Nosotros, la indivisa unidad que habita en nosotros, hemos soñado el mundo. Lo hemos imaginado resistente, perfecto, visible, ubicuo en el espacio y firme, inmutable y estático en el tiempo; pero hemos consentido en su arquitectura tenues y eternos intersticios de discontinuidad, misterio y sin razón, para saber que es falso.

Jorge Luis Borges, 1932.

TRABAJOS PRACTICOS PROBLEMAS DISCUSION DE TRABAJOS CIENTIFICOS

1

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FISICAS Y NATURALES UNIVERSIDAD NACIONAL DE CORDOBA

BIOFISICA QUIMICA GENERALIDADES • • • •

•

Carrera: Ciencias Biológicas Tipo de asignatura: optativa Puntaje: 7 puntos (8 créditos) Carga horaria: 80 hs Prerequisitos: QUÍMICA GENERAL, QUÍMICA BIOLÓGICA, QUÍMICA ORGÁNICA, BIOLOGÍA CELULAR, MATEMÁTICA, FÍSICA I Y II.

DOCENTES Responsable: - Dra María Angélica PERILLO (Prof.Titular- Inv.Indep.CONICET) Colaboradores: - Dr. Daniel A. GARCIA (Prof.Adj. – Inv.Adj.CONICET) - Dr. Raúl H.Marín (Prof.Adj. – Inv.Adj. CONICET) -

Dra. Julieta M. SANCHEZ (JTP Quim.Biológica - Becaria CONICET) Dra. Anahí TURINA (JTP Quím.Biológica - Becaria CONICET) Dra. Verónica M. NOLA (JTP Quím.Biológica – Becaria CONICET) Biól.Eduardo M. CLOP (JTP Quím.Biológica, Becario CONICET) Biól. Benjamín CARUSO (Becario CONICET) Biól. Mariela SANCHEZ (Becaria SeCyT) Biól. Jackelyn M. Kembro (Becaria CONICET) Biól. Pedro D. CLOP (Becario FONCyT) Biól. Gabriela REINER (Becaria CONICET)

OBJETIVOS Se espera que al finalizar este curso los alumnos sean capaces de: • • •

Conocer los principios de la bioenergética estática y dinámica. Comprender los conceptos fundamentales y las implicancias biotecnológicas de la modulación, evolución y autoorganización de sistemas bioquímicos dinámicos. Interpretar la complejidad biológica a partir de conceptos termodinámicos y cinéticos.

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PROGRAMA ANALITICO I) INTRODUCCIÓN A QUÍMICA-FÍSICA • Energética: Calor y trabajo. Gases ideales y reales. Constantes críticas. Cambios isotérmicos, adiabáticos, reversibles, irreversibles. Leyes de la termodinámica. Funciones termodinámicas de estado. Dependencia de ∆U y ∆H con la temperatura. Termoquímica. Entropía. Eficiencia de Carnot, eficiencia de procesos biológicos. Trabajo máximo. Funciones de Hemholz y de Gibbs. Relaciones de Maxwell. Dependencia de la función de Gibbs con la temperatura, la presión. Potencial químico. Sistemas abiertos y cambios en la composición. Aplicaciones: a) cromatografía con fluidos supercríticos; b) calorimetría, titulación calorimétrica. • Cambios de estado: Equilibrios de estado. Diagramas de fase. Cambios en las propiedades termodinámicas que acompañan transiciones de fase de primer orden y de segundo orden. Aplicaciones: calorimetría diferencial de barrrido para el estudios de cambios de fase en membranas artificiales. • Termodinámica de mezclas: magnitudes molares parciales; funciones termodinámicas de mezclas. Diagramas presión-composición. Leyes de Henry y de Raoult. Desviaciones de la idealidad. Propiedades coligativas. Equilibrio Donnan. Mezclas de líquidos volátiles: destilación, azeótropos; líquidos inmiscibles, destilación por arrastre de vapor. Aplicaciones: a) purificación de aguas por ósmosis inversa, b) hidrodestilación de aceites esenciales. • Disoluciones reales: actividades, coeficientes de actividad. • Termodinámica química. Actividad biológica: la termodinámica del ATP. Otros compuestos con alto potencial de transferencia de grupo. Acoplamientos. • Electroquímica: actividades de iones en solución, coeficiente de actividad iónico medio. Teoría de Debye Hückel. Atmósfera iónica. Fuerza iónica. Electrodos: ánodos y cátodos en celdas electrolíticas y pilas. F.e.m. Potenciales redox. Ecuación de Nerst. Reacciones redox en sistemas biológicos. Fenómenos electrocinéticos. Intercambio iónico. Aplicaciones: a) fenómenos de intercambio iónico en suelos. • Principios de termodinámica estadística II) INTERPRETACIÓN CINÉTICO-TERMADINÁMICA DE LA COMPLEJIDAD BIOLÓGICA • Introducción a la termodinámica de los sistemas abiertos. • Autoorganización espacial y temporal en sistemas bioquímicos que presentan comportamiento complejo. Autocatálisis, reacciones oscilantes, biestabilidad. • Evolución de la complejidad biológica. Teoría del caos. Fractales. III) BIOQUÍMICA SUPRAMOLECULAR • Fuerzas intermoleculares. • Estructuras de autoagregación; restricciones geométricas y entrópicas. Interacción lípido-lípido, lípido-proteína, proteína-proteína. Membranas biológicas. Aplicación: Liposomas en la tecnología de alimentos y en la tecnologÍa farmacéutica. • Adsorción en superficies: isotermas de adsorción (Langmuir, BET). Hidratación. Aplicaciones: a) interacción Ligando–receptor; b) hidratación de alimentos; c) crioconservación de tejidos. • Transporte a través de membranas: leyes de difusión; analisis compartamental, transportadores y canales, potenciales electroquímicos, potenciales eléctricos transmembrana. • Electrostática de superficie.

3

ACTIVIDADES: clases teóricas, Trabajos prácticos: clases de laboratorio, seminarios de discusión de trabajos científicos y de resolución de problemas.

TRABAJOS PRACTICOS •

• • •

Trabajos de laboratorio: - Resistencia globular. - Concentración micelar critica. - Autoorganización espacio-temporal (reacción de Belousov-Zhabotinsky) - Adsorción. Interacción ligando-receptor. Trabajo de laboratorio de computación: - Comportamientos caóticos; geometría fractal. Seminarios: - Problemas sobre energética, problemas cambios de estado, termodinámica de mezclas. - Demonios de Maxwell en sistemas biológicos? Discusión de trabajos científicos: - Cromatografía con fluidos supercríticos - Calorimetría: titulación calorimétrica, calorimetría diferencial de barrido. - Modulación de la actividad enzimática por interacción con interfases lipídicas. - Estabilidad de proteínas

EVALUACION: evaluaciones conceptuales en clases prácticas y en seminarios. Guías de problemas. Informes de Trabajos Prácticos. Trabajo final de investigación teórica. Examen final escrito.

BIBLIOGRAFIA Aon M.A. and Cortassa S. DYNAMIC BIOLOGICAL ORGANIZATION. FUNDAMENTALS AS APPLIED TO CELLULAR SYSTEMS. Chapman and Hall, London, UK. 1997. Atkins, P.W. FISICOQUIMICA. Ed. Addison-Wesley Iberoamericana, S.A. Wilmington, Delaware, USA.1991 Daune, M.. MOLECULAR BIOPHYSICS. STRUCTURES IN MOTION, Oxford University Press, Oxford. 1999. Israelachvili J.N. INTERMOLECULAR AND SURFACE FORCES. Academic Press, New York. 1989. Nelson D.L., Cox, M.M. LEHNINGER, PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY. 3ª Ed.. Worth Publishers, New York, 2000. Moore W.J. QUIMICA FISICA. Ed.URMO, S.A.,Bilbao, Espana.1977. Okninski, A. CATASTROPHE THEORY. CHEMICAL KINETICS. vol 33. Ompton R.G. Ed. Elsevier PWN, Polish Scientific Publishers, Varsovia, 1992. Peacocke, A.R. AN INTRODUCTION TO THE PHYSICAL CHEMISTRY OF BIOLOGICAL ORGANIZATION. Oxford Sci.Pub. Clarendon Press, Oxford. 1989. Divulgación Científica: Briggs J. , Peat F.D. LAS SIETE LEYES DEL CAOS. LAS VENTAJAS DE UNA VIDA CAÓTICA. Ed.Grijalbo, Barcelona. 1999. Goodwin, B. LAS MANCHAS DEL LEOPARDO. Tusquets Ed. 1994. Olivares, C.M. TECNOLOGIAS EMERGENTES DE Editor, S.A., Mexico. 1997

COMPUTO. TEORIA DEL CAOS. Alfaomega Grupo

Prigogine, I., TAN SOLO UNA ILUSION. UNA EXPLORACIÓN DEL CAOS AL ORDEN. Tusquets, Barcelona, 1988. 4

BIOFISICA QUIMICA Problemas Tema: Energetica 1 1. Calor (Q) y trabajo (W) no son funciones de estado. Sin embargo, sus cambios o la combinación de sus cambios se usan para representar variaciones de funciones de estado (dU=dQ+dW; dS=dQ/T; dH=dU+pdV). ¿Por qué? 2. Discuta la validez de la siguiente afirmación: “el cambio en la energía interna de un sistema es siempre menor que el cambio de entalpía”. 3. Un adulto típico ingiere 2200 Kcal/día. Muestre que un adulto consume energía aproximadamente a la misma velocidad que un foquito de 100 W. 4. Suponga que 0.1 moles de un gas perfecto con Cv =1.5.R (independientemente de la temperatura), sufre el proceso ciclico reversible 1 2 3 4 que se muestra en el gráfico P vs V de la Figura 1. Calcule q, w y ∆U para cada etapa y para el ciclo completo. P (atm) 3.00

2

3 Fig.1

1.00

1

4 1000

2000

V (ml)

5. Un mol de He gaseoso con Cv=3/2.R esencialmente independiente de T se expande revesiblemente desde 24.6 l y 300K a 49.2 l. Calcule la temperatura y presión finales si la expansión es a): isotérmica; b) adiabática; dibuje un esquema de los dos procesos en un gráfico P-V. 6. Clasifique las siguientes energías como energía cinética, potencial o ambas: a) energía traslacional; b) energía rotacional; energía vibracional; d) energía electrónica. 7. Explique porque la ley de Boyle P.V=cte para un gas ideal no contradice la ecuación PVγ=cte para un proceso reversible adiabático en un gas perfecto con Cv constante. 8. Un gas perfecto con Cv=3R independientemente de T se expande adiabáticamente en el vacío doblando su volumen. Dos estudiantes presentan los siguientes análisis en conflicto. Ana usa la ecuación T2/T1=(V1/V2)R/Cv ; Laura escribe ∆U= q+w=0+0 y ∆U=Cv.∆T. Quien tiene razón? Que error cometió la otra estudiante? 9. Un gas perfecto sufre un proceso de expansión a presión constante. Aumenta o disminuye su energía interna? JSR. 10. Clasifique las siguientes cantidades como extensivas o intensivas e indique las unidades SI para cada una: a) densidad; U; c) H; d) Cp; e) calor especifico; f) Cv. 11. Diga si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas? a)∆H es una función de estado b) Cv es independiente de T en un gas perfecto c) ∆U=q+w para todo sistema termodinámico en reposo en ausencia de campos externos. 5

d) Un proceso en el cual la temperatura final es igual a la temperatura inicial debe ser un proceso isotérmico e) Para un sistema cerrado en reposo en ausencia de campos externos U=q+w f) U permanece constante en todo proceso cíclico en un sistema cerrado. h) ∆U=0 en todo proceso cíclico. i) ∆T=0 para todo proceso adiabático en un sistema cerrado j) Un proceso termodinámico se especifica al especificar el estado inicial y el estado final del proceso k) Si un sistema cerrado en reposo y en ausencia de campos externos sufre un proceso adiabático con w=o entonces la temperatura del sistema debe permanecer constante. l) El trabajo P.V es usualmente despreciable en sólidos y líquidos.

BIOFISICA QUIMICA Problemas Tema: Energetica 2 1. Suponga una maquina de vapor que trabaja con fuente caliente a 800°C y fria a 0°C. a) Calcule el máximo rendimiento posible. b) Si qc es 1000 J, calcule el máximo valor de –w y el mínimo valor de –qf. 2. Para cada uno de estos procesos, deducir si ∆S y ∆Suniv son negativos, cero o positivos: a) Fusión reversible de benceno solido a 1 atm en el punto de fusión normal; b) fusión reversible de hielo a 1 atm y 0oC; c) expansión reversible adiabática de un gas perfecto; d) expansión reversible isotérmica de un gas perfecto; e) expansión adiabática de un gas perfecto en el vacío (experimento de Joule); f) estrangulamiento adiabático Joule-Thompson de un gas perfecto; g) calentamiento reversible de un gas perfecto a presión constante P; h) enfriamiento reversible de un gas perfecto a volumen constante; i) combustión del benceno en un recipiente con paredes adiabáticas. 3. El calor molar de vaporización del Ar en el punto normal de ebullición (87,3 K) es 1,56 Kcal/mol. A) Calcule ∆S cuando se vaporiza 1 mol de Ar a 87,3 K y 1 atm. B) Calcule ∆S cuando se condensan 5 g de Ar (g) a liquido a 87,3 K y 1 atm. 4. 200 g de oro (Cp=0.0313 cal/gC) a 120º C se depositan sobre 25 g de agua a 10º C, y el sistema alcanza el equilibrio en un recipiente adiabático. Calcule a) la temperatura final; b) ∆S Au; c) ∆S agua d) ∆S Au + ∆S agua. 5. Calcule el ∆S en la mezcla de 10 g de He a 120º C y 1,5 bar con 10 g de O2 a 120º C y 1,5 bar (1 bar = 1 mmHg). 6. Cual de los siguientes enunciados puede probarse a partir de la segunda ley de la temodinámica? A) en un sistema cerrado, el equilibrio corresponde a la posición de máxima entropía del sistema; b) la entropía de un sistema aislado debe permanecer constante; c) en un sistema encerrado entre paredes impermeables y adiabáticas, la entropía es máxima en el equilibrio; d) la entropía de un sistema cerrado nunca puede disminuir; e) la entropía de un sistema aislado nunca puede disminuir.

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BIOFISICA QUIMICA Problemas Tema: Energetica 3 1. Indique si ∆A y ∆G de los siguientes procesos son positivos, cero o negativos: a) fusión reversible de benceno sólido 1 atm en el punto de fusión normal; b) fusión reversible de hielo a 1 atm y 0 C; c) expansión reversible adiabática de un gas perfecto; d) expansión adiabática de un gas perfecto en el vacío; e) expansión reversible isotérmica de un gas perfecto; f) estrangulamiento adiabático de un gas perfecto; g) calentamiento reversible de un gas perfecto a presión constante P; h) enfriamiento reversible de un gas perfecto a volumen constante. 2. Calcule ∆A y ∆G en el cambio de estado de un gas perfecto monoatómico con Cv=1,5R (independiente de T) desde 1,5 atm., 400 K hasta 3 atm, 600 K. 3. Determine a) el ∆G de fusión de 50 g de hielo a 0º C y 1 atm; b) el ∆G para la congelación del agua superenfriada a –10º C y 1 atm a hielo a –10º C y 1 atm. Los valores medio de Cp del hielo y el agua superenfriada en el intervalo de 0º a –10º C son, respectivamente, 0,5 y 1,01 cal/g/C. 4. Calcule ∆G para la compresión isotérmica de 30 g de agua de 1 a 100 atm a 25º C, desprecie la variación de V con P. 5. Escriba las condiciones de equilibrio material entre las fases para cada uno de los siguientes sistemas cerrados a) hielo en equilibrio con agua líquida; b) sacarosa sólida en equilibrio con una solución saturada de sacarosa; c) sistema de dos fases constituidas por una solución saturada de éter en agua y una solución saturada de agua en éter. 6.

Diga cuál sustancia de los siguientes pares tiene mayor potencial químico: a) H2O(l) a 25º C y 1 atm, H2O(g) a 25º C y 1 atm; b) H2O(s) a 0ºC y 1 atm, H2O(l) a 0º C y 1 atm; c) H2O(s) a -5º C y 1 atm, H2O(l) superenfriada a –5º C y 1 atm d) C6H12O6 (s) a 25º C y 1 atm, C6H12O6 (ac) en una solución acuosa insaturada a 25º C y 1 atm. e) C6H12O6(s) a 25º C y 1 atm; C6H12O6 en una solución acuosa saturada a 25º C y 1 atm. f) C6H12O6(s) a 25º C y 1 atm; C6H12O6 en una solución acuosa supersaturada a 25º C y 1 atm.

7. Escriba la condición de equilibrio químico de N2 + 3H2 → 2NH3 en un sistema cerrado. 8. Un sistema cerrado contiene inicialmente 5.8 moles de O2 y 6,2 moles de O3. Posteriormente, se encuentran 7,1 moles de O2 debido a la reacción 2O3 → 3 O2. Cuál es el valor de ξ. 9. Para cada uno de los siguientes procesos señale si alguna de las diferencias ∆U, ∆H, ∆S, ∆G debe ser cero. a) un gas no ideal que recorre un ciclo de Carnot. b) quemado de hidrógeno en un calorímetro adiabático de volumen constante. c) expansión Joule’Thomson de un gas ideal, d) fusión del hielo a 0º C y 1 atm. 10. Exprese las condiciones de aplicabilidad de cada una de estas ecuaciones a) dU=dq+dw; dU=TdS – pdV; c) dU= TdS + PdV + ΣΣαµiα dniα

7

BIOFISICA QUIMICA Problemas No 4, Tema: Soluciones reales: determinación de coeficientes de actividad

1. Complete la siguiente tabla. Coeficientes de actividad Ley de Raoult

Ley de Henry

Eter x1.P*1

Acetona γ1

P2

x2.P*2

γ2

K2.x2

γ2

1

0

0

----

0

1

x2

P1

0

86.1

0.2

71.3

12

0.4

58.7

19.7

0.5

52.1

22.4

0.6

44.3

25.3

0.8

26.9

31.3

1.0

0

0

Acetona

---

37.7

ether= 1, acetona= 2, presiones=kPa γ1

Ley de Raoult

P1=x1.P*1 (para el solvente)

Ley de Henry

P2=x2.K2 (para el soluto) γ2 1 x2 0 Graficar P2/x2 vs x2, extrapolar a x2=0 para calcular K2, aparente

2.

1

x1

1

Cómo determinar coeficiente iónico medio del HCl a partir de datos de potenciales electroquímicos de celdas galvánicas. ½ H2(g) + AgCl(s) ∆G = -⏐νe⏐.F.E =

===== HCl(m) + Ag (s)

Σ νi.µio

+ R.T.Σνi.lnai

= -⏐νe⏐.F.Eo + R.T.ln Πaνi

Si PH2 = 1 ν±= n+ + n-

a = (γ± . m± )ν± a = γ± ν±. mν±.(ν+ν+.ν-ν-)

F= 9.649 C/mol

E = Eo - R.T/F ln K E = Eo - R.T/F ln (aHCl/ (PH2/Po)) E = Eo - R.T/F ln (γ±2. m2)

E’ = E - RT/F . 2.ln m = Eo - R.T/F ln (γ±2)

Dado que

m=0

γ± = 1 8

(1)

entonces, para calcular γ±

graficar E’ vs m y extrapolar a m=0 para calcular Eo y luego calcular γ±

para cada x HCl utilizando ec.1

x HCl

E (v)

0.0100

0.5351

0.0200

0.4991

0.0500

0.4514

0.1000

0.4153

0.2000

0.3793

0.4000

0.3435

1.0000

0.2972

2.0000

0.2641

3.0000

0.2466

4.0000

0.2356

5.0000

0.2284

E’ (v)

9

γ±

BIOFISICA QUIMICA TRABAJO PRACTICO N° 1 PRESION OSMOTICA

INTRODUCCION

Presión osmótica, volumen crítico, hemólisis y coeficiente osmótico En una solución ideal los potenciales químicos de los componentes son menores que los potenciales químicos de esos mismos componentes con respecto a cuando están puros. Así por ejemplo, el µ del agua en una solución de NaCl es menor que el µ en agua pura y el µ del NaCl en la solución es menor que en un cristal de NaCl. µi =

∂G . ∂ ni T, P, nj e i

µi = µ° + RT ln Xi El valor de µ de un componente depende de la concentración de ese componente. Una consecuencia de este hecho es que las propiedades coligativas del solvente cambian cuando variamos la concentración del soluto. Se observa, por ejemplo, descenso del punto crioscópico, aumento del punto de ebullición o disminución de la presión de vapor del solvente cuando aumentamos la concentración de soluto. Supongamos que ponemos en contacto, suavemente y sin mezclar enérgicamente, dos soluciones de sacarosa de diferente concentración. Inicialmente el µ correspondiente al agua y a la sacarosa serán distintos. Este sistema, que inicialmente no está en equilibrio termodinámico, lo alcanzará cuando el µ de cada componente sea constante a lo largo de todo el sistema, es decir cuando la solución sea homogénea.

t1 lado1 Solución De Sacarosa

t2

lado 2

Agua Pura

Fig.1

comp.1

comp. 2

solución de sacarosa

agua pura

Fig. 2

En la Fig.1 se muestra un sistema de dos compartimientos de paredes rígidas separados por una membrana semipermeable: permeable al solvente agua pero impermeable a la sacarosa. Imagine que a tiempo cero hay una solución de sacarosa en el compartimiento 1 y agua pura en el 2. Está en equilibrio el sistema?. No es difícil deducir la respuesta: la concentración de agua en el lado 1 es menor y por lo tanto su µ es menor que el lado 2. El sistema entonces, no está en equilibrio. Cómo evolucionaría hacia el equilibrio?. De alguna manera el µ del agua del lado 1 es aumentar la presión dentro del compartimiento. A esta presión se la denomina presión osmótica Π y puede calcularse según:

10

Π=-

RT V

x

ln Xsolvente

Note que si plantea esta ecuación para el lado 2, la fracción molar del solvente 1 y la Π depende de la fracción molar del solvente y no de la naturaleza del soluto. Realizando algunas aproximaciones se obtiene la relación de Van't Hoff Π = RTC

donde la C es la concentración molar de soluto/s osmóticamente activos. En una solución de NaCl 1 la concentración de solutos osmóticamente activos es 2 M (1 M de Na+ y 1 M de Cl-). Para una solución de sacarosa es de 1 M.

Intente resolver analíticamente los siguientes problemas: 1) Si pudiera conectar un manómetro en los compartimientos 1 y 2 de la Fig 1. Cuánto valdría la diferencia de presión entre los compartimientos? 2) En la Fig. 2 se muestra un sistema similar al de la Fig. 1. Los compartimientos 1 y 2 están en contacto con el aire a través de los tubos 1 (t1) y 2 (t2). Estos son suficientemente pequeños como para que cualquier cambio de volumen de solución dentro de los tubos no produzca cambios apreciables de concentración de sacarosa. Cuando se alcance el equilibrio cuánto valdrá la diferencia de nivel del líquido entre los tubos 1 y 2?.

3) Si la membrana semipermeable de la Fig 1. Pudiera desplazarse dentro de compartimiento 2 como un émbolo, cómo evolucionaría el sistema hasta llegar al equilibrio?. 4) Cómo evolucionaría el sistema de la Fig. 1 si la membrana semipermeable fuera permeable tanto al agua como a la sacarosa?. CUESTIONARIO DE ORIENTACION

El alumno deberá entregar resuelto el cuestionario al comenzar el trabajo práctico.

1. Establezca la diferencia entre Osmosis y Presión Osmótica

2. En un proceso de ósmosis ocurre flujo de solvente a través de una membrana sólo permeable al solvente, desde:

a) Una solución más concentrada en soluto hacia una más diluida. b) Una solución de mayor hacia una menor presión osmótica. c) Una solución de menor número de partículas osmóticamente activa hacia una de mayor número de partículas osmóticamente activa. d) Una solución de baja fracción molar de solvente hacia una fracción molar de solvente.

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3. Grafique π/C en función de C (concentración).Considere los casos para una solución ideal y para una solución real.

4. Dos compartimientos A y B en equilibrio con la presión atmosférica están separados por una membrana rígida sólo permeable al agua. El compartimiento A contiene agua pura y el B contiene un volumen de solución de sacarosa 100 mM tal que el nivel de ambos compartimientos es el mismo. Cuando el sistema alcanza el equilibrio existe un desnivel entre ambos compartimientos. Indique a) b) c) d)

En cuál de los compartimientos es mayor el nivel. Cómo calcularía el valor de presión osmótica. En qué compartimiento es mayor el potencial químico del agua. Si el valor de presión osmótica en el compartimiento B en ambos estados es diferente.

5. Considere un sistema formado por dos compartimientos idénticos A y B separados por una membrana rígida permeable al agua. El compartimiento A contiene una solución de 0,1 M NaCl mientras que el B tiene una solución de 0,5 M NaCl. Indique: a) Cuál es la relación (mayor, menor o igual) entre los potenciales químicos del agua de ambos compartimientos en el estado inicial y en el equilibrio termodinámico. b) En cuál compartimiento mediría mayor presión osmótica. c) Prediga el flujo de solvente cuando el sistema tiende al equilibrio. d) Qué observaría si la membrana fuera distensible.

6. Calcule el número de partículas osmóticamente activas de 1000 ml de NaCl 1 M si el coeficiente osmótico es 0,84.

7. Dado un sistema de dos compartimientos, indique qué cantidad y en cuál de ellos es necesario agregar NaCl para no observar flujo de solvente entre ambos. El compartimiento A contiene 100 ml de una solución de NaCl 200 mM y el compartimiento B 100 ml de una solución de NaCl 100 mM y MgCl2 150 mM.

Objetivos del Trabajo Práctico La membrana del glóbulo rojo es permeable al agua e impermeable a iones Cl-, Na+ y a muchos componentes del citoplasma. El µ del agua del citoplasma de un eritrocito es equivalente al de una solución de NaCl 0,15 M. Qué diferencia de presión sentirá esta membrana si un eritrocito de sangre se resuspende en agua o en 0,15 M NaCl. Qué sucederá si se resuspende en soluciones de dilución creciente de NaCl?.

El objetivo del presente trabajo práctico es calcular cuánto vale la máxima diferencia de presión que puede soportar la membrana del eritrocito antes de estallar (hemólisis). Es relativamente sencillo a qué valor de concentración de NaCl externo se produce la hemólisis dado que se puede evidenciar la salida de hemoglobina citoplasmática mediante centrifugación y lectura en el espectrofotómetro. Al volumen máximo que pueda alcanzar el eritrocito antes del estallido hemolítico se lo denomina volumen crítico.

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Técnicas utilizadas en el desarrollo del trabajo práctico Aislamiento de glóbulos rojos: cada muestra de sangre de 10 ml con anticoagulante se procesará de la siguiente manera: a) Centrifugar en tubo plástico 5' a 500 rpm. b) Aspirar el plasma y la capa de glóbulos blancos utilizando una pipeta Pasteur. c) Agregar 5 ml de una solución isotónica de NaCl 0,15 M (0,9 %), mezclar suavemente por inversión. d) Centrifugar de la misma manera que en punto a) y aspirar el sobrenadante.

Determinación del % de hematocrito Colocar en 3 tubos de Kahn 0,5 ml de las soluciones de NaCl de tonicidad creciente (ver Tabla 1). Agregar 0,15 ml de la suspensión de glóbulos a cada tubo de Kahn. Agitar por inversión suave y dejar reposar 15 minutos. Suspender los glóbulos por inversión suave y tomar una muestra de cada tubo para microhematocrito. Centrifugar a 3000 rpm durante 15'. Graficar % de hematocrito en función de concentración de NaCl.

Hemólisis Colocar 2,5 ml de solución hipotónica en tubos de centrifugación: 6 donde las concentraciones NaCl varían entre 0,2 % y 0,8 % P/V y uno de referencia con 2,5 ml de agua (ver Tabla 2). Agregar 50 µl de suspensión de glóbulos al 12 % (0,4 ml de suspensión de glóbulos + 2,4 ml de NaCl 0.9 % ). Dejar reposar 30 minutos. Centrifugar, separar el sobrenadante y leer en el espectrofotómetro a 530 nm. Graficar % de hemólisis en función de la concentración de NaCl. El % de hemólisis se calcula en relación al valor de absorbancia del tubo 1 (hemólisis total en agua destilada = 100 %).

Coeficiente osmótico

El coeficiente osmótico está relacionado con el número de partículas osmóticamente activas que es capaz de dar una sustancia a una concentración dada. Entonces, el coeficiente osmótico es el factor de proporcionalidad Φ que existe entre una solución ideal y la osmolaridad real: Φ=

osmolaridad real osmolaridad ideal

Este coeficiente da una idea de cuán idealmente se comporta una solución. Cuánto vale Φ para una solución ideal?. Conociendo los coeficientes osmóticos de tres compuestos Ud. debería ser capaz de predecir qué relación existiría entre los volúmenes de glóbulos rojos suspendidos en soluciones de igual osmolaridad ideal de los mismos.

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Tabla 1 Tubo 1 2 3

Tabla 2 NaCl % 0,30 0.60 0.90

Hematocrito%

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8

NaCl % Absorbancia agua 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80

Técnica: Coeficiente osmótico

Colocar en tubos de Kahn 0,5 ml de NaCl 0,15 M, 0,5 ml de MgCl2, 0,15 M y 0,5 ml de sacarosa 0,15 M, respectivamente. Estas 3 soluciones son isotónicas idealmente. Agregar 0,15 ml de glóbulos y tomar 2 muestras de cada uno de ellos para microhematocrito. Analizar los resultados justificando claramente las eventuales diferencias entre ellos.

Tabla 3 Tubo

Solución

Con (M)

Sacarosa NaCl MgCl2

0,15 0,15 0,15

1 1 2 3

Osmolaridad ideal (mosM)

Osmolaridad real (mosM)

Φ

Hematocrito %

0,93 0,86 1,02

IMPORTANTE: CADA ALUMNO DEBERA TRAER: REGLA, LAPIZ, CALCULADORA, PAPEL MILIMETRADO.

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BIOFISICA QUIMICA TRABAJO PRACTICO No 2

PRACTICO DE COMPUTACIÓN:

Sistemas Caóticos

En un sistema caótico a diferencia de un sistema aleatorio, el valor de un determinado parámetro representativo del sistema, está relacionado con los valores que tomó en el pasado pasados o los valores futuros por alguna ecuación sencilla pero cuya representación en un sistema de coordenadas aparece como una gráfica compleja y difícil de interpretar. Este tipo de sistema es muy sensible a las variaciones de las condiciones iniciales. Esto equivale a decir que dos representaciones de la evolución del sistema diferirán en gran medida si se varían los parámetros levemente o si las condiciones iniciales son levemente diferentes. Por otra parte estas funciones (o sistemas) suelen presentar regiones en el rango de los parámetros donde su comportamiento es muy estable y regiones donde las variaciones en los parámetros o condiciones iniciales son extremadamente críticos.

1)

Una ecuación que muestra una fuerte dependencia respecto a las condiciones iniciales es : Xn+1 = Xn. λ.(1-Xn)

Esta ecuación es un modelo idealizado del comportamiento demográfico de una población de individuos de determinada especie e generaciones sucesivas (n).Donde Xn+1

es el número

normalizado de individuos en la generación n+1 y Xn el número de individuos en la generación anterior y λ el coeficiente reproductivo de la especie en cuestión. El término entre paréntesis es un factor de competencia que indica que Xn+1 nunca podrá ser 1 es decir la capacidad de carga del ambiente. λ(1-Xn) podría considerarse el potencial reproductivo disminuido por la presión de los individuos sobre el ambiente

a) Calcule el valor de Xn+1 para 10 generaciones consecutivas partiendo de Xn = 0.5 para los siguientes valores de λ. λ=

λ=

λ=

λ=

λ=

λ=

b) Represente en un gráfico los valores obtenidos y describa brevemente el comportamiento de la población. c) Que valores son los más probables de encontrar en un censo de población. d) Que ocurre si se comienzan con otros valores de Xn. 15

2)

A partir del programa que representa Xn en función del parámetro reproductivo determine : a)

puntos de acumulación.

b)

intente encontrar autosimilitudes entre las distintas regiones de la gráfica

c)

amplifique zonas donde parece no haber puntos de acumulación. Existen patrones atractores en estas zonas?

d)

discuta sobre las ventajas o desventajas evolutivas para poblaciones con este comportamiento oscilatorio respecto a predadores, recursos del ambiente, etc.

3)

La aparición de propiedades emergentes es un indicio de autoorganización y de automantenimiento de estructuras jerárquicas superiores. Los autómatas celulares son algoritmos matemáticos que transforman cualidades de unidades aritméticamente definidas en función de el valor de las unidades que interactúan o establecen comunicación con ella. a) ejecute el programa “democaos” y observe la evolución del ejemplo de autómatas celulares, intente descubrir alguna propiedad emergente. b) Puede observar la evolución de alguna estructura jerárquica superior? c) Aparecen estructuras organizadas espacial o temporalmente? d) Imagina la aparición de estructuras organizadas en alguna otra dimensión que no sea la espacio-temporal? Cómo se evidenciarían?

16

BIOFISICA QUIMICA TRABAJO PRÁCTICO No 3

CATÁSTROFES EN REACCIONES QUÍMICAS

En la segunda mitad del siglo 20 tuvo lugar un cambio distintivo en el pensamiento científico. Este cambio estuvo asociado con la aparición de nuevos conceptos en ciencia que involucraban el estudio integral (global) de los problemas considerados, en contraste el método de análisis derivado de Descartes (dividiendo el problema en partes). Estas nuevas teorías fueron: ◊ Teoría de los sistemas (Ludwing von Bertalanffy) ◊ Cibernética (Norbert Wiener) ◊ Sinergética o teorías de la bifurcación (teoría de los fenómenos cooperativos) (Herman Haken) ◊ Teoría de catástrofes (René Thom)

Todas estas teorías enfatizan el carácter no lineal de los fenómenos que examinan. Anteriormente se acostumbraba a linealizar las respuestas a los fines de encontrar la descripción de los fenómenos no lineales, probablemente debido a la falta de métodos matemáticos apropiados. Los primeros problemas no lineales fueron estudiados en el campo de la hidrodinámica y de la relatividad general, los cuales produjeron un avance notable en la teoría de ecuaciones diferenciales no lineales. Posteriormente se desarrollaron nuevas herramientas matemáticas por medio de las teorías de solitones, atractores extraños y teoría de fractales.

Catástrofe: fenómeno consistente en la pérdida de estabilidad de un estado otrora estable de un sistema, seguido por la rápida transición hacia otro estado estable del sistema bajo las nuevas condiciones. ◊ La pérdida de la estabilidad es consecuencia del cambio lento y continuo de los parámetros que determinan el estado del sistema ◊ La transición hacia el nuevo estado es generalmente abrupta

Prigogine comenzó con el estudio de reacciones químicas en condiciones alejadas del equilibrio termodinámico. Él descubrió la aparición de estructuras espaciales y oscilantes en sistemas homogéneos y la generación de estados turbulentos en reactores de flujo. Estos resultados son de vital importancia para las teorías de reactores químicos y para la investigación de organismos vivos, y forman la base de la dilucidación teóricas de los problemas relacionados con la diversificación de tejidos y la explicación de relojes biológicos.

17

PROBLEMAS FILOSÓFICOS ASOCIADOS A LA TEORÍA DE CATÁSTROFES

La descripción de la realidad en la teoría de catástrofes está limitada a algunas formas de cosas y de fenómenos. ◊ describe aquellos fenómenos cuya forma es resistente a perturbaciones, es decir: estructuralmente estable ◊ describe cambios en la forma que tienen lugar como consecuencia de la variación continua en los parámetros de control ◊ enfatiza cambios en la forma que sean cualitativos y estructuralmente estables

Esto se relaciona con el “concepto” de Platón y la “forma” de Aristóteles. Según Platón el concepto básico es una idea y las cosas son imitación de las ideas. Según Aristóteles materia y forma existen combinadas en una entidad. La forma es un componente esencial y permanente de las cosas, es cognoscible. La idea de que los cambios cualitativos en el sistema son debido a lentos cambios cuantitativos en los parámetros de control se relaciona con Hegel y Engels. Según Hegel en el cambio de fase del agua, que él analiza, temperatura y presión son los parámetros de control y densidad es el parámetro de estado factible de ser medido. Según Engels “las constantes físicas son nada más que nombres de puntos nodales en los cuales cambios cuantitativos causan cambios cualitativos en el estado de un sistema; en los puntos nodales cantidad se vuelve cualidad. En la teoría de catástrofes el nodo en el que ocurre esa transición corresponde al conjunto de catástrofe (conjunto de valores de los parámetros de control) en el cual el sistema es sensible (susceptible a perturbaciones). El conjunto de catástrofe divide los estados del sistema; la transición entre esos estados constituye la catástrofe.

TEORÍA DE CATÁSTROFES EN QUÍMICA

En años recientes, se han descripto

numerosas

reacciones químicas que exhiben una

dinámica compleja. La reacción de Belousov-Zhabotinskii (BZ), fue descubierta por Belousov en 1950. Esta reacción implica la oxidación de ácido cítrico por bromato en medio ácido, en presencia de Br- y Ce(IV)-Ce(III) como catalizadores. Belousov observó oscilaciones en las concentraciones de algunos componentes (Br-, Ce(III), Ce(IV), a pesar de la homogeneización de la mezcla de reacción. Zhabotinskii le agregó un indicador (ferroína: FeSO4 + o-fenantrolina) lo cual permitió visualizar las oscilaciones con una claridad marcadamente superior.

En la reacción de BZ es posible observar varios estados dinámicos de interés: ◊ estado de equilibrio, 18

◊ estado periódico temporal (oscilaciones en la concentraciones en función del tiempo), ◊ estado periódico espacial, (oscilaciones en la concentraciones en función del espacio) ◊ estado estacionario (estructuras disipativas), ◊ estado periódico espacio-temporal (ondas químicas propagándose) ◊ estado turbulento (oscilaciones caóticas, estructuras espaciales estocásticas, ondas químicas estocásticas).

Estas periodicidades espaciales o temporales, en un comienzo fueron atribuidas a inhomogeneidades (partículas de polvo, burbujas de gas liberado, agitación insuficiente de la solución), suponiendo que en sistemas verdaderamente homogéneos esto no podía ocurrir. Esta opinión provenía del paradigma profundamente enraizado en la química que considera que: “los sistema se aproximan al estado de equilibrio monotónicamente, debido a que esto resulta del requerimiento termodinámico de la disminución de la energía libre del sistema como un todo”. Este concepto cambió a partir de los resultados sobre estudios de sistemas alejados del equilibrio; de acuerdo con la segunda ley de la termodinámica la aparición de orden bajo condiciones de homogeneidad sólo puede tener lugar en sistemas abiertos. Estructuras no homogéneas pueden aparecer satisfaciendo el requerimiento termodinámico de la disminución monotónica en la energía libre del sistema como un todo, dado que éstas aparecen como resultado de reacciones colaterales.

Por medio del cambio en las condiciones iniciales, el sistema puede pasar desde el estado estacionario hacia cualquiera de los estados mencionados; otras transiciones también son permitidas. La mezcla de reacción es el sistema; el estado del sistema puede ser representado por las variables de estado; otras variables, llamadas parámetros de control son modificadas continuamente y un cambio en el estado del sistema es examinado. Un cambio abrupto en el estado del sistema ocurre para algunos valores de los parámetros de control. Por ejemplo: un cambio continuo en la concentración de uno de los componentes del sistema puede inducir un cambio desde el estado estacionario hacia un estado oscilatorio.

19

MODELO SIMPLIFICADO DE LA REACCIÓN DE BELOUSOV-ZHAVOTINSKII “EL OREGONATOR”

Las cinco reacciones más importantes en el modelo de Fields-Körös-Noyes para el mecanismo de la reacción BZ son las siguientes: BrO3- + Br- 2H+

HBrO2 + HOBr

HBrO2 + Br- + H+ 2Ce

3+

+

BrO3-

(determina velocidad de la reacción) (A)

2HOBr +

4+

+ 3H

2Ce

(B) H2O + 2HBrO2

(producción autocatalítica de HBrO2; no es reacción elemental)

BrO3- + HOBr + H+

2HBrO2

4Ce4+ + BrCH(COOH)2 + 2H2O A + Y

X + P

X + Y

2P

A + X

2X + 2Z

2X

A + P

Z

fY

(determina aumento de [HBrO2]

4Ce3+ + Br- + HCOOH + CO2 + 5H+

(C) (D) (E)

A = BrO3X= HBrO2 P= HOBr Y= BrZ= Ce4+

En este modelo se considera que la reacción BZ transcurre en una solución agitada, a T y P cte, en un sistema cerrado, que los cambios en [BrO3-] son despreciables y que [HOBr] no afecta la cinética de la reacción. El ácido bromoso (HBrO2) es producido autocatalíticamente y su aumento es limitado por la reacción de desproporción (D).

20

PARTE PRÁCTICA: Reacción de Belusov-Zhabotinskii

La siguiente tabla indica los rangos de concentraciones iniciales de los reactivos para las cuales pueden verse las oscilaciones de concentración.

Tabla 1

Reactivo

Rango[M ]

Ejemplo(M)

cantidad

Ce(NH4)2(NO3)6

0.0001-0.01

0.002

0.175 g

CH2(COOH)2

0.125 - 0.50

0.275

4.292 g

NaBrO3

0.03 - 0.625

0.625

1.415 g

H2SO4

0.5 - 2.5

1.5

150 ml

Ferroina

0.0006

0.006

Algunos reactivos pueden ser reemplazados por otros. Una sal diferente de cerio puede ser utilizada por ej. Ce(NH4)2(SO4)4, NaBrO3 puede ser reemplazado por KBrO3, Mn(III)/Mn(II) se puede emplear en lugar de Ce(IV)/Ce(III) y al ácido malónico puede ser reemplazado por Ac. Cítrico. La Ferroina es un indicador redox que permite visualizar la relación de concentraciones del par redox Ce(IV)/Ce(III); el color azul corresponde a un exceso de iones Fe(III) mientras que un color rojo indica un exceso de iones Fe(II).

Proporción de reactivos para preparar ferroína 0.025 M Tabla 2.

Reactivo

Cantidad

FeSO4•7H2O

0.695 g

o-fenantrolina •H2O

1.625 g

H2O

100 ml

Oscilaciones de concentración (periodicidad temporal)

Procedimiento 1)

Disolver el ac. malónico y la sal de cerio en ac. sulfúrico con agitador magnético. La solución inicialmente amarillenta se debe tornar incolora luego de algunos minutos.

21

2)

agregar el NaBrO3 agitando vigorosamente, luego de aproximadamente un minuto se debe comenzar a observar un cambio periódico en la coloración de amarillento a incoloro.

3)

agregar la ferroina, se debe observar un cambio de azul a rojo.

Estructuras espaciales (ondas) La diferencia entre este experimento con el anterior es que este no utiliza agitación. El protocolo es el siguiente:

10 ml 0.418M ácido malonico 10 ml solución saturada de KBrO3 20 ml 0.6M H2SO4 10 ml 0.005M ferroina 0.15g Ce(NH4)2(NO3)6 1)

Los reactivos listados excepto la sal de cerio se deben disolver en un recipiente con agitación por algún tiempo,

2)

luego se detiene la agitación y cuando cese el movimiento del líquido se agrega la sal de cerio con una pipeta suavemente.

3)

La solución de la sal de cerio tiene densidad más baja que la solución receptora por lo que formara una capa en la parte superior.

Agitar y transferir a una caja de Petri y cubrirla cuando se torne uniformemente roja.

22

BIOFISICA QUIMICA TRABAJO PRACTICO N° 4 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION MICELAR CRITICA (CMC)

INTRODUCCION

Sustancias anfipáticas son aquellas que poseen por lo menos dos zonas de polaridad opuesta y orientada asimétricamente en su estructura química. Cuando en un sistema acuoso se incrementa la concentración de una sustancia anfipática, varias propiedades como la presión osmótica (Π), la conductividad (C) y la tensión superficial (γ) varían con la concentración del anfifilo según lo indicado en la Fig.1.

Región hidrofílica

monómero

micela

Región hidrofóbica

Π

γ

Concentración monómero y micela

c

γ C

monómero

micela

C

Π

CMC

CMC

Concentración anfifilo

Total agregado de anfifilo Fig. 1

En soluciones diluidas de sustancia anfipática estos parámetros (Π, γ, C) varían en función de la concentración según lo indicado en la Fig. 1 de manera similar a soluciones de electrolitos simples, pero existe una región o valor de concentración en la cual estos parámetros cambian bruscamente. Esta región de concentración en la cual ocurre el fenómeno se denomina concentración micelar crítica (CMC). La explicación del fenómeno a nivel molecular se puede resumir diciendo que en la zona de CMC se alcanza el equilibrio entre el anfifilo en su forma de monómero y un agregado multimolecular denominado micela. Una micela es una estructura formada por agregación de varios monómeros de anfifilo de tal forma en que se satisfacen las interacciones hidrofílicas y el efecto hidrofóbico de tal forma que la micela reduce el área de contacto de las zonas no polares del anfifilo con la fase acuosa mientras que al mismo tiempo permanecen solvatados los grupos hidrofílicos. La forma de representar la fase micelar se esquematiza en la Fig. 1. La figura muestra que la concentración de monómero aumenta hasta alcanzar un valor máximo y al agregar más moléculas anfipáticas comienza a formarse la fase micelar. La concentración máxima de monómero en solución en equilibrio con la fase micelar corresponde a la CMC. 23

El fundamento del TP consiste en que un colorante como el azul de bromo timol en agua debido a su baja solubilidad en medios de alta constante dieléctrica tiene valores muy bajos de densidad óptica (DO), pero es muy soluble en medios de baja polaridad como el corazón hidrofóbico de una micela y desarrolla un color azul obteniéndose buenos valores de DO en esos medios. Cuando en la solución no existe una fase micelar los valores de DO serán bajos y constantes. Los valores de DO aumentarán significativamente cuando en la solución se forme la fase micelar ya que el colorante particiona a la región no polar de la micela. Conociendo la CMC se puede calcular la energía libre standard ∆G° del proceso mediante: ∆G° = RT ln CMC

(1)

Conociendo la variación de la CMC con la temperatura se puede calcular la entalpía standard ∆H° del proceso mediante: ∂ ln (CMC) ∂ 1/T

=

∆H° R

(2)

Conociendo ∆G° por (1) y ∆H° por (2) se puede estimar la entropía ∆S° mediante: ∆G°m = ∆H°m - T∆S°m

(3)

donde el subíndice m indica expresamente el proceso de micelización.

CUESTIONARIO DE ORIENTACION (El alumno deberá entregar el cuestionario resuelto para poder realizar el T.P.) Los conceptos que necesitará para resolver este cuestionario son : a) Concentración micelar crítica (CMC) b) Efecto hidrofóbico c) ∆H°, ∆S° y ∆G° del proceso de micelización d) Fundamento y técnica del T.P.

1.- a) Explique por qué la presión osmótica (Π) y la tensión superficial (γ) presentan cambios bruscos en la zona correspondiente a la CMC si se grafican éstos en función de la concentración del detergente. b) Con el aumento del número de monómeros que conforman una micela (número de agregación), el cambio será más o menos brusco?.

2.- a) Dados dos lípidos con idéntico grupo polar y diferente longitud de cadena hidrocarbonada: lípido A con un grupo hidrofóbico de 16 átomos de carbono y el lípido B con 10 átomos de carbono, infiera si la CMC son iguales o diferentes, J.S.R. b) Suponga ahora que ambos lípidos tienen igual cadena hidrocarbonada pero el lípido B tiene una mayor área molecular. Analice en forma conceptual como se alteran los parámetros de micelización (CMC, número de agregación).

24

3.- Dados tres recipientes A, B y C de 1 litro cada uno. Al recipiente A se le agregan 0,2 mmoles, al recipiente B 0,31 mmoles y al recipiente C 0,6 mmoles de un mismo detergente cuya CMC - 0,3 mM. Diga: a) Cuál será la concentración de monómero de cada recipiente. b) Suponiendo que el número de agregación N de la micela es 100, exprese la concentración de micelas (mM) en cada recipiente. 4.- Dado un lípido manoácido que está ionizado a pH neutro y forma micelas. A) Calcule el ∆H°, ∆S° y ∆G° del proceso de micelización sabiendo que este compuesto a 25°C tiene una CMC de 1 x 10-10 M y a 50°C es 1,1 x 10-10 M. En base a estos datos y a los parámetros calculados deduzca: a) Cuál es la principal fuerza impulsora del proceso de micelización. b) Qué significa desde el punto de vista termodinámico que un proceso exergónico tiene una muy baja dependencia de su constante de equilibrio con la temperatura?. J.S.R.

5.- Teniendo en cuenta los fundamentos del T.P., indique si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas. J.S.R. a) El tubo que contiene solamente agua y colorante tendrá una absorbancia (A) menor que un tubo que contiene colorante y detergente a una concentración menor que la CMC. b) Los tubos con colorantes y concentraciones crecientes de detergente por debajo de CMC deberían dar valores constantes de A. c) A medida que se comienza a formar la fase micelar los valores de A comienzan a incrementarse. d) Por encima de CMC los valores de A en los tubos con colorantes y cantidades crecientes de detergente deberían ser constantes.

PARTE PRACTICA

MATERIALES 1) Colorante: Azul de Bromo Timol 3.3 % P/V en metanol. Diluir 1/100 en agua antes de usar 2) Detergentes: a) Tritón X-100 (detergente no iónico al 0,04 % P/V (PM = 643). b) Cetrimida (detergente catiónico al 5.46 % P/V (PM = 364.45).

Determinación de CMC de Tritón X-100 a) a temperatura ambiente b) a 90°C

Determinación de CMC de Cetrimida a) a temperatura ambiente b) a 90°C

INDICACIONES PARA AMBOS DETERGENTES

a) Todos los tubos una vez agregados todos los reactivos se deja 30 minutos a temperatura ambiente y se lee la A a 485 nm. b) Se calienta a 90°C durante 15 minutos y se lee la A a 410 nm. c) Agitar vigorosamente todos los tubos cada 5 minutos. 25

TRITON

Tubo N° Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tritón X-100 Colorante (ml) 0,04% (ml) 0,00 0.25 0,15 0.25 0,30 0.25 0,50 0.25 1,00 0.25 1,15 0.25 1,25 0.25 1,35 0.25 1,50 0.25 1,75 0.25 2,00 0.25

Agua Volumen (ml) final 3,00 3,25 2,85 3,25 2,70 3,25 2,50 3,25 2,00 3,25 1,85 3,25 1,75 3,25 1,65 3,25 1,50 3,25 1,25 3,25 1,10 3,25

Concentración A A (Tº amb) (90°C) (mM)

CETRIMIDA

Tubo N° Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cetrimida Colorante 5.46% (ml) (ml) 0,00 0,2 0,10 0,2 0,20 0,2 0,30 0,2 0,35 0,2 0,40 0,2 0,45 0,2 0,50 0,2 0,60 0,2 0,70 0,2 0,80 0,2

Agua (ml) 2,80 2,70 2,60 2,50 2,45 2,40 2,35 2,30 2,20 2,10 2,00

Volumen final (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Concentración A A (mM) (Tº amb) (90°C)

Una vez obtenidos los valores de A a temperatura ambiente y a 90°C, se grafica la A en función de la concentración de detergente expresada en mM. El punto de inflexión corresponde a la CMC. Estime el ∆G° para ambas temperaturas. Determinación del ∆H° de micelización para ambos detergentes. Se grafica el ln CMC en función de la inversa de la temperatura (1/T) y de la pendiente de la curva se puede calcular ∆H° el para el proceso de micelización. Estime el ∆S° y compare con el valor de ∆H°.

26

BIOFISICA QUIMICA TRABAJO PRACTICO N° 5

RECEPTORES Concepto y Generalidades: Un receptor es una proteína cuya función involucra la unión reversible a ella de otra molécula (ligando) la cual puede ser de diversa naturaleza química. La unión ligando-receptor ocurre en un sitio de la proteína receptora llamado sitio de unión que es complementario al ligando en tamaño, forma, carga y carácter hidrofílico o hidrofóbico. De esta manera esta interacción es altamente específica. Estos receptores, por ser de naturaleza proteica, pueden sufrir cambios en su conformación por alteraciones en el ambiente que los contiene y esto puede reflejarse en modificaciones en la interacción con sus ligandos. Los receptores nerviosos de neurotransmisores constan, en la mayoría de los casos,

de dos

componentes diferentes: el sitio de unión al ligando y la parte del receptor que transduce el reconocimiento al ligando en un segundo mensajero, usualmente una alteración a la permeabilidad a ciertos iones o la acumulación de un nucleótido cíclico.

Criterios para la identificación de un receptor La hipótesis de que una proteína dada representa un receptor para una droga o neurotransmisor (ligando) debe estar apoyada por una serie de criterios básicos de identificación del receptor. Algunos de los más importantes están explicados a continuación: A) Saturabilidad: existe un número finito de receptores y por ende, de sitios de unión. La cantidad de complejo ligando-receptor formado no puede ser mayor que la cantidad de receptor existente. Llegado un punto, por más que se incremente la concentración del ligando, no aumentará la concentración del complejo; el sistema está saturado. B) Competencia: Frente a un ligando A, la presencia de otro ligando B específico para el mismo receptor, resultará en una competencia que reducirá el número de moléculas de A originalmente unidas al receptor. C) Afinidad: La unión ligando-receptor está caracterizada por una alta afinidad. Esta afinidad está definida por el valor de la constante de disociación del complejo, y es del orden nM o menor. D) Farmacología de la unión: Debe existir una correlación cuantitativa entre la unión del ligando y los efectos mediados por dicha unión. Si bien no es fácil correlacionar parámetros de unión determinados in vitro con efectos in vivo (por ej. sobre la conducta), existen otros métodos para determinar los efectos farmacológicos in vitro o ex vivo tales como técnicas electrofisiológicas, cuantificación de la concentración de iones, determinación de mensajeros secundarios, etc.

27

Método de Radioligando Es un método para la determinación de los parámetros de la unión ligando-receptor tales como el número de receptores existentes y la afinidad de la unión. Consiste básicamente en la utilización de un ligando marcado radiactivamente el cual debe conservar su actividad biológica y debe poseer una actividad radiactiva específica suficiente para ser detectable. El isótopo más utilizado para marcar la molécula del ligando es tritio ([3H]). PORQUÉ?

Separación del ligando libre del unido. La técnica de separación dependerá del tipo de receptor y ligando a estudiar. Algunas de ellas son por ejemplo filtración, centrifugación, diálisis, etc. Una de las variables más importantes a tener en cuenta para la elección de la técnica es la velocidad de disociación del complejo ligando receptor y su dependencia a la temperatura. En general tanto la asociación como la disociación aumentan hasta cierto punto con la temperatura.

Linealidad y no saturabilidad de la unión inespecífica. El ligando puede interactuar (con mucha menor afinidad) con otras moléculas, distintas del receptor, que forman parte del sistema donde está inserto el receptor (componentes de la membrana como lípidos u otras proteínas no receptoras). Este tipo de interacción se denomina unión inespecífica y aumenta a medida que aumenta la concentración del ligando de manera lineal y sin alcanzar una saturación. Al ser esta interacción no específica, no depende del número de receptores existentes.

Unión Específica, Inespecífica y Total Dada la existencia de esta interacción inespecífica, la unión determinada en presencia del ligando representará tanto la unión específica como la inespecífica (unión total). Para el cálculo de la unión específica, que es la que nos permitirá definir los parámetros de unión, es necesaria la determinación de la unión inespecífica lo cual se realiza mediante el agregado al sistema de un exceso de ligando no marcado (aproximadamente una concentración equivalente a 100 x Kd del mismo ligando no marcado o de otro con afinidad comparable). Así, por competencia se desplazará al ligando marcado de los sitios de unión hacia uniones inespecíficas. Luego por diferencia entre la unión total (en presencia del ligando marcado) y la unión inespecífica (en presencia del ligando marcado y del no marcado) se obtiene la unión específica.

Consideraciones Teóricas La interacción ligando-receptor sigue una cinética similar a la de la interacción enzima sustrato. Básicamente la ecuación que describe la unión reversible ligando receptor es la siguiente: k1

[R] + [L] ' [RL] k2

donde R: receptor y L: ligando. En equilibrio, 28

k1.[R].[L] = k2.[RL] y la constante de disociación es,

Kd =

k 2 [R ] ⋅ [L] = [RL] k1

El número total de receptores esta dado por, Bmax = [R] + [RL] Si multiplicamos ambos términos por [L] y sustituoimos obtenemos:

[RL] = Bmax ⋅ [L] [L] + K d donde [RL]: ligando unido y [L]: ligando libre. Esta ecuación define el comportamiento de una curva de saturación típica. RL

L

A partir de esta ecuación es posible derivar la ecuación de Scatchard,

[RL] = Bmax − [RL] [L] Kd

[RL]/[L]

tg α= -1/Kd Bmax Bmax

[RL]

29

PARTE PRACTICA

A- Mostración (teórica-práctica): Equipos y metodologías utilizados para un experimento completo de radioligando.

B- Problemas:

1) Dado los siguientes datos de unión de un ligando (FNT) marcado radiactivamente determine Bmax y Kd tanto en presencia (Tratamiento:T) como en ausencia (Control:C) de una droga que se estima modificaría la unión de este ligando por su receptor. Analice las características de la unión específica y de la inespecífica.

[FNT] Libre(nM) Total C Inespecífico Específico Especif/Libre 0,5 221,49 25,33 1 380,26 46,05 2 548,36 64,99 3 727,70 95,56 5 865,13 127,05 7,5 996,59 166,37 10 1164,11 224,81 15 1305,93 315,42 20 1426,31 424,31 ----------------- ----------------- ------------------ ------------------ --------------------------------Total T Inespecífico Específico Especif/Libre 0,5 196,45 36,66 1 294,17 54,39 2 431,14 78,21 3 598,81 104,06 5 733,04 135,52 7,5 835,19 177,86 10 942,00 236,66 15 1064,80 324,88 20 1125,06 396,73

30

2) Analice gráficamente la unión total, inespecífica y específica. ¿Se comportan los datos de acuerdo a lo teóricamente esperado? ¿Qué puede decir del experimento?

[FNT] Libre (nM) 0.5 1 2 3 5 7.5 10 15 20

Total Inespecífico Específico 317.28 229.45 497.01 395.12 720.88 609.02 956.76 819.67 1210.23 1049.96 1502.11 1344.8 1848.38 1641.73 2091.21 1859.81 2277.48 2077.37

3) Idem problema (2). 10 12.5 15 20 25 30 40 50

Total Inespecifico Especifico 386.56 308.37 542.4 390.02 678.03 466.67 917.39 569.17 1249.51 647.33 1547.85 801.91 1896.15 1008.6 2082.76 1181.12

4) A partir de las constantes de disociación calculadas a distintas temperaturas para un experimento con dos muestras diferentes (C y S), realice el gráfico de Van’t Hoff correspondiente y determine ∆Gº de la reacción de unión. (1/ºK).103 Bmax C Bmax S Kd C

Temp ºC Temp ºK

1/ºK

Kd S

4

277

0,0036

3,61

929

1195

2,76

2,66

10

283

0,0035

3,53

1142

1118

3,64

3,27

15

288

0,0034

3,47

1236

1291

4,32

3,76

20

293

0,0034

3,41

1099

1358

4,84

4,67

25

298

0,0033

3,35

1190

1285

6,21

5,62

37

310

0,0032

3,23

1121

1183

11,42 11,00

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA: - H.I. Yamamura et al. “Neurotrasmitter receptor binding”. 1978. Raven Press, New York. -

H.I. Yamamura et al. “Methods in neurotrasmitter receptor analysis”. 1990. Raven Press, New York. 31

-

B.W. O’Malley and L. Birnbaumer. “Receptors and hormone action”, vol 1. (1977). Academic Press, New York.

-

D.L. Nelson and M.M. Cox. “Lehninger, Principles of biochemistry”, 3rd ed. (2000). Worth Publishers, New york.

-

Perillo M.A. y Arce A. Estimation of the binding affinity constant of soluble ligand-protein complexes by a rapid filtration technique. The [3H]fntz-bovine serum albumin system as an example. J.Pharm.Tox.Meth. 35:69-76 (1996)

-

U. Quast, H. Mahlmann and K.O. Vollmer. “Temperature dependence of the benzodiazepinereceptor interaction” Molecular Pharmacology, (1982), 22,20-26.

-

D.A. García, R.H. Marín and M.A. Perillo. “Stress-induced decrement in the plasticity of the physical properties of chick brain membranes” Molecular Membrane Biology, (2002), in press.

32

ANALISIS Y DISCUSIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS

1.

The concept of energy-rich phosphate compounds: water, transport ATPases and entropic energy. L. de Meis [Arch.Biochem.Bioph. (1993) vol. 306, pp 287-296].

Cuestionario guía

1. ¿Cuáles son las nociones principales que caracterizan a los compuestos ricos en energía según el punto de vista clásico (Lipmann, 1941)? 2. ¿Qué relación existe entre la constante de equilibrio de una reacción (Keq) y su energía libre?¿Qué significado energético tiene para una reacción una Keq=1? 3. Describa, según el punto de vista clásico, la secuencia de eventos que tienen lugar durante el proceso de transducción de energía en enzimas tales como ATPasas. 4. ¿Cuál es la secuencia de eventos durante este mismo proceso pero según el nuevo punto de vista (desde los años 70)? 5. Según c/u de estos puntos de vista, ¿en qué momento del proceso se obtiene energía disponible para realizar trabajo? 6. Sabiendo que ∆G°=∆H°-T. ∆S°, ¿cómo es considerada la contribución de la entropía a la energía libre según c/u de los puntos de vista? 7. ¿Cuáles son los efectos intramoleculares que proponía Lipmann para explicar la unión de alta energía en compuestos tales como ATP? 8. Explique la razón por la cual, a partir de los trabajos de George y col. (1970), se le atribuye a la energía de solvatación de reactantes y productos la energía presente en estos compuestos? 9. ¿Qué relación existe entre el cambio conformacional que sufre una enzima del tipo ATPasa y la interconversión de uniones fosfato de alta y baja energía? 10. ¿Por qué las condiciones del medio en donde transcurre la hidrólisis de estos compuestos son fundamentales en cuanto a la energía liberada?¿qué relación tiene con cambios en la entropía? 11. ¿Cómo puede una molécula como la glucosa 6-P regenerar ATP a partir de ADP si su energía de hidrólisis es menor que la del ATP? ATP + glucosa → ADP + glucosa 6-P

(∆G° = - 4,6)

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2.

The Maxwell Demon in Biological Systems Use of glucose 6-phosphate and hexokinase as an ATP regenerating system by the Ca++ ATPase of sarcoplasmic reticulum and submitochondrial particles. L.de Meis, M.Montero-Lomelí, M.A.B.Grieco and A.Galina. Annals of the New York Academy of Sciences 671:19-31 (1992).

Cuestionario guía

1) Cuál es el problema que se analiza en el presente trabajo? 2) Cuál es el mecanismo de acción de las Ca++-ATPasa de retículo sarcoplásmico y H+-ATPase mitocondrial? 3) Para cada una de las figuras 1 a la 5 inclusive explique: a) en qué consiste cada experimento b) los resultados obtenidos 4) Discusión: cuáles son los resultados que avalan la siguiente afirmación que hacen los autores: hexoquinasa y glucosa 6-P pueden ser usadas como sistema regenerador de ATP a pesar del exceso de ADP en el medio y la diferencia entre el ∆Go de hidrólisis de Gu-6-P y de ATP. 5) Cuál sería la posible interpretación de la anterior afirmación. 6) Donde estaría actuando el “demonio de Maxwell”. 7) Existen los demonios? Qué representa en este caso?

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