UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA

“ESTUDIO DE LA MIGRACIÓN DE MELAMINA EN MATERIALES DESTINADOS AL CONTACTO CON ALIMENTOS” PROYECTO FIN DE MÁSTER EN INNOVACIÓN EN SEGURIDAD Y TECNOLOGÍA ALIMENTARIAS

VERÓNICA GARCIA IBARRA

JULIO, 2012

ESTUDIO DE LA MIGRACIÓN DE MELAMINA EN MATERIALES DESTINADOS AL CONTACTO CON ALIMENTOS.

AUTOR: Verónica García Ibarra

DIRECTORES DEL PROYECTO: RAQUEL SENDÓN GARCÍA ANA RODRÍGUEZ BERNALDO DE QUIRÓS PERFECTO PASEIRO LOSADA

JULIO, 2012

II

D. Perfecto Paseiro Losada, catedrático de Universidad del área de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Da Ana Rodríguez Bernaldo de Quirós profesora contratada doctora del área de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Da Raquel Sendón García profesora investigadora del programa Isidro Parga Pondal, del área de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. AUTORIZAN A:

Da Verónica García Ibarra, a la presentación del trabajo titulado Estudio de la migración de melamina en materiales destinados al contacto con alimentos, realizado bajo su supervisión en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela, para optar por el título de Máster en Innovación en Seguridad y Tecnologías Alimentarias. Y para que así conste, firman el presente documento, en Santiago de Compostela A 5 de julio de 2012

Firmado:

Firmado:

Firmado:

Firmado:

Perfecto Paseiro Losada

Ana Rodríguez Bernaldo de Quirós

Raquel Sendón García

Verónica García Ibarra

III

Agradecimientos:

Al Gobierno Ecuatoriano a través de la Secretaria Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación (SENESCYT) por la beca otorgada para realizar mis estudios de Maestría.

Al

Proyecto Ref. No. AGL/2008-04146 "MIGRAMIN" del Ministerio de Ciencia e

Innovación del Gobierno de España por financiar parte de este trabajo.

Quiero expresar mi sincero agradecimiento a los Directores de este trabajo, Dra. Raquel Sendón García, Dra. Ana Rodríguez Bernaldo de Quiros y Dr. Perfecto Paseiro Losada, por brindarme la oportunidad de realizar este trabajo y por compartir sus valiosos conocimientos en el desarrollo del mismo.

Quisiera hacer extensiva mi gratitud a Gonzalo, Cristina y Patricia, por su colaboración en el desarrollo de este trabajo.

A mis padres, por ser mi motivación y fuerza en todos los momentos de mi vida, y por enseñarme que nada es imposible. A mis hermanos por su cariño y apoyo.

A Omar por ser mi apoyo y darme ánimos en todo momento.

A mis amigas de toda la vida gracias por estar a mi lado siempre a pesar de la distancia.

A toda mi familia y en especial a la memoria de mi abuelo, quien siempre estará en mi corazón.

IV

Índice

Índice de figuras ……………………………………………………………………………… VII Índice de tablas…………………………………………………………………………………VIII Resumen…………………………………………………………………………………………IX Abstract………………………………………………………………………………………… X Resumo ………………………………………………………………………………………….XI

1.

INTRODUCCIÓN ...............................................................................................................1

1.1.

La seguridad alimentaria ...................................................................................................2

1.2.

Materiales en contacto con alimentos................................................................................4 1.2.1. Papel y Cartón…………………………………………………………………........... 7 1.2.2. Vidrio ......... ………………………………………………………………………….. 7 1.2.3. Metal (Acero y Aluminio) ......................................................................................... 8 1.2.4. Materiales plásticos ................................................................................................... 8

1.3.

Aspectos legislativos de los materiales plásticos en contacto con alimentos .................... 10 1.3.1. Legislación Europea ................................................................................................ 10 1.3.2 Legislación Americana (FDA) .................................................................................. 13 1.3.4 Legislación Latinoamérica y MERCOSUR .............................................................. 13

1.4.

Interacciones envase-alimento ........................................................................................ 14

1.5.

Migración de materiales en contacto con alimentos ........................................................ 16 1.5.1.Migración en plásticos ............................................................................................... 17

1.6. Artículos en contacto con alimentos de melamina .............................................................. 18 1.7. Compuestos relacionados con la melamina ....................................................................... 19 1.8. Métodos de detección de melamina ................................................................................... 22 2.

ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS ............................................................................ 26

3.

OBJETIVOS……………………………………………………………………………… 32

4.

PARTE EXPERIMENTAL…………………………………………………………………34

4.1. Reactivos............................................................................................................................ 35 4.1.1 Estándares ................................................................................................................... 35 4.2 Muestras Problema ............................................................................................................ 37 V

4.3. Preparación de los estándares ............................................................................................ 39 4.3.1. Melamina (1000 mg/l) ............................................................................................. 39 4.3.2. Amelida y Amelina (500 mg/l) ................................................................................ 39 4.3.3. Solución estándar Mix ............................................................................................. 39 4.4. Identificación y cuantificación de la melamina, amelida y amelina por romatografía líquida de alta resolución………………………………………………………………………… ........... 40 4.5. Fase Móvil para el análisis por HPLC ................................................................................ 41 4.6. Repetibilidad ..................................................................................................................... 42 4.7. Repetibilidad Interdía ........................................................................................................ 42 4.8. Exactitud ........................................................................................................................... 42 4.9. Análisis de los artículos en contacto con alimentos ............................................................ 42 4.9.1. Cálculo de la superficie de las muestras problema ................................................... 42 4.9.2. Preparación de muestras problema ........................................................................... 43 4.9.3. Simulante alimentario .............................................................................................. 43 4.9.4. Ensayos de Migración-Objetos de uso repetido ........................................................ 43 4.10. Cálculo de la concentración de melamina a partir de los parámetros de regresión. ........ 44 5.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………… 46

5.1. Selección de la fase móvil ................................................................................................. 47 5.2. Límites de detección y cuantificación ................................................................................ 49 5.3. Repetibilidad ...................................................................................................................... 49 5.4. Repetibilidad Interdía ........................................................................................................ 50 5.5. Exactitud ........................................................................................................................... 50 5.6. Identificación y cuantificación de melamina, amelida y amelina por cromatografía líquida de alta resolución……………………………………………………………….. ............................. 51 5.7. Migración de melamina y análogos amelida y amelina en artículos en contacto con alimentos……………………………………………………………….. .................................... 51 6.

CONCLUSIONES………………………………………………………………………… 66

7.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 69

VI

Índice de figuras

Figura 1-1. Materiales usados en envases alimentarios . ..............................................................7 Figura 1-2. Interacciones-Entorno-Envase-Alimento ................................................................. 15 Figura 1-3. Formación y estructuras de la melamina y compuestos afines . ................................ 18 Figura 1-4. Estructuras de la melamina y compuestos relacionados ......................................... 21 Figura 1-5. Principios de HILIC. ............................................................................................... 24 Figura 4-1. HPLC Hewlett Packard 1100................................................................................. 41 Figura 4-2. Muestra con simulante ácido acético 3% (p/v)…………………………………… 44 Figura 4-3 Muestras en ensayos de migración durante 2 horas a 70° C……………………….. 44 Figura5-1. Espectro de absorción ultravioleta de la melamina.................................................... 51 Figura5-2.Espectro de absorción ultravioleta de la amelida. ...................................................... 52 Figura5-3. Espectros de absorción ultravioleta de la amelina. .................................................... 52 Figura 5-4. Cromatograma obtenido de una solución estándar de 10 mg/L de concentración de melamina, amelida y amelina. .................................................................................................. 53 Figura 5-5. Recta de calibrado obtenida para la melamina. ....................................................... 54 Figura 5-6. Recta de calibrado obtenida para la amelida. .......................................................... 54 Figura 5-7. Recta de calibrado obtenida para la amelina. .......................................................... 55 Figura 5-8. Primera migración muestra MEL-10. ...................................................................... 59 Figura 5-9. Primera migración muestra MEL-EC-07. ............................................................... 59 Figura 5-10. Resultados de la migración melamina en los artículos en relación con el límite de migración específica (mg/kg). ................................................................................................... 60 Figura 5-11 Resultados de la migración melamina en los artículos en relación con el límite de migración específica (mg/dm2). ................................................................................................. 60 Figura 5-12. Resultados del tercer ensayo de migración de melamina en los artículos en relación con el límite de migración específica (mg/kg), aplicando coeficiente superficie volumen de 6dm2……………… .................................................................................................................. 62 Figura 5-13. Superficie descolorida y/o agrietada de MEL-05A, MEL-07B, MEL-EC-03A, MEL-EC_06B, MEL-03A, y MEL-09B después de tres exposiciones sucesivas al simulante ácido acético al 3%.........................................................................................................................65

VII

Índice de tablas

Tabla 1-1. Materiales plásticos derivados del petróleo tradicionalmente utilizados en la fabricación de envases para alimentos.. .......................................................................................9 Tabla 1-2. Resumen de la legislación aplicable a materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con alimentos. ........................................................................................................ 12 Tabla4-1. Propiedades Físico-químicas de la melamina ............................................................ 35 Tabla4-2. Propiedades Físico-químicas de la amelida ............................................................... 36 Tabla 4-3. Propiedades Físico Químicas de la amelina .............................................................. 36 Tabla4-4 Muestras utilizadas en los ensayos de migración......................................................... 39 Tabla 4-5. Condiciones del método HPLC utilizada para la identificación y cuantificación de las sustancias: melamina, amelida y amelina. .................................................................................. 40 Tabla4-6. Condiciones repetibilidad del método. ...................................................................... 42 Tabla4-7. Condiciones repetibilidad interdía. ............................................................................ 42 Tabla5-1. Fases móviles de prueba. ........................................................................................... 48 Tabla5-2. Desviación estándar relativa y límites de detección y cuantificación de la melamina, amelida y amelina. ................................................................................................................... 50 Tabla5-3. Repetibilidad Interdía ............................................................................................... 50 Tabla5-4. Exactitud del método. ............................................................................................... 51 Tabla 5-5. Parámetros de las rectas de calibración de la melamina, amelida y amelina............... 53 Tabla 5-6. Niveles de melamina en las muestras analizadas por duplicado. ............................... 57 Tabla 5-7. Promedio migración de melamina en mg/kg y mg/dm2, en las muestras analizadas usando como simulante acido acético 3% a 70°C durante 2 horas. ........................................... 58 Tabla 5-8. Resultados migración de melamina en mg/kg aplicando coeficiente superficie volumen 6dm2. .......................................................................................................................... 61

VIII

Resumen Las resinas de melamina son polímeros que constan de

sustancias de partida

(monómeros) de melamina y formaldehido, ampliamente utilizadas en todo el mundo para la producción de utensilios de cocina, debido a su durabilidad, resistencia y bajo costo. Estos artículos pueden liberar melamina especialmente cuando entran en contacto con los alimentos a altas temperaturas. En este trabajo se puso a punto un método para evaluar la migración de melamina y análogos amelida y amelina en muestras de artículos plásticos destinados al contacto con alimentos. Se analizaron 18 muestras de artículos de melamina, adquiridos en diversos puntos de venta de Galicia (España) y en Quito (Ecuador). El análisis de melamina se llevo a cabo utilizando cromatografía líquida de alta resolución con detección UV(HPLC-UV), con una columna HILIC (150 x 3 mm, 3µm de tamaño de partícula), y una fase móvil de Formiato de Amonio 10 mM (ajustado a pH 3 con ácido fórmico)/Acetonitrilo (5:95). El simulante de alimentos utilizado para los ensayos de migración fue ácido acético 3% (p/v). Las condiciones de ensayo utilizadas fueron una exposición repetida al simulante durante 2 horas a 70 °C. La cuantificación de la melamina, amelida y amelina se llevo a cabo utilizando una curva de calibración y se han obtenido en todos los casos coeficientes de determinación mayores de 0,999 y límites de detección adecuados, teniendo en cuenta el límite de migración específica de la melamina. Se detecto migración de melamina en 8 de los 18 artículos analizados; la amelida y amelina no fueron detectadas en ninguna de las muestras. Los niveles de migración de melamina en el tercer ensayo se encuentra en un rango de 0,474-1,88 mg/kg, por lo que ninguna de las muestras supera el límite de migración específica de 2,5 mg/kg establecido en el Reglamento (UE) Nº 1282/2011 de la Comisión de 28 de noviembre de 2011 por el que se modifica y corrige el Reglamento (UE) nº 10/2011 sobre materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con alimentos .

IX

Abstract Melamine resins are polymers and consist of the starting substances (monomers) melamine and formaldehyde widely used in the whole world to the production of kitchen utensils, due to its permanence, resistance and low cost. These articles can release melamine specially when they enter in contact with food at high temperatures.

In this work a method was developed to evaluate the migration of melamine and analogous ammelide and ammeline in samples of plastic articles destined for food contact. Eighteen samples of melamine articles were analyzed, purchased in various retail outlets in Galicia (Spain) and Quito (Ecuador). Melamine analysis was carried out using Highperformance liquid chromatography with UV detection (HPLC-UV), with a HILIC column (150x 3 mm, 3 µm size of particle) and mobile phase consisting of ammonium formate 10 mM (adjusted to pH 3 with formic acid) /acetonitrile (5: 95). The food simulant 3% acetic acid (w/v) was used. The test conditions used were repeated exposing to the simulant for 2 hours at 70 °C. Quantification of melamine, ammeline and ammelide was carried out using a calibration curve and determination coefficients were greater than 0,999 in all cases, and limits of detection were suitable, taking into account the specific migration of melamine.

Melamine migration was detected in 8 of the 18 articles analyzed, and ammeline ammelide was not detected in any sample. Migration levels of melamine in the third test are in a range from 0.474 to 1.88 mg/kg, so that none of the samples exceeds the specific migration limit of 2.5 mg/kg established in the Commission Regulation (EU) No 1282/2011 of 28 November 2011 amending and correcting the Commission Regulation (EU) No 10/2011 on plastic materials and articles intended to come into contact with food.

X

Resumo As resinas de melamina son polímeros que constan de sustancias de partida (monómeros) de melamina e formaldehido, ampliamente empregadas en todo o mundo para a producción de utensilios de cociña, debido a súa durabilidade, resistencia e baixo custo. Estos artigos poden liberar melamina especialmente cando entran en contacto cos alimentos a altas temperaturas. Neste traballo púxose a punto un método para avaliar a migración de melamina e análogos amelida e amelina en mostras de artigos plásticos destinados ao contacto con alimentos. Analizáronse 18 mostras de artigos de melamina, adquiridos en diversos puntos de venta de Galicia (España) e en Quito (Ecuador). O analise de melamina levouse a cabo empregando cromatografía líquida de alta resolución con detección UV(HPLC-UV), cunha columna HILIC (150x 3 mm, 3µm de tamaño de partícula) e unha fase móvil de Formiato de Amonio 10mM (axustado a pH 3 con ácido fórmico/ACN (5:95). O simulante de alimentos empregado para os ensaios da migración foi ácido acético 3% (p/v). As condicións de ensaio utilizados foron unha exposición repetida ao simulante durante 2 horas a 70 ºC. A cuantificación da melamina, amelida e amelina levouse a cabo empregando unha curva de calibración e obtivéronse en todos los casos coeficientes de determinación maiores de 0,999 e límites de detección axeitados, tendo en conta o límite de migración específica da melamina.

Detectouse migración de melamina en 8 dos 18 artigos analizados, a amelida e amelina non foron detectadas en ningunha das mostras. Os niveis de migración de melamina no terceiro ensaio encóntranse nun rango de 0,474-1,88 mg/kg, polo que ningunha das mostras supera o límite de migración específica de 2,5 mg/kg establecido no Reglamento (UE) Nº 1282/2011 da Comisión do 28, de novembro de 2011 polo que se modifica e corrixe o Reglamento (UE) nº 10/2011 sobre materiais e obxectos plásticos destinados a entrar en contacto con alimentos.

XI

1.

INTRODUCCIÓN

Introducción 1.1. La seguridad alimentaria En las últimas décadas, ha crecido la preocupación de la población por la seguridad y toxicidad de los alimentos en general. Los consumidores quieren que se les garantice que los productos alimenticios que adquieren en supermercados, tiendas y demás establecimientos comerciales sean seguros, y que la tecnología utilizada en su elaboración cumpla las normas mínimas de calidad (Sanz, 2001).

De igual forma el comercio internacional de alimentos se está expandiendo con una gran rapidez, en parte como consecuencia de los distintos acuerdos que ha ido adoptando la Organización Mundial de Comercio para impulsar la libre circulación de alimentos. Tanto en la Unión Europea como en los Estados Unidos, la gran distribución minorista realiza la adquisición de un número cada vez más elevado de alimentos en un entorno global. En estas redes de suministro de alimentos, la preocupación por la seguridad alimentaria constituye un componente crucial en las percepciones de confianza y riesgo (Fuentes y Jimeno, 2006).

Para hacer frente, tanto a los peligros o riesgos alimentarios clásicos como a los emergentes, las medidas sanitarias y legislativas de todos los países se orientan en la misma dirección: primero, planteando la seguridad alimentaria de forma global e integrada, esto es, desde la producción primaria hasta el consumidor final y segundo, responsabilizando a los productores, tanto primarios como industriales, de la seguridad de los alimentos que elaboran, lo que les obliga a disponer de sistemas de autocontrol (Sanz, 2001)

El concepto de Seguridad Alimentaria surge en la década de los 70, basado en la producción y disponibilidad alimentaria a nivel global y nacional. En los años 80, se añadió la idea del acceso, tanto económico como físico. Y en la década del 90, se llegó al concepto actual que incorpora la inocuidad y las preferencias culturales, y se reafirma la Seguridad Alimentaria como un derecho humano (PESA, 2009).

Según el Diccionario de la Real Academia de la Lengua, seguridad es la cualidad de seguro, y a su vez define seguro como libre y exento de todo peligro, daño o riesgo. Por lo tanto entendemos como riesgo alimentario a la probabilidad que tienen los consumidores de sufrir algún efecto perjudicial por la ingestión de alimentos. La Seguridad Alimentaria podríamos definirla como el conjunto de medidas adoptadas para mantener la inocuidad,

2

Introducción frescura, pureza, integridad, y genuinidad de los alimentos, para prevenir que lleven contaminantes (bióticos e inertes) y para evitar su difusión de unos alimentos a otros y de ellos a la especie humana. La perdida de una o más de las propiedades citadas lleva a la alteración de los alimentos (Sanz, 2001).

Para la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), “Existe seguridad alimentaria cuando todas las personas tienen en todo momento acceso físico y económico a suficientes alimentos inocuos y nutritivos para satisfacer sus necesidades alimenticias y sus preferencias en cuanto a los alimentos a fin de llevar una vida activa y sana”.

En general el concepto de seguridad alimentaria puede entenderse de muy diferentes maneras según el desarrollo económico de cada país. Así en los países en vías de desarrollo, este concepto está más relacionado con el hambre y la desnutrición, mientras que en los países desarrollados existe más preocupación por el riesgo real o percibido de los contaminantes químicos, peligros microbiológicos y alimentos modificados genéticamente.

Para garantizar la seguridad alimentaria se deben poner en práctica varios procedimientos y mecanismos de control a lo largo de la cadena alimentaria, para asegurar que los alimentos que llegan a la mesa de los consumidores, son aptos para el consumo y que los riesgos de contaminación son mínimos.

Podemos definir contaminación alimentaria como la introducción o la presencia de contaminantes en los alimentos o en la cadena alimentaria que suponen un riesgo para la salud humana. Los contaminantes son, por tanto, “agentes de peligro” presentes en los alimentos que hacen que éstos pierdan su inocuidad. Lógicamente, la contaminación de los alimentos conlleva un riesgo sanitario para las personas que consumen esos alimentos (Reig, 2010).

Los contaminantes de los alimentos pueden pertenecer a dos grandes grupos o categorías: bióticos y abióticos. El término biótico hace referencia a seres vivos y, en el caso de la contaminación de los alimentos, incluye sobre todo a microorganismos (bacterias y virus) y parásitos. Con frecuencia, la contaminación biótica de los alimentos es la principal causa de problemas de salud en relación con el consumo de alimentos, muy por encima de los 3

Introducción trastornos que puede desencadenar la presencia de contaminantes abióticos (Mariné y Vidal, 2000). Con el nombre de contaminantes abióticos se designa a aquellas sustancias químicas que pueden incorporarse accidentalmente en los alimentos y cuya presencia provoca normalmente efectos no deseados en el consumidor. Entre los contaminantes químicos que pueden hallarse en los alimentos se puede mencionar los metales pesados, los plaguicidas, los fármacos de uso veterinario, las toxinas naturales como las micotoxinas, los compuestos procedentes del envasado de los alimentos, hidrocarburos aromáticos, policiclicos, compuestos nitrosados como las nitrosaminas y las dioxinas, compuestos halogenados persistentes como los bifenilos policlorados (PCBS), etc.(Vázquez, 2001). En este contexto la calidad y seguridad de los alimentos depende de los esfuerzos de todos los que participan en la compleja cadena de la producción agrícola, procesamiento, transporte, producción y consumo de los alimentos, por lo que la Seguridad Alimentaria es una responsabilidad compartida y la realidad global de nuestros días exige unificar y coordinar los controles aplicables en los distintos países en materia de seguridad alimentaria, con el fin de garantizar que los consumidores de todo el mundo tengan acceso a alimentos seguros. 1.2. Materiales en contacto con alimentos Los alimentos entran en contacto con los más diversos materiales a lo largo de toda su cadena de producción (elaboración, envasado, conservación, distribución y consumo), lo que incluye todo tipo de utensilios alimentarios (vajilla, cristalería), aparatos, envases y embalajes, así como las envolturas, revestimientos y coberturas. Por tanto, cualquier material u objeto destinado a entrar en contacto directa o indirectamente con alimentos, ha de ser lo suficientemente inerte para evitar que se transfieran sustancias a los alimentos en cantidades lo suficientemente grandes para poner en peligro la salud humana o para ocasionar una modificación inaceptable de la composición de los productos alimenticios o una alteración de las características organolépticas de éstos (Reglamento Nº 1935/2004). Es requisito indispensable que todos los objetos destinados a entrar en contacto con los alimentos, incluidas las vajillas, estén fabricados con materiales fáciles de limpiar y desinfectar, además de ser resistentes a la corrosión u otro tipo de alteración que pueda poner en peligro su seguridad.

4

Introducción Son algunos los materiales que a lo largo de la historia se han utilizado para elaborar vajillas. Sin embargo, no siempre han sido los más adecuados, a pesar de que el material de la vajilla determina su calidad, resistencia y grado de riesgo alimentario. Las vajillas de polímeros sintéticos, como el policarbonato, un tipo de plástico rígido y transparente que se emplea también en botellas retornables de bebidas, en biberones y recipientes, son ligeras, irrompibles y aptas para lavavajillas y microondas, aunque no soportan el calor intenso. La melamina también es un material utilizado para la fabricación de vajillas, aunque a menudo, no son aptas para el microondas. La melamina es un producto químico utilizado en diversos procesos industriales, en particular para fabricar plásticos que se emplean en vajillas y utensilios de cocina, así como en revestimientos de latas y en la fabricación de papel y adhesivos. Durante el proceso de preparación y cocción, los alimentos entran en contacto con una variedad de utensilios de cocina, pero en la comercialización de los alimentos, el envase cobra un papel fundamental ya que este se convierte en la principal barrera entre el medio ambiente y el producto. Los alimentos son elementos perecederos, por lo tanto existen numerosos factores que alteran su calidad. Por esa razón, el envase cumple funciones muy importantes, ya que previene el deterioro del alimento y extiende su tiempo de vida media. La tendencia actual de la industria del envase es que los beneficios de los avances tecnológicos alcanzados, repercutan directamente en la conservación y preservación del alimento durante su almacenaje y distribución, como así también, en el cuidado y protección del consumidor. Esto implica además, poder impartir a los envases funciones específicas de aplicación que mejoren las propiedades de los mismos en relación a la conservación del alimento (Costamagna, 2009). Según la Unión Europea un envase alimentario es todo producto fabricado de cualquier naturaleza que se utilice para contener, proteger, manipular, distribuir y presentar mercancías, desde materias primas hasta artículos acabados, que pasan desde el usuario hasta el consumidor (López, 1999). Los envases constituyen por tanto un elemento fundamental en la comercialización de los alimentos y para que un determinado envase sea considerado aceptable deberá cumplir

5

Introducción unas determinadas especificaciones que justifiquen una utilización racional y adecuada del mismo (Represas, 1998): a) Protección del alimento frente a agentes externos b) Que el alimento no interaccione con el envase c) Resistencia física, química, y microbiológica d) Alta resistencia térmica bien a temperaturas altas en su esterilización y a bajas en productos

congelados o refrigerados.

e) Cierres seguros que garanticen su hermeticidad f) Dimensiones estrictamente necesarias g) Adecuación de las necesidades del consumidor h) Adaptación a las líneas de envasado i) Disponibilidad en el mercado j) Cumplimiento de las disposiciones legales k) Rentabilidad l) Adjuntar toda la información requerida para el tipo de material/alimento que recubren m) Diseño orientado a sus posibles “efectos medioambientales”, pudiendo llevar un símbolo especifico. La naturaleza de los materiales que se pueden utilizar en los diferentes niveles de envase alimentario es muy diversa: naturales, mínimamente procesados, totalmente sintéticos, puros, mezclas, etc. De conformidad con el Reglamento (CE) Nº 1935/2004, de 27 de octubre de 2004, del Parlamento Europeo y del Consejo, los materiales y objetos destinados a estar en contacto con productos alimenticios pueden ser: 1. Materiales y objetos activos

8. Metales y aleaciones

e inteligentes

9. Papel y cartón

2. Adhesivos

10. Plásticos

3. Cerámica

11. Tintas de imprenta

4. Corcho

12. Celulosa regenerada

5. Caucho

13. Siliconas

6. Vidrio

14. Productos textiles

7. Resinas

de

intercambio

15. Barnices y revestimientos

iónico

16. Ceras

6

Introducción

Figura 1-1. Materiales usados en envases alimentarios (López, 2008).

1.2.1. Papel y Cartón Son materiales a base de celulosa, procedentes de la madera. Son reciclados o biodegradables durante compostaje en el ambiente. Se trata de materiales ligeros, fácilmente imprimibles, permeables a los gases y al vapor de agua. Tienen una baja resistencia al rasgado, así como una gran adaptabilidad para ser utilizados en combinación con otros materiales empleados en la industria del envase: plásticos, metales, etc. Con estos materiales se hacen bolsas y cajas para diferentes aplicaciones en los alimentos (Kaczmarek, 2003). 1.2.2. Vidrio El vidrio posee importantes cualidades para el envasado, como son impermeabilidad al paso de los gases, inercia química, gran resistencia a la presión interna y a las altas temperaturas sin perder sus propiedades, así también los envases de vidrio no se deforman en líneas de llenado. Su degradación química y su erosión física son muy lentas, no liberando sustancia alguna que pueda resultar perjudicial para el entorno. Principalmente se utiliza para la producción de botellas y tarros, que pueden ser pasteurizados a altas temperaturas (Proexport, 2003).

7

Introducción 1.2.3. Metal (Acero y Aluminio) Las principales propiedades de los materiales metálicos como materia prima para la fabricación de envases y embalajes son la resistencia mecánica, ligereza, hermeticidad, opacidad a luz y radiaciones, conductividad térmica, versatilidad etc. (Proexport, 2003). Se emplea principalmente para la fabricación de latas, ya que el alimento contenido puede ser pasteurizado o esterilizado en su interior. 1.2.4. Materiales plásticos Los materiales plásticos son compuestos macromoleculares orgánicos, obtenidos por policondensación, poliadicción, polimerización o algún proceso similar, a partir de moléculas de peso molecular inferior, o por modificación química de macromoléculas naturales. Además de los monómeros de partida se adicionan también otros compuestos de bajo peso molecular, a modo de coadyuvantes o modificadores de las características del producto final, denominados aditivos; se incluyen las siliconas pero se excluyen las celulosas y sus derivados, papeles cartones, ceras y resinas de intercambio iónico (Represas, 1998). Los plásticos ocupan un lugar destacado en el desarrollo de sectores como el de los envases, embalajes, utensilios y vajilla de cocina, la construcción, la medicina, la agricultura, etc, en general, forman parte de nuestra vida diaria. El plástico termoestable melamina formaldehido es duro y buen aislante del calor y la electricidad, se emplea en recubrimientos de madera, como los empleados en mobiliario de cocina, también se emplea para fabricar algunos utensilios de cocina como tazas y ensaladeras, y utensilios como tiradores, etc. En la industria alimenticia, el plástico es de suma importancia para la fabricación de envases. En algunos envases estos plásticos son fácilmente reconocibles, bajo la forma de envases rígidos, flexibles o finos films de polietileno (PE), polipropileno (PP), polietilentereftalato (PET), policloruro de vinilo (PVC), poliamidas (PA) etc. Los encontramos en pequeños envases lechosos o transparentes para yogures, quesos, mantequillas, bandejas con distintos productos recubiertos por finos films; bolsas para ultracongelados, legumbres secas, pastas, etc, botellas para aguas, bebidas refrescantes y gaseadas, etc. (Paseiro, 1995).

8

Introducción Material

Abreviatura

Aplicaciones

Polietileno de alta densidad

PEAD

Botellas

Polietileno de baja densidad

PEBD

Películas, bolsas

Poli (etilentereftalato)

PET

Botellas

Poliestireno

PS

Bandejas, tarrinas

Polipropileno

PP

Películas flexibles

Poli( cloruro de vinilo)

PVC

Películas flexibles

Tabla 1-1. Materiales plásticos derivados del petróleo tradicionalmente utilizados en la fabricación de envases para alimentos (Arrieta y col, 2011). Estos polímeros pueden obtenerse fundamentalmente (Represas, 1998): 1. Por modificación de productos naturales, inicialmente fue la única vía de obtención. A mediados del siglo XIX se llevo a cabo la modificación de la celulosa y el caucho obteniéndose la goma, la fibra vulcanizada y el celuloide. Las propiedades de estos nuevos materiales mejoraban en muchos aspectos a sus predecesores. 2. Por vía sintética, se obtienen los polímeros partiendo de materias primas derivadas del petróleo, gas natural, carbón y otros productos que contengan N, Cl, S, F. Las principales vías son: la policondensación y polimerización recurriéndose en ocasiones, simultáneamente o sucesivamente a dos de ellas:

a) Polimerización: reacción química entre monómeros idénticos o diferentes por rotura de algún enlace múltiple, formándose cadenas de eslabones sin desprendimiento de producto secundario alguno. Se mantienen la disposición atómica y la composición porcentual, aumentando en peso molecular. b) Policondensación: reacción química entre muchos monómeros dispares formándose polímeros y lateralmente pequeñas moléculas que se segregan de la reacción. Variando tanto el ordenamiento de los átomos como la composición elemental porcentual. c) Poliadición: acoplamiento de distintos componentes a consecuencia del desplazamiento o transposición de átomos de Hidrogeno obteniéndose poliaductos (poliuretanos). Los monómeros iniciales han de estar por lo menos

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Introducción bifuncionales. No se generan productos secundarios. La migración atómica altera su ordenamiento, permaneciendo invariable la composición elemental porcentual.

La polimerización es el procedimiento más utilizado en la síntesis de los plásticos y puede ocurrir por distintas vías: en masa, en emulsión, en suspensión, en disolución o por precipitación.

1.3. Aspectos legislativos de los materiales plásticos en contacto con alimentos Cuando un material u objeto entra en contacto con el alimento, existe la posibilidad de que se transfieran constituyentes procedentes del mismo a los alimentos en cantidades inaceptables que pongan en peligro la salud humana. En este sentido existen legislaciones especificas de materiales en contacto con alimentos, cuyo principal objetivo es garantizar un alto nivel de protección de la salud de los consumidores. 1.3.1. Legislación Europea El Reglamento Nº 1935/2004, de 27 de octubre de 2004, del Parlamento Europeo y del Consejo, sobre los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con alimentos y por el que se derogan las Directivas 80/590/CEE y 89/109/CEE, constituye el marco normativo actual aplicable a todos los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con alimentos El artículo 3 del mencionado reglamento establece los requisitos generales que deben cumplir estos materiales y objetos, de manera que habrán de estar fabricados de conformidad con las buenas prácticas de fabricación para que, en las condiciones normales o previsibles de empleo, no transfieran sus componentes a los alimentos en cantidades que puedan representar un peligro para la salud humana, provocar una modificación inaceptable de la composición de los alimentos o provocar una alteración de las características organolépticas de éstos. Los grupos de materiales en contacto con alimentos que disponen de legislación específica

son los plásticos, cerámicas, celulosa regenerada y materiales activos e

inteligentes. Los materiales plásticos poseen un reglamento específico, en el que se establece la lista positiva de monómeros, otras sustancias de partida, macromoléculas obtenidas por fermentación microbiana, aditivos y auxiliares que pueden ser usados para la fabricación de 10

Introducción polímeros, además se establece límites máximos de migración de estos compuestos a los alimentos. Para verificar si los materiales destinados a entrar en contacto con alimentos cumplen con la legislación vigente, se realizan ensayos de migración bajo condiciones estrictamente controladas. Los ensayos de migración se llevan a cabo mediante una simulación de las condiciones reales de contacto entre el alimento y el objeto o envase. Para ellos se emplean diferentes simulantes de alimentos atendiendo a su naturaleza (neutros, ácidos, alcohólicos o grasos) y se somete a las condiciones de procesado y almacenamiento previstas (Síntesis de la Legislación de la Unión Europea, 2006). En la siguiente tabla se resume la legislación referente a los materiales plásticos en contacto con alimentos. DIRECTIVAS

ESPECIFICACIÓN REGLAMENTO MARCO Reglamento 1935/2004 de 27 de octubre de 2004 Sobre los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con alimentos y por el que se derogan las Directivas 80/590/CEE y 89/109/CEE DIRECTIVAS ESPECIFICAS Directiva 82/711/CEE del Consejo de 18 de Establece las normas de base necesarias para la verificación de la migración de los constituyentes octubre de 1982. de los materiales y objetos de materia plástica destinados a entrar en contacto con productos alimenticios Directiva 85/572/CEE del Consejo, de 19 de Por la que se determina la lista de los simulantes que se deben utilizar para controlar la migración diciembre de 1985 de los componentes de los materiales y objetos de material plástico destinados a entrar en contacto con los productos alimenticios. Directiva 93/8/CEE de la Comisión de 15 de Por la que se modifica la Directiva 82/711/CEE marzo de 1993 del Consejo que establece las normas de base necesarias para la verificación de la migración de los componentes de los materiales y objetos de materia plástica destinados a entrar en contacto con productos alimenticios Directiva 97/48/CE de la Comisión de 29 de julio Se modifica por segunda vez la Directiva de 1997 82/711/CEE del Consejo que establece las normas de base necesarias para la verificación de la migración de los componentes de los materiales y objetos de materia plástica destinados a entrar en contacto con productos alimenticios Directiva 2002/72/CE de la Comisión de 6 de Relativa a los materiales y objetos plásticos agosto de 2002 destinados a entrar en contacto con productos alimenticios.

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Introducción Directiva 2004/19/CE de la Comisión, de 1 de Se modifica la Directiva 2002/72/CE relativa a los materiales y objetos plásticos destinados a marzo de 2004 entrar en contacto con productos alimenticios Directiva 2005/79/CE de la Comisión, de 18 de Se modifica la Directiva 2002/72/CE relativa a noviembre de 2005 los materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios Directiva 2007/19/CE de la Comisión de 30 de Se modifican la Directiva 2002/72/CE relativa a marzo de 2007 los materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios y la Directiva 85/572/CEE del Consejo por la que se determina la lista de los simulantes que se deben utilizar para controlar la migración de los componentes de los materiales y objetos de material plástico destinados a entrar en contacto con los productos alimenticios Directiva 2008/39/CE de la Comisión de 6 de Se modifica la Directiva 2002/72/CE relativa a marzo de 2008 los materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. Reglamento (CE) 282/2008, de la Comisión de Sobre los materiales y objetos de plástico 27 de Marzo de 2008 reciclado destinados a entrar en contacto con alimentos y por el que se modifica el Reglamento (CE) no 2023/2006. Reglamento 975/2009 de la Comisión de 19 de Se modifica la Directiva 2002/72/CE relativa a octubre de 2009 los materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios Reglamento (UE) 10/2011 de la Comisión de 14 de enero de 2011 Reglamento (UE) 284/2011 de la Comisión de 22 de marzo de 2011

Reglamento (UE) noviembre de 2011

1282/2011

Sobre materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con alimentos Por el que se establecen condiciones específicas y procedimientos detallados para la importación de artículos plásticos de poliamida y melamina para la cocina originarios o procedentes de la República Popular China y de la Región Administrativa Especial de Hong-Kong, China. de 28 de Por el que se modifica y corrige el Reglamento (UE) n o 10/2011 sobre materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con alimentos.

Tabla 1-2. Resumen de la legislación aplicable a materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con alimentos.

Es necesario señalar que en la tabla 1-2 se incluye legislación derogada por el Reglamento (UE) 10/2011 (Directivas 2002/72/CE, 80/766/CEE, 81/432/CEE). Esto es debido a que el propio Reglamento (UE) 10/2011 contempla que hasta el 31 de diciembre de 2012 se pueden realizar los ensayos de verificación del cumplimiento de un material siguiendo las normas que ahí se recogen.

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Introducción 1.3.2 Legislación Americana (FDA) Los materiales en contacto con alimentos en Estados Unidos de Norteamérica, están sujetos a las regulaciones de control del Code of Federal Regulations de la Food and Drug Administration (FDA). Las regulaciones de aditivos alimentarios están en la forma de listas positivas publicadas en el Título 21 de la U.S. Code of Federal Regulations (CFR). Los diversos materiales en contacto con alimentos son tratados como aditivos indirectos. Hay que recalcar que los límites de migración total y específica no son los mismos que en las legislaciones de otros países (Etienne, 2005). 1.3.4 Legislación Latinoamérica y MERCOSUR Desde 1991 se establece la Comisión de Envases y Equipamiento en contacto con alimentos, del Sub-Grupo Técnico III del MERCOSUR (integrado por Argentina, Brasil, Paraguay y Uruguay a partir del Tratado de Asunción). Desde sus inicios se ha llevado a cabo un significativo esfuerzo para armonizar las legislaciones nacionales de los cuatro estados parte a fin de eliminar restricciones técnicas (Etienne ,2005). En el marco del MERCOSUR, los envases y otros elementos que pudieran estar en contacto con alimentos deben fabricarse con materiales adecuados y de acuerdo con las buenas prácticas de manufactura, para que en condiciones previsibles de uso, no transfieran componentes indeseables, tóxicos o contaminantes en cantidades tales que superen los límites máximos establecidos de migración global o específica y representen un riesgo para la salud o alteren las características organolépticas de los alimentos (Mercosur, 2011). En América Latina los requisitos sanitarios sobre envases y materiales en contacto con alimentos están incluidos en legislaciones oficiales y en normas voluntarias u obligatorias, lo que demuestra interés por el cuidado de la salud pública y de la calidad de los alimentos. La situación legislativa y normativa en diferentes países de la región es diversa, de acuerdo con las realidades de cada uno de ellos. Las Resoluciones de la región de MERCOSUR parecen ser las más avanzadas comparativamente con otras legislaciones en Latinoamérica. Algunos países como Colombia, Perú y Venezuela están trabajando para aproximar sus legislaciones y normas a las del

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Introducción MERCOSUR, la Unión Europea y/o Estados Unidos-FDA, o aprueban envases alimentarios que cumplen con estas legislaciones (Wolff, 2011). En el caso de Ecuador, el Ministerio de Salud Pública en su calidad de Autoridad Sanitaria Nacional es el organismo encargado de controlar la calidad e inocuidad de los alimentos. En este contexto la Ley Orgánica de Salud de 22 de Diciembre de 2006, en su artículo 146, literal f, establece que en materia de alimentos se prohíbe "La utilización de envases que no cumplan con las especificaciones técnicas aprobadas para el efecto". De igual manera al momento el Instituto Ecuatoriano de Normalización (INEN), como organismo oficial de la República del Ecuador para la normalización, la certificación y la metrología, se encuentra en proceso de elaboración de las normas referentes a materiales en contacto con alimentos y se espera la oficialización de las mismas para este año. 1.4. Interacciones envase-alimento El alimento, desde un punto de vista químico, es un producto complejo formado por otros compuestos químicos más sencillos, que pueden reaccionar entre sí, modificando la composición y características del producto. A su vez, el alimento, a través del envase, está expuesto a la acción de factores externos físicos, químicos y microbiológicos

que

contribuyen, de igual forma, a la alteración del mismo.

Por lo tanto, el producto envasado, debe considerarse como un sistema ternario entorno-envase-alimento, en el que se producen interacciones beneficiosas y perjudiciales. Las interacciones entorno-envase-alimento corresponden a tres fenómenos: permeación, sorción y migración (López, 2008). Estas interacciones se pueden producir no solo con los alimentos envasados sino también con cualquier material que esté destinado a entrar en contacto con los alimentos; un ejemplo serían los utensilios de cocina de melamina. A) Permeación La permeación es un fenómeno físico-químico por el que tiene lugar una transferencia de materia y energía a través del material que constituye el envase o el material que está en contacto con el alimento. Este fenómeno, que se produce con gases, humedad y aromas,

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Introducción puede darse en ambas direcciones. Un ejemplo de permeación sería el paso del oxígeno o humedad del entorno al alimento, provocando reacciones de oxidación como enranciamiento de las grasas, pardeamiento enzimáticos o degradación de vitaminas (Riquet y col, 1998). B) Sorción La sorción consiste en la transferencia de sustancias desde el entorno o el alimento al seno del material, donde quedan retenidas. Engloba dos fenómenos de diferente naturaleza: adsorción, que tiene lugar en la superficie, y absorción, que ocurre en el seno de la matriz del envase o material. La sorción es un fenómeno a tener en cuenta, especialmente, cuando se transfieren grasas, aromas o humedad desde el alimento al envase. Aunque la mayoría de las veces no se altera la composición del alimento, las propiedades del envase pueden modificarse gravemente (López, 2008). C) Migración La migración se define como la transferencia de materia desde el material al alimento durante su almacenamiento o preparación (Briston y Katan, 1974). La incorporación de las sustancias migrantes al producto puede incidir en su calidad y seguridad, al alterarse sus propiedades organolépticas, y en su seguridad en el caso de que los compuestos que migran tienen carácter tóxico. Del mismo modo, la pérdida de componentes del material en contacto con alimentos puede afectar a su estabilidad.

Figura 1-2. Interacciones-Entorno-Envase-Alimento (López 2008).

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Introducción 1.5. Migración de materiales en contacto con alimentos Cuando hablamos de seguridad de un alimento no siempre se tiene en cuenta que el material elegido, más allá de sus propiedades mecánicas, interacciona desde el punto de vista fisicoquímico con el alimento.

Los materiales que entran en contacto con los alimentos son esenciales en todo el proceso de elaboración de un producto, desde la obtención hasta el transporte y el almacenamiento. Todo buen material debe no sólo evitar que el alimento se deteriore, sino que debe evitar que se produzcan migraciones de cualquiera de las sustancias que forman parte de él al alimento.

La interacción entre el envase y el alimento depende del material de envase. Así, en los materiales metálicos se caracteriza por fenómenos de corrosión, y disolución de los iones metálicos en el alimento, mientras que en los materiales cerámicos y vidrio se define como un proceso de disolución química o lixiviación que también produce la incorporación de elementos del material en el alimento. Con relación a los materiales poliméricos (plásticos y derivados celulósicos), la interacción se hace mediante la transferencia de masa a través de la matriz polimérica, produciendo la incorporación de los componentes, aditivos y residuos en los alimentos (Sanchés, 2004). De las interacciones que tienen lugar en el sistema alimento/material/entorno, la migración de residuos y aditivos del material en contacto con alimentos es la que afecta más a la calidad y seguridad de los productos alimenticios. La migración puede ocurrir del material de contacto al alimento y viceversa. El último caso es también conocido como migración negativa, mientras que el primero se identifica simplemente como migración (Baner y col, 1991). La migración se define como la transferencia de masa de una fuente externa al producto envasado por un proceso submicroscópico, lo que origina alteración de las características físico-químicas y mecánicas del material de envase, por pérdida de componentes del mismo, y cambios en la composición del producto, lo que puede modificar su calidad y aceptación comercial.

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Introducción Legalmente se distinguen migración global y migración específica. La primera se refiere a la cantidad máxima permitida de sustancias no volátiles liberada desde un material u objeto en simulantes alimentarios, mientras que el término migración específica indica la cantidad máxima permitida de una sustancia dada liberada desde un material u objeto en alimentos o en simulantes alimentarios (Reglamento (UE) 10/2011). En la Unión Europea, existe legislación de obligado cumplimiento, que define los límites máximos de migración global y migración específica, para materiales plásticos en contacto con alimentos. 1.5.1.

Migración en plásticos

Los plásticos son materiales con propiedades visco-elásticas, formados por una mezcla de polímeros con otras sustancias. Los polímeros base son moléculas de elevado peso molecular, inertes y de solubilidad limitada, por lo que tienen también una migración limitada. Sin embargo, son los compuestos de bajo peso molecular que se encuentran en la matriz polimérica los que presentan mayor probabilidad de migrar. Estos incluyen: residuos (monómeros, oligómeros, disolventes) y coadyuvantes de la polimerización (catalizadores, aceleradores, inhibidores), aditivos, compuestos resultantes de la degradación del polímero y/o aditivos y sustancias adyacentes al material (adhesivos, barnices y tintas de impresión). El estudio de los mecanismos básicos de migración en materiales poliméricos consta de tres etapas diferenciadas, aunque relacionadas entre sí (López, 2008). 1. Difusión de los migrantes desde el interior del material en contacto con alimentos hasta la interfase. Proceso gobernado por la primera y segunda ley de Fick. 2. Transferencia de materia en la interfase entre el material y el alimento. Tiene lugar mediante un mecanismo de disolución o solvatación de los migrantes en el alimento. Se producirá una mayor transferencia de materia cuanto mayor sea el coeficiente de reparto de la sustancia que migra en el alimento. 3. Dispersión de los migrantes en el seno del alimento. Proceso gobernado por la primera y segunda ley de Fick. Dado que los coeficientes de difusión en los alimentos son, por lo general, mayores que en los polímeros, esta etapa no interviene a efectos prácticos ni en el equilibrio, ni en la cinética de la migración. 17

Introducción 1.6. Artículos en contacto con alimentos de melamina La melamina es un compuesto orgánico que se combina a menudo con formaldehido para producir resina de melamina, un polímero sintético resistente al calor. Admite bien toda clase de coloraciones y es de gran resistencia química, excepto a los ácidos. El plástico termoestable "melamina" se utiliza para la fabricación de una diversidad de artículos en contacto con alimentos de uso repetido. Son artículos económicos y ampliamente utilizados en todo el mundo debido a su durabilidad, buena estabilidad química y resistencia al calor. Son muy utilizados especialmente por los niños en forma de tazas, platos y otros utensilios de cocina con atractivas decoraciones (Lund y col, 2006). En general el uso de utensilios de melamina es seguro para servir los alimentos siempre y cuando se utilice para los fines especificados por el fabricante. La mayoría de los fabricantes señalan una temperatura de 30 oC a 120 oC, mientras que algunos especifican una temperatura de hasta 140 oC. Los artículos de melamina, aunque no son inflamables, pueden descomponerse por el calor extremo; así, una

temperatura sobre los

300 oC, no es

conveniente (Chik y col, 2011). La melamina puede ser hidrolizada a amelina, amelida, y ácido cianúrico. Además, estos derivados son subproductos formados durante la síntesis de melamina.

Figura 1-3. Formación y estructuras de la melamina y compuestos afines (Tyan y col, 2009).

La melamina se puede encontrar como un contaminante en los alimentos, y una de las causas puede ser la migración de esta sustancia desde los materiales en contacto con

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Introducción alimentos. La migración de sustancias de la vajilla a los productos alimenticios está influenciada por muchos factores incluyendo el material de la vajilla, el tipo (acuoso, ácido, alcohólico o graso) y la naturaleza (sólida o líquida) del alimento, la temperatura, la duración y el área de contacto. Es así que Lund y col, (2006) y Takiko y col, (1990) demostraron que factores como la temperatura, la acidez y el uso repetido de los plásticos de melamina, afectan los niveles de migración de melamina. En una reciente evaluación de riesgo realizada por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria ( EFSA), se encontró que

los artículos hechos de

plástico melamina-

formaldehido (conocidos coloquialmente como 'melaware') son la fuente más importante de exposición a la melamina a partir de materiales en contacto con alimentos (Bradley y col, 2010). En la Unión Europea la melamina está aprobada como un monómero y como un aditivo en plásticos con un límite de migración específica de 2,5 mg/kg. (Reglamento (UE) 1282/2011). La melamina aumentó su notoriedad después de los episodios de adulteración de alimentos para mascota con melamina en 2007 y la adulteración de leche infantil y otros productos lácteos en 2008, como fue descrito por la Organización Mundial de la Salud y la Autoridad Europea de Seguridad alimentaria (EFSA) (Bradley y col, 2010). El uso ilegal de melamina como aditivo alimenticio se basa en incrementar el aparente contenido proteico, debido al aporte de nitrógeno. En estas determinaciones, la adición de melamina puede hacer suponer que el contenido en proteína es superior al real. Pero el problema grave, incluso mortal, deriva de la hidrólisis de la melamina a urea y derivados ciánicos, muy nefrotóxicos. 1.7. Compuestos relacionados con la melamina La melamina (Nº CAS: 108-78-1) es un compuesto orgánico que responde a la fórmula química C3H6N6, y cuyo nombre IUPAC es 2,4,6-triamino-1,3,5-triazina. La molécula de melamina fue sintetizada por primera vez en el año 1834 por el químico alemán Liebig mediante el calentamiento de

tiocianato de potasio con el cloruro de amonio.

Posteriormente fue obtenido de varios modos por el calentamiento de carbonato de guanidina, tiourea, cianamida, o dicianodiamida (Tyan y col, 2009). 19

Introducción La melamina se produce en grandes cantidades (1,2 millones de toneladas en 2007) principalmente para su uso en la síntesis de resina de melamina-formaldehido, que se utiliza en la fabricación de laminados, plásticos, revestimientos, filtros comerciales, pegamentos o adhesivos, vajilla y utensilios de cocina. Los análogos estructurales de la melamina (ácido cianúrico, amelina o amelida) pueden ser impurezas del proceso de fabricación de la melamina y, también, productos del metabolismo bacteriano de la melamina cuando ésta no es completamente metabolizada a amoníaco y dióxido de carbono (OMS, 2008). La melamina puede formar complejos autoasociados de elevado peso molecular a través de redes intramoleculares de enlaces por puentes de hidrógeno e interacciones de apilamiento del anillo aromático π-π con el ácido cianúrico y otros análogos estructurales, y también con el ácido úrico y otras biomoléculas cíclicas que contienen un grupo imida. Aparentemente, la melamina agregada a la leche adulterada, al menos en el caso de algunas preparaciones para lactantes elaboradas en China y que causaron enfermedad renal durante el incidente de 2008, era relativamente pura.

Según informes, la preparación para lactantes china contenía concentraciones de ácido cianúrico, amelina y amelida que constituían sólo el 0,1% de las de melamina, mucho menores que las detectadas en el gluten de trigo y los concentrados de proteína de arroz contaminados utilizados como ingredientes para la producción de alimento para mascotas y responsables del incidente de 2007 en los EEUU, Canadá y Sudáfrica (OMS, 2008). Para determinar la toxicidad de la melamina se han realizado investigaciones en animales monogástricos, en los cuales se ha encontrado que la melamina se absorbe rápidamente y se excreta sin metabolizar por la orina. La melamina es especialmente tóxica para el aparato urinario de los humanos y los animales. Un efecto regularmente observado en animales experimentales expuestos a melamina es la formación de cálculos vesicales, y en algunos estudios se ha observado microcristaluria. Se considera que los efectos carcinogénicos de la melamina son secundarios a la irritación causada por los cálculos. Hay muy pocos datos sobre los compuestos relacionados con la melamina, fuera del ácido cianúrico (OMS, 2008).

El ácido cianúrico (Nº CAS 108-80-5) es un análogo de la melamina y puede ser producido como un subproducto de la síntesis de melamina. Se puede encontrar en el agua 20

Introducción potable y en el agua de piscinas como producto de la disociación de dicloroisocianuratos usados para la desinfección del agua. Cuando es usado para desinfección en el agua, el dicloroisocianurato de sodio es rápidamente hidrolizado para formar cloro y cianurito.

Los derivados del ácido cianúrico se encuentran regulados en los EE.UU. como componentes de soluciones desinfectantes para su uso en equipos de procesamiento de alimentos, utensilios y otros artículos en contacto con alimentos (WHO, 2008).

La amelida (Nº CAS 645-93-2) y amelina (CAS No. 645-92-1) son producidas como subproductos de la síntesis de melamina o por la degradación microbiana de melamina. La amelina es utilizada en grasas lubricantes. No se ha reportado información sobre los usos de amelida (WHO, 2008).

La tricloromelamina (Nº CAS 7673-09-8), se descompone en melamina, y está regulada en los Estados Unidos y otros países para su uso en soluciones desinfectantes utilizadas en equipos de procesamiento de alimentos, utensilios y otros artículos en contacto con alimentos, con la excepción de recipientes o equipos para leche. Además, en los Estados Unidos se permite el uso de tricloromelamina como desinfectante sobre superficies duras y como un componente de una solución de lavado para frutas y hortalizas (WHO, 2008). La melamina es un metabolito del plaguicida ciromazina (CAS No. 66215-27-8). Sin embargo, se sabe que la ciromazina en la superficie de frutas y verduras se convierte con el tiempo en melamina.

Figura 1-4. Estructuras de la melamina y compuestos relacionados (WHO, 2008).

21

Introducción 1.8. Métodos de detección de melamina Se han desarrollado varios métodos para el análisis de melamina y compuestos análogos. Estos incluyen la cromatografía de intercambio catiónico con detección de diodos, cromatografía líquida con detector UV, cromatografía líquida- espectrometría de masas (LCMS) y cromatografía de gases- espectrometría de masas (GC-MS). También han sido evaluadas otras técnicas como la

espectroscopia SERS (Surface-enhanced Raman

spectroscopy), inmunoensayo enzimático (EIA), ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) y dilución isotópica. Para los métodos de cromatografía de gases- espectrometría de masas (GC-MS) y Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) combinada con detectores UV o MS, los límites de detección (LOD) y rangos para las curvas de calibración son 0.1-0.01 ppm y 0.01-5 ppm, respectivamente (Tyan y col, 2009). La cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) y la cromatografía de gases con espectrometría de masas en tándem (GC-MS/MS) son las técnicas preferidas para los análisis confirmatorios de la presencia de melamina y compuestos relacionados, por su extremada especificidad y sensibilidad (WHO, 2008). En Estados Unidos, la FDA

ha publicado como métodos para el análisis de

melamina, la cromatografía liquida de alta resolución con detección UV (HPLC-UV), cromatografía de gases- espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía de gases con espectrometría de masas en tándem (GC-MS/MS) y cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) (Tyan y col, 2009). La melamina al ser una molécula muy polar, es una buena candidata para la cromatografía en fase acuosa normal, la misma que se ha desarrollado mucho en los últimos años. En la cromatografía en fase acuosa normal, un analito polar hidrófilo se reparte entre una fase estacionaria relativamente polar y una fase móvil relativamente no polar. El orden de elución de solutos en la cromatografía en fase acuosa normal se asemeja al de la cromatografía líquida de interacción hidrofilica, o HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography), y de hecho en la actualidad se sugiere que la diferencia entre cromatografía en fase acuosa normal y cromatografía de interacción hidrofílica o HILIC son

22

Introducción los mecanismos de retención que tienen lugar, de adsorción en superficie y de partición respectivamente (Hemström y col, 2006). HILIC es una técnica diseñada para la retención y la separación de compuestos polares. La retención HILIC es causada por partición (no por adsorción superficial como en la cromatografía líquida en fase normal (NPLC) o en fase reversa) de los analitos inyectados entre la fase móvil y una capa enriquecida por agua en la fase estacionaria hidrofílica HILIC. La superficie de las columnas de sílice comúnmente utilizadas en HILIC se desactivan por la presencia de cantidades significativas de agua en la fase móvil en comparación con la cromatografía en fase normal. Como resultado, se obtienen menos problemas en la forma del pico para solutos fuertemente polares en comparación con las separaciones en fase normal (Bernal y col, 2011). Las separaciones HILIC son muy fáciles de combinar con varias técnicas de detección tales como absorción de luz ultravioleta (UV), fluorescencia (FL), índice de refracción (RI), detección ELSD (evaporative light scattering), detección CAD (charged aerosol) y la espectrometría de masas (MS). La

Cromatografía

de

interacción

hidrofílica

es

una

técnica

que

utiliza una fase estacionaria polar (por ejemplo, sílice) en conjunto con una fase móvil que contiene una cantidad apreciable de agua (al menos 2,5%), combinada con una mayor proporción de un disolvente menos polar (a menudo acetonitrilo). Más comúnmente, las separaciones se llevan a cabo utilizando 5-40% de agua (o tampones acuosos); la técnica también es compatible con elución en gradiente.

El acetonitrilo es típicamente la primera opción como

disolvente orgánico para

HILIC debido a su buena miscibilidad con el agua, buena retención, y baja viscosidad. Sin embargo, muchos otros disolventes orgánicos polares tales como metanol, etanol, propanol, isopropanol, dioxano, y acetona también puede ser utilizados como disolventes.

En HILIC debido al contenido de enlaces de hidrógeno acuoso de la fase móvil se crea una capa de agua sobre la superficie de la partícula, esto permite la partición de los compuestos polares entre la fase móvil más orgánica y la capa acuosa (Figura 1-5).

23

Introducción

Figura 1-5. Principios de HILIC (Tosoh Bioscience, 2011).

El uso de cromatografía líquida de interacción hidrofílica puede mejorar la resolución de la melamina y sus compuestos análogos y evitar la co-elución de los analitos y los componentes de la matriz. Es así que la determinación del contenido de melamina mediante HILIC, permite una mejor retención de esta molécula que mediante cromatografía en fase reversa. (Tyan y col, 2009). La selectividad y la retención en HILIC principalmente son afectadas por variaciones de la fracción y tipo de solvente orgánico, la concentración y tipo de tampón, y el valor del pH. Típicamente la retención aumenta con una fracción creciente de solvente orgánico. El pH afecta a la retención por el cambio de la ionización tanto del material de la columna como de los analitos investigados. Un analito ionizado es más hidrófilo que su forma neutra, por lo tanto también tendrá una retención más fuerte en columnas HILIC. El efecto de la temperatura de la columna en las separaciones HILIC es a menudo bastante pequeño y típicamente menor que en la cromatografía líquida en fase reversa (RPLC), lo cual indica que hay una pequeña interacción entre la fase estacionaria y el analito, pero finalmente esto depende de la naturaleza del analito retenido. Sin embargo, en algunos casos el ajuste de temperatura puede cambiar significativamente no sólo los tiempos de retención y ancho de banda, sino también la selectividad y el orden de elución, dependiendo

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Introducción del tipo de analito y las fases estacionarias. Sin embargo no se ha realizado ninguna investigación sistemática sobre la estabilidad térmica de varias columnas HILIC a temperaturas elevadas (Bernal y col, 2011). En HILIC, el agua actúa como disolvente fuerte, por lo tanto, cuanto mayor sea el contenido orgánico mayor será la retención de los analitos polares. Por esta razón, los disolventes típicamente utilizados en HILIC contienen 60-90% de materia orgánica (Bernal y col, 2011). Para la separación de compuestos no ionizables, comúnmente se utiliza mezclas de acetonitrilo y agua. Para los compuestos ionizables, la elección del tampón está restringido debido a la baja solubilidad de tampones inorgánicos (por ejemplo, el fosfato de uso común en HPLC en fase inversa) en fases móviles que contienen altas proporciones de disolventes orgánicos. Aditivos ácidos tales como el ácido fórmico y acético se han utilizado ampliamente, especialmente cuando la estabilidad de columnas a base de sílice se ve comprometida a pH más altos.

25

2.

ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS

Antecedentes Bibliográficos Se han realizado varias investigaciones para evaluar la migración de melamina (1,3,5triazina-2,4,6-triamina) a partir de materiales en contacto con alimentos fabricados con resina melamina-formaldehido, utilizando simulantes de alimentos, los mismos que se describen a continuación: Martin

y col (1992), estudiaron bajo diferentes condiciones la

migración de

melamina y formaldehido en artículos en contacto con alimentos comprados en diferentes puntos de venta de Filipinas. La determinación de formaldehido se la realizó por espectrofotometría y

la migración de melamina se determinó utilizando cromatografía

líquida de alta resolución, con una columna CLC-ODS(H) (4,6 mm de diámetro interno y 25 cm de longitud). Una solución de tampón fosfato 0.05M (pH 3.0), constituida por fosfato monopotásico y ácido fosfórico fue la fase móvil utilizada en la investigación. Para los ensayos de migración se uso como simulante acido acético 4% a 90°C durante 30 minutos y agua destilada a 60°C durante 30 minutos. Se obtuvo una liberación indetectable o limitada de ambos monómeros cuando se utilizó agua destilada como simulante de alimentos a 60°C durante 30 minutos. Se observó liberación de ambos monómeros en ácido acético 4%, cuando el ensayo de migración se llevó a cabo a 95°C durante 30 min. Bradley y col (2005), determinaron migración de melamina y formaldehido, a partir de 50 artículos en contacto con alimentos comprados en el Reino Unido. Se utilizó como simulante de alimentos ácido acético 3%, al ser el simulante más agresivo para los plásticos de melamina. Las condiciones de ensayo utilizadas fueron una exposición repetida al simulante durante 2 horas a 70 °C. La concentración de melamina en el simulante se determinó por cromatografía líquida de alta resolución con detección UV (HPLC-UV), con una columna C18 (HiChrom ODS1 200 x 4.6 mm, 5 m de tamaño de partícula) y una fase móvil isocrática compuesta por tampón fosfato 5 mM pH 6.5 y acetonitrilo (90:10 v:v). La concentración de formaldehido en el simulante se determinó por espectrofotometría. Se detectó migración de melamina en 43 de las 50 muestras analizadas, mientras que el formaldehido fue detectado en todas las muestras. De igual forma en las muestras analizadas se observaron efectos visibles de deterioro, incluyendo decoloración y agrietamiento de la superficie en contacto con el simulante.

27

Antecedentes Bibliográficos En el año 2006, Lund & Petersen, encontraron migración de formaldehido y/o monómeros de melamina en siete de diez muestras de utensilios en contacto con alimentos analizados. La determinación de formaldehido se realizó utilizando un método espectrofotométrico, mientras que para la determinación de melamina se

utilizó

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detector UV, con una columna Lichrosorb NH2 (4.6 x 200 mm). La fase móvil utilizada fue acetonitrilo (75%) y tampón fosfato 5 mM (25%). La cuantificación se realizó a 230 nm. Las muestras fueron expuestas al simulante alimentario ácido acético al 3%, a 70°C durante 2 horas, a 95°C durante 30 minutos y a 20°C durante 2 días. Los resultados indican una continua migración de formaldehido y melamina a lo largo de la vida útil de estos artículos. En general, a bajas temperaturas de ensayo, la migración de formaldehido y melamina fue insignificante, mientras que la migración era mayor a temperaturas más altas de ensayo. Bradley y col (2010), determinaron migración de melamina en una variedad de artículos “melaware” usando simulantes de alimentos y varias bebidas ácidas, aplicando diferentes condiciones de

ensayo para la comparación de resultados. Los análisis se

realizaron utilizando cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LCMS/MS), con una columna Luna HILIC (3µm, 200 A, 150 x 3.0 mm) y una fase móvil de acetato amónico 5 mM en agua (A) y acetato amónico 5 mM en metanol (B), con un gradiente A:B de 5:95 (0-2 minutos), de 50:50 ( 5.7 minutos) y 5:95 ( 8.3 minutos). Los resultados indican que la acidez del simulante alimentario desempeña un papel importante en la promoción de la migración de melamina. Así al utilizar ácido acético 3% se obtuvieron valores de

migración de aproximadamente el doble de los obtenidos

utilizando agua bajo la misma condición de tiempo y temperatura de ensayo. Por el contrario, la migración en simulantes grasos no fue detectable y fue por lo menos 20 veces menor que con simulantes acuosos. Los niveles de migración en bebidas ácidas calientes (zumo de manzana, zumo de tomate, té y café negro) fueron bastante similares a los obtenidos con el simulante ácido acético 3%, utilizando las mismas condiciones de ensayo. Lu y col (2010), investigaron la migración de melamina a los alimentos desde materiales plásticos de envasado de alimentos y envases de productos lácteos de uso común en China. Las muestras fueron analizadas utilizando cromatografía líquida de alta resolución

28

Antecedentes Bibliográficos (HPLC), con una columna Kromasil C8(250mm x 4.6 mm, 5µm), y una fase móvil compuesta por ácido cítrico 10 mM y octano sulfonato de sodio 10mM/acetonitrilo (85:15 v/v). Se realizaron ensayos de migración en 37 muestras utilizando como simulantes agua destilada, ácido acético al 3%, n-hexano y etanol al 15% durante dos horas a 60°C. No se detectó melamina en ninguno de los 15 envases de productos lácteos analizados, ni en las 22 muestras de envases plásticos de polipropileno y policarbonato analizados. Mientras que en 3 de los 6 contenedores de resina de melamina se encontró un nivel bajo de melamina. Hsu y col (2010), utilizaron Cromatografía Micelar Electrocinética para detectar trazas de melamina y subproductos relacionados (amelina, amelida y ácido cianúrico). Las muestras de utensilios de cocina y productos de harina analizados, fueron adquiridos en supermercados de Taiwán. Las muestras de utensilios fueron expuestas a varios simulantes: ácido fosfórico 2.5%, ácido acético 4%, agua desionizada y zumo de limón 10% a 80°C durante 30 minutos. Las muestras de productos de harina fueron extraídas mezclándolas con agua desionizada, HCl y acetonitrilo. Los resultados del estudio demuestran que existe migración de melamina en un rango de 0.036 a 0.904 mg/L-1, cuando los utensilios fueron expuestos a una solución ácida (ácido acético o fosfórico) a 80 ◦ C durante 30 min.

No se detectó migración de

melamina cuando las muestras fueron expuestas al zumo de limón y agua desionizada. De igual forma en los productos de harina analizados no se detectó migración de melamina. Chien y col (2011), investigaron la migración de melamina en artículos en contacto con alimentos, mediante cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LCMS/MS), utilizando una columna Phenomenex Luna HILIC (100mm x 2mm x 3µm), a un flujo de de 250 µl/min en modo isocrático. La fase móvil utilizada fue un 5% de solución A (Acetato de amonio 2 mM con 0.2% de acido fórmico en agua) y 95% de solución B (acetato de amonio 2 mM con 0.2 % de ácido fórmico en acetonitrilo).Las muestras analizadas fueron sometidas a temperaturas de 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C y 90°C, durante 15 o 30 minutos, utilizando como simulantes agua destilada y acido acético al 3%.

29

Antecedentes Bibliográficos Los niveles más altos de migración de melamina (6.97 a 19.03 µg/ml), se encontraron en las muestras en las que se utilizó ácido acético al 3% a 90°C, por 30 minutos. Además, las muestras de utensilios más baratas, presentaron niveles más altos de migración de melamina. Wei y col (2011), desarrollaron un método para la determinación selectiva de la migración de melamina a partir de materiales en contacto con alimentos (vajilla de melamina), utilizando LC-ESI-MS-MS (Liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry).La separación se realizó en una columna de intercambio catiónico fuerte usando acetonitrilo-10 mmol/L NH4Ac/HAc (pH = 4,0) (40:60 v/v) como fase móvil. El resultado indicó que las curvas de calibración de melamina fueron lineales con concentraciones en el intervalo de 3-130 g/L. Las recuperaciones de tres concentraciones (10, 50, 80 g/L) estaban en el intervalo de 98-104% con una desviación estándar relativa del 3.03.6%. Chik y col (2011), determinaron el nivel de migración de melamina en 246 muestras de utensilios de cocina (tazas, platos, tenedores, cucharas, vasos, cuencos, etc), recolectados en diferentes puntos de venta de Malasia. Las muestras fueron expuestas a dos tipos de simulantes de alimentos (acido acético al 3% y agua destilada), en tres condiciones de prueba (25°C, 70°C y 100°C) durante 30 minutos. El análisis de melamina se llevo a cabo utilizando cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), con una columna HILIC C18 (3µm, 150 mm long x 2.1 mm), y la fase móvil compuesta por acetato de amonio 10 mM con ácido fórmico (0.05%) ácido fórmico (0.05%)

en agua y acetato de amonio 10 mM con

en acetonitrilo (95: 5, v/v).El límite de cuantificación fue (LOQ)

5ng/ml. Se

detectó

migración

de

melamina

en

todas

las

muestras

analizadas.

En los artículos en los que se utilizó como simulante agua destilada, la migración de melamina fue media 22.2 (32.6), 49.3 (50.9), 84.9 (89.9) ng/ml a 25°C, 70°C y 100 °C, respectivamente. En ácido acético 3%, la migración de melamina fue de 31.5 (35.7), 81.5 (76.2), 122.0 (126.7) ng/ml a 25°C, 70°C y 100 °C, respectivamente. Este estudio sugiere que el calor excesivo y la acidez puede afectar directamente la migración de melamina.

30

Antecedentes Bibliográficos Es necesario señalar que se han realizado múltiples investigaciones para el análisis de melamina y compuestos relacionados amelida, amelina y acido cianúrico en alimentos para consumo humano y piensos debido a los casos de adulteración aparecidos en los últimos años. Así Ehling y col, (2007); Esteban (2007); Vail y col, (2007); Dobson y col, (2008); Garber (2008), Heller y Nochetto (2008), Kim y col (2008); Muñiz-Valencia y col, (2008), han desarrollado varios métodos para la detección de melamina y sus análogos después del incidente de alimentos para mascotas del año 2007, en la que el gluten de trigo y proteína de arroz estaban contaminados con concentrados de melamina y ácido cianúrico. De igual forma Puschner y col, (2007); Dobson y col, (2008); Filigenzi y col, (2008), desarrollaron varios métodos para analizar los residuos de melamina en tejidos animales, para realizar estudios de toxicología y patología. Para analizar alimentos de consumo humano, varios investigadores como por ejemplo Andersen y col, (2008); Turnipseed y col, (2008); Tittlemier y col (2009), han desarrollado o adaptado algunos de los métodos que se utilizaron inicialmente para analizar alimentos de consumo animal. Algunos investigadores han utilizando métodos cuantitativos combinados con una técnica de detección selectiva (Esteban 2007; Andersen y col, 2008; Turnipseed y col, 2008; Gratz y col, 2009; Tittlemier y col 2009), mientras que en otras investigaciones se utilizó métodos selectivos (Lin y col, 2008; Huang y col, 2009; Mauer y col, 2009; Zhu y col, 2009). Dentro de todos los métodos utilizados para el análisis de melamina en alimentos y piensos, la espectrometría de masa de tándem (MS/MS) proporciona el grado más alto de selectividad, seguida de la espectrometría de masas (MS), la detección diodo array (DAD), y finalmente, la absorción ultravioleta (el UV).

31

3.

OBJETIVOS

Objetivos La seguridad de los materiales en contacto con los alimentos es un asunto de interés público. Las vajillas de resina melamina-formaldehido (melaware), son ampliamente utilizados en todo el mundo debido a su durabilidad, buena resistencia al calor y bajo costo. La principal preocupación del uso de artículos “melaware” es la posible migración de la melamina a los alimentos. Así el objetivo de este estudio es evaluar la migración de melamina y análogos amelida y amelina en muestras reales de artículos plásticos destinados al contacto con alimentos. 3.1. Objetivos Específicos: 

Desarrollar un método analítico basado en cromatografía líquida de alta resolución con detección UV (HPLC-UV), para identificar y cuantificar la melamina y análogos procedentes de utensilios de melamina.



Realizar ensayos de migración simulando las condiciones reales de contacto entre el alimento y el utensilio, empleando

ácido acético 3% (p/v) como simulante de

alimentos. 

Aplicar el método desarrollado para la determinación de melamina en muestras de utensilios adquiridas en Galicia (España) y Quito (Ecuador) y así verificar el cumplimiento con la legislación europea.

33

4.

PARTE EXPERIMENTAL

Parte Experimental 4.1. Reactivos 

Acetonitrilo grado HPLC, (CH3CN), pureza 99%, CAS 75-05-8. Merck



Acido acético glacial, (CH3COOH), pureza 100%. Merck



Acido fórmico grado HPLC, CH2O2. Fluka Analytical.



Formiato de Amonio, grado HPLC , CH5NO2, CAS: 540-69-2. Fluka Analytical



Hidróxido de Sodio, Na(OH), Merck.



Agua Milli-Q (Millipore; Bedford, MA)



Agua Destilada.

4.1.1. Estándares 

Melamina, pureza 99%. Aldrich Chemical Co. Ltd

PROPIEDADES DE LA MELAMINA Nombre común: Melamina Nombre IUPAC: 2,4,6-triamino-1,3,5-triazina Número de Registro CAS: 108-78-1 Formula Química: C3H6N6 Sinónimos: Melamina; S-Triazinatriamina; Cyanuramida; Cyanurotriamida; Cyanurotriamina; Hicophor PR; Isomelamina; Teoharn; Theoharn; Virset 656-4; 1,3,5-Triazina-2,4,6(1H,3H,5H)triimina; 2,4,6-Triamino-s-triazina; 2,4,6-Triamino-1,3,5-triazina; 2,4,6-Triaminotriazina; s-Triazina, 2,4,6-triamino-; NCI-C50715; Triamida cianurica; Cianurtriamida; Triaminotriazina; s-Triazina, 4,6-diamino-1,2-dihydro-2-imino. Peso molecular: 126.119 g/mol log P (octanol-agua): -1.37 Solubilidad en agua: 3240 mg/L (20°C) Densidad: 1.573 g/cm3 (14°C) Punto de fusión: 345°C

Tabla4-1. Propiedades Físico-químicas de la melamina (ChemIDplus Advanced).

35

Parte Experimental 

Amelida, pureza 99%. Dr.Ehrenstorfer GmbH PROPIEDADES DE LA AMELIDA

Nombre común: Amelida Nombre IUPAC: 6-Amino-1,3,5-triazine-2,4(1H,3H)-diona Número de Registro CAS: 645-93-2 Formula Química: C3H4N4O2 Sinónimos6-Amino-1,3,5-triazina-2,4(1H,3H)-diona, 1,3,5Triazina-2,4(1H,3H)-diona 6-amino-, 6-amino-1,3,5-triazina-2,4diol, 2,4-Dihidroxi-6-amino-1,3,5-triazina, 6-amino-1H-1,3,5triazina-2,4-diona, Acido Melanurico. Peso Molecular: 128.08 g/mol log P (octanol-agua): -1.220 Solubilidad en agua: 76.9 mg/L (2°C)

Tabla4-2. Propiedades Físico-químicas de la amelida (ChemIDplus Advanced).



Amelina, pureza 98%. Dr.Ehrenstorfer GmbH PROPIEDADES DE LA AMELINA

Nombre común: Amelina Nombre IUPAC: 1,3,5-Triazin-2(1H)-one, 4,6-diaminoNúmero de Registro CAS: 645-92-1 Formula Química: C3H5N5O Sinónimos: 4,6-Diamino-1,3,5-triazina-2-ol; 1,3,5-Triazina-2(1H)uno, 4,6-diamino-; s-Triazina-2-ol, 4,6-diamino-; 2,4-Diamino1,3,5-triazina-6-one; 2-Hydroxy-4,6-diamino-1,3,5-triazina; 4,6Diamino-2-hydroxy-1,3,5-triazina; 2,6-diamino-1H-1,3,5-triazin-4one Peso Molecular: 127.10g/mol log P (octanol-agua): -3.650 Solubilidad en agua: 75 mg/L (23°C)

Tabla 4-3. Propiedades Físico Químicas de la amelina (ChemIDplus Advanced).

36

Parte Experimental 4.2 Muestras Problema 18 marcas diferentes de utensilios de cocina de melamina “melamine ware", fueron adquiridos en diferentes puntos de venta de Santiago de Compostela y Noya (España) y en Quito (Ecuador). (11 muestras España, 7 muestras Ecuador). Se realizó un análisis por duplicado de cada muestra, para lo cual se adquirieron 2 utensilios de cada marca. A cada muestra se le asigno un código como se señala en la tabla 44.

MUESTRAS ESPAÑA CODIGO

MEL-O1

MEL-O2

DESCRIPCION

INDICACIONES ETIQUETA Melamine ware No usar para niños de 0-3 años.

Plato sopero

SUPERFICIE

China

2,6 dm2

China

1,9 dm2

China

2,4 dm2

China

1,7 dm2

China

2,9 dm2

Apto uso lavavajillas Resiste hasta 80° No usar en el microondas

Bol melamina

Apto alimenticio

MEL-O3

PAIS FABRICANTE

para

uso

Apto uso lavavajillas Resiste hasta 90° Lavar bien con agua caliente y detergente Antes de su utilización -no meter en microondas

Bol melamina

Apto alimenticio

para

uso

Apto alimenticio

para

uso

MEL-O4 Vaso

Apto para uso con lavavajillas. Resistente hasta 90° Lavar bien con agua caliente y detergente Antes de su utilización -no meter en microondas

MEL-O5 Vaso

Apto alimenticio

37

para

uso

Parte Experimental

MEL-O6 Bol cuadrado

Apto para uso alimenticio

China

No recomendado a niños.

China

1,2 dm2

MEL-O7

Vaso

MEL-O8

Ensaladera

Melamine ware No usar para niños de 0-3 años.

China

4,5 dm2

Plato hondo

-

China

2,7 dm2

China

2,2 dm2

China

1,1 dm2

China

2,5 dm2

-

China

2,0 dm2

-

China

1,5 dm2

1,6 dm2

MEL-O9

Bandeja melamina MEL-10

Bandeja melamina

MEL-11

Taza

Apto alimenticio

para

uso

No usar en lavavajillas Apto alimenticio

para

uso

MUESTRAS ECUADOR

MEL-EC-O1

Plato sopero

Tazón MEL-EC-O2

MEL-EC-O3

Azucarero

38

Parte Experimental No es adecuado para uso en microondas. Lavar con lavavajillas

Vaso

China

2,0 dm2

-

China

2,09 dm2

-

China

1,6 dm2

-

China

3,6 dm2

MEL-EC-O4 Apto para uso alimenticio

Vaso MEL-EC-O5

Vaso MEL-EC-O6

Plato MEL-EC-O7

Tabla4-4 Muestras utilizadas en los ensayos de migración.

4.3. Preparación de los estándares 4.3.1. Melamina (1000 mg/l) Se pesan aproximadamente 10 mg de melamina en un matraz aforado de 10 ml y se enrasa con agua Milli-Q . Para disolver la melamina, se coloca la solución durante 15 minutos en una baño de agua de ultrasonidos a 70°C. 4.3.2. Amelida y Amelina (500 mg/l) Los estándares de amelida y amelina (500 mg/l) , se prepararon por separado pesando aproximadamente 5 mg de amelida y 5 mg de amelina en un matraz aforado de 10 ml. Se añade 30 µl de hidróxido de sodio 0.05 M y se enrasa con agua Milli-Q. 4.3.3. Solución estándar Mix (50 mg/l de melamina, 100 mg/l de amelida y 100 mg/l de amelina).

39

Parte Experimental La solución estándar multi-componente (MIX) se preparó pipeteando 1.25 ml de la solución de melamina (apartado 4.3.1), 5 ml de amelida y 5 ml de amelina (apartado 4.3.2) en un matraz aforado de 25 ml y se enrasa con agua Milli-Q. 4.4. Identificación y cuantificación de la melamina, amelida y amelina por cromatografía líquida de alta resolución. El contenido de melamina, amelida y amelina en simulantes de alimentos se determinó por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), utilizando detección UV, para lo cual se empleó un cromatógrafo de líquidos HPLC Hewlett Packard 1100 Series equipado con un desgasificador, una bomba cuaternaria, inyector automático, y detector Diodo Array (DAD), controlados con el Software HP ChemStation. Las condiciones cromatográficas del método utilizado se indican en la Tabla 4-5. Luna Hilic Phenomenex 200 Å, 150 x3.0 mm, 3µm de tamaño de partícula 0,5 ml/min 30°C 20 µl Formiato de amonio 10 mM ajustado a pH 3 con Acido Fórmico / Acetonitrilo (5:95) Isocratica 25 min Rango: 190-400nm Sustancia λ (nm) Melamina 230 nm Amelida 230 nm Amelina 230 nm

COLUMNA FLUJO TEMPERATURA VOLUMEN DE INYECCIÓN FASE MOVIL TIPO DE ELUCIÓN STOP TIME DETECCIÓN

TIEMPOS DE RETENCIÓN

Sustancia

Tiempo (min)

Melamina Amelida Amelina

7.4 14.8 23.5

Tabla 4-5. Condiciones del método HPLC utilizada para la identificación y cuantificación de las sustancias: melamina, amelida y amelina.

Para la cuantificación de las sustancias se inyectaron por duplicado ocho soluciones patrón (preparadas en la fase móvil), de distintas concentraciones de melamina, amelida y amelina. Las concentraciones de las soluciones fueron de 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 5,7.5, 10 mg/l para la melamina y de 0.2, 0.5, 1, 2, 4,10, 15, 20 mg/l para la amelida y amelina.

40

Parte Experimental La recta de calibrado de la concentración frente al área del pico se obtuvo por regresión lineal. 4.5. Fase Móvil para el análisis por HPLC (Formiato de amonio 10 mM ajustado a pH 3 con Ácido Fórmico/Acetonitrilo (5:95). Se pesan 0,63 g de formiato de amonio y disolver con 50 ml de agua Milli-Q. Se ajusta a pH 3 (±0,2) añadiendo acido fórmico. La disolución tampón preparada anteriormente, se coloca en un matraz aforado de 1000 ml y se completa hasta enrase con acetonitrilo. La disolución resultante se filtra por medio de una membrana de 0,45 µm de tamaño de poro.

Figura 4-1. HPLC Hewlett Packard 1100

41

Parte Experimental 4.6. Repetibilidad Se efectúa el análisis de una concentración conocida de melamina, amelida y amelina el mismo día; cada serie se analiza siete veces. Se calcula la desviación estándar relativa (R.S.D. %). Sustancia

Concentración mg/l

N° análisis

Melamina

2

7

Amelida

4

7

Amelina

4

7

Tabla4-6. Condiciones repetibilidad del método.

4.7. Repetibilidad Interdía Se efectúa el análisis de tres series de concentraciones de melamina en tres días consecutivos. Concentración mg/l

Días

0,5

3

2,0

3

10

3

Tabla4-7. Condiciones repetibilidad interdía.

4.8. Exactitud La exactitud se ha estimado por sobrecarga de seis muestras resultantes de

los

ensayos de migración, en la que previamente se ha comprobado que no ha migrado melamina, amelida y amelina.

Se realizó una sobrecarga en las muestras con una

concentración conocida de un patrón de melamina (2,5 mg/l). Se cálculo el porcentaje de recuperación de la cantidad del analito presente en las muestras. 4.9. Análisis de los artículos en contacto con alimentos 4.9.1. Cálculo de la superficie de las muestras problema La superficie de los utensilios utilizados para los ensayos de migración, se calcula a partir de las dimensiones de cada muestra de ensayo. La superficie puede ser vista como la

42

Parte Experimental suma de todas las áreas de todas las formas que componen la superficie en contacto con los alimentos de un artículo. 4.9.2. Preparación de muestras problema Las muestras deben estar limpias y libres de contaminación superficial, para lo cual antes de iniciar los ensayos de migración los utensilios fueron lavados con agua y una solución de agua/lavavajillas al 1%. 4.9.3. Simulante alimentario Las muestras fueron puestas en contacto con el simulante alimentario de un modo que represente las peores condiciones posibles de uso, es así que para la realización de los ensayos de migración se utilizó el simulante B, acido acético 3% (p/v), (simulante para alimentos acuosos y ácidos). El acido acético 3% (p/v), se prepara por dilución de 30 g de ácido acético con agua destilada y enrasado hasta un volumen de 1 litro. 4.9.4. Ensayos de Migración-Objetos de uso repetido

Los ensayos de migración se efectuaron tres veces en cada muestra, usando otra porción de simulante alimentario en cada ocasión.

Exposición 1

Exposición 2

Exposición 3

Cada muestra de ensayo se llena hasta 1 cm por debajo del borde con el simulante previamente precalentado (70°C), y se cubren con film de aluminio para reducir las pérdidas por evaporación durante los ensayos de migración. Posteriormente se colocan en la estufa en las condiciones de tiempo y temperatura indicadas a continuación: -

2 horas a 70 ° C (± 2 ° C).

43

Parte Experimental Una vez alcanzado el tiempo deseado, las muestras se retiran de la estufa. El volumen del simulante se registra al inicio y terminación de los ensayos de migración El cumplimiento con la legislación de dicho material u objeto se controlará sobre la base del nivel de migración que se encuentre en el tercer ensayo.

Figura4-2. Muestra con simulante ácido

Figura 4-3. Muestras en ensayos de

acético 3% (p/v).

migración durante 2 horas a 70°C.

1 ml de la solución obtenida de los ensayos de migración se coloca en un tubo de ensayo graduado y se evapora aplicando una corriente de nitrógeno y calor seco (45°C) hasta un volumen de 0.5 ml. A continuación se reconstituye con fase móvil hasta un volumen de 2 ml, y se agita en el vortex para obtener una mezcla homogénea. Posteriormente una alícuota de la mezcla anterior se filtra a través de un filtro tamaño de poro 0,45 µm y se inyecta en el cromatografo para su análisis.

4.10. Cálculo de la concentración de melamina a partir de los parámetros de regresión. Si la ecuación de la Recta de regresión es:

y  a  x   b

44

Parte Experimental donde: y

es el área del pico de melamina;

a

es la pendiente de la recta de regresión

x es la concentración de melamina en el simulante de alimento en milígramos por kilogramo; b

es la ordenada en el origen en la recta de regresión

entonces la concentración de melamina en el simulante de alimento, viene dada por; C MEL , sa 

y b a

donde:

C MEL , sa es la concentración de melamina en el simulante de alimento, en miligramos por kilogramo.

45

5.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Resultados y Discusión El plástico termoestable 'melamina' es ampliamente usado para la fabricación de una diversidad de artículos en contacto de alimentos de uso repetido. Sin embargo después del proceso de fabricación, pueden estar presentes monómeros residuales en los artículos plásticos, los mismos que pueden migrar a los productos alimenticios. A pesar del uso generalizado de artículos en contacto con alimentos de melamina, sólo unos pocos investigadores han publicado resultados de las pruebas que abordan la migración de estos monómeros. De ahí que en este trabajo se consideró de suma importancia investigar la migración de melamina en muestras reales de artículos en contacto con alimentos. 5.1. Selección de la fase móvil En este trabajo se puso a punto un método para la detección de melamina y compuestos análogos (amelida y amelina) en muestras de utensilios en contacto con alimentos. Para lo cual se utilizó cromatografía liquida de Interacción hidrofílica (HILIC), al ser una técnica cromatográfica de alto rendimiento para la separación de compuestos polares e hidrófilos. Con HILIC se obtiene una mejor resolución de la melamina y sus compuestos análogos así como una mejor retención de estas moléculas. Una aplicación típica HILIC utiliza acetonitrilo a una concentración de entre 50-95% y un tampón acuoso tal como formiato de amonio, acetato de amonio o sus ácidos, que tienen una alta solubilidad en disolventes orgánicos. En este contexto para este trabajo se evaluaron varias fases móviles, modificando la composición de las mismas. Se utilizaron fases móviles con un contenido alto de acetonitrilo (>80%) y agua o soluciones amortiguadoras de formiato y acetato de amonio evaluando el efecto del pH y de la fuerza iónica (Tabla 5-1).

FASE MÓVIL

A

B

Acetato de Amonio 10 mM (ajustado a pH 3.8 con ácido acético)/Acetonitrilo (5:95): Acetato de Amonio 10 mM (ajustado a pH 3.8 con ácido acético)/Acetonitrilo (10:90):

TIEMPOS DE RETENCIÓN MELAMINA AMELIDA AMELINA 6.0 min

11.0 min

16.4 min

4.4min

4.8 min

6.7 min

47

Resultados y Discusión

C

D

E

F

Formiato de Amonio 100 mM (ajustado a pH 3 con ácido fórmico)/Acetonitrilo (5:95) Formiato de Amonio 100 mM (ajustado a pH 3 con ácido fórmico)/Acetonitrilo (10:90) A:Formiato de Amonio 10 mM (ajustado a pH 3 con ácido fórmico)/Acetonitrilo (5:95) B:Formiato de Amonio 10 mM (ajustado a pH 3 con ácido fórmico)/Acetonitrilo (50:50) Formiato de Amonio 10 mM (ajustado a pH 3 con ácido fórmico)/Acetonitrilo (5:95)

7.9 min

10.6 min

19 min

4.6 min

10.4min

10.5 min

6.8 min

10.6 min

16.4 min

7.4 min

14.8 min

23.5 min

Tabla5-1. Fases móviles de prueba.

Al aumentar la proporción de agua en las fases móviles utilizadas se adelantan los tiempos de retención de los compuestos analizados. Sin embargo se pudo determinar que los tiempos de retención muy cercanos entre la melamina y amelida (fase móvil B) y entre la amelida y amelina (fase móvil D), provocan que no exista una resolución cromatográfica adecuada. El acetonitrilo fue utilizado como disolvente orgánico en las fases móviles debido a su buena miscibilidad con el agua, buena retención, y baja viscosidad. Y al utilizar una proporción alta de acetonitrilo, existe una fuerza de arrastre muy grande y, por tanto la fuerza eluotrópica de las fases móviles es mayor. De igual forma al utilizar como buffer formiato de amonio, se consiguió una mejor relación entre señal/ruido. La forma más eficaz de cambiar la retención en HILIC es mediante el ajuste de la concentración del disolvente orgánico, de esta manera se produce un aumento de la retención con una fracción cada vez mayor de disolvente orgánico. Es así que se produjo un aumento

48

Resultados y Discusión de la retención cuando se utilizó en la fase móvil una mayor proporción de acetonitrilo, obteniéndose los mejores resultados con acetonitro en una proporción del 95 %. Todos los analitos eluyen a tiempos de retención específicos cuando se produce un equilibrio de cada uno de ellos entre las fases estacionaria y móvil. Es así que se obtuvo una mayor retención y resolución de la melamina, amelida y amelina utilizando una mezcla de formiato de amonio 10 mM (ajustado a pH 3 con ácido fórmico)/Acetonitrilo (5:95) como fase móvil. La resolución cromatográfica obtenida en cada par de picos adyacentes fue adecuada, con una separación diferenciada entre melamina y amelida como primer par de picos y amelida y amelina como segundo para de picos respectivamente. De igual forma con esta fase móvil se obtuvo una línea base homogénea a lo largo del tiempo de elución y relaciones entre señal/ruido optimas para la mejor cuantificación de los analitos en los cromatogramas. Es necesario señalar que la selectividad y la retención en HILIC se ve afectada por ligeras variaciones de la fracción y tipo de solvente orgánico, concentración y tipo de tampón, y el pH. Así, se observó que cualquier pequeña variación en estos parámetros produce cambios en los tiempos de retención y resolución de los picos de los analitos analizados. De igual forma el pH puede afectar a la retención por el cambio de la ionización tanto del material de la columna como de los analitos investigados.

5.2. Límites de detección y cuantificación Los límites de detección, definidos como la concentración más baja cuya señal es tres veces la señal del ruido, fueron calculados de acuerdo a la ACS (American Chemical Society ACS guidelines ,1980), como se muestra en la tabla 5-2. El límite de detección más bajo corresponde a la melamina. De igual forma los limites de cuantificación fueron calculados de acuerdo a la ACS (American Chemical Society ACS guidelines ,1980). 5.3. Repetibilidad La repetibilidad

fue estimada como la desviación

estándar relativa (R.S.D.%),

analizando siete veces una concentración de 2 mg/l para la melamina y 4 mg/l para la

49

Resultados y Discusión amelida y amelina. En todos los casos se obtuvo un porcentaje de desviación estándar relativa inferior al 5% (Tabla 5-2). Sustancia

Límite de Detección (LOD) mg/l 0,10 2,0 1,0

Melamina Amelida Amelina

Límite de Cuantificación mg/l 0,25 4,0 2,0

% R.S.D.

1,26 4,63 2,46

Tabla5-2. Desviación estándar relativa y límites de detección y cuantificación de la melamina, amelida y amelina.

5.4. Repetibilidad Interdía Con el fin de evaluar la variabilidad entre días se analizaron 3 concentraciones de melamina, en tres días consecutivos. Las concentraciones de 2 mg/l y 10 mg/l presentan una desviación estándar relativa inferior al 5% mientras que la concentración más baja (0.5 mg/l), presenta el valor más alto, con una desviación estándar relativa de 6,32% (Tabla 5-3).

Concentración mg/l 0,5 2,0 10

% R.S.D. 6,32 1,24 1,46

Tabla5-3. Repetibilidad Interdía

5.5. Exactitud La exactitud se estimó por sobrecarga de seis muestras resultantes de los ensayos de migración, en las que previamente se ha comprobado que no ha migrado melamina, amelida y amelina. Se obtuvo un porcentaje de recuperación promedio de melamina de 97.2% (Tabla 5-4).

50

Resultados y Discusión Concentración Teórica mg/l

Concentración encontrada (mg/l)

2,5 2,20 2,5 2,17 2,5 2,48 2,5 2,69 2,5 2,29 2,5 2,75 Tabla5-4. Exactitud del método.

Porcentaje de recuperación (%)

Promedio Porcentaje de recuperación (%)

88,0 86,8 99,2 107 91,6 110

97,2%

Es necesario señalar que la solución patrón individual de melamina fue estable durante al menos un mes, mientras que las soluciones patrón individuales de amelina y amelida son estables por un máximo dos días, ya que se produce una hidrolisis de las mismas. Así la repetibilidad interdía y exactitud del método se realizó con la melamina, al ser el compuesto más estable, y al ser el monómero detectado en las muestras analizadas. 5.6. Identificación y cuantificación de melamina, amelida y amelina por cromatografía líquida de alta resolución La identificación de la melamina y análogos amelida y amelina en muestras de utensilios, se llevo a cabo mediante la comparación de los espectros de absorción y de los tiempos de retención con los obtenidos al analizar por HPLC una solución con substancias de referencia de melamina, amelida y amelina.

Figura5-1. Espectro de absorción ultravioleta de la melamina.

51

Resultados y Discusión

Figura5-2.Espectro de absorción ultravioleta de la amelida.

Figura5-3. Espectros de absorción ultravioleta de la amelina.

52

Resultados y Discusión

Figura 5-4. Cromatograma obtenido de una solución estándar de 10 mg/l de concentración de melamina, amelida y amelina.

Para la cuantificación de las sustancias se utilizó la recta de calibrado calculada por regresión lineal con los resultados de las soluciones patrón de melamina, amelida y amelina. Para ello se interpolaron las áreas obtenidas por HPLC para las muestras en dicha recta. Se obtuvieron coeficientes de determinación satisfactorios y una linealidad adecuada. Los parámetros de las rectas de calibrado se detallan a continuación.

Parámetro de la recta de calibración Pendiente Término independiente Coeficiente de Determinación Rango (mg/l)

Melamina 62,857 0,5677 0,9999 0,25-10

Sustancia Amelida 9,5147 4,8612 0,9993 4 - 20

Amelina 31,14 -4,6481 0,999 2 - 20

Tabla 5-5. Parámetros de las rectas de calibración de la melamina, amelida y amelina.

53

Resultados y Discusión

MELAMINA 700 600

y = 62,857x + 0,5677 R² = 0,9999

ÁREA

500 400 300 200 100

0 0

2

4

6

8

10

12

CONCENTRACIÓN mg/l

Figura 5-5. Recta de calibrado obtenida para la melamina.

AMELIDA 250

y = 9,5147x + 4,8612 R² = 0,9993

ÁREA

200 150 100 50 0 0

5

10

15

CONCENTRACIÓN mg/l

Figura 5-6. Recta de calibrado obtenida para la amelida.

54

20

25

Resultados y Discusión

AMELINA 700 600

y = 31,14x - 4,6481 R² = 0,999

ÁREA

500 400 300 200 100 0 0

5

10

15

20

25

CONCENTRACIÓN mg/l

Figura 5-7. Recta de calibrado obtenida para la amelina.

5.7. Migración de melamina y análogos amelida y amelina en artículos en contacto con alimentos. Los ensayos de migración se llevaron a cabo por duplicado con

muestras

de

materiales en contacto con alimentos, a una temperatura de 70°C por dos horas, utilizando como simulante alimentario acido acético 3% (p/v). Los artículos de melamina pueden entrar en contacto con todos los tipos de alimentos. En estos casos, la norma CEN EN 13130-1, establece que se debe utilizar una disolución acuosa de ácido acético al 3% (p/v), disolución acuosa de etanol al 10% (v/v) y simulantes alimentarios grasos. Sin embargo, varios estudios han demostrado que la solución de ácido acético es el simulante más agresivo para los plásticos de melamina (Ishiwata y col, 1986), por lo que fue seleccionado como el simulante alimenticio para este trabajo. En la tabla 5-6 se presentan los resultados de los ensayos de migración. De las 18 muestras analizadas por duplicado solamente se detectó melamina en 8 muestras; MEL-01, MEL-02, MEL-06, MEL-08, ME-10, MEL-11 (España) y MEL-EC-01, MEL-EC-07 (Ecuador). La amelida y amelina no fue detectada en ninguna de las muestras analizadas.

55

Resultados y Discusión

MUESTRAS

PRIMERA MIGRACIÓN mg/kg mg/dm2

SEGUNDA MIGRACIÓN mg/kg mg/dm2

TERCERA MIGRACIÓN mg/kg mg/dm2

MEL-01A MEL-01B

0,838 0,979

0,176 0,206

0,650 0,660

0,137 0,139

0,616 0,332

0,130 0,0701

MEL-02A MEL-02B

2,30 2,87

0,35 0,44

2,37 2,87

0,368 0,444

2,24 1,81

0,347 0,281

MEL-3A MEL-3B

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

MEL-4A MEL-4B

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

MEL-5A MEL-5B

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

MEL-06A MEL-06B

1,91 5,96

0,298 0,929

1,61 3,01

0,252 0,470

1,52 2,35

0,23 0,36

MEL-7A MEL-7B

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

MEL-08A MEL-08B

5,51 1,33

1,09 0,265

3,49 0,949

0,692 0,188

2,63 0,803

0,523 0,159

MEL-9A MEL-9B

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

MEL-10A MEL-10B

11,8 13,5

1,43 1,65

3,70 4,77

0,452 0,582

2,23 2,73

0,272 0,333

MEL-11A MEL-11B

1,69 2,46

0,244 0,354

1,69 3,80

0,243 0,548

1,44 *rota

0,208 *rota

MEL-EC-01A MEL-EC-01B

1,92 1,14

0,379 0,226

1,18 1,07

0,234 0,212

1,89 1,44

0,374 0,285

MEL-EC-02A MEL-EC-02B

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

MEL-EC-03A MEL-EC-03B

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

56

Resultados y Discusión MEL-EC-04A MEL-EC-04B

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

MEL-EC-05A MEL-EC-05B

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

MEL-EC-06A MEL-EC-06B

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

MEL-EC-07A MEL-EC-07B

7,67 1,94

0,668 0,169

4,06 1,42

0,354 0,124

5,10 1,43

0,445 0,125

Tabla 5-6. Niveles de melamina en las muestras analizadas por duplicado.

Una observación interesante es la diferencia en el comportamiento de la migración entre los elementos individuales de la misma marca. Este fenómeno, es debido posiblemente a diferencias pequeñas en los procesos de fabricación de los utensilios. Un ejemplo de esta diferencia se la puede observar en la primera migración de la muestra MEL-EC-07; con valores de migración de melamina de 7,67 mg/kg para MEL-EC-07A, y de 1,94 mg/kg para su duplicado MEL-EC-07B (Tabla 5-6). En la tabla 5-7 se puede observar los niveles de migración de melamina en las muestras MEL-01, MEL-02, MEL-06, MEL-08, ME-10, MEL-11, MEL-EC-01, MEL-EC-07 en relación con el límite de migración específica en mg/kg y mg/dm2, considerando la relación superficie/volumen real de cada muestra analizadas. Los resultados de la primera, segunda y tercera exposición fueron variables. Para algunas muestras los niveles de migración permanecieron bastante constantes, pero en otras muestras la migración aumentó o disminuyó. Hubo variabilidad entre las muestras, lo cual al parecer puede ser una característica de la migración desde artículos de melamina (Tabla 5-7). En la Unión Europea la melamina está aprobada como un monómero y como un aditivo en plásticos con un límite de migración específica de 2,5 mg/kg, equivalente a un límite de 0,41 mg/dm2 (Reglamento (UE) 1282/2011). En general en la primera migración se observa que las muestras MEL-02, MEL-06, MEL-08, MEL-10 y MEL-EC-07 presentan valores superiores a 2,5 mg/kg. En la segunda migración las muestras MEL-02, MEL-10, MEL-11 y MEL-EC-07 superan los 2,5 mg/kg.

57

Resultados y Discusión Mientras que en la tercera migración solo MEL-EC-07 supera este valor y MEL-10 presenta un valor cercano de 2.5 mg/kg. (Tabla 5-7). De igual forma en la primera migración las muestras MEL_06, MEL_08, MEL_10 y MEL_EC_07 presentan valores superiores a 0,41 mg/dm2, en la segunda migración MEL_08, MEL_10 presentan valores superiores a 0,41 mg/dm2, mientras que en la tercera migración ninguna muestra supera el límite de migración específica de melamina en mg/dm2 (Tabla 57).

MUESTRAS

PROMEDIO PRIMERA MIGRACIÓN mg/kg mg/dm2

PROMEDIO SEGUNDA MIGRACIÓN mg/kg mg/dm2

MEL-01

0,908

0,191

0,655

MEL-02

2,58

0,400

MEL-06

3,93

MEL-08

PROMEDIO TERCERA MIGRACIÓN mg/kg

mg/dm2

0,138

0.474

0,100

2,62

0,406

2,03

0,314

0,613

2,31

0,361

1,94

0,302

3,42

0,678

2,22

0,440

1,72

0,341

MEL-10

12,6

1,54

4,23

0,517

2,48

0,302

MEL-11

2,08

0,299

2,74

0,395

1,44

0,208

MEL-EC-01

1,53

0,303

1,13

0,223

1,67

0,329

MEL-EC-07

4,80

0,419

2,74

0,239

3,27

0,285

Tabla 5-7. Promedio migración de melamina en mg/kg y mg/dm2, en las muestras analizadas usando como simulante acido acético 3% a 70°C durante 2 horas.

Al comparar los resultados de los tres ensayos de migración en todas las muestras analizadas, las concentraciones más altas de melamina, se encontraron en la primera migración de la muestra MEL- 10 y MEL-EC-7.

58

Resultados y Discusión

Figura 5-8. Primera migración muestra MEL-10.

Figura 5-9. Primera migración muestra MEL-EC-07.

59

Resultados y Discusión

MIGRACIÓN MELAMINA mg/kg 14 12 10 8 6 4 2 0 MEL-01

MEL-02

MEL-06

MEL-08

1 Migración

MEL-10

2 Migración

MEL-11

MEL-EC-01 MEL-EC-07

3 Migración

Figura 5-10. Resultados de la migración melamina en los artículos en relación con el límite de migración específica (mg/kg).

En la Figura 5-10 se puede observar que las muestras MEL-10 y MEL-EC-07 presentaron los mayores niveles de migración de melamina (mg/kg) en el primero, segundo y tercer ensayo de migración. De manera general se puede observar que en casi todas las muestras la migración de melamina es mayor en el primer ensayo de migración.

MIGRACIÓN MELAMINA mg/dm² 2 1,5 1 0,5 0 MEL-01

MEL-02

MEL-06

MEL-08

1 Migración

MEL-10

2 Migración

MEL-11

MEL-EC-01 MEL-EC-07

3 Migración

Figura 5-11 Resultados de la migración melamina en los artículos en relación con el límite de migración específica (mg/dm2).

Expresando el límite de migración específica en mg/dm2, la muestra que presenta mayores niveles de migración de melamina en el primero, segundo y tercer ensayo de

60

Resultados y Discusión migración es MEL-10, siendo considerablemente mayor la migración de melamina en el primer ensayo. La muestra MEL-01 presenta los menores niveles de migración (Figura 5-11). De conformidad con lo establecido en el Reglamento (UE) N°10/2011 de la Comisión de 14 de enero de 2011 sobre materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con alimentos, para verificar la conformidad, los valores de migración específica se expresarán en mg/kg aplicando la relación real entre superficie y volumen en el uso efectivo o previsto. No obstante para envases y otros objetos que contengan o estén destinados a contener menos de 500 mililitros o gramos o más de 10 litros, el valor de la migración se expresará en mg/kg, aplicando un coeficiente superficie/volumen de 6 dm2. Así aplicando el coeficiente superficie/volumen de 6 dm2 en las muestras analizadas con un volumen inferior a 500 ml (MEL-02, MEL-06, MEL-10, MEL-11 y MEL-EC-07), se obtienen los siguientes valores de migración específica de melamina (Tabla 5-8). MUESTRAS

MEL-01

PRIMERA MIGRACIÓN mg/kg 0,908

SEGUNDA MIGRACIÓN mg/kg 0,655

TERCERA MIGRACIÓN mg/kg 0,474

MEL-02

2,40

2,43

1,88

MEL-06

3,68

2,16

1,81

MEL-08

3,42

2,22

1,72

MEL-10

9,27

3,10

1,81

MEL-11

1,79

2,37

1,24

MEL-EC-01

1,53

1,13

1,67

MEL-EC-07

2,51

1,43

1,71

Tabla 5-8. Resultados migración de melamina en mg/kg aplicando coeficiente superficie volumen 6dm2.

La migración de melamina en el primer ensayo se encuentra en un rango de 0,9089,27 mg/kg, en el segundo ensayo en un rango de 0,655-3,10 mg/kg, mientras que en el tercer ensayo se encuentra en un rango de 0,474-1,88 mg/kg (Tabla 5-8).

61

Resultados y Discusión En materiales u objetos destinados a entrar en contacto repetidamente con alimentos, el ensayo o ensayos de migración se efectuarán tres veces en una sola muestra.

La

conformidad de dicho material u objeto se controlara sobre la base del nivel de migración que se encuentre en el tercer ensayo (Reglamento (UE) N°10/2011). En el primer y segundo ensayo algunos artículos analizados superaron el límite de migración específica establecido en la legislación. Sin embargo los resultados del tercer ensayo de migración muestran que los niveles de migración de melamina, son inferiores al límite de migración específica de 2,5 mg/kg establecido en el Reglamento (UE) Nº 1282/2011 de la Comisión de 28 de noviembre de 2011 por el que se modifica y corrige el Reglamento (UE) nº 10/2011 sobre materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con alimentos (Figura 5-12).

TERCER ENSAYO DE MIGRACIÓN mg/kg 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 MEL-01

MEL-02

MEL-06

MEL-08

MEL-10

MEL-11

MEL-EC-01 MEL-EC-07

Figura 5-12. Resultados del tercer ensayo de migración de melamina en los artículos en relación con el límite de migración específica (mg/kg), aplicando coeficiente superficie volumen de 6dm2.

Es necesario señalar que en las muestras analizadas, adquiridas en Ecuador, se evaluó la conformidad con los límites de migración específica, tomando como referencia lo establecido en la normativa Europea de materiales en contacto con alimentos, ya que en Ecuador al momento no existe una legislación específica de materiales en contacto con alimentos en la que se establezca los límites máximos de melamina.

62

Resultados y Discusión Después del incidente del año 2008, en el que se produjo la adición deliberada de melamina en fórmulas en polvo para la alimentación infantil, para incrementar el contenido proteico, la melamina

también ha sido encontrada en otros productos alimenticios,

incluyendo huevos de pollo, pescado y verduras importadas de China. En este trabajo, en concordancia con otras investigaciones se comprueba que el empleo diario de artículos de melamina, tienen un alto potencial para liberar este monómero lo cual añade otra fuente de exposición de melamina en nuestra vida. Los resultados indican que la acidez del simulante alimentario, el tiempo de exposición y la temperatura

juegan un papel importante promoviendo la migración de la

melamina en las muestras analizadas. La estabilidad química del plástico debe ser considerada ya que puede ocurrir una hidrólisis sobre todo en usos a altas temperaturas y posiblemente se ve acelerado por el ácido. En este estudio, un parámetro variable que no se ha tomado en consideración, es la calidad de la resina de melamina usada en la fabricación de los artículos analizados. No obstante, podemos decir que el nivel de migración de melamina es afectado directamente por el ácido acético 3% (p/v) y la temperatura utilizada en los ensayos de migración. De conformidad con este estudio y otros realizados en artículos en contacto con alimentos de melamina, los niveles más altos de migración de melamina se puede esperar que ocurran en el caso de la vajilla en contacto con los alimentos ácidos y bebidas que se consumen calientes. Podría esperarse bajos niveles de migración de melamina con alimentos ácidos y no ácidos, que se consumen fríos. En los ensayos de migración se observó que algunos de los artículos de melamina se deterioraron durante la exposición repetida al simulante (acido acético 3% (p/v)). La superficie del plástico se decoloró en algunos casos y en otros se observó agrietamiento (Figura 5-13). Las muestras en las que se observó deterioro y/o agrietamiento después de los ensayos de migración fueron MEL-03, MEL-04, MEL-05, MEL-06, MEL-07, MEL-08, MEL-09, MEL-10, MEL-EC-03, MEL-EC-05, y MEL-EC-06. Sin embargo en algunas muestras en las que se observó deterioro no se detectó migración de melamina. Aquellas muestras que han mostrado un deterioro físico en los ensayos de migración deberían incluir en su etiquetado que no son aptas para su uso en caliente y con alimentos

63

Resultados y Discusión ácidos. Así de las muestras que presentaron deterioro solo MEL-03 y MEL-05 presentaron en su etiquetado la instrucción de que son resistentes hasta 90°C, sin embargo sufrieron daños físicos al someterlas a los ensayos de migración a 70°C. También en lo referente al etiquetado de los materiales destinados a estar en contacto con alimentos, de acuerdo con el artículo 15 del Reglamento (CE) N° 1935/2004, del Parlamento Europeo y del Consejo, de 27 de octubre de 2004, sobre los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con alimentos y por el que se derogan las Directivas 80/590/CEE y 89/109/CEE, los materiales y envases que no están en contacto con alimentos, cuando se comercializan, deberán ir acompañados de un etiquetado específico. Algunas marcas de los artículos muestreados en Galicia (España) están etiquetados con instrucciones para la utilización segura del material, incluyendo el asesoramiento respecto a su uso en microondas y el lavado en lavavajillas automáticos, mientras que otras marcas muestreadas carecen de una o varias instrucciones de uso. De igual forma solo algunos de los artículos presentaban en la etiqueta el término “para contacto con alimentos”, o el símbolo del anexo II del Reglamento 1935/2004. Solo uno de los artículos muestreados en Ecuador presentó etiqueta con instrucciones de uso. Todos aquellos artículos que no lleven el símbolo correspondiente o el término “para contacto con alimentos” podría entenderse que están enmarcados en el artículo 15, apartado 2 del Reglamento 1935/2004, es decir que “por sus características, estén claramente destinados a entrar en contacto con alimentos”. No obstante este mismo reglamento recoge que de ser necesario deben de figurar “las instrucciones especiales que deban seguirse para un uso adecuado y seguro” (letra b del apartado 1 del artículo 15), por lo que quizás en todos aquellos artículos que han sufrido cambios físicos debería figurar alguna indicación. Aunque en el tercer ensayo de migración las muestras analizadas no superaron el límite de migración específica para la melamina, el deterioro sufrido puede indicar que puedan estar migrando otros compuestos que no se contemplaron en la realización de este trabajo.

64

Resultados y Discusión

Figura 5-13 Superficie descolorida y/o agrietada de MEL-05A, MEL-07B, MEL-EC-03A, MEL-EC_06B, MEL-03A, y MEL-09B después de tres exposiciones sucesivas al simulante ácido acético al 3%.

65

6.

CONCLUSIONES

Conclusiones 1. Se ha puesto a punto un método de Cromatografía líquida de alta resolución con detección UV (HPLC-UV) para la determinación de melamina, amelina y amelida. Se ha estudiado la linealidad, repetibilidad y exactitud del método.

2. Se detectó melamina en 8 de los 18 artículos en contacto con alimentos analizados, la amelida y amelina no fue detectada en ninguna de las muestras analizadas. 3. Se han realizado ensayos de migración en muestras de utensilios de cocina de melamina adquiridas en diversos puntos de venta en Galicia (España) y Quito (Ecuador). Se utilizó ácido acético 3%(p/v) como simulante. 4. En las muestras analizadas los niveles de migración de melamina en el tercer ensayo se encuentra en un rango de 0,474-1,88 mg/kg, por lo que ninguna de las muestras supera el límite de migración específica de 2,5 mg/kg establecido en el Reglamento (UE) Nº 1282/2011 de la Comisión de 28 de noviembre de 2011 por el que se modifica y corrige el Reglamento (UE) nº 10/2011 sobre materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con alimentos. 5. Los resultados del estudio muestran que, incluso bajo las condiciones experimentales que simulan el peor de los casos, en el tercer ensayo de migración todas las muestras analizadas presentan niveles bajos de migración de melamina, los cuales están por debajo de los límites establecidos en la Unión Europea, lo que indica que todas las muestras analizadas son de calidad adecuada para uso alimentario. 6. Los

resultados de este trabajo sugieren también que la acidez del simulante

alimentario y la temperatura utilizada juegan un papel importante para promover la migración de melamina, por lo que podemos concluir que el nivel de migración de melamina es afectada directamente por el

simulante utilizado y condiciones de

tiempo y temperatura de uso.

7. Los resultados de este trabajo demuestran que la migración de melamina se caracteriza por una alta variabilidad entre especimenes incluso dentro de la misma marca y por un comportamiento variable al contacto repetido con el simulante, con niveles de migración bajos en algunos casos y altos en otros. 67

Conclusiones 8. Aunque los niveles de melamina en el tercer ensayo no superan el límite de migración específica (SML) establecido en la normativa europea, los resultados de este trabajo indican claramente la posibilidad de exposición humana a la melamina por la migración desde materiales en contacto con alimentos. 9. En algunos de los artículos analizados se observó una serie de efectos visibles, incluyendo la decoloración y/o erosión de la superficie en contacto con el simulante y agrietamiento de los artículos. Esto indica que se debe continuar con los ensayos para evaluar la seguridad de este tipo de materiales.

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