Validierung: „Wer, wie, was, wieso, weshalb, warum?" Hermann Wätzig

Institut für Pharmazeutische Chemie Universität Braunschweig [email protected]

Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Validierung: „Wer, wie, was, wieso, weshalb, warum?"

Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Validierung: Wieso, weshalb, warum? Zuverlässigkeit von Analysenergebnissen! Richtige Entscheidungen treffen!

Informationssicherung, auch langfristig!

Richtige Folgeentscheidungen treffen! Aufgabenteilung, Schnittstellen!

Überregionale, teilweise globale Kooperation!

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Validierung: Wer? Validierung: Warum? Zuverlässigkeit von Analysenergebnissen!

Validierung: Wer? Wir alle! Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Validierung: Was? Präzision SOP

Detektionsgrenze Selektivität Richtigkeit

Bestimmungsgrenze Robustheit Spezifikation Qualitätssicherung Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Validierung Def.: Validierung einer Analysenmethode: Spezifikation und Erfüllung von Leistungskriterien (Auftrennung, Reproduzierbarkeit, Bestimmungsgrenze usw.) Validierung von Analysenergebnissen: systematische Überprüfung, ob die spezifizierte Leistung der Methode mit den Analysenergebnissen erbracht wurde. http://www.pharmchem.tu-bs.de/lehre/downloads/documents/waetzig/STAT_U33gs.pdf International Conference on Harmonisation, Guidelines; www.ich.org; Q2: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Präzision Def.: Übereinstimmung von Messwerten innerhalb einer Serie http://www.pharmchem.tu-bs.de/lehre/downloads/documents/waetzig/STAT_U33gs.pdf International Conference on Harmonisation, Guidelines; www.ich.org; Q2: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology

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Präzision Achtung: präzise Werte können richtig sein, sie können aber auch falsch sein! Beispiel: Zielscheibe

präzise und richtig

präzise und nicht richtig

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nicht präzise und nicht richtig

Präzision Mit der Präzision wird zufällige Fehler bewertet. Systematische Fehler werden nicht berücksichtigt! Beispiele für systematische Fehler: falsch gehende Uhr, falsche Einwaage, falsche Volumenabmessung

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Präzision: warum? Qualitätskontrolle, Einhaltung von Spezifikationen

X

XX X

95%

X

X

X

105%

XXXXXXX

95%

105%

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Präzision: was tun?

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Präzision: Kontrollkarten!

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Präzision: Kontrollkarten! 15000

CGE mit hydrodynamischer Injektion

13000 11000 9000 7000

40

5000

35

3000 0

Myoglobin 10

Carboanhydrase 20

30Ovalbumin 40 BSA

50

30 25 20 15 10Myoglobin 0

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Carboanhydrase 10 20

Ovalbumin 30

BSA 40

50

Präzision: Kontrollkarten!

RP Separation Myoglobin 200000

800000

150000

Peak area

Peak area

RP Separation Myoglobin

1000000

600000 400000 200000

100000 50000 0

0 0

5

10 Runs

15

20

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0

5

10 Runs

15

20

Präzision: Kontrollkarten! CIEF-m yo-HCl-1-6 30

tmig

25

20

t mig

15

10 0

10

20

30 run

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40

50

60

Präzision: Kontrollkarten! myoglobin, RSD 3.97%

22

ß-lactoglobulin, RSD 4.41% Ovalbumin, RSD 4.73%

20

tmig [min]

18

16 14 12 10 0

10

20

30

40

50

60

run

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70

80

Richtigkeit Def.: Übereinstimmung mit dem wahren Wert http://www.pharmchem.tu-bs.de/lehre/downloads/documents/waetzig/STAT_U33gs.pdf International Conference on Harmonisation, Guidelines; www.ich.org; Q2: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology

Aber: Wie können wir den wahren Wert ermitteln?

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Richtigkeit Problematik: Reinheit/Gehalt von Referenzsubstanzen! Zur Gehaltsbestimmung von Referenzsubstanzen muss eine Methode eingesetzt werden, die fehlerhaft sein kann! Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Richtigkeit Gehaltsbestimmung von Referenzsubstanzen: im Ringversuch

http://www.lme.brandenburg.de/news/messergebnisse.htm Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Qualität Präzision

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Richtigkeit

Robustheit Def.: Unabhängigkeit des Analysenergebnisses von kleinen Veränderungen im Meßsystem (engl.: robustness), oder die Übereinstimmung von Meßwerten in einem Ringversuch (engl.: ruggedness) http://www.pharmchem.tu-bs.de/lehre/downloads/documents/waetzig/STAT_U33gs.pdf International Conference on Harmonisation, Guidelines; www.ich.org; Q2: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology

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Robustheit Übereinstimmung von Messwerten in einem Ringversuch

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Robustheit Übereinstimmung von Messwerten in einem Ringversuch

http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/malz-frank-2003-06-30/HTML/Malz_html_46211f92.gif Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Robustheit Def.: Unabhängigkeit des Analysenergebnisses von kleinen Veränderungen im Meßsystem (engl.: robustness) Aber: von welchen Veränderungen? Stark abhängig von Analysentechnik! In der CE z.B. u.a. wichtig: Lampenalter; in der GE: Temperatur beim Entfärben; in der TLC: Kammersättigung, rel. Luftfeuchtigkeit; in der HPLC: Säulentyp Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Robustheit Literaturhinweise und Links: CE: H. Wätzig, M. Degenhardt, A. Kunkel, Electrophoresis 19, 2695-2752 (1998) L. Baur, H. Jehle, H. Wätzig J. Pharm. Biomed., 22, 433-449 (2000) GE: A. Koller, H. Wätzig, Electrophoresis 26, 2470–2475 (2005) S. Schröder, A. Brandmüller, X. Deng, A. Ahmed, H. Wätzig, J. Pharm. Biomed. Anal., 2009, 50, 320–327 X. Deng et al., in Vorbereitung HPLC: http://www.pharmchem.tu-bs.de/forschung/waetzig/#veranstaltungen, insb. Vorträge 2009 von A. Clarke und T. Zimmermann

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Qualität Präzision

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Richtigkeit

Qualität Präzision

Richtigkeit Robustheit

Error

zufälliger Fehler Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Bias

systematischer Fehler

Selektivität Def.: Unabhängigkeit des Analysenergebnisses von der Anwesenheit möglicherweise erwarteter Begleitstoffe (Abbauprodukte, Synthesenebenprodukte, Metaboliten, Matrices...) http://www.pharmchem.tu-bs.de/lehre/downloads/documents/waetzig/STAT_U33gs.pdf International Conference on Harmonisation, Guidelines; www.ich.org; Q2: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology

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Selektivität Beispiel: Stabilität von Acetylsalicylsäure

+ H 2O

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+ HOAc

Qualität Präzision

Richtigkeit Robustheit

Error

zufälliger Fehler Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Bias

systematischer Fehler

Qualität Richtigkeit

Präzision Robustheit

Error

zufälliger Fehler Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Selektivität

Bias

systematischer Fehler

Bestimmungsgrenze (quantition limit, QL) Def.: Stoffmenge oder Konzentration, die mit einer vorgegebenen Präzision quantifiziert werden kann. http://www.pharmchem.tu-bs.de/lehre/downloads/documents/waetzig/STAT_U33gs.pdf International Conference on Harmonisation, Guidelines; www.ich.org; Q2: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology

100% QL = ⋅ σˆ ( c ) RSD % max

σˆ (c) =

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σˆ ( y ) a1

Empfindlichkeit a1 Def.: Steigung der Kalibrierfunktion http://www.pharmchem.tu-bs.de/lehre/downloads/documents/waetzig/STAT_U33gs.pdf International Conference on Harmonisation, Guidelines; www.ich.org; Q2: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology

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Empfindlichkeit a1 y

35 30

a1

25 20

a1

σˆ (c) =

σˆ (y)

15 10 5 0 0

0,5

1

σˆ (c) 1,5

2

σˆ (c) 2,5

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3

3,5

c

σˆ ( y ) a1

Bestimmungsgrenze (quantition limit, QL) Beispiel: Erforderliche Präzision entspricht RSD% = 10% (z.B. Reinheitskontrolle) Signalstandardabweichung: 2· 10-4 Empfindlichkeit: 105/(mol/L), = 105 L ·mol-1 2·10-8 mol/L

-4 ˆ σ ( y ) 100% 2·10 ˆ ( c ) -9 mol/L σˆ (c) = QL = ⋅ σ2·10 = 2·10-9 mol/L 5/(mol/L) % max RSD 10% 10a 1

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Bestimmungsgrenze (quantition limit, QL) Beispiel (höhere erforderliche Präzision): Erforderliche Präzision entspricht RSD% = 0.2% (z.B. Gehaltsbestimmung sehr wertvoller Substanzen) Signalstandardabweichung: 2· 10-4 Empfindlichkeit: 105/(mol/L), = 105 L · mol-1 1·10-6 mol/L

ˆ ( y )-4 σ 100% 2·10 ˆ ( c ) -9 mol/L σˆ (c) = QL = ⋅ σ2·10 = 2·10-9 mol/L 5/(mol/L) % max RSD 10a 0.2% 1 Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Detektionsgrenze (detection limit, DL) Def.: Substanzmenge oder Substanzkonzentration, bei der mit der vorgegebenen Methode sicher detektiert werden kann. http://www.pharmchem.tu-bs.de/lehre/downloads/documents/waetzig/STAT_U33gs.pdf International Conference on Harmonisation, Guidelines; www.ich.org; Q2: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology

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Detektionsgrenze (detection limit, DL) Meist mit Hilfe des Signal-RauschVerhältnisses definiert: z.B. in der Ph. Eur., Methoden 2.2.28, 2.2.29 und 2.2.46

2H S/N= hn

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Detektionsgrenze (detection limit, DL) wichtig: eindeutige Definition des Rauschens! A) Chromatogramm mit Signalpeak

B) Ermittlung des Rauschens aus dem Chromatogramm einer Blindprobe

Peak

≥ 5 b0.5

H

b0.5

H b0.5

hn

Peakhöhe von der Spitze bis zur Nulllinie (Bestgerade durch das Rauschen) Peakbreite auf halber Höhe des Peaks

Nulllinie

e 5 b0.5 hn

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Bereich um die Peakmitte herum, der dem mindestens 5fachen b0.5 en maximale Amplitude des Grundrauschens im Bereich der mindestens 5

Qualität Richtigkeit

Präzision Robustheit

Error

zufälliger Fehler Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Selektivität

Bias

systematischer Fehler

Qualität Präzision Empfindlichkeit QL (DL)

Richtigkeit Robustheit

Error

zufälliger Fehler Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Selektivität

Bias

systematischer Fehler

Validierung: Was?

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Validierung: Was?

(Beispielfragen 1. Pharm. Prüfg.) Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Validierung: Wie?

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Validierung: Wie? Prinzip: Ziele/Spezifikationen festlegen! Methoden entwickeln! Validieren!

Spezifikationen werden nicht eingehalten:

Spezifikationen werden eingehalten: fertig!

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Validierung: Wie? Organisation: Ziele/Spezifikationen und Zuständigkeiten festlegen! ICH Q2 ! Methoden entwickeln! SOPs ! Spezifikationen werden nicht eingehalten:

Validieren! SOPs ! ICH Q2 ! Spezifikationen werden eingehalten: fertig!

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Validierung: Wie? Standardarbeitsanweisungen = Standard Operation Procedures = SOPs Checklisten mit Parametern, ggf. mit Spezifikationen

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Validierung: Wie? SOPs!

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Validation requirements (ICH Q2) Performance characteristic

Type of analytical procedure

(compare Table 15) Identification

Accuracy Precision Repeatability Intermediate Precision1) Specificity2) Detection limit (LOD) Quantitation limit (LOQ) Linearity Range

+ -

Testing for impurities Quantitation Limit only + + + + + + 3) + + + + -

Assay

+ + + + + + +

”-” signifies that this characteristic is not normally evaluated ”+” signifies that this characteristic is normally evaluated 1) in cases where reproducibility has been performed, intermediate precision is not needed 2) lack of specificity of one analytical procedure could be compensated by other supporting analytical procedure(s) 3) may be needed in some cases

Validierung: Wie? SOPs! Checklisten! Beispiele: Checklisten für experimentelle Bedingungen; I) HPLC

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Validierung: Wie? SOPs! Checklisten! I) HPLC HPLC-experimental: Instrumentierung/Instruments Pumpe/pump, ggf. *pulsdämpfer, manometer(auch engl.), Mischkammer/mixing chamber Injektor/inj.valve, inj.volume, ggf. Probenwechsler/autosampler Detektor/detector; Wellenlänge/wavelength; rate (in Hz), response time Datenauswertung: interface/data analysis: computer//Auswerte/evaluationsoftware, ggf. integration parameter substances: general Probenvorbereitung/sample pretreatment Entgasung/degassing Lösemittel/sample solvent Flussrate/flow rate Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Validierung: Wie? SOPs! Checklisten! I) HPLC (cont.) Säulen/column temperature/ggf.: thermostat Stationäre Phase/stationary phase material, i.d., L (batch-no. for protocol) Fließmittel/mobile phase Molarität und scheinbarer pH, genaue Herstellungsrezeptur molarity and virtual pH, exact recipe (order of added constituents...) Qualität und Bezugsquelle aller Reagentien (für Analysenprotokolle auch mit Chargen- No.) reagent quality and source (batch-no. for protocol)

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pre Conditioning:

2 min mit Laufpuffer

Validierung: Wie? SOPs! Checklisten! Run time:

24 min

UV-Wellenlänge

214 nm

II) MS MS:

Skim1

Not Applicable

Drying Gas Flow:

6.0 l/min

Quad Temp

Skim2

11.0 V

Drying Gas Temp:

200 oC

Ion Energy

5.0 V

Neb. Gas Pressure:

Lens1

3.0 V

Capillary Voltage:

Lens2

15 V

Iris

400 V

HED

10000 V

Width Gain

Peakwidth:

Hermann Wätzig, Chemie 932Institut für Pharmazeutische Cycletime:

99

9

Gas Temp

200

20

10 psig

RoughVac

2,23

2,2

+ 4000 V

HighVac

- 3500 V

CapCur

8,84E-06

8,84E-

47

18

ChamCur

0,12

0,0

0.07 min

DryingGas

6,946

6,96

0.42 sec/cycle

Neb Pres

9,9

9

Validierung: Wie? SOPs! Checklisten! III) CE Experimental: check list CE Buffer: pH, molarity, recipe: weight or volume of all chemicals used. sample solvent if relevant: shelf time of solutions Separation: pole outlet, U, I Capillary: material, i.d., l, L Injektion: t, U/• p Detection: wavelength, instrumentation Temperature rinsing procedures (t, reagents, • p); equilibration times

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Qualitätsmanagement, dokumentierte Abläufe, SOPs SOP 1:

Wie man eine SOP schreibt; welche Angaben wichtig sind, z.B. Autor, Gültigkeit, Verantwortlichkeiten

SOP 12:

Wie man eine Methode validiert; Strukturierung in Szenarien, Orientierung an ICH-Checkliste

SOP 121:

Wie man HPLC-Methoden zur Gehaltsbestimmung validiert

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Qualitätsmanagement, dokumentierte Abläufe, SOPs SOP 14:

Wie man eine HPLC-Methode entwickelt; welche Parameter kontrolliert werden müssen

SOP 1445:

Durchführung einer HPLC-Methode mit Probenvorbereitung zur Bestimmung des Vitamin-E-Gehaltes in einer Brausetablette

Durchführung von SOP 1445:

Dokumentation der Durchführung: SOP 1445, am **.**.201*, von Martin Mustermann

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Qualität Präzision Empfindlichkeit QL (DL)

Richtigkeit Robustheit

Error

zufälliger Fehler Hermann Wätzig, Institut für Pharmazeutische Chemie

Selektivität

Bias

systematischer Fehler

Validierung: Wie? Ziele/Spezifikationen und Zuständigkeiten festlegen! ICH Q2 ! Methoden entwickeln! SOPs ! Spezifikationen werden nicht eingehalten:

Validieren! SOPs ! ICH Q2 ! Spezifikationen werden eingehalten: fertig!

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