UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MAGISTER EN HORTICULTURA

OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE ANTIOXIDANTES PROVENIENTE DE MANZANA DE PIEL Y FRUTOS PEQUEÑOS DE RALEO DE MANZANA SOBRE SÍNDROME METABÓLICO EN UN MODELO ANIMAL MURINO

TESIS DE GRADO

MAURICIO ANDRÉS POBLETE BUSTAMANTE

TALCA, CHILE 2012

UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE ANTIOXIDANTES PROVENIENTE DE MANZANA DE PIEL Y FRUTOS PEQUEÑOS DE RALEO DE MANZANA SOBRE SÍNDROME METABÓLICO EN UN MODELO ANIMAL MURINO

POR MAURICIO ANDRÉS POBLETE BUSTAMANTE

Presentada a la Universidad de Talca Como parte de los requisitos para optar Al grado académico de MAGISTER EN HORTICULTURA

TALCA, CHILE 2012

COMISIÓN EVALUADORA

Iván Palomo Gonzalez Tecnólogo Médico, Dr. Facultad de Ciencias de Salud Universidad de Chile

Iván Razmilic Bonilla Químico, Dr. Instituto de Química de los Recursos Naturales Universidad de Talca PROFESOR TUTOR

José Antonio Yuri Salomón Ingeniero Agrónomo, Dr. Facultad de Ciencias Agrarias Universidad de Talca

Agradecimientos La idea de ingresar al programa era aprender algo nuevo, en lo que estaba trabajando pero sin conocimientos en “el como” funcionaban los organismos vegetales…. Creo que fue una experiencia enriquecedora que ayudo a aumentar mis conocimientos en temas en los que no era especialista, no fue para nada fácil, pero creo que con esto estoy terminando un largo viaje de aprendizaje. Es difícil comenzar a pensar y escribir las personas que de alguna u otra manera me ayudaron a terminar este largo proceso que comenzó hace aproximadamente 3 años. Y para no dejar a nadie fuera, creo que una manera bastante lógica es ordenarlo y dividirlos en dos grupos: Uno profesional/educacional y otro personal. Profesional: Al primero que debiera agradecer es al profesor José Antonio Yuri por abrirme las puertas de uno de los Centro Tecnológicos con más prestigio que cuenta la Universidad de Talca, el Centro de Pomáceas. Digo esto porque es un referente nacional en tema de fruticultura y que tuve la oportunidad de trabajar ahí. Al conocer la dinámica interna de este centro me llevo a conocer cómo se pueden realizar investigaciones y que tengan un impacto concreto en la industria. A la Sra. Amalia Neira, me gustaría agradecer su paciencia y ayuda, que durante las conversaciones que tuvimos, me sirvió en todas las dificultades metodológicas que nos fue presentando mientras avanzábamos en el desarrollo de la tesis. Y por intermedio de ella a Ivette Peña que me fue una tremenda ayuda en las mediciones de fenoles y capacidad antioxidante, y por intermedio de ella al Centro de Pomaceas que me ayudaron de alguna u otra manera. A los profesores guías, Dr. Iván Palomo y Dr. Iván Razmilic, por auxiliarme en ámbitos del conocimiento que yo no manejaba. Al Sr. Reyes que me ayudo en toda la parte de HPLC y química próximal. A Lisbet, que en el último tiempo me tubo una paciencia extraordinaria. Al Programa de Capital Humano Avanzado de CONICYT y el Gobierno Regional del Maule, que me apoyaron en los dos primeros años y que sin su ayuda no hubiera podido entrar al Programa de Magíster en Horticultura.

Personal: Una de las personas que más me ayudo fue Luis, gracias por facilitarme todas las instalaciones e insumos que podía, no tan solo con la tesis…. Y por la amistad en los años en que estuve en la Universidad…. Que no fueron pocos….

A Rodrigo por compartir su conocimiento en cómo trabajar con ratones en cautiverio, terminar y procesar los datos obtenidos… Además que fuiste un gran apoyo cuando la paciencia se agotaba…. A mis padres, que me forjaron como persona y en gran parte a ellos estoy ahora aca terminando mi segundo programa de Magíster…. Según creo, a la persona que más debiera agradecer es a mi Natalia, que durante estos tres años la tuve que dejar de lado para dedicarme a estudiar, siendo una gran apoyo en aquellos momentos en los que las fuerzas me abandonaban. Además, de acompañarme a revisar el ensayo con los animales o cuando me explicaba las formulas inentendibles de cierto ramo…. Gracias por la paciencia……..

A mi gran compañera Natalia que sin su ayuda y apoyo no hubiera sido capaz de terminar

I.

RESUMEN

Chile, desde finales de 1980, está pasando por un extraordinario momento económico que lo ha llevado a situarse como líder en Latinoamérica según una gran cantidad de indicadores (Desarrollo Humano, nivel de pobreza, Producto Interno Bruto, etc.). Es así que nuestro país fue invitado a formar parte de la Organization Economic Cooperation Development (OECD), grupo de países con un fuerte desarrollo socio-económico, como Estados Unidos, Japón, Noruega, Alemania, Corea del Sur entre otros. En temas de fruticultura, el nivel de liderazgo que ha alcanzado está industria en nuestro país lo sitúa en un nivel de categoría mundial, logrando ser lideres exportadores del hemisferio sur de fruta fresca en diversas especies como manzana, uva de mesa, kiwi, cerezas por citar algunos. Y actualmente también tiene una posición de líder de exportación en fruta procesada con frambuesas y arándanos. Aprovechando las fortalezas de ser un proveedor confiable de alimentos, entre otras cualidades de nuestro país. Este periodo de gran brillantez trae consigo nuevos desafíos, los cuales se debe hacer cargo la sociedad en su conjunto y no tan solo el Estado. Debido a que la globalización y la rapidez de las investigaciones han transformado al mundo en el que Chile se encuentra inserto y que en la muchas ocasiones debe competir con países con mayores recursos. Una de las alternativas, que se han barajado para hacer frente a este nuevo escenario es la utilización de las ventajas competitivas que presenta nuestro país para el desarrollo de la fruticultura, como es el clima y la disposición de agua (aunque cada vez sea más escaso este vital elemento). Por otra parte, es necesario aumentar la competitividad de la industria fruticultura en general, para evitar la entrada de nuevos competidores que pueden dejar a nuestro país fuera del mercado de exportación de fruta. Esto se deberá conjugar con las exigencias de los mercados, que cada vez están poniendo mayores exigencias, pero que puede ser una gran oportunidad de negocios para los productores nacionales. Una de las demandas crecientes son los alimentos con propiedades biológicas para evitar enfermedades o suplementos alimenticios de origen natural que signifiquen beneficios para la salud de las personas, especialmente en la última etapa de la vida. 1

La producción de manzana fresca es uno de los puntales en la fruticultura nacional, siendo solamente superada en cantidad de producción por la uva de mesa. Para la Región del Maule es la segunda fuente de ingresos económicos, según la Agencia Regional de Desarrollo Productivo Maule (Agencia Regional de Desarrollo Productivo Maule, 2010). Con el fin de aumentar la competitividad de este sector es que el trabajo realizado toma una gran importancia, porque se está buscando utilizar diversos componentes que no están siendo comercializables en la producción de manzana, ni tampoco se les ha asignado valor. Lo que traería consigo aumentar la competitividad de un sector económico que ha sido fuertemente golpeado por la valorización del peso en desmedro del dólar. Se desea desarrollar un nuevo producto en base de los desechos y/o subproductos de la industria de la manzana, por lo que se orientaron los esfuerzos en dos puntos claves: 

Agregación de valor en el fruto pequeño (raleo), el cual es descartado en alrededor de un 70%, con el fin de alcanzar mayores calibres y por consiguiente mayores precios de venta en la fruta fresca.



Por otra parte, utilizar los desechos industriales (piel) que son eliminados en el proceso de producción industrial de chip de manzana.

Se tomaron en consideración para la extracción de antioxidantes desde estos residuos diferentes factores que facilitaran el escalamiento desde el laboratorio hacia la industria. El primero fue descartar distintas metodologías que no son utilizadas por la agroindustria en sus procesos. El segundo paso fue estudiar si existían diferencias entre los cultivos orgánicos y tradicionales, especialmente en la extracción desde el fruto pequeño para estudiar la existencia de agroquímicos utilizados en sus procesos y que podrían estar presentes debido a que no han cumplido el tiempo de carencia, ya que su presencia sería perjudicial para la salud. Y por último, utilizar los extractos en un modelo animal para confirmar los posibles efectos benéficos que podrían resultar en su administración en organismos complejos y descartar efectos nocivos agudos para la salud. Los resultados del laboratorio demostraron que en el grupo control con dieta grasa se logro inducir el aumento considerable de peso y valores elevados en los indicadores relacionados al metabolismo lipídico, debido a la dieta alta en grasa o hipercalórica a la que fueron sometidos. En cambio en los grupos en estudio que fueron sometidos a los tratamientos con los extractos 2

altos en antioxidantes, proveniente desde el desecho agroindustrial, disminuyeron los valores hasta niveles del control normal. Concluyendo que el extracto alto en antioxidantes provenientes de la manzana se encuentra relacionado con la disminución de colesterol total y colesterol LDL y a su vez un aumento de colesterol HDL.

3

II. I.

CONTENIDO

RESUMEN ...............................................................................................................................1

II. CONTENIDO ...........................................................................................................................4 III. INDICE DE FIGURAS.............................................................................................................5 IV. INDICE DE TABLAS ..............................................................................................................9 V. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................11 VI. HIPOTESIS.............................................................................................................................12 6.1

Objetivo General..............................................................................................................12

6.2

Objetivo Específico .........................................................................................................12

VII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ..............................................................................................13 VIII.

METODOLOGÍA............................................................................................................21

8.1

Recolección Y Extracción ...............................................................................................21

8.2

Preparación De Los Extractos .........................................................................................22

8.3

Caracterización Química .................................................................................................24

8.4

Análisis Estadístico..........................................................................................................25

8.5

Preparación De Las Dietas. .............................................................................................26

8.6

Ensayos Biológicos..........................................................................................................26

8.7

Análisis Bioquímicos.......................................................................................................28

8.8

Análisis De La Dieta........................................................................................................28

IX. RESULTADOS.......................................................................................................................30 9.1

Búsqueda De La Metodología Óptima De Extracción De Compuestos Fenólicos Y

Actividad Antioxidante...............................................................................................................30 4

9.1.1

Evaluación De Concentración De La Mezcla Etanol/H2O.......................................30

9.2

Cuantificación De Los Extractos .....................................................................................38

9.3

Composición De Las Dietas Y Los Extractos .................................................................41

9.4

Ensayos Biológicos..........................................................................................................42

9.4.1

Ensayo De 10 Ml De Extracto / 250 Ml De Volumen Final ....................................42

9.4.2

Ensayo Concentración Constante De 400 Mg / Kg Peso De Raton.........................50

X. CONCLUSIONES ..................................................................................................................57 XI. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................59

III.

INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. COMPOSICIÓN DE DIFERENTES ANTIOXIDANTES PROVENIENTES DE MANZANA. OBTENIDO DESDE MANACH, ET AL 2004.

14

FIGURA 2. PERFILES DE LIPOPROTEÍNAS EN DIFERENTE MODELOS. LAS LIPOPROTEÍNAS FUERON SEPARADAS A PARTIR DEL PLASMA Y FUERON PUESTAS A CORRER 100 UL EN UNA COLUMNA SUPEROSA 6 EN UN FLUJO DE 0,5 ML/MIN EN UN BUFFER QUE CONTENÍA 0,15 M NACL, 0,01 M NA2HPO4 Y 1 MM DE EDTA. CUARENTE FRACCIONES DE 0,5 ML FUERON RECOLECTADAS Y LA CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL FUE CUANTIFICADA ENTRE LAS FRACCIONES 10 – 40. TIPICAMENTE, VLDL ELUYE ENTRE LA FRACCIÓN 15 – 20, LDL EN FRACCIÓN 21 -27 Y HDL EN FRACCIÓN 28 – 34. (A) PERFIL DE LIPOPROTEÍNAS COMPARANDO EL PERFIL “NORMAL” DE LA PERSONA CON UN MODELO C57BL/6J. (B) C57BL/6J Y RATÓN LEP R

DB/DB

. EL PEAK LDL/HDL1

ELUYE EN LA FRACCIÓN 23 – 27. (C) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE RATAS DELGADAS LDLR Y RATAS APOE

–/-

. (D) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE OBESAS LDLR

-/-

Y RATAS APOE

(KENNEDY ET AL., 2010)

-/-

–/-

.

20

FIGURA 3. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES CONDICIONES DE 40% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)

34 5

FIGURA 4. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS EN DISTINTAS CONDICIONES DE 40% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN) 35 FIGURA 5.

RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES

CONDICIONES DE 80% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)

35

FIGURA 6. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS EN

DISTINTAS CONDICIONES DE 80% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE

EXTRACCIÓN) FIGURA 7.

36

CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 80%

ETANOL EN DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO. FIGURA 8.

37

CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 40%

ETANOL EN DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO.

37

FIGURA 9. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN TOTAL DIARIA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).

42

FIGURA 10. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). 43 FIGURA 11. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).

44

FIGURA 12. CONSUMO DE MG DE FENOLES DIARIOS EN CADA UNA DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL

45

FIGURA 13. INGESTA DE FENOLES PROMEDIO DURANTE EL ENSAYO EN LOS DIFERENTES GRUPOS EN ESTUDIO.FUJII ORGÁNICO (FO),

FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO

(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) YGRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP).

45

6

FIGURA 14. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO Y LOS GRUPOS CONTROL. FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). A, B, C, D, E, F, G VALOR P