Timeo danaos et dona ferentes. Hepatitis C: resistencias y tipado. Dr. Josep Quer Responsable Línea de Investigación Básica en Hepatitis C. Malalties Hepàtiques. Vall d'Hebron Institut de Recerca /VHIR). Hospital Universitari Vall d'Hebron (HUVH). Universitat Autònoma de Barcelona. Ciberehd.

Cuando una persona se infecta de nuevo por el VHC desarrolla, en el 80% de los casos, una infección crónica de muy larga duración, que evoluciona lentamente y puede conducir a cirrosis (20% de pacientes a los 20-40 años desde el momento de la infección). Esta cirrosis puede descompensarse, aparecer complicaciones (varices hemorrágicas, encefalopatía hepática, ascitis, hepatocarcinoma) y en este momento, la única solución es el trasplante de hígado. Cualquier tratamiento que pare la progresión del daño hepático es coste-efectiva. A diferencia de lo que ocurre con el virus de la Hepatitis B y el VIH que son infecciones crónicas que nunca se curan, la infección por el virus de la Hepatitis C (VHC) es una infección curable. De hecho, siempre ha sido una infección curable, pero la eficacia de curación virológica (tasa de respuesta virológica sostenida (RVS) definida como mantener el ARN del VHC negativo 12 semanas después de parar el tratamiento, no superaba el 10% con los primeros regímenes (año1991) de Interferón (IFN) y solo llegó al 50% con pegIFN más Ribavirina (Rbv) (14;15;31). Actualmente, con la combinación de Antivirales de Acción Directa (AADs), incluso en tratamientos por vía oral libres de IFN, se consiguen tasas de RVS superiores al 90%. Los actuales AADs aprobados para uso clínico pertenecen a cuatro grupos y actúan bloqueando la actividad de tres proteínas noestructurales cuya función es esencial para la replicación del virus:  NS3, concretamente se inhibe la actividad Serina-proteasa NS3 (PI): Simeprevir. Paritaprevir/ritonavir.  NS5A, es la proteína central de control de la replicación viral y que está involucrada en la formación y liberación de la partícula viral (NS5AI): Ledipasvir, Daclatasvir, Ombitasvir. 1

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NS5B o RNA-polimerasa -RNA dependiente (RpRd), frente a la cual contamos con dos familias de inhibidores, los inhibidores Nuclos(t)ídicos (NI) que bloquean el centro activo de la polimerasa, y los No-Nuclos(t)ídicos (NNI) que actúan sobre un centro alostérico cambiando la estructura tridimensional de la enzima: Sofosbuvir, Dasabuvir.

Los pacientes que desarrollan RVS, experimentan numerosos beneficios en su salud, se reduce de manera significativa el riesgo de sufrir hepatocarcinoma de novo y la muerte debida a daño hepático, mejora la fibrosis, se reduce la inflamación y se consigue una mejora en la calidad de vida del paciente. Las guías de tratamiento recomiendan tratar a todos los pacientes infectados crónicamente y cuanto antes mejor. Por tanto, contamos con un gran arsenal de inhibidores [en 2016 va a aprobarse Grazoprevir (PI), Elbasvir (NS5AI) y Velpatasvir (NS5AI)] , con tasas de RVS superiores al 90-95%. A pesar de estas grandes perspectivas de eliminación del virus, y tal como dice el sacerdote troyano Laoconte a sus conciudadanos cuando reciben el regalo del caballo de Troya: "Timeo danaos et dona ferentes", que significa "Temos a los dánaos (griegos) incluso cuando traen regalos". A pesar de la excelente eficacia de los tratamientos anti-VHC, la enorme carga de la infección por VHC y su naturaleza en quasispecies va a dificultar su erradicación en ausencia de una vacuna. Se estima que en el mundo, entre 160 (2,27%) y 170 millones de personas están crónicamente infectadas por VHC(17;21) de las cuales tan solo el 15% están diagnosticadas. En España, la prevalencia se estima entre 1,2% (472.000) y 2% (1M) de los cuales solo el 35-40% son conscientes de ello. Nos enfrentamos, además, a un virus que posee una enorme capacidad de generar variabilidad. El VHC es una virus de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva de 9.6Kb, que posee una elevada tasa de recambio (vida media (t1/2) estimada ~ 2-5 horas); con una producción y eliminación de 1010 a 1012 viriones por día(9;14;18). Debido a la falta de actividad de lectura y corrección de errores de la RpRd, se estima que tiene una tasa de mutación muy elevada, del orden de 10-3 - 10-4 mutaciones/nucleótido/ciclo de replicación(2). La mayoría de variantes que se producen son eliminadas por el sistema inmune o porque son incapaces de infectar y replicar por pérdida de función de alguna proteína(8;24). No obstante, un número de variantes sobreviven y mantienen la infección crónica. La frecuencia a la cual encontramos cada una de estas variantes en la población de genomas virales, depende de su capacidad de replicación (fitness)(6;29) además de otros factores virales o del hospedador. La consecuencia de la alta variabilidad, es la continua producción de variantes, algunas de ellas con relevancia clínica que puede afectar la patogenia. Esta compleja mezcla de variantes diferentes pero muy parecidas, se le denomina quasispecies (6;11;16;29). La variabilidad entre virus de una quasispecies en un paciente, puede ser del 1 al 10%. 2

El peor escenario se dibuja cuando un paciente falla al tratamiento con AADs. En la mayoría de casos, el fallo terapéutico se produce por recaída "relapse" del virus una vez se para el tratamiento y en menor grado por ruptura "breakthrough" durante el tratamiento. El fallo terapéutico suele ir acompañado de la selección de mutaciones de Resistencia o RAS (Resistance amino acid-associated substitutions) frente al inhibidor usado y que en muchos casos esta mutación puede tener resistencia cruzada frente a otros inhibidores de la misma familia, por ejemplo la mutación Y93H (Tirosina (Y) en posición 93 de NS5A que cambia a Histidina (H)) da resistencia al VHC frente a Daclatasvir, Ledipasvir y Ombitasvir, y esto va a dificultar el retratamiento de estos pacientes. La mejor manera de evitar la emergencia de estas variantes resistentes es eliminar el virus con el primer tratamiento. Para ello es esencial diseñar el régimen de tratamiento más efectivo para cada paciente "medicina de precisión", y para ello es esencial aportar a la práctica clínica datos objetivos predictivos de RVS. Los factores asociados con fallo terapéutico dependientes del paciente son: grado de fibrosis, fallo a tratamiento previo, adherencia al tratamiento, fallo de restauración de la Respuesta Inmune, interacción de los AADs con medicamentos que esté tomando el paciente, otras comorbilidades, etc.... Respecto al virus: fallo en el subtipado, infección mixta, presencia de mutaciones de resistencia, mayor fitness viral, diferente potencia de los inhibidores en el sentido de barrera genética (número de cambios de nucleótidos necesarios para generar resistencia o menor sensibilidad) a la resistencia. Una de las consecuencias de esta gran capacidad que tiene el VHC de generar variabilidad, es que el VHC se clasifica en siete genotipos (GT1-7), que difieren en un 30-35% a nivel de nucleótidos. Dentro de cada genotipo, el VHC se clasifica en subtipos (1a, 1b, 1c, etc.) con cerca del 20-25% en la divergencia entre subtipos dentro del mismo genotipo(28). La clasificación del virus en subtipos, ha adquirido gran relevancia en el momento en que se ha demostrado que todos los tratamientos basados en el uso combinado de AADs es Subtipo-dependiente. En general el subtipo 1a tiene peor respuesta virológica que el 1b(12;20;25;26) lo cual condiciona la necesidad de combinar con Ribavirina en los 1a y más larga duración para conseguir RVS similares a los 1b(19). Respecto a otros subtipos, los datos de estudios recientes sugieren que el subtipo va a condicionar la eficacia de los tratamientos con AAD. Por ejemplo, el inhibidor de NS5A Ledipasvir (Gilead) tiene una menor potencia frente a subtipo 6e comparado con 6a, o 4d comparado con 4a. También se ha observado menor eficacia de Simeprevir, Asunaprevir o Sofosbuvir en 2b comparado con 2a(25) entre muchos otros ejemplos. Una razón no negligible de fallos terapéuticos incluye un tratamiento inadecuado debido a un error en el método de subtipado (4) que puede llegar a ser de hasta el 16% usando los métodos comerciales de genotipado actuales (22). Es este sentido, en un estudio de tratamiento de pacientes no-cirróticos G4 12semanas con Viekirax 3

(Ombitasvir-Paritaprevir/ritonavir de Abbvie), mostró que en el subgrupo tratado sin Ribavirina, los 3 pacientes que fallaron al tratamiento (2 relapse y 1 breakthrough) eran de subtipo 4d y en todos los casos se seleccionaron RAS a NS3 (D168V) y NS5A (L28S or L28V)(10). Otro estudio en pacientes G4 tratados 12w con Harvoni (Ledipasvir+Sofosbuvir de Gilead) dos de los tres subtipos 4r fallaron al tratamiento(1). En otro estudio de pacientes retratados 12w con Harvoni+Rbv en que se incluyeron 51 pacientes G1 con fallo previo a pegIFN+RBV+SOF o SOF+RBV todos de curaron excepto uno que al reanalizarlo resultó estar infectado por G3s (30) sugiriendo que o bien el paciente no fue correctamente clasificado y era G3a y por tanto no debería haber entrado en el estudio dirigido a G1, o bien que el paciente tenía una infección mixta G1+G3a no detectada por las técnicas de baja resolución, en este caso Harvoni+Rbv pudo haber eliminado G1 pero no G3a, que es hoy por hoy el subtipo de más difícil tratamiento con los actuales AADs. Algunos subtipos presentan RAS de manera natural, como p.e. G1g que lleva T54S resistente a Telaprevir, Boceprevir y Narlaprevir (5); S122R de resistencia moderada a Simeprevir está presente en todos los aislados G2, o D168Q asociada a elevada resistencia a Simeprevir está presente en todos los pacientes infectados por G3. En muchos casos esto no afecta la eficacia del tratamiento combinado, por tanto, no solo la mutación, sino también a la estructura del centro sobre el cual actuará la droga será un terreno a estudiar (25). Un dato que debe considerarse, es que el VHC puede recombinar, de manera que el nuevo virus en mitad 5' sea de un subtipo (p.e. 2k) y en cambio en la parte no estructural (NS) 3' sea de otro subtipo (1b)(13). Cabe destacar, que los tratamientos van dirigidos a proteínas de la parte NS, por tanto el subtipado o bien se realiza secuenciando el genoma entero(3), o si no es posible en la región NS (p.e. NS5B) (22). En resumen, un correcto subtipado que a su vez permita detectar infecciones mixtas va a permitir ajustar mejor los tratamientos a las necesidades de cada paciente y esto supone un ahorro en el aspecto social y económico del tratamiento de la Infección por VHC contemplado en el Plan Estratégico de la Hepatitis C del MINECO. Además, el fallo terapéutico lleva consigo la selección de mutaciones de resistencia. Ningún tratamiento antiviral está libre de fracasos debido a las resistencias de tipo RAS, incluyendo las terapias triples con o sin Ribavirina, utilizando inhibidores de cualquier industria farmacéutica y su determinación es importante para decidir que tratamiento de rescate poder ofrecer al paciente. No obstante, se ha observado que existe un número importante de pacientes en que a pesar de mantener el ARN negativo del VHC al final del tratamiento, pasadas unas semanas se produce una reactivación, es decir reaparece el virus y no se detectan mutaciones específicas de resistencia. Una posible explicación, es que o bien han desparecido las RAS en el momento del estudio, que la respuesta 4

inmune no se ha recuperado, o bien debido a la fitness viral (capacidad de replicación). Recientemente se ha demostrado, que un virus con alta fitness puede ser resistente a diferentes AADs incluso a Sofosbuvir en ausencia de mutaciones de tipo RAS(7;27). Conocer este valor antes de iniciar un tratamiento es un dato que puede ser de gran utilidad para personalizar el tipo y duración de este. La metodología que permite obtener toda esta información referente al virus (subtipado, infecciones mixtas, presencia de RAS y complejidad de la quasispecies) es la secuenciación masiva en paralelo. El Vall d’Hebron Institut de Recerca (VHIR) del Hospital Universitario Vall d’Hebron (HUVH) (23) ha desarrollado una metodología basada en la plataforma 454/GS-Junior. Consiste en la secuenciación de miles de viriones de VHC circulantes en suero/plasma de un paciente con infección crónica. Estos genomas (secuencias) se comparan con unos patrones de referencia y por filogenia molecular se clasifican en subtipos. Al estudiar miles de genomas, permite detectar si el paciente está infectado por más de un subtipo a la vez (infección mixta) así como estudiar si los genoma presentan mutaciones de resistencia a AADs. En la actualidad, está metodología ha sido transferida a un laboratorio de Diagnóstico Clínico (Laboratorio de Patología hepática- HUVH) y da servicio a todo el Sistema de Salud de Catalunya. En 2016, se va producir un recambio tecnológico, y la plataforma GS-Junior va a ser sustituida por la plataforma de Secuenciación de Molécula de ADN Única en Tiempo Real (SMRT™, single-molecule real time sequencing) que se basa en una tecnología de secuenciación por síntesis basada en la obtención de imágenes de fluorescencia en tiempo real. La tecnología SMRT se construye sobre una óptica de recogida avanzada denominada guía de onda “modo cero” (ZMWs, zero-mode waveguides), se basa en una estructura de confinamiento de nanofotones que consiste en una cavidad circular recubierta de una película de aluminio sobre un sustrato de sílice de ~70nm de diámetro y ~100nm de profundidad. La secuenciación se realiza sobre un chip (SMRT Cell) que contiene hasta 1M de celdas ZMW. Dentro de cada una de ellas se encuentran fijas una ADN polimerasa activa y una molécula de ADN molde de cadena sencilla circular. A medida que se incorpora un nucleótido marcados por su grupo fosfato (cada nt está marcado con un fluorocromo diferente) durante el proceso de secuenciación a la cadena de ADN, se libera el complejo fluoróforo-fosfato y se detecta más un pulso de luz fluorescente. La óptica ZMW permite que la luz penetre e ilumine solo el fondo del pocillo, de forma que se crea un espacio de visualización que permite monitorizar la actividad de la ADN polimerasa. El volumen de cavidad observable dentro de una ZMW iluminada es de 20-30nm, que permite un volumen de ~20zeptolitros (10-21 litros). 5

La SMRT-NNGS permite secuenciar fragmentos desde 300 a 20.000 nucleótidos y por tanto permite secuenciar genoma viral entero, solucionando zonas ricas en GC, largas inserciones y delecciones, reduciendo los costes de secuenciación. Esta tecnología permite aumentar la eficiencia de secuenciación y ensamblaje de fragmentos y permite la detección directa (sin reacciones previas) de modificaciones epigenéticas (metilación) mediante la medida de la variación en la cinética de incorporación de bases (registra películas de 30-240minutos en tiempo real).

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