Wektory DNA - klonowanie molekularne

Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. „zmusić” go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany tj. zrekombinowany in vitro z odpowiednim elementem genetycznym zwanym wektorem czyli cząsteczką DNA •zdolną do „wnikania” do wnętrza komórek tego gospodarza •zdolną do autonomicznej replikacji O takim fragmencie DNA wbudowanym do wektora i wprowadzonym do jakiegoś gospodarza (najczęściej bakteryjnego) mówimy że jest on sklonowany w bakteriach

Co oznacza klonowanie molekularne? Termin „klonowanie” w odniesieniu do pojedynczego fragmentu DNA oznacza namnożenie określonego odcinka DNA w komórkach gospodarza, najczęściej bakterie np. Escherichia coli, przy zastosowaniu odpowiedniego wektora. Klonowanie DNA jest podstawową techniką inżynierii genetycznej. Klonowanie molekularne umożliwia: •znalezienie, wyizolowanie i namnożenie wybranego genu z genomu jakiegoś organizmu, •przeprowadzania manipulacji, na przykład mutagenezy, •uzyskiwania ekspresji genu, czyli produkcji kodowanego przez niego produktu. Do klonowania molekularnego niezbędne są dwa elementy:

•wektor •gospodarz

Nie zawsze celem klonowania molekularnego jest produkcja białka przez komórki bakteryjne - sklonowanie fragmentu DNA jest często celem samym w sobie

Transformation

•Klonowanie molekularne można przeprowadzić w komórkach mikroorganizmów jak i eukariotycznych, ale: •Klonowanie w komórkach prokariotycznych jest nieporównywalnie prostsze ponieważ komórki bakteryjne łatwo jest hodować i izolować z nich duże ilości specyficznego DNA, które można poddawać kolejnym zabiegom: : sekwencjonowaniu, mapowaniu, transformacji, hybrydyzacji itd. •W bakteriach możemy z powodzeniem klonować (powielać) geny prokariotyczne i eukariotyczne.

„Mówimy partia – myślimy Lenin, Mówimy Lenin – myślimy partia” Mówimy klonowanie molekularne = myślimy klonowanie w bakteriach

Jako wektorów do klonowania molekularnego w mikroorganizmach używa się: 1. Plazmidów 2. Bakteriofagów 3. Kombinacji elementów genetycznych plazmidowofagowych np. kosmidów, fagemidów, itp.

Wektory plazmidowe 1. Ogólnego przeznaczenia – proste powielanie wybranego genu 2. Wektory do „zadań specjalnych” (są to wektory, które oprócz samego powielania DNA umożliwiają np. •

wydajną ekspresję sklonowanego genu – produkcję białka

•

badanie własności sklonowanego genu lub odcinka DNA

•

otrzymywanie jednoniciowego DNA (ssDNA)

•

stabilne powielanie ekstremalnie duże fragmentów DNA – konstrukcja banków (bibliotek) genomowych

Cechy dobrego wektora plazmidowego

kilkadziesiąt – kilkaset pz

•Zdolny do autonomicznej replikacji (niezależnej od chromosomu gospodarza) – musi posiadać tzw. origin replikacji – oriV (nieliczne wektory integracyjne, wbudowują się do DNA gospodarza, są bardziej stabilne, mają mniejszą ilość kopii) •Marker selekcyjny (czyli gen kodujący białko

odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe. Wektor musi być tak skonstruowany aby istniała możliwość selekcji tych komórek , do których wniknął.

•MCS (multiple cloning site – miejsce wielokrotnego klonowania tzw. polilinker)

Pozwala na swobodny dobór odpowiedniego do klonowania enzymu

•Wektor powinien być niezdolny do przeżycia poza komórką gospodarza, namnażać się w niewielu szczepach (mały zakres gospodarza), nie posiadać zdolności koniugacyjnych. •Powinien być stosunkowo niewielki (poniżej 10 kpz)

Wektory plazmidowe – miejsce startu replikacji Dobranie odpowiedniego wektora zależy m.in. od tego w jakich komórkach zamierzamy klonować gen. Najważniejszym elementem warunkującym specyficzność wektora są sekwencje odpowiedzialne za inicjację replikacji tzw. sekwencje oriV

Plazmid

Replikon

pBR322 i pochodne

pMB1

Ilość kopii na komórkę 15-20

wektory serii pUC

pMB1

500-700

pACYC i pochodne

p15A

10-12

pSC101 i pochodne

pSC101

~5

ColE1

ColE1

15-20

Replikony ColE1 i pMB1 są niezgodne, są natomiast w całkowicie zgodne z pSC101 i p15A

500-700 kopii na komórkę

MCS (polilinker)

Wizualna selekcja zrekombinowanych klonów Wektory (nie tylko plazmidowe) zazwyczaj posiadają również systemy pozwalające na odróżnienie komórek gospodarza który pobrał wektor zrekombinowany od takiego, który zamknął się bez połączenia z obcym fragmentem DNA.

Plazmidy takie jak pUC umożliwiają tzw. wizualną identyfikację klonów zrekombinowanych, dzięki wstawieniu do wektora genu kodującego enzym, który rozkłada barwny substrat. MCS znajduje się wtedy w obrębie tego genu. Jego przerwanie przez wstawienie obcego DNA sprawia że kolonie zawierające zrekombinowany i niezrekombinowany wektor rosną na płytce w różnych kolorach

Wizualna selekcja zrekombinowanych klonów c.d.

Wektor zawiera N-końcowy fragment beta-galaktozydazy (genu lacZ), wprowadza się go komórek, które syntetyzują tylko część C-końcową beta-galaktozydazy (niosących zmutowany geny lacZ). Obydwa peptydy mogą asocjować (-komplementacja) tworząc aktywne enzymatycznie białko. X-gal sztuczny substrat dla beta-galaktozydazy IPTG sztuczny induktor beta-galaktozydazy (tzw. bezinteresowny)

X-gal, IPTG

Selekcja zrekombinowanych klonów może zachodzić przez zahamowanie namnażania się komórek zawierających niezrekombinowany plazmid. Takie wektory zawierają gen letalny dla komórki gospodarza. Insercja klonowanego DNA inaktywuje ekspresję letalnego genu umożliwiając wzrost rekombinantów.

Wektory plazmidowe specjalnego przeznaczenia

Plazmidowe wektory ekspresyjne

Co wyróżnia wektory ekspresyjne? 1. Silny, regulowany RNA gospodarza np.

promotor rozpoznawany przez polimerazę

•Silny promotor powoduje , że w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutę. •regulowany promotor oznacza że można go indukować. Przykładem może być promotor laktozowy. Transkrypcję wzmaga się przez dodanie do pożywki IPTG (analog laktozy).

w sekwencje niezbędne do translacji mRNA sklonowanego genu 2. Wektory ekspresyjne są wyposażone

Wektory do transkrypcji in vitro

Zawierają promotory bakteriofagów takiej jak T3, T7 i/lub SP6 umieszczone przed miejscem wstawienia DNA.

Zastosowanie: wydajna produkcja RNA (np. mRNA) in vitro

Fragmenty DNA wprowadza się w tych wektorach w pobliżu genu reporterowego np. pozbawionego własnego promotora genu lacZ i mierzy aktywność jego ekspresji

XhoI BglII EcoRI KpnI XbaI PstI

Wektory do badania własności sklonowanego genu lub odcinka DNA, np. do badania aktywności promotorów

MCS oriT

oriV

lacZ

pMP220 (104000 pz) trfA

Tet

Wektory do rekombinacji nietypowych fragmentów DNA np. uzyskanych inaczej niż przez trawienie cząsteczek DNA enzymami restrykcyjnymi – fragmentów DNA po amplifikacji w reakcji PCR

2. Wektory bakteriofagowe

Wektory fagowe: bakteriofag  Fag  zawiera ds DNA wielkości 48502 pz, 12 pz jednoniciowe lepkie końce cos

Ok. 60% genomu faga jest niezbędna do jego litycznego cyklu życiowego, środkowa część 15 kpz (ok. 1/3) może być zastąpiona obcym DNA. DNA z delecją nie może być pakowany w główki, co staje się zaletą ponieważ tylko DNA ze wstawionym obcym DNA może się zapakować w główki (dobra selekcja fagów zrekombinowanych).

Schemat klonowania DNA w bakteriofagu 

Inne wektory bakteriofagowe:

•pochodne bakteriofaga P1 (Sternberg 1990) •podobne do faga , oparte na wersjach delecyjnych genomu faga P1.

•Ich pojemność zależy od wielkości delecji i miejsca w główce faga. •P1 ma większy niż  genom co pozwala klonować większe fragmenty DNA do 125 kpz – konstrukcja bibliotek genomowych

Wektory fagowe: bakteriofag M13 •ss DNA (6407 pz), 200-300 kopii na komórkę, 10 genów, wszystkie niezbędne do życia •Po wniknięciu do komórki jest syntetyzowana druga komplementarna nić DNA, w formie ds DNA ulega replikacji. W końcowej fazie powstają formy ss DNA pakowane w osłonki i uwalniane z komórki •Nie ma limitu wielkości DNA upakowanego w osłonkę, ale wstawki większe niż 1 kb są bardzo niestabilne

•W jednym z 10 genów jest miejsce rozpoznawana przez BsuI, w które wstawiono fr. operonu lac z miejscem dla EcoRI. W ten sposób powstała seria wektorów do klonowania określanych jako M13mp. •Posiadają możliwość -komplementacji, sztuczne MCS, dawniej używane w sekwencjonowaniu DNA oraz stosowane są kierowanej mutagenezie in vitro. •Dwie orientacje MCS, zapewniają możliwość odczytania sekwencji DNA z obydwu stron

3. Kombinacje plazmidów i bakteriofagów a) Fagemidy Uzyskuje się je np. przez wprowadzenie do wektora plazmidowego fragmentu ori z jednoniciowego bakteriofaga M13 lub f1. Takie wektory plazmidowe nazywamy fagemidami Wektory te służą podobnie jak pochodne M13 do otrzymywanie jednoniciowych kopii DNA Jednoniciowe matryce stosowane są do sekwencjonowania DNA lub syntezy znakowanego radioaktywnie jednoniciowego DNA.

b) Kosmidy •wektory plazmidowe wyposażone w sekwencję cos faga  •ich wielkość wynosi od 5 do 8 kpz co oznacza, że można do niego sklonować od 35-45 kpz.

Zastosowanie: Konstrukcja bibliotek genomowych

Fosmidy - specyficzna odmiana kosmidów

•Zawierają miejsce startu replikacji z plazmidu F oraz sekwencję cos z faga . •Budowa podobna do kosmidów, •Znacznie mniejsza ilość kopii na komórkę i dzięki temu większa stabilność.

Wektory drożdżowe Drożdże jako komórki gospodarzy posiadają pewne niezaprzeczalne zalety: •mają struktury komórkowe typowe dla eukariota ale są jednokomórkowe

•geny w nich klonowane mogą zawierać sekwencje intronowe ponieważ proces obróbki mRNA jest zbliżony do tego, który występuje u wyższych eukariontów •powstające białka mogą podlegać modyfikacjom potranslacyjnym. Kiedy zatem użyć drożdży jako gospodarza w klonowaniu molekularnym? 1. W przypadku klonowania eukariotycznych genów 2. wtedy gdy zależy nam nie tylko na prostym powieleniu DNA, ale także na uzyskaniu ekspresji genu w komórce eukariotycznej i otrzymaniu białek odpowiednio zmodyfikowanych potranslacyjnie

WEKTORY DROŻDŻOWE - wektory wahadłowe

(ang. shuttle vector) wahadłowość to cecha typowa dla wielu wektorów eukariotycznych

Wektory wahadłowe (bifunkcjonalne) mają: •

dwa odrębne miejsca startu replikacji (jedno z nich uruchamiane jest w eukariotycznych komórkach - drożdży, drugie w komórkach prokariotycznych E. coli)

•

dwa typy markerów selekcyjnych: dla komórek drożdżowych jak i bakteryjnych

•

umożliwia to wygodne utrzymywanie wektora w komórkach bakteryjnych oraz np. ekspresję sklonowanych genów w drożdżach

1983 Murray i Szostak –sztuczny chromosom drożdżowy YAC YAC ma wielkość 10-15 kb (chromosom drożdżowy od 230-1700 kpz) co oznacza w YAC-u można sklonować odcinek DNA rzędu Mpz, standardowo ok. 600 kpz)

Wektory te są w drożdżach stabilne mitotycznie nawet bez presji selekcyjnej i utrzymują się jako liniowy minichromosom (w ilości 1-2 kopii na kom.)

YAC składa się z części 1. prokariotycznej(plazmidowe ori i marker selekcyjny – oporność na antybiotyk)

Sup4

2. eukariotycznej

• która zawiera: odcinek ori ARS, centromer CEN, telomery i geny selekcyjne (np. his3, trp1, ura3 – nie są to geny oporności na antybiotyk) • przynajmniej jedno unikalne miejsce restrykcyjne do klonowania obcego DNA •System do wizualnej selekcji klonów zrekombinowanych sup4 (białe i różowe) ale nie jest to alfa-komplementacja

BamH1 BamH1

Dodatkowo w części eukariotycznej występują sekwencje umożliwiające ekspresję sklonowanego genu tzw. kompleks (kaseta) ekspresyjny, który obejmuje

•

Promotor rozpoznawany przez polimerazę RNA gospodarza eukariotycznego (drożdżową polimerazę RNA)

•

Terminatora transkrypcji

•

MCS

•

sztucznej sekwencji intronowej, która umożliwia dojrzewanie klonowanego DNA eukariotycznego

Jak używać YAC-a?

Zrekombinowane YAC-i powielają się drożdżach dzięki chromosomalnym mechanizmom replikacji!!!

Wektory do komórek wyższych eukariontów (zwierząt i ludzi) •Należy rozpatrywać je raczej w kategoriach systemów dostarczania gotowego konstruktu DNA lub transgenu •Znajdują zastosowanie w tzw. badaniach podstawowych in vitro (linie komórkowe) tzw. terapii genowej czy transgenezie

•De facto są w większości wektorami wahadłowymi •Oparte głównie na wirusach •są to rekombinowane wirusy zawierające wewnątrz otoczki zrekombinowane DNA np. sekwencje terapeutyczne lub transgeny, które zastępują geny kodujące samego wirusa -

rekombinowane rekombinowane rekombinowane rekombinowany

wektory retrowirusowe oraz lentiwirusowe (HIV), wektory adenowirusowe, wektory AAV (adenoassociated virus), wektor wirusa opryszczki HSV,

•Rekombinowane wektory retrowirusowe i adenowirusowe są najczęściej stosowanymi wektorami wirusowymi wykorzystywanymi w dopuszczonych protokołach terapii genowej np. nowotworów

Podstawowe kryteria którymi należy kierować się przy tworzeniu wektorów wirusowych np. niosących terapeutyczne DNA to •bezpieczeństwo •specyficzność i stabilność dostarczania genów

•efektywność namnażania się w liniach komórkowych (produkcyjnych) wysokie miano (liczba cząsteczek rekombinowanego wirusa w jednostce objętości) • prosty system produkcji •możliwość dostarczania materiału genetycznego o dużych rozmiarach • brak immunogenności Aktualnie nie dysponujemy jednym uniwersalnym nośnikiem wirusowym, a powyższe cechy charakteryzują różne systemy wektorów. W związku z tym faktem, poszczególne systemy wirusowe wykorzystuje się do odpowiednich strategii i/lub konkretnych zastosowań np. terapii genowych

Co w trakcie konstrukcji wektora można usunąć z wirusa a co musi w nim pozostać? Funkcje (i geny) wirusowe można podzielić na cis i trans. •Cis to takie które nie mogą zostać usunięte z genomu wirusa np. miejsce startu replikacji lub sygnał "pakujący". •Natomiast trans to geny których funkcje mogą z powodzeniem zostać zastąpione przez analogi pochodzące od zmodyfikowanych linii komórek pakujących. •Zwykle dąży się do tego aby wszystkie geny trans usunąć z genomu wirusa i umieścić je w genetycznych elementach pomocniczych. Daje to dużo miejsca na obce geny a poza tym zwiększa bezpieczeństwo, gdyż tak powstały wirus jest niezdolny do namnażania się poza komórkami pakującymi

Rekombinowane wektory retrowirusowe Wektory retrowirusowe oparte są najczęściej na Mysim Wirusie Białaczki Moloney’a - MoMLV (Moloney Murine Leukemia Virus). Jest to podstawowa grupa znajdująca swoje główne zastosowanie w terapii nowotworów, gdyż mają one naturalną skłonność do infekowania intensywnie dzielących się komórek LTR - gag - pol - env - (onc) - LTR

•gag – strukturalne białka płaszcza wirusa •pol – odwrotna transkryptaza •env – glikoproteiny otoczki wirusa LTR - Long terminal repeat – sekwencja promotoroworegulatorowa na każdym z końców genomu RNA wirusa

Ponieważ wektor jest wahadłowy możemy go zrekombinować w bakteriach np. E. coli

Drugi składnik to linia komórek tzw. pakujących z prowirusem pozbawionym sekwencji psi a posiadającym geny kodujące białka otoczki wirusa i odwrotną transkryptazę (geny: gag, pol, env). DNA retrowirusa z włączonym do niego obcym genem (pierwszy składnik) wprowadza się do komórek pakujących W komórkach pakujących DNA retrowirusa zostaje przepisane na RNA a to z kolei jest pakowane jest w otoczki białkowe. Takie wiriony izoluje się i infekuje nimi komórki docelowe, w których następuje przepisanie RNA na DNA, które z kolei włączane jest do chromosomu właściwego biorcy

wektory wahadłowe rekombinuje się w bakteriach np. E. coli a do komórek eukariotycznych (pakujących) wprowadza się gotowe konstrukty

Osobną grupę wektorów retrowirusowych stanowią pochodne lentivirusów, takich jak HIV. Mogą one zakażać nie tylko komórki dzielące się lecz praktycznie wszystkie. Wektor pochodzący od HIV, po wyeliminowaniu genów pomocniczych (np. vif, vpr, vpu i nef) jest w miarę bezpiecznym i skutecznym wektorem.

Wektory adenowirusowe •Adenowirusy to wirusy o genomie długości ok. 36 kpz zawierającym ds DNA, nie posiadające otoczki Adenowirusy mogą infekować duży wachlarz typów komórek, także nie dzielące się i są w miarę łagodne. Ekspresja genów wprowadzony za ich pomocą jest silna i stabilna ale dość krótkotrwala, ponieważ DNA wirusa znajduje się poza DNA gospodarza (nie integrują się z genomem gospodarza) i dlatego nie ulega replikacji. W kolejnych pokoleniach komórek wprowadzonego DNA jest coraz mniej. •Doskonale nadają się do terapii genowej mającej na celu zniszczenie komórek (suicide genes), lecz nie są odpowiednie do dostarczania genów terapeutycznych.

AAV- wirusy towarzyszące adenowirusom •Należą one do niepatogennych ludzkich parvowirusów, które do namnażania wymagają obecności wirusów pomocniczych (najczęściej są to adenowirusy) (wada i zaleta). •Atrakcyjność tego typu wektorów polega na tym, iż nie powodują żadnych ludzkich chorób (bo przy braku adenowirusa są defektywne replikacyjnie)

•Mają dość dużą pojemność (tylko ok. 4% genomu wirusa jest niezbędna) •mogą dostarczać DNA do niedzielących się komórek. •w naturalnej formie wbudowują geny do chromosomów gospodarza co pozwala na przedłużoną ekspresję transgenu

Wektory bazujące na herpeswirusach

Spośród herpeswirusów jako wektory są wykorzystywane dwa: Herpes simplex virus i Epstein-Barr virus. •Wirusy herpes nie wbudowują swojego materiału genetycznego w genom gospodarza. •Mają one powinowactwo do neuronów, dlatego bada się je głównie pod kątem ukierunkowanej terapii genowej tkanki nerwowej, m.in. w leczeniu choroby Parkinsona, złośliwych gliom (nowotworów mózgu). •Herpes simplex virus Połowa wielkości genomu herpeswirusów nie jest istotna dla ich wzrostu w hodowli komórkowej (pojemność wektora herpeswirusowego wynosi 40-50 kb). •Epstein-Barr virus ma duży genom (ok. 172 kb), a przy tym konieczne elementystanwią w sumie ok. 4 kb. Pozwala to na wprowadzenie bardzo dużych fragmentów DNA

Wektory pochodne bakulowirusów – eukariotyczne wektory ekspresyjne •rodzina wirusów DNA chorobotwórczych dla stawonogów, głównie owadów. •Genom bakulowirusów stanowi duży (128 kpz), kolisty, dwuniciowy DNA. •wektor skonstruowany został z sekwencji bakteryjnych ori i genu oporności na antybiotyk a także kasety ekspresyjnej , w skład której w chodzi polilinker i sekwencje regulacyjne genu polihedryny bakulowirusa czyli promotor i terminator. •komórki owadów lub całe larwy transfekuje się mieszaniną DNA bakulowirusa i zlinearyzowanego wektora niosącego zrekombinowany gen i gen markerowy umożliwiający selekcję w komórkach owadów. Wewnątrz komórki dochodzi do homologicznej rekombinacji i utworzenia zrekombinowanego wirusa. •System pozwala uzyskiwać typowe dla wyższych eukariontów modyfikacje potranslacyjne eksprymowanych białek.

•Wydajność produkcji jest dość niska a koszt stosunkowo wysoki. Znajdują one zastosowanie przy produkcji niektórych leków.