Unidad 8. ESTRUCTURA Y REPLICACION DEL ADN Documento elaborado con fines docentes por: GUSTAVO LOZANO CASABIANCA Biólogo M. Sc. Profesor asociado Escuela de Nutrición y Dietética Universidad de Antioquia YOENIS GARCÍA HERRERA Biólogo M. Sc. Profesor de cátedra Escuela de Nutrición y Dietética Universidad de Antioquia SEBASTIAN GARCÍA RESTREPO Estudiante Instituto de Biología Universidad de Antioquia CLARA I. ORTIZ RAMIREZ Bióloga Estudiante de maestría en Biología Universidad de Antioquia

Estructura del ADN Tanto las proteínas como los ácidos nucleicos se consideraban como los candidatos para desempeñar la función de material genético, es más, hasta la década de 1940 muchos biólogos se inclinaban por las proteínas. Fred Griffith en 1928 llevó a cabo investigaciones sobre la transferencia de virulencia en Streptococcus pneumoniae, sentando las bases de la investigación que demostró, por primera vez, que el ADN era el material genético (5). Hirviendo bacterias virulentas e inyectándolas en ratones, Griffith comprobó que éstos no se veían afectados y que tampoco era posible recuperar neumococos de dichos animales. Posteriormente, al inyectar una combinación de bacterias virulentas muertas y una cepa de bacterias vivas no virulentas, los ratones morían y era posible recuperar bacterias virulentas vivas del cuerpo de los ratones. Griffith denotó la conversión de bacterias no virulentas en patógenos virulentos, con el término transformación (5).

Oswald T. Avery, Colin M. MacLeod y Maclyn J. McCarty (1944) se propusieron descubrir qué componente de los neumococos virulentos muertos era responsable de tal transformación. Primero destruyeron algunos componentes de extractos purificados de neumococos virulentos utilizando enzimas capaces de hidrolizar ADN, ARN o proteínas. A continuación, expusieron cepas de neumococos no virulentos a los extractos tratados. Dado que la transformación de bacterias no virulentas sólo se veía impedida cuando se destruía el ADN, esto permitió concluir que el ADN transportaba la información necesaria para la transformación, siendo ésta la primera prueba de que el ADN era el “principio transformador” de Griffith (5). La publicación de su investigación sobre la naturaleza química de un “principio transformante” en bacterias, sumado a posteriores descubrimientos por parte de otros equipos de investigación, constituyeron pruebas experimentales directas de que el ADN, y no las proteínas, era la biomolécula responsable de la herencia (5). Años después, en 1952, Alfred D. Hershey y Martha Chase desarrollaron diversos experimentos para demostrar que el ADN era el material genético en el bacteriófago T2. Es interesante señalar que en el descubrimiento se corrió con la suerte de haber seleccionado un virus ADN para su estudio, ya que en muchos virus el ARN es el material genético (5). El experimento consistió en marcar radioactivamente el ADN del virus con 32P, o la cápside proteica con 35S. Luego se mezclaron los bacteriófagos radioactivos con E. coli y se incubó la mezcla. Después de agitar y centrifugar, se determinó la radioactividad del sobrenadante y del precipitado. Descubrieron que la mayoría de la proteína radioactiva permanecía en el sobrenadante, mientras que el ADN marcado se encontraba dentro de la bacteria. Dado que se había producido la progenie de T2, el material genético se debió haber inyectado, y por lo tanto el ADN tenía que ser el que transportaba la información genética de T2 (5). En la época de las investigaciones de James Watson y Francis Crick se sabía que el ADN consistía en un polímero compuesto de cuatro nucleótidos (Ilustración 45), dos con bases púricas o purinas (Adenina [A] y Guanina [G]) y dos con bases pirimídicas o pirimidinas (Citosina [C] y Timina [T]), que estaban unidos a azúcares fosforilados. Debido al papel central del ADN como material genético, resultaba crítico vislumbrar su estructura tridimensional para entender su función (5).

Ilustración 45. Nucleótido Se ilustra la estructura del Desoxiadenosin monofosfato, un desoxirribonucleótido conformado por un azúcar de cinco carbonos (desoxirribosa), una base nitrogenada (adenina) y un grupo fosfato.

Por esto, la comprensión de la estructura, deducida en 1953, ha sido la base para la biología molecular actual. El enfoque de Watson y Crick estuvo influenciado por la descripción de Linus Pauling de las uniones por puentes de hidrógeno y la -hélice (un tipo común de estructura secundaria de las proteínas). También obtuvieron información experimental sobre la estructura del ADN por medio de los estudios de cristalografía por refracción de rayos X realizados por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin. El análisis de los datos permitió a Watson y Crick describir la molécula de ADN como una hélice compuesta por dos cadenas de ADN que da un giro cada 3.4 nm, y que la distancia entre pares de base nitrogenadas es de 0.34 nm, por lo que en cada vuelta de la hélice hay 10 pares de bases. Además, que el diámetro de la hélice es de 2 nm (6). (Ilustración 46) En cada una de las hebras de ADN, el grupo fosfato de un nucleótido se une con el azúcar del siguiente nucleótido, llevando a una sucesión de enlaces que da forma a una “columna vertebral” donde se alternan azúcares y fosfatos unidos por enlaces covalentes, y desde la cual se proyectan bases de nucleótidos (6).

Es decir, cada nucleótido de ADN consta de tres partes: un grupo fosfato, un azúcar llamado desoxirribosa y una base nitrogenada: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) o Timina (T) (2). Las bases están en el interior y orientadas de tal forma que se forman enlaces de hidrógeno entre Purinas y Pirimidinas. La adenina únicamente forma enlaces de hidrógeno con la citosina (A-T), y a su vez, la guanina solo forma enlaces con la citosina (G-C); formando los llamados “Pares de bases complementarias” (Ilustración 47). Ilustración 46. Estructura del ADN Modelo propuesto por Watson y Crick (1953) de la estructura de la doble hélice

Ilustración 47. Bases Nitrogenadas .

Esta especificidad explica los resultados previos de Erwin Chargaff, quien estudió la composición de diversos ADN encontrando que la cantidad de adenina siempre era equivalente a la de timina, y la cantidad de citosina era equivalente a la de guanina. A causa de dicha especificidad, las dos hebras de ADN son complementarias: cada hebra contiene toda la información necesaria para especificar la secuencia de bases de la otra (1). Una característica propia de la estructura del ADN es formar una doble hélice enrollada, con el esqueleto azúcar-fosfato en el exterior y las bases nitrogenadas en el interior de la molécula. Además, las dos hebras de la doble hélice de ADN están orientadas en direcciones opuestas o antiparalelas, es decir, una hebra tiene un grupo fosfato unido al carbono 5 del azúcar, pero que no se une a otro nucleótido en la parte superior y un azúcar que tiene el carbono 3 libre en la parte inferior (es decir que no se une a otro nucleótido), mientras que en la otra hebra ocurre lo contrario (en otras palabras una corre en dirección 3’→5’ y la otra en dirección 5’→3’) (6) (Ilustración 48).

Ilustración 48. Cadenas complementarias de ADN

Cromosomas y Cromatina Los genomas de los eucariotas están compuestos por múltiples cromosomas, cada uno de los cuales contiene una molécula de ADN lineal. Aunque el número y el tamaño de los cromosomas varían considerablemente entre especies, su estructura básica es la misma en todos los eucariotas (7). El ADN de las células eucariotas está fuertemente unido a unas pequeñas proteínas básicas llamadas histonas que empaquetan el ADN de manera ordenada en el núcleo de la célula (7). Estos complejos de ADN e histonas forman la cromatina, esta contiene el doble de proteínas que de ADN (7).

El empaquetamiento del ADN con las histonas produce una fibra de cromatina aproximadamente de 10 nm, esta fibra presenta la apariencia de un collar que sugiere el modelo del nucleosoma (7). Empaquetar el ADN en una fibra de cromatina de 10 nm reduce su longitud aproximadamente seis veces. La cromatina se puede condensar aún más para formar fibras de 30 nm, resultando en una condensación total de una 50 veces (7). Las interacciones de las histonas son importantes en la condensación de la cromatina, esto es crítico para determinar la accesibilidad del ADN cromosómico en procesos como la replicación y transcripción del ADN (7). El grado de condensación de la cromatina varía durante el ciclo celular y juega un papel importante en la expresión génica (2). En células en interfase (sin dividirse), la mayoría de la cromatina, llamada eucromatina, se encuentra relativamente sin condensar y distribuida por todo el núcleo (7), esto permite que los genes sean trascritos para la preparación a la división celular. De forma contraria la heterocromatina, se encuentra en un estado muy condensado, estas hebras de ADN son transcripcionalmente inactivas y altamente repetidas como aquellas que se presentan en los centrómero y en los telómeros (7). El centrómero es la región central del cromosoma, cuya función es asegurar la correcta distribución de los cromosomas duplicados a las células hijas durante la mitosis (7). Por lo tanto, los centrómeros actúan como sitios de asociación de las cromátidas hermanas y como sitios de unión para los microtúbulos del huso mitótico (7). Los centrómeros son secuencias específicas de ADN a las que se unen numerosas proteínas de unión que forman el cinetocoro (7), así la unión de los microtúbulos al cinetocoro dirige la unión de los cromosomas al huso mitótico en la división celular (7). Mientras que los telómeros, son secuencias de ADN situadas al final de los cromosomas eucariotas y desempeñan un papel crítico en la replicación y el mantenimiento de la estabilidad cromosómica (7).

Replicación del ADN La replicación del ADN es un proceso semiconservativo en el que cada hebra “parental” sirve como molde para síntesis de una nueva hebra “hija” complementaria (1). La replicación de una molécula de ADN comienza en sitios especiales llamados orígenes de replicación (3). El cromosoma bacteriano, que es circular, tiene un único origen de replicación, un tramo de ADN con una secuencia de nucleótidos especifica. Las proteínas que inician la replicación del ADN reconocen esta

secuencia y se fijan al ADN separando las dos cadenas y abriendo una “burbuja” de replicación (3). La replicación del ADN progresa entonces en ambas direcciones hasta que se copia la molécula entera (3). En contraste un cromosoma eucariótico puede tener cientos o miles de orígenes de replicación. Se forman burbujas de replicación múltiples que después se fusionan, acelerando de este modo la copia de las moléculas de ADN (3). En cada extremo de una burbuja de replicación hay una horquilla de replicación, una región en forma de “Y” donde están creciendo nuevas cadenas de ADN (3). La elongación de la cadena nueva de ADN en la horquilla de replicación se cataliza por enzimas denominadas ADN polimerasas (3). A medida que los nucleótidos individuales se alinean con nucleótidos complementarios a lo largo de la cadena molde de ADN, la ADN polimerasa los añade, uno a uno, al extremo en crecimiento de la nueva cadena de ADN (3). Cada nucleótido que se añade a una cadena de ADN en crecimiento es un nucleótido trifosfato, esto es, un nucleósido (una azúcar y una base) con tres grupos fosfatos (3), al momento de la unión se separan dos grupos fosfato de manera que cada nucleótido del ADN posee un solo grupo fosfato. Como se mencionó anteriormente las dos cadenas de ADN son antiparalelas, lo que significa que se orientan en direcciones opuestas una de otra (3). La ADN polimerasa agrega nucleótidos solo al extremo 3’ libre de una cadena de ADN en crecimiento, nunca al extremo 5’ (3). De este modo una cadena de ADN nueva se puede alargar solo en la dirección 5’→3’ (3). En bacterias la ADN polimerasa III (ADN Pol III), se acomoda simplemente en la horquilla de replicación sobre la cadena molde y agrega nucleótidos de forma continua a la cadena complementaria a medida que la horquilla progresa. La cadena de ADN sintetizada por medio de ese mecanismo se llama hebra líder (3). Para elongar la otra cadena nueva de ADN en la dirección obligatoria 5’→3’, la ADN Pol III debe actuar a lo largo de otra cadena molde en dirección contraria a la horquilla de replicación (3). La cadena de ADN sintetizada en esta dirección se denomina hebra retrasada, esta hebra se sintetiza con una serie de segmentos (3). Una vez que la burbuja de replicación se abre lo suficiente, una molécula de ADN Pol III se adhiere al molde de la cadena retrasada y se aleja de la horquilla de replicación, para sintetizar un segmento corto de ADN (3). A medida que crece la burbuja se puede elaborar otro segmento de la hebra retrasada de una manera similar, estos segmentos de la hebra retrasada se llaman fragmentos de Okazaki, en honor al japonés que lo descubrió (3). Los fragmentos tienen de 1000 a 2000

nucleótidos de longitud en E. coli y de 100 a 200 en eucariotas (3). Otra enzima, la ADN ligasa, finalmente une o liga los fragmentos de Okazaki y forma una cadena de ADN nueva (3). Ilustración 49. Replicación del ADN

Las ADN polimerasas no pueden iniciar la síntesis de un polinucleótido; solo puede añadir nucleótidos al extremo 3’ de una cadena ya existente que esta apareada con las bases de la cadena molde (3). La cadena de nucleótidos inicial es un segmento corto llamado cebador o primer, que es un segmento corto de ARN con un extremo 3’ disponible (3). Una enzima denominada primasa puede comenzar una cadena de ARN desde el principio. La primasa une los nucleótidos de ARN de uno por vez y sintetiza un cebador complementario de la cadena molde en el lugar donde se producirá la iniciación de la nueva cadena de ADN (3). Luego al ADN pol III añade un nucleótido de ADN al extremo 3’ del cebador de ARN y continúa agregando nucleótidos a la cadena de ADN en crecimiento de acuerdo con las reglas del apareamiento de bases (3). Solo se requiere un cebador para que la ADN Pol III comience a sintetizar la cadena líder, pero para sintetizar la cadena retrasada, cada fragmento de Okasaki debe cebarse por separado (3). Otra enzima llamada la ADNPol I, sustituye los nucleótidos de ARN de los cebadores con versiones de ADN añadiendo uno a uno sobre el extremo 3’ del fragmento de Okasaki adyacente; posteriormente la ADN ligasa une los esqueletos de azúcar-fosfato de todos los fragmentos de Okazaki en una cadena continua de ADN (3).

La helicasa es una enzima que desenrolla la doble hélice en la horquilla de replicación y separa las dos cadenas parentales para que estén disponibles como cadena molde (3). Este desenrollamiento genera un enrollamiento más tenso y tensión por delante de la horquilla de replicación y la topoisomerasa ayuda a aliviar esta tensión. Después de que la helicasa separa las dos hebras parentales, las moléculas de la proteína de unión a cadena simple se unen a las cadenas desapareadas del ADN para estabilizarlas hasta que sirva como molde para la síntesis de las nuevas cadenas complementarias (3). Tabla 8. Proteínas involucradas en la Replicación. Proteína

Función en las hebras líder y retrasada

Helicasa

Desenrolla la doble hélice parental en la horquilla de replicación

Proteínas de unión a cadena simple

Se unen y estabilizan el ADN de cadena simple hasta que pueda emplearse como molde

Topoisomerasa

Corrige el sobreenrollamiento delante de la horquilla de replicación, rompiendo, girando y uniendo de nuevo las cadenas de ADN

Tabla 9. Proteínas de la replicación del ADN y sus funciones. Proteínas

Función en la hebra líder

Función en hebra retrasada

Primasa

Sintetiza un cebador de ARN en el extremo 5’ de la hebra líder

Sintetiza un cebador de ARN en el extremo 5’ de cada fragmento de Okazaki

ADN polimerasa III

En baterías, sintetiza la hebra líder en forma continua, añadiéndola al cebador

Alarga el fragmento de Okazaki y lo añade a su cebador

ADN polimerasa I

En bacterias, elimina el cebador del extremo 5’ de la hebra líder y lo reemplaza con ADN,

Elimina el cebador del extremo 5’ de cada fragmento y lo reemplaza con ADN para añadirlo al

ADN ligasa

añadiéndolo al extremo 3’ adyacente

extremo 3’ del fragmento adyacente

Une el extremo 3’ del ADN que reemplaza el cebador al resto de la hebra líder

Une los fragmentos de Okazaki

La enzima principal implicada es la ADN polimerasa, que cataliza la unión de los desoxirribonucleótidos (5’-trifosfato, dNTP) para formar la cadena de ADN en crecimiento (1). ADN polimerasa: Se identificó por primera vez en E. coli por Arthur Kornberg en 1956. La capacidad de esta enzima para copiar exactamente una hebra molde de ADN proporciona una base bioquímica para la replicación del ADN. Horquilla de replicación: Las moléculas de ADN en proceso de replicación se analizaron por primera vez por John Cairns en experimentos con E. coli (1). La horquilla de replicación representa las regiones de la síntesis activa del ADN, en cada horquilla las hebras se separan y son sintetizadas dos nuevas hebras hijas (1).

Diferencias en la Replicación del ADN en eucariotas A pesar de que la replicación del ADN sigue los mismos pasos (es semiconservativa y bidireccional, se separan las cadenas, se necesitan cebadores, se sintetizan las nuevas cadenas mediante polimerasas, etc), las diferencias estructurales entre los cromosomas de procariotas y eucariotas, y su bioquímica diferente, el proceso y las enzimas también son un poco diferentes (8). En las bacterias existe un solo origen de replicación. Ya que el ADN procariota es una molécula circular, a partir de este único punto, la replicación avanza en ambas direcciones hasta que se replica toda la molécula. Cuando la duplicación se está llevando a cabo, es cuando se pueden observar las burbujas de replicación (8). En eucariotas el ADN no es una sola molécula circular, sino que está formado por un número variable de hebras independientes. Cada una de ellas forma un cromosoma durante la división celular. Por esto, y debido a la mayor cantidad de ADN que poseen y a que está repartido en varias moléculas de ADN distintas, los

eucariotas tienen muchos orígenes de la replicación (a diferencia de los procariotas) (8). En E. coli existen tres ADN polimerasas, (I, II y III). La ADN polimerasa III sintetiza las nuevas cadenas de ADN. En eucariotas existen otros tipos de ADN polimerasas (8). En eucariotas, los fragmentos de Okazaki son más cortos, y la velocidad de elongación más lenta que en procariotas. Además el control sobre la regulación es más complejo y estricto ya que solo debe haber una replicación del material hereditario en cada ciclo celular (8). En procariotas, al ser el ADN una sola molécula y circular, la replicación dura hasta que ambos extremos de la burbuja se encuentran. En eucariotas ocurre lo mismo, pero en los extremos de la molécula hay un inconveniente. Al final las nuevas moléculas de ADN quedan con un extremo 3’ que no puede ser replicado por las ADN polimerasas celulares. Esto resultaría en un acortamiento progresivo de los cromosomas tras cada ciclo de replicación. Para evitarlo, los eucariotas han desarrollado una estrategia que consiste en elongar los extremos de los ADN 3’ protuberantes de manera que no queden secuencias importantes del cromosoma sin replicar (8).

REFERENCIAS 1. Cooper G, Hausman R. La célula. 5a ed. Madrid: Marbá Libros, S.L; 2011. 2. Audesirk T. Biología la vida en la tierra. 6a ed. México: Pearson Educación; 2003. 3. Cambell, NA. Biología. 7a ed. Madrid: Editorial Médica Panamericana; 2007.

4. Prescott LM, Harley JP, Klein DA. Microbiología. 7a ed. España: McGraw Hill; 2009. 5. Klug WS, Cummings MR, Spencer CA. Conceptos de Genética. 8a ed. Madrid: Pearson Educación; 2006. 6. Audesirk T, Audesirk G, Byers BE. Biología, la vida en la tierra, con fisiología. 9a ed. México: Pearson Educación de México, S.S de C.V; 2012. 7. Jiménez, LF. Conocimientos Fundamentales de Biología. Volumen 1. México: Pearson Educación; 2006. 8. Diferencias en la replicación de procariotas y eucariotas. [Citado Julio 26 de 2015]. Disponible en: http://www.mas-que-ciencia.com/diferencias-replicacion-procariotas-eucariotas/