Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau
“Tumor-infiltrierende Lymphozyten beim Glioblastoma multiforme”
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von Christian Beyer aus Hersbruck
Gedruckt mit Erlaubnis der Med izi n ischen Faku ltät der Fri edri ch -Alexander-U n iversität Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. G. G. Grabenbauer
Korreferent:
Prof.
Tag der mündlichen Prüfung:
10. Februar 2010
Dr. R. J. Fietkaus
3
1.
Zusammenfassung .............................................................................................. 5 1.1.
Englisch........................................................................................................ 5
1.2.
Deutsch ........................................................................................................ 8
2.
3.
Einleitung ....................................................................................................... 11 2.1.
Das Glioblastoma multiforme - Epidemiologie, Therapie und Prognose. 11
2.2.
Tumor-infiltrierende, inflammatorische Zellen im GBM ........................... 12
2.3.
Lokale und globale Immunsuppression in Patienten mit GBM................ 16
2.4.
Ziele der Untersuchungen ...................................................................... 20
Material und Methoden...................................................................................... 22 3.1.
3.1.1.
Auswahl des Patientenkollektivs ......................................................... 22
3.1.2.
Anfertigung der Tissue Micro Arrays® ................................................. 22
3.1.3.
Färbung relevanter Lymphozytensubpopulationen ............................. 24
3.1.4.
Bildanalytisch-gestützte Auswertung mit BIOMAS® ............................ 25
3.1.5.
Statistische Analyse ............................................................................ 28
3.2.
4.
Immunhistochemische Untersuchungen .................................................... 22
Chemokinetischer Migrations-Assay .......................................................... 29
3.2.1.
Das Prinzip der 2-dimensionalen Boyden-Chamber ........................... 29
3.2.2.
Isolation der Lymphozytensubpopulationen ........................................ 37
3.2.3.
Herstellung der Tumorüberstände....................................................... 39
Ergebnisse ........................................................................................................ 42 4.1.
Immunhistochemische Untersuchungen .................................................... 42
4.1.1.
Auswertung der klinischen Daten........................................................ 42
4.1.2.
Anzahl und Lokalisation Tumor-infiltrierender Lymphozyten im GBM . 49
4.1.3.
Prognostische Bedeutung der Tumor-infiltrierenden Lymphozyten..... 55
4.2.
Ergebnisse aus Chemotaxis-Untersuchungen ........................................... 67
4.2.1.
Konzentrationsausgleich in der Boyden-Chamber .............................. 67
4.2.2.
Charakterisierung der Primärzelllinien ................................................ 67
4.2.3.
Calcein zur Detektion migrierter Zellen ............................................... 71
4.2.4.
Einfluss der Migrationszeit auf die Migration ....................................... 73
4.2.5.
Einfluss des Kulturmediums auf die Migration..................................... 75
4.2.6.
Migration auf A172- und LN18-Überstände......................................... 79
4.2.7.
Migration auf Primärüberstände .......................................................... 80
5.
Diskussion ......................................................................................................... 86
6.
Abkürzungsverzeichnis...................................................................................... 95
4 7.
Literaturverzeichnis ........................................................................................... 96
8.
Danksagung .....................................................................................................102
9.
Curriculum vitae ...............................................................................................103
5 1. Zusammenfassung 1.1. Englisch Scientific background: In the early 70’s of the last century, researchers identified different subtypes of tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) with diffuse and perivascular infiltration patterns in malignant gliomas (MG). Subsequent studies investigated the role of TIL as prognostic biomarkers in patients with MG. Since the results of these studies were conflicting, the prognostic value of lymphocytic tumour infiltration in MG remained unknown: Some researchers showed that TIL were positive prognostic markers, while others demonstrated that increased lymphocytic tumour infiltration was associated with poor prognosis. Few studies did not observe any prognostic role of TIL in MG at all. The discovery of the FoxP3+ regulatory T-cells (Treg) and their key role in tumour immunology prompted us and other researchers to re-evaluate the prognostic role of TIL in MG. First results demonstrated that Treg might be involved in the defective cellular immune system of patients with MG. Thus, by causing local immunosuppression in the tumour side, Treg could promote tumour progression and worsen the prognosis of patients with MG. In this context, differences in numbers of Treg might explain the conflicting results of the early studies on TIL in MG, when Treg had still been unknown. Therefore, we wanted to re-evaluate the prognostic impact of Treg in MG and identify mechanisms of Treg and TIL attraction by MG tumour cells, which might escape the anti-tumour immune response with the help of immunosuppressive Treg. Methods: The Tissue Micro Array® (TMA®)-technique was performed for immunhistochemistry analysis of 77 patients with glioblastoma multiforme (GBM), the WHO-grade IV-variant of MG. TMA®-slices were stained against CD3, CD8, CD20, CD34, CD68, FoxP3, and MIB1. Slices were evaluated with computerassisted microscopy; data on tumour cell counts, numbers of TIL and tissue vascularisation were collected for each patient. In addition to cell counts, distances from cells to vessels were evaluated. The Tumorzentrum (TUZ) Erlangen provided clinical data, including information about overall survival, age, and ECOG-index of patients at diagnosis. Cox’s
6 regression and Kaplan-Meier-estimator with log rank test were performed to study the prognostic role of TIL and tumour vascularisation for the overall survival of patients. In addition to the immunhistochemistry analysis, migration of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), CD8+ T-cells and Treg towards supernatants from GBM tumour cells was studied in a modified Boyden chamber. Migrating immune cells were isolated from the peripheral blood of healthy individuals and separated with Miltenyi Biotech MicroBeads®. Tumour supernatants were produced by established GBM cell lines as well as by primary GBM tumour cell lines. Furthermore, tumour cells were treated with radiation and/or temozolomide during the production of supernatants to examine the impact of anti-neoplastic therapy on tumour infiltration by TIL. Results: The number of neither Treg nor CD3+, CD8+, and CD20+ TIL were important prognostic markers for the overall survival of patients with GBM. In contrast, high numbers of CD68+ microglia/macrophages were associated with a prolonged survival of patients. Interestingly, the Treg/CD68-ratio was of prognostic relevance and prolonged survival occurred with high Treg/CD68-ratios. Dense tumour vascularisation was a positive prognostic marker for patients’ survival, whereas high tumour cell counts were associated with a poor prognosis in patients with GBM. Distances of TIL to blood vessels did not show any prognostic importance. In the Boyden chamber assay, migration of lymphocytes towards supernatants of established tumour cells was inconsistent and dependent on the TIL subpopulation and the supernatant. In primary cell lines, migration depended on the specific tumour supernatant of treated or untreated tumour cells. Tumour supernatants from primary tumour cells that were pre-treated with radiation and temozolomide generally enhanced lymphocytic migration. Conclusion: The findings from both immunohistochemistry analysis and Boyden chamber assays suggest that Treg and TIL might play an important role in tumour progression and could help to establish the prognosis of patients with GBM. Many
7 results of this study, however, seem to be conflicting, which may be due to the complex nature of tumour immunology in MG and GBM. To further elucidate the role of Treg and TIL in MG, future studies need to mimic the tumour microenvironment in detail.
8 1.2. Deutsch Wissenschaftlicher Hintergrund: Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) in malignen Gliomen (MG) wurden seit den frühen 70er Jahren des vergangenen Jahrhunderts intensiv beforscht. Dabei zeigte sich, dass TIL diffus im Tumorgewebe oder dicht um die Gefäße lokalisiert sind. Nachfolgende Studien untersuchten das Überleben von Patienten mit MG in Abhängigkeit von der Infiltration des Tumors durch Lymphozyten. Da die Ergebnisse strittig waren, blieb die prognostische Bedeutung der TIL in MG weitestgehend unbekannt. TIL in MG erwiesen sich in unterschiedlichen Studien sowohl als positive als auch als negative prognostische Faktoren für das Überleben der Patienten. Einige Autoren kamen zu dem Ergebnis, dass TIL keine prognostische Bedeutung für das Gesamtüberleben der Patienten hätten. Mit der Entdeckung der FoxP3+, regulatorischen T-Zellen (Treg) und ihrer bedeutenden
Rolle
in
der
Tumorimmunologie,
mussten
die
bisherigen
Beobachten zu TIL in MG neu bewertet werden. Erste Studien wiesen nach, dass Treg an der eingeschränkten zellulären Immunantwort von Patienten mit MG beteiligt sind. Da Treg auch eine lokale Immunantwort im Tumor verursachen, könnten sie zur Tumorprogression beitragen und die Prognose der Patienten verschlechtern. Des Weiteren könnten Unterschiede in der Anzahl der Treg die strittigen Ergebnisse der frühen Studien, als Treg noch unbekannt gewesen waren, erklären. Folglich war das Hauptaugenmerk der vorliegenden Arbeit, die prognostische Bedeutung der TIL in MG nochmals zu untersuchen. Außerdem sollten Mechanismen erforscht werden, die zur chemotaktischen Anlockung von TIL und Treg durch Tumorzellen maligner Gliome führen und damit den Tumorzellen ein Immunprivileg verschaffen könnten. Methoden: Die immunhistochemische Untersuchung der Tumorproben von 77 Patienten mit Glioblastoma multiforme (GBM), der WHO-Grad 4-Variante maligner
Gliome,
wurde
mittels
Tissue
Micro
Array
(TMA)®-Verfahren
durchgeführt. Die TMA® wurden gegen CD3, CD8, CD20, CD34, CD68, FoxP3 und MIB1 gefärbt. Mittels computer-gestützter Bildanalyse wurden die Anzahl der Tumorzellen, die Anzahl der TIL sowie die Tumorvaskularisierung für jeden
9 Patienten erfasst. Zudem wurden die Distanzen von Tumorzellen und TIL zu den Gefäßen ermittelt. Die klinischen Patientendaten, inklusive des Gesamtüberlebens, Alters und ECOG-Index zum Diagnosezeitpunkt, wurden vom Tumorzentrum (TUZ) des Universitätsklinikums Erlangen zur Verfügung gestellt. Die prognostische Bedeutung der TIL und der Tumorvaskularisierung für das Gesamtüberleben der Patienten wurde mittels Cox Regression und Kaplan-Meier-Schätzer statistisch überprüft. Neben den immunhistochemischen Untersuchungen, wurde in einer modifizierten Boyden Chamber die Migration peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC), CD8+ T-Lymphozyten und regulatorischer T-Zellen auf Überstände von GBMTumorzellen untersucht. Die Immunzellen wurden aus dem peripheren Blut gesunden Probanden isoliert und mit MicroBeads® isoliert. Tumorüberstände wurden
von
etablierten
abgenommen.
Zudem
GBM-Zelllinien
wurden
und
Tumorzellen
von mit
GBM-Primärkulturen
Bestrahlung
und/oder
Chemotherapie mit Temozolomid vorbehandelt, um einen möglichen Einfluss der Tumortherapie auf die lymphozytäre Tumorinfiltration herauszufinden. Ergebnisse: Tumor-infiltrierende Treg, CD3+, CD8+, und CD20+ Lymphozyten waren nicht von prognostischer Bedeutung für das Überleben der GBM-Patienten. Dagegen
war
eine
Mikroglia/Makrophagen
mit
hohe einem
Anzahl
Tumor-infiltrierender
verlängerten
Überleben
der
CD68+ Patienten
assoziiert. Erstaunlicherweise war der Treg/CD68-Quotient von prognostischer Bedeutung. Ein hoher Treg/CD68-Quotient war mit einem verlängerten Überleben assoziiert. Eine erhöhte Tumorvaskularisierung war ein positiv prognostischer Faktor für das Überleben der Patienten, wohingegen sich eine erhöhte Tumorzelldichte negativ auf die Prognose der Patienten auswirkte. Abstände von TIL und Blutgefäßen waren ohne Bedeutung für die Prognose der Patienten. Die Migration von Lymphozyten auf Tumorüberstände in der Boyden chamber war nicht einheitlich, sondern abhängig von der TIL-Subpopulation und den verwendeten Überständen. Bei den Überständen von Primärkulturen schien die
10 Migration in erster Linie von der Tumorzelllinie und deren Behandlung abhängig, aber
unabhängig
von
den
migrierenden
Immunzellen.
Nach
Kombinationsbehandlung der Tumorzellen mit Bestrahlung und Temozolomid war die Migration auf den entsprechenden Tumorüberstand üblicherweise erhöht. Schlussfolgerung:
Die
Erkenntnisse
aus
den
immunhistochemischen
Untersuchungen und den Migrationsversuchen lassen vermuten, dass die Treg und TIL die Tumorprogression und damit das Überleben von Patienten mit GBM wesentlich beeinflussen können. Dennoch scheinen einige Ergebnisse dieser Studie widersprüchig, was an den komplexen Zusammenhängen in der Tumorimmunologie von MG und GBM liegen könnte. Zukünftige Studien sollten deshalb versuchen, das Tumormilieu noch detailgetreuer nachzustellen, um die Rolle der Treg und der TIL in malignen Gliomen weiter aufklären zu können.
11 2. Einleitung 2.1. Das Glioblastoma multiforme - Epidemiologie, Therapie und Prognose Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der häufigste und zugleich bösartigste Tumor astrozytären Ursprungs. Mehr als 50 % aller Gliome und 10 bis 12 % aller primären Hirntumore des Erwachsenenalters sind Glioblastome. Die Inzidenz für Nordamerika und Europa beträgt zwei bis drei pro 100 000 (Deckert et al. 2001). Die Behandlung von Glioblastompatienten erfolgt interdisziplinär und umfasst Chirurgie, Strahlen- und Chemotherapie. Im Anschluss an die Resektion des Tumors
erhalten
Glioblastompatienten
eine
simultane
und
adjuvante
Radiochemotherapie. Patienten mit nicht resektablen GBM werden primär radiochemotherapiert. Der Therapiestandard für die Radiochemotherapie wurde in einer großen Multicenter-Studie von Stupp etabliert (Stupp et al. 2006; Stupp et al. 2005). Die lokale Gesamtdosis der Radiotherapie beträgt dabei 60 Gy, die normofraktioniert in 30 Einzelbestrahlungen, zu je 2 Gy, mit wöchentlich fünf Bestrahlungstagen, über sechs Wochen appliziert wird. Das Alkylans Temozolomid (Temodal®) ist Mittel der Wahl bei der simultanen und adjuvanten systemischen Therapie. Die individuelle Dosierung wird über die Körperoberfläche des Patienten berechnet. Während der Strahlentherapie erhalten die Glioblastompatienten täglich 75 mg Temozolomid, an allen sieben Tagen pro Woche. Nach Beendigung der simultanen Radiochemotherapie folgen im Einmonatsabstand sechs Zyklen adjuvante Chemotherapie mit jeweils 150 bis 200 mg Temozolomid an fünf Tagen. Temozolomid (TMZ) ist ein Prodrug, das spontan in seine Wirkform 5-(3methyltriazen-1-yl)imidazole-4-carboxamide (MTIC) hydrolysiert. Es wird oral appliziert und besitzt eine Bioverfügbarkeit von nahezu 100 % (Weller et al. 2005). Temozolomid kann die Blut-Hirn-Schranke gut passieren und die Konzentration im Liquor beträgt circa 20 % der Plasmakonzentration (Ostermann et al. 2004). Seine antineoplastische Wirkung beruht auf der Alkylierung der DNS an der O6-Position des Guanins. Gesunde Körperzellen wie auch Tumorzellen können
mit
Hilfe
des
DNS-Reparaturenzyms
O6-Methylguanin-DNS-
Methyltransferase (MGMT) diese Läsion reparieren. Der Therapieerfolg bei der
12 Behandlung mit Temozolomid ist daher von der MGMT-Aktivität in den Tumorzellen
abhängig,
wobei
eine
niedrige
MGMT-Aktivität
in
den
Glioblastomzellen ein besseres Ansprechen auf Temozolomid ermöglicht. Als klinischer
Biomarker
wurde
die
Bestimmung
des
MGMT-Promotor-
Methylierungsstatus am resezierten GBM-Gewebe etabliert. Ist der MGMTPromotor wie bei circa 20 bis 30 % aller GBM-Patienten methyliert, dann spricht das für eine niedrige MGMT-Aktivität in den Tumorzellen, ein gutes Ansprechen auf Temozolomid und eine bessere Prognose (Stupp 2006; Stupp 2005). Glioblastomzellen infiltrieren diffus in das umgebende, gesunde Gewebe, weshalb das GBM nicht im Gesunden reseziert werden kann und letztendlich jeder Patient ein Rezidiv erfährt. Bei adjuvanter Radiochemotherapie mit Temozolomid beträgt das mittlere Überleben 14,6 Monate, das Zweijahresüberleben 26,5 % (Stupp 2005). Die Einführung von Temozolomid verbesserte insbesondere das Zweijahres- sowie das Langzeitüberleben. Als Langzeitüberleber werden beim GBM diejenigen Patienten bezeichnet, die drei Jahre nach Diagnosestellung noch am Leben sind. Circa 3 bis 5 % aller Glioblastompatienten sind Langzeitüberleber. Bisher sind drei prognostisch Faktoren bekannt, die Langzeitüberleber auszeichnen: Ein junges Lebensalter (< 40 Jahre), ein hoher Karnofsky Performance Score (Median = 80) und die Methylierung des MGMT-Promotors (Hegi et al. 2005; Krex et al. 2008). Das Langzeitüberleben wird durch diese drei Prognosefaktoren jedoch nicht hinreichend erklärt. Beispielsweise zeichnen sich nicht alle Langzeitüberleber durch einen methylierten MGMT-Promotor aus. Umgekehrt sprechen manche Patienten mit inaktiviertem Reparaturenzym schlecht auf die Therapie mit Temozolomid an (Krex and Schackert 2008). Es muss also weitere biologische Faktoren geben, die den Therapieverlauf günstig beeinflussen und das Überleben von GBM-Patienten verlängern.
2.2. Tumor-infiltrierende, inflammatorische Zellen im GBM Bereits zu Beginn des letzten Jahrhunderts erkannte William Coley, ein Chirurg aus New York, dass das menschliche Immunsystem einen kritischen Einfluss auf
13 die Entwicklung neoplastischer Erkrankungen nehmen kann (Old 1996). Er beobachtete bei einigen seiner Patienten die spontane Regression von Sarkomen nach vorausgegangener bakterieller Infektionserkrankung (Coley 1991). Im Jahr 1929 stellte Pearl an Autopsien am Johns Hopkins Hospital fest, dass Patienten, die unter Lebzeiten an Tuberkulose litten, seltener an Krebs erkrankten (Pearl 1929). Erste Versuche der Tumorvakzinierung mit dem Bacille de Calmette et Guérin (BCG), das damals bereits verfügbar war, blieben jedoch erfolglos (Guerin 1957). Erst 1976 gelang es BCG zur Tumorimmuntherapie erfolgreich einzusetzen. Morales provozierte mittels intravesikaler BCG-Instillation eine lokale Immunreaktion, die die Rezidivrate des Blasenkarzinom nachhaltig zu senken vermochte (Morales et al. 1976). Wenige Jahre vorher hatte man schon erste detaillierte Studien an der Tumorimmunologie verschiedener neoplastischer Läsionen, so auch maligner Gliome (MG), durchgeführt. In diese Studien waren neben Glioblastomen auch anaplastische
Astrozytome
eingeschlossen
worden,
Tumore
astrozytären
Ursprungs, aus denen sich ein GBM entwickeln kann (Wen et al. 2008). Diese ersten Untersuchungen beschäftigten sich überwiegend mit der histologischen Analyse Tumor-infiltrierender, inflammatorischer Zellen (Bertrand I 1960). Obwohl es
sich
bei
den
Tumor-infiltrierenden,
inflammatorischen
Zellen
nicht
ausschließlich um Immunzellen lymphozytären Ursprungs handelt, hat sich dennoch der Begriff Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) etabliert. Die lymphozytäre Infiltration des Tumorgewebes und die gegen die Tumorzellen gerichtete Immunantwort stellen die Endstrecke einer mehrstufigen antigenspezifischen Immunantwort in einem peripheren Gewebe dar (Banchereau et al. 1998). Die Untersuchung antigen-spezifischer Immunantworten im Gehirn erfordert die Berücksichtigung einiger immunologischer Besonderheiten, wie zum Beispiel der Bedeutung der Mikroglia, der Barrierefunktion der Blut-Hirn-Schranke oder dem Fehlen von Lymphgefäßen und lymphatischen Organen (Mrass et al. 2006). Dennoch scheint die antigen-spezifische Immunantwort bei malignen Hirntumoren gleichen Prinzipien wie in anderen peripheren Organen zu gehorchen: Antigenpräsentierende, dendritische Zellen nehmen tumorspezifische Antigene
14 auf.
Die
antigenbeladenen,
dendritischen
Zellen
gelangen
über
den
Subarachnoidalraum entlang der Hirnnerven und durch die Lamina cribriforme zur Nasenschleimhaut, wo sie sich dem lymphatischen System anschließen. In den Halslymphknoten präsentieren sie die Tumorantigene und bewirken die Aktivierung naiver Immunzellen zu Effektorzellen. Die aktivierten Effektorzellen gelangen schließlich über verschiedene Wege ins Hirngewebe. Intraparenchymal finden sich anschließend sowohl zelluläre als auch humorale Abwehrreaktionen des adaptiven Immunsystems gegen die Tumorzellen maligner Gliome. Das angeborene Immunsystem scheint ebenfalls in die immunologische Tumorabwehr maligner Gliome involviert. Eine detaillierte Übersicht über die zahlreichen Untersuchungen, die zur Aufdeckung antigenspezifischer Immunantworten bei den MG beitrugen wurde von Dunn erstellt (Dunn et al. 2007). Zahlreiche Studien beschäftigten sich bereits mit der histologischen und immunhistochemischen Charakterisierung der TIL im Glioblastoma multiforme und in malignen Gliomen. Die TIL sind häufig um die zahlreichen Blutgefäße lokalisiert, ein diffuses Verteilungsmuster ist selten (Ridley et al. 1971). 28 bis 37 % aller malignen Gliome zeichnen sich durch perivaskuläre, lymphozytäre Infiltrate aus (Bertrand et al. 1960; Ridley and Cavanagh 1971; Takeuchi et al. 1976). Die Ergebnisse zur phänotypischen Charakterisierung der TIL in malignen Gliomen divergieren
stark,
was
auf
methodische
Unterschiede
in
den
verschiedenen Studien zurückzuführen ist (Dunn 2007). Hitchcock und Morris fanden in 15 MG durchschnittlich 4 % cluster of differentiation (CD)4+ und 10 % CD8+ Lymphozyten, sowie über 20 % Makrophagen, gemessen an der Gesamtzahl der analysierten Zellen (Hitchcock et al. 1988). Farmer detektierte 42 % CD4+ und 41 % CD8+ Zellen innerhalb der TIL von neun MG (Farmer et al. 1989). Die Ergebnisse aus weiteren Untersuchungen waren ebenfalls inkonsistent (Paine et al. 1986; Phillips et al. 1982; Saito et al. 1988; Yasuda et al. 1983; Yu et al. 2003). Makrophagen und Mikroglia stellen den größten Anteil an Immunzellen in MG, jedoch ist ihre Bedeutung für die Tumorimmunologie noch unklar (Dunn 2007). Ältere Studien fanden 20 bis 30 % Makrophagen und Mikroglia gemessen an der Gesamtzellzahl (Hitchcock and Morris 1988; Morimura et al. 1990; Nishie et al.
15 1999; Roggendorf et al. 1996). Hussain konnte mittels flußzytometrischer Untersuchungen durchschnittlich 0,825 % CD45+, CD11b+ und CD11c+ Mikroglia und Makrophagen in Resektionspräparaten detektieren (Hussain et al. 2006). Der zu den älteren Studien vergleichsweise niedrige Anteil an Mikroglia und Makrophagen ist am ehesten auf methodische Unterschiede zurückzuführen: Die gleichzeitige,
flußzytometrische
Detektion
mehrere
für
Mikroglia
und
Makrophagen spezifischer Oberflächenantigene führte zu einer restriktiven Selektion positiver Zellen. Die prognostische Bedeutung der TIL in malignen Gliomen wurde bereits intensiv beforscht, jedoch sind die Ergebnisse nicht konsistent (Dunn 2007). In den Untersuchungen von Brooks korrelierten perivaskuläre Infiltrate mit einem längeren Überleben von Patienten mit GBM oder anaplastischen Astrozytom (Brooks et al. 1978). Patienten, deren Hirntumore perivaskuläre Infiltrate aufwiesen, überlebten durchschnittlich zwei bis vier Monate länger. Diffuse Infiltration des Hirntumors hatte hingegen keinen signifikanten Effekt auf das Überleben (Brooks 1978). Zwei weitere Studien von Palma und von Böker konnten den prognostisch günstigen Effekt der TIL im GBM bestätigen (Boker et al. 1984; Palma et al. 1978). Palma teilte 200 Patienten in drei Gruppen, nämlich Patienten deren MG deutliche (23 / 200), schwache (46 / 200) oder keine (131 / 200) perivaskulären, lymphozytären
Infiltrate
zeigten.
Patienten
mit
deutlich
ausgeprägten
perivaskulären Infiltraten überlebten signifikant länger (p < 0,01). Fünf Patienten aus dieser Gruppe waren sechs Jahre nach der Operation noch am Leben, während in den beiden anderen Gruppen kein Patient so lange überlebte (Palma 1978). Diese Studie wurde 1978 veröffentlicht, als die Bedeutung von Temozolomid und MGMT noch nicht bekannt war. Sie könnte ein wichtiger Hinweis dafür sein, dass neben dem MGMT-Promotor-Methylierungsstatus die Infiltration
des
GBM
durch
TIL
ebenfalls
eine
wichtige
Rolle
bei
Langzeitüberlebern spielt. In weiteren Untersuchungen konnte Schiffer keine Korrelation zwischen der Infiltration maligner Gliome durch TIL und dem Überleben der Patienten feststellen (Schiffer et al. 1979). Zu einem ähnlichen Schluss kam Rossi, der intraparenchymale und perivaskuläre CD8+ und CD4+
16 Lymphozyten
sowie
makrozytäre
Infiltrate
untersuchte
und
keinen
Zusammenhang mit dem Überleben der Patienten erkennen konnte (Rossi et al. 1989). In den beiden größten Studien zu TIL und ihrer prognostischen Bedeutung für die GBM-Patienten wies Safdari einen negativen Einfluss der TIL für die Patienten nach (Safdari et al. 1979, Tumorareale,
nämlich
1985). In 342 Patienten wurden verschiedene
zellreiches,
peripheres,
hypervaskularisiertes
und
nekrotisches Tumorgewebe sowie Normalgewebe auf Anwesenheit von TIL untersucht. In 35 % der Patienten zeigten sich TIL im zellreichen Tumorgewebe, bei 29 % konnten TIL in peripheren Arealen festgestellt werden, im Normalgewebe fanden sich jedoch nur bei 4 % der Patienten Lymphozyten. Patienten mit lymphozytären Infiltraten überlebten im Mittel 8,4 Monate, wohingegen Patienten ohne TIL noch 11,9 Monate nach Diagnose überlebten. Die negativ-prognostische Bedeutung der TIL bestätigte sich auch, wenn sich die TIL überwiegend in hypervaskularisierten oder nekrotischen Arealen befanden. Die bisherigen Studien lassen keinen eindeutigen Schluss über die prognostische Bedeutung der TIL in malignen Gliomen zu. Methodische Unterschiede in der Erfassung des Phänotyps, der Anzahl und der Lokalisation der TIL könnten die Ursache für die gegensätzlichen Ergebnisse sein. Außerdem erfolgten die Untersuchungen vor der Entdeckung der regulatorischen T-Lymphozyten (Treg) (Sakaguchi et al. 1995), deren entscheidende Rolle für die Tumorimmunologie in einer bahnbrechenden Arbeit von Curiel vor wenigen Jahren das erste Mal belegt wurde (Curiel et al. 2004).
2.3. Lokale und globale Immunsuppression in Patienten mit GBM Mitte der 70er Jahre des vergangen Jahrhunderts, nahezu zeitgleich mit der Erforschung der TIL in malignen Gliomen, beschrieben zahlreiche Studien Defekte in der zellulären Immunität bei Patienten mit malignen Hirntumoren. Weiterführende Untersuchungen zeigten eine beeinträchtigte Funktion der TLymphozyten. Beispielsweise ließen sich periphere mononukleäre Lymphozyten nur eingeschränkt durch T-Zell-Mitogene, Anti-CD3-Antikörper oder T-Zell-
17 abhängige B-Zell-Mitogene stimulieren (Ashkenazi et al. 1997; McVicar et al. 1992). Die Patienten litten häufig an einer Lymphopenie und im Patientenserum fanden sich etliche immunsupprimierende Faktoren, wie zum Beispiel Interleukin (IL)-10 (Dummer et al. 1995; Gastl et al. 1993; Nitta et al. 1994; Vieira et al. 1991), Prostaglandin E2 (Anastassiou et al. 1992; Castelli et al. 1989; Couldwell et al. 1991; Elliott et al. 1993) oder Tumor growth factor β (Fontana et al. 1984; Olofsson et al. 1992; Sasaki et al. 1995; Weller et al. 1994; Weller et al. 1995). Lymphopenie
und
immunsuppressive
Faktoren
im
Serum
konnten
die
Immunsuppression der Gliompatienten jedoch nur unzureichend erklären. Isolierte man T-Lymphozyten aus dem Patientenserum und kultivierte diese in frischen Kulturmedium, so ließen sie sich weiterhin nur eingeschränkt stimulieren (Morford et al. 1997; Roszman et al. 1980). Die T-Zell-Dysfunktion schien folglich nicht durch exogene Faktoren bedingt, sondern die Ursachen mussten innerhalb des T-Zell-Kompartiments zu finden sein. Da vorwiegend T-Helferzellfunktionen beeinträchtigt waren, war die Ursache für die defekte Immunabwehr von Gliompatienten in der CD4+ T-Zell-Subpopulation zu suchen (Roszman et al. 1985). CD4+ T-Lymphozyten von Gliompatienten sezernierten eine verminderte Menge an TH1-Zytokin Interleukin 2 (Ausiello et al. 1991; Elliott et al. 1984). Die Sekretion weiterer TH1-Zytokine war ebenfalls vermindert, wohingegen erhöhte Konzentrationen von TH2-Zytokinen zu finden waren (Ott et al. 2005; Roussel et al. 1996; Zou et al. 1999). In einer Übersichtsarbeit aus dem Jahr 1999 stellte Dix die bis dato gewonnen Erkenntnisse zur Immunsuppression bei MG detailliert dar. Ein zentraler pathophysiologischer Faktor war noch nicht auszumachen (Dix et al. 1999) (Abb. 1).
18
TH1 Æ IL-2TH2 Sekreti on↓ IFNγT-ZellAktivierung & Sekreti Proliferation ↓
?
on↓
Dix et al., 1999 Abb. 1: Immunsuppression in malignen Gliomen nach Dix et al.
Auf der Suche nach zentralen Faktoren für die Immunsuppression bei Patienten mit MG, gelang der Arbeitsgruppe von Fecci wenige Jahre nach der Veröffentlichung Dixs umfassender Übersichtarbeit ein entscheidender Schritt. Die Forscher beobachteten, dass sich die im Zusammenhang mit der Immunsuppression
von
Gliompatienten
bekannten
Effekte
gut
mit
dem
Wirkungsspektrum von CD4+ CD25+ Forkhead box P3-positiven (FoxP3+) regulatorischen T-Lymphozyten in Deckung bringen ließen (Fecci et al. 2006). Treg hemmen die Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten, unter anderem durch Hemmung der IL-2-Produktion in den Zielzellen (Thornton et al. 1998), ein Effekt, der wesentlich an der T-Zell-Dysfunktion von Gliompatienten beteiligt schien (Ausiello 1991; Elliott 1984). Treg bewirken zudem einen Zytokinshift von einer TH1-basierten, zellulären zu einer TH2-basierten, humoralen Immunantwort (Dieckmann et al. 2002) und inhibieren die Interferon-γ-Sekretion (Camara et al. 2002; Piccirillo et al. 2001) (Abb. 2).
19
TH1 Æ IL-2TH2 Sekreti on↓ IFNγT-ZellAktivierung & Sekreti Proliferation ↓
Regulatorische TZelle
on↓
Dix et al., 1999
Fecci et al., 2006
Abb. 2: Mögliche Rolle der Treg in MG nach Fecci et al.
Man geht davon aus, dass Treg die gegen neoplastische Läsionen gerichtete Immunreaktion hemmen können. Die Treg-Fraktion, das heißt der prozentuale Anteil regulatorischer T-Lymphozyten an der Gesamtzahl der Immunzellen, ist im Blut und im Tumor zahlreicher Krebspatienten erhöht (Curiel 2004; Ichihara et al. 2003; Liyanage et al. 2002; Woo et al. 2001). Treg scheinen ein wesentlicher Bestandteil
der
immunologischen
„tumour-escape“
beziehungsweise
der
„immunosubversion“ zu sein (Zitvogel et al. 2006). Der Tumor scheint mit Hilfe der Treg das Immunsystem aktiv umgehen zu können. In der Studie von Fecci fand sich eine vergrößerte Treg-Fraktion innerhalb des CD4+-Kompartiment von Patienten mit malignen Gliomen, wobei die Gesamtzahl der CD4+ Lymphozyten sowie der Treg erniedrigt war. Depletion der Treg mit einem anti-CD25-Antikörper in vitro machte den Zytokinshift von TH1 nach TH2 rückgängig. Ebenso zeigten die restlichen CD4+-Zellen eine vermehrte Proliferation nach Stimulation mit antiCD3-Antikörper (Fecci 2006). Im GBM-Mausmodell führte die Depletion der Treg zur spontanen Remission von Tumoren und verlängerte das Überleben der Mäuse (El Andaloussi et al. 2006a; Fecci 2006). Weitere Studien konnten die Bedeutung der Treg in MG bestätigen. El Andaloussi beschrieb sowohl eine vergrößerte Treg-Fraktion als auch eine erhöhte TregGesamtzahl im Blut und im Tumor von GBM-Patienten (El Andaloussi et al. 2006b). In einer Vergleichsstudie von Gliomen unterschiedlicher Malignität wurde die größte Treg-Fraktion bei den hochmalignen Grad IV Gliomen (11,54 +/- 1,95
20 %) festgestellt, während in Grad III (6,74 +/- 0,19 %) und II (2,53 +/- 0,11 %) Gliomen die Treg-Fraktion deutlich kleiner war (El Andaloussi et al. 2007). Schließlich zeigte Jordan, dass GBM-Tumorzellen durch Sekretion des CCligands (CCL) 2 regulatorischen T-Zellen anlocken können (Jordan et al. 2008). Der dazu korrespondierende CC-receptor (CCR) 4 auf den Treg war bei den Gliompatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen vermehrt exprimiert. Tumorzellen maligner Gliome und insbesondere Glioblastomzellen scheinen der immunologischen Tumorabwehr zu entgehen, indem sie die immunsuppressiven CD4+CD25+FoxP3+
Treg
selektiv
anlocken.
Im
Tumor
hemmen
Treg
Immuneffektorzellen, die die immunologische Tumorabwehr ausführen könnten. Die Tumorzellen könnten so der immunologischen Tumorabwehr entgehen. Verschiedene Veröffentlichungen beschreiben die Expression von FoxP3+ auch in diversen Tumorzellen, so zum Beispiel GBM-Zellen, (Ebert et al. 2008; Hinz et al. 2007; Zuo et al. 2007) und legen nahe, dass die Tumorzellen selbst immunsupprimierende Wirkung auf immunologische Effektorzellen ausüben könnten. Ursprünglich war man davon ausgegangen, dass FoxP3+ ausschließlich in Treg exprimiert werden (Brunkow et al. 2001; Fontenot et al. 2005; Liston et al. 2007).
2.4. Ziele der Untersuchungen Das
Langzeitüberleben
beim
Glioblastoma
multiforme
ist
ein
bislang
weitestgehend ungeklärtes Phänomen (Krex and Schackert 2008). Eine günstige immunologische Ausgangssituation könnte eine effektive Tumorabwehr bewirken und die Tumorprogression bei GBM-Patienten wesentlich vermindern. Dies wiederum würde die Prognose der Glioblastompatienten deutlich verbessern und ein Langzeitüberleben ermöglichen. Die Korrelation zwischen ausgeprägter lymphozytärer Infiltration des GBM und guter Prognose, wie sie in der Studie von Palma beschrieben wurde, würde diese Hypothese stützen (Palma 1978). Jener Zusammenhang konnte von anderen Arbeitsgruppen jedoch nicht eindeutig bestätigt werden (Boker 1984; Rossi 1989; Safdari 1979; Schiffer 1979). Unterschiede in der Erfassungsmethodik der TIL sowie fehlende Kenntnisse über
21 immunsupprimierende
Treg
könnten
die
Diskrepanzen
zwischen
den
verschiedenen Studien erklären. Um die Diskrepanzen der vorausgegangen Studien zu egalisieren, wurden in diesen Untersuchungen unterschiedliche Lymphozytensubpopulationen, inklusive der CD4+CD25+FoxP3+ regulatorischen T-Zellen im Hinblick auf Anzahl und Lokalisation in immunhistochemischen Präparaten quantitativ erfasst. Das komplexe immunologische Tumorgeschehen im GBM sollte möglichst genau rekonstruiert werden. Der Abgleich mit klinischen Daten sollte Auskunft über die Bedeutung
der
TIL
für
die
klinische
Prognose
geben.
Mittels
Migrationsuntersuchungen sollte zudem geklärt werden, ob das GBM selektiv immunkompetente Zellen anlocken kann. Würden Glioblastomzellen gezielt immunsuppressive Treg anlocken, die die Immunreaktion supprimieren?
22 3. Material und Methoden 3.1. Immunhistochemische Untersuchungen 3.1.1. Auswahl des Patientenkollektivs In die immunhistochemischen Untersuchungen wurden 77 Patienten mit GBM eingeschlossen, die zwischen 2003 und 2007 in der Neurochirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Erlangen operativ behandelt worden waren. Die histopathologische Diagnose war durch das Neuropathologische Institut des Universitätsklinikums Erlangen gesichert worden. Ein Teil der Patienten hatte in der Strahlenklinik des Universitätsklinikums Erlangen eine adjuvante Strahlen- und Chemotherapie erhalten. Die Patientendaten, einschließlich der Daten von den Tumornachsorgeuntersuchungen, waren vom Tumorzentrum des Universitätsklinikums Erlangen akquiriert und für diese Untersuchungen zur Verfügung gestellt worden. Fehlende Daten konnten aus den Arztbriefen der Neurochirurgischen Klinik und der Strahlenklinik des Universitätsklinikums Erlangen entnommen und ergänzt werden.
3.1.2. Anfertigung der Tissue Micro Arrays® Die in Paraffin gegossenen Tumorproben wurden von der Neuropathologie zur immunhistochemischen Aufarbeitung mittels Tissue Micro Array® (TMA®)Verfahren
bereitgestellt.
Die
TMA®-Technik
ermöglicht
eine
effiziente
immunhistochemische Untersuchung zahlreicher Patienten (Kononen et al. 1998). Aus einem Spenderblock, der das in Paraffin gegossene Tumorgewebe enthält, wird eine repräsentative, zylinderförmige Stanze gewonnen. Diese wird
in
einen
„leeren“
Paraffinempfängerblock
übertragen.
Da
der
Empfängerblock zahlreiche Stanzen aus verschiedenen Spenderblöcken aufnehmen
kann,
können
zahlreiche
Tumorproben
gleichzeitig
immunhistochemisch untersucht werden. Nachdem alle Stanzen in den Empfängerblock übertragen sind, werden sie durch Erwärmen des Paraffins (10 min; 43°C) im Empfängerblock fixiert (AlphaMetrix 2005). Danach können vom Empfängerblock Leerschnitte gewonnen und anschließend gefärbt werden (Abb. 3).
23
Abb. 3: TMA-Anfertigung mit dem Beecher MTA-1. Grafik entnommen aus der deutschsprachigen Bedienungsanleitung für den Manuellen Tissue Arrayer (MTA)-1 (AlphaMetrix Biotech GmbH).
Der Durchmesser eines Stanzzylinders beträgt 2 mm und repräsentiert nur einen kleinen Ausschnitt des gesamten Tumors. Dementsprechend sorgfältig muss die Lokalisation der Stanze im Spenderblock beziehungsweise im Tumorgewebe vorab gewählt werden. In dieser Studie wurden mit Hilfe von Hämatoxylin-Eosin
(HE)-Schnitten
der
Spenderblöcke
repräsentative
Tumorbereiche aufgesucht. Diese Bereiche wurden auf den Spenderblöcken markiert, um dort genau definiert die Stanzen zu gewinnen. Zur Anfertigung der TMA® diente der Manuelle Tissue Arrayer (MTA)-1 (Beecher Instruments, Wisconsin, USA). Pro Untersuchungsfall wurden mindestens zwei Stanzen aus der sehr zelldichten Tumorhauptmasse untersucht sowie eine weitere im Infiltrationsbereich, wo die Tumorzellen das Normalgewebe infiltrieren. Eine eindeutige Infiltrationszone konnte jedoch nicht für alle Tumorproben bestimmt werden. Die Stanzen wurden fern von nekrotischen Arealen gewonnen. Pro Patient wurden drei Stanzen angefertigt, gefärbt und ausgewertet (Abb. 4).
24
®
Abb. 4: Fertiger TMA nach anti-CD3-Färbung und ein Untersuchungsfeld in verschiedenen Vergrößerungen.
3.1.3. Färbung relevanter Lymphozytensubpopulationen In der folgenden Tabelle (Tab. 1) findet sich eine Zusammenstellung der untersuchten
Lymphozytensubpopulationen
sowie
der
verwendeten
Antikörper. Tab.
1:
Untersuchte
Antigene
und
verwendete
Antikörper
bei
den
immunhistochemischen Untersuchungen. Spezifisches Lymphozytensubpopulation
Merkmal,
Verwendeter Antikörper
Oberflächenantigen T-Lymphozyten
CD3
Zytotoxische T-Lymphozyten
CD8
Abcam, mouse-antihuman CD3 DAKO Cytomation,
Verwendete Konzentration 1 : 100 1 : 200
25 mouse- anti-human CD8 B-Lymphozyten
CD20
Makrophagen und Mikroglia
CD68
Regulatorische T-Zellen
FoxP3
Gefäßmarker
CD34
DAKO Cytomation, mouse-anti-human CD20 DAKO Cytomation, mouse-anti-human CD68 Abcam, mouse anti-
1 : 500 1 : 200 1 : 100
human FoxP3 DAKO Cytomation; mouse-anti-human CD34
1 : 200
Die Schnitte wurden mit einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert, in der Mikrowelle thermisch vorbehandelt und mit der Biotin-Streptavidin-KomplexMethode entsprechend der Protokolle der Hersteller gefärbt. Bei FoxP3 kam eine Verstärkung mit Tyramin zum Einsatz.
3.1.4. Bildanalytisch-gestützte Auswertung mit BIOMAS® Die Auswertung der TMA erfolgte mit einem bildanalytisch-gestützten Verfahren. Die 2 mm-Stanzen wurden in 200-facher Vergrößerung als Serienbild mit dem Leica DM 6000 B Mikroskop (Leica, Wetzlar) aufgenommen. Damit war die Begutachtung einer Stanze im Ganzen möglich. Das Serienbild wurde mit der BIOMAS®-Software ausgewertet (MSAB, Erlangen). Zunächst wurden die Vaskularisierung und die Gesamtzellzahl erfasst. Grundlage waren die mit dem Gefäßmarker CD34 gefärbten TMA. Die Gefäßinnenwände wurden markiert, womit BIOMAS® die Gefäßfläche jedes einzelnen Gefäßes und die Gesamtgefäßfläche berechnete. Die durch die HEFärbung blau gefärbten Zellkerne wurden ebenfalls markiert und von BIOMAS® gezählt. Zusätzlich ermittelte BIOMAS® den jeweils kürzesten Abstand von den markierten Zellen zur Gefäßinnenwand. Die Daten zur Vaskularisierung und Gesamtzellzahl wurden durch die ausgewertete Fläche (Region
of
interest;
ROI)
dividiert,
so
dass
Flächeneinheiten bezogen werden konnten (Abb. 5).
die
Ergebnisse
auf
26
Abb. 5: Anti-CD34-Färbung zur Erfassung von Gesamtzellzahl und Vaskularisierung. Rot unterlegt sind markierte Gefäße. Die blauen Sternchen kennzeichnen Zellkerne in HE-Färbung für die Gesamtzellzahlbestimmung.
27
In einem zweiten Schritt erfolgte die Auswertung der TIL. Hierzu wurden neben den Lymphozyten wiederum die Gefäßinnenwände markiert, um den Abstand zwischen Lymphozyt und dem nächstgelegenen Gefäß erfassen zu können. Durch Markierung der ROI war wiederum der Bezug zu einer Flächeneinheit möglich. Die Anzahl der TIL wurde durch die zuvor ermittelte Gesamtzellzahl dividiert, um den relativen Anteil der TIL im Tumorgewebe ermitteln zu können (Abb. 6).
Abb. 6: Erfassung der Lymphozytenanzahl sowie der Abstände der Lymphozyten zum jeweils nächstgelegenen Gefäß am Beispiel einer CD8+-Färbung. Rot unterlegt sind Gefäße. Die Grüne Pfeile markieren das Lot der CD8+ TIL auf das nächstgelegene Gefäß. Die orangefarbenen Pfeile zeigen den Abstand eines Lymphozyts zum nächstgelegenen Lymphozyten.
28
3.1.5. Statistische Analyse Am Ende der Auswertung der TMA® lagen pro Tumorprobe folgende Datensätze vor: -
Gesamtzellzahl pro Tumorfläche
-
Gefäßfläche in Relation zur Gesamtfläche
-
Anzahl der TIL relativ zur Gesamtzellzahl
-
Abstände der TIL zum nächstgelegenen Gefäß
Die aus den immunhistochemischen Untersuchungen gewonnen Daten wurden zusammen mit den dazugehörigen klinischen Daten aus dem Erlanger Tumorzentrum in das Statistikprogramm SPSS (SPSS Software GmbH, München) übertragen. Die statistische Überlebenszeitanalyse erfolgte mit der Cox-Regression und dem Kaplan-Meier-Schätzer. Endpunkt der Analyse war der Tod der Patienten. Der Beobachtungszeitraum erstreckte sich folglich vom Tag der neurochirurgischen Operation bis zum Tod des Patienten. Die Abhängigkeit
des
Gesamtüberlebens
von
den
verschiedenen
immunhistochemischen Charakteristika wurde mit dem Logrank-Test geprüft. Für
die
Überlebenszeitanalyse
wurden
die
Patienten
anhand
der
immunhistochemischen Daten jeweils in zwei Gruppen aufgeteilt. Die Trennung erfolgte entweder am Median oder an der 66 %-Perzentile der immunhistochemischen Datensätze. Bei annähernder Normalverteilung der Datensätze wurde die Trennung am Median durchgeführt, dagegen wurden die Datensätze an der 66 %-Perzentile getrennt, wenn im oberen Drittel der Verteilung ein ausgeprägter Peak zu erkennen war. Eine Auswertung des progressionsfreien Überlebens mit dem Endpunkt der Tumorprogression war nicht möglich, da die klinischen Daten hierfür lückenhaft waren. Neben der Analyse der immunhistochemischen Daten, wurde der mögliche Einfluss von Patientenalter und Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG)-Index (Oken et
al.
1982)
Patientenalter,
auf
das
Gesamtüberleben
Karnofsky-Index
und
der
Patienten
MGMT-Promotor-Status
untersucht. sind
die
einzigen, beim GBM etablierten prognostischen Faktoren. Da der KarnofskyIndex vom Tumorzentrum für diese Studie nicht erfasst worden war, wurde der
29 ECOG-Index ersatzweise untersucht. Daten über den MGMT-Promotor-Status der Patienten standen nicht zur Verfügung, da dessen routinemäßige Bestimmung erst 2008 in Erlangen eingeführt wurde.
3.2. Chemokinetischer Migrations-Assay 3.2.1. Das Prinzip der 2-dimensionalen Boyden-Chamber Zahlreiche verschiedene Methoden zur Analyse von Zellmigration wurden bereits etabliert (Entschladen et al. 2005). Der 2-dimensionale Filter-Assay wurde 1962 von Boyden erstmalig beschrieben (Boyden 1962). Eine obere Kammer wird durch einen Filter mit definierter Porengröße von einer unteren Kammer getrennt. Um Chemotaxis und Migration an Immunzellen zu untersuchen, werden in die obere Kammer Immunzellen und in die untere ein Lockstoff gegeben. Die obere Kammer ist partiell in die untere Kammer eingetaucht. Der Lockstoff kann nun über die Membran in die obere Kammer diffundieren, die Immunzellen in die untere Kammer migrieren (Abb. 7).
30
Abb. 7: Prinzip der modifizierten Boyden Chamber: Nach Probengewinnung (Lymphozyten und Tumorüberstände) folgt die Migration in der Boyden Chamber. Die migrierten Lymphozyten können mit Hilfe verschiedener Meßverfahren (Mikroskopie, Multi-Assay-Reader, Flußzytometrie) detektiert werden.
Da der Diffusionsprozess sehr schnell vonstatten geht, kann man mit der „klassichen“ Boyden-Chamber zwar Chemokinetik jedoch nicht Chemotaxis analysieren. Chemotaxis beschreibt die gerichtet Migration an einem Konzentrationsgradienten, Chemokinetik hingegen die ungerichtete Migration, die
durch
Chemokine
gesteigert
werden
kann.
Der
rasche
31 Konzentrationsausgleich wurde für das in dieser Studie verwendete 96-well Millipore-MultiScreen®-System
mit
Hilfe
des
Farbstoffes
Toluolblau
nachgewiesen. In die unteren Kammern wurde statt des Lockstoffes in Wasser gelöstes Toluolblau gegeben. In den oberen Kammern befand sich ungefärbtes destilliertes Wasser. Die Konzentrationen von Toluolblau in den oberen Kammern wurden nach definierten Zeiten photometrisch bestimmt. In die obere Kammer des Versuchsystems nach Boyden werden Lymphozyten im Überschuss gegeben. Man geht von einer Migrationsfraktion von circa 10 % der vorgelegten Zellen aus (Entschladen 2005). Abhängig von der Größe und der Migrationsgeschwindigkeit stimulierter und unstimulierter Zellen muss zunächst das passende System, in erster Linie der passende Filter beziehungsweise die passende Membran, gefunden werden. Zu beachten sind Unterschiede im Membranmaterial, in der Membrandicke, in Porengröße und Porendichte (NeuroProbe 2006). Für diese Versuche kam das 96-well MultiScreen®-System von Millipore (Millipore, Billerica, MA, USA) mit einem Porendurchmesser von 3 µm zur Anwendung. Die relativ dünnen Millipore-Membranen eignen sich gut für die Detektion
migrierter
Lymphozyten
an
der
Membranunterseite
mittels
Immunofluoreszenzfärbung- und Mikroskopie. Dickere Filter, zum Beispiel die ThinCertTM-Membran (Greiner BIO-ONE GmbH, Frickenhausen), führen bei der Mikroskopie zu einem stärkeren Hintergrund (Abb. 8). Die Porengröße von 3 µm wird vom Hersteller für Migrationsuntersuchungen an Lymphozyten empfohlen, jedoch können auch 5 µm Poren bei verkürzter Migrationszeit eingesetzt werden (Ott 2005).
32
Abb. 8: ThinCert®- (links) und MultiScreen®- (rechts) Membran bei Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop.
Zur Detektion der migrierten Zellen kommen üblicherweise drei Verfahren zum Einsatz, die auch bei Etablierung der Migrations-Assays im Vorfeld dieser Studie getestet worden waren: 1)
Bildanalytische
Erfassung
der
migrierten
Lymphozyten
an
der
Membranunterseite nach Fixierung und DAPI- Färbung 2)
Bestimmung der in die untere Kammer gewanderten Lymphozyten mittels Flußzytometrie
3)
Detektion der in die untere Kammer migrierten Lymphozyten mit Hilfe eines Multi-Assay-Readers nach Fluoreszenzfärbung mit in vivoFarbstoffen
Bei der bildanalytischen Erfassung der migrierten Lymphozyten wurden die Lymphozyten an der Membranunterseite am Ende der Migrationszeit mit 4 % Formaldehydlösung für 15 min fixiert, mit 0,1 % Triton-X-Lösung für 10 min permeabilisiert und mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gefärbt. Dazu wurden 0,3 µl DAPI in 1 ml Standard saline citrate (SSC) / Tween (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) verdünnt. Die Membran wurde auf einen Objektträger gelegt, mit Vectashild® (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) eingedeckt und dann als Serienbild mit dem Leica DM 6000 B Mikroskop (Leica, Wetzlar) aufgenommen. Die mit dem
33 Fluoreszenzfarbstoff
DAPI
gefärbten
Lymphozyten
wurden
mit
dem
Bildanalyse-Programm BIOMAS® (MSAB, Erlangen) erfasst (Abb. 9).
Abb. 9: Auswertung einer Millipore-MultiScreen®-Membran mit der BildanalyseSoftware BIOMAS®.
Detektionsverfahren dieser Art können die Lymphozytenanzahl an der Membranunterseite sehr genau ermitteln. Lymphozyten, die sich von der Membranunterseite abgelöst haben und am Grund der unteren Kammer liegen, können jedoch nicht erfasst werden. Man kann mit diesem Verfahren also nur eine Momentaufnahme erstellen. Die Lymphozyten durchwanderten die dünne Millipore Membran sehr schnell und waren nach wenigen Minuten an der Membranunterseite zu finden. Daraufhin lösten sie Sie sich von der Membran. Nur bei einem günstig gewählten Migrationsstopp konnte man davon ausgehen, dass die Lymphozytenzahl an der Membranunterseite mit dem chemokinetischen Verhalten der Lymphozyten korrelierte.
34 Mit Hilfe der Flußzytometrie konnten die Zellen, die die Membran durchwandert und sich von dieser gelöst haben, quantifiziert werden. Die für die
Flußzytometrie
benötigten
Zellzahlen
waren
relativ
hoch.
Dementsprechend erwies die flußzytometrische Auswertung nach Migration im 96-well-System, das mit einer geringen Anzahl an Lymphozyten pro Well arbeitet, als weniger gut geeignet. Durch Zusammenfassen mehrerer Wells, um die zu analysierende Zellzahl zu steigern, konnte die Flußzytometrie als zusätzliches Kontrollverfahren dennoch genutzt werden. Neben Größe und Granularität wurden die Calcein-Fluoreszenz zur Erfassung der Lymphozyten genutzt. Die Messungen erfolgten an einem Beckman Coulter Epics XL-MCL (Beckman Coulter GmbH, Krefeld). Die Detektion mittels Multi-Assay-Reader HTS 7000 (Perkin Elmer Inc., Wellesley, MA, USA) nach Färbung der Lymphozyten mit einem in vivoFluoreszenzfarbstoff erwies sich im Zusammenspiel mit dem 96-well MultiScreen®-System
von
Millipore
am
praktikabelsten.
Calcein-
Acetoxymethylester (Calcein-AM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) war ein geeigneter intrazytoplasmatischer Fluoreszenzfarbstoff, der im Vergleich zu Höchst 33342 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ein deutlicheres Signal emittierte. Calcein-AM wird von intakten Lymphozyten aufgenommen und die Acetoxymethylgruppe wird von Esterasen im Zytoplasma der Lymphozyten abgespalten. Es entsteht Calcein, das intrazytoplasmatisch an Calcium bindet. Dieser Komplex kann nicht mehr aus der Zelle entweichen. Er kann mit Licht der
Wellenlänge
495
nm
angeregt
werden,
woraufhin
er
grünes
Fluoreszenzlicht von 515 nm emittiert (Parish 1999). Entsprechend des Protokolls von Millipore wäre die Färbung der Lymphozyten erst
nach
der
Migration
Lymphozytensuspension
in
durch den
Zugabe unteren
von
Calcein-AM Kammern
zur erfolgt
(MilliporeCorporation 2008). Deutlich bessere Ergebnisse ließen sich jedoch dann erzielen, wenn zunächst die Lymphozyten vor der Migration mit CalceinAM gefärbt wurden und danach der restliche Farbstoff ausgewaschen wurde. Der Hintergrund war bei diesem Messverfahren geringer. Der mögliche Einfluss von Calcein auf die Migration der Lymphozyten war zuvor
35 ausgeschlossen worden. Um den Hintergrund weiter zu minimieren, wurden die Zellsuspensionen nach der Migration und vor der Messung mit dem MultiAssay-Reader aus der 96-well Millipore Receiver Plate® in eine schwarze, Floureszenz-absorbierende Nunc F96 MicroWellTM Plate (Nunc GmbH & Co. KG, Langenselbold) überführt. Die
Migrationsmessungen
wurden
als
Triplette
angelegt.
Für
das
Detektionsverfahren mittels Multi-Assay-Reader wurde pro Triplett in einem vierten Well ein dazugehöriger Hintergrund bestimmt, wohinein ungefärbte Lymphozyten
auf
den
gleichen
Tumorüberstand
migrierten.
Um
die
Ergebnisse aus der Fluoreszenzmessung zu quantifizieren, wurde für jeden Versuch eine Standardkurve ermittelt. Dafür wurden definierte Anzahlen Calcein-gefärbter Lymphozyten in die unteren Kammern der 96-well-Platte pipettiert. Die Beziehung zwischen Lymphozytenanzahl und gemessener Fluoreszenz konnte in einem Steigungsdreieck abgebildet werden. Die ermittelte Steigung ermöglichte die Umrechnung eines Fluoreszenzwertes in die entsprechende Anzahl migrierter Lymphozyten (Abb. 10, 11).
36
Abb. 10: Einteilung eines 96-well Millipore MultiScreen®-Systems für MigrationsAssays.
Abb. 11: Standardkurve: Fluoreszenz zu Lymphozytenanzahl.
37 Um die Migration unabhängig vom verwendeten 96-well Millipore System darzustellen
wurde
der
Migrationsindex
für
die
Migration
auf
die
Tumorüberstände ermittelt. Die Migration auf frisches Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Biochrom AG, Berlin) mit 2 % fötalem, bovinem Serum (FBS) diente als Kontrolle und stellte die basale Migration dar. Die Migration auf die verschiedenen Tumorüberstände wurde auf die basale Migration bezogen, die basale Migration selbst wurde gleich 1 beziehungsweise 100 % gesetzt. MigrationsIndex =
Migration(Tumorüberst.) ⋅ 100% basale _ Migration
3.2.2. Isolation der Lymphozytensubpopulationen Aus 100 ml peripher-venösem Blut gesunder Spender wurden mittels eines Bicoll®-Dichtegradientens periphere mononukleäre Zellen (peripheral blood mononuclear cells; PBMC) isoliert. Spenderblut wurde 1 : 1 mit 1xPhosphate buffer saline (1xPBS) verdünnt, auf das Bicoll® aufgetragen und bei 1000 g für 20 min zentrifugiert. Die Bremse der Zentrifuge wurde abgeschaltet. Nach dem Zentrifugieren wurde der Buffy Coat mit den PBMC abgenommen und in 1xPBS aufgefangen. Es folgten zwei Waschschritte mit 1xPBS. Mit Hilfe von Magnetic cell separation® (MACS®)-CD4- und CD8-MicroBeads® (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach) wurden CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten positiv selektioniert. Die „magnetischen“ MACS® richteten sich gegen die Oberflächenantigene CD4 beziehungsweise CD8, der daraus resultierende „magnetische“
Antigen-Antikörper-Komplex
konnte
mit
Hilfe
eines
Ferromagneten separiert werden. Die Selektion der CD4+CD25+ Treg erfolgte mit dem MACS® CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, wobei die CD4+ T-Lymphozyten zunächst negativ
selektioniert
und
daraus
die
CD25+-Lymphozyten
mittels
Positivselektion gewonnen wurden. Bei der negativen Selektion waren die „magnetischen“ Antikörper gegen CD4- T-Lymphozyten gerichtet, die nicht markierten CD4+ T-Zellen blieben nach Anwendung des Ferromagneten zurück. Mittels CD25-MicroBeads wurden aus dem CD4+ Kompartiment, die
38 Subpopulation
der
CD4+CD25+
regulatorischen
T-Zellen
mittels
Positivselektion gewonnen (Abb. 12).
Abb. 12: Isolation und Separation der Lymphozyten mit MicroBeads®.
Vor dem unmittelbaren Auftragen auf die 96-well-Platten wurden die CD4+, CD8+, CD4+CD25+ Lymphozyten sowie die PBMC nochmals mit 1xPBS gewaschen, abzentrifugiert und mit frischem, serumfreien Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium (Biochrom AG, Berlin) resuspendiert. Die Konzentration der Lymphozyten wurde auf 1 Mio/ml adaptiert. Dadurch befanden sich alle Lymphozyten in unverbrauchten, nicht konditionierten Medium. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt mit Hilfe des CASY®Messgerätes (innovatis AG, Reutlingen), das Zellzahlen mittels elektrischer
39 Impedanz misst. In die oberen Kammern des 96-well-Systems wurden 50 µl Zellsuspension und damit 50.000 Lymphozyten gegeben.
3.2.3. Herstellung der Tumorüberstände Zellüberstände
aus
etablierten
GBM-Zelllinien
sowie
Überstände
aus
Primärkulturen dienten als Lockstoffe. Die Tumorzellen wurden in hoher Konzentration von 1 Mio/ml für 72 h in 2 % DMEM mit 1 % Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) kultiviert und dann abgenommen. Zellbestandteile wurden abzentrifugiert und die Überstände wurden entweder für spätere Verwendung in flüssigem Stickstoff tief gefroren oder sofort für Migrationsversuche verwendet. Als etablierte Zelllinien dienten A172 und LN18 Glioblastomzellen, die von Weller bereits charakterisiert worden waren (Weller et al. 1998). Um das in vivo-Tumormilieu
möglichst
gut
nachzustellen,
wurden
GBM-
Primärzellkulturen etabliert. Die Zustimmung des Erlangener Ethikrates lag vor. Die Primärzellkulturen wurden aus Tumorfrischgewebe aus der Neurochirurgie mit Hilfe des MACS® Neural Tissue Dissociation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) gewonnen. Hierfür wurde das Tumorgewebe in 1xPBS aufgenommen und mehrere Male mit 1xPBS gewaschen. Das Tumorgewebe wurde in circa 0,25 mm x 0,25 mm große Stückchen mit dem Skalpell zerkleinert, so dass es mit Hilfe einer 10 ml-Plastikpipette aufgenommen werden konnte. Daraufhin erfolgte nach Protokoll ein 20-minütiger Gewebeverdau mit Papain. Die Papainwirkung wurde mit einer Inhibitor-Lösung gestoppt. Das verdaute Gewebe wurde auf einen Filter mit 40 µm Porendurchmesser aufgetragen und die Zellen in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen bei 300 g über 2 min abzentrifugiert. Um Zellen weiter von
Myelin,
Faser-
und
Bindegewebe
zu
trennen,
waren
weitere
Zentrifugationsschritte notwendig. Die hieraus gewonnene Zellsuspension wurde auf 1 Mio/ml verdünnt und in Zellkulturflaschen überführt. Die Bestimmung der Zellkonzentration erfolgte mit dem CASY® Messgerät. Nach 72 h konnten die Primärüberstände abgenommen werden. Die zellulären
40 Bestandteile wurden abzentrifugiert, die Überstände tief gefroren (- 80°C) oder sofort verwendet. Die adhärenten Tumorzellen wurden zur Charakterisierung noch einige Male passagiert. Die Diagnose „Glioblastoma multiforme“ wurde durch die Neuropathologie des Universitätsklinikums Erlangen gesichert. Um darüber hinaus sicherzustellen, dass es sich bei den aus dem Gewebeverdau gewonnen Zellen überwiegend um GBM-Zellen handelte, wurden glial fibrillary acidic protein (GFAP), p53 sowie das morphologische Bild unter dem Lichtmikroskop erfasst und bewertet. GFAP ist ein zytoplasmatisches Protein, das hochspezifisch für Zellen astroglialen Ursprungs ist (Reeves et al. 1989). GFAP wurde mittels Immunofluoreszenzfärbung bestimmt. Der verwendete Antikörper war antiGFAP-Maus-Antikörper
(Sigma-Aldrich,
St.
Louis,
MO,
USA);
als
Sekundärantikörper wurde ein Alexa 488 anti-Mouse-Antikörper (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) benutzt. Der p53-Status wurde im Western Blot erfasst. Dafür wurden die Tumorzellen in ausreichender Menge vermehrt. Neben einer Kontrolle, wurden für jede Zelllinie zwei weitere Proben mit 2 Gy an einer Seifert Isovolt Titan Röntgenröhre (General Electrics, Ahrensburg) bestrahlt und den Zellen 1 h beziehungsweise 24 h Reparaturzeit gegeben. Danach wurden die Zellen lysiert, Proteine isoliert und der Western Blot durchgeführt. Neben dem p53Gesamtprotein, wurde zusätzlich die Phosphorylierungsstelle am Serin-15 untersucht. Bei der lichtmikroskopischen Begutachtung der Zellen galten ungehemmtes
Wachstum,
Wachstum
in
Zellklumpen
und
Übereinanderwachsen in mehreren Zelllagen als Malignitätskriterien. Die LN18-, A172- und Primärkulturen wurden 24 h nach Aussäen der Tumorzellen
mit
Bestrahlung
und/oder
Temozolomid
behandelt.
Die
Bestrahlungsdosis lag bei 2 Gy, Temozolomid wurde in einer Konzentration von 10 µM appliziert. 40,3 mg Kapselinhalt einer Temodal®-Kapsel mit 20 mg Wirkstoff wurden in 5,15 ml sterilem Dimethyl-Sulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gelöst. Das in DMSO gelöste Temodal® wurde dem Kulturmedium zugegeben, so dass sich eine Zielkonzentration von 10 µM
41 ergab. Die mittlere inhibitorische Konzentration von Temozolomid in vitro, gemessen an U87-Glioblastomzellen, beträgt 150 µM (Su et al. 2004).
42 4. Ergebnisse 4.1. Immunhistochemische Untersuchungen 4.1.1. Auswertung der klinischen Daten Vom Tumorzentrum des Universitätsklinikums Erlangen waren zahlreiche klinische Daten für das Erlanger Patientenkollektiv zur Verfügung gestellt worden. Für den Abgleich mit den immunhistochemischen Ergebnissen wurden davon nur einige ausgewählte Faktoren untersucht. Die klinischen Daten aus der großen Multicenter-Studie von Stupp mit insgesamt 573 Patienten,
die
zur
Etablierung
der
simultanen
und
adjuvanten
Radiochemotherapie mit Temodal® als Therapiestandard beim GBM geführt hatte, dienten als Referenzwerte (Stupp 2005). Daran ließ sich das Erlanger Patientenkollektiv klinisch gut bewerten. Das
mittlere
Alter
der
untersuchten
Erlanger
Patienten
betrug
60,0 ± 11,3 Jahre zum Zeitpunkt der Operation und Histologiegewinnung. Der Median lag bei 61 Jahren. Der jüngste Patient war zu Beginn der Therapie 40 Jahre alt und die älteste Patientin 81 Jahre (Abb. 13).
43
Alter (a)
Mittelwert Median Standardabweichung
60,0 61,0 11,3
Abb. 13: Alter der Patienten in Jahren (Histogramm).
59,7 % der Patienten waren männlich; der Anteil der Patientinnen lag bei 40,3 %. Dem Großteil der Patienten wurde zum Zeitpunkt der Operation ein leicht eingeschränkter Allgemeinzustand als Stufe 1 der ECOG-Klassifikation bescheinigt. Zum Zeitpunkt der Datenauswertung waren bereits 71 der 77 Patienten verstorben (Tab. 2). In Bezug auf Alter, Geschlechtsverteilung und Allgemeinzustand war das Erlanger Patientenkollektiv dem großen Kollektiv der „Stupp-Studie“ sehr ähnlich. In den beiden Armen der Studie von Stupp betrug das mediane Patientenalter 57 Jahre beziehungsweise 56 Jahre, der Männeranteil war 61 % und 64 % groß. Der Großteil der Patienten beider Studienarme zeichnete sich durch einen uneingeschränkten oder leicht eingeschränkten, klinischen Allgemeinzustand aus (Stupp 2005).
44 Tab. 2: Allgemeine klinische Daten des Erlanger Patientenkollektivs. Faktor Geschlecht ECOG-Index
Patientenstatus
Alle Patienten Männlich Weiblich 0 = normale Leistungsfähigkeit 1 = ambulante Betreuung, leichte Arbeiten möglich 2 = weniger als 50% am Tage bettlägerig, Selbstversorgung möglich, aber nicht arbeitsfähig 3 = mehr als 50% am Tage bettlägerig, begrenzte Selbstversorgung noch möglich 4 = ständig bettlägerig 5 = tot Verstorben Lebend mit Hirntumor Keine Angabe
N (%) 77 (100) 46 (59,7) 31 (40,3) 0 (0) 61 (79,2) 9 (11,7) 5 (6,5) 2 (2,6) 0 (0) 71 (92,2) 4 (5,2) 2 (2,6)
Bei allen Patienten des Erlanger Patientenkollektivs wurde histologisch ein Glioblastoma multiforme des WHO-Grades IV diagnostiziert. 85,7 % der Patienten wurden erstmalig an einem primären, de novo entstandenen GBM behandelt. 7,8 % der Patienten erhielten eine Primärbehandlung eines sekundären GBM, das sich aus einem niedriggradigen Gliom entwickelt hatte. Bei 6,5 % der Patienten, die nach auswärtiger Primärtherapie eine Rezidivtherapie am Universitätsklinikum Erlangen erhielten, war die Ätiologie aufgrund fehlender Daten nicht nachzuvollziehen. Vier der 77 Patienten litten neben
dem
GBM
an
einem
Zweittumor
(Tab.
3).
Patienten
mit
Rezidivbehandlung oder Zweittumor waren in der Studie von Stupp nicht eingeschlossen worden, eine Differenzierung von Patienten mit primärem und sekundärem GBM war nicht erfolgt (Stupp 2005).
45 Tab. 3: Tumorspezifische klinische Daten des Erlanger Patientenkollektivs.
Faktor Histologie WHO-Klassifikation Tumorentwicklung
Zweittumor Seitenlokalisation Tumorlokalisation
N (%) 77 (100) 77 (100) 77 (100) 66 (85,7) 5 (6,5)
Alle Patienten Glioblastoma multiforme WHO-Grad IV Neuerkrankung (primäres GBM) Lokales Rezidiv nach auswärtiger Ersttherapie Entwicklung aus niedrig-gradigem Gliom (sekundäres GBM) Ja Nein Rechts Links Zentral Frontallappen Temporallappen Parietallappen Okzipitallappen Cerebellum Überlappende Lokalisation
6 (7,8) 4 (5,2) 73 (94,8) 48 (62,3) 27 (35,1) 2 (2,6) 24 (31,2) 24 (31,2) 7 (9,1) 3 (3,9) 1 (1,3) 18 (23,4)
Eine Resektion des GBM erfolgte bei 96,1 % der Patienten des Erlanger Kollektivs. Drei der 77 Patienten wurden zum Zwecke der Diagnosesicherung ausschließlich biospsiert. Bei der Tumorresektion wurde das GBM nach makroskopischen
Kriterien
zumeist
total
oder
subtotal
mit
einem
Resektionsausmaß größer als 90 % des ursprünglichen Tumorvolumens entfernt.
Eine
R0-Situation,
wie
sie
vom
Pathologen
bei
anderen
Tumorerkrankungen beschrieben wird, ist beim Glioblastom aufgrund der lokalen Mikrometastasierung nicht möglich. Schließlich blieb bei 5,4 % der Erlanger Patienten ein makroskopischer Tumorrest von größer als 50 % des Ausgangsvolumen in situ zurück. Eine radioonkologische Nachbehandlung nach neurochirurgischer Intervention erhielten 75,3 % der Patienten. Die große Mehrheit wurde mit konventioneller Technik am Linearbeschleuniger mit einer Enddosis von 57,75 Gy oder 60 Gy bestrahlt.
Die
Enddosis
von
57,75
Gy
wurde
dabei
in
einem
hyperfraktionierten Studienkonzept erreicht, wohingegen die Gesamtdosis von 60 Gy normofraktioniert in 30 Einzeldosen à 2 Gy appliziert wurde. Ein kleiner
46 Anteil von Patienten mit Tumorrezidiv wurde nach einer Zweitoperation stereotaktisch
radiotherapiert.
41,6
%
der
Patienten
erhielten
eine
Chemotherapie, üblicherweise simultan und adjuvant zur Strahlentherapie (Tab. 4).
Tab. 4: Therapie der Erlanger Patienten.
Faktor Resektion Resektionsausmaß bei N = 74
Strahlentherapie Methode der Strahlentherapie N = 58 Chemotherapie
Im
Gegensatz
zu
N (%) 77 (100) 74 (96,1) 3 (3,9) 4 (5,4)
Alle Patienten ja nein (nur Biopsie) Tumorrest größer als 50 % des Ausgangsvolumens Tumorrest kleiner als 50 % des Ausgangsvolumens Subtotale Resektion Totale Resektion keine Angabe ja nein keine Angabe Konventionell Stereotaktisch
15 (20,3) 25 (33,8) 12 (16,2) 58 (75,3) 16 (20,8) 3 (3,9) 53 (91,4) 5 (8,6)
ja nein keine Angabe
32 (41,6) 38 (49,4) 7 (9,1)
den
zahlreichen,
teils
18 (24,3)
individuell
modifizierten
Therapiekonzepten des untersuchten Erlanger Patientenkollektivs, wurden die Patienten
aus
der
„Stupp-Studie“
auf
zwei
verschiedenen
Armen
studiengemäß behandelt: Die alleinige Radiotherapie bis 60 Gy wurde als bisherige
Standardtherapie
mit
der
simultanen
und
adjuvanten
Radiochemotherapie mit Temodal® verglichen. Die Strahlentherapie im experimentellen Arm war der Bestrahlung im Standardarm gleich. Das mediane Gesamtüberleben im experimentellen Arm der „Stupp-Studie“ erwies sich mit 14,6 Monaten im Gegensatz zu 12,1 Monaten mit dem Standardregime als signifikant besser, das Zweijahresüberleben betrug 26,5 % beziehungsweise 10,1 %. Das Protokoll des experimentellen Armes
47 der „Stupp-Studie“ wurde aufgrund dieser guten Ergebnisse zum aktuellen Therapiestandard in der Primärtherapie des GBM (Stupp 2006). Das mittlere Überleben der Erlanger Patienten ausgehend vom Zeitpunkt der Operation betrug 14,5 ± 13,5 Monate (410 ± 371 Tage), das mediane Überleben 11,5 Monate (334 Tage) und das Zweijahresüberleben 12,5 % (Abb. 14).
Gesamtüberleben (m) Zweijahresüberleben (%)
Mittelwert Median Standardabweichung
14,5 11,5 13,5 12,5
Abb. 14: Gesamtüberleben ab Operation in Monaten (Histogramm).
Der Anteil der Langzeitüberleber an den bereits zum Zeitpunkt der Auswertung verstorbenen Patienten war 4,2 %. Diese Patienten lebten mehr als drei Jahre nach Diagnosestellung. Das Gesamtüberleben im Erlanger Patientenkollektiv war damit dem Standardarm der Studie von Stupp ähnlich und schlechter als im experimentellen Arm. Wären Patienten mit Rezidiv oder
48 Zweitumoren aus dem Erlanger Kollektiv ausgeschlossen worden, wäre das Gesamtüberleben womöglich besser gewesen. Wie schon in der Literatur beschrieben, erwies sich das Patientenalter auch im Erlanger Patientenkollektiv als prognostisch bedeutender Faktor für das Gesamtüberleben (Krex and Schackert 2008). In der Logrank-Analyse, nach Gruppierung der Patienten am Median von 61 Jahren, zeigte die Gruppe der jüngeren Patienten ein signifikant besseres Überleben als die Patienten mit höherem Lebensalter (Abb. 15). Der Allgemeinzustand zum Zeitpunkt der Operation als zweiter wichtiger prognostischer Faktor bei Patienten mit GBM konnte im Erlanger Kollektiv hingegen nicht bestätigt werden (Abb. 16).
Abb. 15: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit vom Patientenalter in Jahren.
49
Abb. 16: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit vom ECOG-Index.
4.1.2. Anzahl und Lokalisation Tumor-infiltrierender Lymphozyten im GBM Die Häufigkeit der Lymphozyten verschiedener Subpopulationen in den Histologiepräparaten des Erlanger Patientenkollektivs variierte sowohl im Tumorhauptbereich als auch in der Tumorinfiltrationszone, wo der Tumor nach histologischen Kriterien ins intakte Gewebe infiltrierte, sehr stark (Tab. 5). Die CD68+ ortsständigen Mikroglia/Makrophagen waren die mit Abstand am häufigsten vertretenen Immunzellen. Gemessen an der Gesamtzellzahl waren im Mittel 30,3 % der Zellen im Tumorhauptbereich positiv für CD68, in der Infiltrationszone 18,7 %. Der Anteil der CD3+ Lymphozyten betrug dagegen nur 2,64 % im Tumorhauptbereich, beziehungsweise 1,02 % in der Tumorinfiltrationszone. Die CD8+-Zellen waren ähnlich häufig. FoxP3+ Zellen machten schließlich nur 0,19 %, beziehungsweise 0,12 % jeweils gemessen an der Gesamtzellzahl
50 aus. Die Standardabweichungen dieser Messungen waren sehr groß und die Mediane wichen oft erheblich von den dazugehörigen Mittelwerten ab, sowohl in Bezug auf die Infiltration im Tumorhauptbereich als auch in der Tumorinfiltrationszone ab. Einige Tumorproben waren durch eine überaus starke lymphozytäre Infiltration charakterisiert, was die statistischen Parameter entsprechend beeinflusste (Tab. 5).
Tab. 5: Anzahl der TIL pro mm² Tumorfläche im Tumorhauptbereich und in der Infiltrationszone. Zelltyp
GesamtZellzahl MIB-1 CD3 CD8 CD20 CD68 FoxP3
Mittelwert, Median und Standardabweichung pro mm² Tumor Infiltrationszone 2902,9 1019,3 2777,1 871,7 ± 1506,9 ± 753,5 262,3 196,0 131,3 30,9 ± 365,2 ± 449,0 30,0 17,6 12,1 11,0 ± 41,2 ± 19,8 34,7 17,8 7,5 16,6 ± 42,4 ± 20,0 2,0 1,7 1,4 1,6 ± 2,4 ± 1,4 338,0 227,3 321,6 199,4 ± 227,6 ± 153,4 3,6 1,5 1,7 0,0 ± 6,8 ± 1,2
Gefäßfläche prozentual an Gesamtfläche in % mit Mittelwert, Median und Standardabweichung Tumor Infiltrationszone 6,26E-02 4,75E-02 4,92E-02 2,98E-02 ± 4,25E-02 ± 5,02E-02
Mittelwert, Median und Standardabweichung bezogen auf Gesamtzellzahl Tumor Infiltrationszone 1 1 9,18E-02 6,07E-02 ± 1,10E-01 2,64E-02 5,69E-03 ± 1,15E-01 2,50E-02 6,00E-03 ± 8,40E-02 1,64E-03 5,59E-04 ± 4,16E-03 3,03E-01 1,12E-01 ± 1,09E-01 1,86E-03 6,28E-04 ± 4,29E-03
3,91E-02 7,98E-03 ± 5,67E-02 1,02E-02 8,88E-03 ± 7,63E-03 2,33E-02 8,56E-03 ± 3,77E-02 2,09E-03 1,50E-03 ± 1,83E-03 1,87E-01 1,71E-01 ± 1,17E-01 1,17E-03 1,05E-03 ± 9,09E-04
51 Starke interindividuelle Schwankungen ließen sich auch in der Anzahl der MIB1+-Zellen sowie in der Vaskularisierung von Tumorhauptbereich und Infiltrationszone beobachten. Im Mittel waren im Tumorhauptbereich 9,18 % und
in
der
Infiltrationszone
Proliferationsmarker
MIB1.
3,91 % 6,26 %
aller der
Zellen
positiv
für
Gesamtfläche
den des
Tumorhauptbereiches waren durch Gefäß- und Gefäßmalformationen besetzt. Im Infiltrationsbereich betrug die Gefäßfläche bemessen an der Gesamtfläche 3,91 % (Tab. 5). Bei der Begutachtung der mittels Immunhistochemie gefärbten Tumorschnitte fiel auf, dass die TIL vermehrt um die Gefäße lokalisiert waren. Diese Beobachtung war bereits vielfach in der Literatur beschrieben und dort als „perivascular cuffs“ oder perivaskuläre Infiltrate bezeichnet worden. Zur genaueren Quantifizierung der perivaskularen Infiltrate wurden mittels Computer-gestützter Bildanalyse der jeweils kürzeste Abstand eines TIL zum nächst gelegenen Gefäß ermittelt (Tab. 6).
52 Tab. 6: Abstände „Zelle zu Gefäß“ in µm in Abhängigkeit vom Zelltyp Zelltyp
Alle Zellen MIB1 CD68 CD3 CD8 CD20 FoxP3
Mittelwert, Median und Standardabweichung in µm
48,87 35,28 ± 20,635 29,74 26,70 ± 10,03 28,23 22,86 ± 8,68 24,86 18,10 ± 19,21 21,99 16,37 ± 9,11 23,17 15,55 ± 31,17 25,66 18,65 ± 18,93
Anteil der Zellen in Abhängigkeit vom Abstand zum Gefäß (µm) 0 bis 30
30 bis 60
60 bis 90
> 90
0,426 0,397 ± 0,231 0,591 0,573 ± 0,183 0,646 0,639 ± 0,202 0,712 0,750 ± 0,252 0,749 0,758 ± 0,209 0,733 0,852 ± 0,320 0,713 0,750 ± 0,280
0,308 0,322 ± 0,108 0,324 0,333 ± 0,145 0,262 0,270 ± 0,135 0,219 0,174 ± 0,224 0,190 0,158 ± 0,170 0,252 0,143 ± 0,309 0,206 0,178 ± 0,228
0,139 0,145 ± 0,093 0,071 0,050 ± 0,070 0,067 0,043 ± 0,078 0,049 0,000 ± 0,119 0,048 0,000 ± 0,095 0,014 0,000 ± 0,087 0,065 0,000 ± 0,151
0,127 0,040 ± 0,176 0,015 0,000 ± 0,037 0,025 0,000 ± 0,056 0,020 0,000 ± 0,057 0,013 0,000 ± 0,072 0,001 0,000 ± 0,007 0,016 0,000 ± 0,067
Aus diesen Abständen ließ sich für jeden Patienten eine Verteilung der TIL in Abhängigkeit vom Abstand zum Gefäß bilden und graphisch darstellen (Abb. 17). Eine mittlere, standardisierte Verteilung über alle Patienten zeigte, dass die CD3+, die CD8+ und die CD20+-Lymphozyten vermehrt in einem Bereich von bis zu 30 µm um das Gefäß lokalisiert waren (Abb. 18).
53
Abb. 17: Relative Verteilung der CD8+-Lymphozyten in Abhängigkeit des Abstandes (in µm) zum jeweils nächsten Gefäß für die Ermittlung des CutoffWertes.
Abb. 18: Relative Verteilung der Zellen in Abhängigkeit des Abstandes zum jeweils nächsten Gefäß in µm.
54 Mehr als 70 % der dieser TIL Subpopulationen befanden sich innerhalb der 30 µm-Zone um das nächstliegende Gefäß. Als Referenz diente eine für alle im
Tumor
befindlichen
Gesamtzellverteilung
Zellen
konnte
ermittelte
näherungsweise
Verteilung. als
eine
Die
mittlere
Verteilung
der
Tumorzellen betrachtet werden, da die Tumorzellen mit Abstand den größten Anteil aller Zellen im GBM ausmachten. Danach lagen nur 42,6 % der Tumorzellen innerhalb der 30 µm-Zone des nächst gelegenen Gefäßes. Die CD68+ Mikroglia/Makrophagen, von denen bekannt ist, dass sie sich in einer genau definierten räumlichen Distanz zueinander im Hirngewebe anordnen, zeigten eine geringere Affinität zu den nächstliegenden Gefäßen als die Lymphozyten. 64,6 % der gegen CD68 gefärbten Zellen war innerhalb der ersten 30 µm vom Gefäß lokalisiert. Schließlich befanden sich die MIB-1+ Zellen ebenfalls vermehrt in der Nähe des nächstliegenden Gefäßes. Dabei blieb unklar, ob diese Beobachtung als Confounding-Effekt gewertet werden sollte, da aktivierte Immunzellen ebenfalls vermehrt den Proliferationsmarker MIB1 exprimieren. Tumorzellen in unmittelbarer Nähe zu den Gefäßen könnten aber auch eine erhöhte MIB1-Expression vorweisen, da sie in Gefäßnähe eine bessere Versorgung mit Sauerstoff, Nährstoffen und endokrine Botenstoffen vorfinden (Tab. 5). In der graphischen Aufarbeitung der mittleren, standardisierten Verteilungen von TIL und Tumorzellen (Abb. 18) zeigte sich ein Schnittpunkt zwischen der Verteilungslinie der TIL (bunt) und der Gesamt-/Tumorzellen (schwarz) bei etwa 30 µm Abstand zum Gefäß. Innerhalb der ersten 30 µm war der standardisierte Anteil der TIL größer, außerhalb der 30 µm-Zone waren vermehrt Tumorzellen lokalisiert. Diese Beziehung zeigte sich auch, wenn anstatt der mittleren Gesamtverteilungen von TIL und Gesamt-/Tumorzellen, die patientenspezifischen, standardisierten Verteilungen, zum Beispiel für die CD8+ Lymphozyten, auftragen wurden (Abb. 17). Die perivaskuläre 30 µmZone erwies sich somit als geeigneter Parameter, um die Verteilungen der verschiedenen
Lymphozytensubpopulationen
zu
vergleichen
sowie
interindividuelle Unterschiede in den TIL-Verteilungen zu charakterisieren und
55 hinsichtlich ihrer prognostischen Bedeutung für das Patientenüberleben zu untersuchen.
4.1.3. Prognostische Bedeutung der Tumor-infiltrierenden Lymphozyten Zur Überlebenszeitanalyse mit Hilfe der Cox-Regression sowie des KaplanMeier-Schätzers wurden die Patienten anhand der immunhistochemischen Daten gruppiert. Die Aufteilung in zwei Gruppen erfolgte bei der Untersuchung des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit von Gesamt-/Tumorzellzahl, MIB1+Zellzahl und Gefäßfläche jeweils am Median. Bei der Analyse der Ergebnisse aus den Abstandsmessungen erfolgte die Trennung ebenfalls am Median. Die verschiedenen Datensätze waren dabei näherungsweise normalverteilt (Abb. 19).
Gesamtzellen pro mm² im Tumorhauptbereich
Mittelwert Median Standardabweichung 66 %-Perzentile
2902 2777 1507 3553
Abb. 19: Anzahl der Gesamtzellen pro mm² Tumorfläche im Tumorhauptbereich (Histogramm).
56 Bei der Analyse des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit von der Anzahl der TIL erfolgte die Trennung des Patientenkollektivs hingegen an der 66 %Perzentile. Der Grund dafür waren Peaks im oberen Drittel der TILVerteilungen (Abb. 20). Zudem schien die Trennung an der 66 %-Perzentile besser geeignet, das Langzeitüberleben in Abhängigkeit von der Anzahl der TIL zu untersuchen. Die kleine Gruppe der Langzeitüberleber könnte, so die Vorstellung, durch eine 1/3- zu 2/3-Trennung des Patientenkollektivs besser erfasst
werden.
Die
immunhistochemischen
Überlebenszeitanalyse Charakteristika
in
erfolgte
Abhängigkeit nur
für
der den
Tumorhauptbereich. Der Tumorinfiltrationsbereich wurde nicht ausgewertet, da er nicht für alle Tumorproben eindeutig definiert werden konnte.
CD8+-Lymphozyten pro mm² im Tumorhauptbereich
Mittelwert Median Standardabweichung 66 %-Perzentile
Abb. 20: Anzahl der CD8+-Lymphozyten Tumorhauptbereich (Histogramm).
34,7 16,6 42,4 27,6 pro
mm²
Tumorfläche
im
Die Cox-Regressions-Analyse des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit der verschiedenen immunistochemischen Variablen, ließ lediglich auf eine
57 prognostische Bedeutung der CD68+ Mikroglia/Makrophagen schließen. Mit einem Hazard Ratio von 0,49 bei einem 95 %-Konfidenzintervall von 0,25 bis 0,95 erwiesen sich die CD68+ als prognostisch günstig. Eine vermehrte Infiltration mit CD68+-Zellen ging mit einem längeren Überleben der Patienten einher, was in der Kaplan-Meier-Überlebenskurve veranschaulicht wurde (Tab. 7).
Tab. 7: Hazard Ratio und 95 %-Konfidenzintervall aus der Cox-RegressionsAnalyse von Gesamtüberleben in Abhängigkeit der TIL. Zelltyp
Hazard Ratio
95 %-Konfidenzintervall Unteres
Gruppiert nach
Oberes
MIB-1
1,01
0,58
1,78
Median
CD3
0,54
0,29
1,02
66 %-Perzentile
CD8
0,65
0,35
1,22
66 %-Perzentile
CD20
0,64
0,34
1,21
66 %-Perzentile
CD68
0,49
0,25
0,95
66 %-Perzentile
FoxP3
0,62
0,34
1,16
66 %-Perzentile
Gesamt
1,35
0,80
2,29
Median
Gefäße
0,58
0,34
1,00
Median
Die prognostische Bedeutung der CD68+ Mikroglia/Makrophagen bestätigte sich bei Anwendung des Logrank-Tests (Abb. 21). Bei der Cox-Regression deutete sich eine prognostische Bedeutung der CD3+-TIL sowie der relativen Gefäßfläche im Tumor an, ohne dass eine Signifikanz mit 5 %Signifikanzniveau abgeleitet werden konnte.
58
Abb. 21: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit der CD68+-Zellen bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich.
In der Überlebenszeitanalyse mit Kaplan-Meier-Schätzer und Logrank-Test hatte die Tumorzelldichte für das Gesamtüberleben der Patienten eine prognostische 2794 Zellen/mm²
Bedeutung. war
ein
Eine
Tumorzelldichte
prognostisch
negativer
von
größer
Faktor
für
als das
Gesamtüberleben, wenn auch, bei einem p-Wert von 0,048, von schwacher Signifikanz (Abb. 22). Dennoch scheint es plausible, dass eine hohe Zelldichte ein
hochmalignes
Geschehen
mit
Ausbreitungstendenz repräsentieren könnte.
hoher
Wachstums-
und
59
Abb. 22: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit von der Zelldichte im Tumorhauptbereich pro mm² Tumorfläche.
Eine erhöhte Tumorvaskularisierung ging mit einer verbesserten Prognose der Patienten einher. Patienten mit einer Gefäßfläche von mehr als 4,9 % der Gesamtfläche überlebten signifikant länger (p = 0,049) im Vergleich mit Patienten mit geringerer Tumorvaskularisierung (Abb. 23). Über mögliche Ursachen
lässt
sich
nur
spekulieren.
Dabei
könnte
eine
erhöhte
Sauerstoffversorgung eine entscheidende Rolle spielen, da eine ausreichende Tumoroxygenierung eine Voraussetzung für eine wirkungsvolle Therapie mit ionisierender Strahlung und Antineoplastika ist. Tumorhypoxie, hervorgerufen durch eine verringerte Sauerstoffversorgung des Tumors, könnte dagegen die Proliferation von Tumorzellen stimulieren. Beispielsweise stimuliert HIF-1α, der zentrale Mediator der zellulären Antwort auf Hypoxie, Zellproliferation- und Überleben (Vaupel et al. 2007). Eine geringe Tumorvaskularisierung würde eine verminderte Sauerstoffversorgung
60 des Gewebes bedingen, was in den Tumorzellen Proliferations- und Überlebenssignale aktiviert. Dies wiederum könnte das Tumorwachstum beschleunigen und die Prognose der Patienten letztendlich verschlechtern. Beide
Hypothesen
immunhistochemischen immunhistochemische
ließen
sich
mit
Untersuchungen Markierung
der
den
Ergebnissen
jedoch Gefäße
nicht mit
aus
den
belegen.
Die
CD34
sowie
die
bildmorphologischen Kriterien ermöglichten keine eindeutige Unterscheidung zwischen
funktionellen
Gefäßen
und
Gefäßmalformationen.
Gefäßmalformationen, die Ausdruck der dysregulierten Angiogenese und Vaskulogenese im GBM sind, tragen schließlich kaum zu einer ausreichenden Blutversorgung des Tumorgewebes bei.
Abb. 23: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit von der Gefäßfläche bezogen auf die Tumorgesamtfläche.
61 Die Marker MIB-1, CD3, CD8 und CD20 erwiesen sich nicht als prognostische bedeutende Faktoren für das Überleben der Patienten. Lediglich bei den CD3+ T-Lymphozyten
war
eine
vermehrte
Infiltration
tendenziell
mit
einen
verlängerten Überleben verbunden (Abb. 24). Die mögliche prognostische Bedeutung
der
FoxP3+
TIL
war
die
Hauptfragestellung
der
immunhistochemischen Untersuchungen am Erlanger Patientenkollektiv. In anderen Tumorerkrankungen war den immunsupprimierenden FoxP3+ TIL eine
prognostisch
negative
Bedeutung,
im
Sinne
einer
Überlebenszeitverkürzung zugeschrieben worden. Man nahm an, dass Tumorzellen die FoxP3+-TIL gezielt anlocken und sich damit ein Immunprivileg verschaffen könnten (Zitvogel 2006). Zuletzt war in einigen Tumorentitäten auch die Expression von FoxP3+ durch die Tumorzellen selbst beschrieben worden (Ebert 2008; Hinz 2007; Zuo 2007). Bei den Untersuchungen des Erlanger Patientenkollektivs zeigten die mit FoxP3 gefärbten Zellen ausschließlich histomorphologische Kriterien von Lymphozyten. Die mit FoxP3 gefärbten Zellkerne waren klein, dicht und rund. Der Zytoplasmasaum der FoxP3 gefärbten Zellen war sehr schmal. Insgesamt waren die FoxP3 gefärbten Zellen deutlich kleiner als die Tumorzellen. Damit zeigte sich im Erlanger Patientenkollektiv mit den oben beschriebenen immunhistochemischen Methoden keine Expression von FoxP3 in den Tumorzellen, sondern nur in den Treg.
62
Abb. 24: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit der MIB-1+-Zellen (links oben), CD20+ Lymphozyten (links unten), CD3+ Lymphozyten (rechts oben) und CD8+ Lymphozyten (rechts unten) jeweils bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich.
Die Anzahl der FoxP3+ Treg war, wie oben beschrieben, sehr gering und betrug im Tumorhauptbereich 0,19 % aller Zellen und 7,04 % aller CD3+-TLymphozyten. Diese Resultate entsprachen den Angaben aus der Literatur (El Andaloussi and Lesniak 2006b). Im Gegensatz zu vorangegangenen Studien (El Andaloussi 2006a; Fecci 2006) bestätigte sich die negativ prognostische Bedeutung der Treg im Erlanger Patientenkollektiv jedoch nicht (Abb. 25). In der Kaplan-Meier-Analyse des Erlanger Kollektivs zeigten Patienten mit erhöhter Infiltration durch Treg ein verlängertes Überleben. Der Unterschied zu den Patienten mit weniger Treg im Tumorhauptbereich war mit p = 0,130 jedoch nicht signifikant.
63
Abb. 25: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit der FoxP3+-Lymphozyten bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich.
Um die Bedeutung möglicher Interaktionen der TIL für das Gesamtüberleben der Patienten zu untersuchen, wurden Verhältnisse verschiedener TIL Subpopulationen prognostische
zueinander
Bedeutung
bestimmt.
des
Dabei
Quotienten
aus
fiel
besonders
Treg
zu
die
CD68+
Mikroglia/Makrophagen auf. Ein großer FoxP3/CD68-Quotient war mit einem signifikanten (p = 0,037) Überlebensvorteil assoziiert (Abb. 26). Somit war das Überleben der Patienten bei hoher Treg-Anzahl und/oder niedriger Anzahl der Mikroglia/Makrophagen verlängert. Dieses Resultat war erstaunlich, da die hohe Anzahl von Mikroglia/Makrophagen unabhängig von der Anzahl der Treg prognostisch günstig war. Eine Erklärung für diesen Widerspruch ließ sich aus den
vorliegenden
Ergebnissen
nicht
schließen.
Im
Gegensatz
zum
FoxP3/CD68-Quotienten hatten die Verhältnisse von CD3+ T-Lymphozyten zu
64 CD68+ Mikroglia/Makrophagen sowie der Anteil der Treg im CD3+ TZellkompartiment keine prognostische Bedeutung (Abb. 26).
Abb. 26: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit von den Verhältnissen der FoxP3+ zu CD68+ Zellen (Mitte oben), der FoxP3+ zu CD3+-Lymphozyten (links unten) und der CD3+ zu CD68+ Zellen (rechts unten) jeweils im Tumorhauptbereich.
65
Die Lokalisation der Treg im Tumorhauptbereich war ebenfalls ohne prognostische Relevanz. Das Überleben wurde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Treg innerhalb der 30 µm-Zone um das nächstgelegene Gefäß getestet. Patienten, wo sich mehr als 73 % aller Tumor-infiltrierenden Treg innerhalb
der
30
µm-Zone
befanden,
zeigten
nahezu
das
gleiche
Gesamtüberleben wie Patienten, bei denen kleiner oder gleich 73 % aller FoxP3+-Zellen innerhalb der 30 µm-Zone lokalisiert waren (Abb. 27).
Abb. 27: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit vom Abstand der FoxP3+ Lymphozyten zum Gefäß.
Das Überleben der Patienten war außerdem unabhängig von der Lokalisation der MIB1+ Zellen, der CD3+ T-Lymphozyten, der CD20+ B-Lymphozyten sowie
66 der CD68+ Mikroglia/Makrophagen (Abb. 28). Das Versuchsvorgehen war dabei stets gleich. Untersucht wurde die Häufigkeit der verschiedenen Zelltypen innerhalb der 30 µm-Zone zum nächstgelegenen Gefäß. Die Gruppierung
der
Patienten
erfolgte
jeweils
am
Median
der
Häufigkeitsverteilung und die statistische Testung erfolgte mittels LogrankTest. Die teils deutlichen Unterschiede in der Lokalisation der TIL, die weiter oben beschrieben sind, hatten allesamt keine prognostische Bedeutung für das Gesamtüberleben im Erlanger Patientenkollektiv.
Abb. 28: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit vom Abstand der MIB1+Zellen (links oben), der CD20+ B-Lymphozyten (links unten), der CD3+ TLymphozyten (rechts oben) und der CD68+ Mikroglia/Makrophagen (rechts unten) zum Gefäß.
67 4.2. Ergebnisse aus Chemotaxis-Untersuchungen 4.2.1. Konzentrationsausgleich in der Boyden-Chamber Der Konzentrationsausgleich zwischen oberer und unterer Kammer erfolgte nach Zugabe von Phenolrot in die untere Kammer sehr rasch. Nach circa 30 bis 40 min erreichte die Konzentration in der oberen Kammer ein konstantes Plateau, der Konzentrationsausgleich war damit abgeschlossen. Zwar kann man davon ausgehen, dass die kleinen Phenolrot-Moleküle (Molekulargewicht = 354,38 g/mol) rascher diffundieren als Chemokine (Molekulargewicht = 8000 bis 14000 g/mol), dennoch dürfte sich auch bei den Chemokinen rasch ein Konzentrationsausgleich eingestellt haben (Entschladen 2005) (Abb. 29).
Abb. 29: Diffusion von Phenolrot durch MultiScreen®-Membran mit 3 µmPorendurchmesser in Abhängigkeit von der Diffusionszeit in Minuten.
4.2.2. Charakterisierung der Primärzelllinien GFAP ist ein hochspezifischer, zytoplasamatischer Marker für astrogliale Zellen. Nach längerer in vitro-Kultivierung kann die GFAP-Produktion vermindert sein, was sich an den LN18 und A172 Zelllinien zeigte. Die selbst etablierten
Primärzelllinien
zeigten
im
Immunostaining
allesamt
eine
ausgeprägte Anfärbung mit dem anti-GFAP-Antikörper. Im Gegensatz zu den
68 LN18 und A172 Zellinien, war die GFAP-Färbung innerhalb der einzelnen Primärzelllinien sehr polymorph (Abb. 30).
Abb. 30: Doppelfärbung von Glial fibrillary acid protein (GFAP; grün) und DAPIFärbung (Kern; blau) bei primären und sekundären Glioblastoma multiformeZellkulturen (primär: KD, BS, BT, RA und RE2; sekundär: A172 und LN18).
Die Primärkulturen beinhalteten wahrscheinlich verschiedene Tumorzellklone und nicht-tumoröse Zellen astroglialen Ursprungs. Zur Produktion der Tumorüberstände war der polymorphe Charakter der Primärzelllinien als positiv anzusehen. Die Primärzellinien waren dem komplexen Tumormilieu ähnlicher als die monoklonalen A172 und LN18 Glioblastomzelllinien. In früheren Untersuchungen von Wagner nahmen die IL-10-Spiegel während der
69 Etablierung und weiteren Kultivierung von Glioblastomzellkulturen stark ab. Vermutlich führte die Abnahme der CD68+ Mikroglia und Makrophagen, die als Hauptproduzenten für IL-10 im GBM-Tumormilieu identifiziert werden konnten, zum Abfall der IL-10-Spiegel nach Etablierung und Kultivierung der (Wagner et al. 1999). Das
Wachstum
der
Primärkulturen
wurde
beim
Passagieren
lichtmikroskopisch beobachtet. In den Primärkulturen fanden sich häufig übereinander wachsende Zellen und ausgeprägte Zellklumpen, was als Zeichen unkontrollierten Wachstums bewertet wurde (Abb. 31). Im Gegensatz dazu würden nicht-neoplastische Zellen, zum Beispiel Hautfibroblasten, Wachstum und Teilung durch Kontaktinhibition einschränken, nachdem der Flaschenboden vollständig bedeckt ist.
70
Abb. 31: Primärkultur BRA: verschiedene Bereiche in Zellkulturflasche.
71 4.2.3. Calcein zur Detektion migrierter Zellen Calcein und Höchst 33342 sind Fluoreszenzfarbstoffe für in vitro- und in vivoMigrationsuntersuchungen an Lymphozyten. Während Höchst 33342 ähnlich wie DAPI an Adenosin-Thymidin-reiche Regionen der DNS bindet, verbleibt Calcein nach Bindung an Proteine im Zytoplasma der Lymphozyten (Parish 1999). Calcein erwies für diese Untersuchungen als geeigneter. Die Differenzen zwischen den Messpunkten waren bei beiden Farbstoffen ähnlich, der Hintergrund nach Calceinfärbung und Messung mit dem HTS 7000 MultiAssay-Reader jedoch geringer (Abb. 32).
Abb. 32: Detektion der Lymphozyten mittels Multi-Assay-Reader nach Calceinoder H33342-Färbung.
Verschiedene
Studien
hatten
belegt,
dass
Calcein
auch
in
hohen
Konzentrationen keinen Einfluss auf zelluläre Funktionen ausübt (Parish 1999). In einer in vivo-Studie wurde jedoch gezeigt, dass eine bestimmte Lymphozytensubpopulation besonders viel Calcein aufnehme und dass bei dieser Subpopulation das homing über die high endothelial venules eingeschränkt ist (Weston et al. 1992). In einer weiteren Veröffentlichung war zudem beschrieben worden, dass die Migration von Monozyten durch Calcein gehemmt werden kann (Czepluch et al. 2007). In dieser Studie waren die Monozyten für 30 min mit 8,03 µM Calcein-Lösung inkubiert worden.
72
In den eigenen Untersuchungen übte Calcein jedoch keinen Einfluss auf die Migration von Lymphozyten aus. Die Lymphozyten wurden 45 min mit 0,5 µM Calcein gefärbt, das überschüssige Calcein, das noch nicht in die Zellen aufgenommen worden war, mit 1xPBS ausgewaschen und die Zellen nach Zentrifugation in RPMI-Medium plus 0,2 % BSA für die Migration resuspendiert (Abb. 32-35).
Abb. 33: Detektion der Lymphozyten mittels Multi-Assay-Reader nach CalceinFärbung mit und ohne Auswaschen des überschüssigen Calceins.
73
Abb. 34: Ermittlung einer möglichst niedrigen Calcein-Konzentration (in µM).
Abb. 35: Einfluss von Calcein auf die Migration.
4.2.4. Einfluss der Migrationszeit auf die Migration Die Migrationszeit sollte so gewählt werden, dass die Unterschiede zwischen stimulierten und unstimulierten Lymphozyten möglichst gut zur Darstellung kamen. Bei Verwendung der Millipore MultiScreen®-Membranen mit 3 µm Porendurchmesser erwies sich für die Migration eine Zeitspanne von 3 h als günstig.
Bereits
nach
5 min
waren
erste
Lymphozyten
an
der
74 Membranunterseite mittels Immunofluoreszenzfärbung und -mikroskopie detektierbar. Mit dem Multi-Assay-Reader-Verfahren zeigten sich nach spätestens 1 h deutliche Unterschiede im chemokinetischen Verhalten der Lymphozyten. Bei längeren Migrationszeiten fielen die Unterschiede meistens deutlicher aus. Bei Verwendung der Millipore MultiScreen®-Membranen mit 5 µm Porendurchmesser, wanderten die Lymphozyten schneller in das untere Well (Abb. 36-38).
Abb. 36: Detektion von Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) an der Membranunterseite.
Abb. 37: Einfluss der Migrationszeit auf den Migrationsindex.
75
Abb. 38: Verwendung von Millipore MultiScreen Membranen mit 3 µm und 5 µm Porendurchmesser im Vergleich. Migration von Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) mit Migrationszeiten von 2 und 4 h.
4.2.5. Einfluss des Kulturmediums auf die Migration Fötales,
bovines
Serum
(FBS)
enthält
zahlreiche
Wachstums-
und
Botenstoffe. Es kann als einfacher und sicherer Lockstoff zur Etablierung von Migrationsassays eingesetzt werden. Zur Etablierung der Migrationsversuche wurde DMEM mit 10 % FBS als Lockstoff eingesetzt. Serumfreies DMEM und 1xPBS mit jeweils 0,2 % BSA dienten als Negativkontrollen (Abb. 39).
76
20000 15000 10000 5000
PBMC
CD8+
RPMI+10%FBS
RPMI+0,2%BSA
PBS+0,2%BSA
RPMI+10%FBS
RPMI+0,2%BSA
PBS+0,2%BSA
RPMI+10%FBS
RPMI+0,2%BSA
0
PBS+0,2%BSA
Lymphozyten pro well (150 µl)
25000
CD4+
Abb. 39: RPMI plus 10 % FBS als Chemoattractant.
Aufgrund der chemotaktischen Wirkung von FBS wurde bei der Gewinnung der Tumorüberstände aus den GBM-Zelllinien DMEM mit 2 % FBS zur Kultivierung
eingesetzt.
Damit
sollte
den
Zellen
ausreichend
Wachstumsfaktoren zur Verfügung gestellt werden, aber gleichzeitig ein zu großer Einfluss des FBS auf die späteren Migrationsversuche vermieden werden. In den Migrationsversuchen diente frisches DMEM mit 2 % FBS als Kontrolle. Eine interessante Beobachtung war schließlich, dass die Zeit, die die Lymphozyten im Medium verbrachten, erheblichen Einfluss auf die Migration hatte. In einem Vergleichsversuch wurden in einem Ansatz Lymphozyten nach Isolation, Waschen und Zugabe frischen Mediums zum Zeitpunkt 0, 2 und 4 h in die 96-well Platte aufgetragen und die Migration zum Zeitpunkt 6 h gestoppt. Die Lymphozyten waren damit 2, 4 beziehungsweise 6 h gewandert. Das Medium aller Lymphozyten wurde einmalig zum Zeitpunkt 0 h ausgetauscht. Die Ergebnisse fielen überraschend aus. Die meisten Lymphozyten waren nicht nach 6-stündiger Migration, sondern nach 2 h Migrationszeit gewandert. Die Wiederholung des Versuchs bestätigte dieses Ergebnis (Abb. 40).
77
Abb. 40: 2, 4, 6-stündige Migration von Lymphozyten mit Auftragen nach 0, 2 und 4 h und gemeinsamen Stopp nach 6 h.
Im zweiten Ansatz betrugen die Migrationszeiten ebenfalls 2, 4 und 6 h. Jedoch wurden alle Lymphozyten nach Waschen, Zentrifugation und Resuspension in frischem Medium zum Zeitpunkt 0 h ausgesät und die Migration entsprechend nach 2, 4 und 6 h gestoppt. Wie erwartet wanderten bei 6 h Migrationszeit die meisten Lymphozyten, bei 2 h am wenigsten (Abb. 41).
78
Abb. 41: 2, 4, 6-stündige Migration von Lymphozyten mit gemeinsamen Auftragen und Stopp nach 2, 4 und 6 h.
Auf den ersten Blick scheinen beide Versuche identisch. Die unterschiedlichen Ergebnisse sind vermutlich auf folgenden, entscheidenden Unterschied zurückzuführen: die Lymphozyten aus dem ersten Ansatz, die zu den späteren Zeitpunkten ausgesät wurden, verblieben für 2 h beziehungsweise 4 h im Medium und sezernierten Boten- und Wachstumstoffe. Das Medium wurde unmittelbar vor dem Aussäen nicht mehr ausgetauscht, die Lymphozyten wurden in dem konditionierten Medium aufgetragen. Dadurch wurde das Migrationsverhalten
nachhaltig
beeinflusst.
Für
die
darauf
folgenden
Versuchen war es deshalb umso wichtiger, alle Lymphozyten unmittelbar vor dem Auftragen auf die 96-wells (Zeitpunkt: 0 h) durch einen zusätzlichen Waschvorgang
und
Zugabe
von
frischen
Medium
in
die
gleiche
Ausgangsposition zu bringen, zumal das Isolieren der verschiedenen Lymphozytensubpopulationen
unterschiedlich
lange
dauerte
und
die
Lymphozyten bis zum Versuchsbeginn unterschiedlich lange in ihrem Medium verweilten.
79 4.2.6. Migration auf A172- und LN18-Überstände Unabhängig von der Behandlungsmodalität (Tumor unbehandelt, 2 Gy, TMZ, 2 Gy + TMZ), zeigten PBMC und CD8+ Lymphozyten auf Überstände der beiden etablierten Zelllinien A172 und LN18 eine verstärkte Migration (Abb. 42).
Abb. 42: Migration von Spenderlymphozyten (PBMC) auf verschiedene Kontrollen und Tumorüberstände.
Die Migration der Treg wurde dagegen nur durch Überstände der LN18Tumorzellen verstärkt. CD4+ sowie CD4+CD25- Lymphozyten wurden weder durch die Tumorüberstände von A172 noch durch die Überstände von LN18 angelockt. Die Migration der CD4+ sowie der CD4+CD25- Lymphozyten auf die Tumorüberstände war im Vergleich zur Migration auf das Kontrollmedium sogar vermindert. Es konnte kein konstanter, von den Tumorzelllinien unabhängiger
Einfluss
einzelner
Behandlungsmodalitäten
auf
die
chemotaktische Wirkung der Tumorüberstände festgestellt werden. Die
80 Migration der verschiedenen Lymphozytensubpopulationen wurde im Mittel allenfalls durch Überstände aus der Kombinationsbehandlung von 2 Gy + TMZ verstärkt aktiviert. Dabei könnte die Kombinationsbehandlung von 2 Gy + TMZ die höchsten Apoptose- und Nekroseraten in den Tumorzelllinien hervorgerufen haben. Die daraus resultierende Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren könnte wiederum die verstärkte Migration besonders der CD8+ Lymphozyten verursacht haben. Die Migration der CD8+ Lymphozyten war um die Faktoren 1,4 (A172) beziehungsweise 2,1 (LN18) nach Kombinationsbehandlung der Tumorzellen mit 2 Gy plus TMZ im Vergleich zur Wanderung auf das Kontrollmedium verstärkt.
4.2.7. Migration auf Primärüberstände Die Migration auf die verschiedenen Überstände aus den Primärkulturen war sehr unterschiedlich. Ein eindeutiges Muster war nur schwer auszumachen. Bei genauer Betrachtung der Ergebnisse, insbesondere der Migration bei Verwendung der Tumorüberstände von KD- und BS-Primärkulturen, schien die Migration abhängig von der Behandlungsform der Tumorzellen, aber unabhängig von der verwendeten Lymphozytensubpopulation (PBMC, CD8+ und Treg). Die lymphozytäre Migration auf die unbehandelten und die mit 2 Gy plus TMZ kombiniert behandelten Überstände von KD und BS war erhöht. Eine Behandlung mit entweder 2 Gy oder TMZ steigerte die Migrationsrate im Vergleich zur Kontrolle mit Medium jedoch nicht (Abb. 43, 44).
81
Abb. 43: Migrationsindex: Spenderlymphozyten (PBMC, CD8+, CD4+) auf KDTumorüberstände (Kontrolle Tumor, 2 Gy, 10 µM TMZ, 2 Gy + 10 µM TMZ).
82
Abb. 44: Migrationsindex: Spenderlymphozyten (PBMC, CD8+, CD4+) auf BSTumorüberstände (Kontrolle Tumor, 2 Gy, 10 µM TMZ, 2 Gy + 10 µM TMZ).
Ein ähnliches Migrationsverhalten zeigte sich bei den Überständen von RA und RE2 (Abb. 45, 46). Wie schon andeutungsweise bei der Migration auf die Überstände der etablierten A172- und LN18-Tumorzelllinien zu erkennen war, bewirkte insbesondere die Kombinationsbehandlung mit 2 Gy und TMZ bei den Primärkulturen eine gesteigerte Migrationsrate. Insbesondere bei Überständen von BS- und RE2-Primärkulturen zeigte sich der Effekt der Kombinationsbehandlung deutlich.
83
Abb. 45: Migrationsindex: Spenderlymphozyten (PBMC, CD8+, CD4+) auf RATumorüberstände (Kontrolle Tumor, 2 Gy, 10 µM TMZ, 2 Gy + 10 µM TMZ)
84
Abb. 46: Migrationsindex: Spenderlymphozyten (PBMC, CD8+, CD4+) auf RE2Tumorüberstände (Kontrolle Tumor, 2 Gy, 10 µM TMZ, 2 Gy + 10 µM TMZ).
Davon abweichend war die Migrationsrate bei Überständen der BTPrimärkultur bei alleiniger Vorbehandlung mit Chemotherapie erhöht (Abb. 47). Insgesamt waren die Migrationsindices eher klein, sowohl bei Verwendung von A172- und LN18-Überständen als auch bei der Migration auf Überstände aus den Primärkulturen. Selten überschritt die Migration auf die Tumorüberstände im Verhältnis zur Migration auf das Kontrollmedium den Faktor 2.
85
Abb. 47: Migrationsindex: Spenderlymphozyten (PBMC, CD8+, CD4+) auf BTTumorüberstände (Kontrolle Tumor, 2 Gy, 10 µM TMZ, 2 Gy + 10 µM TMZ).
86 5. Diskussion Curiels
Arbeit
über
die
Rolle
der
regulatorischen
T-Lymphozyten
im
Ovarialkarzinom war für die Tumorimmunologieforschung bahnbrechend (Curiel 2004). Erstmals war der Blick auf diese kleine Lymphozytensubpopulation mit immunsuppressiven Eigenschaften gerichtet, die eine entscheidende Bedeutung für die Progression einer Tumorerkrankung und damit für die Prognose der Patienten hatte. Fecci übertrug die Erkenntnisse von Curiel auf die Tumorimmunologie beim GBM und
schien
damit
die
bereits
lange
bekannte
lokale
und
globale
Immunsuppression in Patienten mit malignen Gliomen erklären zu können (Fecci 2006). Die Arbeitsgruppe von Fecci beobachtete eine vergrößerte Treg-Fraktion innerhalb des CD4+-Kompartiment von Patienten mit malignen Gliomen. Depletion der Treg mit einem anti-CD25-Antikörper in vitro konnte die im CD4+Kompartiment beobachteten immunsuppressiven Effekten der Treg egalisieren (Fecci 2006). In einem kleinen Kollektiv von zehn Glioblastompatienten beobachtete El Andaloussi eine erhöhte Anzahl von Treg im Tumorgewebe und in der Zirkulation (El Andaloussi and Lesniak 2006b). In weiteren Untersuchungen an einem GBM-Mausmodell führte die Depletion der Treg zur spontanen Remission von Tumoren und verlängerte das Überleben der Mäuse (El Andaloussi 2006a; Fecci 2006). Zudem wurde gezeigt, dass GBMTumorzellen durch Sekretion des CC-ligands (CCL) 2 regulatorischen T-Zellen anlocken können (Jordan 2008). Man vermutete, dass sich die GBM-Tumorzellen durch Anlockung der immunsuppressiven Treg aktiv der immunologischen Tumorabwehr entziehen könnten. In den bisherigen Studien über Tumor-infiltrierende Treg im Glioblastoma multiforme wurde die prognostische Bedeutung der Treg für die Patienten noch nicht dezidiert untersucht. Der möglich, negative Effekt der Treg für der Prognose der Patienten wurde von den in vitro-Daten und den Erkenntnissen aus den Mausmodellen abgeleitet. Die bisherigen Untersuchungen an menschlichen Tumorproben waren deskriptiv und umfassten nur kleine Patientenkollektive. Der
87 direkte Vergleich mit der Anzahl und prognostischen Bedeutung anderer TILSubpopulationen erfolgte bisher nicht. Ziel dieser Untersuchungen war es deshalb in einem größeren Patientenkollektiv von insgesamt 77 Patienten die Anzahl, Lokalisation und prognostische Bedeutung der Tumor-infiltrierenden Treg genauer zu bestimmen, eine mögliche Bedeutung für die Prognose der Patienten abzuleiten und Beziehungen zu anderen TIL-Subpopulationen zu untersuchen. Die Migrationsuntersuchungen sollten zudem Aufschluss darüber geben, ob GBM-Tumorzellen Treg im Vergleich zu anderen Lymphozytensubpopulationen selektiv anlocken können und sich somit ein Immunprivileg verschaffen könnten. In Bezug auf Alter, Geschlechtsverteilung und Allgemeinzustand war das ausgewählte Patientenkollektiv dem Kollektiv der großen „Stupp-Studie“ sehr ähnlich (Stupp 2005) und konnte damit als repräsentativ betrachtet werden. Das Gesamtüberleben
der
Erlanger
Patienten
entsprach
in
etwa
dem
des
Radiotherapiearmes der „Stupp-Studie“. Es war schlechter als das Überleben im experimentellen Arm mit Radiochemotherapie, obwohl bereits viele Erlanger Patienten entsprechend dieses Protokolls behandelt worden waren. Mögliche Ursachen für das kürzere Gesamtüberleben im Vergleich zum experimentellen
Arm
der
„Stupp-Studie“
waren
neben
unterschiedlichen
Therapiekonzepten auch verschiedene Einschlusskriterien. In dem untersuchten Erlanger Patientenkollektiv waren im Gegensatz zur „Stupp-Studie“ Patienten mit Rezidiv und Zweittumoren, aber nicht Patienten mit prognostisch günstigeren Anaplastischen
Astrozytomen
eingeschlossen.
Unter
ähnlichen
Einschlusskriterien wie die der „Stupp-Studie“ wäre das Gesamtüberleben des Erlanger Patientenkollektives womöglich besser gewesen. Trotz der weniger restriktiven Einschlusskriterien schien das Erlanger Patientenkollektiv gut geeignet, um die Bedeutung der TIL im GBM zu untersuchen. Patientenalter, Karnofsky-Index und MGMT-Methylierungsstatus sind die bisher einzig etablierten, prognostisch bedeutsamen Faktoren beim GBM (Hegi 2005; Krex and Schackert 2008). Im Erlanger Patientenkollektiv erwies sich das
88 Patientenalter als prognostisch wichtiger Faktor. Ältere Patienten hatten ein signifikant schlechteres Überleben als junge Patienten. Da der Karnofsky-Index der Erlanger Patienten nicht routinemäßig bestimmt worden war, wurde die Abhängigkeit des Gesamtüberlebens vom ECOG-Index untersucht. In der statistischen Analyse zeigte sich jedoch keine prognostische Relevanz des ECOG-Index für das Gesamtüberleben. Dies könnte daran liegen, dass der fünf-stufige ECOG-Index den Allgemeinzustand weniger genau erfasst als der 100-Punkte-Karnofsky-Index. Ein Großteil der Patienten im untersuchten Erlanger
Patientenkollektiv
war
als
ECOG
1
eingestuft
worden.
Der
durchschnittliche Allgemeinzustand war also recht gut. Auch deshalb könnte der Allgemeinzustand im Erlanger Patientenkollektiv keine signifikante Bedeutung für das Überleben gehabt haben. Die quantitative Erfassung der TIL zeigte, dass die CD68+ Mikroglia/Makrophagen mit 30,3 % aller Zellen im Tumor das Gros der Immunzellen darstellten. Dieses Ergebnis deckte sich mit den Beobachtungen aus zahlreichen anderen Studien (Hitchcock and Morris 1988; Morimura 1990; Nishie 1999; Roggendorf 1996). Die Sonderstellung der Mikroglia/Makrophagen im GBM ist ein wesentlicher Unterschied
zur
Tumorimmunologie
in
anderen
Tumorerkrankungen,
wo
Makrophagen oft nur eine Nebenrolle einnehmen. Bis zu 3 % aller Zellen im GBM waren CD3+ und/oder CD8+, ein deutlich geringerer Anteil als vorangegangene Studien ermittelt hatten (Farmer 1989; Hitchcock and Morris 1988). Der Anteil der FoxP3+-Zellen betrug nur 0,19 % im Tumorhauptbereich
und
0,12
%
in
der
Tumorinfiltrationszone.
Im
Tumorhauptbereich befand sich also eine erhöhte Infiltration mit TIL im Vergleich zur Tumorrandzone. Der Anteil der FoxP3+ Zellen an der Gesamtzahl aller CD3+ T-Lymphozyten
betrug
im
Tumorhauptbereich
durchschnittlich
6,9
%.
Aussagekräftige Vergleichswerte aus anderen Studien existierten nicht, da diese mit
anderen
Meßmethoden,
zum
Beispiel
arbeiteten (El Andaloussi and Lesniak 2006b).
flußzytometrischen
Verfahren,
89 Die TIL waren diffus sowie perivaskulär im GBM lokalisiert, wie es bereits von zahlreichen Autoren beschrieben worden war (Bertrand and Mannen 1960; Ridley and Cavanagh 1971; Takeuchi and Barnard 1976). Die Abstände zwischen TIL und Gefäßen waren bisher nicht quantifiziert worden. Mit der Bestimmung des jeweils kürzesten Abstandes der TIL zum nächstgelegenen Gefäß, konnte in dieser Studie die Lokalisation der verschiedenen TIL-Subpopulationen für jeden Patienten ermittelt werden. Als charakteristischer Marker wurde der Anteil der TIL innerhalb der 30 µm-Zone zum nächsten Gefäß definiert. Über das gesamte Patientenkollektiv betrachtet hatten mehr als 70 % der CD3+, der CD8+, der CD20+ und der FoxP3+ Lymphozyten einen Abstand von weniger als 30 µm zum nächsten Gefäß. Als Referenz diente die Verteilung aller Zellen, die näherungsweise als Verteilung der Tumorzellen betrachtet werden konnte. Danach hatten 42,6 % aller Tumorzellen einen Abstand von weniger als 30 µm zum nächsten Gefäß. Die Immunzellen zeigten somit eine ausgeprägte Affinität zu den Gefäßen. Diese Affinität war unterschiedlich stark ausgeprägt. Die CD68+ Mikroglia/Makrophagen waren mit 64,6 % weniger innerhalb der 30 µm-Zone lokalisiert als die oben beschriebenen TIL-Subpopulationen. Erstaunlicherweise zeigten auch die MIB1+ Zellen mit durchschnittlich 59,1 % eine deutliche Affinität zu den Gefäßen, obwohl eine Verteilung nahe der Verteilung der Tumorzellen erwartet worden war. Die Lokalisation der MIB1+ Zellen nahe den Gefäßen könnte damit erklärt werden, dass aktivierte Immunzellen, die vermehrt um die Gefäße lokalisiert sind, MIB1+ exprimieren. Daneben könnten aber auch Tumorzellen in unmittelbarer Nähe zu den Gefäßen vermehrt MIB1+ als Zeichen gesteigerter Zellaktivierung- und Proliferation exprimieren. In der Nähe von Gefäßen ist nämlich eine gute Versorgung mit Sauerstoff, Nährstoffen und endokrinen Botenstoffen zu erwarten. Eine prognostische Bedeutung der Anzahl Tumor-infiltrierender Treg im GBM ließ sich nicht feststellen. Das Gesamtüberleben der Patienten war unabhängig von der Anzahl der Treg bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich. Lediglich ein hoher FoxP3/CD68-Quotient ging mit einem längeren Überleben der
90 Patienten einher. Dieses Resultat war erstaunlich, da sich die CD68+ Makrophagen/Mikroglia in der Auswertung der Einzelfaktoren als prognostisch günstig erwiesen. In Zusammenhang mit dem FoxP3/CD68-Quotienten war dagegen eine geringe Anzahl CD68+-Zellen und/oder eine hohe Anzahl FoxP3+Lymphozyten mit einem längeren Überleben der Patienten verbunden. Die prognostische Bedeutung des FoxP3/CD68-Quotienten führte indirekt zur Verwerfung der ursprünglichen Arbeitshypothese, wonach eine verstärkte Infiltration des GBM mit den immunsupprimierenden Treg in einem schlechteren Gesamtüberleben resultieren würde. Diese Vermutungen, die auf den Daten aus in vitro- und Mausmodellen basierten (El Andaloussi and Lesniak 2006b; Fecci 2006), ließen sich im Erlanger Patientenkollektiv nicht bestätigen. Neben der prognostischen Bedeutung der CD68+ Mikroglia/Makrophagen, waren sowohl die Gesamtzellzahl als auch die Vaskularisierung im Tumorhauptbereich von
prognostischer
Relevanz.
Es
zeigte
sich,
dass
eine
vermehrte
Gesamtzellzahl pro Tumorfläche ein prognostischer Marker für ein verkürztes Gesamtüberleben der Patienten war. Möglicherweise weist ein besonders zellreicher Tumor eine höhere Progression als Tumoren mit einer geringeren Zelldichte auf. Eine große Gefäßfläche in Relation zur Tumorgesamtfläche war ein prognostisch günstiger
Marker
für
die
Patienten.
Die
Erklärungsmöglichkeiten
sind
mannigfaltig. Zum Beispiel könnte eine ausgeprägte Tumorvaskularisierung den Blutfluss im und damit die Sauerstoffversorgung des Tumorgewebes verbessern. Eine hohe Sauerstoffsättigung wäre wiederum Voraussetzung für eine gute Wirksamkeit der Strahlentherapie, deren zytotoxische Effekte auf die Bildung von Sauerstoffradikalen und deren schädigende Wirkung für die DNS zurückzuführen sind. Eine ausgeprägte Tumorvaskularisierung könnte also ein besseres Ansprechen der Strahlentherapie ermöglichen. Ebenso wäre es denkbar, dass eine schlechte Sauerstoffversorgung aufgrund einer geringen Tumorvaskularisierung Stress- und Gefahrsignalkaskaden in den Tumorzellen
aktiviert.
Die
Ausschüttung
von
Angiogenese-
und
Proliferationsmediatoren als Antwort auf die Sauerstoffunterversorgung des
91 Tumorgewebes könnte unspezifisch das Tumorzellwachstum ankurbeln (Vaupel and Mayer 2007). Diese Hypothesen ließen sich mit den Ergebnissen aus den immunhistochemischen
Untersuchungen
jedoch
nicht
belegen.
Die
immunhistochemische Markierung mit dem Endothelmarker CD34 sowie die bildmorphologischen Kriterien ermöglichten keine eindeutige Unterscheidung zwischen funktionellen Gefäßen und Gefäßmalformationen und ließen damit keinen exakten Rückschluss auf die Gewebeperfusion zu. Das Gesamtüberleben der Patienten zeigte keine Abhängigkeit von der Anzahl der CD3+, der CD8+ und der CD20+ TIL in den Tumorproben. Dieses Ergebnis entsprach den Studien von Schiffer und von Rossi, die ebenfalls keine prognostische Bedeutung dieser TIL-Subpopulationen fanden (Rossi 1989; Schiffer 1979). Das Gesamtüberleben war auch unabhängig von der Lokalisation der TIL im GBM. Weder eine vermehrte perivaskuläre Infiltration, welche durch einen hohen Anteil der TIL innerhalb der 30 µm-Zone um die Gefäß wiedergegeben wurde, noch der diffuse Infiltrationstyp mit einem geringen Anteil von TIL innerhalb der 30 µm-Zone hatten einen Einfluss auf das Überleben der Patienten. Bei keiner der untersuchten Lymphozytensubpopulationen konnte eine prognostische Relevanz hinsichtlich ihrer Lokalisation im Tumor nachgewiesen werden. Zu einer ähnlichen Erkenntnis waren auch Schiffer und Rossi gelangt (Rossi 1989; Schiffer 1979), wobei andere Studien gegenteiliges beschrieben und sowohl eine positive (Boker 1984; Brooks 1978; Palma 1978) wie auch negative (Safdari 1979,
1985) prognostische Bedeutung der TIL in Abhängigkeit ihrer
Lokalisation zu den Gefäßen fanden. Bei der immunhistochemischen Untersuchung der Lokalisation von TIL im GBM wird stets nur eine Momentaufnahme des Tumorgeschehens abgebildet. Der Infiltrationsprozess per se kann immunhistochemisch kaum erfasst werden. In vivo-Untersuchungen
der
TIL
im
Tiermodell,
beispielsweise
mit
fluoreszenzmarkierten Lymphozyten, könnten genauere Aufschlüsse über die Lokalisation der TIL im GBM und dessen prognostische Bedeutung liefern. Mit den Migrationsuntersuchungen in der Boyden-Chamber konnte der komplexe Prozess der lymphozytären Tumorinfiltration in vivo zumindest teilweise
92 rekonstruiert werden. Mit Hilfe der Migrationsuntersuchungen wurde überprüft, ob Tumorzellen lösliche Botenstoff sezernieren, die die Wanderungsgeschwindigkeit (Chemokinetik) bestimmter Lymphozytensubpopulationen erhöht. Die eigentliche Anlockung der Lymphozyten durch die Tumorzellen (Chemotaxis) konnte in der Boyden chamber nicht bestimmt werden. Dennoch erschien es wahrscheinlich, dass Konzentrationsgradienten der chemokinetischen Botenstoffe von den Tumorzellen auch eine gerichtete Wanderung der Lymphozyten ermöglichen. Da die rege Interaktion der Tumorzellen mit ihrem Mikromilieu die Sekretion von Botenstoffen beeinflussen könnte, wurden neben den bereits etablierten GBMZelllinien LN18 und A172 auch Tumorprimärzelllinien zur Herstellung der Überstände für die Migrationsuntersuchungen verwendet. Die Tumorzellen wurden nach dem Gewebeaufschluss nicht extrahiert, womit sich neben den Tumorzellen auch andere zelluläre Bestandteile des Tumormikromilieus in den Primärkulturen befanden. Die Primärkulturen in der ersten Passage gaben, so die Vorstellung, das Geschehen im Tumor besser wieder, als die bereits vielfach in vitro passagierten LN18- und A172-Zellen. Diese Vorstellung beruhte unter anderem auf den Ergebnissen von Wagner, der rasch abfallende IL-10-Spiegel während der ersten Passagen von GBM-Primärkulturen beobachtete und CD68+ Mikroglia/Makrophagen als Hauptproduzenten von IL-10 identifizieren konnte (Wagner 1999). Mikroglia/Makrophagen waren in den Primärkulturen von Wagner nach wenigen Passagen von den Tumorzellen verdrängt worden. Die Bestimmung von GFAP, p53 und MGMT sollte sicherstellen, dass sich in den Primärkulturen ausreichend Tumorzellen astrozytären Ursprungs fanden. Die histopathologische Diagnose wurde von der Neuropathologie der FAU ErlangenNürnberg gestellt. Zur Quantifizierung der Migrationsuntersuchungen in der Boyden Chamber wurde die
Lymphozytenbestimmung
mittels
Fluoreszenzmessung
etabliert.
Die
Lymphozyten wurden bereits vor der Migration mit dem Farbstoff Calcein gefärbt, ein Farbstoff, der in Tierversuchen auch in vivo Anwendung findet (Parish 1999). Vorversuche zeigten, dass die Färbung mit Calcein keinen Einfluss auf das Migrationsverhalten der peripheren mononukleären Zellen hatte.
93 Dagegen war der Einfluss des Kulturmediums auf die Migration von entscheidender Bedeutung. Insbesondere der Zusatz von fötalen, bovinen Serum (FBS) sowie die Konditionierung des Mediums durch die Lymphozyten nahmen großen Einfluss auf den Versuchsablauf. Folglich wurde dem Medium anstatt FBS stets
bovines
Serumalbumin
(BSA)
zugesetzt,
außer
FBS
wurde
als
Positivkontrolle genutzt. Zudem wurde das Medium der Lymphozyten unmittelbar vor der Migration in der Boyden Chamber nochmals ausgetauscht, um der Konditionierung des Mediums durch die Lymphozyten entgegenzuwirken. Bei der Migration von PBMC, CD8+ T-Lymphozyten und Treg auf die Überstände der etablierten LN18- und A172-Tumorzelllinien war keine eindeutige, selektive Migration erkennbar. PBMC und CD8+ T-Zellen wanderten verstärkt sowohl bei LN18- als auch bei A172-Tumorüberständen, wohingegen die Migrationsrate der Treg nur von LN18-Tumorüberständen erhöht wurde. Interessanterweise war eine vermehrte Migration nach einer Kombinationsbehandlung der Tumorzellen mit 2 Gy plus Temozolomid vor der Probengewinnung festzustellen. Folglich enthielten die Tumorüberstände nach Kombinationsbehandlung eine erhöhte Konzentration
chemokinetische
Signalstoffe,
die
die
Migrationrate
der
Lymphozyten steigerte. Möglicherweise hat die Kombinationsbestrahlung zu einer vermehrten Tumorzellschädigung mit konsekutivem Zelltod geführt. Sowohl die Sekretion von Botenstoffen während des geregelten Zelltodes als auch die Freisetzung von zellulären Bestandteilen im Zuge der Nekrose könnten das gesteigerte Migrationsverhalten in der Boyden Chamber bewirkt haben. Bei den Migrationsuntersuchungen auf Überstände von Primärzellkulturen schien die Migration abhängig von spezifischen Überstanden jedoch nahezu unabhängig von
der
wandernden
Lymphozytensubpopulation.
Ähnlich
wie
bei
den
Überständen der etablierten Tumorzelllinien, war die Migration auf Überständen von den Primärkulturen nach Kombinationsbehandlung mit 2 Gy und TMZ erhöht. Da die alleinige Behandlung mit entweder Bestrahlung oder Chemotherapeutikum die Migration im Vergleich zur Kontrolle nicht erhöhte, konnte kein additiver Effekt der
Kombinationsbehandlung
abgeleitet
werden.
Die
Wanderung
der
Lymphozyten auf die unbehandelten Überstände der KD-, BS-, RA- und RE2Primärkulturen war gegenüber der Migration auf Überstände nach alleiniger
94 Behandlung mit 2 Gy oder TMZ erhöht. Eine schlüssige Erklärung für diese Resultate ließ sich nicht finden. Eindeutige Ergebnisse, wie sie Jordan in seinen Migrationsversuchen mit GBMTumorüberständen ermittelten konnte, wurden nicht beobachtet. Es blieb ungeklärt, ob GBM-Tumorzellen selbst oder via parakriner Mechanismen die Anlockung von und die Infiltration durch Tumor-infiltrierende Lymphozyten selektiv bewirken können. Vielleicht repräsentierten weder die etablierten noch die Primärkulturen
das
Tumormilieu
ausreichend
gut.
Während
des
Gewebeaufschluss zur Gewinnung der Primärkulturen wurden die Zellen massiven Stress ausgesetzt, was vermutlich eine extrem erhöhte Sekretion von Signal- und Gefahrstoffe provoziert hatte. Die Kokultivierung von Tumorzellen und Immunzellen zur Herstellung der Tumorüberstände wäre eine gute Alternative, dem Tumormilieu ohne vorangehenden Gewebeverdau näher zu kommen. In zukünftigen immunhistochemischen Untersuchungen der TIL sollte ebenfalls versucht werden, dem komplexen Tumormilieu des GBM gerecht zu werden. Bei der Probenauswahl könnten neben Tumorhauptbereich und Infiltrationszone eventuell auch Randbereiche mit nekrotischen Arealen und hypervaskularisierte Areale berücksichtigt werden. Aufgrund des bunten histomorphologischen Bildes des Glioblastoma multiforme, erfordert Analyse der TIL in GBM-Paraffinschnitten ein sorgfältig geplantes Vorgehen. Die Resultate dieser Untersuchungen schließen sich nahezu nahtlos an die Ergebnisse früherer Studien an und liefern neue Hinweise für die Bedeutung der Tumorvaskularisierung und des Zusammenspiels
von
Mikroglia/Makrophagen.
FoxP3+
regulatorischen
T-Zellen
mit
CD68+
95 6. Abkürzungsverzeichnis BCG: Bacille de Calmette et Guérin BSA: Bovines Serumalbumin Calcein AM: Calcein-Acetoxymethylester CD: Cluster of differentiation DAPI: 4',6-Diamidino-2-phenylindol DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO: Dimethylsulfoxid DNS: Desoxyriboneucleinsäure FAU: Friedrich-Alexander-Universität FBS: Fötales bovines Serum FoxP3: Forkhead box P3 GBM: Glioblastoma multiforme GFAP: Glial fibrillary acid protein HE: Hämatoxylin-Eosin IL: Interleukin MACS®: Magnetic cell separation® MG: maligne Gliome MGMT: O6-Methylguanin-DNS-Methyltransferase MTA-1: Manueller Tissue Arrayer-1 MTIC: 5-(3-methyltriazen-1-yl)imidazole-4-carboxamide PBMC: Peripheral blood mononuclear cells PBS: Phosphate buffer saline PCR: Polymerase-chain-reaction PML: periphere mononukleäre Zellen ROI: Region of interest RPMI 1640-Medium: Roswell Park Memorial Institute 1640-Medium TH1: T-Helferzellen vom Typ 1 TH2: T-Helferzellen vom Typ 2 TIL: Tumor-infiltrierende Lymphozyten TMA: Tissue-micro-array TMZ: Temozolomid
96 7. Literaturverzeichnis 1. 2. 3.
4.
5. 6. 7. 8.
9. 10. 11.
12. 13. 14. 15. 16.
AlphaMetrix, Biotech, Bedienungsanleitung Manueller Tissue Arrayer MTA-1. 2005, Rödermark, Deutschland. Anastassiou ED, Paliogianni F, Balow JP, Yamada H, Boumpas DT. Prostaglandin E2 and other cyclic AMP-elevating agents modulate IL-2 and IL2R alpha gene expression at multiple levels. J Immunol 1992;148:2845-52. Ashkenazi E, Deutsch M, Tirosh R, Weinreb A, Tsukerman A, Brodie C. A selective impairment of the IL-2 system in lymphocytes of patients with glioblastomas: increased level of soluble IL-2R and reduced protein tyrosine phosphorylation. Neuroimmunomodulation 1997;4:49-56. Ausiello CM, Palma C, Maleci A, Spagnoli GC, Amici C, Antonelli G, Casciani CU, Cassone A. Cell mediated cytotoxicity and cytokine production in peripheral blood mononuclear cells of glioma patients. Eur J Cancer 1991;27:646-50. Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998;392:245-52. Bertrand I, Mannen H. Etudes des reactions vasculaires dans les astrocytomes. Rev Neurol (Paris) 1960;102:3-19. Bertrand I MH. Etudes des reactions vasculaires dans les astrocytomes. Rev Neurol (Paris) 1960;102:3-19. Boker DK, Kalff R, Gullotta F, Weekes-Seifert S, Mohrer U. Mononuclear infiltrates in human intracranial tumors as a prognostic factor. Influence of preoperative steroid treatment. I. Glioblastoma. Clin Neuropathol 1984;3:1437. Boyden S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med 1962;115:453-66. Brooks WH, Markesbery WR, Gupta GD, Roszman TL. Relationship of lymphocyte invasion and survival of brain tumor patients. Ann Neurol 1978;4:219-24. Brunkow ME, Jeffery EW, Hjerrild KA, Paeper B, Clark LB, Yasayko SA, Wilkinson JE, Galas D, Ziegler SF, Ramsdell F. Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. Nat Genet 2001;27:68-73. Camara NO, Ng WF, Hernandes-Fuentes M, Eren E, Lechler RI. Human CD4+ CD25+ T cells regulate CD8+ T-cell activation. Transplant Proc 2002;34:2858-60. Castelli MG, Chiabrando C, Fanelli R, Martelli L, Butti G, Gaetani P, Paoletti P. Prostaglandin and thromboxane synthesis by human intracranial tumors. Cancer Res 1989;49:1505-8. Coley WB. The treatment of malignant tumors by repeated inoculations of erysipelas. With a report of ten original cases. 1893. Clin Orthop Relat Res 1991:3-11. Couldwell WT, Dore-Duffy P, Apuzzo ML, Antel JP. Malignant glioma modulation of immune function: relative contribution of different soluble factors. J Neuroimmunol 1991;33:89-96. Curiel TJ, Coukos G, Zou L, Alvarez X, Cheng P, Mottram P, EvdemonHogan M, Conejo-Garcia JR, Zhang L, Burow M, Zhu Y, Wei S, Kryczek I, Daniel B, Gordon A, Myers L, Lackner A, Disis ML, Knutson KL, Chen L, Zou W. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med 2004;10:942-9.
97 17. 18. 19.
20. 21. 22. 23.
24. 25. 26. 27.
28. 29. 30. 31.
32.
Czepluch FS, Olieslagers SJ, Waltenberger J. Monocyte function is severely impaired by the fluorochrome calcein acetomethylester. Biochem Biophys Res Commun 2007;361:410-3. Deckert M, Reifenberger G, Riede U-N, Schlote W, Thal DR, Wiestler OD, Nervensystem. 5 ed. Allgemeine und spezielle Pathologie, ed. M.W. U.-N. Riede, H.-E. Schaefer. 2001, Stuttgart: Georg Thieme Verlag. Dieckmann D, Bruett CH, Ploettner H, Lutz MB, Schuler G. Human CD4(+)CD25(+) regulatory, contact-dependent T cells induce interleukin 10producing, contact-independent type 1-like regulatory T cells [corrected]. J Exp Med 2002;196:247-53. Dix AR, Brooks WH, Roszman TL, Morford LA. Immune defects observed in patients with primary malignant brain tumors. J Neuroimmunol 1999;100:21632. Dummer W, Becker JC, Schwaaf A, Leverkus M, Moll T, Brocker EB. Elevated serum levels of interleukin-10 in patients with metastatic malignant melanoma. Melanoma Res 1995;5:67-8. Dunn GP, Dunn IF, Curry WT. Focus on TILs: Prognostic significance of tumor infiltrating lymphocytes in human glioma. Cancer Immun 2007;7:12. Ebert LM, Tan BS, Browning J, Svobodova S, Russell SE, Kirkpatrick N, Gedye C, Moss D, Ng SP, MacGregor D, Davis ID, Cebon J, Chen W. The regulatory T cell-associated transcription factor FoxP3 is expressed by tumor cells. Cancer Res 2008;68:3001-9. El Andaloussi A, Han Y, Lesniak MS. Prolongation of survival following depletion of CD4+CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg 2006a;105:430-7. El Andaloussi A, Lesniak MS. CD4+ CD25+ FoxP3+ T-cell infiltration and heme oxygenase-1 expression correlate with tumor grade in human gliomas. J Neurooncol 2007;83:145-52. El Andaloussi A, Lesniak MS. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol 2006b;8:234-43. Elliott L, Brooks W, Roszman T. Inhibition of anti-CD3 monoclonal antibodyinduced T-cell proliferation and interleukin-2 secretion by physiologic combinations of dexamethasone and prostaglandin E2. Cell Mol Neurobiol 1993;13:579-92. Elliott LH, Brooks WH, Roszman TL. Cytokinetic basis for the impaired activation of lymphocytes from patients with primary intracranial tumors. J Immunol 1984;132:1208-15. Entschladen F, Drell TLt, Lang K, Masur K, Palm D, Bastian P, Niggemann B, Zaenker KS. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res 2005;307:418-26. Farmer JP, Antel JP, Freedman M, Cashman NR, Rode H, Villemure JG. Characterization of lymphoid cells isolated from human gliomas. J Neurosurg 1989;71:528-33. Fecci PE, Mitchell DA, Whitesides JF, Xie W, Friedman AH, Archer GE, Herndon JE, 2nd, Bigner DD, Dranoff G, Sampson JH. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res 2006;66:3294-302. Fontana A, Hengartner H, de Tribolet N, Weber E. Glioblastoma cells release interleukin 1 and factors inhibiting interleukin 2-mediated effects. J Immunol 1984;132:1837-44.
98 33. 34.
35. 36.
37.
38. 39. 40.
41.
42.
43. 44. 45.
46.
47.
Fontenot JD, Rasmussen JP, Williams LM, Dooley JL, Farr AG, Rudensky AY. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3. Immunity 2005;22:329-41. Gastl GA, Abrams JS, Nanus DM, Oosterkamp R, Silver J, Liu F, Chen M, Albino AP, Bander NH. Interleukin-10 production by human carcinoma cell lines and its relationship to interleukin-6 expression. Int J Cancer 1993;55:96101. Guerin C, Early history of BCG. BCG vaccination against tuberculosis., ed. S.R. Rosenthal. 1957, Boston: Little Brown. 48–53. Hegi ME, Diserens AC, Gorlia T, Hamou MF, de Tribolet N, Weller M, Kros JM, Hainfellner JA, Mason W, Mariani L, Bromberg JE, Hau P, Mirimanoff RO, Cairncross JG, Janzer RC, Stupp R. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005;352:997-1003. Hinz S, Pagerols-Raluy L, Oberg HH, Ammerpohl O, Grussel S, Sipos B, Grutzmann R, Pilarsky C, Ungefroren H, Saeger HD, Kloppel G, Kabelitz D, Kalthoff H. Foxp3 expression in pancreatic carcinoma cells as a novel mechanism of immune evasion in cancer. Cancer Res 2007;67:8344-50. Hitchcock ER, Morris CS. Mononuclear cell infiltration in central portions of human astrocytomas. J Neurosurg 1988;68:432-7. Hussain SF, Yang D, Suki D, Aldape K, Grimm E, Heimberger AB. The role of human glioma-infiltrating microglia/macrophages in mediating antitumor immune responses. Neuro Oncol 2006;8:261-79. Ichihara F, Kono K, Takahashi A, Kawaida H, Sugai H, Fujii H. Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers. Clin Cancer Res 2003;9:4404-8. Jordan JT, Sun W, Hussain SF, DeAngulo G, Prabhu SS, Heimberger AB. Preferential migration of regulatory T cells mediated by glioma-secreted chemokines can be blocked with chemotherapy. Cancer Immunol Immunother 2008;57:123-31. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Barlund M, Schraml P, Leighton S, Torhorst J, Mihatsch MJ, Sauter G, Kallioniemi OP. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med 1998;4:844-7. Krex D, Schackert G. Langzeitüberleben mit Glioblastom. brainstorm 2008:410. Liston A, Farr AG, Chen Z, Benoist C, Mathis D, Manley NR, Rudensky AY. Lack of Foxp3 function and expression in the thymic epithelium. J Exp Med 2007;204:475-80. Liyanage UK, Moore TT, Joo HG, Tanaka Y, Herrmann V, Doherty G, Drebin JA, Strasberg SM, Eberlein TJ, Goedegebuure PS, Linehan DC. Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma. J Immunol 2002;169:2756-61. McVicar DW, Davis DF, Merchant RE. In vitro analysis of the proliferative potential of T cells from patients with brain tumor: glioma-associated immunosuppression unrelated to intrinsic cellular defect. J Neurosurg 1992;76:251-60. MilliporeCorporation, Evaluation of MultiScreen-MIC Plates in Chemotaxis Assays. 2008.
99 48. 49. 50.
51. 52. 53.
54. 55. 56. 57.
58. 59.
60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67.
Morales A, Eidinger D, Bruce AW. Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumors. J Urol 1976;116:180-3. Morford LA, Elliott LH, Carlson SL, Brooks WH, Roszman TL. T cell receptor-mediated signaling is defective in T cells obtained from patients with primary intracranial tumors. J Immunol 1997;159:4415-25. Morimura T, Neuchrist C, Kitz K, Budka H, Scheiner O, Kraft D, Lassmann H. Monocyte subpopulations in human gliomas: expression of Fc and complement receptors and correlation with tumor proliferation. Acta Neuropathol 1990;80:287-94. Mrass P, Weninger W. Immune cell migration as a means to control immune privilege: lessons from the CNS and tumors. Immunol Rev 2006;213:195-212. NeuroProbe, Experiment Design. Designing Cell-Activity Assays. 2006. Nishie A, Ono M, Shono T, Fukushi J, Otsubo M, Onoue H, Ito Y, Inamura T, Ikezaki K, Fukui M, Iwaki T, Kuwano M. Macrophage infiltration and heme oxygenase-1 expression correlate with angiogenesis in human gliomas. Clin Cancer Res 1999;5:1107-13. Nitta T, Hishii M, Sato K, Okumura K. Selective expression of interleukin-10 gene within glioblastoma multiforme. Brain Res 1994;649:122-8. Oken MM, Creech RH, Tormey DC, Horton J, Davis TE, McFadden ET, Carbone PP. Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group. Am J Clin Oncol 1982;5:649-55. Old LJ. Immunotherapy for cancer. Sci Am 1996;275:136-43. Olofsson A, Miyazono K, Kanzaki T, Colosetti P, Engstrom U, Heldin CH. Transforming growth factor-beta 1, -beta 2, and -beta 3 secreted by a human glioblastoma cell line. Identification of small and different forms of large latent complexes. J Biol Chem 1992;267:19482-8. Ostermann S, Csajka C, Buclin T, Leyvraz S, Lejeune F, Decosterd LA, Stupp R. Plasma and cerebrospinal fluid population pharmacokinetics of temozolomide in malignant glioma patients. Clin Cancer Res 2004;10:3728-36. Ott TR, Pahuja A, Lio FM, Mistry MS, Gross M, Hudson SC, Wade WS, Simpson PB, Struthers RS, Alleva DG. A high-throughput chemotaxis assay for pharmacological characterization of chemokine receptors: Utilization of U937 monocytic cells. J Pharmacol Toxicol Methods 2005;51:105-14. Paine JT, Handa H, Yamasaki T, Yamashita J, Miyatake S. Immunohistochemical analysis of infiltrating lymphocytes in central nervous system tumors. Neurosurgery 1986;18:766-72. Palma L, Di Lorenzo N, Guidetti B. Lymphocytic infiltrates in primary glioblastomas and recidivous gliomas. Incidence, fate, and relevance to prognosis in 228 operated cases. J Neurosurg 1978;49:854-61. Parish CR. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol 1999;77:499-508. Pearl R. Cancer and tuberculosis. 1929:97–159. Phillips JP, Eremin O, Anderson JR. Lymphoreticular cells in human brain tumours and in normal brain. Br J Cancer 1982;45:61-9. Piccirillo CA, Shevach EM. Cutting edge: control of CD8+ T cell activation by CD4+CD25+ immunoregulatory cells. J Immunol 2001;167:1137-40. Reeves SA, Helman LJ, Allison A, Israel MA. Molecular cloning and primary structure of human glial fibrillary acidic protein. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:5178-82. Ridley A, Cavanagh JB. Lymphocytic infiltration in gliomas: evidence of possible host resistance. Brain 1971;94:117-24.
100 68. 69.
70. 71.
72. 73. 74. 75.
76.
77. 78. 79. 80.
81.
82. 83.
Roggendorf W, Strupp S, Paulus W. Distribution and characterization of microglia/macrophages in human brain tumors. Acta Neuropathol 1996;92:288-93. Rossi ML, Jones NR, Candy E, Nicoll JA, Compton JS, Hughes JT, Esiri MM, Moss TH, Cruz-Sanchez FF, Coakham HB. The mononuclear cell infiltrate compared with survival in high-grade astrocytomas. Acta Neuropathol 1989;78:189-93. Roszman TL, Brooks WH. Immunobiology of primary intracranial tumours. III. Demonstration of a qualitative lymphocyte abnormality in patients with primary brain tumours. Clin Exp Immunol 1980;39:395-402. Roszman TL, Brooks WH, Steele C, Elliott LH. Pokeweed mitogen-induced immunoglobulin secretion by peripheral blood lymphocytes from patients with primary intracranial tumors. Characterization of T helper and B cell function. J Immunol 1985;134:1545-50. Roussel E, Gingras MC, Grimm EA, Bruner JM, Moser RP. Predominance of a type 2 intratumoural immune response in fresh tumour-infiltrating lymphocytes from human gliomas. Clin Exp Immunol 1996;105:344-52. Safdari H, Hochberg FH, Richardson EP, Jr. Histological correlations with survival in malignant gliomas. Acta Neurochir Suppl (Wien) 1979;28:485-8. Safdari H, Hochberg FH, Richardson EP, Jr. Prognostic value of round cell (lymphocyte) infiltration in malignant gliomas. Surg Neurol 1985;23:221-6. Saito T, Tanaka R, Yoshida S, Washiyama K, Kumanishi T. Immunohistochemical analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and major histocompatibility antigens in human gliomas and metastatic brain tumors. Surg Neurol 1988;29:435-42. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M. Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alphachains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol 1995;155:1151-64. Sasaki A, Naganuma H, Satoh E, Nagasaka M, Isoe S, Nakano S, Nukui H. Secretion of transforming growth factor-beta 1 and -beta 2 by malignant glioma cells. Neurol Med Chir (Tokyo) 1995;35:423-30. Schiffer D, Cavicchioli D, Giordana MT, Palmucci L, Piazza A. Analysis of some factors effecting survival in malignant gliomas. Tumori 1979;65:119-25. Stupp R, Hegi ME, van den Bent MJ, Mason WP, Weller M, Mirimanoff RO, Cairncross JG. Changing paradigms--an update on the multidisciplinary management of malignant glioma. Oncologist 2006;11:165-80. Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, Weller M, Fisher B, Taphoorn MJ, Belanger K, Brandes AA, Marosi C, Bogdahn U, Curschmann J, Janzer RC, Ludwin SK, Gorlia T, Allgeier A, Lacombe D, Cairncross JG, Eisenhauer E, Mirimanoff RO. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med 2005;352:987-96. Su YB, Sohn S, Krown SE, Livingston PO, Wolchok JD, Quinn C, Williams L, Foster T, Sepkowitz KA, Chapman PB. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol 2004;22:610-6. Takeuchi J, Barnard RO. Perivascular lymphocytic cuffing in astrocytomas. Acta Neuropathol 1976;35:265-71. Thornton AM, Shevach EM. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. J Exp Med 1998;188:287-96.
101 84. 85.
86. 87. 88. 89.
90. 91. 92. 93.
94. 95. 96. 97.
98.
Vaupel P, Mayer A. Hypoxia in cancer: significance and impact on clinical outcome. Cancer Metastasis Rev 2007;26:225-39. Vieira P, de Waal-Malefyt R, Dang MN, Johnson KE, Kastelein R, Fiorentino DF, deVries JE, Roncarolo MG, Mosmann TR, Moore KW. Isolation and expression of human cytokine synthesis inhibitory factor cDNA clones: homology to Epstein-Barr virus open reading frame BCRFI. Proc Natl Acad Sci U S A 1991;88:1172-6. Wagner S, Czub S, Greif M, Vince GH, Suss N, Kerkau S, Rieckmann P, Roggendorf W, Roosen K, Tonn JC. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer 1999;82:12-6. Weller M, Constam DB, Malipiero U, Fontana A. Transforming growth factor-beta 2 induces apoptosis of murine T cell clones without downregulating bcl-2 mRNA expression. Eur J Immunol 1994;24:1293-300. Weller M, Fontana A. The failure of current immunotherapy for malignant glioma. Tumor-derived TGF-beta, T-cell apoptosis, and the immune privilege of the brain. Brain Res Brain Res Rev 1995;21:128-51. Weller M, Rieger J, Grimmel C, Van Meir EG, De Tribolet N, Krajewski S, Reed JC, von Deimling A, Dichgans J. Predicting chemoresistance in human malignant glioma cells: the role of molecular genetic analyses. Int J Cancer 1998;79:640-4. Weller M, Steinbach JP, Wick W. Temozolomide: a milestone in the pharmacotherapy of brain tumors. Future Oncol 2005;1:747-54. Wen PY, Kesari S. Malignant Gliomas in Adults. N Engl J Med 2008;359:492507. Weston SA, Parish CR. Calcein: a novel marker for lymphocytes which enter lymph nodes. Cytometry 1992;13:739-49. Woo EY, Chu CS, Goletz TJ, Schlienger K, Yeh H, Coukos G, Rubin SC, Kaiser LR, June CH. Regulatory CD4(+)CD25(+) T cells in tumors from patients with early-stage non-small cell lung cancer and late-stage ovarian cancer. Cancer Res 2001;61:4766-72. Yasuda K, Alderson T, Phillips J, Sikora K. Detection of lymphocytes in malignant gliomas by monoclonal antibodies. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1983;46:734-7. Yu JS, Lee PK, Ehtesham M, Samoto K, Black KL, Wheeler CJ. Intratumoral T cell subset ratios and Fas ligand expression on brain tumor endothelium. J Neurooncol 2003;64:55-61. Zitvogel L, Tesniere A, Kroemer G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol 2006;6:715-27. Zou JP, Morford LA, Chougnet C, Dix AR, Brooks AG, Torres N, Shuman JD, Coligan JE, Brooks WH, Roszman TL, Shearer GM. Human gliomainduced immunosuppression involves soluble factor(s) that alters monocyte cytokine profile and surface markers. J Immunol 1999;162:4882-92. Zuo T, Wang L, Morrison C, Chang X, Zhang H, Li W, Liu Y, Wang Y, Liu X, Chan MW, Liu JQ, Love R, Liu CG, Godfrey V, Shen R, Huang TH, Yang T, Park BK, Wang CY, Zheng P, Liu Y. FOXP3 is an X-linked breast cancer suppressor gene and an important repressor of the HER-2/ErbB2 oncogene. Cell 2007;129:1275-86.
102 8. Danksagung Mein Dank gilt allen, die mich bei meiner wissenschaftlichen Arbeit unterstützt und zu ihrem Gelingen beigetragen haben. Zunächst möchte ich mich bei meinen Betreuern Dr. L. Distel und Prof. Dr. G. G. Grabenbauer bedanken, die diese Arbeit initiiert und stetig mit neuen Ideen bereichert
haben.
Besonders
gerne
denke
ich
an
die
gemeinsamen
wissenschaftlichen Diskussionen zurück. Zu großen Dank bin ich den Herren PD Dr. O. Ganslandt und PD Dr. R. Voll verpflichtet, meinen Betreuern seitens des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung (IZKF) Erlangen. Das IZKF Erlangen bot mir zudem finanzielle und wissenschaftliche Unterstützung bei der Durchführung meines Projektes. Die Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern der Neurochirurgischen Klinik und des Neuropathologischen Institutes des Universitätsklinikums Erlangen war stets hervorragend. Besonderer Dank gilt Herrn Dr. R. Coras aus der Neuropathologie und ein weiteres Mal Herrn PD Dr. O. Ganslandt, meinem Ansprecherpartner in der Neurochirurgie. Zuletzt danke ich Herrn Prof. Dr. R. Fietkau, Direktor der Strahlenklinik des Universitätsklinikums
Erlangen,
der
die
finanziellen
und
wissenschaftlichen
Rahmenbedingungen zur Durchführung dieser Arbeit in der Strahlenbiologie Erlangen geschaffen hat.
103 9. Curriculum vitae PERSÖNLICHE DATEN Christian Beyer Schuhstraße 52 91052 Erlangen 0171 4171806
[email protected] * 14.09.1983, Hersbruck AUSBILDUNG 10/2009 - 12/2009
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung nach ÄAppO 2002
08/2008 - 06/2009
Praktisches Jahr mit folgenden Tertialen: Strahlentherapie (Universitätsklinikum Erlangen) Chirurgie (Universitätsklinikum Erlangen) Rheumatologie (Duke University, North Carolina)
10/2005 - 07/2008
Klinischer Ausbildungsabschnitt an der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg
10/2003 - 09/2005
Vorklinischer Ausbildungsabschnitt an der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg Abschluss mit dem Ersten Abschnitt der Ärztlichen Prüfung nach ÄAppO 2002 Note: 1,0
09/1994 - 06/2003
Gymnasium Eschenbach Abiturnote: 1,0
FORSCHUNG seit 08/2008
„Tumor-infiltrierende Lymphozyten beim Glioblastoma multiforme“ Promotionsarbeit bei Prof. Grabenbauer und Dr. Distel im Rahmen des D4-Projekts des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung (IZKF), Erlangen
seit 07/2009
Murine Fibrose-Modelle in der Sklerodermie Forschungsarbeit in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Distler, Medizinische Klinik 3 des Universitätsklinikums Erlangen
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AUSZEICHNUNGEN 06/2003
Buchpreis der Deutschen Physikalischen Gesellschaft
06/2003
Appolinaire-Preis der Robert Bosch Stiftung
06/2003
Vorschlag für die Stiftung Maximilianeum
09/2007
Aufnahme in das Erlanger Leonardo-Kolleg (ExzellenzInitiative der Friedrich-Alexander-Universität ErlangenNürnberg)
02/2008
Aufnahme in die Studienstiftung des Deutschen Volkes
08/2008
Doktorandenstipendium des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung (IZKF) Erlangens
REVIEWTÄTIGKEITEN Associate Member of Faculty 1000 Medicine, Section: Etiology, Pathogenesis and Animal Models of Rheumatic Disease Arthritis Research and Therapy KONGRESSBEITRÄGE „CD4+CD25+, regulatorische T-Lymphozyten werden in vitro im Vergleich zu peripheren mononukleären Zellen durch Glioblastoma-Tumorzellen nicht selektiv angelockt.“ Postervortrag auf der Jahrestagung der Deutschen und Österreichischen Gesellschaft für Radioonkologie (DEGRO und ÖGRO), Wien 2008 „Lokalisation Tumor-infiltrierender Lymphozyten im Glioblastoma multiforme.“ Poster am Doktorandenworkshop des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung, Erlangen 2008 PUBLIKATIONEN Beyer C, Schett G, Gay S, Distler O, Distler JH. Hypoxia. Hypoxia in the pathogenesis of systemic sclerosis. Arthritis Res Ther 2009;11(2):220 Beyer C, Abraham D, Distler JH, Distler O. The pathogenesis of systemic sclerosis. In: Distler O, editor. Scleroderma - modern aspects of pathogenesis, diagnosis and therapy. Bremen: UNI-MED Verlag AG; 2009. Distler JH, Beyer C, Schett G, Luscher TF, Gay S, Distler O. Endothelial progenitor cells: Novel players in the pathogenesis of rheumatic diseases. Arthritis Rheum 2009;60(11):3168-3179. Beyer C, Pisetsky DS. Microparticles in rheumatologic diseases. Nature Reviews Rheumatology 2009;in press.
Erlangen, 6. November 2009
