CAPÍTULO 2.7.14.

VIRUELA OVINA Y VIRUELA CAPRINA

RESUMEN La viruela ovina y caprina son enfermedades víricas de las ovejas y de las cabras que se caracterizan por fiebre, aparición de pápulas o nódulos generalizados, vesículas (raramente), lesiones internas (particularmente en los pulmones), y por la muerte. Ambas enfermedades están causadas por cepas de un capripoxvirus, que puede infectar a las ovejas y a las cabras. Aunque la mayoría de las estirpes examinadas causan la enfermedad clínica en su forma más grave ya sea en las ovejas o en las cabras, se han aislado algunas cepas que son igualmente patógenas en ambas especies. Se ha propuesto que se haga referencia a la viruela maligna de las ovejas y de las cabras causada por capripoxvirus, así como a la viruela ovina y caprina de Kenia, la dermatitis caprina de India y la forma nodular de la enfermedad de las ovejas y de las cabras del norte de África, como la viruela caprina. La viruela caprina es endémica en África (al norte del Ecuador), Oriente Medio, Turquía, Irán, Afganistán, India, Nepal, en zonas de la República Popular China, y, desde 1984, en Bangladesh. Recientemente, la enfermedad ha hecho frecuentes apariciones en el sur de Europa. Identificación del agente: La confirmación más rápida de la viruela caprina en el laboratorio es la identificación de los viriones típicos de la viruela caprina utilizando el microscopio electrónico de transmisión en combinación con un historial clínico de la infección generalizada de la viruela caprina. El virión de la viruela caprina es diferente del otro poxvirus que comúnmente infecta a las ovejas y a las cabras – un parapoxvirus que causa el ectima contagioso o dermatitis pustular contagiosa. Se puede identificar un antígeno de precipitación mediante una prueba de inmunodifusión en gel de agar (IGDA) utilizando material de biopsia de un ganglio linfático de un caso precoz de viruela caprina y de sueros inmunes específicos; sin embargo, se produce una reacción cruzada con parapoxvirus. El capripoxvirus crece en los cultivos de tejidos de origen ovino, caprino o bovino, aunque los aislamientos de campo pueden necesitar hasta 14 días para crecer, o requerir uno o más pases adicionales en cultivos de tejidos. El virus produce inclusiones intracitopasmáticas que se observan con claridad mediante la tinción con hematoxilina y eosina. El antígeno se puede detectar también en cultivos de tejidos utilizando sueros específicos y las técnicas de inmunoperoxidasa o de inmunofluorescencia. El antígeno de los capripoxvirus y los cuerpos de inclusión se pueden observar en los cortes obtenidos en un microtomocriostato o en cortes de parafina teñidos a partir de material procedente de lesiones de biopsias o exámenes post mórtem. Se ha elaborado un enzimoinmunoensayo (ELISA) utilizando un suero de detección policlonal obtenido frente a un recombinante del antígeno inmunodominante de capripoxvirus. Se ha descrito también la detección del genoma empleando cebadores específicos de capripoxvirus para los genes de las proteínas de fusión y de unión. Pruebas serológicas: La prueba de neutralización vírica es la prueba serológica más específica, pero, debido a que la inmunidad a la infección de la viruela caprina está predominantemente mediada por células, la prueba no es lo suficientemente sensible para identificar a los animales que han tenido contacto con el virus y que solo han desarrollado niveles bajos de anticuerpos neutralizantes. Las pruebas IGDA y de inmunofluorescencia indirecta son menos específicas debido a las reacciones cruzadas con anticuerpos frente a otros poxvirus. El análisis de inmunoelectrotransferencia (Western blotting) es sensible y específico, pero resulta caro y difícil de llevar a cabo utilizando la reacción entre el antígeno P32 de capripoxvirus y los sueros de prueba. El uso de este antígeno, expresado en un vector adecuado, en una prueba ELISA ofrece la posibilidad de realizar una prueba serológica aceptable y estandarizada.

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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina

Requisitos para las vacunas y los productos biológicos de diagnóstico: Las vacunas vivas y las inactivadas se han empleado para el control de la viruela caprina. Todas las cepas de capripoxvirus examinadas hasta ahora comparten un sitio de neutralización principal y muestran una protección cruzada. Las vacunas inactivadas proporcionan inmunidad a corto plazo en el mejor de los casos.

A. INTRODUCCIÓN La viruela ovina y la viruela caprina son endémicas en África del norte y central, en Oriente Medio y en India. La viruela caprina está causada por cepas de capripoxvirus y produce una enfermedad clínica característica en razas plenamente susceptibles de ovejas y cabras, que es difícil confundir con ninguna otra. En los animales autóctonos, la enfermedad y la mortalidad generalizadas son menos frecuentes, aunque sí se observan en los lugares donde la enfermedad ha estado ausente en una zona o en un pueblo durante un período de tiempo al introducir métodos intensivos de cría, o en asociación con los agentes causales de otras enfermedades, tales como el virus de la peste de los pequeños rumiantes o el virus de la fiebre aftosa. La viruela caprina es la restricción más importante para la introducción de razas exóticas de ovejas y cabras, y para el desarrollo de la producción intensiva de animales de cría. Las cepas de capripoxvirus que originan la dermatosis nodular contagiosa (tal como la Neethling) se encuentran también en los bovinos, pero no hay pruebas de que estas cepas causen la enfermedad en ovinos y en caprinos de forma natural. La distribución geográfica de la dermatosis nodular contagiosa difiere de la de la viruela ovina y caprina. Las cepas de capripoxvirus se transmiten entre los ovinos y los caprinos, aunque la mayoría solamente causan la enfermedad clínica más grave en una especie; también se produce la recombinación entre estas cepas, originando un espectro que muestra preferencias intermedias por el hospedador y un rango de virulencia. Algunas cepas son patógenas tanto en ovinos como en caprinos. La viruela caprina tiene la capacidad de propagarse y establecerse en países fuera de su distribución normal. En 1983 se propagó a Italia, en 1985 y 1989 a Chipre, y en 1988 y en numerosas ocasiones posteriores a Grecia, pero no llegó a establecerse en estos países. Sin embargo, en 1984 se propagó a Bangladesh donde persiste. En 2005, un brote en cabras de Vietnam puso de manifiesto que la viruela caprina tiene una distribución geográfica más amplia de lo que se creía hasta ese momento. El período de incubación está entre 8 y 13 días después del contacto entre un animal infectado y los animales susceptibles. Dicho período puede reducirse a 4 días después de una infección experimental por inoculación intradérmica o por transmisión mecánica por insectos. Algunas razas de oveja europea, tal como la Soay, pueden morir de una infección aguda antes del desarrollo de las lesiones cutáneas. En otras razas se produce una elevación inicial de la temperatura rectal por encima de los 40°C, seguida, en primer lugar, por el desarrollo de máculas – pequeñas zonas rodeadas de hiperemia que son más obvias sobre la piel no pigmentada – entre los 2–5 días, y, posteriormente, por el desarrollo de pápulas – hinchazones duras de entre 0,5 y 1 cm de diámetro – que pueden cubrir el cuerpo o restringirse a la entrepierna, la axila y el periné. Las pápulas pueden estar cubiertas por vesículas llenas de fluido, pero esto no es muy común. En algunas razas de cabra europea se ha observado una forma de viruela caprina hemorrágica, en la que todas las pápulas parecen unirse por todo el cuerpo; esta forma es siempre mortal. Dentro de las 24 horas de la aparición generalizada de pápulas, los animales infectados desarrollan rinitis, conjuntivitis y el aumento del tamaño de todos los nódulos linfáticos superficiales, en particular de los nódulos preescapulares. Las pápulas sobre los párpados producen blefaritis de gravedad variable. Conforme se ulceran las pápulas de las membranas mucosas de los ojos y de la nariz, las secreciones se vuelven mucopurulentas, y las mucosas de la boca, el ano, y el prepucio o la vagina se necrosan. La respiración se hace pesada y ruidosa por la presión en el tracto respiratorio superior producida por los nódulos linfáticos retrofaríngeos hinchados, debido al desarrollo de lesiones pulmonares. Si el animal afectado no muere en esta fase aguda de la enfermedad, las pápulas comienzan a necrosarse a partir de la necrosis isquémica después de la formación de trombos en los vasos sanguíneos situados en la base de la pápula. En los siguientes 5–10 días, las pápulas forman costras que persisten hasta 6 semanas dejando pequeñas cicatrices. Las lesiones cutáneas son susceptibles al ataque de las moscas, y es común una neumonía secundaria. No es habitual la anorexia a no ser que las lesiones en la boca interfieran físicamente la alimentación. El aborto es poco común. Las lesiones cutáneas son a menudo menos manifiestas en el examen post mórtem del animal con infección aguda que en el animal vivo. Las membranas mucosas parecen necrosadas y todos los nódulos linfáticos del cuerpo han aumentado de tamaño y están edematosos. Las pápulas, que pueden ulcerarse, se pueden encontrar habitualmente en la mucosa abomasal, y algunas veces en la pared del rumen y del intestino grueso, en la lengua, en el paladar duro y en el blando, en la tráquea y en el esófago. Ocasionalmente, pueden

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observarse zonas de aproximadamente 2 cm de diámetro en la superficie del riñón y del hígado, y se ha descrito su presencia en los testículos. Con frecuencia se observan numerosas lesiones graves de hasta 5 cm de diámetro por todas las partes de los pulmones y en particular, en los lóbulos diafragmáticos. Los síntomas y las lesiones observadas en el examen post mórtem varían considerablemente con la raza del hospedador y la cepa de capripoxvirus. Las razas autóctonas son menos sensibles y, con frecuencia, muestran solo unas pocas lesiones que pueden confundirse con picaduras de insectos o con la dermatitis pustular contagiosa. Sin embargo, se observan con frecuencia casos de animales afectados de viruela caprina de forma generalizada y a veces mortal en casos de: corderos que han perdido su inmunidad derivada de la maternidad; animales a los que se ha mantenido aislados; y animales traídos a zonas endémicas, procedentes de pueblos aislados, y, en particular, si se les ha sometido a estrés durantes el desplazamiento a largas distancias y se les ha mezclado con otras ovejas y cabras y sus patógenos. Después de la infección con capripoxvirus se produce invariablemente una gran mortalidad en razas ovinas y caprinas importadas sin ninguna protección previa. La viruela caprina no es infecciosa para los humanos.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

•

Recogida, envío y preparación de muestras

El material para el aislamiento del virus y la detección del antígeno debe recogerse mediante biopsia o en el examen post mórtem a partir de las pápulas cutáneas, de las lesiones de los pulmones o de los nódulos linfáticos. Las muestras para el aislamiento del virus y para el enzimoinmunoensayo (ELISA) de detección de antígenos se recogerán en la primera semana de la manifestación de los signos clínicos, antes de que se produzcan anticuerpos neutralizantes. Las muestras para la detección genómica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden recogerse cuando ya está presente el anticuerpo neutralizante. Para el aislamiento del virus también se puede también la capa leucoplaquetaria de la sangre recogida en heparina o EDTA (ácido etilendiamino tetracético) durante el estadio virémico de la viruela caprina (antes de la generalización de las lesiones o en los cuatro días de generalización de la enfermedad). Las muestras para el examen histológico han de incluir tejido procedente de las áreas circundantes, y se han de colocar inmediatamente después de su recogida en formalina al 10% en un volumen que sea diez veces el de la muestra. Los tejidos en formol no necesitan requisitos especiales para el transporte. Las muestras de sangre para el aislamiento del virus a partir de la capa leucoplaquetaria se recogerán en tubos con anticoagulante, se colocarán inmediatamente en hielo y se procesarán lo antes posible. En la práctica, las muestras de sangre deben conservarse a 4°C durante dos días antes de su procesamiento, pero no deben congelarse o mantenerse a temperatura ambiente. Los tejidos destinados al aislamiento de virus, la detección de antígenos o la detección de genoma se conservarán a 4°C, en hielo o a –20°C. Si hay que transportar las muestras a largas distancias sin refrigeración, el medio de transporte deberá contener glicerol al 10%; las muestras tendrán el tamaño suficiente para que el medio de transporte no llegue a la parte central de la biopsia que se utilizará para el aislamiento o la detección del virus. El material para el análisis histológico se preparará mediante técnicas normalizadas y se teñirá con hematoxilina y eosina (H-E). El material de las lesiones para el aislamiento de virus y para la detección del antígeno se homogeneiza. Una técnica para la homogeneización es la siguiente: se corta el tejido empleando tijeras y fórceps, y después se muele en un almirez y la mano de mortero con arena estéril y un volumen igual de tampón salino fosfato (PBS) que contenga penicilina sódica (1.000 unidades internacionales [UI]/ml, sulfato de estreptomicina (1 mg/ml), micostatina (100 UI/ml) o fungizona (2,5 µg/ml) y neomicina (200 UI/ml). La suspensión homogeneizada se congela y descongela tres veces y posteriormente se clarifica por centrifugación, empleando una centrífuga de mesa, a 600 g durante 10 minutos. La capa leucoplaquetaria puede prepararse a partir de 5– 8 ml de sangre sin coagular por centrifugación a 600 g durante 15 minutos; la capa se transfiere cuidadosamente a 5 ml de agua bidestilada fría empleando una pipeta Pasteur estéril. Pasados 30 segundos, se añaden 5 ml de medio de crecimiento frío y a doble concentración, y se mezclan. La mezcla se centrífuga a 600 g durante 15 minutos, se desecha el sobrenadante y el sedimento de células se resuspende en 5 ml de medio de crecimiento como el medio de Eagle modificado de Glasgow (GMEM). Después de la centrifugación a 600 g durante 15 minutos, el sedimento resultante se resuspende en 5 ml de GMEM recién preparado. Alternativamente, la capa leucoplaquetaria se puede preparar a partir de una muestra heparinizada utilizando un gradiente de Ficoll.

a)

Cultivo El capripoxvirus crecerá en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino y caprino, aunque se considera que los cultivos primarios y secundarios de células de testículo (LT) o de riñón (LK) de cordero son las más

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susceptibles, en particular las que se derivan de una raza ovina lanar. A continuación se ofrece un ejemplo de una técnica de aislamiento; se inocula un frasco de cultivo celular de 25 cm2 de células ovinas de testículo o riñón (con un 90% de confluencia) con 1 ml ya sea de la suspensión de la capa leucoplaquetaria o del sobrenadante de la preparación clarificada de la biopsia, y se permite la absorción a 37°C durante 1 hora. Posteriormente, se lava el cultivo con PBS caliente y se cubre con 10 ml de un medio adecuado, como GMEM, conteniendo antibióticos y suero fetal bovino al 2%. Si se dispone de ellos, se infectan también tubos de cultivos de tejidos que contengan células LT o LK y un cubreobjetos, o portaobjetos con cultivos de tejidos. Los frascos se examinarán diariamente durante 14 días en busca de indicios de efecto citopático (ECP), y si el medio está turbio se reemplaza. Las células infectadas desarrollan un ECP característico consistente en la retracción de la membrana celular de las células circundantes, y finalmente en el redondeamiento de las células, quedando la cromatina nuclear situada en el margen. Al principio solo se observan pequeñas zonas de ECP, algunas veces tan solo 4 días después de la infección, que se expanden durante los siguientes 4– 6 días hasta cubrir todo el tapiz celular. Si antes de 7 días no hay pruebas del ECP, se congelará y descongelará el cultivo tres veces, y el sobrenadante clarificado se inoculará en un cultivo fresco de células LT o LK. Al primer signo de ECP en los frascos, o antes, en el caso de que se estén usando varios cubreobjetos infectados, se tomará un cubreobjetos, se fijará con acetona y se teñirá empleando H-E. La presencia de los cuerpos de inclusión intracitoplásmáticos eosinófilos que son de tamaño variable, pero que pueden ser hasta la mitad del tamaño del núcleo y están rodeados por un halo claro, es indicativo de la infección por poxvirus. La formación de sincitios no es una característica de la infección por capripoxvirus. Si el efecto citopático se debe a la infección por capripoxvirus del cultivo celular, se puede evitar o retrasar mediante la inclusión de un suero anticapripoxvirus en el medio. Esto proporciona una identificación preliminar del agente. Algunas cepas de capripoxvirus se han adaptado para crecer en las células de riñón de mono verde africano (células Vero), pero estas no se recomiendan para el aislamiento primario. •

Microscopía electrónica

Antes de la centrifugación, el material de la suspensión original se prepara para su examen en un microscopio electrónico de transmisión de la siguiente manera: sobre una gota de la suspensión colocada sobre parafina o sobre una placa de cera, se deja flotar una rejilla de microscopía electrónica de 400 mallas hexagonales con un substrato de pileoform-carbón activado por una descarga luminiscente en vapor de pentilamina. Transcurrido 1 minuto, la rejilla se transfiere a una gota de tampón Tris/EDTA, pH 7,8, durante 20 segundos y después a una gota de ácido fosfotungsténico al 1%, pH 7,2, durante 10 segundos. Se escurre la rejilla empleando papel de filtro, se deja secar al aire y se coloca en el microscopio electrónico. El virión de la viruela caprina tiene forma de ladrillo y está cubierto por elementos tubulares cortos y mide aproximadamente 290 × 270 nm. Algunos de los viriones pueden rodearse de una membrana que procede de la célula del hospedador y se debe examinar el mayor número posible de células para confirmar su aparición (19). Los viriones de los capripoxvirus no se distinguen de los de ortopoxvirus, pero, aparte del virus vacunal, ningún ortopoxvirus causa lesiones en las ovejas o en las cabras. Sin embargo, el capripoxvirus se distingue de los viriones de parapoxvirus que causan dermatitis pustular contagiosa, puesto que aquellos son más pequeños, de forma ovalada, y cada uno de ellos está cubierto por un único elemento tubular continuo que aparece como estriaciones sobre el virión. •

Histología

Después de la preparación, de la tinción con H-E y del montaje del material de biopsia fijado con formalina, se examinarán varias secciones al microscopio óptico. En el examen histológico, los aspectos más característicos de las lesiones cutáneas en fase aguda son un infiltrado celular masivo, vasculitis y edema. Las lesiones tempranas se caracterizan por una inflamación perivascular marcada. Inicialmente, la infiltración es por macrófagos, neutrófilos y ocasionalmente eosinófilos, y a medida que progresa la lesión se infiltran más macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. Un rasgo característico de todas las infecciones por capripoxvirus es la presencia en la dermis de cantidades variables de “células de la viruela ovina”. Estas células de la viruela ovina pueden aparecer también en otros órganos en los que hay lesiones microscópicas de viruela ovina y caprina. Estas células son grandes, estrelladas, eosinófilas, con inclusiones intracitoplásmáticas mal definidas y núcleos vacuolados. La vasculitis va acompañada de trombosis e infarto, produciendo edema y necrosis. Los cambios epidérmicos consisten en acantosis, paraqueratosis e hiperqueratosis. Los cambios en los órganos son similares, con infiltración celular predominante y vasculitis. Las lesiones en el tracto respiratorio superior se caracterizan por la ulceración. •

Inoculación animal

El sobrenadante de la preparación de la biopsia clarificada (véase la sección B.1.a. Cultivo) se puede utilizar también para la inoculación intradérmica en corderos sensibles. Estos corderos se examinarán diariamente en busca de evidencias de una reacción cutánea.

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b)

Métodos inmunológicos •

Pruebas con anticuerpos fluorescentes

El antígeno de capripoxvirus también puede identificarse en cultivos de tejidos infectados sobre cubreobjetos o sobre portaobjetos, utilizando pruebas con anticuerpos fluorescentes. Los cubreobjetos o los portaobjetos se lavarán, se dejarán secar al aire y se fijarán con acetona fría durante 10 minutos. La prueba indirecta utilizando sueros ovinos o caprinos está expuesta a la aparición de un color de fondo muy oscuro y a reacciones no específicas. Sin embargo, se puede preparar un conjugado directo a partir de sueros de ovejas o cabras convalecientes o de conejos hiperinmunizados con capripoxvirus purificado. Como control negativo deben incluirse los cultivos de tejidos sin infectar, porque las reacciones cruzadas pueden causar problemas debido a los anticuerpos contra los antígenos de los cultivos de tejidos. Se ha utilizado también la técnica con anticuerpos fluorescentes sobre portaobjetos en cortes de tejido preparados en un microtomocriostato. •

Inmunodifusión en gel de agar

Para la detección del antígeno de precipitación de capripoxvirus se ha utilizado la prueba de inmunodifusión en gel de agar (IDGA), pero tiene la desventaja de que este antígeno es compartido por el parapoxvirus. La agarosa (1%) se prepara en tampón borato, pH 8,6, se disuelve por calor, y se vierten 2 ml sobre un portaobjetos de cristal (76  26 mm). Cuando al agar se ha solidificado, se excavan 6 pocillos formando una roseta alrededor de un pocillo central. Cada pocillo mide 5 mm de diámetro, y hay una distancia de 7 mm entre el centro del pocillo central y el centro de cada uno de los pocillos periféricos. Los pocillos se llenan de la siguiente manera: en tres pocillos de la periferia se depositan 18 µl de la suspensión de la lesión alternando con el antígeno de control positivo, y en el pocillo central se depositan 18 µl de suero de control positivo de capripoxvirus. Los portaobjetos de colocan en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 48 horas, y se examinan para detectar la formación de líneas de precipitación visibles empleando un transiluminador. El material ensayado es positivo si se forma una línea de precipitación con el suero control que confluye con la producida por el antígeno de control positivo. Esta prueba, sin embargo, no permite distinguir entre la infección de la viruela caprina y la dermatitis pustular contagiosa (ectima contagioso). Para preparar el antígeno para la prueba IDGA, uno de los dos frascos de 125 cm2 con células LT o LK se infecta con capripoxvirus y, cuando se alcanza un grado de efecto citopático del 90% (8–12 días), se recogen las células. Se congela y descongela el frasco dos veces, y se agita este para liberar las células del frasco. El contenido se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, se decanta la mayor parte del sobrenadante y se guarda, y el sedimento se resuspende en el sobrenadante restante. Las células se lisarán utilizando una sonda ultrasónica durante 60 segundos aproximadamente. A continuación este homogenado se centrifuga como antes, el sobrenadante resultante se mezcla con el que ya está recogido. El sobrenadante mezclado se añade a un volumen igual de sulfato amónico saturado a pH 7,4 y se deja a 4°C durante 1 hora. Esta solución se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, y el precipitado se recoge y se resuspende en un volumen pequeño de solución salina al 0,8% para su uso en la prueba IGDA. El frasco que no se ha infectado se procesa de forma totalmente idéntica para obtener el antígeno control del cultivo celular (17). •

Enzimoinmunoensayo

Después de la clonación de la proteína estructural P32 de capripoxvirus, que es muy antigénica, se puede utilizar el antígeno recombinante expresado para la producción de reactivos para el diagnóstico, incluyendo la obtención de antisuero policlonal monoespecífico contra P32 y la producción de anticuerpos monoclonales (MAb). Estos reactivos han facilitado la elaboración de un ELISA muy específico (4, 5). Utilizando antisuero de conejo hiperinmune, obtenido por inoculación a conejos con capripoxvirus purificado, se puede inmovilizar el antígeno de la viruela caprina procedente de suspensiones de biopsias o del sobrenadante de cultivos de tejidos en una placa ELISA. A continuación, la presencia del antígeno inmovilizado puede ponerse de manifiesto utilizando un suero de cobaya obtenido contra el grupo específico de la proteína estructural P32, la inmunoglobulina comercial anticobaya de ratón conjugada con peroxidasa de rábano y una solución de substrato cromogénico.

c)

Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos Mediante las técnicas serológicas no es posible distinguir entre las cepas de capripoxvirus de los bovinos, los ovinos y los caprinos. Sin embargo, estas cepas se pueden caracterizar comparando los fragmentos genómicos originados por la digestión con HindIII de su ADN purificado (2, 16). Con esta técnica y con la secuenciación del genoma, se han identificado las diferencias entre los aislamientos de diferentes especies (12) pero no son consistentes, y hay pruebas de difusión de cepas entre especies y de recombinación entre cepas en condiciones naturales (10).

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Se puede utilizar la técnica de la PCR para detectar el genoma de capripoxvirus en muestras de biopsia o en cultivos de tejidos. Los cebadores para los genes de las proteínas víricas de unión y de fusión son específicos para capripoxvirus, y la naturaleza de los productos de la PCR puede confirmarse utilizando los lugares de reconocimiento de las enzimas de restricción (11, 13).

2.

Pruebas serológicas

a)

Neutralización vírica Un suero de ensayo se puede titular bien frente a un título constante de capripoxvirus (100 DICC50 [dosis infectiva 50% en cultivo celular]) o bien una cepa de un virus de referencia se puede titular frente a una dilución constante de un suero de ensayo para calcular el índice de neutralización. El método preferido es el índice de neutralización debido a la sensibilidad variable de los cultivos de tejidos a capripoxvirus, y la consecuente dificultad para garantizar el uso de 100 DICC50. Según la descripción de la prueba, se utilizan placas de microtitulación de cultivos de tejidos de 96 pocillos de fondo plano, pero se puede realizar perfectamente igual en tubos de cultivos de tejidos introduciendo los cambios apropiados para los volúmenes utilizados, aunque la lectura de un punto final en los tubos es más difícil. Se ha descrito que el uso de células Vero en la prueba de neutralización de virus produce resultados más consistentes (20). •

Procedimiento del ensayo

i)

Los sueros de ensayo, incluyendo un control positivo y un control negativo, se diluyen 1/5 en medio Eagle/HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina, ácido N-2-etanosulfónico) y se inactivan a 56°C durante 30 minutos.

ii)

A continuación, se deposita un volumen de 50 µl del primer suero inactivado en los pocillos de las columnas 1 y 2, de las filas A a la H de la placa de microtitulación. El segundo suero se coloca en los pocillos de las columnas 3 y 4, el tercero en las columnas 5 y 6, el suero de control positivo en las columnas 7 y 8, el control de suero negativo en las columnas 9 y 10, y se depositan 50 µl de medio Eagle/HEPES sin suero en las columnas 11 y 12 y en todos los pocillos de la fila H.

iii)

Una cepa de referencia de capripoxvirus, que normalmente es una cepa vacunal que se sabe que crece bien en cultivos de tejidos, con un título superior a log10 6 DICC50 por ml se diluye en medio Eagle/HEPES en frascos con tapón de rosca para obtener diluciones logarítmicas seriadas de log10 5,0; 4,0; 3,5; 3,0; 2,5; 2,0; 1,5 DICC50 por ml (equivalente a log10 3,7; 2,7; 2,2; 1,7; 1,2; 0,7; 0,2 DICC50/50 µl).

iv)

Comenzando por la fila G y por la preparación de virus más diluida, se añaden 50 µl de virus a cada pocillo de esa fila. Esto se repite con cada dilución del virus, colocando la dilución con el título más alto en la fila A.

v)

Las placas se cubren y se incuban a 37°C durante 1 hora.

vi)

Las células LT se preparan a partir de monocapas crecidas con anterioridad en una suspensión de 105 células/ml en medio Eagle con antibióticos y suero fetal bovino al 2%. Después de la incubación de las placas de microtitulación, se añaden 100 µl de la suspensión celular a todos los pocillos, excepto a los pocillos H11 y H12, que sirven como pocillos de control para el medio. Los restantes pocillos de la fila H son los controles celulares y séricos.

vii)

Las placas de microtitulación se cubren y se incuban a 37°C durante 9 días.

viii) A partir del cuarto día, se examinan diariamente las monocapas en busca de pruebas del ECP, utilizando un microscopio de inversión. En las células de la fila H no ha de haber ECP. Utilizando la cepa vacunal 0240 KSGP de capripoxvirus, la lectura final se toma el 9º día, y el título del virus en cada titulación réplica se calcula según el método Kärber (14). Si se deja más tiempo, siempre se produce un aumento del virus, de modo que el virus que al principio estaba neutralizado parece disociarse del anticuerpo. ix)

Interpretación de los resultados: El índice de neutralización es la diferencia entre el título del virus en un suero negativo y el del suero de ensayo. Un índice ≥1.5 es positivo. La prueba puede hacerse más sensible si se examina el suero del mismo animal antes y después de la infección. Debido a que la inmunidad a la viruela caprina está predominantemente mediada por células, un resultado negativo, en particular después de la vacunación en la que la respuesta es débil, no implica que el animal del que se ha obtenido el suero no esté protegido. Se ha descrito un método que mantiene constante el virus y varía el suero en el que se utilizan diluciones del suero en un rango desde 1/5 a 1/500 y células de músculo fetal bovino. Debido a que estas células tienen menor sensibilidad a los capripoxvirus que las células LT, el problema del aumento del virus queda resuelto.

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b)

Inmunodifusión en gel de agar La prueba IGDA no puede recomendarse como una prueba serológica para la diagnosis de la viruela caprina, debido a la reacción cruzada con anticuerpos contra el virus de la dermatitis pustular contagiosa, que es la principal prueba diagnóstica diferencial. Una consecuencia de esta reacción cruzada es la aparición de resultados falsos positivos.

c)

Prueba indirecta con anticuerpos fluorescentes Para la prueba indirecta con anticuerpos fluorescentes, se pueden utilizar los cultivos de tejidos infectados con capripoxvirus cultivados sobre cubreobjetos o los cultivos de tejidos sobre portaobjetos. En la prueba se incluirán el control del cultivo celular sin infectar y los sueros de control positivo y negativo. Los cultivos infectados y los cultivos control se fijan con acetona a –20°C durante 1 hora y se guardan a 4°C. Las diluciones de los sueros de prueba se realizan en PBS, comenzando con una dilución 1/5, y los positivos se identifican utilizando una gammaglobulina antioveja conjugada con isocianato de fluoresceína (8). Las reacciones cruzadas pueden tener lugar con el virus del ectima contagioso, con el de la estomatitis papular bovina y quizás con otros poxvirus.

d)

Análisis por inmunoelectrotransferencia (Western blot) El análisis por inmunoelectrotransferencia de los sueros de ensayo frente a los lisados de células infectadas por capripoxvirus proporciona un sistema sensible y específico para la detección del anticuerpo contra las proteínas estructurales de capripoxvirus, aunque la prueba es cara y difícil de llevar a cabo (7). Las células LT infectadas por capripoxvirus deben recogerse cuando se observe un efecto citopático del 90%, a continuación se congelan y descongelan tres veces, y los desechos celulares se sedimentan por centrifugación. Se decanta el sobrenadante y las proteínas se separan después por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS/PAGE). Se recomienda un sistema vertical de gel discontinuo, empleando gel de concentración con acrilamida (5%) en Tris (125 mM), pH 6,8, y SDS (0,1%), y gel de resolución con acrilamida (10–12,5%) en Tris (560 mM), pH 8,7, y SDS (0,1%), utilizando un tampón de desarrollo de glicina que contenga Tris (250 mM), glicina (2 M), y SDS (0,1%). Antes de cargar el gel, se preparan las muestras del sobrenadante mediante ebullición con un tampón de lisis adecuado. Como alternativa al antígeno del cultivo celular, se puede utilizar también un virus purificado o la proteína recombinante expresada de P32 (6, 11). Simultáneamente con las muestras de proteínas, se hacen correr los marcadores de peso molecular. Una vez separadas las proteínas en el gel SDS/PAGE se transfieren electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa (NCM). Después de la transferencia, la membrana se aclara exhaustivamente con PBS y se bloquea con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBS, o con leche en polvo desnatada al 5% en PBS, y se deja en un agitador rotatorio a 4°C toda la noche. A continuación, la NCM puede separarse en tiras utilizando un aparato comercial que permite el ensayo simultáneo de múltiples muestras de suero, o bien se puede cortar en tiras e incubar luego cada una de ellas por separado. La NCM se lava cuidadosamente realizando cinco cambios de tampón PBS durante 5 minutos en un agitador rotatorio, y después se deja en un agitador a temperatura ambiente durante 1,5 horas con el suero apropiado a una dilución de 1/50 en tampón de bloqueo (3% BSA y Tween 20 al 0,05% en PBS; o leche en polvo al 5% y Tween 20 al 0,05% en PBS). Se lava de nuevo la membrana exhaustivamente y se incuba (en el tampón de bloqueo) con antiinmunoglobulinas de la especie conjugadas con peroxidasa de rábano a una dilución determinada previamente mediante titulación. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1,5 horas, la membrana se lava y se le añade una solución de tetrahidrocloruro de diaminobencidina (10 mg en 50 ml de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, y 20 µl de peróxido de hidrógeno al 30% [v/v]. Acto seguido se incuba en un agitador a temperatura ambiente durante aproximadamente 3–7 minutos con observación constante, y se detiene la reacción mediante lavado con PBS antes de que el color de fondo se vea en exceso. Para cada ocasión se utilizará un suero de control positivo y negativo. Las muestras que se consideren positivas en el ensayo y el control positivo originarán un patrón de bandas consistente con una reacción con las proteínas de pesos moleculares 67, 32, 26, 19, y 17 kDa – las proteínas estructurales principales de capripoxvirus – mientras que las muestras de suero negativas no reaccionarán dando este patrón. El suero hiperinmune preparado contra parapoxvirus (virus del ectima contagioso) reaccionará con algunas de las proteínas de capripoxvirus, pero no con la de 32 kDa que es específica de capripoxvirus.

e)

Enzimoinmunoensayo Se ha elaborado un ELISA para capripoxvirus empleando la expresión de la proteína estructural P32 de capripoxvirus y los MAb obtenidos contra la proteína P32 (6, 11).

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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO Se ha utilizado una variedad de vacunas de capripoxvirus vivas atenuadas e inactivadas para proteger a las ovejas y a las cabras contra la viruela caprina (véanse las referencias 4 y 15 para las revisiones). Todas las cepas de capripoxvirus de origen ovino, caprino o bovino examinadas hasta ahora comparten un sitio de neutralización principal, de forma que los animales recuperados de la infección con una cepa son resistentes a la infección por cualquiera de las otras (3). En consecuencia, es posible utilizar una sola cepa de capripoxvirus para proteger a las ovejas y a las cabras contra todas las cepas de campo del virus, con independencia de que su origen estuviera en Asia o África (18, 20). Hay dos formas antigénicas de capripoxvirus, el virión intacto cubierto por elementos tubulares cortos, y el virión intacto cubierto además por una membrana que procede de la célula hospedadora. Esta última es la forma producida normalmente por el animal infectado, mientras la primera es la que se observa cuando el virus se produce por congelación y descongelación de cultivos de tejidos infectados. Las vacunas muertas producidas a partir de cultivos de tejidos están formadas por viriones casi completamente desnudos, y cuando se utilizan como una vacuna no estimulan la inmunidad para que el virión se envuelva con la membrana. Esto explica en parte el poco éxito que tienen las vacunas inactivadas. Un factor adicional es que las vacunas inactivadas son menos eficaces que las vivas (que replican al virus vacunal) en la estimulación de la respuesta inmune mediada por células, que es la respuesta protectora predominante a la infección por poxvirus. Las vacunas muertas de la viruela caprina proporcionan, como mucho, una protección temporal. Una serie de cepas de capripoxvirus han tenido un uso extendido como vacunas vivas (9), por ejemplo, la cepa de la viruela ovina y caprina de Kenia 0240, utilizada en ovejas y cabras, las cepas Rumana y RM-65, utilizadas principalmente en ovejas, y Mysore y Gorgan utilizadas en cabras. La inmunidad contra la viruela caprina en las ovejas y las cabras después de la vacunación con la cepa 0240 dura más de un año y probablemente proporcionará una protección para toda la vida frente al desafío letal. La cepa 0240 no se utilizará en razas bovinas Bos taurus. Se está elaborando una nueva generación de vacunas de la viruela caprina que utiliza el genoma de capripoxvirus como vector para los genes de otros patógenos de los rumiantes, por ejemplo, los genes de los virus de la peste bovina y de la peste de los pequeños rumiantes (PPR). La vacuna recombinante proporcionará protección contra la viruela caprina, la peste bovina y la PPR en una sola vacuna (1).

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo Una cepa de capripoxvirus utilizada en la producción de una vacuna debe ir acompañada de un historial en el que se describa su origen y su pase por cultivos de tejidos o animales. Debe ser inocua para utilizarla en todas las variedades de ovejas y cabras en las que se pretende emplear, incluyendo los animales preñados. No debe ser transmisible, debe permanecer atenuada después del pase posterior por un cultivo celular, y proporcionar una protección completa frente al desafío de cepas de campo virulentas por un mínimo de un año. Será conveniente preparar una cantidad de inóculo original del virus vacunal y guardarlo con el fin de proporcionar un inóculo de trabajo constante para la producción regular de vacunas.

b)

Método de cultivo El inóculo de vacuna debe liofilizarse y guardarse en viales de 2 ml a –20°C. Se puede guardar en estado húmedo a –20°C, pero de ser así, es más estable a –70°C o a temperatura más baja. Para obtener un rendimiento óptimo, el virus debe cultivarse en células primarias o secundarias LT o LK de oveja lanar. También pueden utilizarse células Vero.

c)

Validación como vacuna Debe demostrarse que los lotes de siembra son: i)

Puros: Estar libres de virus ajenos, en particular de pestivirus, tales como el virus de la enfermedad de la frontera y de la diarrea vírica bovina, y libres de contaminación por bacterias, hongos y/o micoplasmas.

ii)

Inocuos: No producir reacción clínica en ninguna de las razas de ovejas o cabras cuando se les administra por la vía recomendada.

iii)

Eficaces: Estimulador una inmunidad completa a la viruela caprina en todas las razas de ovejas y cabras durante al menos 1 año.

En la sección C.4. se describen las pruebas necesarias.

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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina

2.

Método de producción

Los lotes de vacuna se producen sobre monocapas de células secundarias LT o de células primarias LK. Se reconstituye un vial de inóculo vírico con GMEM y se inocula en una monocapa de células LT o LK, que previamente se ha lavado con PBS templado, y se permite la adsorción a 37°C durante 15 minutos antes de recubrir la mezcla con GMEM adicional. Transcurridos 4–6 días, deberá apreciarse un gran efecto citopático (50– 70%). El cultivo deberá examinarse en busca de indicios de ECP no específico, turbidez del medio o cambio en el pH. Se congela y descongela el cultivo tres veces, se recoge la suspensión y se centrifuga a 600 g durante 20 minutos. Puede requerirse un segundo pase para producir una cantidad de virus suficiente para obtener un lote productivo (para producir suficiente cantidad para 106 dosis se requiere la producción de cinco frascos de 175 cm2). Se repite el procedimiento y el producto obtenido de cada uno de los frascos numerados por separado se mezcla también por separado con un volumen igual de hidrolizado estéril de lactoalbúmina al 5% frío y sacarosa al 10%, y se transfiere a frascos numerados por separado para su conservación a –20°C. Antes se toman 0,2 ml de cada frasco para un control de esterilidad, y una muestra adicional de 0,2 ml para la titulación del virus. Se toman mezclas de 2 ml formadas por las muestras de 0,2 ml tomadas de los diez frascos. Debe conservarse un registro escrito de todos los procedimientos para todos los lotes de vacunas. Las vacunas inactivadas se producen normalmente a partir de cepas de campo de capripoxvirus sin atenuar, que han crecido en cultivos de tejidos como se ha descrito anteriormente, inactivadas con formaldehído al 0,03%, y mezcladas con un volumen igual de alhidrogel como adyuvante. Ya no se considera adecuado el formaldehído para la inactivación de otras vacunas víricas debido a que su modo de acción no puede garantizar que sea totalmente eficaz para la inactivación de todos los virus vivos. Este extremo no ha sido completamente investigado para capripoxvirus.

3.

Control durante el proceso

Células: Las células se obtendrán a partir de testículo o riñón de un cordero joven y sano de un rebaño libre de prurigo lumbar de una raza de ovejas lanares. Las células deben observarse durante el cultivo en busca de pruebas de efecto citopático y de células con morfología normal (predominantemente fibroblásticas). Normalmente se pueden llevar a cabo con éxito hasta diez pases de estas células. Cuando estas se utilicen para la producción de vacunas, se realizarán paralelamente cultivos control sin infectar, y se mantendrán al menos durante un pase más para su posterior observación. Se revisarán para determinar la presencia de cepas de virus no citopáticos de la diarrea vírica bovina o de la enfermedad de la frontera mediante técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa. Si resulta posible, se hará una preparación de células y una criba antes de la producción de la vacuna, y se guardará un stock en DMSO estéril (dimetilsulfóxido) en nitrógeno líquido (alícuotas de 1–2 ml conteniendo 20 × 106 células/ml). El suero utilizado en el medio de crecimiento debe estar libre de anticuerpos contra capripoxvirus o de contaminación con pestivirus. Virus: El virus de inóculo y la vacuna final deben titularse en tubos de cultivos celulares o en placas de microtitulación. Las muestras de vacunas deben examinarse para la presencia de virus ajenos, incluyendo cepas de pestivirus citopáticas y no citopáticas, y deben mezclarse con suero inmune contra capripoxvirus con un título alto que haya dado resultado negativo con relación a los anticuerpos contra pestivirus, con el fin de impedir que el virus vacunal mismo interfiera con la prueba. El material de la vacuna puede mantenerse a –20°C hasta que se completen todas las pruebas de esterilidad y de titulación, y entonces se liofilizará en alícuotas de 1 ml en viales suficientes para 100 dosis. El producto vacunal diluido con hidrolizado de lactoalbúmina y sacarosa tendrá un título mínimo de log10 4,5 DICC50 por mililitro después de la liofilización, equivalente a una dosis de campo de log10 2,5 DICC50. Se lleva a cabo una titulación posterior en cinco viales de la preparación liofilizada, elegidos al azar para confirmar el título.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Las pruebas para determinar la esterilidad y la ausencia de contaminación de los materiales biológicos pueden encontrarse en el capítulo 1.1.9.

b)

Inocuidad y eficacia En una unidad animal de nivel de contención alto, se confinan cuatro ovejas y cuatro cabras de sensibilidad conocida a los capripoxvirus, y se recogen muestras de suero. Se reconstituyen cinco viales elegidos al azar de la vacuna liofilizada en 1 ml de PSB estéril cada uno, y se mezclan. Se inoculan por vía intradérmica una oveja y una cabra con 0,2 ml de la vacuna concentrada. La vacuna restante se diluye

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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina

20 veces con PBS estéril y se inoculan dos ovejas y dos cabras subcutáneamente con 0,2 ml – la dosis de campo recomendada. Los animales control son la oveja y la cabra restantes. Los animales se examinan clínicamente a diario y se registra su temperatura rectal. Al cabo de 21 días después de la vacunación, se toman nuevas muestras de sangre a los ocho animales y se ensayan mediante inoculación intradérmica con una cepa virulenta conocida de capripoxvirus. Se anota la respuesta clínica durante los 14 días siguientes. Los animales control desarrollarán los síntomas típicos de la viruela caprina, mientras que no deberá haber reacción local o sistémica en los vacunados, excepto una reacción de hipersensibilidad tardía, que desaparecerá a los 4 días. Se tomarán nuevas muestras de suero 30 días después de la vacunación. Las muestras de suero del día 21 se examinan para observar si se produce seroconversión en cuanto a las enfermedades víricas seleccionadas que podrían haber contaminado la vacuna, y las muestras del día 0 y 30 se comparan para confirmar la ausencia de anticuerpos contra pestivirus. Se prueba también la vacuna totalmente reconstituida en ratones y cobayas. Se inoculan dos cobayas con 0,5 ml por vía intramuscular en la pata trasera, y dos cobayas y seis ratones intraperitonealmente con 0,5 ml y 0,1 ml respectivamente. Como controles sin inocular se conservan dos cobayas y cuatro ratones. Los animales se observan durante tres semanas, se sacrifican de forma humanitaria y se lleva acabo un examen post mórtem. No deberá haber evidencia de patología debido a la vacuna.

c)

Pruebas de potencia Es suficiente con menos de 1 DICC50 de la cepa 0240 para inmunizar a una oveja o una cabra. Sin embargo, deben realizarse pruebas de potencia para otras cepas de capripoxvirus si no se conoce la dosis mínima inmunizante. Esto se lleva a cabo mediante la comparación del título de un virus de prueba virulento y el de los animales control por inoculación en los costados de los animales vacunados. Después de la vacunación, se afeita la lana o el pelo del costado de al menos tres animales y de tres controles. Se preparan diluciones logarítmicas decimales del virus prueba en PBS estéril, y se inoculan por vía intradérmica seis de estas diluciones (0,1 ml por inóculo) a lo largo de la longitud del flanco; inoculando adicionalmente cuatro réplicas de cada dilución verticalmente de arriba hacia abajo también en el flanco. Es posible que se desarrolle una inflamación edematosa en los 24 sitios de inoculación en los animales de control, aunque preferiblemente habrá poca reacción o ninguna en los cuatro sitios de los inóculos más diluidos. Dentro de las 24 horas los animales vacunados desarrollarán una reacción de hipersensibilidad inicial en los puntos de inoculación que disminuirá rápidamente. Pueden desarrollarse pequeñas zonas de necrosis en el punto de inoculación del virus problema más concentrado. La mácula/pápula se mide entre 8 y 10 días después del desafío. El título del virus problema se calcula para los animales vacunados y para los animales de control; se toma como evidencia de protección una diferencia en el título logarítmico >log10 2,5.

d)

Duración de la inmunidad La inmunidad de las ovejas y de las cabras a los virus de campo virulentos después de la vacunación con la cepa 0240 dura más de 1 año, y la protección contra la infección generalizada después de la vacunación intradérmica dura al menos tres años, y es eficaz durante toda la vida. La duración de la inmunidad producida por otras cepas vacunales se establecerá en las ovejas y en las cabras mediante la realización de ensayos controlados en unas condiciones en las que no haya posibilidad de que las cepas de campo de capripoxvirus interfieran los resultados. Las vacunas inactivadas proporcionan una inmunidad de menos de un año y, por las razones expuestas al comienzo de esta sección, no confieren inmunidad a la forma de capripoxvirus normalmente asociada con la transmisión natural.

e)

Estabilidad Las preparaciones de la vacuna de la viruela caprina adecuadamente liofilizadas, en particular aquéllas que incluyen un protector como la sacarosa y el hidrolizado de lactoalbúmina son estables más de 25 años cuando se guardan a –20°C, y 2–4 años si se hace a 4°C. Hay pruebas de que son estables a temperaturas más altas, pero no se tiene constancia de experimentos controlados a largo plazo. Las vacunas inactivadas deben conservarse a 4°C, y su período de validez está normalmente fijado en 1 año.

f)

Conservantes Aparte de un protector, como la sacarosa y el hidrolizado de lactoalbúmina, no se requieren conservantes para la preparación del liofilizado.

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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina

g)

Precauciones (riesgos) No existen precauciones, aparte de las descritas anteriormente, en relación con la esterilidad y la ausencia de agentes extraños. La cepa vacunal 0240 no se empleará en razas bovinas de Bos taurus. El capripoxvirus no infecta a los humanos.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Las pruebas de inocuidad deben llevarse a cabo sobre el producto final de cada lote, como se describe en la sección C.4.b.

b)

Potencia Una vez que se haya determinado la potencia de una cepa concreta que se esté utilizando para la producción de vacunas, en relación con la dosis mínima que se requiere para proporcionar inmunidad, no es necesario repetir la prueba de potencia sobre el producto final de cada lote, si se ha determinado el título del virus.

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Capítulo 2.7.14. — Viruela ovina y viruela caprina

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la viruela ovina y la viruela caprina (véase el cuadro de la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la OIE: www.oie.int).

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