W. and Michel, C.: Antioxidant capacity of flavanols and gallate esters: Pulse radiolysis studies. Free Radic. Biol. Med. 27, 1413-1426 (1999) Bors, W., Foo, L.Y., Hertkorn, N., Michel, C. and Stettmaier, K.: Chemical studies of proanthocyanidins and hydrolyzable tannins. Antiox. Redox Signal. 3, 995-1008 (2001)

60  GSF

Bors, W., Michel, C., Stettmaier, K., Lu, Y.R. and Foo, L.Y.: Pulse radiolysis, electron paramagnetic resonance spectroscopy and theoretical calculations of caffeic acid oligomer radicals. Biochim. Biophys. Acta 1620, 97-107 (2003)