Procedimiento Operativo Estandarizado N° 6

TOMA DE MUESTRAS DE ANIMALES MUERTOS I. Objetivo Definir y describir los procedimientos para la toma de muestras de animales muertos para el diagnóstico toxicológico. Cada vez que tome muestras, tenga en cuenta las medidas de higiene y profilaxis, descriptas en el POE N°3

II. Procedimientos POE N° 6 A. Consideraciones generales de la toma de muestras

1. Recomendaciones previas

* Antes de tomar cualquier muestra en el sitio de la mortandad, se le debe asignar al incidente una identificación única y preestablecida, que será luego repetida en cada muestra e informe relacionado con el mismo. * Si hubiera animales domésticos involucrados, y no hay en la patrulla un inspector del SENASA, contacte un inspector en forma urgente. Si esto no es posible, proceda a tomar muestras. * Evite el contacto de las muestras con el exterior del cadáver o contaminarlas con fluidos corporales , sustancias del medio ambiente y entre animales muestreados. Limpie cuidadosamente los utensilios entre disecciones de distintos individuos con acetona o alcohol. * Evite la dispersión de deshechos. En lo posible trabaje fuera del área del incidente, sobre un papel, cartón o polietileno. * Utilice elementos no contaminantes para realizar las disecciones. Limpie bien los utensilios entre disecciones. Lávelos o repáselos con toallas de papel y enjuague, preferentemente, con acetona o con alcohol. * Antes de comenzar la disección, lea el POE N° 9. 2. Número de muestras a colectar Para determinaciones químicas, una muestra

adecuada sería no menor a 10 animales muertos. Si esta cantidad se puede superar, mejor, dependiendo de las limitaciones de tiempo y recursos. * Si dispone de tiempo y elementos, proceda al fraccionamiento de las muestras para conservar un duplicado de cada una. Si no dispone de tiempo, ni elementos, ni personal, duplique el número de animales a muestrear y conserve unos como originales y otros como duplicados. * Para órganos pares, tome muestras por duplicado, en lo posible, sin fraccionar. * Para órganos únicos como el cerebro, fraccione sólo por hemisferio completo (es decir, cortando el cerebro en sentido longitudinal y separando cada hemisferio completo). No se deben cortar transversalmente los hemisferios. Si el cerebro se encuentra muy desintegrado proceda a dividir el macerado en fracciones iguales. * El contenido del tracto gastro-intestinal debe ser homogeneizado y luego fraccionado en partes iguales. * Las muestras como lavado de patas (una muestra por cada pata) o pelo/plumas son de fácil fraccionamiento. * Para muestras de sangre, el volumen de cada fracción dependerá del volumen disponible, según el tamaño del animal muestreado. Las muestras pueden fraccionarse en distintos tubos capilares, o en partes iguales en tubos eppendorf o de ensayo si los volúmenes son mayores. POE Nº 10

3. Qué animales muestrear? Prefiera los cadáveres en mejor estado de conservación y completos. * Los cadáveres en putrefacción tienen escaso valor para el diagnóstico histopatológico, pero pueden ser importantes para la detección de residuos. * La muestra ideal es el cadáver completo (sobre todo en especies de tamaño pequeño) y es mejor aún si corresponde a un animal observado con

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sintomatología y luego muerto.

* Si se hallaran huevos en el área del incidente, estos deben ser colectados y conservados refrigerados, en envases irrompibles (frascos plásticos con tapa), acolchados con papel o algodón y etiquetados.

4. Información complementaria:

Las muestras más importantes son:

-cerebro -contenido gastrointestinal -plumas -pelos -lavado o trozado de patas -sangre

* Para detectar biotoxinas y residuos de plaguicidas, son de utilidad las muestras de contenido gastro - intestinal. * Para detectar residuos de plaguicidas e inhibición de enzimas, son fundamentales las muestras de cerebro y sangre. * Para detectar residuos de plaguicidas en el exterior de los animales, se deben colectar plumas o pelos y realizar lavados o trozados de patas. Otras muestras * Para detectar efectos crónicos de sustancias tóxicas (plaguicidas, metales pesados), son de utilidad las muestras de hígado y tejido graso. * Para detectar efectos agudos de sustancias tóxicas, sobre todo metales pesados, son de utilidad las muestras de riñón, aunque suelen ser difíciles de disecar en aves.

5. Consideraciones especiales: * Considerando los costos de los análisis de residuos y enzimas, es importante recordar que inicialmente NO es necesario enviar todas las muestras colectadas al laboratorio. Las más importantes son el cerebro y contenido del tracto gastrointestinal. * Las muestras como lavado/trozado de patas o plumas/pelos, se analizarán cuando: * Se colecten muestras de animales vivos. * Si los cerebros y tractos gastro - intestinales de las aves halladas no están presentes por predación, descomposición, etc. * Si se sospecha la acción de un plaguicida pero no hay evidencias del mismo en cerebro, tracto gastrointestinal. * En casos de intoxicación dérmica, especialmente en casos de plaguicidas organofosforados o carbamatos.

Si los resultados de los análisis fueran dudosos o conflictivos, se podrá recurrir a la muestra duplicado para repetir los análisis de residuos tóxicos en el mismo u otro laboratorio, que será establecido de común acuerdo entre las partes interesadas. 72

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SECUENCIA DE DECISIONES RESPECTO A TOMA DE MUESTRAS SEGUN EL DESTINO DE LOS EXAMENES

CADÁVER Conservación de las muestras H I S T O P A T O L O G I A

Cerebro

Sin veterinario en la patrulla

Tracto gastrointestinal

Refrigerar Congelar Muestra de todos los órganos

Colocar en formol 10%

Necropsia completa Con veterinario en la patrulla

POE N°6 B. Metodología de colecta de muestras

A. Secuencia de toma de muestras:

Nota: deben cambiarse los guantes y limpiar los utensillos apropiadamente entre los distintos pasos de la secuencia de toma de muestras.

1°) Examen externo del animal

· especie, sexo · estado físico · traumatismos, heridas, etc. · presencia de alimento en la boca. Tipo. (*) · presencia de anillos en aves · otra información que estime útil

Trozado/ lavado de patas

Disección

Plumas/pelos del pecho y abdomen

T O X I C O L O G I A

patas minuciosamente intentando recuperar la mayor cantidad de residuos posibles. · De ser posible, corte las patas en trocitos pequeños y consérvelos en otro frasco con etanol, puesto que la absorción de los tóxicos liposolubles al tejido graso plantar es importante y rápida. · Utilice un embudo distinto por cada animal. · Cuando termine con las 10 muestras, colecte en un frasco (50 ml), ETANOL puro (sin usar) extraído del recipiente de origen para destinarlo como muestra PATRÓN. Identifique y rotule este frasco en particular como “muestra patrón”.

2º) Lavado y/o trozado de patas

· Tenga la precaución de no manipular las patas de los animales antes de realizar el lavado de patas. Sostenga al ave de sus alas o cuerpo de tal manera que sus patas “cuelguen”. · Para el lavado, deje caer un chorro de ETANOL (utilizando la piseta) sobre las patas del animal recolectando el líquido del lavado con un embudo en un frasco hermético con tapa a rosca (cantidad: 50ml). · Utilice un hisopo o cepillo y con ellos frote las Manual de Procedimientos Operativos Estandarizados de Campo para Documentar Incidentes de Mortandad de Fauna Silvestre en Agroecosistemas

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3º) Toma de muestras de plumas/ pelos

EN AVES: colecte plumas en no menos cuatro puntos de animal: dorso de cada ala, dorso del cuerpo y ventral del cuerpo EN MAMIFEROS: colecte pelos en no menos cuatro puntos del animal: de miembros anteriores y posteriores, del dorso del cuerpo y del vientre

4º) Disecciones: Realice la disección de los animales hallados muertos siguiendo la metodología descripta en el POE N° 9, Disecciones. NOTA: Si no puede realizar la disección en el campo, se aconseja tomar las muestras externas (plumas- pelos- lavado de patas) en el momento. Luego conservar el cuerpo del animal en una bolsa de nylon y refrigerar. En lo posible NO CONGELE el animal antes de la disección, la que deberá realizarse en el menor tiempo posible. 4.1 Extracción de muestras de cerebro Las cabezas completas, en buen estado de conservación, pueden ser cortadas enteras, conservadas en bolsitas whirl-pack y congeladas en forma inmediata. (Figura 1 y 2 ) Si se dispone de un termo de Nitrógeno líquido, se recomienda disecar el cerebro completo (incluyendo el cerebelo). Se lo debe colocar en criotubos o envolverlo doblemente en papel aluminio, colocando la etiqueta de identificación entre ambas capas de papel para evitar su contacto directo con la muestra. Se recomienda el uso de Parafilm(R) como envoltura primaria de la muestra para que no se pegue al papel aluminio. Para obtener duplicados de estas muestras se recomienda la extracción del doble de muestras sugeridas. Si esto no es posible, el único fraccionamiento aceptable es el corte sagital de ambos hemisferios, conservando uno y otro hemisferio como muestras duplicado. 4.2.Tracto gastro - intestinal (GI) Se considera la muestra clave en casos de intoxicaciones. Quite el tracto GI completo y colóquelo sobre una superficie limpia para su disección detallada. 74

Intente identificar el tipo de contenido del tracto GI y observe señales de teñido o manchado del tracto por las sustancias usadas como cebo. · Si la parte superior del sistema GI está lleno (esófago, estómago), sólo tome éste. Ate con hilo sus extremos para no derramar su contenido. · Si se dispone de numerosos animales para muestrear, concentre sus esfuerzos en aquellos con tractos GI superiores completos (buche, esófago, proventrículo, estómago). La porción posterior del tracto GI (intestinos) son menos valiosos como muestras pero igualmente válidas. · Si todos los tractos GI hallados están vacíos, coléctelos completos: desde el esófago a la cloaca. Ate los extremos con un hilo. · Enfríe y congele las muestras lo más rápido posible. 4.3. Resto del cadáver Coloque dentro de bolsas limpias y conserve congelados para futuros posibles análisis, por ej. la extracción de residuos de las plumas y patas (si estas muestras no se han tomado aún).

B. Registro y conservación de las muestras * Se debe llevar un registro en la libreta de campo de cada muestra tomada, incluyendo el número y código de identificación de la muestra, el sitio de muestreo, la fecha y las iniciales del operador. Esta información servirá de respaldo en el caso en que las etiquetas sobre las muestras se dañen o pierdan. * Cada muestra debe ser guardada por separado en un recipiente específico: bolsitas de nylon sin usar o frascos limpios enjuagados con acetona. De ser posible, coloque un trozo de papel de aluminio entre la tapa y el frasco al cerrar. * Cada muestra debe identificarse en forma individual con etiquetas o con marcador indeleble, conforme a lo detallado en el POE Nº 11, Etiquetado e identificación de muestras. * Las muestras para análisis toxicológicos deben enfriarse lo más rápido posible. Deben conservarse en hielo o hielo seco hasta su llegada a un freezer. * Las muestras para diagnóstico histopatológico deben ser conservadas en formol bufferado al 10%, en envases herméticos, manteniendo una proporción de una parte de muestra en 10 de formol. Si las disecciones no pueden realizarse en el campo, conserve los cadáveres enteros enfriados (NO congelados) hasta su correspondiente tratamiento.

Editoras: MARCELA UHART y MARÍA E. ZACCAGNINI

· Recuerde tomar nota del tiempo (horas) y modo de conservación de las muestras hasta su llegada al freezer. · Por cada animal muestreado debe comple-

tar un Formulario N° 2, Muestras Animales. · El total de muestras correspondientes a un determinado incidente, deberá ir acompañado de su correspondiente Formulario N° 5 de Cadena de Custodia.

C. Materiales necesarios REGISTROS / GENERAL: Indispendable

Optimo

* copias del Formulario N° 2 * Formulario N° 5 "cadena de custodia" * marcador indeleble / criomarcador * cámara de fotos y rollos * libreta de campo * lápiz, portaminas * etiquetas * tabla portaplanillas

*libros de referencia (enfermedades infecciosas y de origen tóxico en animales silvestres, etc.) * cámara de video y cassettes

DISECCIÓN Nota: se aconseja llevar dos kits completos y así tener uno para trabajar mientras el otro se está desinfectando. * tijeras * pinzas * calibre y/o regla * bisturí / hojas de bisturí

* tijera rompe - huesos * balanzas (pesolas) * cuchillo * chaira/piedra de afilar

TOMA DE MUESTRAS * guantes de látex * bolsas de nylon (residuos) * bolsas whirl-pack, bolsas zip-lock * frascos de vidrio/plástico de distintos tamaños * papel aluminio * parafilm * criotubos

* embudos * alcohol/etanol/acetona * piseta para etanol * cinta de papel, etiquetas * algodón, gasa * hilo grueso * rollo de papel/papel de diario * guantes de cuero

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