T.C. ANADOLU ÜN‹VERS‹TES‹ YAYINI NO: 2067 AÇIKÖ⁄RET‹M FAKÜLTES‹ YAYINI NO: 1101

TIBB‹ LABORATUVAR UYGULAMALARI (UYGULAMA K‹TABI)

Yazarlar Prof.Dr. Ahmet ÖZATA (Ünite 1) Arfl.Gör.Dr. Volkan KILIÇ (Ünite 1, 3) Arfl.Gör.Dr. Gözde Aydo¤an KILIÇ (Ünite 1, 3) Prof.Dr. K›ymet GÜVEN (Ünite 2) Yrd.Doç.Dr. Mehmet Burçin MUTLU (Ünite 2) Arfl.Gör.Dr. Meral YILMAZ (Ünite 2) Prof.Dr. A.Yavuz KILIÇ (Ünite 4) Arfl.Gör. Hülya ALTUNTAfi (Ünite 4)

Editör Yrd.Doç.Dr. Mehmet Burçin MUTLU

ANADOLU ÜN‹VERS‹TES‹

Bu kitab›n bas›m, yay›m ve sat›fl haklar› Anadolu Üniversitesine aittir. “Uzaktan Ö¤retim” tekni¤ine uygun olarak haz›rlanan bu kitab›n bütün haklar› sakl›d›r. ‹lgili kurulufltan izin almadan kitab›n tümü ya da bölümleri mekanik, elektronik, fotokopi, manyetik kay›t veya baflka flekillerde ço¤alt›lamaz, bas›lamaz ve da¤›t›lamaz. Copyright © 2010 by Anadolu University All rights reserved No part of this book may be reproduced or stored in a retrieval system, or transmitted in any form or by any means mechanical, electronic, photocopy, magnetic, tape or otherwise, without permission in writing from the University.

UZAKTAN Ö⁄RET‹M TASARIM B‹R‹M‹ Genel Koordinatör Prof.Dr. Levend K›l›ç Genel Koordinatör Yard›mc›s› Doç.Dr. Müjgan Bozkaya Ö¤retim Tasar›mc›lar› Yrd.Doç.Dr. Alper Tolga Kumtepe Arfl.Gör.Dr. Öznur Öztürk Grafik Tasar›m Yönetmenleri Prof. Tevfik Fikret Uçar Ö¤r.Gör. Cemalettin Y›ld›z Ö¤r.Gör. Nilgün Salur Dil Yaz›m Dan›flman› Okt. Ayd›n F›nd›ko¤lu Grafiker Yasin Karakoç Kitap Koordinasyon Birimi Yrd.Doç.Dr. Feyyaz Bodur Uzm. Nermin Özgür Kapak Düzeni Prof. Tevfik Fikret Uçar Dizgi Aç›kö¤retim Fakültesi Dizgi Ekibi T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›) ISBN 978-975-06-0750-9 ???. Bask› Bu kitap ANADOLU ÜN‹VERS‹TES‹ Web-Ofset Tesislerinde ...... adet bas›lm›flt›r. ESK‹fiEH‹R, ........ 2011

iii

‹çindekiler

‹çindekiler Önsöz ...........................................................................................................

vii

Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar›... ....................

1

KARAC‹⁄ER FONKS‹YON TESTLER‹ ......................................................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: B‹L‹RUB‹N M‹KTAR TAY‹N‹..................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: TOTAL KOLESTEROL M‹KTAR TAY‹N‹... BÖBREK FONKS‹YON TESTLER‹ ............................................................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: KREAT‹N‹N M‹KTAR TAY‹N‹ ................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: ‹DRAR ANAL‹ZLER‹................................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: KAN GRUBU TAY‹N‹ .............................. ABO Kan Gruplar› ve Kal›t›m› .................................................................... Kaynaklar .......................................................................................................

3 4 6 7 8 10 13 13 16

Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›................... 18 Uygulama 1.................................................................................................... Deney Tüpü ............................................................................................ Santrifüj Tüpü.......................................................................................... Durham Tüpü.......................................................................................... Balon Joje (Volümetrik Balon, Dereceli Balon).................................... Erlenmayerler .......................................................................................... Beherler ................................................................................................... fiifleler....................................................................................................... Petri Kutular› ........................................................................................... Mezür (Dereceli Silindir) ........................................................................ Pipetler..................................................................................................... Baget ........................................................................................................ Cam huni ................................................................................................. Lam........................................................................................................... Rodajl› Lam .............................................................................................. Lamel........................................................................................................ Büret ........................................................................................................ Ay›rma Hunisi.......................................................................................... Desikatör.................................................................................................. fiale........................................................................................................... Di¤er Malzemeler .......................................................................................... Sporlar...................................................................................................... Süzgeç Ka¤›d› ......................................................................................... Flask ......................................................................................................... Cryotüp .................................................................................................... Puar .......................................................................................................... Mavi ve Sar› Tip ...................................................................................... Spatül ....................................................................................................... Bal›k (Manyetik Bar)............................................................................... Çelik Küvet .............................................................................................. Pens.......................................................................................................... Bistüri....................................................................................................... Diseksiyon ‹¤nesi ....................................................................................

19 19 19 20 20 20 20 20 21 21 21 23 23 23 23 23 23 23 23 23 24 24 24 24 24 24 24 25 25 25 25 25 25

1. ÜN‹TE

2. ÜN‹TE

iv

‹çindekiler

Otoklav Band› ......................................................................................... Cam kalemi.............................................................................................. Laboratuvar Çalar Saati ........................................................................... Pipetlik ..................................................................................................... Piset.......................................................................................................... Ekim Aletleri .................................................................................................. Öze........................................................................................................... Eküvyon................................................................................................... Drigalski Spatülü ..................................................................................... Sterilizasyon Aletleri...................................................................................... Otoklav .................................................................................................... Pasteur F›r›n›............................................................................................ Filtreler..................................................................................................... Su Banyosu (Ben Mari)........................................................................... UV Lambalar›........................................................................................... Di¤er Aletler .................................................................................................. Etüvler ............................................................................................................ Santrifüjler...................................................................................................... Spektrofotometreler....................................................................................... pH metreler ................................................................................................... Derin Dondurucu .......................................................................................... Teraziler ......................................................................................................... Manyetik Kar›flt›r›c› ve Is›t›c›lar .................................................................... Çalkalamal› Tabla .......................................................................................... Vortex............................................................................................................. Steril Kabin .................................................................................................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: M‹KROORGAN‹ZMALARDA ÇO⁄ALMANIN KONTROLÜ ......................................................................... S›cakl›k ‹le Sterilizasyon ............................................................................... Kuru Is› ‹le Sterilizasyon............................................................................... Nemli Is› ‹le Sterilizasyon ............................................................................. Dezenfeksiyon......................................................................................... Tindalizasyon........................................................................................... Pastörizasyon ........................................................................................... Kimyasal Maddeler ‹le Sterilizasyon ........................................................... Fenol ve Fenol Türevleri ........................................................................ Klor .......................................................................................................... Kuaterner Amonyum Bileflikleri ............................................................. Hipokloritler ............................................................................................ Alkoller .................................................................................................... Formaldehit.............................................................................................. A¤›r Metaller ............................................................................................ Peroksitler ................................................................................................ Boyalar..................................................................................................... Fiziksel Ajanlar ‹le Dezenfeksiyon......................................................... Antisepsis ................................................................................................. Filtrasyon ‹le Sterilizasyon ............................................................................ Radyasyon ‹le Sterilizasyon .......................................................................... ‹yonize Olmayan Radyasyon.................................................................. ‹yonize Radyasyon ..................................................................................

25 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 27 27 28 28 28 28 28 29 29 30 30 31 31 31 31 32 32 33 35 36 36 36 36 36 37 37 37 37 37 37 37 37 37 38 39 39 39

‹çindekiler

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: CANLI BAKTER‹ PREPARATLARININ ‹NCELENMES‹ VE M‹RRORGAN‹ZMALARIN M‹KROSKOB‹K ÖLÇÜMÜ............................................................................. Uygulama 1: As›l› Damla Yöntemi............................................................... Uygulama 2: Yafl Preparasyon Yöntem ....................................................... Mikroorganizmalar›n Mikroskobik Ölçümü................................................. Uygulama ...................................................................................................... Mikroorganizmalar›n Boyutlar›n›n Ölçülmesi........................................ LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: M‹KROORGAN‹ZMALARIN KÜLTÜR ED‹LMES‹ ...................................................................................... Uygulama 1: Besiyeri Haz›rlanmas› ............................................................. Saf Kültür Eldesi ve Mikroorganizma ‹nokülasyon (Ekim) Teknikleri ...... Uygulama 1: S›v› Besi Yerine ‹nokülasyon ................................................. Uygulama 2: Çizgi Ekim ‹le Saf Kültür Elde Eldesi ................................... Uygulama 3: Yayma Plak Ekim Yöntemi .................................................... Uygulama 4: Dökme Plak Yöntemi ............................................................. LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: ANAEROB‹K BAKTER‹LER‹N KÜLTÜR ED‹LMES‹ ....................................................................................... Uygulama: GasPak Sistemi ‹le Anaerobik Kültür Gelifltirme...................... LEBORATUVAR ÇALIfiMASI 6: BAKTER‹LER‹N BOYANMASI VE M‹KROSKOB‹K ‹NCELEME..................................................................... Uygulama 1: Mikroskobik Preparat Haz›rlama ve Basit Boyama .............. Uygulama 2: Gram Boyama ........................................................................ Uygulama 3: Spor Boyama .......................................................................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 7: BAZI METALLER‹N VE K‹MYASAL MADDELER‹N ANT‹M‹KROB‹YAL ETK‹S‹ ‹LE ANT‹B‹YOT‹K DUYARLILIK TESTLER‹........................................................ Uygulama 1: Oligodinamik Etki ................................................................... Uygulama 2: Baz› Kimyasal Maddelerin Antimikrobiyal Etkisi .................. Uygulama 3: Antibiyotik Duyarl›l›k Testleri (Kirby-Bauer Testi) ............... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 8: LAM AGLUT‹NASYON TEST‹.................. Uygulama 1: Aglutinasyon reaksiyonu ........................................................ Amaç: Lam üzerinde aglutinasyon reaksiyonunu göstermek. .................. LABORATUVAR ÇALIfiMASI 9: BAZI FUNGUSLARIN KÜLTÜR ED‹LMES‹ VE MORFOLOJ‹K ‹NCELENMES‹................................................ Uygulama 1: Küfler ....................................................................................... Uygulama 2: Mayalar .................................................................................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 10: OTOMAT‹ZE B‹YOK‹MYASAL BAKTER‹YAL TANI TESTLER‹ (API 20E, V‹TEK)........................................ API Kitleri ile Mikroorganizma ‹dentifikasyonu .......................................... Genel Bilgiler .......................................................................................... Uygulamalar : .......................................................................................... Uygulama 1: API CHL ile ‹dentifikasyon ..................................................... Uygulama 2: Mikroorganizmalar›n VITEK Sistem ile Tan›s› ve Karakterizasyonu ........................................................................................... Uygulama 3: PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Polymerase Chain Reaction - PCR) ile Belirli Bir Gen Bölgesinin Ço¤alt›lmas› ........... Yararlan›lan ve Baflvurulabilecek Kaynaklar ...............................................

40 40 41 42 42 42 43 43 45 46 48 49 49 50 52 52 53 55 57

58 59 60 61 63 63 63 64 64 66 66 66 66 66 69 73 77 79

v

vi

‹çindekiler

3. ÜN‹TE

Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar›............ 80 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: .................................................................... M‹KROSKOP PARÇALARININ TANITIMI VE KULLANIMI.......................... Ifl›k Mikroskobunun K›s›mlar› ...................................................................... Gövde K›sm› (Mekanik K›s›m) ............................................................... Optik K›s›mlar ......................................................................................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: PREPARAT HAZIRLAMA ........................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: EP‹TEL DOKU ........................................... Örtü Epiteli .................................................................................................... LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: BA⁄ VE DESTEK DOKU .......................... Gevflek Ba¤ Doku ......................................................................................... S›k› Ba¤ Doku ............................................................................................... Ya¤ Doku ..................................................................................................... K›k›rdak Doku .............................................................................................. Kemik Doku ................................................................................................. LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: KAS DOKU ................................................ Düz Kas ......................................................................................................... Çizgili Kas (‹skelet Kas›)............................................................................... Kalp Kas›........................................................................................................ Yararlan›lan Kaynaklar..................................................................................

4. ÜN‹TE

81 81 81 81 82 83 86 87 89 89 90 90 91 91 92 93 93 93 95

T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›......................... 96 LAB. I. PARAZ‹TOLOJ‹ LABORATUVARINDA DIfiKI ÖRNEKLER‹N‹N ‹NCELENMES‹NDE KULLANILAN YÖNTEMLER ......................................... LAB II. S‹ND‹R‹M S‹STEM‹NDE YERLEfiEN PROTOZOON PARAZ‹T ÖRNEKLER‹N‹N ‹NCELENMES‹.................................................... LAB.III. KAN DOKU VE ÜROGEN‹TAL S‹STEM‹NDE YERLEfiEN PROTOZOON PARAZ‹T ÖRNEKLER‹N ‹NCELENMES‹ .............................. LAB IV. TIBB‹ ÖNEM‹ OLAN HELM‹NT PARAZ‹TLER‹N ‹NCELENMES‹ .. LAB V. TIBB‹ ÖNEM‹ OLAN PARAZ‹T‹K ARTHROPODLARIN ‹NCELENMES‹ ................................................................................................ Yararlan›lan ve Baflvurulabilecek Kaynaklar ...............................................

97 99 105 110 117 119

Sözlük ................................................................................... 121

Önsöz

Önsöz Sa¤l›k kurum ve kurulufllar›n›n laboratuvarlar›nda görev alacak nitelikli laboratuvar teknikerlerinin yetifltirilmesini amaçlayan “T›bbi Laboratuvar Teknikleri Önlisans Program›” kapsam›ndaki “T›bbi Laboratuvar Uygulamalar›” dersi için haz›rlanan bu kitap, laboratuvar çal›flmas›na kat›lacak ö¤renciler için temel bir kaynak durumundad›r. Kitap genel olarak Histoloji ve Embriyoloji, Biyokimya, Mikrobiyoloji ve Parazitoloji olmak üzere 4 farkl› bölümden oluflmaktad›r. Her bölüm içerisinde ö¤rencilerin bilmesi ve ö¤renmesi gereken temel uygulamalara yer verilmeye çal›fl›lm›flt›r. Kitap uygulama a¤›rl›kl› olarak haz›rlanm›fl ve üniversitemiz laboratuvarlar›ndaki imkanlar dahilinde yap›labilecek deneyler olmas›na özen gösterilmifltir. Uygulamalar›n olabildi¤i kadar güncel olmas›na ayr›ca dikkat edilmifltir. Yazarlar›n k›sa sürede büyük çabalarla ortaya ç›kard›klar› bu kitab›n bas›ma haz›rlanmas›nda eme¤i geçen herkese teflekkür eder, tüm ö¤rencilerimize baflar›lar dileriz.

Editör Yrd.Doç.Dr. Mehmet Burçin MUTLU

vii

TIBB‹ LABORATUVAR UYGULAMALARI (UYGULAMA K‹TABI)

1

Amaçlar›m›z

N N N N

Bu üniteyi tamamlad›ktan sonra; Karaci¤er fonksiyon bozukluklar›n›n hangi testlerle belirlenebilece¤ini aç›klayabilecek, Böbrek fonksiyon bozukluklar›n› belirleyebilmek için temel basit testleri gerçeklefltirebilecek, ‹drar›n fiziksel, kimyasal ve mikroskobik özelliklerini incelemek için gerekli testleri uygulayabilecek, Kan grubu tayinini temelini kavrayarak kan grubu tespiti yapabileceksiniz.

Anahtar Kavramlar • • • •

Bilirubin Kolesterol Kreatin ‹drar

• Karaci¤er • Böbrek • Kan

‹çerik Haritas›

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar›

• KARAC‹⁄ER FONKS‹YON TESTLER‹ • LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: B‹L‹RUB‹N M‹KTAR TAY‹N‹ • BÖBREK FONKS‹YON TESTLER‹ • LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: TOTAL KOLESTEROL M‹KTAR TAY‹N‹ • LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: KREAT‹N‹N M‹KTAR TAY‹N‹ • LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: ‹DRAR ANAL‹ZLER‹ • KAN GRUBU TAY‹N‹

Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar› KARAC‹⁄ER FONKS‹YON TESTLER‹ Karaci¤erin bafll›ca görevleri: • Safra ve safra tuzlar›yla birlikte, sindirime yard›mc› olur. • Besinlerden al›nan ya¤larla birlikte, ya¤da eriyen vitaminlerin emilmesini kolaylaflt›r›r. • Kan›n p›ht›laflmas› için gereken, protrombin, fibrinojen ve heparin gibi maddeleri üretir. • Vücuttaki toksinlerle birlikte zararl› maddeleri atar. • Protein, lipit ve karbonhidrat sentezini yapar. • Protein, ya¤, karbonhidrat, mineral ve vitaminleri gerekti¤inde kullan›lmak üzere • Kan flekerini ayarlar. • Baz› hormonlar›n yap›s›nda yer alan kolesterolü üretir. • Pek çok reaksiyonun gerçekleflmesinde görev alan enzimleri yapar. • Suyla birlikte pek çok maddeyi tafl›yan albumin’i üretir. Karaci¤er yukar›daki görevlerini yerine getiremezse, çeflitli hastal›klar ortaya ç›kar. Bu hastal›klar›n en önemlileri; • Karaci¤er yetmezli¤i (Hepatik koma) • Siroz • Safra kesesi iltihaplar› ve tafllar› • Kanser Karaci¤er hastal›klar›, en iyi flekilde ‘Karaci¤er Fonksiyon Testleri’ ile anlafl›l›r. Biyokimyasal testlerden olan Karaci¤er Fonksiyon Testlerinin bafll›calar› flunlard›r: Karbonhidrat metabolizmas› ile ilgili testler Glukojenez, glukojenoliz, glukoneojenez gibi olaylar ile glukoz d›fl›ndaki heksozlar›n glukoza dönüfltürülmesi karaci¤erde gerçekleflir. Bu gruptaki testler, çeflitli flekerlere karfl› tolerans üzerine dayan›rlar. a. Glukoz tolerans testi: Diabet hastal›¤›n›n teflhisi için uygulanmaktad›r b. Galaktoz tolerans testi: Karaci¤er hücre hasar›n›n tesbiti için uygulanmaktad›r. c. Epinefrine karfl› tolerans testi: Karaci¤erin glikojeni depo etme kapasitesini ölçmek amac›yla uygulanmaktad›r Lipid metabolizmas› ile ilgili testler Lipoproteinler ve fosfolipid, kolesterol, trigliserit gibi lipid elemanlar› karaci¤erde sentezlenir. Kolesterol esterleflmesi ve kolesterol’ün safra asitlerine y›k›m› karaci¤erde gerçekleflir. Toplam kolesterol, ester kolesterol, fosfolipid seviyeleri ölçülür.

4

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Protein metabolizmas› ile ilgili testler Protein sentez ve y›k›mlar›nda karaci¤erin önemli rolü vard›r. Karaci¤er hastal›klar›nda albümin seviyeleri azal›r (hipoalbuminemi), kronik karaci¤er hastalar›nda ise globülin düzeyi artar (hiperglobulinemi). Detoksifikasyon ile ilgili testler Endojen ve eksojen baz› toksik maddeler ve boya maddeleri karaci¤erde faz I ve faz II reaksiyonlar› ile biyotransformasyona u¤rat›l›r. Karaci¤er detoksifikasyon bozukluklar› hippürik asit testi, bromosülfoftalein testi ve rose bengal testi gibi testlerle belirlenir. Bilirubin metabolizmas› ile ilgili testler Karaci¤erin al›n›m, at›l›m ve konjugasyon reaksiyonlar› ile ilgili testlerdir. Bilirubin kanda direkt ve indirekt olmak üzere iki flekilde bulunur. Hepatoselüler sar›l›klarda herikiside artar. T›kanma sar›l›klar›nda ise direkt bilirubin artar. Serumda bilirubin düzeyi tayini, idrarda bilirubin ve bilirubin y›k›l›m ürünü olan ürobilinojen tayini bu testlerden baz›lar›d›r. Serum enzimlerinin tayini ile ilgili testler Karaci¤er hastal›klar›nda meydana gelen doku harabiyetinin bir sonucu olarak a盤a ç›kan baz› enzimlerin aktivite tayinleri ile ilgili testlerdir. • Alkalen fosfataz (ALP): T›kanma ve hepatoselüler sar›l›klarda art›fl gösterir.. • Alanin amino transferaz (ALAT) ve Aspartat amino transferaz (ASAT): Enfeksiyöz hepatitlerde ve toksik hepatitlerde yükselir. • Laktat Dehidrogenaz (LDH): Hepatit ve sirozda artar. • Lösin amino peptidaz (LAP) ve 5’ Nükleotidaz: Hepatik t›kanmalarda art›fl gösterir. • Gama-glutamil transferaz (GGT): Viral hepatitin saptanmas›nda ölçülür. Kronik alkoliklerde art›fl gösterir. • Kolinesteraz Hepatoselüler hastal›klarda aktivitesi azal›r. Not: Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar›’nda karaci¤er fonksiyon testlerinden ‘Bilirubin Miktar Tayini’ ve ‘Total Kolesterol Miktar Tayini’ testleri uygulanacakt›r.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: B‹L‹RUB‹N M‹KTAR TAY‹N‹ Kan dolafl›m›nda bulunan k›rm›z› kan hücreleri yaklafl›k 120 günlük bir süre sonunda ömürlerini tamamlar ve ço¤unlu¤u dalakta olmak üzere parçalan›rlar. A盤a ç›kan bilirubin karaci¤ere götürülür. Karaci¤er özel bir ifllemle bilirubini suda çözünebilen bir hale getirir ve safra yoluyla ba¤›rsa¤a atar. Karaci¤erde bu iflleme maruz kalm›fl bilirubine direk, henüz ifllem görmemifl bilirubine ise indirek bilirubin denilir. Bu sistemin herhangi bir noktas›nda meydana gelebilecek bir aksama kan bilirubin düzeyinin yükselmesine neden olur. Bu aksamalar; k›rm›z› kan hücrelerinde afl›r› y›k›m, karaci¤er hastal›klar› ve safra yolu t›kan›kl›klar›d›r. Sonuçta kan bilirubin seviyesi yükselecek ve koyu sar› ten rengiyle tipik sar›l›k ortaya ç›kacakt›r. UYGULAMA: Van Den Bergh Metodu Amaç: Karaci¤er fonksiyon bozukluklar›n› belirleyebilmek amac›yla kan serumundaki bilirubin miktar›n› ölçmek Prensip: Serum veya plazma üzerine diazo reaktifi ilave edildi¤inde serum veya plazmada bulunan bilirubin diazo ile reaksiyona girer ve mor renkte azobilirubin denilen bir bileflik meydana gelir.

1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar›

D‹REKT Distile su

TOTAL

1.Tüp

2. Tüp

4 ml

2 ml

3. Tüp

4. Tüp

4 ml

2 ml

Metil Alkol %6 HCl

0.8 ml

0.8 ml

Diazo reaktifi

0.4 ml

Serum Dilüsyonu

3.2 ml

0.4 ml

1.6 ml

3.2 ml

1.6 ml

Materyal: Cam deney tüpü, 1ml lik cam pipeti, puar, tüplük, metil alkol, %6 HCl, diazo reaktifi, kurutma ka¤›d›, spektrofotometre, spektrofotometre küvetleri Uygulanacak ‹fllem: 1. 4 adet deney tüpü 1’den -4 e kadar numaraland›r›l›r. 2. Daha sonra her bir tüpe afla¤›daki tablodaki gibi kimyasal maddeler eklenir. 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

32.7

31.3

30.7

30.2

29.0

27.0

26.0

25.2

24.4

23.7

20

22.9

22.2

21.8

21.5

20.9

19.8

19.2

18.7

18.2

17.7

30

17.2

16.8

16.6

16.3

15.8

15.4

15.0

14.5

14.2

13.8

40

13.0

12.7

12.5

12.3

12.0

11.6

11.3

11.0

10.7

10.4

50

9.8

9.5

9.4

9.3

9.0

8.8

8.6

8.3

8.0

7.8

60

7.3

7.1

6.9

6.8

6.6

6.4

6.2

5.9

5.7

5.5

70

5.1

4.9

4.8

4.7

4.5

4.3

4.1

3.9

3.7

3.5

80

3.1

3.0

2.9

2.8

2.7

2.5

2.3

2.2

2.0

1.8

90

1.5

1.3

1.2

1.2

1.0

0.9

0.7

0.6

0.4

0.3

3. 1. tüp 2. tüp için kör, 3. tüp ise 4. tüp için kördür. 4. Tüm kimyasal maddeler eklendikten sonra her tüp kar›flt›r›l›r. 5. Tüpler kar›flt›r›ld›ktan 5. dakika sonra 2. tüp spektrofotometrede 560 nm de okutulur. 6. Tüpler kar›flt›r›ld›ktan 10 dakika sonra 4. tüp spektrofotometrede 560 nm okutulur. 7. Daha sonra afla¤›daki bilirubin kalibrasyon grafi¤inden de¤erlendirilir. Total Bilirubin-Direkt Bilirubin = ‹ndirekt Bilirubin Normal de¤erler

Total Bilirubin Direkt Bilirubin ‹ndirekt Bilirubin

: 0.1 mg/dl : 0-0.4 mg/dl : 0.1-0.5 mg/dl

Gözlem ve Sonuçlar • Spektrofotometreden elde etti¤iniz verileri bilirubin kalibrasyon grafi¤inde de¤erlendirerek Total bilirubin, Direkt bilirubin ve ‹ndirekt bilirubin miktarlar›n› hesaplay›n›z. Tart›flma • Elde etti¤iniz sonuçlar›n normal de¤erler aras›nda olup olmad›¤›n› kontrol ediniz. Bilirubin de¤erlerinin normal de¤erlerde olmamas› vücudumuzdaki hangi bölgelerin tahribat›ndan kaynaklanmaktad›r? Tart›fl›n›z.

5

6

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: TOTAL KOLESTEROL M‹KTAR TAY‹N‹ Klinik bak›mdan plazma veya serumda total kolesterol ve kolesterol esterlerinin miktar› plazma veya serum total lipid miktar› hakk›nda yeterli bilgi vermektedir. Kanda kolesterol ve lipid miktarlar› karaci¤er fonksiyonlar› ve koroner hastal›klar hakk›nda bilgi vermektedir. Serumda kolesterol miktar› %140-250 mg aras›ndad›r. Afl›r› ya¤l› g›dalar beslenen insanlarda, hamile bayanlarda, fleker hastal›¤›nda, karaci¤er t›kanmalar›nda karbonhidrat eksikli¤ine ba¤l› açl›kta ve nefrozda, kandaki lipid ve kolesterol miktar› artmaktad›r. Afl›r› derecedeki anemilerde, hipertriodizm, hepatit ve sirozda ise kolesterol ve buna ba¤l› olarak lipid miktar› azalmaktad›r. Erkeklerdeki total kan kolesterol miktar› kad›nlardakinden daha yüksektir. Kolesterol miktar›n›n çok fazlas› olmas›, ileri yafllarda arteriosklererozise (damar sertli¤i) neden olmaktad›r. UYGULAMA: Lefter Metodu Amaç: Kan serumunda bulunan toplam kolesterol düzeyini belirlemek. Prensip: ‹zopropil alkolün serum veya plazma ile muamelesi sonucu çöktürülen kolesterolün ferrik klorit ve sülfirik asit ile mor renk vermesi esas›na dayan›r. Materyal: ‹zopropil alkol, konsantre sülfirik asit, ferrik klorit, kolesterol çal›flma standart›, serum, deney tüpü, spektrofotometre küveti, spektrofotometre, santrifüj tüpü, santrifüj, mikropipet ve ucu. Uygulanacak ‹fllem: 1. Kapakl› santrifüj tüpüne 0.1 ml serum ve 4.9 ml izopropil alkol konur. Tüpün a¤z› kapat›larak iyice çalkalan›r ve 10 dakika beklemeye b›rak›l›r. 2. Bekletilen tüp 3000 devirde 5 dakika santrifüj edilir. 3. Test, standart ve kör tüpü olmak üzere 3 adet tüp haz›rlan›r. 4. Test tüpüne 1 ml santrifüj tüpündeki s›v›dan konur. Standart tüpüne 1 ml çal›flma standart çözeltisinden konur. Kör tüpüne ise 1 ml izopropil alkol konur. 5. Daha sonra her üç tüpe de pipet yard›m›yla 2 ml ferrik klorit ilave edilerek kar›flt›r›l›r. 6. Bu tüplere yine pipet yard›m›yla 2 ml konsantre sülfirik asit tabaka oluflturacak flekilde ilave edilir. 7. Bu tüpler iyice kar›flt›r›ld›ktan sonra 10 dakika bekletilir. 8. Kör tüp ile spektrofotometre s›f›ra ayarlan›r ve 450 nm de test tüpünün ve standart tüpünün optik dansiteleri okunur. Hesaplama: Total Kolesterol =

Test Tüpünün Optik Dansitesi Standart Tüpünün Optik Dansitesi

* 200 mg (% mg)

Gözlem ve Sonuçlar: • Elde etti¤iniz optik dansite sonuçlar›n› kullanarak total kolesterol miktar›n› hesaplay›n›z? Tart›flma: • Buldu¤unuz de¤eri normal insanlarda olmas› gereken de¤erlerle karfl›laflt›r›n›z ve yorumlay›n›z? • Serum kolesterol miktar›ndaki art›fl veya azalma vücuttaki hangi de¤iflikliklerin belirtisidir?

1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar›

BÖBREK FONKS‹YON TESTLER‹ Böbrekler organizmada homeostaz’›n sa¤lanmas›nda önemli rol oynar. Böbre¤in en küçük fonksiyonel ünitesi ‘nefron’ dur. Nefronlar glomerüller ve tübülüslerden meydana gelir. Glomerüller, kapiller yuma¤› ve Bowman kapsülünden oluflur. Böbre¤in önemli fonksiyonlar› flunlard›r. • Zararl› maddeleri vücuttan atmak • Vücutta su hacmini ayarlamak • ‹yon dengesini düzenlemek • Plazman›n ozmotik dengesini düzenlemek • Kan bas›nc›n› düzenlemek • Asit-baz dengesini düzenlemek Böbrek fonksiyon testlerini 3 grupta toplamak mümkündür Böbrekte kan ak›m›n› ölçen testler Glomerül ve tübülüslerdeki dolafl›m› ölçmek için kullan›lacak olan maddenin hem glomerülden süzülmesi, hemde tübülüslerden uzaklaflt›r›lmas› gerekmektedir. Diodrast, para amino hippürik asit, fenolsülfonftalein böbrek kan ak›m›n› ölçmek için kullan›lan maddelerden baz›lar›d›r. Glomerül filtrasyonunu ölçen testler Bu testler ‘Klerens testleri’ ad› alt›nda toplanmaktad›r. Bir maddenin klerensi, plazman›n o maddeden ar›nma h›z›d›r. Bir maddenin glomerül filtrasyonunu ölçmek amac›yla kullan›labilmesi için, o maddenin idrara sadece glomerül filtrasyonu ile geçmesi, tübülüslerden at›lmamas›, reabsorbe edilmemesi, vücutta kullan›lmamas› ve plazma proteinlerine ba¤lanmamas› gerekmektedir. Bu flartlar› tafl›yan üre, kreatinin, inülin gibi maddeler hemen hemen tamamen glomerüllerden süzülür ve çok az reabsorbe edilir. Tübülüs fonksiyonunu ölçen testler Böbreklerin idrar› yo¤unlaflt›rma veya suland›rma kabiliyetlerini ölçmeye yarayan testlerdir. ‹drarda bulunan maddelerin miktar› ve bununla ilgili olarak idrar›n de¤iflen yo¤unlu¤u, böbrek tübülüslerinin reabsorbsiyon ve salg›lama özelliklerine ba¤l›d›r. Bu nedenle su testleri genellikle tübüler fonksiyonu ölçmek amac› ile uygulanan testlerdir. a. Yo¤unlaflt›rma testleri: Hastay› belirli bir süre susuz b›rakarak, böbre¤in suyu ne derece absorbe etti¤i ölçülür.Yani, bir sudan yoksun b›rak›l›fl zaman›ndan sonra idrar›n özgül a¤›rl›¤›n›n tayini, böbrek fonksiyonunun önemli bir göstergesidir. b. Suland›rma testleri: Bu testlerde hastaya su içirildikten sonra belli zaman aral›klar› ile idrar toplanarak hacmi ve özgül a¤›rl›¤› ölçülür. c. Tübülüsün d›fla at›l›fl testleri: Tübülüsün vücuda d›flar›dan al›nan yabanc› maddeleri salg›lama gücünü ölçen testlerdir. Vücuda d›flar›dan verilen baz› boyalar›n d›fla at›l›fl h›z› ölçülür. Not: Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar›’nda böbrek fonksiyon testlerinden ‘Kreatinin Miktar Tayini’ testi uygulanacakt›r.

7

8

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: KREAT‹N‹N M‹KTAR TAY‹N‹ Böbrekler retroperitoneal bölgede bulunan her biri yaklafl›k 120-150 gram a¤›rl›¤›nda olan organlard›r. Her iki böbrekte yaklafl›k 2.000.000 nefron vard›r ve bir nefron temel olarak glomerül ve tübül olmak üzere iki k›s›mdan oluflur. Nefronda, glomerüler filtrasyon, tübüler reabsorpsiyon (geri emilim) ve tübüler sekresyon (salg›lama) sonucu idrar oluflur. Böbre¤in idrar oluflumu d›fl›nda da birçok fonksiyonu vard›r. Böbrek yetmezli¤inde, böbre¤in bu temel fonksiyonlar›nda bozulmalar olur ve de¤iflik adaptif sistemler devreye girer. Böbrek yetmezli¤i akut veya kronik olabilir. Böbrek yetmezli¤inin derecesinin belirlenmesinde kullan›lan en objektif parametre glomerüler filtrasyon de¤erinin (GFD) ölçülmesidir. Glomerül filtrasyon bozuklu¤unu belirlemek amac›yla uygulanan testler “Klerens testleri” ad› alt›nda toplanm›flt›r. Klerens, temizleme ar›nma anlam›ndad›r. Bir maddenin klerensinin ölçülmesi denincede plazman›n o maddeden ar›nma h›z›n›n ölçülmesi anlafl›l›r. Bir maddenin glomerül filtrasyonunu ölçmesi için ideal flartlar o maddenin idrara sadece glomerül filtrasyonu ile geçmesi, tübülüslerden at›lmamas› veya reabsorbe edilmemesi, vücutta kullan›lmamas›, plazma proteinlerine ba¤lanmamas› ve ekstraselüler s›v›da eflit da¤›lmas›d›r. Bu flartlar› karfl›layabilen üre, kreatinin, inülin hemen hemen tamamen glomerüllerden süzülür ve çok az reabsorbe edilir. Kreatinin kas metabolizmas›n›n sonucunda kreatinden oluflur, ve yap›m oran› kas kitlesiyle yak›ndan ilgilidir. Kanda normal kreatinin düzeylerinde bu metabolit glomerulusda süzülür. Fakat tübülüs taraf›ndan ne salg›lan›r ne de reabsorbe edilir. Bu nedenle kreatinin klerensi özellikle glomerül filtrasyonunun durumu hakk›nda bilgi verir. Kreatinin klerensi yani 1 dakikada kreatininden ar›nan plazma miktar›, 1 dakikada glomerülden süzülen süzüntü miktar›na denktir. UYGULAMA: Jaffe Metodu Amaç: Glomerül filtrasyon düzeyini ve böbrek fonksiyon bozukluklar›n› belirleyebilmek için kan serumundaki kreatinin miktar›n› ölçmek. Prensip: Kreatinin’in alkali ortamda pikrik asit ile turuncu k›rm›z› renk vermesidir (Jaffe Reaksiyonu) Materyal: 10 ml distile su, 8 ml %2 lik pikrik asit solüsyonu, 3 ml 2.5 N NaOH, 4 adet uzun cam tüp,1 adet tüplük, 5 adet 2 ml’lik cam pipet, 1 adet kurutma ka¤›d›. Uygulanacak ‹fllem: 1. Bir deney tüpüne serum numune süzüntüsü haz›rlan›r. Bunun için 1 ml serum 3 ml %2 lik pikrik asit solüsyonu ile kar›flt›r›l›r. Serum 1 ml %2 lik Pikrik asit solüsyonu 3 ml 2. Haz›rlanan serum numune tüpü 1000 rpm de 5 dakika santrifüj edilir. Serum numune süzüntüsü elde edilmifl olur. 3. Baflka bir tüpteyse idrar dilüsyonu haz›rlan›r. Bunun için 0.5 ml idrar, 4.5 ml distile su ile kar›flt›r›l›r. 4. Spektrofotometrede ölçülecek örnekler afla¤›daki flekilde haz›rlan›r.

1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar›

Numune Tüpü (Serum)

Kör Tüpü

Numune Tüpü (‹drar)

Distile su

0.5 ml

-

-

Serum numune süzüntüsü

-

2 ml

-

‹drar Dilüsyonu

-

-

0.5 ml

Pikrik asit olüsyonu

1.5 ml

-

1.5 ml

2.5 N NaOH

0.2 ml

0.2 ml

0.2 ml

5. Haz›rlanan örnekler kar›flt›r›l›r ve 20 dakika bekletilir. 6. Daha sonra spektrofotometrede 520 nm de kör tüpüne karfli di¤er tüpler okunur. 7. Elde edilen sonuçlar kalibrasyon grafi¤inden de¤erlendirilir. Hesaplama: Kreatinin klerens testinde kan ve (24 saatlik) idrarda kreatinin tayinleri yap›larak klerens için afla¤›daki formül uygulan›r. CKr = Kreatinin klerens (ml/dak) P = Kandaki kreatinin miktar› (mg/dl)

U = ‹drarda kreatinin miktar› (mg/dl) V = Dakikadaki idrar hacmi

CKr = U/P x V Kreatinin klerensinin normal de¤eri 95-105 ml / dk d›r. Not: ‹drar de¤eri idrar numunesinin kalibrasyon grafi¤inden elde edilen de¤erin 10 ile çarp›lmas›yla verilir. Kreatinin kalibrasyon grafi¤i: 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

7.4

7.2

7.0

6.9

6.8

6.7

6.6

6.5

6.4

6.3

20

6.2

6.1

6.0

5.8

5.6

5.5

5.3

5.2

4.9

4.8

30

4.6

4.5

4.4

4.3

4.1

4.0

3.9

3.8

3.7

3.6

40

3.5

3.4

3.3

3.3

3.2

3.1

3.0

2.9

2.8

2.7

50

2.6

2.5

2.4

2.3

2.1

2.0

1.9

1.8

1.7

1.6

60

1.5

1.4

1.3

1.2

1.1

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

70

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

Gözlem ve Sonuçlar: • Spektrofotometrede yapt›¤›n›z ölçümlerde elde etti¤iniz OD de¤erlerini transmittansa çeviriniz. Buldu¤unuz transmittans de¤erlerinin kalibrasyon grafi¤inden karfl›l›klar›n› bularak kreatinin klerensini hesaplay›n›z. Tart›flma: • Kreatinin klerensi ne amaçla hesaplan›r? • Elde edilen bulgular bize vücudumuzun hangi bölgesiyle ilgili bilgiler verir?

9

10

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: ‹DRAR ANAL‹ZLER‹

‹drar böbrekler taraf›ndan vücuttan seçilerek süzülen ve çok say›da maddeyi içeren s›v› at›k maddedir. ‹drar genellikle iki amaçla incelenir. ‹lki böbrek hastal›klar› hakk›nda bilgi edinmek di¤eriyse böbrekten kaynaklanan kimyasal madde ve metabolitlerin incelenmesidir. ‹drarda mevcut maddeler belirli s›n›rlar dahilinde bulunur. Bu s›n›rlar farkl› g›dalar›n al›nmas›yla ve di¤er faktörlere ba¤l› olarak de¤ifliklik göstermektedir. ‹drar› incelerken onun fiziksel özelliklerine, kimyasal özelliklerine ve mikroskobik özelliklerine bak›l›r. Fiziksel özelliklerinde idrar›n miktar›na, kokusuna, rengine, yo¤unlu¤una ve pH reaksiyonuna bak›l›r. ‹drar›n kimyasal özelliklerinde fleker, protein, bilirubin, ürobilinojen, keton cisimleri, kan gibi maddelerin olup olmamas›na bak›l›r. Ayr›ca idrar mikroskobik olarak incelenir. Burada hastal›kl› idrarlarda organik ve organik olmayan maddelerin varl›¤›n›n belirlenmesi klinik aç›dan önemlidir. Bir çok hastal›¤›n teflhisi idrar›n mikroskobik olarak incelenmesiyle gerçekleflir. UYGULAMA 1: ‹drar›n Fiziksel Özelliklerinin Belirlenmesi Hacim (miktar): Analizi yap›lacak idrar›n hacmidir. ‹drar miktar› besinle al›nan s›v› miktar›na, metabolizma durumuna, ter ve solunum havas› ile kaybedilen s›v› miktar›na, dolafl›m ve böbreklerin durumuna göre de¤ifliklik gösterir. ‹drar miktar› günlük 1200-1500 ml’dir. ‹drar miktar› normalin üzerinde olursa Poliüri (2500 ml üstü)denir. ‹drar miktar›n›n normalden az olmas›na Oligoüri (750 ml alt›) denir.Günlük idrar miktar›n›n 100 ml’nin alt›na düflmesineyse Anüri denir. Koku: Normal idrar›n aromatik kokusu vard›r. Bu kokuyu idrar›n içindeki fenoller verir. Bozulan idrarda amonyok oluflmas› nedeniyle amonyak kokusu oluflur. Görünüm: ‹drar›n berrak veya bulan›kl›¤›n›n belirlenmesidir. Renk: Normal idrar›n rengi aç›k sar› ile koyu sar› aras›nda de¤iflmektedir. Bu rengi idrarda bulunan ürokrom pigmenti verir. ‹drar›n rengi hastal›klarda de¤iflir. fieker hastal›¤›nda aç›k sar›,böbrek ve idrar yollar› hastal›klar›nda kan bulaflmas› nedeniyle k›rm›z›, bilirubin bulundu¤unda sar›, yeflil veya yeflilimsi kahverengi olmaktad›r. ‹drar renginin belirlenmesidir. pH Reaksiyonu: Normal olarak idrar›n pH’s› 4.8-7.5 aras›ndad›r. ‹drar›n pH’s›n› turnusol ka¤›d› veya pH test ka¤›d› ile belirlenebilir. Amaç: ‹drar›n fiziksel özelliklerini gözlemlemek ve elde edilen veriler sonucunda idrar›n al›nd›¤› kiflinin sa¤l›kl› olup olmad›¤›n› belirlemek. Materyal: Mezür, beher, pastör pipeti, pH ka¤›d›. Uygulanacak ‹fllem: 1. Al›nan idrar örne¤inin mezür ile hacmi ölçülür. 2. ‹drar›n görünümüne, kokusuna ve rengine bak›l›r. 3. ‹drar›n pH ka¤›d› ile pH’› ölçülür. Gözlem ve Sonuçlar: • Uygulamada kulland›¤›n›z idrar›n fiziksel özelliklerini not ediniz. Tart›flma: • Normal idrar özelliklerini tafl›y›p tafl›mad›¤›n› belirtiniz ve e¤er tafl›m›yorsa sa¤l›k aç›s›ndan ne gibi bozukluklar olabilir tart›fl›n›z.

1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar›

UYGULAMA 2: ‹drar›n Kimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi Amaç: ‹drarda fleker, albumin, ürobilinojen ve bilirubinin bulunup bulunmad›¤›n› belirlemek. Materyal: Deney tüpleri, benedict ay›rac›, %20’lik TCA, Ehrlich ay›rac›, iyot ay›rac›, pastör pipeti, cam pipet. Uygulanacak ‹fllem: 1. fieker Aranmas›: Normal idrarda fleker bulunmaz. ‹drarda fleker aranmas› en çok fleker hastal›¤›nda uygulanmaktad›r. 1. Bir deney tüpüne 5 ml Benedict ay›rac› ve 0.5 ml idrar koyunuz ve kar›flt›r›n›z. 2. Bunsen beki alevi üzerinde 1-2 dakika kaynat›n›z, so¤utunuz. Tüpte gözledikleriniz nelerdir? 2. Albumin (protein) Aranmas›: Normal idrarda protein çok az miktarda bulunur. ‹drarda protein bulunmas› özellikle böbrek hastal›klar› için ön bilgi verir. 1. Bir deney tüpünün 2/3 ne kadar idrar koyunuz. 2. Üzerine birkaç damla %20 lik TCA damlat›n›z, bu s›rada tüpü gözlemleyiniz. 3. Ürobilinojen Aranmas›: Normal idrarda ürobilinojen bulunmaz. Karaci¤er hastal›klar›nda ve yetersizliklerinde, safra yolu t›kan›klar›nda idrarda görülür. Bu olaya Ürobilinojenüri ad› verilir. 1. Bir deney tüpüne 5 ml idrar koyunuz. 2. Üzerine 1 ml Ehrlich ay›rac› kat›n›z ve kar›flt›r›n›z. 3. 5 dakika sonra tüpte gözlemledikleriniz nelerdir? 4. Bilirubin Aranmas›: Ölü ve yafll› eritrositlerin hemoglobin yap›lar› bozulur ve hem halkas› aç›larak bilirubin oluflur. Normalde idrarda bulunmaz. Ancak öd yollar›n›n tafl veya ur nedeniyle t›kanmas›, karaci¤erin vital hepatitlerinde, zehirlenmelerde ve sirozda kanda bulunan bilirubin idrara geçer. ‹drarda bilirubin bulunmas›na Bilirubinüri denir. 1. Bir deney tüpünün 1/3 üne kadar idrar koyunuz. 2. Bir pipetle tüpün iç k›sm›na iyot ay›rac› katarak tabakaland›r›n›z. 3. Tüpte gözledikleriniz nelerdir? Gözlem ve Sonuçlar: • ‹drar›n kimyasal özelliklerini belirlerken tüplerde meydana gelen de¤iflimleri not ediniz. Tart›flma: • Normal bir insan›n idrar›nda fleker, albumin, ürobilinojen ve bilirubinin olmas› gereken de¤erleri nelerdir? Elde etti¤iniz de¤erlerle karfl›laflt›r›n›z. • Anormal de¤erler tesbit edilmiflse idrar sahibinin sa¤l›k durumu hakk›nda neler söyleyebilirsiniz? Tart›fl›n›z.

11

12

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

UYGULAMA 3: ‹drar›n Mikroskobik ‹ncelenmesi Amaç: ‹drarda ‹norganik sedimentler (tirozin, lösin, sistin ve ürikasit kristali), Organik sedimentler (a. Silindirler, b. Hücreler, c. Mikroorganizmalar) ve Yabanc› Cisimlerin (ya¤ taneleri, saç, tüy ve yün lifleri) olup olmad›¤›n› belirlemek. Materyal: Ependorf tüp, santrifüj, lam ve lamel, mikroskop Uygulanacak ‹fllem: 1. Bir Ependorf tüpüne 2 ml idrar koyunuz ve tüpü 1500-2000 devirde 2-3 dakika santrifüj ediniz. 2. Oluflan peletten lam üzerinde preparat haz›rlay›n›z. Mikroskop alt›nda flekilleri inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar: • Mikroskopta gözlemledi¤iniz flekilleri çiziniz ve isimlendiriniz. Tart›flma: • ‹drarda gözlemlenen flekillerin nedeni nedir? Her bir flekil için tart›fl›n›z. fiekil 1.1

Epitel hücreleri

Hiyalen silindir

Tiple fosfat/Kalsiyum okzala

Eritrositler

Granül silindir

Sistin kristali

Lökositler

Mum silindir

Lözin/tirozin kristali

Maya hücreleri/Tricomonas

Lökosit silindir

Kolesterol kristali

Eritrosit Silindir

Ürik asit kristali

1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar›

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: KAN GRUBU TAY‹N‹ Kan grubu tayini antijen-antikor tepkimelerine ba¤l› olarak gerçeklefltirilmektedir. Bu nedenle kan grubu tayininin temelini kavrayabilmek için antijen ve antikor tan›mlar› iyi bilinmelidir. Antijen (aglütinojen): Antijenler, vücuda girdiklerinde ba¤›fl›kl›k sistemini uyararak kendisine karfl› bir ba¤›fl›kl›k yan›t›n oluflmas›na neden olan yabanc› madde ve mikroorganizmalard›r. Genellikle protein ve polisakkarit yap›s›nda canl› organizma k›s›mlar› ya da büyük moleküllü proteinler ile bunlara ba¤lanm›fl karbonhidratlar, nükleik ve lipidik yap›lard›r. Antikor (aglütinin): Çok hücreli hayvansal organizmalar›n ba¤›fl›kl›k sistemi taraf›ndan, kendi organizmalar›na ait olmayan organik yap›lara karfl› gelifltirilen glikoprotein yap›l› moleküllerdir (immunoglobulin). Kendilerinin oluflmas›nda etkili olan antijenlerle özgül olarak birleflebilirler. Organizmaya d›flar›dan giren yabanc› moleküllerin neden olabilece¤i zarar verici etkilere karfl› erken bir savunma oluflturarak koruyuculuk sa¤larlar. IgG, IgM, IgA, IgD, IgE gibi çeflitleri vard›r.

ABO Kan Gruplar› ve Kal›t›m› Kan gruplar›n›n varl›¤› ilk kez 1901 y›l›nda Karl Landsteiner adl› araflt›rmac› taraf›ndan ortaya koyulmufltur. Farkl› kan gruplar›ndaki insanlar›n kanlar› biribirine kar›flt›r›ld›¤›nda, baz›lar›nda kümelenme (çökelme, aglütinasyon) meydana gelirken, baz›lar›nda çökelme görülmemektedir. Bu kümelenmeye alyuvarlarda bulunan farkl› proteinler (antijen, aglütinojen) ile kan plazmas›nda bulunan çökelticiler (antikor, aglütinin) neden olmaktad›r. • Alyuvarlar›nda A antijeni bulunduran kifliler A kan grubuna sahiptir. • Alyuvarlar›nda B antijeni bulunduran kifliler B kan grubuna sahiptir. • Alyuvarlar›nda hem A antijeni hemde B antijeni bulunduran kifliler AB kan grubuna sahiptir. • Alyuvarlar›nda antijen bulundurmayan kifliler O kan grubuna sahiptir Bu kan gruplar›na sahip olan kiflilerin kan plazmas›nda baflka bir kan›n alyuvarlar›n› çökelten antikorlar bulunur. • A kan grubuna sahip kifliler anti-B antikoru üretebilirler. • B kan grubuna sahip kifliler anti-A antikoru üretebilirler • AB kan grubuna sahip kifliler anti-A ve anti-B antikorlar›ndan hiçbirini üretemezler. • O kan grubuna sahip kifliler anti-A ve anti-B antikorlar›n›n herikisini birden üretebilirler. A ve B antijenleri alyuvarlar›n hücre zarlar›nda yer alan glikoprotein çeflitlerindendir. Anti-A ve anti-B antikorlar› ise, kan serumunda do¤al olarak bulunan ve ilgili antijen vücuda girsin veya girmesin yaflam›n çok erken evrelerinde akyuvarlar taraf›ndan oluflturulan moleküllerdir. Yani ABO kan gruplar› ile ilgili antikorlar›n di¤er antikorlardan fark›, antijenlerle temas etmese bile kanda az miktarda bulunmalar›d›r. Bir kifli hiçbir zaman mikrobik bir hastal›¤a tutulmad›kça ya da afl›lanmad›kça o hastal›¤›n antikoruna sahip olamaz. Ancak A kan gruplu bir kifliye B kan grubundan kan verilmese bile kan›nda anti-B antikoruna sahiptir. Afla¤›daki tabloyu (Tablo 1.1) inceleyiniz.

13

14

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Tablo 1.1 Kan Gruplar› ve Özellikleri Kan Alyuvarlar›ndaki Plazmas›ndaki Kan verebildi¤i grubu antikor gruplar antijen

Kan alabildi¤i gruplar

Anti-A antikoru Anti-b antikoru durumu

ile çökelme durumu

ile çökelme

A

A antijeni

Anti-B antikoru

A, AB

A, O

Çökelme var

Çökelme yok

B

B antijeni

Anti-A antikoru

B, AB

B, O

Çökelme yok

Çökelme var

AB

A ve B antijeni

Antikor yok

Yaln›z kendi grubu

Bütün gruplar (Genel al›c›)

Çökelme var

Çökelme var

O

Antijen yok

Hem anti-B hemde anti A antikoru var

Bütün gruplar (Genelverici)

Yaln›z kendi grubu

Çökelme yok

Çökelme yok

Gruplar aras› kan al›fl-verifli, d›flar›dan verilen kandaki antijenik yap›ya karfl›, al›c›n›n kan›nda anikor oluflturulmas› esas›na dayan›r. Vericinin kan›nda antijenik yap› bulunuyorsa ve al›c›da da bu antijenik yap›ya karfl› antikor üretilebiliyorsa çökelme meydana gelecektir. Ancak vericinin kan›nda, al›c›da antikor oluflumuna neden olacak bir antijenik yap› bulunmuyorsa çökelme meydana gelmez. Bu durumda vericide al›c›n›n kan›nda bulunan antijenlerle çökelme oluflturabilecek bir antikor bulunsa dahi, bu çökelme k›smi bir çökelme (yar› çökelme) olacak ve tam çökelme gerçekleflmedi¤i için hayati bir risk oluflturmayacakt›r. Örne¤in, A kan gruplu bir kiflide A antijeni bulunmaktad›r. O kan gruplu bir kiflide ise antijenik yap› bulunmaz. Ancak O kan gruplu kifli hem anti-A hem de anti-B antikorlar›n› bulundurmaktad›r. O kan grubunda antijenik yap› bulunmad›¤›ndan A kan grubundaki bir kifliye verildi¤inde herhangi bir antikor oluflumuna neden olmaz. O kan grubunda az miktarda anti-A antikoru do¤al olarak bulunmaktad›r. Ancak bu antikor A kan grubunda bulunan A antijeni ile birleflse dahi, çok az bir çökelme (yar› çökelme) meydana gelecek ve hayati bir risk oluflturmayacakt›r. Bu nedenle, A kan gruplu kifli kendi grubunun yan› s›ra O kan grubundan da kan alabilir. Buna ra¤men, kan gruplar› aras›ndaki en uygun kan al›fl-verifli, her bireyin kendi grubuyla yapt›¤› al›fl-verifltir. Buna ideal kan al›fl-verifli denir. ‹deal olmayan gruplar aras›ndaki kan nakillerinde yar› çökelme veya tam çökelme olmaktad›r. Yandaki flekilde (fiekil 1.2) fiekil 1.2 gruplar aras› kan al›fl-veO Gruplar Aras› Kan rifli gösterilmektedir. NorGenel Verici Al›fl-Verifli mal çizgi ile gösterilen okO larla yap›lan nakillerde hiç çökelme meydana gelA A B B mez. Kesik çizgi ile gösterilen oklarla yap›lan nakillerde ise yar› çökelme meyAB dana gelir. Genel Al›c›

AB

1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar›

Rhesus (Rh) Faktörü ABO kan gruplar›n›n oluflmas›n› sa¤layan antijenlere ek olarak baz› kiflilerin alyuvarlar›nda fazladan antijenlerin bulundu¤u gözlenmifltir. Bu antijenler ilk kez Rhesus macacus ad›ndaki bir maymunun kan›nda tespit edilmifl ve ‘Rh antijeni’olarak adland›r›lm›flt›r. Bir kiflinin alyuvarlar›nda Rh antijeni varsa Rh(+) yoksa Rh-‘tir. Rh(–) kan grubuna sahip kiflilerin kan plazmas›nda Rh antijenini çökelten anti-D antikorlar› bulunmaz. Ancak Rh antijeni ile biraraya geldi¤inde anti-D antikoru oluflur. Bu nedenle Rh(–) kan grubuna sahip bir birey Rh(+) kan grubuna sahib bir bireyden kan alamazken bu kifliye kan verebilir.

Kan Uyuflmazl›¤› Annenin kan grubu Rh(–), bebe¤in kan grubu Rh(+) uldu¤u durumlarda kan uyuflmazl›¤› ortaya ç›kabilir. Hamilelik s›ras›nda plasentada meydana gelebilecek bir hasar sonucunda embriyonun kan› annenin kan›na geçer. Annenin kan›na geçen Rh antijenlerine karfl› anti-D antikoru oluflur. Bu antikorlar plasenta yolu ile bebe¤e geçer ve bebe¤in alyuvarlar›n›n çökelmesine neden olur. Bebekte meydana gelen bu hastal›¤a ‘Eritroblastosis fetalis’ denir. Bu olay düflü¤e ya da ölü do¤umlara neden olabilir. Bu durumu engellemek için gebelere 28. haftada anti-D i¤nesi yap›lmal›d›r. Do¤umdan sonra bebe¤in kan grubu pozitif ise ilk 72 saat içinde yeniden anti-D uygulanmal›d›r. UYGULAMA 1: Kan Grubu Tayini Amaç: Kan, grubu tayinini gerçeklefltirmek. Materyal: Lam lanset, pamuk, %70’lik etil alkol, kürdan, anti-A antibadi solüsyonu, anti-B antibadi solüsyonu ve anti-D antibadi solüsyonu. Uygulanacak ‹fllem: 1. Bir adet temiz lam haz›rlay›n›z. 2. Cam kalemi kullanarak lam› 3 bölgeye ay›racak flekilde çiziniz. Bu bölmeleri A, B ve C olarak iflaretleyiniz. 3. Lam›n A yaz›lan bölümüne bir damla anti-A serumu, B yaz›lan bölümüne bir damla anti-B serumu C yazan bölümüne ise bir damla anti-D serumu damlat›n›z. 4. Sol elinizin orta parma¤›n› uç k›sm›na do¤ru birkaç kez s›vazlayarak kan›n parmak ucunda toplanmas›n› sa¤lad›ktan sonra %70’lik etil alkol damlat›lm›fl pamuk ile parma¤›n›z› siliniz. 5. Parma¤›n›z›n ucunu tek kullan›ml›k steril lanset ile h›zl›ca deliniz. 6. Parma¤›n›z› deldikten sonra 1’ er damla kan› s›rayla anti-A, anti-B ve anti-D serumlar›n›n üzerine damlat›n›z. 7. Her damla için ayr› kürdan kullanrak anti-A, anti-B ve anti-D serumlar›n› kan damlalar› ile kar›flt›r›n›z. Sonra lamlar› hafifçe öne ve arkaya do¤ru hareket ettirerek sallay›n›z. 8. Birkaç saniye içinde aglütinasyon oluflup oluflmad›¤›na makroskopik ve mikroskopik olarak bak›n›z.

15

16

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

fiekil 1.3 Kan Gruplar›na Göre Çökelme (Aglütinasyon) Durumlar›

Kan Grubu

Damlat›lan Serum Anti-A

AB, Rh(+)

A, Rh(+)

B, Rh(–)

O, Rh(–)

Anti-B

Anti-D

• E¤er sadece anti-A ile aglütinasyon varsa, kan grubu A d›r. • E¤er sadece anti-B ile aglütinasyon varsa, kan grubu B dir. • E¤er hem anti-A hem anti-B ile aglütinasyon varsa, kan grubu AB dir. • E¤er gerek anti-A gerek anti-B ile aglütinasyon yoksa, kan grubu 0 d›r. • E¤er anti-D ile aglütinasyon varsa kan grubu Rh(+)’ dir. (Bkz. fiekil 1.3)

Kaynaklar Yöntem, M., Pratik Biyokimya, 2006, Bizim Büro Bas›mevi, ISBN 975-8201-61-1, sayfa 335. Aktümsek, A., Nurullaho¤lu, Z.Ü., 1996, Pratik Biyokimya, Mimoza Yay›nlar› Sa¤l›k Dizisi, ISBN 975-543-042-3, sayfa 171. Uslu, S. Biyokimya Dersi Laboratuvar Çal›flmalar› (Ders notlar›) Osmangazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi.

TIBB‹ LABORATUVAR UYGULAMALARI (UYGULAMA K‹TABI)

2 Amaçlar›m›z

N N N N N N N

Bu üniteyi tamamlad›ktan sonra; Mikrobiyoloji laboratuvar›nda kullan›lan malzeme ve araçlar› listeleyebilecek, Mikroorganizmalarda ço¤alman›n kontrolü için kullan›lan yöntemleri aç›klayabilecek, Canl› bakteri preparatlar›n›n incelenmesini gerçeklefltirebilecek ve mikroorganizmalar›n mikroskobik ölçümünü hesaplayabilecek, Besiyeri ve dilüsyon haz›rlama, ekim tekniklerini (kültür transfer, saf kültür, çizgi, yayma, damla ekimler) gerçeklefltirebilecek, Bakterilerin boyanmalar› ve mikroskobik incelenmelerini uygulayabilecek, Maya ve miselli funguslar›n kültür edilmesi ve mikroskobik incelenmelerini gerçeklefltirebilecek, Otomatize biyokimyasal bakteriyal tan› testlerini (API 20e, VITEK, PZR) aç›klayabileceksiniz.

Anahtar Kavramlar • • • • •

Sterilizasyon Preparat haz›rlama Mikroskobik ölçüm Besiyeri Dilüsyon haz›rlama

• • • • •

Besiyeri tipleri Ekim teknikleri Kültür etme ‹dentifikasyon Tan› testleri

‹çerik Haritas›

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

• M‹KROB‹YOLOJ‹ LABORATUVARINDA KULLANILAN MALZEME VE ARAÇLAR • M‹KROORGAN‹ZMALARDA ÇO⁄ALMANIN KONTROLÜ • CANLI BAKTER‹ PREPARATLARININ ‹NCELENMES‹ VE ORGAN‹ZMALARIN M‹KROSKOB‹K ÖLÇÜMÜ • M‹KROORGAN‹ZMALARIN KÜLTÜR ED‹LMES‹ • ANAEROB‹K BAKTER‹LER‹N KÜLTÜR ED‹LMES‹ • BAKTER‹LER‹N BOYANMASI VE M‹KROSKOB‹K ‹NCELEME • BAZI METALLER‹N VE K‹MYASAL MADDELER‹N ANT‹M‹KROB‹YAL ETK‹S‹ ‹LE ANT‹B‹YOT‹K DUYARLILIK TESTLER‹ • LAM AGLUT‹NASYON TEST‹ • BAZI FUNGUSLARIN KÜLTÜR ED‹LMES‹ VE MORFOLOJ‹K ‹NCELENMES‹ • OTOMAT‹ZE B‹YOK‹MYASAL BAKTER‹YAL TANI TESTLER‹

Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar› LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: M‹KROB‹YOLOJ‹ LABORATUVARINDA KULLANILAN MALZEME VE ARAÇLAR Uygulama I Amaç: Laboratuvarlarda kullan›lan araç ve gereçlerin tan›t›m› ve kullan›m›.

Deney Tüpü Çap› 1,5 ile 1,8 cm; boyu 8-10 cm ya da 15-18 cm aras›nda olan cam borudur. Titrasyon ifllemlerinde, biyokimyasal deneylerde ve besiyeri haz›rlama gibi çeflitli ifllemlerde kullan›labilir. A¤z› vidal› kapakl› ya da kapaks›z olabilir.

Santrifüj Tüpü Santrifüjlere s›¤acak boyda amaca göre uçlar› sivri yada yuvarlak ve santrifüjün tipine göre de¤iflik hacimlerde sa¤lam camdan yada plastikten yap›lm›fl tüplerdir.

20

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Durham Tüpü Deney tüplerinin içerisine ters olarak yerlefltirilen 7x25 mm boyutlar›nda küçük tüplerdir. Genellikle s›v› besiyerlerinde bakterilerin karbonhidrat› kullanarak gaz oluflturup oluflturmad›¤›n› belirlemek için kullan›l›r.

Balon Joje (Volümetrik Balon, Dereceli Balon) Vücudu küre fleklindeki alt› düz olan, dar silindir fleklinde boynu olan cam kaplard›r. 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml gibi de¤iflik hacimlerde olabilir. Besiyeri ve çözeltilerin saklanmas›nda kullan›l›r. Balon jojelerin boyun k›sm›nda bir çizgi bulunur, bu çizgi seviyeyle ilgili hacmi belirtmektedir. Ölçü çizgisine kadar dolduruldu¤unda üzerinde belirtilen hacim kadar s›v› al›r.

Erlenmayerler Dip k›sm› genifl, a¤›z k›sm› dar bir bo¤azla sona eren konik flekilli bir cam malzemedir.A¤z› t›rafll› ya da t›rafls›z olabilir. Bunun yan›s›ra kapakl› ve kapaks›z olanlar› vard›r. 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml gibi de¤iflik hacimlerde ve materyal olarak da cam ya da plastikten üretilmifl olabilirler.

Beherler Çözelti ve s›v›lar›n haz›rlanmas›nda ve titrasyon için kullan›l›r. Beherlerde erlenler gibi de¤iflik hacimlerde üretilebilmektedir. Yine cam ya da plastikten üretilmifl olabilirler.

fiifleler Balon joje ve erlenlerde oldu¤u gibi de¤iflik hacimlerde ve de¤iflik materyalden üretilebilmektedirler. Koyu renkli olanlar genellikle boya ve ayraçlar›n konulmas›

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

amaçl›d›r. Vidal› kapakl› olanlarsa besiyerlerinin ve baz› çözeltilerin saklanmas› amaçl›d›r.

Petri Kutular› 1-2 cm yükseklikte, 5-8 cm çap›nda camdan yada plastikten yap›lm›fl kapak ve kutudan ibarettir. Özellikle kat› besiyerlerinin haz›rlanmas›nda kullan›l›r. Plastikten üretilmifl olanlar steril haldedir ve kullan›ma haz›rd›r. 1887 y›l›nda ilk kez PETR‹ taraf›ndan tan›mland›¤› için bu ad kullan›l›r.

Mezür (Dereceli Silindir) Silindir fleklinde dereceli cam malzemedir. S›v›lar›n ölçülmesinde kullan›l›r. De¤iflik hacimlerde cam yada plastikten üretilmifltir.

Pipetler Dereceli pipet: ‹stenilen miktarda s›v›y› bir yerden bir yere tafl›mada kullan›l›r. Genellikle ›s›ya dayan›kl› camdan üretilmifllerdir. De¤iflik hacimlerde üretilmektedir. Pipetin üst k›sm›nda çal›flma hacminin aral›klar› belirtilmifltir.

21

22

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Pipetin kullan›lmas› 1. Pipet, sa¤ elle yere dik bir flekilde bafl ve orta parmak aras›nda tutulur. 2. Pipetin ucu, kab›n cidar›yla taban› aras›ndaki aç› içinde duracak flekilde s›v› içine dald›r›l›r ve s›v›dan d›flar› ç›kmamas›na dikkat edilir. Aksi halde hava da beraber emilece¤inden s›v› a¤za gelir. 3. Pipetin di¤er ucundan a¤›zla düzgün bir emme yap›larak volüm çizgisinin biraz üstüne kadar pipet doldurulur. 4. Sonra süratle iflaret parma¤›yla pipetin üst deli¤i t›kan›r. Nemli yada ›slak parmakla s›v› seviyesini ayarlamak güç oldu¤undan iflaret parma¤› kuru olmal›d›r. 5. S›v›yla dolu pipet biraz e¤ik tutulur. ‹flaret parma¤›na hafif ve yumuflak gevfleme hareketleri yapt›r›l›r. Bu flekilde fazla s›v› at›l›r. 6. S›v› tamamen boflalt›lacaksa pipet dikey tutulur ve iflaret parma¤› kald›r›l›r, son k›sm› üflenir. Pasteur pipeti: Üzerinde derecesi bulunmayan çok az s›v› maddeyi bir baflka yere aktarmaya yarayan pipetlerdir. Plastik ve camdan üretilebilmektedir. Camdan üretilmifl olanlar pasteur f›r›n›nda steril edilebilir ve ucu amaca göre ›s›yla flekillendirilebilir.

Otomatik Pipetler: Küçük miktardaki (mikrolitre (µl)) s›v›lar›n çekilmesinde kullan›lan ayarlanabilir pipetlerdir.

Otomatik pipet kullan›m›nda dikkat edilecek noktalar 1. Pipetin hacim aral›¤›n› pipetin basma yerinden ya da yan yüzden bakarak kontrol ediniz. Pipetin üzerinde belirtilen hacimler d›fl›nda kullan›lamaz, kullan›ld›¤› taktirde pipet bozulur.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

2. ‹stenilen hacme uygun pipet seçilir ve bu pipete uygun tip seçilir. Genellikle pipetin üzerindeki renkler hangi tipin (ucun) kullan›laca¤›n› belirler. 3. Otomatik pipetlerde, pipete bast›r›ld›¤›nda iki kademe vard›r. 4. ‹lk kademe, pipete hafifçe bas›ld›¤›nda ulafl›lan kademedir ve s›v› al›m›nda istenen hacimdeki s›v›n›n al›m›n› sa¤lar. 5. ‹kinci kademe, pipete daha kuvvetli bir biçimde bast›r›ld›¤›nda ve en sona ulaflan kademedir. S›v›n›n at›m›nda kullan›l›r. 6. S›v› al›m›nda ikinci kademede s›v›y› al›rsan›z, istedi¤iniz miktardan fazlas›n› alm›fl olursunuz. Bu da yanl›fll›¤a neden olur ve s›v›, pipetin çeperine dolar, sonraki pipetlemede kontaminasyona neden olur. Böylece sonraki aktar›mda pipet bozulur.

Baget Ezme ve kar›flt›rma iflleminde kullan›lan cam çubuktur.

Cam huni S›v›lar› a¤z› dar kaplara boflalt›rken ve süzme ifllemi bafllad›¤› zaman kullan›l›r. ‹çlerine yerlefltirilen süzgeç ka¤›tlar› huniden taflmayacak flekilde kesilmelidir.

Lam Genellikle 76x26 mm boyutlar›nda dikdörtgen fleklinde cam malzemedir. Preparat haz›rlamada kullan›l›r. Thoma lam›, Howard lam›, çukur lam gibi özel tipte lamlar da bulunmaktad›r.

Rodajl› Lam Lam›n üçte birlik k›sm› buzlu camdan üretilmifltir. Bu k›sma kurflun kalemle etiketlendirme yap›labilir.

Lamel Genellikle 20x20 yada 22x22 mm boyutlar›nda yap›lm›fl malzemedir. Lam üzerine haz›rlanan preparatlar›n kapat›lmas› için kullan›l›r. Kare ya da dikdörtgen fleklindeki malzemedir. Yuvarlak olan tipleri de bulunmaktad›r.

Büret Titrasyon ifllemlerinde titre edilecek s›v›ya, di¤er s›v›y› damlatmakta kullan›l›r.

Ay›rma Hunisi ‹ki farkl› faz› birbirinden ay›rmada kullan›l›r.

Desikatör Kat› bilefliklerin kurutulmas› için vakum desikatörleri kullan›labilir. Kurutma için desikatörün dibine önce deriflik H2SO4, susuz CaCl2, fosfor pentoksit, NaOH yada silikajel yerlefltirilir. Sonra kurutulacak bileflik, bir kap içerisine konarak desikatörün raf›na yerlefltirilir ve desikatörün havas› bir tromp yada vakum pompas› yard›m›yla al›n›r.

fiale Dörtgen prizma fleklinde, camdan yap›lm›fl kapakl› kaplard›r. ‹çlerinde 4-7 lam›n uzun ya da k›sa kenar› üzerinde dik durmas›n› sa¤layacak yivler aç›lm›flt›r. Preparatlar›n boya, tampon, çözelti ve benzeri s›v›lar içerisinde muamele edilmesi için gerçeklefltirilmifltir.

23

24

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Di¤er Malzemeler Sporlar Metal ya da tahtadan yap›lm›fl tüplerin dik olarak içine yerlefltirilip tafl›nmas›n› ve saklanmas›n› sa¤layan tafl›y›c›d›r. Sterilizasyonda kullan›lacaksa metal tipleri tercih edilmelidir.

Süzgeç Ka¤›d› Süzme iflleminde kullan›l›r. Düz katlanm›fl süzgeç ka¤›d›: Özellikle çökeltiye gereksinim oldu¤unda, süzgeç ka¤›d› huninin büyüklü¤üne göre düzgün bir flekilde kesilir ve dörde katlan›p haz›rlan›r. Pilili süzgeç ka¤›d›: Süzme yüzeyini artt›rd›¤› için süzme ifllemi çabuklafl›r. Ancak buradan çökeltinin toplanmas› ifllemi güçleflir. Süzgeç ka¤›tlar› bir defa kullan›l›r ve ifllem bittikten sonra at›l›r. Süzme iflleminin çabuklaflt›r›lmas› için sisteme vakum yada bas›nç uygulanabilir.

Flask Kültür hücrelerinin yetifltirilmesi amac›yla kullan›lan zemini özel kaplama maddeleriyle kaplanm›fl plastik materyaldir.

Cryotüp -196°C’ye dayan›kl› içinde hücre saklanan plastik tüptür.

Puar Armut biçiminde, pipet takmak için bir aç›kl›¤› bulunan, kal›n plastik balonlard›r. Pipetin ucuna tak›ld›ktan sonra avuçta s›k›l›p gevfletilerek vakum oluflmas› sa¤lan›r. Böylece, pipetle s›v› çekme, boflaltma ya da püskürtme gibi ifllerde kolayl›k sa¤lar.

Mavi ve Sar› Tip Otomatik pipetlerle birlikte kullan›l›r. S›v› al›m› ve boflalt›lmas› gerçeklefltirilir.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Spatül Bir ucu düz öteki ucu kafl›k fleklinde olabilen, 10-15 cm uzunlu¤unda metal ya da porselenden yap›lm›fl, çeflitli genifllikte araçlard›r. Tart›m s›ras›nda toz maddelerin al›n›p tart›m kab›na aktar›lmas›nda kullan›l›rlar.

Bal›k (Manyetik Bar) Haz›rlanan s›v›lar›n, manyetik kar›flt›r›c› üzerinde, kar›flt›r›lmas›nda kullan›l›r.

Çelik Küvet Hayvansal materyallerin incelenmesinde kullan›l›r.

Pens Mafla ya da makas biçiminde metalden yap›lm›fl bir gereçtir. Elle tutulmas› mümkün olmayan ya da sak›ncal› olan kimi materyal pens yard›m›yla tutulabilir ve tafl›nabilir.

Bistüri Elle kavranabilecek bir sap k›sm› ve tak›l›p ç›kar›labilen, çok keskin bir uçtan oluflur. Uç k›sm› sterildir ve kullan›l›p at›labilir. Çeflitli materyalin küçük parçalara ayr›lmas› amac›yla kullan›l›r.

Diseksiyon ‹¤nesi Diseksiyon esnas›nda parçalar›n ayr›lmas› amac›yla kullan›l›r.

Otoklav Band› Otoklav etti¤iniz malzemenin steril olup olmad›¤›n› gösteren, belirli bölgeleri iflaretli yap›flkan etikettir.

Cam kalemi Bunlarla cam eflya üzerine iflaret konur ve yaz› yaz›labilir. Is›ya dayan›kl›d›r, renkleri farkl› olabilir.

Laboratuvar Çalar Saati De¤iflik süreler için kullan›lan ve bunun için dü¤meyle ayarlanabilen, süre dolunca zille haber veren saatlerdir.

Pipetlik Cam pipetlerin steril edilmesi amac›yla kullan›lan silindir ya da dikdörtgen flekilli metal kutulard›r.

Piset Plastikten yap›lm›fl fliflelerdir. Gövde k›sm›na bas›nç uygulanarak, içlerine konulan s›v›y› (alkol, distile su gibi) kapaktan geçirilmifl plastik boru vas›tas›yla d›flar› püskürtmeye yarar.

25

26

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Bütün bunlar›n d›fl›nda saat cam›, havan ve eli, makas ve pensler, tüp f›rças›, de¤iflik hacimde enjektör ve i¤neler, pH ka¤›tlar›, parafilm, 6, 12, 24 ve 96 kuyucuklu plakalar, lens ka¤›d›, boyama küveti gibi malzemeler de laboratuarda yayg›n flekilde kullan›lan ekipmanlard›r.

Ekim Aletleri Öze Platin ve okside olmayan tellerden halka fleklinde k›vr›lm›fl bir uç k›sm› ve bunun ba¤land›¤› sopas› vard›r. S›v› yada kat› besiyerlerine mikroorganizmalar›n ekilmesinde kullan›l›r. Özenin yuvarlak tel k›sm› genellikle 0.01-0.005 ml s›v› tafl›r. Platin özeler ›s›yla steril edilerek kullan›r. Bunun yan›nda tek kullan›ml›k olan plastik ve benzeri malzemelerden üretilmifl olan özeler de mevcuttur.

Eküvyon Ucuna bir miktar pamuk sar›lm›fl çubuktur. Bu tek çubuk tutulacak k›sm› d›flar›da kalacak flekilde pamuklan›r. Deney tüpüne konarak yada alüminyum ka¤›tlara sar›larak steril edilirler. Bo¤az, burun, yara, vajina ve gaitadan numune al›nmas›nda kullan›l›r. Mikroorganizmalar›n agar yüzeyine yay›lmas›nda da kullan›labilmektedir.

Drigalski Spatülü Petri kutusundaki kat› besiyerinin yüzeyine yayma yöntemiyle ekim yapmak için kullan›lan, cam baget veya pasteur pipetinden bunzen beki alevinde özel bir biçimde k›vr›larak haz›rlanan özedir. Alkol ile ya da alimünyum folyolara sar›larak otoklavda steril edilir.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Sterilizasyon Aletleri Otoklav Bas›nçl› buharla sterilizasyon yapmaya yarar. Havagaz›, petrol yada elektrikle çal›flan ›s› kayna¤› ve bir kazandan ibarettir. Kapa¤› hava s›zd›rmaz. Sterilize olacak madde uygun flekilde ambalajlan›r. Kapasitesine göre kazana su konur. Bas›nç ve zaman ayar› yap›l›r. Otoklav 121°C’de 15-20 dk süreyle sterilizasyon sa¤lar.

Pasteur F›r›n› Elektrik enerjisiyle çal›fl›r. Etüve benzer, tek fark›; sterilizatörde ›s›n›n mikroorganizmalar›n üremeleri için de¤il, öldürülmeleri için kullan›lmas›d›r. Cam malzemeler Pasteur f›r›n içinde 150°C’ da 3 saat, 160°C’ da 2 saat ya da 170°C’ da 1 saat tutularak kuru ›s›yla steril edilirler.

Filtreler Is›, kimyasal yolla ve ›fl›nland›rmayla steril edilemeyen çözeltilerin, s›v›lar›n ve besiyerlerinin ayr›lmas›nda kullan›l›r. De¤iflik markalar de¤iflik çapta ve de¤iflik por büyüklü¤ünde filtreler üretmektedir. Cam pamu¤u, toprak, cam tozu, porselen filitreler vard›r.

Su Banyosu (Ben Mari) Paslanmaz metalden yap›lm›fl içindeki suyu istenilen ›s›da tutan bir araçt›r. Elektrik enerjisiyle çal›fl›r. Çalkalamal› olanlar› da vard›r. Agar içeren besi ortamlar›n› s›v› halde muhafaza etmenin yan› s›ra serum, enzim inaktivasyonunda kullan›l›r.

27

28

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

UV Lambalar› Ultra viyole ›fl›nlar›yla sterilizasyonu sa¤lar. S›v› maddelerin, malzemenin ve havan›n sterilizasyonunda kullan›l›r. Mutasyon (canl›lardaki kal›tsal de¤iflim) oluflturmak için kullan›l›r.

Di¤er Aletler Etüvler Sabit ›s› sa¤layan bir araçt›r. Elektrik enerjisiyle çal›fl›r. Paslanmaz metal malzemeden yap›lm›fl, bir kapakla aç›l›p kapanan inkübatör, bir çeflit f›r›n görevi yapar. Etüv termostat› yard›m› ile istenilen s›cakl›¤a ayarlan›r ve ekimi yap›lan örnekler, üremeleri için etüvde belirli sürelerde tutulur (inkübe edilirler). CO2 etüvü, so¤utmal› etüv ve çalkalamal› etüv gibi çeflitleri vard›r. Etüvün afl›r› doldurulmamas› gerekir. Hava sirkülasyonunu sa¤layacak flekilde boflluklar b›rak›lmal›d›r.

Santrifüjler Çökeltme ifllemlerinde kullan›l›r. Devir say›s› iste¤e göre ayarlanabilir. S›v› maddelerin, bakteri ve hücrelerin tüp diplerine çöktürülmesi, hücre k›s›mlar›n›n, kan serumunun plazmadan ayr›lmas›nda kullan›l›r. Ço¤unlukla geliflmifl olanlar› elektriklidir. Kullan›labilen tüp say›s› ve hacmi de¤iflir. Yüksek devirli so¤utmal› santrifüjlerin yan› s›ra, masaüstü tipte küçük santrifüjler de laboratuarlarda yayg›n olarak kullan›lmaktad›r. Masa Sant. 3000-5000 rpm, Ultra Santrifüjlerse 10.000-100.000 rpm lik dönüfl h›z›na sahiptir.

Spektrofotometreler Spektrofotometre örnek safl›¤›n›n kalitatif analizinde, DNA-protein oranlanmas›nda, hücre yo¤unlu¤u ölçümünde, enzimlerin katalizledi¤i reaksiyon ölçümlerinde kullan›l›r. Spektrofotometrenin temelinde, çeflitli maddelerin özel dalga boylar›n›

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

farkl› olarak absorbe etme ilkesi yer al›r (UV; 200-400 nm, görünür; 400- 700 nm, k›z›lötesi; 700-900 nm). Fotometrik ölçüm; belli bir dalga boyunda örnek absorbans›n›n direkt ölçülmesini, enzimatik reaksiyon ürününün yada direkt olarak absorbans›n›n indikatörü olarak rol oynayan ilgili maddelerin indirekt ölçümünü kapsar. Bütün spektrofotometreler dalga boylar›n›n absorbsiyonuyla konsantrasyonlardaki de¤ifliklikleri belirlemek için dizayn edilmifl, ayn› temel yap›sal unsurlar› tafl›rlar. Pek çok spektrofotometrede genel olarak bir ›fl›k kayna¤›, dalga boyu seçici, sabit ya da ayarlanabilir bir slit (yar›k), küvet, fotosel ve analog ya da dijital okuyucu bulunur. UV yada Vis’ e özel ›fl›k kayna¤› ›fl›k yayar, bu ›fl›k dalga boyu seçiciden geçer. Bu genellikle bir prizmad›r ya da eleme filtresidir. Burada monokromatik ›fl›¤›n spesifik dalga boyu yarat›l›r. Ifl›k örnek dolu küvete geçmeden önce yo¤unlu¤unun düzenlenmesi amac›yla ince bir yar›¤a yönlendirilir. Küvetler absorbans karakteristiklerine göre farkl›d›r. Sonuç olarak absorbans fotosel taraf›ndan belirlenir. Fotosel k›r›lan ›fl›ktaki elektronlar› elektrik ak›m›n› yaratmakta kullan›r. Bu ak›m gücü artt›r›larak absorbans de¤eri ve optik yo¤unluk (OD) de¤eri elde etmek için ölçülür. OD okunmas› esnas›nda; blank’e (kontrol; test maddesi hariç bütün ve reagentlar) karfl› örne¤in OD’ sinin ölçümünü do¤rulamak için yap›lmal›d›r.

pH metreler pH farkl› yollarla ölçülebilir. pH ölçmede en do¤ru ve pratik yol pH metre kullan›lmas›d›r. pH metre bir cam elektrot aras›ndaki potansiyel de¤iflimini ölçmeye dayal› olarak pH de¤erini belirler. pH metre ile çözeltideki H+ iyonu konsantrasyonunun say›sal de¤eri ölçülür. pH metre ile ölçüm yap›l›rken; pH metrenin besiyeri s›cakl›¤›na göre s›cakl›¤› ayarlan›r. Tampon çözeltilerle (genellikle pH=4 ve pH=7 veya pH=4 ve pH=11 olan tampon çözeltiler kullan›l›r) pH metre ayarlan›r.

Derin Dondurucu Doku kültürlerinin, bakteri sufllar›n›n uzun süre sakland›¤› cihazlard›r, buzdolab›ndan (+4°C den düflük) daha so¤uk ›s›larda, biyolojik ve biyokimyasal maddelerin saklanmas›nda kullan›l›r (-85°C).

29

30

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Teraziler Laboratuvarlarda gerekli tart›m ifllerinde kullan›l›r. Ayr›ca santrifüj tüplerinin karfl›l›kl› dengelenmesinde kullan›lan teraziler de vard›r. Laboratuvarda kullan›lan terazilerin kaba, hassas laboratuvarda vard›r. Hassas terazi 0,01g ve ± 0,0001g duyarl›l›ktad›r. Hassas terazi laboratuvarda titreflimden uzak bir yere konmal›d›r.

Manyetik Kar›flt›r›c› ve Is›t›c›lar Bir kimyasal çözeltinin içine konan parçalara daha kolay ifllemesini sa¤lamak için daha çok tespit ve dekalsifikasyon gibi ifllemleri h›zland›rmak amac›yla kullan›lan araçlard›r. Manyetik kar›flt›r›c›larda tabla alt›nda dönen bir manyetik alan oluflturulmaktad›r. Çözeltiyi koydu¤unuz kab›n içine küçük, metal bir çubuk (manyetik bal›k) konur. Kap, tabla üzerine kondu¤unda manyetik alan›n hareketine ba¤l› olarak metal çubuk dönmekte ve s›v›y› devaml› olarak kar›flt›rmaktad›r. Is› kimyasal reaksiyonlar›n h›z›n› etkileyen önemli bir faktördür. Bu araçlar›n tablalar›n› ayarlanabilir derecelere kadar ›s›tan termostatl› elektrik devreleri de bulunabilir. Ayr›ca bir reosta yard›m› ile manyetik alan›n dönüflü h›z›n› da artt›r›p azaltmak mümkündür.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Çalkalamal› Tabla Mekanik kar›flt›r›c›lar bir elektrik motorunun yard›m›yla bir tablay› düzenli olarak sallamaktad›rlar. Buna ba¤l› olarak bu tablo üzerine konan örneklerinde çalkalanmas› sa¤lanmaktad›r.

Vortex Küçük miktarlardaki (örne¤in bir tüpteki) s›v›lar›n kar›flt›r›lmas›nda manyetik bal›k kullan›lmas› materyal kayb›na yol açabilir. Vorteks ise üst k›s›mdaki plastik yuvaya yerlefltirilerek bast›r›lan tüp ve benzeri kaplar içersindeki s›v›lar›n girdap oluflturacak flekilde döndürülmesiyle kar›flt›rmay› sa¤lar.

Steril Kabin Laboratuvarlarda kontaminasyon riski, çal›flma alanlar›n›n yüzeylerinin uygun dezenfektanlarla silinnerek havan›n filtre edmesiyle küf, maya, bakteri, spor ve hücrelerinin elimine edilmesiyle ortadan kalrd›r›labilir. Bakteriyolojik çal›flmalar bazen steril kabin içinde yap›l›r Çeflitli steril kabinler vard›r. Bunlardan birisi SINIF II steril kabinlerdir. Bunlarda steril hava devaml› olarak çal›flma yüzeyine dik olarak akar ve hava daha sonraki filtrasyon için d›flar›ya verilir. SINIF III steril kabinlerse gaz s›zd›rmaz kabinlerdir. Hava içeri al›nmadan ve verilmeden önce filtre edilir. S›n›f III kabinler çok patojenik mikroorganizmalar la çal›fl›rken kullan›l›r.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: M‹KROORGAN‹ZMALARDA ÇO⁄ALMANIN KONTROLÜ

Mikrobiyoloji çal›flmalar› ve araflt›rmalar›ndaki pek çok ifllem canl› mikroorganizmalar›n kullan›lmas›n› içerir. Canl› mikroorganizmalarla yap›lan çal›flmalarda, laboratuarda kullan›lan her mikroorganizman›n potansiyel zararl› olabilece¤i, her kültür s›v›s›n›n patojen organizmalar ve toksik maddeler tafl›d›klar› unutmamal›d›r.

31

32

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Bu nedenle, mikroorganizmalar›n elimine edilmesi yada aktivitelerinin inhibe edilmesiyle ilgili metodlara gerek vard›r. Bazen bütün canl› yaflam formlar›n›n tamamen ortadan kald›r›lmas› yada sadece zararl› organizmalar›n elimine edilmesi gerekebilir. Ayr›ca canl› dokular›n içindeki yada üzerindeki patojenik bakterilerin inaktivite edilmesinde de baz› problemler vard›r. Mikrobiyal populasyonlar›n kontrol alt›na al›nmas›nda çeflitli yöntemler vard›r. Bu ifllemler ›s› uygulamas›, kimyasal sterilizasyon, filtrasyon ve radyasyon olarak grupland›r›labilir. Bir ortam yada maddenin tüm canl› mikroorganizmalardan ar›nd›r›lmas› ifllemine STER‹L‹ZASYON ad› verilir. Sterilizasyonda bütün organizmalar öldürüldü¤ü için, k›smi sterilizasyon gibi bir terim anlams›zd›r. Sterilizasyon metodlar› etkili, çabuk, basit, ucuz ve pek çok çeflitli materyale uygulanabilir olmal›d›r.

S›cakl›k ‹le Sterilizasyon

Bakteri türleri, hücrelerindeki içerdikleri su miktar›na ba¤l› olarak, s›cakl›¤a karfl› farkl› hassasiyet gösterirler. Endosporlar vejetatif hücrelerden daha dirençlidir. Vejetatif hücreler kaynayan su içinde genellikle h›zla ölürken endosporlar, daha uzun süre yaflayabilirler. Is›n›n sterilizasyon günü sadece s›cakl›¤a de¤il, zamana, nem oran›na ve çevre flartlar›na ba¤l›d›r. S›cakl›k kuru ve nemli olarak sterilizasyon ifllemlerinde kullan›l›r.

Kuru Is› ‹le Sterilizasyon

Buhar bas›nc›yla steril edilemeyen porselen, tüp, balon, pipet, petri kutusu gibi cam malzemenin ve toz halindeki maddelerin sterilizasyonu kuru s›cakl›kla çal›flan elektrikli yada gazl› f›r›nlarda yap›l›r. Bu f›r›nlar Pasteur f›r›n› olarak adland›r›l›rlar. Bu f›r›nlarda cam malzemeler 150°C da 3saat, 160°C da 2 saat ya da 170°C da 1 saat tutularak kuru ›s›yla steril edilirler. Bu ifllemde proteinler denatüre olur, sitoplazma büzülür ve organizmalardaki çeflitli bileflikler okside edilir. Ayr›ca kuru ›s› hücrelerden su çekerek dehidratasyona da neden olur. F›r›n içindeki fanla hava sirkülasyonu sa¤lanmal›d›r. Ancak bu flekilde bütün k›s›mlar istenilen ›s›da tutulabilir. F›r›n içine yerlefltirilen malzeme, hava sirkulasyonuna engel olmayacak flekilde yerlefltirilmelidir. Kuru ›s›yla sterilizasyonda uygulanan di¤er bir yöntem de ALEVDEN GEÇ‹RME’dir. Steril edilmifl, a¤z› pamuk ya da kapakla kapat›lm›fl cam eflyalar hem aç›l›rken hem de kapat›l›rken alevden geçirilir. Alev tüpün a¤z›ndaki herhangi bir mikroorganizmay› elimine etti¤i gibi, hem de d›fl k›s›mda hava ak›m› yaratarak kontaminasyon flans›n› azalt›r (flekil 2.1). fiekil 2.1 Tüp ve lam›n alevden geçirilmesi

33

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Steril lamlarda, ekim yap›lacak yüzeyleri alevden üç kez geçirilerek steriliteleri korunur. Transfer i¤neleri öze gibi mikroorganizmalar›n transferinde kullan›lan araçlar YAKMA ‹fiLEM‹ ile steril edilirler. Enfekteli materyaller ve hayvan kadavralar›da yak›larak imha edilirler(flekil 2.2). fiekil 2.2 Özenin alevde yak›lmas›

Öze

Nemli Is› ‹le Sterilizasyon Nemli s›cakl›¤›n öldürücü etkisi, kuru s›cakl›¤a göre daha fazlad›r. Besiyeri, kuru s›cakl›kla bozulacak materyaller, kumafl, elbise, önlük, kauçuk, seyreltme kaplar›, ifli biten materyaller, çözeltiler nemli s›cakl›kla steril edilirler. Ortam›n nemli olmas›ndan dolay› besiyerlerinden su kayb› olmaz. Nemli s›cakl›kla sterilizasyon bas›nçl› ve bas›nçs›z buharla olmak üzere iki flekilde uygulan›r. Bas›nçl› Buhar ‹le Sterilizasyon: Bu ifllemde doymufl su buhar›yla çal›flan OTOKLAV ad› verilen cihaz kullan›l›r. Bilindi¤i gibi normal atmosfer bas›nc›nda buhar s›cakl›¤› 100°C dir. Bu s›cakl›kta baz› endosporlar uzun süre canl›l›klar›n› sürdürebilirler. Fakat buhar bas›nç alt›nda, sterilizasyon için uygun olan daha yüksek s›cakl›¤a ulaflabilir. Bas›nç ve s›cakl›k aras›nda bir iliflki vard›r. Bas›nç artt›kça s›cakl›kda artar. Bas›nçl› buhar›n yüksek s›cakl›¤› hücredeki proteinlerin koegülasyonuna neden olur. Yüksek s›cakl›¤a ek olarak, bas›nçl› buharda bulunan bol miktardaki su, h›zl› bir ›s›tma ve hücre içine girifl özelli¤iyle proteinlerin koegülasyonunu h›zland›rarak hücrenin ölümüne sebep olur. Otoklav, yüksek bas›nca dayan›kl› çift çeperli ve metal bir cihazd›r (fiekil 2.3). De¤iflik flekillerde(kare, dikdörtgen) olabilen otoklavlarda, kazan›n içine su koymay› sa¤layan bir musluk, hava ve buhar ç›kmas›n› sa¤layan bir musluk, monometre ve emniyet subab› vard›r. Ayr›ca buhar›n d›flar› ç›kmas›n› sa¤layan bir musluk daha vard›r. Otoklav elektrik enerjisiyle çal›fl›r. Buhar kazan içerisinde üretilir. Büyük otoklavlardaya bir kaynat›c›dan kazan›n içine pompalan›r. Hava aç›k vanadan, kazan doymufl buhar doluncaya kadar geçer. Kazan tamamen doymufl buhar ile dolunca vana kapat›l›r, ›s›tmaya devam edilerek bas›nç ve s›cakl›k artt›r›l›r. Otoklavda sterilizasyon için 2 atmosferlik bas›nc›n 15-20 dakika uygulanmas› yeterlidir. Bu bas›nçta buhar s›cakl›¤› 121°C dir. Daha sonra buhar vanas› aç›larak buhar›n d›flar› ç›kmas› sa¤lan›r. Bas›nc›n s›f›ra düfltü¤ü monometreden kontrol edilerek otoklav›n kapa¤› dikkatlice aç›l›r. Sterilizasyon için beklenilen süre; otoklavdaki tüm materyaller için etkili olmal›, sterilizasyon s›cakl›¤›na ulaflmak için yeterli olmal› ve bütün organizmalar›n öldürülmesi için istenilen sürede olmal›d›r.

34

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Otoklavda kullan›lan genel s›cakl›k zaman kombinasyonlar›n› flöyle s›ralayabiliriz; - 115 °C da 35 dakika, - 121 °C da 15-21 dakika, - 134 °C da 4 dakika. fiekil 2.3 Otoklav

Bas›nç vanas›

Bas›nç ölçer

Aç›k Hava/buhar ç›k›fl› Kapal› Somun Kapak Conta

Steril edilcek flifleler Tafl›y›c› Su Is›t›c›

Otoklavda baflar›l› bir sterilizasyon için afla¤›da say›lan noktalara dikkat edilmelidir; 1. Tam bir sterilizasyon için gerekli sürenin, otoklav içerisine yerlefltirilen materyalin kalite ve miktar›na göre de¤iflece¤i unutulmamal›d›r. 2. Otoklavda steril edilecek malzemeler gevflek olarak aralar›nda buhar›n en küçük gözeneklerine girmesine izin verecek flekilde yerlefltirilmelidir. 3. Otoklav›n bas›nc› h›zl› bir flekilde düflürülmemelidir. Aksi halde kaplar içindeki s›v›lar kaynar, kaplar›ndan taflar yada t›kaçlar› atabilir. 4. Otoklava konulan malzemelerin a¤›zlar›, buhar›n kaplar›n içine girmesine engel olmayacak flekilde çok s›k› kapat›lmamal›d›r. 5. Etkili bir sterilizasyon için buhar doymufl olmal›d›r. Buhar istenilen s›cakl›kta olmal› ve mümkün olabildi¤i kadar gaz formunda su içermelidir. 6. Kazan›n içerisinde hava bulunmamal›d›r. Çünkü; hava, bas›nçs›cakl›k iliflkisini bozar. Ayn› bas›nç alt›nda havabuhar kar›fl›m› sadece buhar›n sahip oldu¤u s›cakl›ktan daha az s›cakl›¤a ulafl›r. Bu nedenle hava kazandaki ve kazan içindeki bütün malzemelerden hava vanas› kapanmadan önce ç›kar›lmal›d›r.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Laboratuvarlarda, evlerde kullan›lan düdüklü tencereler birer otoklav olarak kullan›labilir. Çünkü; bu tencerelerin çal›flmas› ve kullan›lmas› prensipg-i otoklav ile ayn›d›r. Hastanelerde kullan›lan büyük otoklavlardaya buhar bir kaynat›c›dan kazana pompalan›r. Zaman, bas›nç ve buhar, kalitesi gibi faktörler otomatik olarak kontrol edilir. Baz› otoklav modellerinde buhar kazan›n›n üst k›sm›ndan verilir, böylece hava kazan›n alt taraf›na kayar. Bu küçük otoklavlarda kullan›lan yukar› do¤ru yer de¤ifltirmeden daha etkilidir. Çünkü; bu flartlarda buhar havadan daha hafiftir. Baflka bir çeflit otoklavda ise kazan›n içindeki hava buhar verilmeden önce pompaya boflalt›l›r. Bu ifllem delikli materyallerden buhar›n h›zl› ve etkin bir flekilde geçmesine izin verir. Baz› materyaller otoklavda steril edilemezler. Örne¤in; su geçirmeyen maddeler (petroleum jelly), ›s›ya bozunabilen maddeler. Bu maddeler pasteur f›r›nda veya filtrasyon ile steril edilebilirler. Otoklav›n sa¤l›kl› çal›fl›p çal›flmad›¤›, otoklav›n içerisine yerlefltirilen maksimal bir termometreyle, kükürt gibi 120°C da eriyen maddeler özel bir tüpün içerisine yerlefltirilerek, boyal› ka¤›tlar yada biyolojik indikatörler(Bacillus subtilus veya B.stemothermophilus gibi sporlu bakteriler) yard›m›yla test edilebilir. Kaynatma ‹le Sterilizasyon: Kaynatma yoluyla mikroorganizmalar›n sadece vejetatif formlar› ölür. Etkili bir sterilizasyon için 100°C da 30 dakikal›k bir zaman gereklidir. Bu yöntemde sterilizasyon edilecek materyallerin tümünün suyu içine bat›k durumda kaynat›lmas›, kaynatma ifllemi bittikten sonra malzemelerin önceden steril edilmifl bir pensle tutularak sudan ç›kar›lmas› gerekmektedir. Kaynatma ifllemi sterilizasyondan çok bir dezenfeksiyon ifllemi sa¤lar. Sterilizasyon için ise gaz kar›fl›m› özel kabinler içinde kullan›l›r ve etilen oksitin konsantrasyonu dikkatli bir flekilde kontrol edilir. Protein ve nükleik asitlerdeki çeflitli grublarla reaksiyona giren etilen oksit klinik araçlar›n, yatak, çarflaf vb. maddelerin sterilizasyonunda kullan›l›r.

Dezenfeksiyon Baz› kimyasal maddelerin uygun kontrasyonlar›ndaki çözeltilere gaz yada buharlar› mikroorganizmalar› öldürme (bakterisidal) yada üremelerini durdurma (bakteriostatik) özelli¤i gösterir. Kimyasal maddeler kullan›larak, patojen mikroorganizmalar› öldürülmesi ifllemine, DEZENFEKS‹YON ad› verilir. Dezenfeksiyon tam olarak bir sterilizasyon de¤ildir, yani sterlizasyon yerine kullan›lamaz. Çünkü; dezenfeksiyon için kullan›lan maddeler (dezenfektanlar) baz› mikroorganizmalar› ve sporlar› etkilemezler. Dezenfeksiyon ifllemi daha çok cans›z objeler ve yüzeyler için kullan›l›r. Kimyasal dezenfeksiyon yayg›n olarak kullan›lmas›na ra¤men, baz› ifllemler için fiziksel yöntemler daha uygundur. Genel amaç için kullan›lan dezenfektanlar›n ideal olarak çok genifl kapsaml› ve potansiyel patojenleri öldürme özelli¤ine sahip olmas› gerekir. Fakat bir dezenfaktan genellikle baz› mikroorganizmalara di¤erlerinden daha fazla etkilidir. Dezenfaktan maddelerin etkinli¤i; dilusyon oran›na, s›cakl›¤a, pH’a, organik madde yada deterjan varl›¤›na, ortamdaki mikroorganizma cinsine ve yüküne ba¤l›d›r. Dezenfektan maddelerin etkili olmas› için uygun flartlarda, uygun kontrasyonlarda ve zaman aral›¤›nda kullan›lmas› gerekir. Hipokloritler gibi baz› dezenfaktanlar kararl› de¤ildir. Baz› dezenfektanlar›n da etkili olabilmesi için eriyik olmas› gerekir. Baz› dezenfektanlar düflük konsantrasyonlarda etkili olurken baz› bakterileri metabolize edebilirler. Örne¤in; Pseudomonas türleri karbonik asit (fenol)’in seyreltik solusyonlar›nda büyüyebilirler. Dezenfeksiyon iflleminde kullan›lan çeflitli kimyasal maddeleri flöyle s›ralayabiliriz; sülfirik asit (H2SO4), Hidroklorik asit (HCl), borik asit, benzoik asit, etil alkol, kloroform, fenol, kresol, lizol, hidrojen peroksit, potasyum permanganat, sönmemifl kireç, kireç sütü, timol, iyot, klor, sodyum hipoklorit, kalsiyum hipoklorit, klor

35

36

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

amin, antiformin, etilen oksit, sabun ve deterjanlar, a¤›r metaller, kuaterner amonyum bileflikleri(QACs) boyalard›r. Genel olarak yayg›n flekilde kullan›lan baz› dezenfektanlara örnekler afla¤›da verilmifltir;

Tindalizasyon 100°C üzerindeki s›cakl›klarda bozulabilen besiyerleri (flekerli, jelatinli besiyerleri) ve baz› çözeltiler dayanabildikleri s›cakl›k derecelerine göre (56-100°C ) birkaç gün arka arkaya ›s›t›larak steril edilebilirler. Bu yöntemde steril edilecek materyal genellikle 100°C de yar›m saat aral›klarla 3 gün tutulur. Böylece vejetatif hücreler ölür. Ancak s›cakl›k 100°C nin üzerine ç›kart›lmad›¤› için sporlar canl› kal›r. Materyal ertesi güne kadar oda s›cakl›¤›nda bekletilir. Bu süre içinde 1. gün iflleminden etkilenmeyen sporlar vejetatif forma dönüflür. Materyal 2. gün yine 100°C’ de yar›m saat tutulur. Ayn› ifllemler bir gün daha tekrarlan›r ve tindilizasyon ifllemi 3 gün içinde tamamlan›r. Tindilizasyon ifllemi otoklavda otoklav kapa¤› tamamen kapat›lmadan 100°C’ daki buhar›n serbestçe d›flar› ç›kaca¤› durumda, benmari ad› verilen metal su banyolar›nda, Koch kazan› ve Steam Arnold isimli araçla yap›labilir. Tindilizasyon ifllemiyle sterilizasyon bazen 3 gün içinde tamamlan›r. Bu gibi durumlarda süre birkaç gün daha artt›r›labilir.

Pastörizasyon Tam bir sterilizasyon de¤ildir. Süt, meyve sular›, krema, bira, flarap gibi alkollü içeceklerdeki patojen mikroorganizmalar›n (bütün mikroorganizmalar de¤il) yafl ›s› uygulanarak öldürülmesi ifllemidir. ‹ki çeflit pastörizasyon uygulan›r; 1. LTH (Low temperatureholding) : Pastörize edilecek materyal 63°C de yar›m saat tutulur ve s›cakl›k en k›sa sürede 10°C ye düflürülür. Buradaki 63°C, besinlerde zararl› olan mycobacterium tuberculosis’ in, bu s›cakl›kta 15 dakikada öldü¤ünün deneysel olarak tesbiti sonucunda bulunmufltur. 2. HTST (High temperature short time) : Materyal 72°C de 15 saniye tutulur ve s›cakl›k en k›sa sürede 10°C’ ye indirilir.

Kimyasal Maddeler ‹le Sterilizasyon

Sterilizasyon için kullan›lan kimyasallar oldukça reaktiftirler ve canl› dokulara zarar verirler. Bu yüzden kullan›mlar›nda çok dikkatli olmak gerekir. Sadece uygun alet ve yetifltirilmifl personel bulunan kurulufl ve enstitülerde kullan›l›rlar. Etilen oksit (C2H4O) suda eriyen siklik eter 10.8°C nin üzerinde gazd›r. Hava ile temas›nda patlay›c›d›r. Bu yüzden azot, CO2 gibi gazlar ile seyreltilmifl halde kullan›l›r.

Fenol ve Fenol Türevleri Uygun konsantrasyonlarda bakterisidaldir. Sitoplazmik membran permeabilitesini etkilerler. Lizol metilfenolün sabunla solubize edilmifl kar›fl›m›d›r. % 5’ lik konsantrasyonlarda, 15 dakikada, spor yapmayan birçok bakteriyi öldürür. Endosporlar % 2’ lik lizolde birkaç gün yaflayabilir. Fenol rahats›z edici bir kokuya sahiptir ve kullan›ld›ktan sonra yüzeyde yap›flkan bir iz b›rak›r.

Klor ‹çme sular›n›n ve yüzme havuzlar›n›n dezenfeksiyonunda kullan›l›r. Direkt olarak ya da hipoklorik asit yoluyla etki eder. Organik materyaller yada reaksiyona girdi¤i di¤er maddeler etkinli¤ini azalt›r. Hemen hemen bütün bakterilere ve sporlar›na karfl› oldukça etkilidir. Gaz halindeyken çok tehlikelidir. Bu yüzden genellikle hipoklorit yada kloraminler olarak s›v› halde kullan›l›r. Klor çözeltileri zamanla etkilerini kaybettikleri için taze olarak haz›rlanmal›d›r.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Kuaterner Amonyum Bileflikleri Katyonik deterjanlard›r. Besin ve süt endüstrisinde kullan›lan aletlerin dezenfeksiyonunda kullan›l›rlar. Düflük konsantrasyonlarda bakteriyostatik etki gösterirler. Yüksek konsantrasyonlardaya bakterisidal etki gösterirler. Gram pozitif bakteriler üzerinde daha etkilidrler. Sitoplazmik membran›n bütünlü¤ünü bozaralar. Sabunlar ve baz› katyonlar (Ca+2,Mg+2), düflük pH ve organik maddeler etkinliklerini inhibe ederler. Kokusuz olmalar›, yüzey boyamad›klar›, matallerde korozik etki göstermedikleri, stabil olduklar›, ucuz ve nispeten toksik olmad›klar› için tercih edilirler.

Hipokloritler Bakteri ve sporlara karfl› oldukça etkindirler. HCOl kuvvetli bakterisidaldir. Sodyum hipoklorit ticari hipoklorit dezenfektanlar›n stabilizeri olarak yayg›n kullan›lmaktad›r.

Alkoller Genellkile etil alkolün % 50-70’ lik konsantrasyonlar› kullan›l›r. Yüzey dezenfeksiyonunda kullan›l›rlar, sporlara etkili de¤ildirler. Alkol mutlaka su ile kar›flt›r›larak kullan›lmal›d›r, çünkü; saf alkol hücre duvar›ndaki proteinleri bloke ederek hücre içine nüfuz edemez. Alkoller etkilerini proteinleri denature ederek de¤il, lipid çözücü ve dehidre edici özelliklerinden dolay› gösterirler.

Formaldehit Zehirli buhar› nedeniyle kullan›m›na özen gösterilmelidir. % 37-40’ lik konsantrasyonlar›nda s›v› (formol) yada para formaldehit (kat›) halde yüzey dezenfeksiyonunda kullan›l›rlar.

A¤›r Metaller Gümüfl, civa, bak›r, çinko, alt›n tuzlar› yayg›n olarak kullan›l›r. Mikroorganizmalar üzerinde “sidal” etkiye sahiptirler. Hücre enzimlerini çökelterek yada SH gruplar› ile birleflerek enzimlerini inhibe ederler. Çok az miktarlarda çok etkili olmas›n›n nedeni, baz› hücre proteinlerinin, bu iyonlara ilgisinin fazla olmas›d›r. Baz› bakteriler, plasmidler taraf›ndan kodlanan a¤›r metal dirençlili¤ine sahiptirler. Materyal bu maddelerden yap›lm›fl ka¤›tlar aras›na saklanarak uygulan›r.

Peroksitler Hidrojen peroksitin % 3’ lük sulu çözeltisi dezenfeksiyonda kullan›l›r. Antimikrobiyal etkisi çok zay›ft›r.

Boyalar Malaflit yeflili, brilyant gren, kristal violet gibi mikroorganizmalar›n boyanmas›nda kullan›lan baz› boyalar bakterisidal etkiye sahiptirler. Kristal violet Gram pozitif koklar üzerinde etkilidir. Akriflavin ve proflavin boyalar özellikle gram pozitif bakteriler üzerinde etkilidir. Boyalar›n yo¤unluklar› ve mikroorganizma türü önemlidir.

Fiziksel Ajanlar ‹le Dezenfeksiyon U.V, DNA’ ya zarar verebilir ve uygun flartlar alt›nda bakterilerin ölümüne neden olabilir. UV’ nin etki gücü oldukça zay›ft›r (toprak taraf›ndan kolayca absorbe edilebilir), fakat UV lambalar› (254 nm), havan›n ve kapal› alanlardaki yüzeylerin dezenfeksiyonundan kullan›l›r.

Antisepsis Canl› dokular›n dezenfeksiyonuna ANT‹SEPS‹S ad› verilir. Enfeksiyondan korunmak yada enfeksiyonu tedavi etmek için uygulan›r. Genel olarak kullan›lan dezen-

37

38

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

faktan maddeler fazlaca suland›r›larak antisepsi uygulan›r. Bu maddelerse antiseptik maddeler olarak adland›r›l›rlar. Antiseptiklere ait baz› örnekler afla¤›da verilmifltir: Detol: Genel amaçla seyreltik olarak kullan›lan fenol antiseptiktir. Evsel dezenfeksiyonda daha konsantre formlar› kullan›l›r. Hekzoklorafen: Antiseptik sabunlarda kullan›l›r. Bir bizis fenoldür (Molekül 2 fenol grubu tafl›r). Gram bakterilere karfl›n daha etkindir. 70:30 EtanolSu Kar›fl›m›: Deri antisepti¤i olarak kullan›l›r. Sabunlar antiseptik tafl›mad›klar› sürece çok az ya da hiç antibakteriyal aktivite göstermezler. Sabun bakterilerin, kir ve ya¤lar›n deriden uzaklaflt›r›lmas›n› sa¤lar. QACs : Antiseptik kremlerde kullan›l›r. ‹yod: Alkol ya da sulu solüsyonlar› potansiyel bakterisidaldir. Ayr›ca sporisidal bir antiseptiktir.

Filtrasyon ‹le Sterilizasyon Yüksek ›s›yla sterilizasyon uyguland›¤›nda, fiziksel ve kimyasal yap›lar›nda de¤iflmeler olabilecek serum, enzim, vitamin, antibiyotik, protein vb. maddeler ›s›ya dayan›ks›z olduklar›ndan filtreden geçirilerek steril edilirler (fiekil 2.4). Filtrenin yap›s› ve kalitesi yan›nda, filtrasyonda etkili olan faktörler aras›nda filtre edilecek s›v› içindeki mikroorganizman›n elektrik yükü, filtrenin kendi elektrik yükü ve por büyüklü¤ü say›labilir. Çok çeflitli filtreler vard›r; membran filtreler, porselen, cam tozu, amyant (Seitz), diotome (Berkfeld), asbest, selüloz asetattan yap›lm›fl filtreler örnek olarak verilebilir. Bir sterilizasyon metodu olan filtrasyon ayn› zamanda mikroorganizmalar›n izolasyonu ve çeflitli metabolizma ürünlerinin elde edilmesinde ve havan›n sterilizasyonunda da kullan›l›r. Filtrasyonda mikroorganizmlar ya filtrenin küçük deliklerine mekanik olarak tutunur ya da elektrik yüklerindeki farkl›l›k nedeniyle filtreye absorbe olur. Membran filtreler mikrobiyolojide en çok kullan›lan filtrelerdir. Bunlar›n por çaplar› genellikle 0.45 µm’ dir. Bu filtreler bakteriler için kullan›l›r. Son y›llarda 0.001-10 µm’ lik por çapl› olan filtrelerde yap›lm›flt›r. Membran ve moleküler filtreler biyolojik olarak reaksiyona girmeyen maddelerden yap›lm›flt›r. Delik çap› çok küçük (0.2 µm) olan virüslerin ve çok küçük partiküllerin ayr›lmas›nda kullan›lan filtrelerde vard›r. Filtre cihaz› kullan›lmadan önce alimünyum ka¤›tlara ayr› ayr› sar›larak steril hale getirilirler. fiekil 2.4 laboratuarda kullan›lan çeflitli filtreler

Steril edilecek medium

Hazne Tutucu Membran filtre Cam platform Taban Plastik t›pa

Vakum borusu

Steril medium

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Radyasyon ‹le Sterilizasyon 2000-3800 A° dalga boylar› aras›ndaki fleritte yer alan ultraviole ›fl›nlar› (UV) mikroorganizmalar üzerinde bakterisid özelli¤e sahiptir. Güneflten gelen UV ›fl›nlar›, su yüzeyinde ve havada serbest dolaflan mikroorganizmalar› öldürür. Radyasyon ile sterilizasyon k›s›tl› bir uygulama alan›na sahiptir ve etki mekanizmas› hakk›nda çok az ayr›nt› bilinmektedir. Radyasyon uygulamalar› iyonize radyasyon ve iyonize olmayan radyasyon olarak ikiye ayr›labilir:

‹yonize Olmayan Radyasyon Buna en iyi örnek UV ›fl›nlar›d›r. UV ›fl›nlar› k›sa dalga boylu olduklar› için çok az etki etme özelli¤i gösterirler. Bu yüzden UV ›fl›nlar› hava ve yüzeylerdeki mikroorganizma populasyonlar›n›n say›s›n› azaltmak için kullan›l›r. UV ›fl›nlar› gözlere zararl›d›r. Bu yüzden kullan›c›lar taraf›ndan gerekli tedbirler al›nmal›d›r. Yap›lan deneyler sonucunda, UV spektrumunda en etkin dalga boyunun, her bir mikroorganizma cinsi için farkl› oldu¤u saptanm›flt›r. E. coli, Yersinia enterocolitica, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Serretia ve Proteus cinsi Gram negatif bakteriler radyasyona karfl› en hassas olanlard›r. Gram pozitif bakterilerinse bir k›sm› radyasyona direnç gösterirken, bir k›sm›ysa dirençsizdir. Sporlar, radyasyona karfl› oldukça dirençlidir. Mayalar radyasyondan, hücrelerin diploid ya da haploid olufluna göre farkl› flekilde etkilenirler. UV ›fl›nlar›yla sterilizasyon UV lambalar›yla sa¤lan›r. Ticari UV lambalar› 260 nm dalga boyunda ›fl›k ç›kar›r. UV etkisi, lamabayla steril edilecek materyal aras›ndaki uzakl›¤›n karesiyle ters orant›l›d›r. UV ›fl›nlar› hücre içindeki nükleik asitlere etki ederek, hücrenin metabolik faaliyetlerini bozarlar ve hücrenin ölümüne neden olur. Hücre mutasyona u¤rayarak da canl› kalabilir. Ancak bu mutasyona u¤rayan hücreler günefl ›fl›¤›na maruz b›rak›l›rsa bir baflka onar›m mekanizmas› ile normal haline dönebilirler. UV ›fl›nlar›, mikroorganizmalar›n kontrolü yan›nda mutasyona neden olduklar› için, mikroorganizmalar›n ›slah›nda kullan›l›r.

‹yonize Radyasyon X ›fl›nlar› ve _ (gama) ›fl›nlar› bu grupta yer al›r. X ›fl›nlar›n›n dalga boyu 100 A°’ dan, γ ›fl›nlar›n›n dalga boyuyla 1 A°’ dan daha k›sad›r. Bu ›fl›nlar, moleküllerden elektron kopararak, onlar›n iyonlaflmalar›na neden olur. Çok yüksek penetrasyon özelli¤ine sahiptirler. Bu ›fl›nlar polietilen yada sentetik maddelerden yap›lm›fl cihazlar›n, malzemelerin, steril edilmesinde, besin ve ilaç endüstrisinde kullan›lmaktad›r. Biyolojik materyallerin sterilizasyonunda iyonize ›fl›nlar›n kullan›lamas› “so¤uk sterilizasyon” olarak adland›r›l›r. Çünkü; bu ifllemlerde çok az ›s› oluflur. X ›fl›nlar› üretildikleri merkezden her yöne do¤ru yay›ld›klar› için, uygulay›c›lar›n çok dikkatli olmalar› gerekir. γ ›fl›nlar› çok derin nüfuz etme özelli¤i nedeniyle büyük hacimli maddelerin içinde yada üzerindeki mikroorganizmalar›n öldürülmesinde kullan›l›rlar. Bu ›fl›nlar›nda çal›flanlara zarar verebilece¤i unutulmamal›d›r. Etkin penetre özelliklerinin yan› s›ra, uygulay›c›lara verebilecekleri zarar nedeniyle bu ›fl›nlar›n kullan›m alanlar› s›n›rl› olmufltur. Katod Ifl›nlar› : Yeterli fliddette uyguland›¤›nda germisidal etkiye sahip ›fl›nlard›r. Kolay üretilirler ama, penetrasyon güçleri zay›ft›r. Uygulad›klar› maddeyi çok k›sa sürede sterilizasyona u¤rat›rlar.

39

40

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Fotooksidasyon : Bir bakteri populasyonu, belirli bir süre, kuvvetli bir ›fl›¤a maruz b›rak›l›rsa bakterilerin, hücrelerinde yer alan riboflavin ve porfinlere ›fl›¤›n etkisi sonucu ölürler. Fluoresan (rose, bengal, metilen blue vb.) boyalar boyanan mikroorganizmalar, kuvvetli ›fl›k alt›nda tutulursa boyalar ›fl›ktan enerji absorbe eder. Bu enerjiyi fluoresan ›fl›¤a çevirir ve bitiflik protein molekülüne aktar›r. Proteinler de bu enerjiyle okside olur ve hücre ölür. Sonik Radyasyon : Ultrasonik dalgalar›n bakterisidal etkisi vard›r. Bu ses dalgalar›, 200.000 sayk›l›n (titreflim menzil birimi) üzerinde titreflim yapan ses dalgalar›d›r. Ultrasonik ses dalgalar›, s›v› içindeki mikroorganizmalara uyguland›¤›nda hücreler y›rt›lmakta ve içerikleri a盤a ç›kmaktad›r. Bu metod mikroorganizmalar›n öldürülmesinden ziyade, hücre çeperi ve hücre içi yap›lar›n, enzimlerin ekstraksiyonunda kullan›lmaktad›r.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: CANLI BAKTER‹ PREPARATLARININ ‹NCELENMES‹ VE M‹KROORGAN‹ZMALARIN M‹KROSKOB‹K ÖLÇÜMÜ Canl› bakterileri incelemek için en uygun yöntem, “as›l› damla” ya da “yafl preparasyon” yöntemleridir. Bu yöntemlerde bakteriler, çeflitli s›v›lar (su, tuzlu su, broth gibi) içerisinde süspanse edilerek “as›l› damla” ya da “yafl preparasyonlar›” lar› haz›rlan›r. Bu yöntemleri kullan›larak bakterilerdeki hareket olay› rahatl›kla gözlenebilmektedir. Bakteriler hareketli ya da hareketsiz olabilir. Hareket olay› da aktif ya da pasif olarak gerçekleflebilmektedir. Aktif hareket, hareket organeli flagella ile sa¤lanmaktad›r. Flagella bulunmayan bakterilere “atrik” denilmektedir. Hücrede tek bir flagellum varsa “monotrik” flagellum, hücrenin iki ucundaysa “amfitrik”, hücrenin bir yada iki ucunda iki ve daha fazlaysa “löfotrik”, hücrenin her taraf›ndaysa “peritrik” ad› verilmektedir. Bakteriler aktif hareketle yer de¤ifltirirler. Pasif hareketse titreflim fleklinde kendini göstermektedir. S›v› moleküllerinin bakteri üzerine yapt›¤› moleküler bombard›manla aç›klanabilir. Pasif harekette bakteri yer de¤ifltirmez ancak titreflim hareketi yapar. Bakterilerde flagellum bulunup bulunmad›¤› flagella boyama yöntemiyle ortaya konabilece¤i gibi, bakterilerin hareket edip etmedikleri “as›l› damla” ve “yafl preparasyon” yöntemleriyle gözlenebilmektedir.

Uygulama 1: As›l› Damla Yöntemi Amaç: Bakteri hareketini as›l› damla yöntemiyle incelemek. Materyal: 24-48 saat’lik Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus kültürleri. Mikroskop, sedir ya¤›, çukur lam, lamel, vazelinparafin,kar›fl›m öze,bek alevi, kurutma ka¤›d›, ksilol ‹fllem: 1. Temiz bir lamelin ortas›na bir damla bakteri süspansiyonu koyunuz. 2. Çukur lam› alevden geçirdikten sonra çukur k›sm›n etraf›na vazelin-parafin kar›fl›m›ndan sürünüz.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

3. Lameli ters olmak üzere, kültür süspansiyonu çukur k›sm›n ortas›na gelecek flekilde lam üzerine kapat›n›z. 4. Yüksek büyütme güçlü objektifle damlac›¤›n kenar k›sm›n› inceleyiniz.

Çukur etraf›na vazelin sürülür.

Bir öze dolusu bakteri kültürü lamelin ortas›na aktar›l›r.

Çukur lam lamelin üzerine kapat›l›r.

As›l› damla preparasyonu haz›rlanm›fl olur.

Uygulama 2: Yafl Preparasyon Yöntem Amaç: Bakteri hareketini yal preparasyon yöntemiyle incelemek. Materyal: 24-48 saat’lik Escherichia coli, Proteus vulgaris, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus kültürleri. Mikroskop, sedir ya¤›, çukur lam, lamel, vazelin parafin,kar›fl›m öze,bek alevi, kurutma ka¤›d›, ksilol ‹fllem: 1. Temiz bir lam üzerine bir damla sedir ya¤› damlatarak lamel büyüklü¤ünde yay›n›z. 2. Yine temiz bir lamelin ortas›na bir damla bakteri süspansiyonu koyunuz. 3. Lameli kültür altta kalacak flekilde çevirerek lam üzerine yay›lm›fl olan sedir ya¤› üzerine oturtunuz. 4. ‹mmersiyon objektifi ile en az ›fl›kland›rma durumunda bakteri hareketini gözleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar: Bakteri hareketini inceleyerek, hareket yönlerini gözlemleyerek çiziniz. Tart›flma: Hareketin saptanmas›nda kullan›lan iki yöntemi karfl›laflt›r›n›z.

Mikroorganizmalar›n Mikroskobik Ölçümü Mikroorganizmalar cinslerine ve çevresel faktörlerin etkisine göre farkl› boyutlarda olabilmektedirler. Genel olarak boyama ve tespit ifllemleri s›ras›nda, büzülme gösterdikleri gibi, baz›lar› da yetifltirildikleri besi yerinin bileflimine göre, büzülme

41

42

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

gösterebilmektedir. Bunun yan›nda genç hücreler yafll› hücrelerden daha uzundur. Kok fleklindeki mikroorganizmalar›n büyükü¤ü çaplar›n›n ölçümü ile sa¤lan›r. Çubuk fleklindeki bakterilerin uzunluklar› ve genifllikleri ölçülür. Mikroorganizmalar›n boyutlar›n›n ölçülmesinde oküler mikrometre ve objektif mikrometre kullan›lmaktad›r. Ölçü birimi mikron olup “µ” iflaretiyle gösterilir. Oküler mikrometre, 2 cm çap›nda ve üzerinde 100 bölme bulunan daire flekilli ince bir camd›r. Objektif mikrometreyse 10 µ’luk 100 eflit bölme içeren özel bir lamd›r.

Uygulama Mikroorganizmalar›n Boyutlar›n›n Ölçülmesi Amaç: Mikroorganizmalar›n uzunluk, genifllik ve çaplar›n›n mikroskopta ölçümü. Materyal: 24-48 saat’lik Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus kültürleri. Mikroskop, oküler mikrometre, objektif mikrometre, lam, lamel, immersiyon ya¤›, kurutma ka¤›d›, ksilol. ‹fllem: 1. Yuvarlak ve ince camdan yap›lm›fl olan, üzerinde 1/10 mm bölmeleri bulunan oküler mikrometreyi, okülere yerlefltiriniz. 2. Mikroskop tablas›na 1/100 mm bölmeli olan objektif mikrometre yerlefltirilir. 3. Kullan›lacak objektif seçilir 4. Kaba ve ince ayar vidalar›yla objektif mikrometrenin bölme çizgilerini bularak netlefltiriniz. 5. Objektif mikrometrenin bafllang›ç çizgisiyle oküler mikrometrenin s›f›r noktas›n› çak›flt›r›n›z. 6. Bundan sonra, her iki mikrometrenin bölmelerini takip ederek, üst üste çak›flan iki çizgiyi bulunuz. 7. Her iki mikrometrede de çak›flma noktas›na kadar olan çizgileri say›n›z. 8. Oküler mikrometrenin bir bölmesinin kaç mikron oldu¤unu afla¤›daki flekilde hesaplay›n›z. Oküler mikrometrenin 10 çizgisi 1 objektif mikrometre çizgisiyle çak›fl›rsa, Bir objektif çizgi aral›¤› 10 µ oldu¤una göre, Oküler mikrometrenin 1 çizgi aral›¤› 1/10 x 10 µ olur. Yani oküler mikrometrenin 1 çizgi aral›¤› 1 µ’ye eflit olur. Buna oküler bölmenin kalibrasyon faktörü denir. 9. Mikrometre ayarlamas› yap›ld›ktan sonra objektif mikrometreyi mikroskop tablas›ndan kald›r›n›z. 10. Usülüne uygun preparat haz›rlay›n›z. 11. Preparat› mikroskop tablas›na yerlefltiriniz. 12. Ölçülmesi istenen mikroorganizmay› oküler mikrometrenin çizgileri aras›na getiriniz. 13. Mikroorganizman›n kaç oküler mikrometre çizgisi kapsad›¤›n› bulunuz. 14. Mikroorganizman›n boyunu afla¤›daki flekilde bulunuz. Mikroorganizma boyu= Kapsad›¤› oküler mikrometre bölme say›s› X Kalibrasyon Faktörü

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Gözlem ve Sonuçlar: 1. Oküler mikrometrenin bir çizgi aral›¤›n›n kaç mikron oldu¤unu bulunuz. 2. ‹nceledi¤iniz mikroorganizmalar›n boyutlar›n› kaydediniz. Tart›flma: 1. Bütün objektifler için tek bir kalibrasyon de¤eri kullan›labilir mi? Neden? 2. Boyanm›fl ve boyanmam›fl hücrelerde boyutlar fark eder mi?

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: M‹KROORGAN‹ZMALARIN KÜLTÜR ED‹LMES‹ Uygulama 1: Besiyeri Haz›rlanmas› Mikroorganizmalar›n toprak , su, hava, yiyeceklerimiz ve canl› vücutlar› da dahil her yerde bulundu¤unu biliyoruz. Mikroorganizmalar›n izole edilerek ço¤alt›lmas› için kullan›lan besiyerleri genellikle do¤al yaflam flartlar›na yak›n özelliktedir. Besiyerlerini haz›rlarken dikkat etmemiz gereken konular vard›r: 1. Besiyeri formülüne giren maddeler ya ayr› ayr› tart›larak ya da haz›r ticari besiyeri ise do¤rudan tart›larak distile su içinde çözündürülür. 2. Besiyerine otoklavda sterile edildi¤inde bozulacak vitamin, üre, çeflitli flekerler gibi katk› maddesi ilave edilecekse bunlar, membran filtrasyon yöntemiyle steril edildikten sonra ilave edilirler. Kan gibi katk› maddeleriyse otoklavlanamayaca¤› ve membran filtreyle de steril edilemeyece¤i için, sa¤l›kl› hayvandan steril koflullarda al›nma zorunlulu¤u vard›r. 3. Besiyeri haz›rlanacak cam malzemenin çok iyi temizlenmifl ve kuruttulmufl olmas› gerekmektedir. Haz›rlanacak besiyeri için hacminin 2 misli hacimde cam kap kullan›lmal›d›r. 4. Maddelerin tart›m›nda 0.01 g duyarl›l›kta terazi yeterlidir. Tart›m s›ras›nda toz bulutu oluflturmamal›, maddeler deriye ve göze de¤dirilmemelidir. 5. Gerekli suyun 1/3’ü besiyeri haz›rlanacak kaba konulmal›, maddeler bu su içinde eritilip kalan s›v›, balonun bo¤az›nda kalm›fl besi yerinin y›kanarak afla¤› indirilmesinde kullan›lmal›d›r. Agarl› besiyeri bileflimleri; agar›n tam erimesi için sürekli kar›flt›r›l›p kaynama s›cakl›¤›na getirilmesiyle, küçük kaplara da¤›t›l›p steril edilebilir. 6. Sterilizasyondan sonraki pH çok önemlidir. Sterilizasyon sonras› pH ayarlamas› gerekliyse, aseptik koflullarda al›nan belli bir hacimdeki besiyerine, titrasyon ile pH ayarlamas› yap›l›r. Orant›yla as›l besiyerine ilave edilecek asit (1 N HCl) yada baz (1 N NaOH) miktar› hesaplan›r. 7. Besiyerlerin sterlizasyonu otoklavda yap›lmaktad›r. Besiyeri haz›rland›ktan hemen sonra steril edilmelidir. Aksi takdirde içinde mikroorganizma ço¤alabilir ve ortam›n pH’s›n› de¤ifltirebilir. Otoklavlama süresi; besiyerinin hacmi, besiyerinin bulundu¤u cam kab›n kal›nl›¤› ve besiyerinin agarl› olup olmad›¤›yla ba¤lant›l›d›r. Besiyerlerinin sterilizasyonu için genellikle otoklavda 121 °C de 15-20 dakika süre yeterli olacakt›r. 8. Vidal› kapakl› tüpler ve flifleler içinde besiyeri otoklavlanaca¤› zaman tüm kapaklar gevflek b›rak›lmal›, sterilizasyondan hemen sonraysa s›k›ca kapat›lmal›d›r. Ancak çok s›cakken kapat›l›rsa vakum oluflabilir ve kullanma esnas›nda havadan vakum yapabilir. Otoklavda sterilizasyonun baflar›l› olup olmad›¤› indikatör band› kullan›larak tespit edilebilir.

43

44

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Amaç: Genel amaçl› (Nütrient agar ve Nütrient Broth), Selektif (Eozin Metilen Blue agar) ve Diferansiyal (kanl› agar) Besiyerleri haz›rlamak. Materyal: Formül besiyerleri: Nütrient agar, Nütrient broth, Eozin Metilen Blue (EMB) agar, kan, cam erlen ve tüpler, Petri plaklar›, pamuk, alimünyum folyo, otoklav indikatör band›. ‹fllem: • Nütrient agar ve nütrient broth besi yerlerini, üretici firman›n belirtti¤i flekilde tart›n›z. • Nütrient agar (NA) besiyerini, agar eriyene dek ›s›t›n›z. Bir k›sm›n› tüplere 5 ml halinde paylaflt›r›n›z, bir k›sm›n› erlende b›rak›n›z. • Nütrient broth (NB) besiyerini tüplere 5 ml halinde paylaflt›r›n›z. • Kanl› agar bileflimindeki maddeleri tart›n›z: a. 100 ml final hacim için nütrient agar tart›n›z. b. Üzerine 95 ml distile su ilave ederek otoklavlay›n›z. 2. EMB agar besiyerini üretici firman›n belirtti¤i flekilde tart›n›z. • Tüm besiyerlerini 121 °C de 15 dakika steril ediniz. • NA tüplerini 45 derece e¤imle yat›r›n›z ve kat›laflmaya b›rak›n›z • NA ve kanl› agar erlenlerini 45-50 °C’ de su banyosuna b›rakarak so¤umas›n› bekleyiniz. • 45-50 °C’ de (el yakmayacak) bekletilen NA besi ortam›n› steril kabin içinde Petri plaklar›na 15-20 ml olacak flekilde paylaflt›r›n›z. Paylaflt›rma ifllemlerini tercihen steril kabin içinde, steril kabinin bulunmad›¤› ortamlarda bek alevinin alt›nda gerçeklefltiriniz. • Kanl› agar için haz›rlad›¤›n›z NA içeren erlene steril flartlarda 5 ml kan (tavflan, koyun, insan) ilave ediniz. • Erleni kan›n homojen flekilde kar›flmas› için yavaflça çalkalay›n›z ve petrilere paylaflt›r›n›z • Steril kabin içindeki Petri plaklar›n› besi ortamlar›n› kat›laflana dek kapaklar› yar› aç›k bekletiniz (fiekil.2.5). • Petrilerde besiyerlerinin kat›laflt›¤›ndan ve kapaklar›nda su buhar› kalmad›¤›ndan emin olunuz. Besiyerlerini ya hemen kullan›n›z yada kullanana dek 4 °C’de (buzdolab› s›cakl›¤›) bekletiniz. fiekil 2.5 Petri pla¤›ndaki besi ortamlar›n›n kat›laflana dek kapaklar› aç›k bekletilmesi.

Gözlem ve Sonuçlar: 1. Haz›rlad›¤›n›z bütün besiyerlerini renk bak›m›ndan karfl›laflt›r›n›z. 2. Haz›rlad›¤›n›z besiyerlerin bilefliminde bulunan maddeleri karfl›laflt›r›n›z.

Tart›flma: 1. Kanl› agar besiyerinin ne amaçla ve hangi mikroorganizmalar için kullan›ld›¤›n› tart›fl›n›z. 2. EMB agar besiyerinin ne amaçla ve hangi mikroorganizmalar için kullan›ld›¤›n› tart›fl›n›z.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Saf Kültür Eldesi ve Mikroorganizma ‹nokülasyon (Ekim) Teknikleri ‹nokülasyon (ekim yada afl›lama), incelenecek örne¤in steril bir besiyeri üstüne ya da içine, aktarma tekniklerinden yararlan›larak, uygun bir flekilde aktar›lmas› olay›d›r. Saf kültür; besiyerinde yaln›zca tek bir mikroorganizma türü üretilmifl kültürlerdir. Saf kültür eldesi genel olarak iki flekilde gerçeklefltirilir. 1. Çizgi ekim yöntemi ile, 2. Yayma plak yöntemi ile. Besiyerleri için Petri pla¤› tercih edilir, çünkü; besiyeri yüzeyi daha genifltir. Böylece ekim yap›lan örnekteki mikroorganizma hücreleri, bu genifl yüzeye rahat yay›larak, inkübasyon an›nda ayr› ayr› geliflir ve ayr› ayr› koloni olufltururlar. Ekimlerin ard›ndan Petri plaklar› inkübe edilir. ‹nkübasyon sonras› Petri pla¤›nda oluflan koloniler incelenir ve birbirlerine hiç temas etmeyen ayr› özellikteki koloniler seçilir, öze yard›m›yla istenirse s›v› bir besiyerine aktarma yap›l›r (adaptasyon ve canland›rma amac›yla). Bu aflamada koloniler birbirlerine çok yak›nsa i¤ne öze tercih edilmelidir. ‹nkübasyonu takiben elde edilecek kültürden uygun bir kat› besiyerine (genellikle tüpteki yat›k agarl› besiyerine) tekrar aktarma yap›larak, inkübasyon ifllemi gerçeklefltirilir. ‹nkübasyon sonras›nda da saf kültür elde edilmifl olur. Bu kültürün saf olup olmad›¤›n› kontrol etmek için, buradan tek koloni düflürme tekniklerinden birisi (çizgi ya da yayma) kullan›larak, Petri pla¤›ndaki agarl› besiyerine ekim yap›l›r ve inkübasyon sonras›nda besiyeri yüzeyinde geliflen koloniler flekil, yap›, büyüklük, renk vb. özellikleri yönünden incelenir. Farkl› özelliklere sahip kolonilerin varl›¤› gözlendi¤inde, kültürün kar›fl›k olmas›ndan flüphelenir. ‹nokülasyon esnas›nda flunlara dikkat edilmelidir: 1. Öze ve pipet gibi gereçler mutlaka steril olmal›d›r. Hiçbir flekilde, incelenecek olan örne¤e yada aktarma yap›lacak olan steril besiyerine sterilize edilmemifl öze veya pipet dald›r›lmamal›d›r. 2. Aktarma ifllemi tamamland›ktan sonra pipetler, do¤rudan içinde dezenfektan çözeltisi bulunan uygun bir kaba konmal›d›r. Özeyse ifllem bittikten sonra tekrar alevde tutularak sterilize edilmelidir. 3. Aktarma ifllemleri gerçeklefltirilirken gerek aktar›lacak örne¤i, gerekse aktarma yap›lacak steril besiyerini içeren tüp yada erlen gibi cam kaplar›n a¤›z k›s›mlar›, ifllemler öncesi ve sonras›nda ayr› ayr› olmak üzere mutlaka bek alevinden geçirilmelidir. 4. Alevden geçirme an›nda, tüp, balon veya erlenmayer gibi kaplar›n a¤›zlar›ndaki kapak,pamuk t›kaç öze ya da pipet tutan elin parmaklar›yla ç›kar›lmal› ve kontaminasyon kayna¤› olabilecek yüzeylere temas ettirilmemelidir. 5. Aktarma ifllemi seri bir flekilde gerçeklefltirilmelidir. Mikroorganizmalar›n besiyerlerine aktar›lmas›nda halka öze, i¤ne öze, drigalski özesi, cam pipet, mikropipet gibi araçlar kullan›labilir (fiekil 2.6). ‹¤ne öze çok küçük bakteri kolonileriyle misel oluflturan küflerin inokülasyonu için tercih edilmektedir.

45

46

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

fiekil 2.6 Mikroorganizmalar ›n besiyerlerine aktar›lmas›nda kullan›lan halka öze, i¤ne öze, drigalski özesi, cam pipet, mikropipet gibi araçlar.

Uygulama 1: S›v› Besi Yerine ‹nokülasyon Amaç: Mikroorganizmalar› s›v› besi yeri içeren tüplere inoküle etmek. Materyal: 24 saat’lik Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus kültürleri. Kat› besiyeri içeren petri, tüp ve s›v› besi yeri içeren tüpler. Öze,bek alevi, etüv. ‹fllem: 1. Önce aktaraca¤›n›z s›v› kültürü iyice çalkalay›n›z. Kat› kültürlerde böyle bir iflleme gerek yoktur. Çalkalama ifllemini elinizle ya da vorteksle yap›n›z (fiekil 2.7). 2. Tüpü sol elinizle tutup, sa¤ elinizle özeyi bek alevinde akkor haline getirerek steril ediniz (fiekil 2.7). 3. Daha sonra özeyi alev çat›s› alt›nda 10-15 saniye tutarak so¤utunuz. E¤er so¤utma ifllemi baflar›l› olmazsa öze ucuna de¤en mikroorganizmalar yanarak ölebilir. 4. Sa¤ elinizin serçe parma¤›yla sol elde tutulan tüpün a¤z›ndaki kapa¤› (pamuk t›kaç) al›n›z (fiekil 2.7). E¤er bir Petri pla¤›ndan örnek alacaksan›z, Petri pla¤›n› sol elin ayas›na yerlefltiriniz ve bu elin bafl ve iflaret parma¤›yla kapak k›sm›n› kavray›n›z. ‹flaret parma¤› destek vazifesi görürken bafl parmak arac›l›¤›yla kapa¤› aralay›n›z (fiekil 2.7). 5. Tüpün a¤z›n› alevden geçiriniz ve tüpü hafifçe e¤erek özeyi s›v› kültüre dald›r›n›z. (fiekil 2.7). 6. Özeyi tüpe de¤dirmeden, sadece s›v› kültür içinde hareket ettirerek, özeyle kültürü temas ettiriniz ve d›flar› ç›kart›n›z. Böylece öze halkas› içinde bir film oluflur ve bir öze dolusu örnek al›nm›fl olur (fiekil 2.7). 7. E¤er kat› besi yerinden örnek alacaksan›z, steril öze ucunu mikroorganizman›n ço¤ald›¤› bölgeye yada koloniye temas ettiriniz ve sürerek bir miktar örnek al›n›z (fiekil 2.7). 8. Örnek alma ifllemini bitirdikten sonra, mikroorganizma kültürü içeren tüpün a¤z›n› tekrar bek alevinden geçiriniz ve a¤z›n› serçe parma¤›n›zda tuttu¤unuz kapak ile kapat›n›z. Petri pla¤› için böyle bir iflleme gerek yoktur. 9. ‹fli biten tüpü, tüplü¤e yerlefltiriniz. Boflalan sol elinize, ekim yapaca¤›n›z besiyeri içeren tüpü al›n›z. 10. Sa¤ elinizin serçe parma¤›yla sol elde tutulan tüpün a¤z›ndaki kapa¤› (pamuk t›kaç) al›n›z.

47

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

11. Örnek içeren öze ucunu, besiyeri içeren hafifçe e¤ik konumdaki tüpün içine sokunuz ve besiyeri yüzeyinde tüpün duvar›ndan afla¤› do¤ru sürtme hareketleri yaparak y›kay›n›z. Böylece besiyerine mikroorganizma örne¤inin inokülasyon ifllemi gerçekleflmifl olur. 12. Özeyi tüpten ç›kar›n›z ve bek alevinde tekrar akkor haline gelene dek yakarak steril ediniz. 13. ‹noküle edilmifl tüpleri çalkalamal› etüvde, 37 °C’de 1 gün inkübe ediniz. fiekil 2.7 S›v› besiyerine s›v› kültürden yada kat› kültürden inokülasyon aflamalar›.

1. Vorteksle çalkalama

2. Öze ucunu akkor haline getirme

3. Tüp a¤z›ndaki pamu¤u ç›karma

4. Petri pla¤›ndan örnek alma

5. Tüpten örnek alma

6. Öze halkas›nda film oluflturma

7. S›v› besiyerine inokülasyon

48

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Uygulama 2: Çizgi Ekim ‹le Saf Kültür Elde Eldesi Amaç: Saf kültür elde etmek. Materyal: Kar›fl›k mikroorganizma içeren Petri pla¤› kültürleri, Nütrient agar plaklar›, Nütrient broth tüpleri, öze, etüv.

fiekil 2.8 Çizgi ekim yöntemi ile tek koloni eldesi

‹fllem: 1. Farkl› ortamlardan kat› besiyerlerine yap›lan ekimlerin sonras›nda, farkl› renk ve görünümlerde bakteri, maya ve küf kolonilerin gözlendi¤i plaklardan, saflaflt›r›lmak istenen kolonileri iflaretleyiniz. 2. Birbirine temas etmeyen izole durumdaki mikroorganizma kolonisini, öze ya da transfer i¤nesiyle besi ortam›na (genellikle s›v› besi ortam›na) aktararak, etüvde 37 °C’de 24-48 saat inkübe ediniz (s›v› kültürlerin inkübasyonu için çalkalamal› etüv kullan›n›z). 3. ‹nkübasyon sonras›nda geliflen s›v› kültürden bir öze dolusu kültür al›n›z. Steril agarl› besiyerini içeren Petri pla¤›n› sol elin ayas›na yerlefltiriniz, bu elin bafl ve iflaret parma¤›yla kapak k›sm›n› kavray›n›z. ‹flaret parma¤› destek vazifesi görürken bafl parmak arac›l›¤›yla kapa¤› aralay›n›z. 4. Özeyi bu aral›ktan içeri sokarak, ucunda örnek bulunan özeyi agar yüzeyinin seçilecek bir bölgesine temas ettiriniz. 5. Örne¤i bu bölgede birkaç mm çap›nda yay›n›z. 6. Daha sonra özeyle bu yay›lma alan›ndan bafllayarak çizgi ifllemine geçiniz. Çizgi ifllemi de¤iflik flekillerde gerçeklefltirilebilmektedir (fiekil 2.8). En çok kullan›lan yöntem birbirini 90 derece aç›yla kesen bölgeler oluflturacak flekilde çizgiler çekmektir. Ancak, hangi flekilde olursa olsun, çizgi olay› ilerledikçe örnekteki mikroorganizma say›s› özenin ilk sürüldü¤ü bölgeye göre gittikçe azalacakt›r. Bunun sonucunda da inkübasyonu takiben, son çizgi ifllemlerinin yap›ld›¤› agar yüzeyi bölgelerinde, izole koloniler elde edilebilecek, yani koloniler tek tek düflebilecektir. 7. Ekim yap›lm›fl Petri plaklar›n› etüvde 37 °C’de 24-48 saat inkübe ediniz.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Uygulama 3: Yayma Plak Ekim Yöntemi Amaç: Mikroorganizmalar› inoküle etmek. Materyal: 24 saat’lik Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus s›v› kültürleri, drigalski özesi, % 95’etil alkol beheri, uygun aral›kl› mikropipet, Steril mikropipet uçlar›, bek alevi, at›k kab›, etüv. ‹fllem: 1. Petri kutusundaki kat› besiyeri yüzeyine (yüzey daha önceden kurutulmal›d›r) mikropipetle 0.1 ml miktarda örnek aktar›n›z. 2. Drigalski özesi ad› verilen e¤ik L fleklindeki steril bir cam bageti, yeterli miktarda alkol içeren beher içine bat›rarak alkol ile y›kay›n›z. Bek alevinde alkolün yanmas›n› bekleyiniz. 3. Bek alevinin alt›nda 10-15 saniye tutarak so¤umas›n› sa¤lay›n›z. Drigalski özesi vas›tas›yla örne¤i besiyeri yüzeyine yay›n›z. Bu amaçla drigals ki özesini petri pla¤› yüzeyinde gezdirebilece¤iniz gibi, özeyi sabit tutarak pe ri pla¤›n› da döndürebilirsiniz. 4. Petri kutusunu en az 15 dakika süreyle ters çevirmeden bekletiniz. 5. Daha sonra Petri pla¤›n› ters çevirerek, etüvde 37 °C’de 24-48 saat inkübe ediniz. NOT: Yayma plak yöntemi Genel Mikrobiyoloji Kitab›n›z›n 78. Sayfas›nda resimlerle gösterilmektedir.

Uygulama 4: Dökme Plak Yöntemi Amaç: Mikroorganizmalar› inoküle etmek. Materyal: 24 saat’lik Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus s›v› kültürleri, steril bofl cam petri pla¤›, 45°C’ye kadar so¤utulmufl PCA (Plate Count Agar) besiyeri, 9 ml steril fizyolojik tuzlu su içeren seyreltme tüpleri, Uygun aral›kl› mikropipet, steril mikropipet uçlar›, at›k kab›, etüv ‹fllem: 1. S›v› bakteri kültürlerini vorteksleyerek homojenize ediniz. 2. 1ml bakteri kültürünü 9 ml fizyolojik tuzlu su içeren seyreltme tüpüne aktar›n›z ve dilüsyon serisi haz›rlay›n›z. (NOT: Dilüsyon haz›rlama Genel Mikrobiyoloji Kitab›n›z›n 77. sayfas›nda resimlerle gösterilmektedir). 3. Ekim yap›lacak dilüsyonlar› belirleyiniz (10-1, 10-3, 10-5... yada 10-2, 10-4, 10-6). 4. En büyük dilüsyondan bafllayarak, ekim için seçilen her bir dilüsyondan steril bir pipetle Petri kutusuna 1 ml aktar›n›z. 5. Vakit geçirmeden her bir petriye 15-20 ml miktarda eritilmifl ve 45°C’ye kadar so¤utulmufl besiyerinden dökünüz. 6. Örnek ile besiyerinin homojen kar›fl›m›n›n sa¤lanmas› için, Petri pla¤›na düz bir yüzey üzerinde sekiz hareketi yapt›r›n›z ve agar›n kat›laflmas›n› bekleyiniz. Kar›flt›rma s›ras›nda, agar›n petri kutusundan taflmamas›na özen gösteriniz. 7. Petri pla¤›n› ters çevirerek, s›cakl›¤› ayarlanm›fl bir etüve yerlefltiriniz ve etüvde 37 °C’de 24-48 saat inkübe ediniz.

49

50

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

NOT: Yayma plak yöntemi Genel Mikrobiyoloji Kitab›n›z›n 78. sayfas›nda resimlerle gösterilmektedir. Gözlem ve Sonuçlar: (4 uygulama için verilmektedir) Uygulama 1. ‹nokülasyon yapt›¤›n›z tüpte mikroorganizmalar›n s›v› besi ortam›nda geliflti¤ini nas›l anlars›n›z? Uygulama 2. Saflaflt›rma için seçti¤iniz koloninin özelliklerini not ediniz. Safl›k kontrolünden sonra petride tek düflen koloni özellikleriyle bafllang›çta seçilen koloni özellikleri ayn› m›, karfl›laflt›r›n›z. Uygulama 3. Yayma ekim yapt›¤›n›z petrilerin inkübasyon sonras›n› gözlemleyerek, de¤iflik tipteki kolonileri not ediniz. Uygulama 4. 1. Dökme plak yöntemiyle ekim yapt›¤›n›z petri plaklar›nda mikroorganizma kolonilerini gözledi¤iniz dilüsyon tüpü hangisidir? 2. Dökme plak yöntemiyle ekim yapt›¤›n›z petri plaklar›nda mikroorganizma kolonilerini büyüklük bak›m›ndan karfl›laflt›r›n›z. Tart›flma 1. S›v› kültür içeren tüplerin neden çalkalamal› etüvde inkübasyona b›rak›ld›¤›n› tart›fl›n›z. 2. Saf kültür eldesinde, koloniden direk petri pla¤›na çizgi ekim ile önce s›v› besiyerine inoküle edip, daha sonra petri pla¤›na çizgi ekim yöntemlerinin avantaj ve dezavantajlar›n› tart›fl›n›z. 3. Mikroorganizma inokülasyonu için kullan›lan yayma plak ve dökme plak yöntemlerinin avantaj ve dezavantajlar›n› tart›fl›n›z.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: ANAEROB‹K BAKTER‹LER‹N KÜLTÜR ED‹LMES‹ Mikroorganizmalar hücresel faaliyetleri için, oksijen kullan›m yetene¤ine göre farkl›l›klar gösterirler. Anaerobik mikroorganizmalar oksijen varl›¤›nda üreyip geliflemezler. Çünkü; oksijen, bu mikroorganizmalar üzerinde toksik etki yapmaktad›r. Ancak, anaerobik mikroorganizmalar›n genifl bir aral›kta oksijen tolerans› bulunmakta ve buna göre de fakültatif (istemli) ya da obligat (zorunlu) gibi çeflitli tiplere ayr›lmaktad›rlar. Anaerobik mikroorganizmalar›n kültürünü yapmada iki önemli nokta; ortamdan oksijenin uzaklaflt›r›lmas› (ayr›lmas›) ya da besiyerine indirgen maddeler ekleyerek, besiyerinde negatif bir oksidasyon redüksiyon potansiyelinin oluflturulmas›d›r (Eh -100 mV, -200 mV). Anaerobik kültür yapmada genel olarak, her iki koflul birlikte yap›lmaya çal›fl›l›r. Ancak ortamdaki oksijenin uzaklaflt›r›lmas›n›n, bu yönde daha büyük bir önemi vard›r. Çünkü; Eh’s› -50 mV olan bir besiyerinde dahi, e¤er ortamda oksijen varsa anaerobik bir mikroorganizma gelifliminin inhibe oldu¤u gösterilmifltir. Anaerobik mikroorganizmalar›n kat› besi yerinde kültürü, petri kutular›nda yap›labilmekte ve böylece sonraki izolasyon aflamalar› daha kolayl›kla yap›labilmektedir. Ancak bu yöntem, “anaerobik jar = oksijensiz kavanoz” denilen

51

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

özel bir inkübasyon kab›n› gerektirir (fiekil 2.9). Anaerobik kavanozlar; metal ya da camdan yap›lm›fl, de¤iflik tipleri olan özel kaplard›r. Kavanozun üstünde gaz geçifline izin vermeyecek flekilde kapat›labilen ve belirli fonksiyonlar› olan vanalara sahip bir kapak bulunmaktad›r. Kapakta ayr›ca bas›nç göstergesi de bulunabilmektedir. Ekim yap›lan petri kutular›, birkaç s›ra üst üste olacak flekilde kavanoz içine yerlefltirilir ve kavanoz›n kapa¤› kapat›l›r (kavanoz içine tüpler de yerlefltirilebilmektedir). Kapaktaki hava vanas› kullan›larak, kavanoz içindeki hava boflalt›l›r ve kavanoz içine di¤er bir vanadan hemen oksijen içermeyen bir gaz (hidrojen ya da azot gibi) verilir. Kavanoz içine daha önceden yerlefltirilmifl bir indikatör anaerobik ortam›n oluflup oluflmad›¤›n› ve anaerobik ortam›n devaml›l›¤›n› göstermeye yarar. Ortamdaki oksijenin uzaklaflt›r›lmas› için, daha kolay bir teknikse, kavanoz içine belirli kimyasal madde kar›fl›m›n› (sodyum bikarbonat ve sodyum borohidrit kar›fl›m› gibi) içeren özel bir paket yerlefltirmektir. Kitin a¤›z k›sm› kavanoz içinde aç›larak, içine birkaç ml su eklenir ve kapak hemen s›k›ca kapat›l›r. Poflet içindeki reaksiyon sonucunda hidrojen ve karbondioksit gazlar› oluflur. Kavanozun kapa¤›ndaki katalist (palladium katalist pelletleri) a盤a ç›kan hidrojenle kavanoz içindeki mevcut oksijenin birleflmesi ve su oluflumunu sa¤lar. Böylece oksijen, ortamdan su fleklinde uzaklaflt›r›lm›fl olur. Kavanoza yerlefltirilen metilen mavisi ya da resazürin gibi bir indikatör, kavanoz içindeki oksidasyon redüksiyon potansiyelinin - 50 mV ‘ un alt›na düflüp düflmedi¤ini iflaret eder. Bu yönde yeterli bir düflüfl sa¤land›¤›nda metilen mavisinin rengi indirgenmeye (oksijenin ba¤lanmas›na) ba¤l› olarak maviden renksize, resazürinin rengiyse pembeden beyaza döner. Katalitik aktivite bu indikatörün yan› s›ra kapaktaki bas›nç ölçerle de kontrol edilebilir. Kavanoz, reaksiyon tamamlan›p kontroller gerçeklefltirildikten sonra etüve yerlefltirilerek inkübasyon ifllemine geçilir. fiekil 2.9 Anaerobik kavanoz.

52

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Uygulama: GasPak Sistemi ‹le Anaerobik Kültür Gelifltirme Amaç: Anaerobik mikroorganizmalar› kültür etmek. Materyal: Bacillus cereus, Escherichia coli ve Micrococcus luteus’un ve Clostridium butyricum’un 48 saatlik kültürü. Her grup için 4 Nütrient agar pla¤›, Bunzen beki, öze, GasPak anaerobik sistem ve kitleri. ‹fllem: 1. Kalemle her bir nutrient agar petrisinin alt›n› iki bölüme ayr›l›r. 2. Petri üzerindeki iki bölgeyi, afl›lanacak organizma ad›yla etiketleyin, 3. Steril teknikler kullanarak, pla¤›n her iki bölgesinde etiketlenen bölgeye, her bir test organizmas›n› tek çizgi ekimle afl›lay›n. 4. Hidrojen ve karbondioksit gaz jeneratörlerinin paket ucunu kesin ve GasPak kavanozunun köflesine yerlefltirin. 5. Gaspak kavanozuna ters flekilde petri kutular›n› bir s›ra halinde yerlefltirin. 6. Anaerobik indikatör stribini kavanoza d›flardan görebilecek flekilde yerlefltirin. 7. Bir pipetle gaz oluflumu için gerekli olan 10 ml suyu ilave edin ve h›zl› bir flekilde kapa¤› kapat›n. 8. Kapal› kavanozu 37°C’de 24-48 saat inkübasyona b›rak›n. Birkaç saat inkübasyondan sonra, indikatör stribin anaerobik koflullar belirten renk de¤iflimini gözleyin. 9. Petrilerin ikinci serilerini aerobik koflullarda, ters pozisyonda 37°C’ de 24-48 saat inkübe edin. Gözlem ve Sonuçlar: 1. Gaspak sistem ve aerobik olarak inkübe edilen petri kültürlerinde üreme olup olmad›¤›n› inceleyin, sonuçlar›n›z› kaydedin. 2. Gözlemlerinize dayanarak, her bir test organizmas›n›, oksijen gereksinimlerine göre zorunlu anaerob, istemli anaerob ya da aerob fleklinde s›n›fland›r›n›z. Tart›flma: • Anaerobik kültür oluflturmak için kullan›lan yöntemleri bir tablo halinde belirtiniz ve herbir yöntemin avantaj ve dezavantajlar›n› tart›fl›n›z.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 6: BAKTER‹LER‹N BOYANMASI VE M‹KROSKOB‹K ‹NCELEME Ifl›k mikroskobu kullan›ld›¤›nda, hücrelerin daha iyi görünür hale gelebilmeleri için boyanmalar› gerekir. Hücreler boyanmad›¤›nda, neredeyse saydam olduklar›ndan ancak kritik ayd›nlatma sa¤layabilen tekniklerle yani faz kontrast ya da karanl›k saha mikroskopisiyle en iyi flekilde incelenebilirler. Mikroorganizmalar› boyamak için, çok say›da renkli organik bileflikler (boyalar) mevcuttur. Boyama ifllemi s›ras›nda, hücre içerisindeki ya da yüzeyindeki aktif k›s›mlarla boya aras›nda, iyon de¤ifltirme reaksiyonlar› olufltu¤u san›lmaktad›r.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Bir mikroskop lam›n›n haz›rlanmas›nda (preparat yap›m›nda) en önemli k›s›m, içerisinden ›fl›¤›n geçebilmesi ve dolay›s›yla mikroskopta görülebilmesi için yeterince hücreler toplulu¤u tabakas›n›n lam üzerine yerlefltirilmesidir. Hemen hemen tüm bakteri boyama yöntemleri için ilk olarak, lam üzerinde bir bakteriyel film haz›rlan›r. Haz›rlanan bakteriyel filmin iyi sonuç verebilmesi için, her fleyden önce, kullan›lacak lam›n çok temiz olmas› gereklidir. Bunun için de lamlar kullan›lmadan önce her zaman sabun ve suyla iyice temizlenmeli ve kurulanmal›d›r. Daha sonra lam›n bakteriyel film haz›rlanacak yüzüne birkaç damla %96’ l›k alkol ya da bir damla ksilol sürmeli ve sonra bu yüzeyi bir iki kez alevden geçirip so¤umaya b›rak›lmal›d›r. Böylece, mikroorganizma süspansiyonunun cam›n üzerinde iyice yay›labilbesini önleyecek olan ince ya¤ tabakas› ortadan kald›r›lm›fl olacakt›r. S›v› mikroorganizma kültürü kullan›ld›¤›nda 2-3 öze dolusu al›nmal› ve lam üzerinde ince bir tabaka oluflturacak flekilde yaklafl›k 1-1,5 cm çap›nda bir dairenin alan› kadar yüzeye yay›lmal›d›r. Kat› besiyerinden al›nan kültürlerle haz›rlanan bakteriyel filmlerde karfl›lafl›lan en büyük sorun, çok fazla hücre al›nmas›ndan kaynaklanmaktad›r. Bu nedenle kat› besiyerleri üzerinde geliflen kültürler kullan›ld›¤›nda, özeyle yaklafl›k toplu i¤ne bafl› büyüklü¤ünde bir k›s›m al›nmal›, lam üzerine konulmufl bir damla su içerisinde kar›flt›r›larak lam yüzeyine yay›lmal›d›r. Hücrelerin lama iyice tutunmas› ve boyama ifllemleri s›ras›ndaki y›kamalarla ak›p gitmemesi için, ilk önce havada kurumaya b›rak›l›r ve daha sonra fiksasyon (tespit etme) ifllemine geçilir. Bakteri fiksasyonu için ›s› kullan›l›r. Havada kurumufl olan bakteriyel film lam›n üzerinde kalacak flekilde, lam›n bek alevinin içerisinden 3 kez geçirilmesiyle ›s›yla fiksasyon ifllemi tamamlanm›fl olur. Boyamaya geçmeden önce fiksasyon sonras› lam so¤utulur. Çünkü; s›cak lam üzerine boya çözeltisi uygulan›rsa boya kristalleri oluflur.

Uygulama 1: Mikroskobik Preparat Haz›rlama ve Basit Boyama Basit boyama; bir preparat›n, tek bir boya çözeltisi muamelesiyle bakterilerin renklendirilmesi ifllemi olarak tan›mlanabilir. Basit boyamayla bakteri hücrelerinin morfolojisi ve düzenlenifli ortaya ç›kar›labilir. Fikse edilmifl ve so¤utulmufl preparat›n üzerini örtecek kadar boya çözeltisinden dökülür, kullan›lan boyaya ba¤l› olarak, belirli bir süre beklendikten sonra, fazla boya suyla ak›t›l›p y›kan›r ve daha sonra absorbe edici bir ka¤›tla dikkatlice kurutulur. Hücreler genellikle homojen olarak boyan›rlar, fakat baz› mikroorganizmalarda özellikle metilen mavisi kullan›ld›¤›nda hücre içerisindeki baz› granüller, hücrenin geri kalan k›sm›na nazaran daha koyu olarak boyanabilir. Her bir boya için boyama süresi de¤iflik olup, karbol fuksin için 15-30 saniye, kristal viyole için 2-60 saniye ve metilen mavisi için 1-2 dakika yeterlidir. Amaç: Mikroskobik inceleme için preparat haz›rlamak ve basit boyama yöntemiyle bakterileri ›fl›k mikroskobunda incelemek. Materyal: Bacillus subtilis,, Stapylococcus aureus ve Streptococcus faecalis’ e ait kat› ya da s›v› kültürler, metilen mavisi, kristal violet ve safranin çözeltileri, bunzen beki, öze, lam, cam kalemi, mikroskop.

53

54

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

‹fllem: 1. Preparat haz›rlamak için birkaç lam› temizleyiniz. 2. Lam›n temizlenmifl yüzünün ortas›na küçük bir su damlas› b›rak›n›z. 3. Özeyi bek alevinde steril ediniz. 4. Steril özeyle kültürlerden bir parça al›p, lam›n üzerine koydu¤unuz su damlas› içinde dairesel hareketlerle kar›flt›rarak yay›n›z. Özeyi tekrar steril ederek b›rak›n›z. 5. Haz›rlad›¤›n›z bakteri filmini havada kurumaya b›rak›n›z. 6. Lam üzerindeki bakteri filmi üstte kalacak flekilde lam› 2-3 kez alevden geçirerek tespit ediniz (fiekil 2.10). 7. Kristal violet (15-60 sn.), metilen mavisi (1-1,5 dak.) ve safranin (10-30 sn.) boya çözeltilerinden birinden bakteri filminin üzerine 1 damla damlat›n›z. 8. Kulland›¤›n›z boya için verilen sürede etkiye b›rakt›ktan sonra fazla boyay› hafifçe su alt›nda ak›t›n›z. 9. Haz›rlanan boyanm›fl preparatlar› mikroskobik olarak inceleyiniz. fiekil 2.10 Mikroskobik inceleme için lam üzerinde bakteri preparat›n›n haz›rlanmas›.

SIVI KÜLTÜRDEN

KATI KÜLTÜRDEN

Lamdaki “hedef yuvarlak”

2 öze dolusu organizma içeren s›v› lam üzerine al›n›r.

2 öze dolusu su lam üzerine b›rak›l›r.

Organizma lam üzerine yay›l›r.

Çok az miktarda organizma öze ile su içerisine kar›flt›r›larak lama yay›l›r.

Oda s›cakl›¤›nda kurutulur.

Birkaç kez lam›n alt k›sm› alevden geçirilir. Bu flekilde fiksasyon gerçeklefltirilmifl olur.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Gözlem ve Sonuçlar: 1. Her kültür için en iyi mikroskobik saha görüntüsünü bakterilerin flekillerini yans›tacak biçimde çiziniz. 2. Çizimlerin yan›na afla¤›daki terimleri kullanarak ilgili bakteriyi tan›t›n›z. fiEK‹L: Kok (küre), basil (çomak), filament, spiral. DÜZENLEME: Tekli, çiftli, zincirli, tetrad (dörtlü), salk›m. BÜYÜKLÜK: Çok küçük, küçük, orta, büyük. GEN‹fiL‹K: ‹nce, orta, kal›n. Tart›flma: • Fiksasyon için neden ›s›yla muamele edildi¤ini tart›fl›n›z.

Uygulama 2: Gram Boyama Gram boyama ad›n› bulucusu Dr. Christian Gram’ den almaktad›r ve mikrobiyolojide kullan›lan boyama teknikleri aras›nda en önemli ve en çok uygulanan ay›rt edici bir boyama tekni¤idir. Lam üzerinde tespit edilmifl bakteriyel film üzerine s›ras›yla; kristal violet, iyodür çözeltisi, alkol ve safranin uygulan›r. Kristal violet boyas›n› tutup koyu mor renkte gözükenler “Gram pozitif (olumlu)” ve kristal violeyi ç›kar›p yerine safranin ile boyanarak k›rm›z› renkte gözlenenler “Gram negatif (olumsuz)” olmak üzere iki grup alt›nda toplan›rlar. Gram boyama mekanizmas› çeflitli flekillerde aç›klanabilir. Birinci teoriye göre; Gram pozitif bakteriler lugol ile muameleden sonra hücrede meydana gelen kristal violet ve iyot kompleksini, alkol ile dekolarizasyon sonras›nda hücre d›fl›na b›rakamazlar. Çünkü; alkol hücre çeperindeki suyu alarak uzaklaflt›r›r ve çeperi kurutur ve bu bakteriler mikroskop alt›nda mor-mavi renkli görünürler. Gram negatif bakterilerdeyse hücre çeperindeki ya¤ oran› çok yüksek oldu¤undan (%15-25) alkol, hücre çeperindeki ya¤› belli ölçülerde çözerek hücre çeperinde bir tak›m boflluklar meydana gelmesine yol açar. Kristal violet iyot kompleksi bu boflluklardan hücre d›fl›na ç›kar ve hücre yine bafllang›çtaki haline dönüflür. Bu aflamadan sonra bakteriler, ikinci boya olan safranin ile boyand›klar›nda renkleri pembe k›rm›z› görünmektedir. Bir baflka teoriye göre ise iyot, sadece Gram pozitif bakteri hücreleri içerisinde kristal violet, Mg ve RNA ile birlikte dekolarizasyona dirençli bir kompleks oluflturmaktad›r. Gram negatif bakterilerde bu kompleks oluflmamakta ve kristal violet, dekolarizasyonla hücreden kolayl›kla uzaklaflmaktad›r. Gram negatif bakteriler gram reaksiyonlar›nda ço¤unlukla tutarl› olmalar›na ra¤men, Gram pozitif bakteriler belirli koflullar alt›nda de¤ifliklik gösterebilirler. Örne¤in; baz› Gram pozitif bakterilerin yafll› kültürleri kristal violeti tutma yetene¤ini kaybederler, bu durumda safranin ile boyanacaklar›ndan Gram negatif reaksiyonu gösterirler. Ayn› benzer etki bazen de mikroorganizman›n çevresindeki de¤iflikliklere ya da boyama yöntemindeki ufak de¤iflimlere ba¤l› olarak da oluflabilir. Bu yüzden denenmifl ve oturmufl tekniklere ba¤l› kalmak ve Gram reaksiyonu için her zaman 24 saatlik genç kültürler kullanmak gerekir. Amaç: Gram boyama yöntemini uygulamak. Materyal: Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Enterobacter aerogenes ve E. coli’ nin 24 saatlik kültürleri, kristal violet, safranin, Gram iyodür (lugol) ve alkol (%95’ lik), Bunzen beki, öze, lam, cam kalemi, mikroskop.

55

56

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

‹fllem: 1. Kültürlerden lam üzerinde birer preparat haz›rlay›n›z. 2. Havada kuruyan preparatlar› üç kez alevden geçirerek tespit ediniz ve so¤umaya b›rak›n›z. 3. Preparatlar› önce, filtreden geçirlmifl kristal violetle mikrobiyal film kaplanacak flekilde örtünüz ve bir dakika bekletiniz. 4. Fazla boyay› ak›t›n›z. Bu kez preparatlar› gram iyodür (lugol) çözeltisiyle örtünüz ve bir dakika bekletiniz. 5. Fazla lugolü ak›t›p, alkolle k›sa süre (6 sn.) muamele ediniz. Alkolü damla damla ak›t›n›z. Suyla y›kayarak alkolü uzaklaflt›r›n›z. 6. Son olarak, preparatlar›n üzerini safraninle kaplayarak, 30-45 saniye bekletiniz. 7. Fazla boyay› ak›t›n›z ve suyla yavaflça y›kay›n›z. Tüy b›rakmayan kurutma ka¤›d›yla hafif kurulay›n›z. Havada iyice kuruduktan sonra mikroskobik olarak inceleyiniz (fiEK‹L 2.11). fiekil 2.11 Gram boyama ifllem basamaklar›.

1

4

7

KR‹STAL V‹YOLE

20 saniye

ALKOL ‹LE 10-20 saniye DEKOLOR‹ZASYON

YIKAMA

2 saniye

2

YIKAMA

2 saniye

3

GRAM ‹YODÜR LUGOL

1 dakika

5

YIKAMA

2 saniye

6

SAFRAN‹N

20 saniye

8

KURUTMA

Gözlem ve Sonuçlar: 1. Haz›rlad›¤›n›z preparatlarda, mikroorganizmalar›n flekil, büyüklük, renk ve Gram reaksiyonu yönünden özelliklerini bir tablo halinde kaydediniz. 2. Mikroskopta inceledi¤iniz mikroorganizmalar›n flekil, büyüklük, renk ve Gram reaksiyonu yönünden özelliklerini belirterek çiziniz.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

E coli

Micrococcus luteus

Erteobacter aerogenes

Bacillus cereus

fiekli: Rengi: Gram reaksiyonu

Tart›flma 1. Gram boyama yönteminin basit boyama yönteminden üstünlükleri nelerdir, tart›fl›n›z. 2. Gram boyama yönteminde en önemli ve kritik basamak hangisidir, nedenleriyle tart›fl›n›z.

Uygulama 3: Spor Boyama Baz› bakteriler hücre bafl›na bir tane olmak üzere, kal›n çeperli oval ve oldukça dayan›kl› bir yap› üretme yetene¤ine sahiptirler. Bu dayan›kl› yap›, endospor olarak isimlendirilir. Bacillus ve Clostridium cinslerindeki türlerin hepsi endospor üretme yetenekleriyle özellik kazanm›fllard›r. Endosporun boyutu ve hücre içerisindeki pozisyonu, spor oluflturan türlerin birbirinden ay›rt edilebilmesini sa¤layan belirgin özellikleridir. Endosporlar basit boyama ve Gram boyamada kullan›lan bazik boyalar› (Gram boyamada kullan›lan bütün boyalar baziktir.) içlerine almaya karfl› büyük direnç gösterirler. Bu nedenle, boyama sonucunda sporangium boyan›rken endospor boyanmaz. Böylece endosporlar gözlenebilir hale gelirler. Spor boyamak için genel olarak bazik boya olan malaflit yeflili kullan›lmaktad›r. Boyama s›cak malaflit yeflili ile yap›l›r, böylelikle boya endospor içine kolayl›kla girer. Boya bir kez spor içine girdi¤inde; bu boyan›n, spordan y›kamayla uzaklaflt›r›lmas› zordur. Boyama yap›ld›ktan sonra, preparat so¤utularak y›kan›rsa sporlar yeflil renkli, sporangium ise renksiz kal›r. Endosporlar›n sporangium içindeki konumunu görmek önemli oldu¤undan, preparat daha sonra karfl›t bir boyayla boyan›r. Bu durumda sporangium karfl›t boyan›n rengini al›r, endospor yine yeflil renkli olarak görülür. Amaç: Bakterilerde endopor boyama yöntemini uygulamak. Materyal: Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus cerus ve Clostridium sporogenes’ e ait (48-72 saatlik) kültürler, malaflit yeflili (%5’ lik), safranin(% 0,5’lik) çözeltileri, Bunzen beki, öze, kurutma ka¤›d›, lam, cam kalemi, mikroskop. ‹fllem: 1. Kültürlerden preparat haz›rlay›n›z ve 3 kez alevden geçirerek fikse ediniz. 2. Preparatlar›n üzerini malaflit yefliliyle kaplay›n›z. 3. Preparat› bunzen bekinin üzerinde tutunuz. Buharlaflt›kça boya ilave ediniz (5 dakika).

57

58

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

4. Su ile y›kad›ktan sonra safranin ile 30 sn muamele ediniz. 5. Tekrar suyla y›kay›p, havada kuruttuktan sonra mikroskobik olarak inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar: 1. Boyama sonucunda sporangium k›rm›z›, endospor ise yeflil olarak görülmelidir. ‹nceledi¤iniz mikroorganizma kültürlerinde sporangiumlardaki endosporlar›n pozisyonunu belirleyiniz. Bacillus subulis

Bacillus sphaericus

Clostridium sporogenes

Bacillus cereus

Spor rengi: Vejetatif hücre rengi: Endospor konumu:

Tart›flma 1. Spor boyama esnas›nda ilk boya için neden ›s›yla muamele ifllemi uygulan›r, tart›fl›n›z. 2. Spor boyama esnas›nda 2. boya için neden ›s›yla muamele ifllemi uygulanmaz, tart›fl›n›z.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 7: BAZI METALLER‹N VE K‹MYASAL MADDELER‹N ANT‹M‹KROB‹YAL ETK‹S‹ ‹LE ANT‹B‹YOT‹K DUYARLILIK TESTLER‹ Mikroorganizmalar›n geliflme ve ço¤almas›n› engelleyen maddelere antimikrobiyal madde (antimikrobiyal ajan) denir. Bunlar etkin olduklar› mikroorganizma grubuna göre antifungal, antiviral ve antibakteriyal gibi isimler al›rlar. Bu maddeler boya, deterjan, asit, alkol, fenol, a¤›r metal bileflikleri gibi çeflitli maddeler olabilir. Hastal›klar›n tedavisinde kullan›lan, insan ve hayvan dokular›na zararl› olmadan mikroorganizmalar›n aktivitelerini engelleyen, onlar› öldüren, sentetik ya da canl›lardan elde edilen maddelere kemoterapötik maddeler denir. Bu maddeler sadece hastal›klar›n tedavisinde de¤il, ayr›ca baz› mikroorganizmalar›n tan›s›nda da kullan›l›r. Yukar›da say›lan tüm bu kimyasal maddelerin etkisi, çok say›da faktöre ba¤l›d›r: 1. Konsantrasyon; konsantrasyon artt›kça daha çok ölüm gözlenir. 2. Maruz kalma süresi; süre ne kadar uzarsa, antimikrobiyal aktivite o kadar artar. 3. Mikrorganizman›n çeflidi; bakteri sporlar› en dirençli formlard›r. Ayr›ca kapsüllü bakteriler kapsülsüz bakterilerden daha dirençli, yafll› hücreler genç hücrelerden daha dirençlidir.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

4. Çevre flartlar›: a. S›cakl›k: Hücreler kimyasal maddeyle hücre bileflenleri aras›ndaki kimyasal reaksiyonun bir sonucu olarak öldürülürler. Yüksek s›cakl›k kimyasal reaksiyonlar› h›zland›rd›¤› için, mikrobiyal populasyon h›zla yok edilir. b. pH: ‹fllem s›ras›ndaki pH flartlar› sadece mikroorganizma de¤il ayn› zamanda madde üzerinde de bir etki yapar. Nötral pH (pH 7)’dan sapmalar kimyasal maddeye ba¤l› olarak maddenin iyonize olmas›na yol açar. Bu da kimyasal›n antimikrobiyal aktivitesinin artmas›na ya da azalmas›na neden olur. c. Mikrorganizman›n üzerinde bulundu¤u materyalin çeflidi; hücreler üzerine kimyasal maddenin parçalay›c› gücü organik moleküllerle etkilefliminin sonucudur. E¤er mikroorganizman›n üzerinde bulundu¤u materyal temelde organikse örne¤in; kan ve dokulara ait s›v›ysa, kimyasal madde, bu organik oluflumlara ba¤lan›r ve onun antimikrobiyal aktivitesi de böylece azal›r. Baz› mikroorganizmalar zamanla antimikrobiyal maddelere direnç kazanabilirler.

Uygulama 1: Oligodinamik Etki Çok az miktardaki a¤›r metalin bakteriler üzerine öldürücü etkisi oligodinamik etki olarak adland›r›l›r. Bu etkinin sebebinin hücresel proteinlerin metal iyonlar›na yüksek ilgisi oldu¤u san›lmaktad›r. Ortamdaki metallerin konsantrasyonu milyonda birkaç partikül olmas›na ra¤men hücre içindeki iyonlar›n toplam etkisi nedeniyle bakteriler ölmektedir. Örne¤in; gümüfl difl dolgusu kullan›m›, difllerde ikincil çürümeleri uzun süre önlemektedir. Difl tamir materyali olarak kullan›m›n›n yan› s›ra su ar›t›m›nda, merhem ve yara band›yla kumafl üretiminde de bu etkiden yararlan›lmaktad›r. Amaç: Bak›r, gümüfl, alüminyum gibi çeflitli metallerin oligodinamik etkisini gözlemek. Materyal: 50 °C’lik su banyosunda erimifl halde Nütrient agar, steril bofl Petri plaklar›, pens, alkol, bek alevi, E.coli ve S.aureus bakterilerinin 24 saatlik nütrient broth kültürleri, çeflitli metal diskler (alt›n, gümüfl, alüminyum, bak›r para ya da objeler), pipet uçlar› ve pipetler. ‹fllem: 1. 50 °C’lik su banyosunda erimifl Nütrient agar içeren erlenlere s›v› bakteri kültüründen pipetleyiniz (100 ml besiyerine 1 ml s›v› bakteri kültürü). 2. H›zl› bir flekilde homojen kar›fl›m›n› sa¤lay›n›z. 3. Petri plaklar›na bir tabaka olacak flekilde (15-20 ml) paylaflt›r›n›z ve agarlar› kat›laflmaya b›rak›n›z. 4. Metal diskleri temizleyiniz: a. önce su ve sabunla y›kay›n›z. b. bol suyla durulay›n›z. c. pensle tutarak alkole bat›r›n›z. d. steril distileri suyla tekrar durulay›n›z ve disklerin bek alevi alt›nda kurumas› n› bekleyiniz. 5. Metal diskleri bakteri kültürü içeren petri plaklar›na eflit uzakl›klarda yerlefltiriniz.

59

60

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

6. Disklerin üzerine, tekrar bir tabaka oluflturacak flekilde, bakteri içeren besiyerinden paylaflt›r›n›z. 7. Petri plaklar›n› 35 °C’de 16-24 saat inkübe ediniz. Gözlem ve Sonuçlar 1. ‹nkübasyon sonras› metal diskler etraf›nda inhibisyon zonu oluflup oluflmad›¤›n› kaydediniz. 2. Metal diskleri oligodinamik etkilerine göre karfl›laflt›r›n›z. Tart›flma • Oligodinamik etki prensibinin kullan›ld›¤› bakteri üretmeyen kumafllar›n kullan›m yerlerini nedenleriyle tart›fl›n›z.

Uygulama 2: Baz› Kimyasal Maddelerin Antimikrobiyal Etkisi Rutin uygulamada en çok kullan›lan yöntem disk difüzyon yöntemidir. Kat› besiyeri üzerine saf kültür süspansiyonundan yay›larak ekim yap›l›r ve belirli miktarda antimikrobiyal madde emdirilmifl diskler besiyeri üzerine yerlefltirilir. Bakterinin duyarl› oldu¤u antimikrobiyal madde diski, çevresinde bakteri üremedi¤i için, bir inhibisyon zonu gözlenir. ‹nhibisyon zonlar›n›n çaplar› ölçülerek, farkl› antimikrobiyal maddelerin etkisi karfl›laflt›r›labilir. Amaç: Disk difüzyon yöntemiyle baz› kimyasal maddelerin antimikrobiyal etkisini göstermek. Materyal: Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, E. coli, Pseudomonas aeroginosa ve Proteus vulgaris ‘ in nütrient broth içinde 108 bakteri/ml’lik kültürleri, Nütrient agar içeren petriler, Kimyasal madde (alkol, çamafl›r suyu, bulafl›k deterjan›, emdirilmifl steril ka¤›t diskler, steril pamuklu çubuk, (eküviyon), pens ve milimetre bölmeli cetvel. ‹fllem: 1. ‹çinde nütrient agar bulunan petrileri herbir mikroorganizmaya göre etiketleyiniz. 2. Steril eküviyonu mikroorganizma kültürü içeren tübe sokarak pamu¤un ›slanmas›n› sa¤lay›n›z. 3. Fazla inokulumu uzaklaflt›rmak için, eküviyonu tübün iç taraf›na do¤ru bast›r›n›z. 4. Kültür içeren pamuklu çubu¤u etiketlenmifl petri yüzeyine yay›n›z. 5. Yaklafl›k 5 dakika petrileri dinlendiriniz. 6. Steril pens yard›m›yla kimyasal madde emdirilmifl disklerden ve antibiyotik disklerinden birer tane alarak, birbirinden ayr› olarak petriye yerlefltiriniz (fiekil 2.12). 7. Petrileri 37 °C de 24 saat inkübe ediniz. 8. ‹nhibisyon zon çaplar›n› mm bölmeki cetvelle ölçünüz (fiekil 2.12).

61

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

fiekil 2.12

Kimyasal madde emdirilmifl diskler

Diskleri birbirinden ayr› olarak petriye yerlefltiriniz

Her bir disk üzerine steril disk ile yavaflça bast›r›n›z

‹nkübasyon sonunda her bir inhibisyon zonunu ölçünüz

Gözlem ve Sonuçlar: 1. Herbir petride diskler etraf›nda mikroorganizma üremesini engelleyen bir inhibisyon zonu olup olmad›¤›n› inceleyiniz. 2. Milimetre bölmeli cetvel yard›m›yla ölçtü¤ünüz herbir disk etraf›ndaki inhibisyon zonunun çaplar›n› tablo halinde gösteriniz. 3. Disklerde bulunan herbir kimyasal maddenin aktivite spektrumunu tablo halinde gösteriniz. Tart›flma • Farkl› kimyasal maddelerin antimikrobiyal aktivitesi mikroorganizma grubuna göre neden farkl›l›k gösterir, tart›fl›n›z.

Uygulama 3: Antibiyotik Duyarl›l›k Testleri (Kirby-Bauer Testi) Günümüzde mevcut kemoterapötik ajanlar›n antimikrobiyal etkisi de¤ifliklik gösterir. Baz›s› sadece bir grup mikrooganizma üzerine etkili olur (s›n›rl› etki spektrumu), baz›lar› da çok çeflitli mikroorganizma gruplar›na etkili (genifl etki spektrumu) olabilir. Standart disklere emdirilmifl antibiyotiklerin petri pla¤›nda enfeksiyon etmeni mikroorganizmalar›n geliflimini engellemesine dayal› testlere disk diffüzyon testi ya da “ Kirby-Bauer testi” ad› verilir. Bu yöntem, antibiyotiklerin test edilen mikroorganizman›n gelifliminin engellenmesi sonucunda disk etraf›ndaki inhibisyon zonunun ölçümüne dayal› oldu¤u için, antibiyoti¤in etkilili¤ini göstermede çok h›zl› bir yöntemdir. Bu ifllemde besiyeri olarak Mueller-Hinton agar (pH 7,2-7,4) kullan›l›r. petri plaklar›na paylaflt›r›lan besiyeri kal›nl›¤› bütün plaklarda eflit olmal› ve 5 mm’yi geçmemelidir. Kullan›mdan önce plaklar, oda s›cakl›¤›nda ya da 37°C’de bekletilirse agar yüzeyinde oluflan nemin kurumas› sa¤lanm›fl olur. Petri plaklar›-

Disk difüzyon yöntemi ile antimikrobiyal etkinin belirlenmesi.

62

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

na yayma yöntemiyle mikroorganizma ekilir ve üzerine antibiyotik diskleri yerlefltirilir. ‹nkübasyon sonunda diskler etraf›nda oluflan inhibisyon zonlar›n›n çap› ölçülür ve standarlara göre de¤erlendirilir. Amaç: Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemini ö¤renmek. Materyal: Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, E. coli, Pseudomonas aeroginosa ve Proteus vulgaris ‘ in petri pla¤›ndaki saf 24 saatlik kültürleri, Mueller-Hinton agar içeren petri plaklar›, 5 ml steril fizyolojik su içeren tüpler, 0.5 numaral› McFarland standart›, standart antibiyotik diskleri, steril pamuklu çubuk (eküviyon), pens ve milimetre bölmeli cetvel. ‹fllem: 1. Agar üzerindeki kolonilerden steril flartlarda 1-2 koloni alarak steril fizyolojik su tüplerinde süspansiyon haline getiriniz (fiekil 2.13a). 2. Tüplerin bulan›kl›¤›n› 0.5 numaral› McFarland standart›na göre ayarlay›n›z (108kob/ml). 3. Bakteri süspansiyonuna steril bir pamuklu çubuk dald›r›n›z. Fazla s›v›y› tüpün kenar›na bast›rarak uzaklaflt›r›n›z (fiekil 2.13b). 4. Steril bofl Mueller-Hinton agar petri pla¤› içine eflit olacak flekilde süspansiyonu yay›n›z. 5. Pensin ucunu bek alevinde yakarak steril ediniz ve bakteri hal›s› üzerine antibiyotik diskleri yerlefltiriniz. 5-6 diski bir petri üzerine yerlefltirebilirsiniz. 6. Petrileri 37 °C de 28-24 saat inkübe ediniz. 7. Oluflan inhibisyon zonlar›n›n çap›n› mm bölmeli cetvelle ölçerek de¤erlendiriniz. fiekil 2.13 Kirby-Bauer yöntemiyle disk difüzyon testi aflamalar›: a) bakteri kolonilerinin al›nmas›, b) eküviyon ile bakteri süspansiyonunun al›nmas› ve c) inkübasyon sonras› antibiyotik diskleri etraf›nda oluflan inhibisyon zonlar›.

a

c

b

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Gözlem ve Sonuçlar: 1. Milimetre bölmeli cetvel yard›m›yla ölçtü¤ünüz herbir disk etraf›ndaki inhibisyon zonunun çaplar›n› tablo halinde gösteriniz. Tart›flma 1. Antibiyotiklerde s›nrl› etki ve genifl etki spektrumunun nedenlerini tart›fl›n›z. 2. Baz› mikroorganizmalar, baz› antibiyotiklere, zamanla nas›l direnç kazan›rlar, tart›fl›n›z.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 8: LAM AGLUT‹NASYON TEST‹ Spesifik ba¤›fl›kl›k, konuk oganizman›n antijen ad› verilen belli bir yabanc› madde ile karfl›laflt›¤› zaman ortaya ç›kar. Antijenler konuk içinde antikor ad› verilen homolog maddelerin yap›m›n› stimüle ederler. Bunlar›n fonksiyonu onlar›n üretiminden sorumlu antijenlerin yüzeyine ba¤lanmak ve böylece onlar› parçalamak, inaktif hale getirmektir. Antijenle antikorun birleflmesi çok spesifik bir olayd›r ve in vitro flartlarda antijen-antibadi reaksiyonlar› çal›flmalar› seroloji olarak adland›r›l›r. Serolojik reaksiyonlar, bütün diagnostik immünoloji testlerinin temelidir. Aglutinasyon, belirli bir antijen bu antijene spesifik antibadilerle kar›flt›r›ld›¤›nda meydan gelen gözle görülür p›ht›laflmad›r. Aglutinasyon testleri di¤er baz› serolojik testler kadar hassas olmasa da presipitasyon testlerinden 100 kat daha hassast›r Presipitasyon ise çözünebilir bir antibadinin, çözünebilir bir antijenle reaksiyonundan, çözünmez bir kompleks oluflturmas›d›r.

Uygulama 1: Aglutinasyon reaksiyonu Amaç: Lam üzerinde aglutinasyon reaksiyonunu göstermek. Materyal: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Stapylococcus aureus ve Pseudomonas aeroginosa kültürleri, %0.85 lik NaCl çözeltisi, Salmonella typhimurium H antijeni, ve H antiserumu, bunzen beki, öze, lam, cam kalemi, steril kürdanlar, mikroskop. ‹fllem: 1. Temiz bir lam üzerine cam kalemi yard›m›yla 1 cm çap›nda iki daire çiziniz ve bunlar› A, B ve C fleklinde etiketleyiniz. 2. A yaz›l› bölgeye 1 damla S. typhimurium H antijeni ve 1 damla %0.85 lik NaCl çözeltisinden damlat›n›z. Steril bir kürdan yard›m›yla kar›flt›r›n›z. 3. B yaz›l› bölgeye 1 damla S. typhimurium H antijeni ve 1 damla S. typhimurium H antiserumu damlat›n›z ve steril bir kürdan yard›m› ile kar›flt›r›n›z. 4. C yaz›l› bölgeye 1 damla elinizdeki bakteri kültüründen ve 1 S. typhimurium H antiserumu damlat›n›z ve steril bir kürdan yard›m›yla kar›flt›r›n›z. 5. Lam› iki parma¤›n›z aras›nda tutarak öne arkaya hareket ettiriniz. 6. Lam› önce makroskopik ve daha sonra da mikroskobik olarak inceleyiniz.

63

64

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Gözlem ve Sonuçlar: Afla¤›daki tabloda makroskobik ve mikroskobik olarak aglutinasyon gözleyip gözlemedi¤inizi belirtiniz.

Antijen

Antiserum

S. typhimurium H

S. typhimurium H

E. coli

S. typhimurium H

P. vulgaris

S. typhimurium H

S. aureus

S. typhimurium H

P. aureginosa

S. typhimurium H

Mikroskobik Aglutinasyon (+/-)

Makroskobik Aglutinasyon (+/-)

Tart›flma 1. Elinizdeki bakteri kültürlerinin tümü, neden aglutinasyon pozitif de¤ildir, tart›fl›n›z. 2. Çapraz reaksiyon terimi neyi ifade eder, tart›fl›n›z.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 9: BAZI FUNGUSLARIN KÜLTÜR ED‹LMES‹ VE MORFOLOJ‹K ‹NCELENMES‹ Mikrobiyolojinin funguslarla ilgilenen bölümü mikoloji olarak adland›r›l›r. Funguslar ökaryotik ve besinsel isteklerine göre de çok çeflitli organik maddeyi enzimatik olarak metabolize edebilme yetene¤indeki heterotrof organizmalard›r. Büyümeleri silindirik tüpsü iplikçiklerin (hif) uçlar›ndan olur. Hiflerden meydana gelen y›¤›na misel denir. Baz› funguslarda misel enine bölme çeperli (septal›) baz›lar›ndaysa septas›zd›r. Efleysiz ço¤almalar› genellikle bir hifin ucunda ya da sporangium denen bir kese içinde oluflan sporlarla gerçekleflir. Baz› primitif funguslarda zoospor denilen harketli sporlar bulunabilir. Bir fungus grubu olan mayalardaysa tomurcuklanma yoluyla ço¤alma olur. Di¤er baz› gruplardaysa hifin parçalanmas› (fragmentasyon) yoluyla ço¤alma görülür. Efleyli ço¤almalar›ysa fruktifikasyon denen özel yap›lar içinde mayoz ile oluflan sporlar (askospor, basidiospor) arac›l›¤›yla olur. Hastal›k etmeni (patojenik) funguslar enfekte ettikleri bölgeye göre iki gruba ayr›l›rlar. Superficial (yüzeysel) mikozisler deri, saç ve t›rnak enfeksiyonlar›na neden olurken sistemik mikozisler akci¤erler, genital organlar ve sinir sistemi gibi iç dokularda enfeksiyon oluflturur.

Uygulama 1: Küfler Fungal organizmalar›n büyük bir k›sm›n› oluflturan küfler gözle görülebilir özellikteki yap›lard›r. Genelde septal› hifsel yap›dad›rlar. Efleysiz sporlarla ve fragmentasyon sonucu oluflan yap›larla ço¤alabildikleri gibi, efleyli ço¤alma gösteren türleri de vard›r. Küflerin yap›sal bileflenleri oldukça k›r›lgan yap›da oldu¤u için onlarla çal›flmak özel teknikler gerektirir. Mikrobiyolojik ifllemlerde kullan›lan öze yard›m›yla ekim yapmak, onlar›n yap›s›n›n bozulmas›na neden olur. Bunun için, genellikle

65

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

çukur lam içine besi ortam› konarak, i¤ne özeyle ekim yap›l›r. Fungus sporlar› burada çimlenerek miselyumu olufltururlar. Bu tip preparatlar›n mikroskobik incelemeleri de oldukça kolayd›r. Bu tip çukur lam›n bulunmad›¤› laboratuvarlarda normal lam üzerinde de lam kültürü yap›labilir. Afla¤›daki tabloda, çeflitli funguslar›n koloni morfolojileri ve mikroskobik görüntüleriyle ilgili bilgiler verilmifltir. fiekil 2.14

1

6

2

3

7

4

8

5

9

10

Baz› küflerin mikroskobik görünüflü (Benson: Microbiological Applications Lab. Manual, Eight Edititon, 2001, The McGraw-Hill Companies. 1.Penicillium, 2.Aspergillus, 3.Verticillium, 4.Trichoderma, 5.Gliocadium, 6.Cladosporium, 7.Pleospora, 8.Scopulariopsis, 9.Paecilomyces, 10.Alternaria

Amaç: Küflerin yap›sal bileflenlerini makroskobik ve mikroskobik olarak incelemek. Materyal: Penicillum sp., Rhizopus sp., Aspergillus sp., Alternaria sp. ve Fusarium sp. ‘nin 710 günlük Sabouroud agar kültürleri, laktofenol pamuk mavisi solusyonu, Bunzen beki, transfer i¤nesi, binoküler stereomikroskop, ö¤renci mikroskobu, lam, lamel, alkol. ‹fllem: 1. Petri kaplar› üzerinde geliflen küflerin flekil ve yap›lar›n› önce ç›plak gözle sonra binoküler stereomikroskop yard›m›yla inceleyiniz. 2. Temiz bir lam›n ortas›na bir damla laktofenol pamuk mavisi damlat›n›z. 3. Transfer i¤nesinin ucunu bek alevinde akkor haline getirip, alevden uzaklaflt›rmadan so¤utunuz. 4. Transfer i¤nesi yard›m›yla küf kültüründen küçük bir parça al›n›z ve lam üzerindeki laktofenol pamuk mavisi içinde süspansiyon haline getiriniz. 5. Üzerine Lamel kapat›n›z ve preparat› mikroskopta inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar 1. Makroskobik olarak inceledi¤iniz küflerin herbirinin petri üzerindeki görünümünü ve rengini belirtiniz. 2. ‹nceledi¤iniz küflerin mikroskoptaki görünümünü yap›sal bileflenlerini belirterek çiziniz. Tart›flma • Aspergilloma hastal›¤›n›n etmeni olan küf nedir, hastal›k belirtileri ve tedavisini tart›fl›n›z.

66

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Uygulama 2: Mayalar Mayalar, bakterilerden 5-10 kez daha büyük tek hücreli mikroorganizmalard›r. Morfolojik olarak elips, küresel ve baz› durumlarda silindirik yap›da olabilirler. Baz› mayalar efleyli üreme özelli¤ine sahipse de mayalar›n büyük bir k›sm› efleysiz olarak tomurcuklanmayla (ana hücrenin d›fla do¤ru geliflmesiyle oluflan yavru hücre) ço¤al›r. Candida albicans gibi baz› mayalar patojeniktir ve üriner, vajinal enfeksiyonlara ve halk aras›nda pamukçuk olarak adland›r›lan a¤›z enfeksiyonuna neden olurlar. Amaç: Ö¤rencilerin mayalar›n morfolojik yap›lar›n›n tan›mas›n› sa¤lamak. Materyal: Saccharomyces cerevisiae ‘nin flekerli su içindeki taze kültürü, Laktofenol pamuk mavisi solüsyonu, Bunzen beki, öze, transfer i¤nesi, lam, lamel ve mikroskop. ‹fllem: 1. Lam üzerine 1 damla laktofenol pamuk mavisi solüsyonu damlat›n›z. 2. Bek alevinde k›zd›r›p so¤uttu¤unuz öze yard›m›yla 1 öze dolusu maya kültürü al›n›z. 3. Maya kültürünü homojen hale getirip yay›n›z ve lamel kapatarak mikroskopta inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar 1. Preperat› mikroskopta önce düflük ve daha sonra yüksek büyütmeyle inceleyiniz. 2. Tomurcuklanma olup olmad›¤›n›, büyüklü¤ünü ve fleklini çizerek gösteriniz. 3. Askus oluflumunu büyüklü¤ünü ve fleklini çizerek gösteriniz. Tart›flma 1. ‹nsanlarda patojen mayalar nelerdir, tart›fl›n›z. 2. Maya enfeksiyonlar›nda tedavi nas›l olmaktad›r, tart›fl›n›z.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 10: OTOMAT‹ZE B‹YOK‹MYASAL BAKTER‹YAL TANI TESTLER‹ (API 20E, V‹TEK) API Kitleri ile Mikroorganizma ‹dentifikasyonu Genel Bilgiler Yöntem yar› otomatik bakteri ve maya tan›mlamas›n› içerir. Biyokimyasal metotlar›n kullan›m›na dayal›, kullan›ma haz›r kitlerdir.

Uygulamala : Enterik bakteriler, Stafilokoklar, Streptokoklar, Mayalar, Non Fermenterler, Anaeroblar, Basilluslar, Cornynebakterler, Campylobacterler, Listeria, Lactobasiller için kullan›lmaktad›r.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Api 20 E Rapid 20 E Api 20 NE Api Staph Api 20 Strep Api 20 A Api Listeria Api Coryne Api Campy Api 20 C AUX Api 50 CHB Api 50 CHL Api NH

API K‹TLER‹ Enterikler Enterikler Non Enterikler Stafilokoklar Streptokoklar Anaeroblar Listeria türleri Corinebakterler Campylobakterler Mayalar Basilluslar Laktobasilluslar Neisseria ve Haemophylus

Salmonella, E.coli, Yersinia Salmonella, E.coli, Yersinia Vibrio parahaemoliticus S.aureus, S.intermedius S.fecalis C.perfringens, C.botilinum L.monocytogenes, L.inocua R.equi C.jejuni, C.albicans, B.cereus, B.anthracis Lactobacillus brevis Haemophilus influenzae

API 20 E API 20 E, 21 minyatür hale getirilmifl biyokimyasal test ve veritaban› kullanan Enterobacteriaceae ve zor üremeyen Gram negatif çomaklar için standart hale getirilmifl tan›mlama sistemidir. API 20 E stribi dehidrate substratlar içeren 20 mikrotüpten oluflmaktad›r. Bu testler ortam›n yeniden haz›rlanmas›n› sa¤layan bir bakteriyel süspansiyonla inoküle edilir. ‹nkübasyon s›ras›nda, metabolizma sonucu spontan olarak ya da reaktiflerin eklenmesiyle renk de¤iflimi oluflmaktad›r. Reaksiyonlar, okuma tablosuna göre okunur ve tan›mlama, analitik profil indeksi ya da bilgisayar ortam›nda tan›mlama program› kullan›larak sonuçlar elde edilir. API 20 A The API 20 A sistemi, anaeroblar›n biyokimyasal tan›mlamas› için, h›zla ve kolayl›kla gerçeklefltirilen 21 test içerir. Koloniyal ve mikroskopik morfoloji, gram yayma gibi di¤er testler gerçeklefltirilmeli ve sonuçlar tan›mlamay› do¤rulamak ve tamamlamak için kullan›lmal›d›r. API 20 A stripi dehidrate substratlar içeren 20 mikrotüpten oluflmaktad›r. Besiyerini suland›ran bir bakteriyel süspansiyonla bu testlere ekim yap›l›r. ‹nkübasyon esnas›nda, oluflan metabolitler kendili¤inden ya da ilave reaktiflerle gösterilen renkleri olufltururlar. Reaksiyonlar, Okuma Tablosu’na göre okunur ve tan›mlama, Analitik Profil indeksi ya da bilgisayar tan›mlama program› kullan›larak elde edilir. API 20NE API 20 NE, Enterik olmayan, zor üremeyen gram-negatif çomaklar›n (örne¤in; Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, gibi.) tan›mlanmas› için, 8 geleneksel testi, 12 asimilasyon testini ve bir veritaban›n› kombine eden standartlaflt›r›lm›fl bir sistemdir. API 20 NE stribi, dehidrate madde ve substratlar içeren 20 mikrotüpten oluflmaktad›r. Geleneksel testler ortam›n yeniden haz›rlanmas›n› sa¤layan bir fizyolojik bakteriyel süspansiyonla inoküle edilir. ‹nkübasyon s›ras›nda metabolizma sonucu spontan olarak ya da reaktiflerin eklenmesiyle renk de¤iflimi oluflmaktad›r. Asimilasyon testleri minimal maddeyle inoküle edilir ve bu substratlar› kullanabildiklerinde bakteriler ço¤al›rlar. Reaksiyonlar, Okuma Tablosu’na göre okunur ve tan›mlama, analitik profil indeksi ya da bilgisayar tan›mlama program› kullan›larak elde edilir.

67

68

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

API 50 CHL Medium API 50 CHL Medium, Lactobacillus ve iliflkili cinslerin identifikasyonu için haz›rlanm›fl haz›r bir besiyeridir. API 50 CH stribi ile 49 karbonhidrat›n fermentasyon özellikleri tespit edilebilir. Besiyeri içinde test edilecek mikroorganizmayla bir süspansiyon haz›rlan›r ve stripteki her tüp inoküle edilir. ‹nkübasyon s›ras›nda karbonhidratlar›n fermentasyonuyla asidik ortam oluflur ve buna ba¤l› olarak pH düfler. Bu ortam de¤iflikli¤i indikatörler sayesinde tespit edilir. Bu sonuçlar suflun biyokimyasal profilini ortaya koyar ve tan›mlama ya da tiplemede kullan›l›r. API Listeria API Listeria, Listeria bakterilerini tan›mlayan standardize bir sistemdir. API Listeria stripinde enzimatik testler ya da seker fermentasyonlar›n›n sonuçlar›n› kullanan dehidrate substratlar içeren 10 mikrotüp mevcuttur. ‹nkübasyon esnas›nda, metabolizma kendili¤inden ya da reaktiflerin ilavesiyle aç›klanan renk de¤iflimini meydana getirir. Reaksiyonlar okuma tablosuna göre okunur ve tan›mlama prospektüsteki profil endeksine baflvurarak ya da tan›mlama yaz›l›m› kullanarak elde edilir. API 20C AUX API 20 C AUX en s›k karfl›lafl›lan mayalar›n kesin olarak tan›mlanmas›n› sa¤layan bir sistemdir. API 20 C AUX stripi, 19 asimilasyon testinin performans›n› gösterebilen ve dehidrate substratlar içeren 20 küpülden oluflmaktad›r. Küpüller yar›kat› bir minimal maddeyle inoküle edilir ve mayalar karbon kayna¤› olarak her bir substrat› kullanma kapasitesine sahip olduklar›nda ço¤alabilirler. Reaksiyonlar, kontrollerdeki ço¤almayla karfl›laflt›r›larak okunur ve Analitik Profil ‹ndeksi ya da bilgisayar tan›mlama program› kullan›larak tan›mlama elde edilir API 20 Strep API 20 Strep, genifl bir kapasiteye sahip 20 kimyasal testi kombine eden standartlaflt›r›lm›fl bir metottur. Birçok Streptokok ve enterokok gurup ya da tür düzeyinde tan›mlanmas›n› sa¤lar. API 20 Strep stribi, flekerlerin enzimatik aktivitesi ya da fermentasyonunun belirlenmesi için dehidrate substratlar içeren 20 mikrotüpten oluflmaktad›r. Enzimatik testler, enzimatik substratlar› yeniden hidrate etmek için kullan›lan saf bir kültürden yap›lm›fl, yo¤un bir organizma süspansiyonu ile inoküle edilir. ‹nkübasyon periyodu s›ras›nda ortaya ç›kan metabolik son ürünler spontan olarak ya da reaktiflerin eklenmesiyle ortaya ç›kan renk de¤ifliklikleri meydana gelir. Fermentasyon testleri, fleker substratlar› meydana getiren zenginlefltirilmifl bir madde ile inoküle edilir. Karbonhidratlar›n fermentasyonu pH indikatöründe bir kayma ile saptan›r. Reaksiyonlar, okuma tablosu’na göre okunur ve tan›mlama, analitik profil indeksi ya da bilgisayar tan›mlama program› kullan›larak elde edilir. API Campy API Campy minyatür hale getirilmifl ve özel bir veritaban› kullanan Campylobacter tan›mlayan standardize bir sistemdir. API Campy stripinde dehidrate substratlar içeren 20 mikrotüp vard›r. ‹ki bölümden yap›lm›flt›r. Stripin ilk bölümü (enzimatik ve konvansiyonel testler) substratlar› suland›ran yo¤un bir süspansiyonla ekilir. ‹nkübasyon esnas›nda (aerobik flartlarda), metabolizma kendili¤inden ya da ilave reaktifler eklenerek renk de¤iflikli¤i meydana getirir. Stripin ikinci bölümü

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

(assimilasyon ya da inhibisyon testleri) minimal medium ile ve mikroaerofilik flartlarda ekilir. Bakteri test edilen antibiyoti¤e karfl› direncine veya içindeki subtrat› kullanma kapasitesine ba¤l› olarak ürer. Reaksiyonlar okuma tablosuna göre okunur ve tan›mlama prospektüsteki profil listesine ya da gerekiyorsa, tan›mlama tablosuna baflvurarak, tan›mlama yaz›l›m› kullanarak elde edilir. API Staph API Staph, özel olarak haz›rlanm›fl bir veri taban›yla birlikte standartlaflt›r›lm›fl ve minyatür hale getirilmifl biyokimyasal testler kullanan, Staphylococcus, Micrococcus ve Kocuria türleri için bir tan›mlama sistemidir. API Staph, dehidrate test maddeleri içeren 20 mikrotüp içeren bir stripten oluflmufltur. Bu mikrotüpler, testleri suland›ran, API Staph medyumuyla haz›rlanm›fl bir bakteri süspansiyonuyla ekilir. ‹nkübasyon s›ras›nda, metabolizma kendili¤inden ya da ilave testlerle aç›klanan renk de¤ifliklikleri meydana getirir. Bu reaksiyonlar okuma tablosuna göre okunur ve Analitik Profil ‹ndeksi ya da bilgisayar tan›mlama program› kullan›larak tan›mlama elde edilir. API 50 CHB/E Medium API 50 CHB/E Medium, Bacillus (Bacillus ve ilgili türlerin) ve Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae ve Vibrionaceae) cinslerinin çal›fl›lmas› için gelifltirilmifl kullan›ma haz›r ve API 50 CH stribi ile 49 karbonhidrat›n fermentasyon özelliklerinin çal›fl›labilece¤i bir besiyeridir. Besiyeri içerisine haz›rlanan test edilecek mikroorganizma süspansiyonuyla stripteki her tüp inoküle edilir. ‹nkübasyon s›ras›nda karbonhidratlar›n fermentasyonuyla asidik ortam oluflur ve buna ba¤l› olarak pH düfler. Bu ortam de¤iflikli¤i, indikatörler sayesinde oluflan renk de¤iflimiyle tespit edilir. Sonuçlar suflun biyokimyasal profilini ortaya koyar ve tan›mlama ya da tiplemede kullan›l›r. API 20 E stribi tamamlay›c› olarak API 50 CH stribinde kullan›labilir (Bacillus’lar için opsiyoneldir ancak Enterobacteriaceae için zorunludur). API Coryne API Coryne, minyatür hale getirilmifl ve özel bir veritaban› kullanan 24 saatte coryneform bakterileri tan›mlayan standardize bir sistemdir. API Coryne stripinde karbonhidratlar›n enzimatik aktivitesi ya da fermentasyonunu gösteren dehidrate substratlar içeren 20 mikrotüp vard›r. Enzimatik testler, enzimatik substratlar› suland›ran organizmalar›n yo¤un bir süspansiyonuyla ekilir. ‹nkübasyon esnas›nda, metabolizma kendili¤inden ya da ilave reaktifler eklenerek renk de¤iflikli¤i meydana getirir. Fermentasyon testleri, fleker substratlar›n› suland›ran zenginlefltirilmifl besiyeriyle ekilir (bir pH indikatörü vard›r). Karbonhidratlar›n fermentasyonu pH indikatöründe kendili¤inden renk de¤iflimiyle saptanan asidifikasyona neden olur. Reaksiyonlar okuma tablosuna göre okunur ve tan›mlama Analitik Profil Endekse baflvurarak ya da tan›mlama yaz›l›m› kullanarak elde edilir.

Uygulama 1: API CHL ile ‹dentifikasyon Amaç: API CHL Medium ile Lactobacillus identifikasyonu REAKT‹FLER Kit içeri¤i (10 test) flu flekildedir: - 10 ampul API 50 CHL Besiyeri - 1 adet paket içerik kitap盤›

69

70

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Di¤er materyaller - API 50 CH stripleri - McFarland Standart› no 2 - Densitometre - ‹dentifikasyon yaz›l›m program› (bioMerieux’ye dan›fl›lacak) - Pipetler - Mineral ya¤ - Ampul kutusu - Swaplar - MRS Besiyeri - (Süspansiyon ortam›, 2 ml, ve 5 ml) Gerekli laboratuar ekipman›: - ‹nkübatör (30 °C ya da 37°C) - Bunsen oca¤› - Cam kalemi - Anaerobik inkübasyon sistemi

Süspansiyon Solüsyonu 2 ve 5 ml

Demineralize su

API 50 CHL Besiyeri 10 ml

Polipepton Maya ekstresi Tween 80 Dipotasyum fosfat Sodyum asetat 3H2O

10 g 5g 1 ml 2g 5g

Diamonyum sitrat Magnezyum sülfat 7H2O

2g 0.20 g

Manganez sülfat 4H2O

0.05 g

Bromokresol moru 0.17 g 1000 ml’ye tamamlamak için demineralize su

BES‹YER‹N‹N B‹LEfi‹M‹ STR‹PLER VE BES‹YERLER‹N SAKLANMASI Besiyerleri, paket üzerindeki son kullanma tarihine kadar 2-8°C’de saklanmal›d›r. UYARILAR VE ÖNLEMLER • Sadece in vitro diagnostik kullan›m içindir. • Nitelikli laboratuvar personeli bulafl›c› ajanlardan korunmak için aseptik teknik kullanmal› ve bilinen önlemleri almal›d›r. • Örnekleri a¤›zla pipete çekmeyin. • Son kullanma tarihi geçmifl reaktifleri kullanmay›n. • Buzdolab›ndan ç›kar›ld›ktan sonra kullanmadan önce reaktiflerin oda ›s›s›na (20-30°C) gelmesini sa¤lay›n. • Ampulleri afla¤›daki flekilde dikkatlice aç›n: • Ampulü bir elinizle dik pozisyonda tutun (plastik kapak yukar›ya gelecek

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

flekilde) • Kapa¤› mümkün oldu¤unca afla¤› do¤ru bast›r›n. • Kapa¤›n düzleflmifl k›sm›n› baflparma¤›n›z›n ucuyla kapat›n. • Ampulün kapak içindeki uç k›sm›n›n kopmas› için, baflparma¤›n›zla kapa¤›n düz k›sm›na, d›flar›ya do¤ru bir hareketle bas›nç uygulay›n. • Damlatmal› kapa¤› olmayan ampuller için: - Kapa¤› dikkatlice aç›n›z. • Damlatmal› kapa¤› olan ampuller için: - Ampulu ters çeviriniz ve dik tutunuz. - Kapa¤› s›karak reaktifin, damlal›k fliflesine transferini sa¤lay›n›z. • Tüm inoküle ürünler bulafl›c› olarak kabul edilmeli ve dikkatlice kullan›lmal›d›r. • Tüm hasta materyalleri ve mikrobiyal kültürler potansiyel infeksiyon kayna¤›d›r ve genel tedbirlere uygun olarak muamele edilmelidir. • Tüm testler, okuma ve yorumlamas› tamamland›ktan sonra, tüm örnekler ve inoküle edilmifl malzemeler otoklavlanmal›, yak›lmal› ya da antiseptik içerisine konarak imha edilmelidir. Kolonilerin seçimi • Saf sufl ile çal›flt›¤›n›za emin olunuz. • Bu saf suflun MRS agar besiyerinde kültürünü yap›n ve aerobik olarak 24 saat süreyle 30°C ya da 37°C’de inkübe edin. ‹nkübasyon ›s›s› suflun kayna¤›na göre de¤iflir. • Laktik bakteri grubuna ait olup olmad›¤›n› kontrol edin: Gram (+), katalaz (-), spor oluflturmayan, anaerobik (fakültatif ya da nadiren zorunlu) çomaklar, MRS agarda ço¤alanlar. • E¤er stok kültürler (dondurularak kurutulmufl ya da yat›k yüzeyde saklanm›fl) kullan›l›yorsa MRS agarda izolasyondan önce iki kez, MRS s›v› besiyerinde sub kültür (alt kültür) yap›n. Stribin haz›rlanmas› API 50 CH paket içerik kitap盤›na bak›n›z. ‹nokulumun haz›rlanmas› • E¤er Dansitometre kullan›l›yorsa: - ”Uyar›lar ve Önlemler” bölümünde belirtildi¤i gibi bir API 50 CHL Medium ampülünü (damlal›¤› olmayan ampul) aç›n. - Bir kaç tane eflde¤er koloniyi seçin ve bir ampul API 50 CHL içinde 2 McFarland’a eflde¤er türbidite seviyesinde bir süspansiyon haz›rlay›n. • E¤er Dansitometre kullan›lm›yorsa: - “Uyar›lar ve Önlemler” bölümünde belirtildi¤i gibi bir Süspension Medium (2 ml) ampülünü (damlal›¤› olmayan ampul) aç›n ya da katk›s›z steril distile su içeren herhangi bir tüp kullan›n. - Bir eküvyon yard›m›yla kültür içindeki bütün bakterileri al›n ve tüp içinde yo¤un bir süspansiyon (S) haz›rlay›n. -

“Uyar›lar ve Önlemler” bölümünde belirtildi¤i gibi bir Süspension Medium

71

72

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

(5 ml) ampülünü (damlal›¤› olmayan ampul) aç›n ve süspansiyondan belli say›da damlatarak 2 McFarland’a eflde¤er türbidite seviyesine sahip bir süspansiyon elde edin; bu say›y› (n) kaydedin. - ”Uyar›lar ve Önlemler” bölümünde belirtildi¤i gibi bir API 50 CHL Medium ampülünü (damlal›¤› olmayan ampul) aç›n ve damla say›s›n›n iki kat› kadar süspansiyon ilave ederek (yani 2 n kadar) API 50 CHL Medium ampülünü inoküle edin. - Homojenize edin. Stribin inokülasyonu • Tüpleri (küpülleri de¤il) inoküle edilmifl API 50 CHL Medium ile doldurun ve tüm tüpleri mineral ya¤la kaplay›n. • 48 saat süreyle aerobik olarak 30°C ya da 37°C’de inkübe edin. Stribin okunmas› (API 50 CH paket içerik kitap盤›na bak›n›z.) Tüm testler hem 24 hem de 48 saat sonra okunur. Pozitif bir test, besiyeri içindeki bromokresol moru indikatörünün sar›ya dönmesiyle ortaya ç›kan asidifikasyon ile belli olur. Esculin testi için (tüp no: 25) mordan siyaha dönüflüm görülür. Sonuçlar› sonuç ka¤›d›na kaydedin. Yorumlama Suflun biyokimyasal profili; - Tan›mlama yaz›l›m›yla belirlenebilir, - Suflun özelliklerini belirlemek ve karfl›laflt›rma yapabilmek için oldu¤u gibi kaydedilebilir, - Taksonomik çal›flma için di¤er profillerle birlikte kullan›labilir. KULLANILMIfi MATERYAL‹N ATILMASI Kullan›mdan sonra at›lmadan önce tüm ampuller, eküvyonlar, pipetler ve stripler otoklavlanmal›, yak›lmal› ya da dekontaminasyon için bir dezenfektana bat›r›lmal›d›r. STR‹PLER‹N B‹LEfi‹M‹

A P I CHL 50 test kiti kuyucuklar›

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Uygulama 2: Mikroorganizmalar›n VITEK Sistem ile Tan›s› ve Karakterizasyonu VITEK h›zl› otomotize identifikasyon cihazlar›ndan birisidir. Gram negatif, Gram pozitif bakteriler, mayalar, anaerob bakterilerin tan›s› için üretilmifl kitleri mevcuttur. VITEK sistemi seçilmifl olan baz› karbohidratlar›n biyokimyasal kullan›m›na dayal› bir sistemdir. Cihaz bu karbohidratlar›n kullan›l›p kullan›lmad›¤›n› yüksek hassasiyetle tespit eder ve veri bankas›nda mevcut olan daha önceden tan›mlanm›fl mikroorganizmalar›n profilleriyle karfl›laflt›rarak sonuç verir. ‹dentifiye edilmesi istenilen mikroorganizman›n cihazda tan›mlanmas›ndan önce cihaz›n kullan›m k›lavuzunda belirtilmifl olan baz› harici testlerin yap›lmas› ve bu testlerin sonuçlar›na göre kullan›lacak olan kit grubu seçilmelidir. • Gram negatifler için harici testler: oksidaz • Gram pozitifler için harici testler: katalaz, koagülaz, B hemoliz • Mayalardaysa baz› yavafl üreyen mayalar için ek 24 saat inkübasyon gerekebilir. Bu durumda “48 saat” iflareti kart›n üzerine yap›lmal›d›r. Mayalar için ek testler: - RAT - G.T. - Blastoporlar - Arthrosporlar - Chlamydosporlar - Ascosporlar - Gerçek hif - Kapsül oluflumu • Anaerob bakterileri için harici testler: Indol, morfoloji ve gram boyama. Son iki test mutlaka yap›lmal›d›r. ‹ndol opsiyonel olarak yap›l›r. VITEK cihaz› için üretilmifl olan kit içerisinde identifikasyon kartlar›, mikroorganizmalar› aktarmay› sa¤layan steril çubuklar, mikroorganizmalar›n süspande edildi¤i steril s›v› ve mikroorganizma konsantrasyonunu ayarlamak için kullan›lan turbidometre cihazla birlikte kullan›lmaktad›r. Her mikroorganizma grubu için kullan›lan besiyerleri, ön testler ve cihaza yerlefltirilen identifikasyon kartlar› farkl›l›k göstermektedir.

VITEK cihaz› için kullan›lan identifikasyon kart› Bu uygulamada sadece gram negatif mikroorganizmalar›n identifikasyonuna yönelik bilgiler verilmifltir.

73

74

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Amaç: VITEK sistemle gram negatif mikroorganizmalar›n identifikasyonu ‹fiLEMLER: 1) Vitek Cihaz› ‹çin McFarland Ayar›n›n Yap›lmas› VITEK cihaz›nda mikroorganizma identifikasyonu yap›l›rken öncelikle mikroorganizma konsantrasyonunun ayarlanmas› gerekir. Bu konsantrasyon cihaz›n kullan›m k›lavuzunda belirtildi¤i gibi mikroorganizma gruplar›na göre de¤iflmektedir.

VITEK kolorimetre Vitek kolorimetre örne¤in yerlefltirilece¤i bir hazne, ölçüm için bas›lan bir buton, ayar vidas› ve süspansiyondaki bakteri miktar›n› ifade eden çeflitli renklerin bulundu¤u bir göstergeye sahip olan basit bir sistemdir. Kolorimetrede bulunan renkler ve bulan›kl›k miktarlar› afla¤›daki flekildedir: 0,5

K›rm›z›

1

Mavi

2

Yeflil

3

Sar›

Vitek kolorimetrenin kullan›m›: • Kolorimetrede yer alan hazneye kolorimetrenin standart solüsyonu yerlefltirilir ve butona bas›l› tutarak sa¤ s›f›r ayar› yap›l›r. • Hazneye ikinci olarak bir kalem yerlefltirilir ve butona bas›l› halde sol s›f›r ayar› yap›l›r. Bir ikinci aflamada belirtilen ifllemler kolorimetrenin kalibrasyonunu sa¤lamaktad›r. • ‹ncelenecek örnekten, kolorimetre için özel olan küçük tüpe al›narak, hazneye yerlefltirilir ve butona bas›l›r. Butona bas›l›yken ibrenin gösterdi¤i renk, bize süspansiyondaki bakteri miktar›n› belirtir. • Süspansiyon istenilen aral›kta de¤ilse bir miktar bofl bir tüpe al›narak üzerine steril FTS ilave edilir. Homojenizasyon sa¤land›ktan sonra kolorimetrede ölçüm yap›l›r. Bu ifllem bakteri süspansiyonu istenen renk aral›¤›na gelene kadar devam edilir. • Süspansiyonun, istenen renk aral›¤›ndan daha düflük olmas› durumundaysa bakteri süspansiyonu ilave edilir. Gram negatifler için identifikasyon • Enterobacteriaceae’lerin, non fermentatif Gram negatif bakterilerin ve Vibrionaceae ailesine ba¤l› baz› bakterilerin identifikasyon testlerini yapmak amaçl›d›r. • Aerofil ve mikroaerofil ortamlarla çal›flmaktad›r • Büyüme kontrolü: kuyu no 3

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

• Testler : - 26 adet konvansiyonel biyokimya testi - 3 non konvansiyonel (DP300, plan indican, p-coumaric acid) • Oksidaz testi yap›l›r ve kart üzerine iflaretlenir. • Mikroorganizma konsantrasyonu 1,8 ml’lik VITEK solüsyonu içerisinde kalorimetreyle ayarlan›r. • Mikroorganizmay› içeren solüsyon identifikasyon kartlar›na aktar›lmak üzere cihaza yerlefltirilir. • Bundan sonraki ifllemler cihaz›n kullan›m k›lavuzunda belirtildi¤i flekilde yap›l›r. • Analiz süresinden sonra bilgisayardan identifikasyon sonucu al›n›r. Gram Negatif ‹dentifikasyon kart›

AEROBiK 1. DP3 2. OFG 3. GC 4. ACE 5. ESC 6. PLI 7. URE 8. CIT 9. MAL 10. TDA 11. PXB 12. LAC 13. MLT 14. MAN 15. XYL

MiKROAEROFiLiK DP 300 Glucose(oxydative) Growth control Acetamide Esculin Plant indican Urea Citrate Malonate TDA Polymyxin B Lactose 10 % Maltose Mannitol Xylose

16. RAF 17. SOR 18. SUC 19. INO 20. ADO 21. COU 22. H2S 23. ONP 24. RHA 25. ARA 26. GLU 27. ARG 28. LYS 29. 30. ORN 31. OXI

Raffinose Sorbitol Sucrose Inositol Adonitol p. Coumaric Acid H2S ONPG Rhamnose Arabinose Glucose (fermentative) Arginine Lysine Decarboxylase control Ornithine Oksidaz iflareti

Oksidaz testi haricen yap›l›r ve kart›n üzerindeki yuvarla¤a pozitif sonuçlar iflaretlenir.

75

76

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Positive Oxidase

Negative Oxidase

GNI+ Metodoloji Gram negatif basil

BES‹YER‹ = TSA +%5 SheepBlood agar, Mac Monkey agar, EMB agar

Oksidaz iflaretlenir.

GNI+ Teknik tavsiyeler. • Kültürün saf kültür oldu¤undan emin olunmal›d›r. Vitek süspansiyonunun kontamine olup olmad›¤› kontrol edilmelidir. Vitek solüsyonunu 2-8„°C’de bir ay süreyle saklanmal›d›r. Her gün süspansiyona sterilite testi uygulanmal›d›r. • Taze kültür (24 saatlik) ile çal›fl›lmal›d›r. • Onayl› besiyeri: EMB, TSA+%5 blood agar, MacConkeyagar (inhibitif madde içermeyecek) kullan›lmal›d›r. • Inokülom standardizasyon: VITEK kolorimetre her on okumada ya da her yer de¤ifltirdi¤inde kalibre edilmelidir. • Oksidaz pozitif bakteriler için inokülom standardizasyonu GNI kart› için McF = 1, non fermentatifler için McF = 2’ye kadar ç›k›labilir. • Tüm süspansiyonlar vortekslenmelidir. • Oksidaz test ‘inin sonucunu GNI + kartlar›n›n üzerinde belirtilmelidir • Dolumu kontrol edin: kartlar›n içerisinde hava kabarc›¤› olmamal›d›r. • Dolan kart 20 dakika içerisinde okuyucuya verilmelidir.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Uygulama 3: PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Polymerase Chain Reaction - PCR) ile Belirli Bir Gen Bölgesinin Ço¤alt›lmas› Bu teknik Cetus firmas›n›n insan geneti¤i departman›nda çal›flan araflt›rmac› Kary Mullis taraf›ndan 1985’ te bulunmufl ve patenti al›nm›flt›r. PCR; ilk defa, ayn› y›l R. Saiki, K. Mullis ve arkadafllar› taraf›ndan orak hücre anemisi tan›s›n›n konulmas›nda uygulamaya sokulmufltur. 1993 y›l›nda bu çal›flma Kary Mullis’ e Nobel ödülünü kazand›rm›flt›r. PCR, herhangi bir organizmaya ait genomik DNA’ daki özgül bölgelerin ço¤alt›lmas›n› (amplifikasyonunu) sa¤layan basit ama çok baflar›l› bir invitro DNA sentezi yöntemidir. PCR; DNA molekülünün milyonlarca hatta milyarlarca kopyas›n› k›sa zamanda yapan bir tekniktir. Metod basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun koflullarda ço¤alt›lmas› esas›na dayan›r. Bir çeflit “in vitro klonlama” olarak da tan›mlanan PCR; 94°C-98°C aral›¤›nda gerçeklefltirilen denatürasyon, 37°C-65°C aral›¤›nda gerçeklefltirilen ba¤lanma (‹ng. annealing) ve 72°C’de gerçeklefltirilen uzama aflamalar›ndan oluflur ve bu döngülerin belirli say›da tekrarlanmas›na dayan›r. Amaç: E.coli bakterisinden elde edilen genomik DNA’dan 16S rRNA gen bölgesinin PZR amplifikasyonu (yaklafl›k 1500-2000 baz içeren gen bölgesi) Materyaller: E.coli’den izole edilmifl olan saf genomik DNA PZR için gerekli malzemeler: Steril pipet uçlar› Otomatik pipetler Uygun primer setleri Primer 27f (AGAGTTTGATCATGGCTCAG) Primer 1492r (GGTTACCTTGTTACGACTT) Taq DNA polimeraz Steril ultra saf su (DNaz - RNaz içermeyen) BSA Elektroforez için gerekli malzemeler Agaroz 1X TAE tampon Ethidium bromid Elektroforez cihaz› ‹stenilen PZR ürünün büyüklü¤üne uygun bant büyüklüklerine karfl›l›k gelen mark›r ‹fllem: • Bakteriden izole edilmifl olan genomik DNA ile afla¤›daki tabloda belirtilmifl olan oranlarda PCR reaksiyonu haz›rlan›r.

77

78

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Stok konsantrasyon

Son konsantrasyon

H2O

/

/

Buffer PCR

10 x

1x

BSA

10 mg/ml

1 mg/ml

MgCl2

25 mM

1,5 mM

dNTP

10 mM

200µM

‹leri primer

20 pico/µl

0,5

Geri primer

20 pico/µl

0,5

Taq DNA polimeraz

5 U/µl

1 U/reaksiyon

DNA

/

/

• Elde edilen E. coli genomik DNA’s›ndan 16S rRNA gen PCR amplifikasyonu 50µl lik bir reaksiyon kar›fl›m›nda gerçeklefltirilir. • Amplifikasyon reaksiyonu thermocycler içerisine yerlefltirilir. • Kullan›lan koflullar afla¤›daki flekilde tan›mlanm›flt›r. 1 X of Super Taq Plus tampon, 1 mg ml-1 BSA (bovine serum albumin), 200 µM dNTP mix, 0.5 µM forward and reverse primerleri, 1U/reaksiyon Super Taq Plus (HT Technology, UK), 1µl genomik DNA, toplam hacim 50µl’ye tamamlan›r. PCR koflullar› afla¤›daki flekilde ayarlanm›flt›r. bafllang›ç

son

denaturasyon basama¤›: 94°C 5 dk denaturasyon basama¤›: 94°C 30 s annealing basama¤›: 50°C 45 s elongation basama¤›: 72°C 2 dk elongation basama¤›: 72°C 7 dk

(30 döngü)

Tüm çal›flmalar boyunca hem pozitif hem de negatif kontrol reaksiyonlar› haz›rlan›r. Pozitif kontrol olarak standart E. coli genomik DNA’s›, negatif kontrol olarak da DNA içermeyen reaksiyon kar›fl›mlar› oluflturulur. Elde edilen PZR ürünleri %1,5 agaroz jellerde 110V’da yürütülerek gözlemlenir. Agaroz jel elektroforezi %1 Agaroz haz›rlamak için agoroz 1 X TAE tampon (50 X TAE: 242 g Tris base, 57.1 ml asetik asit, 100 ml 0.5M EDTA, 1 litre milipore su ve pH 8.5) içinde süspande edilir. Solüsyon agaroz eriyinceye kadar ›s›t›l›r. S›cakl›k 60°C’ye ulaflt›¤›nda plastik tepsi (15 x 15 cm) içerisine dökülmüfl ve 60 dk süreyle polimerizasyona b›rak›l›r. Jele yükleme yapmadan önce 4 °C de 30 dk bekletilir. Elektroforez 110V’da 30-45 dk süreyle yap›l›r. Elektroforez sonras›nda jel, ethidium bromideyle boyanarak UV ile görsel hale getirilir. Elde edilen bant büyüklü¤ü mark›r ile karfl›laflt›r›larak do¤rulan›r. Do¤ru PCR ürünün büyüklü¤ü yaklafl›k 1500-2000 bazl›k mark›r bantlar›n›n oldu¤u bölgede yer almal›d›r.

2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Yararlan›lan ve Baflvurulabilecek Kaynaklar Cappuccino, J. G. ve Sherman, N. 1987, Microbiology a laboratory Manual, second edition The Benjamin Cummings Publishing Company, Inc. Tamer, A.Ü., Uçar, F., Ünver, E. ve di¤erleri, 1986, 3. ve 4. S›n›f Mikrobiyoloji Laboratuar klavuzu, Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Teksirler Serisi no:55, Bornova-‹zmir. Benson: Microbiological Applications Lab. Manual, Eight Edititon, 2001, The McGraw-Hill Companies. Temiz, A. Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri, 1994, birinci bask›, Ankara. Durmaz, G. 2008, Mikrobiyoloji Laboratuar K›lavuzu. Eskiflehir Osmangazi Üniversitesi Bas›mevi, Eskiflehir. Morello, J. A., Granato, P. A. ve Mizer, H. E, 2002, Laboratory Manual and Workbook in Microbiology Applications to Patient Care 7th Edition, The McGraw_Hill Companies (ISBN: 0-07-246354-6)

79

TIBB‹ LABORATUVAR UYGULAMALARI (UYGULAMA K‹TABI)

3 Amaçlar›m›z

N N N

Bu üniteyi tamamlad›ktan sonra; Mikroskobu ve parçalar›n› tan›yacak, Basit preparat haz›rlama tekniklerini aç›klayabilecek, Haz›r preparatlarda Epitel doku, Kan doku, Ba¤ ve Destek doku, Kas doku çeflitlerini ay›rt edebileceksiniz.

Anahtar Kavramlar • Ifl›k mikroskobu • Preparasyon teknikleri • Kan doku

• Epitel doku • Ba¤ ve destek doku • Kas doku

‹çerik Haritas›

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

• LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: M‹KROSKOP PARÇALARININ TANITIMI VE KULLANIMI • LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: PREPARAT HAZIRLAMA • LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: EP‹TEL DOKU • LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: BA⁄ VE DESTEK DOKU • LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: KAS DOKU

Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar› LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: M‹KROSKOP PARÇALARININ TANITIMI VE KULLANIMI Bugün en çok kullan›lan en basit mikroskop, ›fl›k mikroskobudur. Ifl›k mikroskobunun gözle bakt›¤›m›z oküleri ve inceledi¤imiz preparat k›sm›n›n üzerinde yer alan objektif k›sm› bulunur. Objektif ve okülerin ayr› ayr› kendilerine göre bir büyütme güçleri vard›r. Ifl›k mikroskobunun büyütme gücüyse objektif ve okülerin büyütme güçleri çarp›m›na eflittir.

Ifl›k Mikroskobunun K›s›mlar› Gövde K›sm› (Mekanik K›s›m) Ayak, sap, tabla ve k›zaktan oluflur. Ayak k›sm› mikroskoplar›n flekil, marka ve modeline göre de¤iflir. Sap k›sm› mikroskobu tafl›mak için kullan›l›r. Bu k›s›m, ayakla eklem yaparak gövdeye ba¤l› ise arkaya do¤ru hareket edebilme özelli¤i verir. Lam›n kondu¤u k›sma tabla denir. Tablan›n ortas›nda kondansörden gelen ›fl›¤› geçirmek için boflluk bulunur. Tabla üzerinde lam› sabitlefltiren 2 mafla ya da geliflmifl flekillerinde lam›n hareketini sa¤layan flaryo bulunur. Birinci k›zaktaki kaba ayar vidas› (=makrometre) ile objektifin lama yaklaflt›r›l›p uzaklaflt›r›lmas› için kullan›lan, ince ayar vidas›yla (= mikrometre) da netlik sa¤lan›r. ‹kinci k›zak kondansörü tafl›r ve afla¤› yukar› hareketini sa¤lar. MEKAN‹K BÖLÜMLER tüp

revolver

gövde

sehpa netleme dü¤meleri

flaryo taban

fiekil 3.1 Mikroskobun Mekanik Bölümleri

82

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Optik K›s›mlar Mikroskobun esas görevini yapan k›sm›d›r. Optik k›s›m objektif ve okülerden meydana gelir. Objektifler: ‹ki ile befl deli¤i olan revolver (döner parça) üzerine vidalanm›fllard›r. Mikroskobun cinsine göre çeflitli objektifler vard›r. Genelde mikroskoplarda bulunan objektifler 4’lük, 10’luk, 40’l›k ve 100’lüktür. Mikrobiyolojide en s›k 100’lük objektif kullan›l›r. Bu objektif, lam ile objektif aras›na immersiyon ya¤› (= sedir ya¤›) damlat›larak kullan›l›r. Bu nedenle immersiyon objektifi olarak da adland›r›l›r. Okülerler: Çeflitli büyütme özelli¤indedirler. Alt ve üst olmak üzere çift merceklidirler, üzerlerinde 5x, 10x, 15x, 20x gibi kaç kez büyütme yapt›klar› yaz›l›d›r. fiekil 3.2

fiekil 3.3

Mikroskobun Optik Bölümleri oküler

Kondansör ve Diyafram OPT‹K BÖLÜMLER

Objektif

objektif

Örnek Slayt Kondansatör

kondansör Diyafram

›fl›k kayna¤›

Yard›mc› Optik K›s›m: Ifl›k ve kondansör tak›m›ndan oluflmaktad›r. Her türlü mikroskopik incelemelerde görüntü alan›n› ayd›nlatmaya yarayan ›fl›k kayna¤› bulunur. Gere¤ine göre ayarlan›p kullan›labilen, 12 voltluk, önünde toplay›c› merce¤i, iris diyafram› bulunan, ›fl›k fliddeti bir reosta dü¤mesiyle ayarlanabilen lambalar en idealidir. Kondansör tak›m halinde bulunur. Ifl›¤› obje üzerinde odaklar ve yo¤unlaflt›r›r. Ifl›¤›n da¤›larak görüntünün bozulmas›n› önler ve rezolüsyon artt›r›r. S›cak lambay› optik bölümlerinden ve kullan›c›dan uzak tutar. Diyafram, Ifl›k kayna¤›ndan gelen ›fl›k demetinin çap›n› kontrol eder. Ifl›k kayna¤›n›n üstünde ya da kondansörün alt›ndad›r. En iyi kontrast ve rezolüsyon elde edilecek ›fl›k çap›n› ayarlamak için kullan›l›r. Daha yukar›da mercek tak›m› bulunur. Alt› genifl olup, üstü lama kadar dayanan k›sm› düz ve dar çapl›d›r. Mikroskop kullan›m›ndan sonra dikkat edilmesi gereken hususlar: • Mikroskop sadece gövde kolu üzerinden tutulmal› ve tafl›nmal›d›r. • Objektifi en düflük büyütme seviyesine getirip b›rak›n›z. • Ayd›nlatma sistemini kapatmay› unutmay›n›z. • E¤er mikroskobun gövdesi ve tablas› tozluysa tozun silinmesi için yumuflak pamuklu bez parças› kulan›n›z. • Tüm bu ifllemlerden sonra, mikroskobu koruma örtüsüyle örtebilirsiniz.

3. Ünite - Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

UYGULAMA: Ifl›k Mikroskobunda Preparat ‹ncelenmesi Amaç: So¤an zar›n› inceleyerek ›fl›k mikroskobunu ve k›s›mlar›n› tan›mak, ›fl›k mikroskobunda incelemeler yapabilecek düzeyde mikroskobu kullanmay› ö¤renmek. Materyal: Ifl›k Mikroskobu, lam ve lamel, 1 adet so¤an, bistüri, distile su. Uygulanacak ‹fllemler: 1. Getirmifl oldu¤unuz so¤an› bistüri yard›m›yla kesiniz ve so¤an zar›n› ç›kar›n›z. 2. So¤an zar›n› lam üzerine damlat›¤›n›z su damlas›n›n üzerine koyunuz. 3. Üstüne lameli 45 °lik aç› yapacak flekilde tutun ve b›rak›n.T›rnak ucu ile hafifçe lamele vurularak, arada kalm›fl olan hava kabarc›klar› ç›kart›labilir. 4. Preparat› (lam ve lameli) mikroskopta tabla üzerine koyup s›k›flt›r›n›z. 5. Ifl›k, tablan›n ortas›ndan geçecek flekilde aynay› ayarlay›n. Diyafram› aç›p kapatarak en uygun ›fl›¤›n geçmesini sa¤lay›n. 6. Objektifi en küçük ayara getirin. Preparata bakarken kaba ayar vidas›n› (makrovida) çevirerek görüntüyü ayarlay›n. 7. Okülerden bak›n, görüntüyü ayarlad›ktan sonra kaba ayar vidas›n› b›rak›p, ince ayar vidas›yla netlik ayar›n› yap›n. 8. Daha büyük görüntüler elde etmek için objektif de¤ifltirince kaba ayar vidas›yla oynamay›n. (Objektifin de¤ifltirilmesi görüntü ayar›n› bozmaz sadece netli¤ini de¤ifltirir). 9. Her büyütmede ›fl›¤a gereksinim artaca¤›ndan, iris diyafram daha fazla aç›lmal›d›r. 10. Preparattaki so¤an zar›n› inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar • ‹nceledi¤iniz so¤an hücrelerinin mikroskobun her bir farkl› objektifiyle inceledi¤inizde normal görüntüsünden kaç kat daha fazla büyüttü¤ünü hesaplay›n›z. • So¤an hücresinin fleklini çizip k›s›mlar›n› isimlendiriniz. Tart›flma • Mikroskopta 100 lük objektifte inceleme yaparken immersiyon ya¤› neden kullan›l›r?

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: PREPARAT HAZIRLAMA Preparat, bir lam üzerine konulup gerekli ifllemler (tesbit etme, boyama vb) yap›ld›ktan sonra üzeri lamelle kapat›l›p mikroskopta incelenmeye haz›r hale gelmifl materyaldir. ‹ncelenecek materyali preparat haline getirirken materyalin özelli¤ine göre de¤iflen yöntemler uygulan›r. Afla¤›daki yöntemlerle haz›rlanan preparatlar, uzun süreli dayan›kl› olmayan geçici preparatlard›r. Bunlar›n bafll›calar› flunlard›r: • Do¤rudan inceleme yöntemi: Bir hücreli kültürlerinden, havuz suyundan ya da su birikintilerinden al›nan birkaç damla suyun lam ile lamel aras›nda mikroskobik olarak incelenmesidir. Bu çal›flmada obje üzerinde boyaman›n d›fl›nda herhangi bir ifllem uygulanmaz.

83

84

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

• Kaz›ma yöntemi: Yana¤›n iç yüzü gibi yumuflak dokulardan lamelle hafifçe kaz›narak al›nacak s›yr›nt›daki hücrelerin, boyanarak ya da boyanmadan sulu bir ortamda incelenmesidir. Ayn› yöntem, bitkisel preparatlar haz›rlan›rken örne¤in; fasulye, nohut, bu¤day gibi tanelerin iç yüzeyinden parçalar›n s›yr›larak incelenmesinde de uygulanabilir. • Kesit Alma yöntemi: ‹ncelenecek objeden jilet, bistüri gibi keskin araçlar yard›m›yla ya da mikrotom ad› verilen araçlarla ›fl›¤› geçirecek flekilde kesitler al›narak boyal› ya da boyas›z preparatlar haz›rlan›r. ‹ncelenecek yap›n›n özelli¤ine göre kesitler enine, boyuna, yüzeysel ya da te¤etsel olarak objenin farkl› bölgelerinden al›nabilir. • Ezme Yöntemi: Dokular›n çeflitli araçlar yard›m›yla bas›nçla ezilerek preparat haline getirilmesidir. • Yayma Yöntemi: Preparat› haz›rlanacak materyal (s›v› materyal) lam üzerine düzgün bir yüzey oluflturacak flekilde yay›l›r. Örne¤in; kan preparat› bu yolla haz›rlanmaktad›r. Sürekli preparatlar›n haz›rlanmas› daha fazla ifllem gerektirir. Bu preparatlar›n ömürleri oldukça uzundur. Çal›flman›n özelli¤ine göre sürekli preparatlar›n haz›rlan›fl ve boyanma teknikleri çeflitlilik gösterir. Çal›flmalar›m›zda yeri geldikçe bu flekilde haz›rlanm›fl preparatlarda kullanacaks›n›z. UYGULAMA 1: Yanak Epiteli Hücrelerinin ‹ncelenmesi Amaç: Yanak Mukozas›ndan “Kaz›ma Yöntemi” ile Preparat Haz›rlamak ve yanak mukozas›ndaki epitel hücrelerini incelemek. Araç ve Gereçler: Lam, lamel, metilen mavisi, mikroskop, kurutma ka¤›d› ve pastör pipeti Uygulanacak ‹fllemler: 1. Temiz bir lam üzerine pastör pipetiyle bir damla su koyunuz. 2. Temiz bir lameli sa¤ elinizin bafl ve iflaret parmaklar› aras›nda tutarak dilinizin (ya da yana¤›n›z iç k›sm›) üzerine fazla bast›rmadan arkadan öne do¤ru sürünüz. 3. Toplanan materyali lamdaki suyla kar›flt›n›z. (Bu flekilde çok katl› yass› epitelden koparak ayr›lan hücreler lam üzerine gelmifl olur). Boyama yapmadan önce epitel hücrelerini mikroskopta inceleyiniz. 4. Bu kar›fl›m›n üzerine bir damla metilen mavisi ilave ediniz. 5. Hava kabarc›¤› kalmayacak flekilde 45 derecelik aç›yla lameli kapat›n›z. 6. Önce en küçük objektif ile epitel hücrelerini bulunuz. 7. Sonra görüntüyü büyük objektife getirerek görüntüyü netlefltiriniz. 8. Bu durumda hücre zar›, sitoplazma ve çekirde¤i inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar • Yanak mukozas› epitel hücrelerinin fleklini çiziniz ve k›s›mlar›n› isimlendiriniz. • Boyanm›fl ve boyanmam›fl hücreler aras›ndaki farklar› belirtiniz. Tart›flma • Laboratuvarda ö¤renmifl oldu¤unuz preparat haz›rlama yöntemlerini ve biribirinden farkl›l›klar›n› tart›fl›n›z.

3. Ünite - Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

UYGULAMA 2: Kan Hücrelerinin ‹ncelenmesi Kan Doku Kan Doku Elemanlar› Kan Plazmas›: %90 oran›nda su, %10 civar›nda organik ve inorganik maddeleri içeren, hafif bazik karakterdeki (pH 7,4) s›K›rm›z› v›d›r. ‹çerdi¤i organik maddeler, protein, Kan Hücreleri aminoasit, karbonhidrat, ya¤, tuz, hormon, (eritrositler) Eritrosit enzim ve antikorlard›r. Çözünmüfl gazlar ve çeflitli iyonlar da inorganik içeri¤ini oluflturmaktad›r. Kan hücreleri plazma s›v›s› Nötrofil içinde bulunmaktad›r. Granüllü Kan Hücreleri: Kan›n flekilli elemanlar›d›r. Lökositler Bu hücreler kana k›rm›z› rengi veren alyuEozinofil varlar (eritrositler), kan›n beyaz hücreleri olan akyuvarlar (lökositler) ve klasik hücre yap›s› göstermeyen kan pulcuklar›d›r (trombositler). Bazofil A. Alyuvarlar (Eritrositler): Kan Beyaz hücreleri aras›nda en fazla buluKan Hücreleri nanlar›d›r. ‹nsanda çaplar› yakla(lökositler) fl›k 7,5 mikrondur. 1mm3 kanda orMonosit talama olarak ergin diflide 4,5 milGranülsüz yon, erkekte 5,5 milyon eritrosit hücLökositler resi bulunur. Olgunlaflt›klar›nda çekirdeklerini kaybederler. Lenfosit B. Akyuvarlar (Lökositler): Pigment içermeyen renksiz görünümlü, çekirdekli kan hücrelerdir. Yalanc› Kan Pulcuklar› ayaklarla hareket ederler. 1mm3 Trombositler kanda ortalama olarak 7-8 bin akyuvar bulunur. Vücut savunmas›nda görev al›rlar. Sitoplazmalar›nda özelleflmifl taneciklerin bulunup bulunmay›fl›na göre 2 grupta incelenirler. Granülsüz akyuvarlar: Sitoplazmalar›nda spesifik tanecik bulundurmazlar. Lenfosit ve monosit bu gruba giren hücrelerdir. 1. Lenfositler: Akyuvarlar›n en küçü¤üdürler, çekirdekleri büyük küre fleklinde, hafif girintili ç›k›nt›l›, sitoplazmalar› az miktarda ve granülsüzdür. Sa¤l›kl› ergin bir bireyin kan›ndaki akyuvarlar›n yaklfl›k %20-25’ini olufltururlar. 2. Monositler: Kan dokunun en büyük hücreleridir. Sa¤l›kl› eriflkin lökositlerinin %2-8’ini olufltururlar. At nal› ya da fasulye fleklindeki karakteristik çekirde¤e sahiptir ve bol miktarda bulunan sitoplazmalar› granülsüzdür. Granüllü akyuvarlar: Loplu yap›da çekirde¤e sahip büyük ve çok say›da sitoplazmik tanecik içeren hücrelerdir. Sitoplazmik taneciklerinin boyalarla verdikleri reaksiyonlara göre 3’e ayr›l›rlar: Bunlar nötrofiller, eozinofiller ve bazofillerdir. 1. Nötrofiller: Kanda en fazla say›da bulunan lökosit çeflididir. Sa¤l›kl› insan kan›ndaki lökositlerin %60-70 ini olufltururlar. Kan boyalar›yla soluk pembe renkte boyanan çok parçal› çekirde¤e ve sitoplazmik granüllere sahiptirler. 2. Eozinofiller: Sa¤l›kl› ergin bireyde lökositlerin %1-4’ünü olufltururlar. Sitoplazmalar› kan boyalar›yla parlak pembe renkte boyanan çok say›da iri tanecik içerir. 3. Bazofiller: Granüllü lökositlerin kanda en az say›da bulunan›d›r. Sa¤l›kl› bir eriflkin kan›nda bulunan akyuvarlar›n %0.5-1 ini olufltururlar. Sitoplazmalar› kan boyalar›yla mavi ya da mor renkte boyan›r. 2 ya da 3 loplu bir çekirde¤e sahiptirler.

Kan Doku

Kan Hücresi Tipi

Mikroskobik Görünüm

85

86

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

UYGULAMA 3: Kan Pulcuklar› (Trombositler): ‹nsanda çaplar› 2-4 mikron olup, yuvarlak, oval ya da y›ld›zs› flekillerdeki renksiz hücrelerdir. Bu hücreler 1 mm3 kanda, 25.000-500.000 kadar say›da bulunmaktad›rlar. Amaç: Kandan “Yayma Yöntemi” ile Preparat Haz›rlamak ve Kan dokusunun hücrelerini mikroskopta gözlemleyerek incelemek Materyal: Lanset, giemsa boyas›, alkol, boyama kab›, pastör pipeti, lam, lamel, kurutma ka¤›d›, pamuk, distile su Uygulanan ‹fllemler: 1. Alkollenmifl pamukla orta parma¤›n›z›n iç yüzünü siliniz. 2. Bafl parma¤›n›zla orta parma¤›n›z›n iç yüzünü 3-4 kez s›vazlay›n›z. 3. Steril lanset ile orta parma¤›n›z›n ucunu deliniz. 4. ‹lk bir iki damla kan› ak›t›n›z. Üçücü damla kan› lam›n kenar›na damlat›n›z. 5. Lameli 45 °C’lik aç›yla lam›n kenar›na yerlefltirerek, kan› lam üzerine tek hamlede yayacak flekilde, lameli bir uçtan bir uca do¤ru çekiniz. 6. Kan›n kurumas›n› bekleyiniz. 7. Kan kuruduktan sonra, üzerini kaplayacak flekilde absolü alkol damlat›p alkol kuruyuncaya dek bekletiniz. 8. Preparat›n üzerine, kurumufl kan› örtecek flekilde, giemsa boyas› damlat›n›z ve 15-20 dakika bekleyiniz. 9. Daha sonra preparat› distile suyla dikkatlice y›kayarak silmeden kurutunuz. 10. Önce en küçük objektifle kan hücrelerini bulunuz. 11. Sonra görüntüyü büyük objektife getirerek görüntüyü netlefltiriniz. Gözlem ve Sonuçlar • Haz›rlad›¤›n›z kan preparat›ndaki kan hücrelerinin say›lar›n› birbirleriyle karfl›laflt›r›n›z. • Her bir kan hücresinin fleklini birbirleri aras›ndaki büyüklüklerini dikkate alarak çiziniz ve k›s›mlar›n› isimlendiriniz. Tart›flma • Hangi tip materyaller için kaz›ma ve yayma yöntemi uygulan›r? Tart›fl›n›z.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: EP‹TEL DOKU Vücudun d›fl ve iç k›s›mlar›yla organlar›n yüzeyini kaplayan bir örtü dokusudur. En belirgin özellikleri hücrelerin dokuyu olufltururken bol ve s›k bir dizilimde s›ralanmalar› ve hücre ara maddesinin az miktarda bulunmas›d›r. Epitel dokuyu, vücutta bulundu¤u yere göre, ifllevine göre ve görevi nedeniyle kazand›¤› flekline göre grupland›rmak mümkündür. • Örtü epiteli • Salg› epiteli (bez epiteli) • Duyu epiteli (nöroepitel) • Kassal epitel (miyoepitel) olarak dört temel alt gruba ayr›labilir.

3. Ünite - Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

87

Örtü Epiteli Tek katl› yass› epitel: Geniflli¤i yüksekli¤inden fazla olan, oldukça yass›laflm›fl tek s›ra halindeki hücrelerdir. Hücre çekirde¤i de hücrenin yap›s›na ba¤l› olarak yass›laflm›flt›r. Çekirdek, hücrenin ortas›nda, hafif bir fliflkinlik oluflturacak flekilde yer al›r. Tek katl› kübik epitel: Çeflitli kesitlerde kare ya da çokgen fleklinde görülebilen, eni, boyu ve yüksekli¤i genel olarak birbirine yak›n olan tek s›ral› hücrelerdir. Çekirdek, hücrenin ortas›nda ve yuvarlak flekillidir. Tek katl› silindirik epitel: Yüksekli¤i eninden fazla olan tek s›ral› hücrelerdir. Çekirdek, hücrenin flekline benzer flekilde silindirik ya da prizmatik olarak hücrede, bazal yüze yak›n olarak yer almaktad›r Yalanc› çok katl› epitel: Mikroskobik incelemede çok katl› gibi görünen ancak, gerçekte tek katl› yap›daki epitel hücreleridir. Bu epitel türünde, hücrelerin tamam› bazal lamina ile iliflki içindedir. Ancak, bu hücrelerin tamam› ayn› boyda de¤ildir ve hücre çekirdeklerinin yerleflimi de her hücrede farkl›l›k gösterir. Çok katl› yass› epitel: Hücre tabakalar›n›n üst üste s›ralanmas›yla meydana gelir. En alt tabakadaki hücreler bazal membran üzerine oturmaktad›r. Bu hücreler yeni hücrelerin üretiminden sorumlu olan ço¤unlukla silindirik yap›daki hücrelerdir. Yeni hücreler üretildikçe, eskileri yukar›ya do¤ru itilerek yass›laflmaya bafllar. Bu sayede hücreler bazalden itibaren silindirikten kübi¤e, kübikten yass›ya do¤ru de¤iflen flekillerde dokuyu meydana getirir. Çok katl› de¤iflici epitel: fiiflme gerilme fonksiyonlar› bulunan vücut bölgelerinde görülen çok katl› epiteldir. Yüzeydeki hücreler büyük, bazal hücrelerse küçük yap›l› silindirik hücrelerdir. Katmanlar› oluflturan tüm hücreler, ifllevlerine göre flekil de¤ifltirebilirler. Epitel Çeflidi

Vücutta Bulundu¤u Yerler

Tek katl› yass› epitel

K›lcal damarlar›n duvarlar›, Akci¤erlerin hava keseleri

Tek katl› kübik epitel

Yumurtal›k yüzeyi Böbrek tübüllerinin örtüsü Tiroid folikülleri Çeflitli bezlerin kanallar›n›n örtüleri

Tek katl› silindirik epitel

Uterus ve sindirim kanal›n›n örtüsü

Yalanc› çok katl› epitel

Solunum kanallar›n›n örtüsü Üreme sisteminde çeflitli tüplerin örtüsü

Çok katl› yass› epitel

Derinin d›fl örtüsü A¤›z bofllu¤u Vajina ve anal kanal›n örtüsü

Çok katl› kübik epitel

Baz› ter ve tükrük bezlerinin örtüsü Boflalt›m kanallar›n›n örtüsü

Çok katl› silindirik epitel

Farinks ve epiglottis Baz› bezlerin büyük boflalt›m kanallar›

De¤iflici Epitel

‹drar kesesi ‹drar kanallar›n›n iç örtüleri

Tablo 3.1 Örtü epiteli çeflitleri ve ve vücutta bulundu¤u yerler

88

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

fiekil 3.4 Örtü Epiteli Çeflitleri

UYGULAMA: Haz›r Preparat Kullan›larak Epitel Doku Çeflitlerinin ‹ncelenmesi Amaç: “Epitel doku” gruplar›ndan “Örtü epiteli” çeflitlerini, vücutta bulundu¤u yerleri ve birbirlerinden farkl›l›klar›n› ›fl›k mikroskobunda incelemek SIRA S‹ZDE

D Ü fi Ü N E L ‹ M S O R U

D‹KKAT

SIRA S‹ZDE

AMAÇLARIMIZ

K ‹ T A P

TELEV‹ZYON

‹NTERNET

Materyal SIRAhaz›r S‹ZDEpreparatlar› (sürekli preparat), mikroskop Örtü epiteli Uygulanacak ‹fllemler: D Ü fi Ü N E L ‹ M 1. Mikroskobunuzun 4 lük objektifte olmas›na dikkat ediniz. 2. Size verilen preparat› mikroskop tablas›na yerlefltiriniz. 3. ‹ncelemeye en küçük objektif olan 4’lük objektifle bafllay›p s›ras›yla 10’luk ve S O R U 40’l›k objektiflerde de inceleyiniz.

Sizden istenmedi¤i D ‹ K K A Tsürece mikroskobu kesinlikle 100’lük objektife getirmeyiniz. 4. ‹nceledi¤iniz epitel doku çeflidini mikroskopta gözlemledi¤iniz haliyle çiziniz.

N N

SIRA S‹ZDE

Gözlem ve Sonuçlar: • Çizim yapt›¤›n›z dokunun flekline, boyutuna, boyanma durumuna dikkat ediniz.AMAÇLARIMIZ Bunlar› çiziminiz de belirtiniz. • Epitel doku hücrelerinin farkl›l›klar›n› belirtiniz. • Hücrenin flekliyle çekirde¤in fleklini, büyüklük aç›s›ndan oran›n› ve boyanma K ‹ T A Pbelirtiniz. farkl›l›klar›n›

Tart›flma • ÖrtüT Eepitel çeflitlerindeki farkl› hücre flekillerinin nedenini tart›fl›n›z. LEV‹ZYON

‹NTERNET

89

3. Ünite - Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: BA⁄ VE DESTEK DOKU Dokular› ba¤lay›c› özellikteki ve di¤er dokularla organlar›n aralar›n› dolduran doku tipine ba¤ doku, desteklik görevi görerek organizman›n iskeletini ve baz› organlar›n duvarlar›n› oluflturan dokuya da destek doku ad› verilir. Koruma ve ya¤ depolama özelli¤i olan ya¤ dokusu ve s›v› yap›daki ara maddeye sahip kan dokusu (daha önceki konularda bahsetmifltik) ise özelleflmifl ba¤ doku çeflitleri olarak kabul edilmektedir. Tablo 3.2

Ba¤ ve Destek Doku

Ba¤ doku Embriyonik ba¤ doku

Eriflkin ba¤ dokusu

Mezenflimal ba¤ doku Mukoz ba¤ doku

Gevflek ba¤ doku S›k› ba¤ doku Elastik ba¤ doku Retiküler ba¤ doku

Özelleflmifl ba¤ doku

Destek doku

Kan doku Ya¤ doku

K›k›rdak doku Kemik doku

fiekil 3.5 Ba¤ dokusunda bulunan hücreler ve fibrillerin flematik görünümü

Gevflek Ba¤ Doku Organizmada en s›k rastlanan ba¤ doku tipidir. Kollajen fibriller baflta olmak üzere tüm ba¤ doku fibrillerini gevflek bir düzende içerir. Fibroblast ve histiyositler (mast hücreleri) a¤›rl›kl› olacak flekilde, ba¤ doku hücreleri a¤s› görünümlü fibrillerin aras›na yerleflik durumda bulunmaktad›r. Yo¤un ve ak›c› bir matrikse sahiptir.

90

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

fiekil 3.6 Gevflek ba¤ dokunun mikroskobik ve flematik görünümü

Mast Hücreleri Elastik Lifler Fibroblast Hücreleri Kollajen Fibriller 100X

S›k› Ba¤ Doku Kollajen fibrilleri paralel demetler halinde yo¤un olarak içermektedir. Bulundu¤u organ›n gerilme ve bas›nca maruz kalma durumuna göre fibril demetlerinin düzenleniflinde farkl›l›klar olmakta ve bu farkl›l›klara göre iki tipe ayr›lmaktad›r. Düzenli S›k› Ba¤ Doku, tendon ve ligamentler gibi bas›nç ve çekilmenin tek yönde oldu¤u bölgelerde bulunmaktad›r. Çok yo¤un ve düzenli yap›daki kollajen fibril demetlerinden oluflur. Düzensiz s›k› ba¤ doku, bas›nç ve çekilmenin her yönde gerçekleflti¤i birçok vücut bölgesinde bulunmaktad›r. Kollajen fibriller enine, boyuna ve birbirlerini çaprazlayacak flekilde farkl› yönlerde düzenlenmifltir. fiekil 3.7 S›k› ba¤ dokunun flematik ve mikroskobik görünümü

Fibroblast Hücreleri Kollajen Fibriller 100X

Ya¤ Doku Ya¤ dokusu hücrelerine liposit denir. Ya¤ hücrelerinin sitoplazmas›ndaki ya¤ damlac›klar› tek ve büyük yap›da ya da çok say›da küçük damlac›klar halinde görülebilir. K›lcal damarlarca zengin bir doku olan ya¤ dokusu, deri alt›nda, kaslar aras›nda, böbrekler ve üreme organlar›n›n etraf›nda yer al›r. fiekil 3.8 Ya¤ damlas›

Ya¤ dokunun mikroskobik ve flematik görünümü

Sitoplazma Çekirdek Jel halindeki pfotein lifi

100X

91

3. Ünite - Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

K›k›rdak Doku Kondrosit ad› verilen k›k›rdak doku hücreleri yuvarlak ya da oval yap›dad›r ve bir ya da bir kaç› bir kapsül içerisinde lakün ad› verilen boflluklarda yer almaktad›r. Kapsüllerin çevresinde kondron ad› verilen 2 k›k›rdak k›l›f bulunmaktad›r. K›k›rdak hücrelerinin çekirdekleri yuvarlak ya da oval flekillidir. Ara maddesine kondrin denir. K›k›rdak dokunun etraf› perikondrium ad› verilen sa¤lam bir ba¤ dokusu k›l›f›yla sar›lm›flt›r. Bulundurdu¤u matriksin yap›sal özelliklerine göre k›k›rdak doku Hiyalin K›k›rdak, Elastik K›k›rdak ve Fibröz K›k›rdak olmak üzere 3 çeflide ayr›l›r. fiekil 3.9

Jel halindeki Proteinler Kondrosit

Hiyalin k›k›rda¤›n mikroskobik görünümü

Elastik lifler

Lakün 100X

fiekil 3.10 Kollojen liflerin matrix k›sm›

Kemik dokunun mikroskobik görünümü

Lakün içindeki osteositler Merkez kanal 100X

92

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Kemik Doku Kemik doku, bir ara madde ve bu ara madde içersine yerleflmifl lif ve osteosit ad› verilen hücrelerden oluflmaktad›r. Kollajen liflerin oluflturdu¤u lamelli bir yap› ve lamellerin boflluklar›na gömülmüfl osteositler mevcuttur. Lameller havers kanal› ad› verilen damar, sinir ve kemik ili¤i içeren bir bofllu¤un etraf›nda bulunmaktad›r. Kemik hücrelerinin oluflturdu¤u toplulu¤a osteon ad› verilir. Havers kanallar› birbirlerine Volkmann kanal› ad› verilen ve osteonlar aras› iletimi sa¤layan enine kanallarla ba¤lanmaktad›r. Olgun kemik hücreleri, kanalikül ad› verilen uzant›lara sahip y›ld›z flekilli hücrelerdir.

UYGULAMA: Haz›r Preparat Kullan›larak Ba¤ Doku ve Destek Doku Çeflitlerinin ‹ncelenmesi Amaç: Eriflkin ba¤ dokusu çeflitlerinden gevflek ba¤ doku ve s›k› ba¤ doku’yu; özelleflmifl ba¤ doku çeflitlerinden ya¤ doku’yu ve destek doku çeflitleri olan k›k›rdak doku ve kemik doku’nun yap›s›n›, vücutta bulundu¤u bölgeleri ö¤renmek. Araç ve Gereçler: Ifl›k mikroskobu, haz›r preparatlar Uygulanacak ‹fllemler: 1. Mikroskobunuzun 4’lük objektifte olmas›na dikkat ediniz. 2. Size verilen preparat› mikroskop tablas›na yerlefltiriniz. 3. ‹ncelemeye en küçük objektif olan 4’lük objektifle bafllay›p s›ras›yla 10’luk ve 40’l›k objektiflerde de inceleyiniz. (Sizden istenmedi¤i sürece mikroskobu kesinlikle 100’lük objektife getirmeyiniz) 4. ‹nceledi¤iniz doku çeflidini mikroskopta gözlemledi¤iniz haliyle çiziniz. Gözlem ve Sonuçlar: • Size verilen preparatlardaki ba¤ dokusu çeflitlerini mikroskopta inceleyerek, bu doku çeflitlerini biribirinden ay›ran özelliklere dikkat ediniz. • Yapm›fl oldu¤unuz çizimlerin üzerinde, hücreleri ve hücre çeflitlerini, hücreleraras› maddeyi (matriks) ve di¤er dokusal bileflenleri belirtiniz. Tart›flma • Laboratuvarda inceledi¤iniz ba¤ ve destek doku çeflitlerinin yap›sal özellikleri ve görevleri aras›ndaki iliflkiyi tart›fl›n›z.

LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: KAS DOKU Kas doku, canl›lara hareket özelli¤i kazand›ran, kas›lma ifllevi için özelleflmifl hücreler toplulu¤udur. Bu hücreler “miyosit” olarak adland›r›l›r ve çok küçük, uzunlamas›na parelel kontraktil liflere (miyofibril) sahiptirler. Miyofibriller de birer protein olan aktin ve miyozin’den oluflurlar. Kas hücrelerinin sitoplazmas›na “sarkoplazma” ad› verilir 3 çeflit kas dokusu vard›r.

93

3. Ünite - Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Düz Kas ‹stemsiz hareket eden kaslard›r. ‹¤ fleklindeki hücrelerden yap›lm›flt›r. Hücrelerin çekirdekleri ortada ve iridir. Hücre uçlar› sivri ve çatall›d›r. Yavafl kas›lmalar›na karfl›l›k uzun süre kas›l› kalabilirler. Sindirim sisteminde, büyük damarlar›n orta tabakalar›nda, üreme organlar› ve idrar kesesi gibi organlar›n duvarlar›nda, boflalt›m sistemine ait kanallarda, k›l foliküllerine ba¤l› olarak deride, gözde iriste bulunur.

Çizgili Kas (‹skelet Kas›) ‹ste¤imizle hareket eden kaslard›r. Kas hücrelerinin öncülleri olan miyoblast’lar›n biribiri ard›na yapt›klar› bölünmeler ve kaynaflmalar sonucunda hücreler aras›ndaki s›n›rlar kaybolur. Uzunlamas›na yap›daki çekirdekleri miyofibrillerin d›fl yüzü boyunca dizilirler. Hareketleri çok çabuk fakat k›sa sürelidir. Mikroskopta gözlendi¤inde bantl› yap›da olduklar› görülür. Bu yap›da, ›fl›¤› az k›ran bölgeler aç›k renkli olarak görülür ve bu bölgelere izotrop bölge ya da I band› ad› verilir. Ifl›¤› çift k›ran bölgelereyse anizotrop bölge ya da A band› denir. I band›, Z fleridi ad› verilen bir protein fleritle iki eflit k›sma ayr›l›r. ‹ki Z fleridi aras›nda kalan bölge sarkomer (kas segmenti) olarak adland›r›l›r. 15-40 kadar fibril demeti, d›fltan sarkolem denilen bir zarla örtülmüfltür.

Kalp Kas› ‹stemsiz olarak hareket eden kaslard›r. Çizgili kasa benzer yap›dad›r. Ancak, çekirdekler miyofibrillerin ortas›nda yer almaktad›r. Her sarkomerde bir ya da birkaç çekirdek bulunur. fiekil 3.11 Düz kas boyuna (A) ve enine (B) kesitlerinin ›fl›k mikroskobik görünümü

a)

b) fiekil 3.12 Çizgili kas boyuna (A) ve enine (B) kesitlerinin ›fl›k mikroskobik görünümü

a)

b)

94

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

fiekil 3.13 Kalp kas› boyuna (A) ve enine (B) kesitlerinin ›fl›k mikroskobik görünümü

a)

b)

UYGULAMA: Haz›r Preparat Kullan›larak Kas Doku Çeflitlerinin ‹ncelenmesi Amaç: Kas doku’nun çeflitlerini , vücudun hangi bölgelerinde bulundu¤unu ve birbirinden farkl›l›klar›n› ö¤renmek. Araç ve Gereçler: Ifl›k mikroskobu, haz›r preparatlar Uygulanan ‹fllemler: 1. Mikroskobunuzun 4’ük objektifte olmas›na dikkat ediniz. 2. Size verilen preparat› mikroskop tablas›na yerlefltiriniz. 3. ‹ncelemeye en küçük objektif olan 4’lük objektifle bafllay›p s›ras›yla 10’luk ve 40’l›k objektiflerde de inceleyiniz. (Sizden istenmedi¤i sürece mikroskobu kesinlikle 100’lük objektife getirmeyiniz) 4. ‹nceledi¤iniz kas doku çeflidini mikroskopta gözlemledi¤iniz haliyle çiziniz. Gözlem ve Sonuçlar • Size verilen preparatlardaki kas doku çeflitlerini dikkatlice inceleyerek, bu doku çeflitlerini biribirinden görsel olarak ay›ran özelliklerini (hücre görüntüsü, çekirdek flekli ve konumu, bantlaflma özellikleri vb.) not ediniz. Tart›flma • ‹stemli ve istemsiz çal›flan kas dokusu çeflitlerini ve aralar›ndaki farkl›l›klar› görevleri aç›s›ndan tart›fl›n›z.

3. Ünite - Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Yararlan›lan Kaynaklar K›l›ç, A.Y.,(2000), Genel Biyoloji Laboratuvar› I-II. Eskiflehir, Anadolu Üniversitesi Yay›nlar›. Histoloji ve Embriyoloji (2009), Anadolu Üniversitesi Yay›nlar›. Murathano¤lu O. (1982), Histoloji Laboratuvar› Çizimleri. ‹stanbul Üniversitesi Yay›nlar›.

95

TIBB‹ LABORATUVAR UYGULAMALARI (UYGULAMA K‹TABI)

4 Amaçlar›m›z

N N N N N

Bu üniteyi tamamlad›ktan sonra; Parazitoloji laboratuvar›nda d›flk› örneklerinin incelenmesinde kullan›lan yöntemleri uygulayabilecek, Sindirim sisteminde yerleflen Protozoon parazitleri tan›mlayabilecek, Kan doku ve üregenital sisteminde yerleflen Protozoon parazitleri tan›mlayabilecek, T›bbi önemi olan Helmenit parazitleri tan›mlayabilecek, T›bbi önemi olan parazitik Arthropod parazitleri tan›mlayabileceksiniz.

Anahtar Kavramlar • • • •

Parazitolojik tan› D›flk› Kan Protozoon

• Helmint • Arthropod • Parazit

‹çerik Haritas›

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

• PARAZ‹TOLOJ‹ LABORATUVARINDA DIfiKI ÖRNEKLER‹N‹N ‹NCELENMES‹NDE KULLANILAN YÖNTEMLER • LAB II. S‹ND‹R‹M S‹STEM‹NDE YERLEfiEN PROTOZOON PARAZ‹T ÖRNEKLER‹N‹N ‹NCELENMES‹ • LAB III.KAN DOKU VE ÜREGEN‹TAL S‹STEM‹NDE YERLEfiEN PROTOZOON PARAZ‹T ÖRNEKLER‹N‹N ‹NCELENMES‹ • LAB IV. TIBB‹ ÖNEM‹ OLAN HELM‹NT PARAZ‹TLER‹N‹N ‹NCELENMES‹ • LAB V. TIBB‹ ÖNEM‹ OLAN PARAZ‹T‹K ATHROPOD PARAZ‹TLER‹N ‹NCELENMES‹

T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar› LAB. I. PARAZ‹TOLOJ‹ LABORATUVARINDA DIfiKI ÖRNEKLER‹N‹N ‹NCELENMES‹NDE KULLANILAN YÖNTEMLER Parazitoloji laboratuvar›na gelen d›flk› örneklerinin incelenmesinde öncelikle güvenlik kurallar›n›n bilinmesi gereklidir. Bu laboratuvarlarda çal›flan kifliler, parazit yumurtas› veya kistlerinin yutulmas›, enfektif larvalar›n deriden geçifli ya da d›flk›daki di¤er biyolojik s›v›lardaki paraziter olmayan enfeksiyöz ajanlarca enfekte olmak gibi önemli risklerle karfl› karfl›yad›r. Laboratuvarda çal›fl›rken dikkat edilmesi gereken genel kurallar flu flekilde özetlenebilir: • Çal›flma s›ras›nda laboratuvar önlü¤ü ve lastik eldiven giyilmeli, • Gerekli durumlarda biyolojik güvenlikli kabinler kullan›lmal› (filtreli özel kabinler), • Çal›flma ortam›nda yiyecek yenmemeli, sigara, çay v.b. fleyler içilmemeli, makyaj yap›lmamal›, kontak lens takma, ç›karma, düzeltme yap›lmamal›, • Çal›flma sahas› daima temiz ve düzenli tutulmal›, Akan, dökülen ya da etrafa s›çrayan her türlü örnek ya da maddeler hemen temizlenmelidir. Saha günde bir kez dekontaminasyon (bulafl›klardan uzaklaflt›rma, temizlik) ifllemine tabi tutulmal›, • Ellerde bulunan kesikler, y›rt›klar, yaralar ve ezikler yara band› ya da pansuman malzemeleriyle kapat›lmal›, • E¤er keskin maddeler (bisturi ucu, i¤ne v.b.) kullan›lm›fl bunlar, hemen özel at›k kutular›na yerlefltirilmelidir. Ortada b›rakmak ya da normal çöp kovalaSIRA S‹ZDE r›na atmak sak›ncal›, • Eldivenler ç›kart›l›p uygun biyolojik at›k çöp kutular›na at›l›p, eller temizce y›kanmal›d›r. D Ü fi Ü N E L ‹ M Bu kurallara çal›flanlar›n mutlaka uymas› gereklidir. D›flk› örneklerinin incelenmesinde di¤er ad›mlarsa d›flk› örneklerinin uygun koflullarda toplanmas› ve inS O R U celenmesidir. D ‹ KT›bbi K A T Parazitoloji T›bbi parazitoloji laboratuvar›nda yap›lacak tüm uygulamalardan önce kitab›n›z›n 3. Ünitesini tekrar gözden geçiriniz.

SIRA S‹ZDE

AMAÇLARIMIZ

K ‹ T A P

N N

SIRA S‹ZDE

D Ü fi Ü N E L ‹ M S O R U

D‹KKAT

SIRA S‹ZDE

AMAÇLARIMIZ

K ‹ T A P

98

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

UYGULAMA: Parazitoloji Laboratuvar›nda D›flk› Örneklerinin Toplanmas› ve ‹ncelenmesi Amaç: 1. D›flk› örneklerinin al›nmas› ve incelenmesinde gerekli temel kurallar›n belirlenmesi. 2. D›flk› örneklerinin makroskobik ve mikroskobik incelenmesi için, gerekli temel yöntemlerin ö¤renilmesi. Materyal: %10’luk formalin, D›flk› kab›, Lugol, Fizyolojik Tuzlu Su, Pipet, Santrifüj tüpü, Lam ve Lamel. Uygulanacak ‹fllemler: 1. D›flk› öreklerinin al›nmas›: D›flk› kuru ve s›zd›rmaz kaplar içerisine toplanarak di¤er maddeler (idrar, toprak, saman v.s.) ile kontaminasyonu (bulaflmas›) engellenmelidir. Rutin incelemeler için 2-5 gr örnek yeterlidir. Taze d›flk› ya hemen incelenmeli ya da daha sonra incelenecekse zaman geçirmeden koruyucular içerisine konulmal›d›r. Örnekler mümkün olan en k›sa sürede koruyuculara konulmal›d›r. Bu koruyucular, % 10’luk formalin ya da PVA (polivinil alkol) olabilece¤i gibi ticari olarak sat›lan koruyucularda olabilir. Koruyucu içine konulan d›flk› 1:3 v/v oran›nda olmal›d›r. D›flk› örne¤inin koruyucu s›v› içinde tam olarak da¤›lmas› sa¤lanmal›d›r. D›flk› örneklerinin al›nd›¤› kaplar›n iyice kapat›ld›¤›ndan emin olunmal›d›r. D›flk› muayenesi parazit yönünden negatif ç›karsa hastadan örnek al›nmas› 2-3 gün ara ile üç kez tekrarlanabilir. 2. D›flk›n›n incelenmesi: D›flk› örneklerinin incelenmesinde bu uygulama kapsam›nda iki yöntem kullan›lacakt›r. Bunlar, Makroskobik Yöntem: D›flk›n›n ç›plak gözle yap›lan incelemesidir. D›flk›n›n rengi, kokusu, k›vam› ve varsa Helmint parazitlerin ergin formlar› ya da vücut parçalar› (halklar› gibi) gözlemlenebilir. Mikroskobik ‹nceleme: D›flk› örneklerinin mikroskobik incelemesinde direkt yöntemlerle birlikte, zenginlefltirme yöntemleri de kullan›lmaktad›r. Ancak bu uygulama kapsam›nda d›flk› örnekleri direkt yöntemler kullan›larak incelenecektir. Di¤er yöntemlerle ilgili ayr›nt›l› bilgilere T›bbi Parazitoloji kitaplar›n›z›n 3. Ünitesinden ulaflabilirsiniz. D›flk›n›n direkt olarak incelenmesinde; 1. Fizyolojik tuzlu su ile inceleme: Taze d›flk› örneklerinden özellikle de sulu, mukuslu ve kanl› olan örneklerden bir öze veya baget ile al›nan 1-2 mm3 hacimdeki örnek temiz bir lam üzerinde fizyolojik tuzlu su ile ezilir ve oluflan süspansiyonun üzeri bir lamel ile kapat›l›r. Haz›rlanan preparatlar, ›fl›k mikroskobunda 10X ve 40X objektifte incelenir. D›flk› örnekleri koruyucu içinde gelmifl örne¤in %10’luk formalin içeren tüplerde gelen d›flk› örnekleri, santrifüj tüplerine aktar›l›r ve 1000 devirde bir dakika santrifüj edilir. Üstteki bulan›k s›v› dökülüp altta kalan peletten lam üzerine bir damla örnek al›narak, bu örne¤in üzerine de fizyolojik tuzlu su damlat›l›p lamel ile kapat›larak, ayn› flekilde mikroskopta incelenir. Bu yöntemle barsak parazitlerinin kistleri, trofozoitleri ve helmint yumurtalar› belirlenebilir. 2. Lugol ile boyama: Fizyolojik tuzlu su yönteminde verildi¤i gibi al›nan d›flk› örnekleri lam üzerinde bir damla lugol ile kar›flt›r›l›r ve lamel ile kapat›larak ›fl›k mikroskobunda incelenir.

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

3. Kal›c› Preparatlar›n haz›rlanmas› için boyama yöntemler: Bu yöntemde özellikle protozoon parazitlerin trofozoit ve kistik dönemlerinin daha iyi teflhis edilmesi için, çeflitli boyama metotlar› kullan›l›r. Bu yöntemler di¤er uygulamalarda ayr›nt›l› olarak verilecektir. Gözlem ve Sonuçlar: • Laboratuvarda size verilen d›flk› örneklerini makroskobik ve mikroskobik olarak inceleyerek karfl›laflt›r›n›z. Tart›flma: • D›flk› örne¤inin makroskobik incelenmesinde, d›flk›n›n hangi özelliklerinden yararlan›lmaktad›r? • D›flk› örnekleri 30 dakika içinde incelenemeyecekse hangi ifllemlere tabi tutulmal›d›r? Tart›fl›n›z.

LAB II. S‹ND‹R‹M S‹STEM‹NDE YERLEfiEN PROTOZOON PARAZ‹T ÖRNEKLER‹N‹N ‹NCELENMES‹ Protozoon yönünden incelenecek olan d›flk› materyallerinin hemen incelenmesi tan› yönünden büyük önem tafl›maktad›r. D›flk› örnekleri, su s›zd›rmayan kap içinde ve taze olmal›d›r. Kan ya da mukus içeren sulu ya da yumuflak d›flk› 30 dakika içinde, kat› örneklerse ayn› gün içinde incelenmelidir. Ayr›ca trofozoit formlar›n tespit edilebilmesi için d›flk› örneklerinin en geç 30 dakika içinde laboratuvara ulaflt›r›lmas› gerekmektedir. Önerilen zaman periyodunda iflleme al›nmayan ve incelenmeyen örneklerse daha sonraki bir zamanda incelemek üzere uygun flekilde korunmal›d›r. Bu uygulama kapsam›nda; parazitoloji laboratuvarlar›nda s›kl›kla karfl›lafl›lan protozoon türler incelenece¤inden, boyama yöntemleri olarak ço¤unlukla tercih edilen Trichrom ve Kinyon’un asit-fast boyama yöntemleri ele al›nacakt›r. Sindirim sisteminde yerleflen protozoon parazitlerin tan›s›nda kullan›lan bu yöntemler ilgili bilgilere, T›bbi parazitoloji kitab›n›z›n 3. Ünitesindeki “Gastrointestinal parazitlerin tan›s›nda kullan›lan yöntemler” bafll›kl› bölümden ulaflabilirsiniz. UYGULAMA 1: Entamoeba histolytica ve Entamoeba coli’nin incelenmesi Entamoeba histolytica’n›n trofozoit formlar› 20-50 mikron büyüklü¤ündedir. Ektoplazma belirgin olarak endoplazmadan ayr›lmaktad›r. Pseudopodlar› parlak ve belirgin uzant› verir. Endoplazma ince granüllüdür ve içinde fagosite edilmifl alyuvarlar› bulundurur. Parazitin hareketleri h›zl›d›r. Çekirdekte karyozom merkezidir. Kist formlar›ysa yaklafl›k 15 mikron kadar olup, olgun bir kistte dört çekirdek bulunur. Entamoeba coli’nin trofozoit formlar›ysa E. histolytica’dan daha büyükçedir. Ektoplazmas› endoplazmadan kolayca ayr›lamad›¤› gibi yalanc› ayaklar› kal›n ve küttür. Endoplazmada alyuvar yerine bakteriler bulunur. Çekirdekte karyozom asentral yerleflmifltir. Kist formlar›ysa biraz daha büyük olup olgun kistlerde sekiz çekirdek vard›r. Bu özellikler ancak boyamayla espit edilebildi¤inden teflhislerde, trichrom boyama yöntemi s›kl›kla kullan›lmaktad›r.

99

100

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

a)

b)

E.coli (a) ve E. histolytica’n›n (b) d›flk›da lugolle boyanm›fl kistleri.

Trichrom boyama ile boyanm›fl, E. histoloytica trofozoitleri Amaç: E. coli ve E. histolytica’n›n kistik ve trofozoit dönemlerinin d›flk›da tan›mlanmas›. Materyal: Lam ve lamel, lugol eriyi¤i, serum fizyolojik, damlal›k, pamuk ve Trichrom boyal› haz›r preparatlar. Uygulanan ‹fllemler: 1. %10’luk formalin içinde bulunan d›flk› örne¤inden lam üzerine bir damla alarak lugol ile boyay›n›z ve lamelle kapatarak mikroskopta 40x’lik büyütmeyle inceleme yap›n›z. 2. Size verilen trichrom boyamayla boyanm›fl haz›r preparatlar› mikroskopta 40x’lik büyütmeyle inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar: • E. coli ve E. histolytica’n›n kistik ve trofozoit dönemlerinin morfolojik özelliklerini inceleyerek tan›da kullan›lan ay›rt edici özellikleri gözlemleyiniz. • E. coli ve E. histolytica kistleri aras›ndaki farkl›l›klar› karfl›laflt›rarak inceleyiniz. Tart›flma • Yapt›¤›n›z gözlemlere göre E. coli ve E.histolytica aras›ndaki farklar› tart›fl›n›z. • Laboratuvara getirilen E. histolytica enfeksiyonlu bir d›flk› örne¤inin makroskobik olarak hangi özelliklere sahip olmas›n› beklersiniz? Tart›fl›n›z.

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

UYGULAMA 2: Blastocystis hominis’in incelenmesi. B. hominis’in d›flk›da belirlenen formlar 6-40 µm çap›nda, yuvarlak ve hemen hemen tamamen merkezi olan bir orta cisim taraf›ndan kaplanm›fl yap›lard›r. Orta cismin etraf›nda bir ya da daha fazla say›da çekirdek bulunmaktad›r. B. hominis’in tan›s›nda d›flk›da parazitin tipik bu formlar› lugolle boyanarak incelendi¤i gibi Trichrom boyama yöntemiyle de incelenebilir.

B. hominis’in d›flk›da luggolle boyanm›fl görünümü. Amaç: B. hominis’in tipik flekillerinin d›flk›da tan›mlanarak belirlenmesi. Materyal: Lam ve lamel, Lugol çözeltisi, pamuk, damlal›k. Uygulanan ‹fllem: Size %10’luk formalin içinde verilen d›flk› materyalinden bir damla örnek alarak lugol ile boyama yap›n›z. Haz›rlad›¤›n›z preparat› 40x’lik büyütmeyle ›fl›k mikroskobunda inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar: • Lugolle boyanm›fl B. hominis kistlerinin morfolojik özelliklerini inceleyiniz. Tart›flma: • B. hominis kistleri genlikle hangi tip d›flk›larda bulundu¤unu tart›fl›n›z.

UYGULAMA 3: Giardia intestinalis’in incelenmesi. Kamç›l› Protozoon parazitlerden olan Giardia intestinalis parazitoloji laboratuvarlar›nda s›kl›kla rastlanan parazitlerden birisidir. Laboratuvar tan›s›nda s›kl›kla d›flk› örne¤i incelenir. fiekilli d›flk›larda genellikle parazitin kistik formu, sulu d›flk›lardaysa trofozoit formu baz› durumlardaysa her iki flekli de görülebilir. Trofozoitler ortas›ndan ikiye bölünüfl armut biçiminde olup, 9-21 µm boyunda, 5-15 µm çap›ndad›rlar.

101

102

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Genellikle Trichrom boyamayla boyanm›fl preparatlarda iki çekirde¤i, dört çift blefaroplast› ve bunlardan ç›kan dört çift kamç›s› bulunur. Ventral bölgesinde kona¤a yap›flmay› sa¤layan bir emici disk bulunur. D›flk›da tipik görünümleri ve s›çrama ve bükülme fleklindeki hareketleriyle rahatl›kla tan›mlan›rlar. Kistik dönemleriyse, oval ya da yuvarlak olan çift çeperlidirler. Kistler 7-10 µm eninde, 8-14 µm boyundad›rlar ve serum fizyolojikle ya da lugolle boyanm›fl olan preparatlarda olgunlaflmam›fl kistlerde iki çekirdek görülürken olgunlaflm›fl olanlarda dört çekirdekli görülürler.

a)

b)

Serum fizyolojikle haz›rlanm›fl (a) ve lugolle haz›rlanm›fl (b) d›flk›da G. intestinalis kistleri.

Trichrom boyamayla boyanm›fl G. intestinalis kistleri. Materyal: lam, lamel, lugol eriyi¤i, serum fizyolojik, damlal›k, pamuk, Trichrom boyamayla boyanm›fl haz›r preparatlar. Uygulanan ‹fllemler: 1. Size verilen %10’luk formalin içindeki d›flk› örne¤inden lam üzerine bir damla alarak lugol ile boyay›n›z ve lamelle kapatarak mikroskopta 40x’lik büyütmeyle inceleme yap›n›z. 2. Size verilen Trichrom boyal› haz›r preparatlar› mikroskopta 40x’lik büyütmeyle inceleyiniz.

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Gözlem ve Sonuçlar • Giardia intestinalis’in kist ve trofozoit formlar›n› ayr›nt›l› olarak inceleyip tan›da kullan›lan morfolojik özelliklerini belirleyiniz. Tart›flma • Formalinli d›flk›da sadece kistij dönemleri gözlemlemenizin nedenlerini tart›fl›n›z. • Trichrom boyama yönteminin G. intestinalis tan›s›nda kullan›lmas›ndaki nedenlerini tart›fl›n›z.

UYGULAMA 4: Isospora belli’nin d›flk›da incelenmesi Protozoonlar›n Sporozoa filumunda yer alan I. belli’nin konak d›flk›s›nda görülen dönemi oval veya yuvarlak flekilde olan olgunlaflmam›fl ookistlerdir. Ookistler, 20-30 µm boyunda, 10-19 µm enindedir. Olgunlaflm›fl ookistler ise beklemifl d›flk› örneklerinde görülebilir. Bu kistler ise içinde her biri kist duvar›yla çevrelenmifl olan sporoblastlar içeren sporokistler fleklinde belirlenirler. D›flk› örneklerinde ookistler serum fizyolojik ya da lugolle boyanarak incelendikleri gibi Asit-Fast boyama yöntemi de kullanarak tan›mlanabilirler.

a)

b)

Lugolle (a) ve Asit-Fast boyamayla boyanm›fl olgunlaflmam›fl (b) I. Belli’nin olgunlaflm›fl ookistleri. Amaç: D›flk›dan haz›rlanan Asit-Fast boyal› preparatlarda I. belli ookistlerini tan›mlamak. Materyal: Asit-Fast boyamayla boyanm›fl haz›r preparatlar. Uygulanan ‹fllemler: Size verilen haz›r preparatlar› önce 40X daha sonra 100X büyütmeyle mikroskopta inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar: • I. belli ookistlerinin enfektif dönemde olup olmad›klar›n› tespit ederek inceleyiniz. • Boyaman›n hangi tip oldu¤unu ve kistleri boyama özelli¤ini inceleyiniz.

103

104

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Tart›flma • Laboratuvara gelen d›flk› örneklerinde I. belli’nin ookistelerinin olgunlaflm›fl ya da olgunlaflmam›fl olmas›n›n nedenlerini ve bu durumun önemini tart›fl›n›z.

UYGULAMA 5: Cryptosporidium parvum ve Cyclospora cayetanensis’in incelenmesi Cryptosporidium parvum Sporozoon parazitlerden olup, konak d›flk›s›na at›lan ookistlerin belirlenmesiyle tan›mlan›rlar. Konak d›flk›s›nda görülen ookistler, kal›n çeperli olup 4-6 µm çap›ndad›rlar. Cyclospora cayetanensis ise ishalli kiflilerin d›flk›s›nda görülen 8-10 µm çap›ndaki ookistlerin belirlenmesiyle tan›mlan›rlar. Her iki türün tan›s›nda da d›flk› materyali Kinyon’un Asit-Fast boyama yöntemiyle boyanarak incelenmektedir. Boyanan preparatlarda ookistler aç›k pembe veya koyu k›rm›z› renkte boyand›klar›ndan benzer görünüm verirler. Ancak her iki türün tan›mlanmas›nda ookistlerin büyüklükleri ay›rt edici özelliktir ve büyüklüklerine göre tan›mlanarak rapor edilirler.

a)

b)

Cryptosporidium parvum (a) ve Cyclospora cayetanensis’in (b) Kinyon’un Asit-Fast boyamayla boyanm›fl ookistlerinin karfl›laflt›rmal› olarak gösterimi. Amaç: D›flk› örneklerinde C. parvum ve C. cayetanens ookistlerinin tan›mlanmas›. Materyal: Lam, lamel, lugol eriyi¤i, serum fizyolojik, damlal›k, pamuk, Kinyon’un asit-fast boyama ile boyanm›fl haz›r preparatlar. Uygulanan ‹fllemler: 1. Size verilen %10’luk formalin içindeki d›flk› örne¤inden lam üzerine bir damla alarak lugol ile boyay›n›z ve lamelle kapatarak mikroskopta 40x’lik büyütmeyle inceleme yap›n›z. 2. Size verilen Kinyon’un Asit-fast boyal› haz›r preparatlar› mikroskopta 40x’lik büyütmeyle inceleyiniz.

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

105

Gözlem ve Sonuçlar: • C. cayetanensis ve C. pavum ookistlerini karfl›laflt›rarak, tan›da kullan›lan özelliklerini inceleyiniz. Tart›flma: • C. cayetanensis ve C. pavum ookistleri aras›ndaki farklar› tart›fl›n›z. • Kinyon’un asit-fast boyama yönteminin kullan›lma nedenlerini tart›fl›n›z.

LAB III. KAN DOKU VE ÜROGEN‹TAL S‹STEMDE YERLEfiEN PROTOZOON PARAZ‹T ÖRNEKLER‹N ‹NCELENMES‹ Kanda bulunan Protozoon parazitlerden Plasmodium’lar›n, Leishmania ve Trypanosom’lar›n tan›s›nda kan dokudan haz›rlanarak boyanan preparatlar incelenmektedir. Kandan haz›rlanan bu preparatlarda parazitler, morfolojik özelliklerine göre SIRA S‹ZDE mikroskobik olarak incelenirler. Parazitin say›s› kanda çoksa rutin incelemeler s›ras›nda tan› konulabilir ancak az say›daysa yo¤unlaflt›r›lan örneklerin incelenmesi gereklidir. Parazitoloji laboratuvarlar›nda yap›lan rutin incelemelerde PlasD Ü fi Ü N E Ls›kl›kla ‹M modium’lar›n neden oldu¤u s›tma tan›s›nda ince ve kal›n damla preparatlar› haz›rlan›rken di¤er kan parazitlerinin tan›s›nda, Giemsa ile boyanm›fl yayma kan prepaS O R U ratlar› haz›rlanmaktad›r. T›bbi parazitoloji kitab›n›z›n 3. Ünitesindeki kan dokuda ve ürogenital yerleD ‹ sistemlerde KKAT flen parazitlerin tan›s›nda kullan›lan yöntemler bölümlerini tekrar gözden geçiriniz. SIRA S‹ZDE

N N

UYGULAMA 1: S›tma etkeni Plasmodium türlerinin tan›s›nda kullan›lan yöntemler ve Plasmodium falciparum ve P. vivax’›n incelenmesi AMAÇLARIMIZ

S›tma hastal›¤› etkenleri Plasmodium’lard›r. Plasmodium’lar insanlara sivrisineklerle bulafl›r. Parazitler öncelikle karaci¤er hücrelerine, daha sonrada eritrositler içine K ‹ T A P yerleflirler. Eritrositler içerisinde bafllang›çta tipik olarak tafll› yüzük ya da halka görünümleri vard›r. Yüzü¤ün tafll› k›sm›n› çekirdek oluflturur ve pembe k›rm›z› renktedir. Sitoplazma, yüzü¤ün halkas›na benzer ve mavi renktedir. S›tma parazitlerine TELEV‹ZYON ait di¤er elemanlar bu yöntemle incelenirler ve etkenin tan›mlanmas› gerçeklefltirilir.

‹NTERNET

a)

b)

Plasmodium vivax (a) ve P. falciparum’un (b) giemsa ile boyanan ince yayma preparatlardaki yüzük ya da halka dönemi.

SIRA S‹ZDE

D Ü fi Ü N E L ‹ M S O R U

D‹KKAT

SIRA S‹ZDE

AMAÇLARIMIZ

K ‹ T A P

TELEV‹ZYON

‹NTERNET

106

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Amaç: S›tma tan›s›nda kullan›lan genel yöntemleri uygulamak ve P. vivax, P. falciparum türlerini incelemek. Materyal: Lam ve lamel, pamuk, alkol, lanset, giemsa boyas›, fosfat tamponu, distile su, boyama küveti, methanol, haz›r preparat. Uygulanan ‹fllemler: 1. S›tma tan›s› amac›yla kan preparatlar›n›n haz›rlanmas›: Bu yöntemle kanda yerleflen Plasmodium türlerinin yaflam döngüsünde insanda bulunan dönemleri belirlenir. Bu amaçla parmaktan al›nan kanla ince ve kal›n damla preparatlar› haz›rlan›r. Bu ifllemler için afla¤›da verilen basamaklar› s›ras›yla uygulay›n›z; • Bu ifllemlerde daha önce kullan›lmam›fl lam ve lameller kullan›n›z. Lam ve lameller eteralkol kar›fl›mlar›ndan geçirilerek temiz bir cam beziyle kurulay›n›z, • Kan al›nacak kiflinin sol elinin yüzük parma¤›n›n iç yüzünün derisi, %70’lik alkolle dezenfekte ettikten sonra, steril lanset ile deliniz. • Parma¤› daha geriden yavaflça s›karak ortaya ç›kan ilk damla kan damlas› kuru bir pamukla silin. ‹kinci damla kan›, temizlenmifl lam›n üzerine ve k›sa kenar›na yak›n k›sm›na de¤dirilerek al›n›z, • ‹nce yayma preparat haz›rlamak için, Parmaktan al›nan ve lam üzerine konulan bu kan damlas›n› ikinci bir lam ya da lamel yard›m›yla birinci lamla aras›nda 45° aç› olacak flekilde, kan damlas›na do¤ru yaklaflt›r›n. Kan, lam›n kenar›na yay›ld›ktan sonra ileri do¤ru çekilip ince yaymay› tamamlay›n›z. ‹nce yaymada tüm hücreleri incelemek mümkündür. • Kal›n damla preparat haz›rlamak için, ayn› fleklide parmak ucundan kan al›narak lam üzerine konulur. Bu kez di¤er lam›n sivri ucu kullan›larak 1,5 cm2’lik bir alan› geçmeyecek flekilde kar›flt›r›larak kan›n p›ht›laflmadan kurumas› sa¤lay›n›z. Bu durumda eritrositler parçalanarak parazitler a盤a ç›kacak, az bir alana daha yo¤un parazit düflmesi sa¤lanacakt›r.

‹nce yayma kan preparat›n›n haz›rlan›fl›.

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

A-Kal›n damla preparat›n haz›rlan›fl› B-Kal›n damla ve ince yayman›n ayn› lamda haz›rlan›fl›. 2. Haz›rlanan preparatlar›n Giemsa boyama yöntemi ile boyanmas›: Giemsa boyama yönteminden, kan›n flekilli elemanlar›n›n de¤erlendirilmesinde ve kan parazitlerinin tan›s›nda yararlan›lmaktad›r. Bir hastadan al›nan kan örne¤inin ayn› lam üzerinde hem ince yayma, hem de kal›n damla preparat›n yap›lmas›nda pratik aç›dan yarar vard›r. Giemsa boyas› kullan›lacak hacimde taze olarak haz›rlanmal›d›r. Giemsa boyama yönteminde afla¤›daki ifllemleri s›ras›yla yap›n›z; • Haz›rlad›¤›n›z ince yayma preparat›, metil alkol ile 3 dakika tespit ediniz. Kal›n damla için tespit ifllemi yapmay›n›z. • Fiksasyondan sonra preparat› Giemsa boyas›na dald›r›larak 30 dakika bekletiniz. Süre sonunda preparat›, önce distile su ile daha sonra da fosfat tamponunda y›kay›n›z. • Preparat havada kurutulduktan sonra önce 40X büyütmeyle sonra da 100X büyütmeyle mikroskopta inceleyerek, alyuvarlarda Plasmodium enfeksiyonunun varl›¤›n› araflt›r›n›z. Gözlem ve sonuçlar: • Haz›rlad›¤›n›z preparatlarda ve size verilen boyanm›fl preparatlarda P. vivax ve P. falciparum trofozoitlerini karfl›laflt›rarak inceleyiniz. Tart›flma • Giemsa ile boyanan preparatlarda Plasmodium türlerinin hangi dönemlerine rastlayabilirsiniz? Tart›fl›n›z. • ‹nce ve kal›n yayma preparatlar›n inceleme yönünden birbirlerine göre avantajlar› ve dezavantajlar› nelerdir ? Tart›fl›n›z.

107

108

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

UYGULAMA 2: Trypanosoma gambiense ve Leishmania donovani’nin incelenmesi. Trypanosoma gambiense giemsa boyama yöntemi ile boyanan kan yayma preparatlar›nda 14-33 µm boyunda tripomastigot döneminde bulunurlar. Eritrositler aras›nda bulunan tripomastigotlar›n sitoplazmas› mavi, çekirdek, kinetoplast ve blefaroblast› k›rm›z› renkte boyan›rlar. Tek olan kamç›lar› k›rm›z›, dalgal› zar ise soluk mavi renkte boyan›rlar.

Giemsa ile boyanm›fl kan ince yayma preparat›nda T. gambiensa tripomastigotlar›. L. donovani insanda kan dokuda yerleflti¤i dönemde amastigot fleklinde bulunurken, omurgas›z “kona¤›nda yani vektöründe” promastigot dönemde bulunurlar. Giemsa ile boyanan preperatlarda amastigotlar, kamç›s›z, oval veya yuvarlak flekilde 2-4 µm büyüklü¤ündedirler. Amastigotlar hücre içinde veya hücreler parçaland›klar›nda hücre d›fl›nda kümeler halinde de bulunabilirler. Giemsa ile boyand›ktan sonra amastigotlar›n sitoplazmas› mavi, çekirde¤i ise pembe yada koyu k›rm›z› renkte boyan›r. Vektörde veya kültür ortam›nda L. donovani’nin hareketli ve kamç›l› olan promastigot dönemi bulunur.

Giemsa ile boyanm›fl kan ince yayma preparat›nda L. donovani’nin amastigotlar›.

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Kültür ortamlar›ndan haz›rlanan giemsa ile boyanm›fl preparatlarda L. donovani’nin promastigotlar›. Amaç: Trypanosoma gambiense ve Leishmania donovani’nin kan preparatlar›nda tan›mlanmas›. Materyal: Haz›r preparatlar. Uygulanan ‹fllem: Size verilen kan dokusundan haz›rlanm›fl preparatlar› 100X büyütmeyle inceleyiniz. Gözlem ve sonuçlar: • T. gambiense’nin tripomastigot dönemlerinin kamç› ve zar yap›lar›n› ayr›nt›l› olarak gözlemleyiniz. • L. donovani’nin hem amastigot, hem de promastigot dönemlerinin karakteristik özelliklerini ayr›nt›l› olarak inceleyiniz. Tart›flma: • T. gambiense’nin kanda görülen dönemiyle vektörde bulunan dönemi aras›ndaki farkl›l›klar› karfl›laflt›rarak tart›fl›n›z. • L. donovani’nin amastigot döneminin tan›da kullan›lmas›n›n nedenlerini tart›fl›n›z. • T. gambiense’nin tripomastigot dönemiyle L. donovani’nin promastigot döneminin morfolojik özellikleri aç›s›ndan temel fark nedir?

UYGULAMA 3: Trichomonas vaginalis’in incelenmesi. ‹nsanda ürogenital sistemde yaflayan T. vaginalis, kamç›l› bir Protozoon olup, yaflam döngüsünde sadece trofozoit dönemi bulunmaktad›r. Trofozoit 8-30 µm uzunlu¤unda, 5-15 µm eninde olup, görünümü armuda benzer. Trofozoidin ön ucunda dört serbest kamç› bulunurken d›fl kenar› boyunca uzanan kamç›ysa arka uçta serbest halde de¤ildir. Trofozoidin d›fl kenar›nda dalgal› zar bulunmaktad›r. Bu nedenle dalgalanma fleklinde hareket etmektedir. Çekirdek tek olup, ön tarafa daha yak›nd›r. Tan›da kullan›lan inceleme materyali, vajina ve üretra salg›s›, masajla elde edilen

109

110

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

prostat s›v›s› ve baz› durumlarda idrard›r. Lamlamel aras›nda haz›rlanan preparatlar direkt olarak mikroskopta incelenebildi¤i gibi, giemsa ile boyanarak da incelenebilir.

T. vaginalis’in giemsa ile boyanan preparatlardaki trofozoit dönemleri. Amaç: Vajinal sürüntü öreklerinden haz›rlanan giemsa boyal› preparatlarda T. vajinalis’in tan›mlanmas›. Materyal: Haz›r preparat Uygulanan ‹fllem: Size verilen haz›r preparatlar› 40X’lik büyütmeyle mikroskopta inceleyiniz. SIRA S‹ZDE

S‹ZDE GözlemSIRA ve sonuçlar: • T. vajinalis’in kamç› ve hücre yap›s›n› ayr›nt›l› olarak inceleyiniz.

D Ü fi Ü N E L ‹ M

D Ü fi Ü N E L ‹ M Tart›flma • T. vajinalis’in yaflam bölgesi ve bulaflma flekilleri hakk›nda tart›fl›n›z.

S O R U

D‹KKAT

SIRA S‹ZDE

AMAÇLARIMIZ

S O R U D ‹ K K Akitab›n›z›n T T›bbi parazitoloji 3. Ünitesinden T. vajinalis tan›s›nda kullan›lan mikroskobik ve kültür yöntemleri bölümlerini tekrar gözden geçiriniz.

N N

SIRA S‹ZDE

LAB IV. TIBB‹ ÖNEM‹ OLAN HELM‹NT PARAZ‹TLER‹N ‹NCELENMES‹ AMAÇLARIMIZ

UYGULAMA 1: Ascaris lumbricoides’in incelenmesi

K ‹ T A P

TELEV‹ZYON

‹NTERNET

K ‹ T A P

Bir ba¤›rsak Helminti olan Ascaris lumbricoides’in hem d›flk› örneklerinde hem de haz›r preparatlarda incelenmesinde yumurta dönemlerine bak›lmaktad›r. Ayr›ca baz› d›flk›lardaki ergin dönemleri de makroskobik olarak ç›plak gözle incelenebilir. TELEV‹ZYON D›flk›da görülen döllenmemifl yumurtalar›n kabuklar› iki tabakal› iken döllenmifl olan yumurtalar üç katmanl›d›r ve oval biçimdedirler. Yumurtalar 45-75 µm boyunda, 35-50 µm enindedirler. ‹NTERNET

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

A. lumbricoides’in d›flk›da makroskobik olarak görülebilen ergin dönemi.

A. lumbricoides’in lugolle boyanm›fl döllenmifl yumurtalar›. Amaç: A. lumbricoides’in tan›s›nda kullan›lan yöntemleri ve dönemlerini tan›mlamak. Materyal: Lam, lamel, lugol, serum fizyolojik çözeltisi, pamuk, damlal›k. Uygulanan ‹fllem: 1. Size verilen d›flk› örneklerini makroskobik olarak inceleyerek ergin Ascaris varl›¤›n› araflt›r›n›z. 2. Size verilen d›flk› örneklerinden lugollü ve serum fizyolojikli preparatlar haz›rlayarak Ascaris yumurtalar›n› inceleyiniz. Gözlem ve sonuçlar • Döllenmifl ve döllenmemifl yumurtalar aras›ndaki fark› haz›rlad›¤›n›z preparatlarda inceleyiniz. • ‹nceledi¤iniz ergin dönemin morfolojik özelliklerini tan›mlay›n›z. Tart›flma • Döllenmifl ve döllenmemifl yumurtalar aras›ndaki morfolojik farklar› tart›fl›n›z. • D›flk›da sadece döllenmemifl yumurta tan›mland›¤›nda hastaya verilecek sonuç raporuna hangi bilgiler eklenmelidir? Tart›fl›n›z.

111

112

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

UYGULAMA 2: Enterobius vermicularis’in incelenmesi. Halk aras›nda k›l kurdu diye bilinen Enterobius vermicularis bir ba¤›rsak Helmintidir. Diflileri yumurtlar›n› kona¤›n anüs çevresine b›rakt›¤› için tan›da selofan bant yöntemi kullan›lmaktad›r. Selofan bantl› örnekler direk olarak ya da serum fizyolojik ya da lugol ile boyanarak mikroskopta incelenerek yumurta ya da ergin formlar tespit edilmektedir. Enterobius vermicularis’in yumurtalar› ekmek somununa benzer flekilde, bir taraf› düz di¤er taraf› konvekstir. ‹çinde larva bulunan yumurtalar renksiz, fleffaf ve kal›n bir kabu¤a sahiptir.

E. vermicularis’in serum fizyolojik ve lugolle boyanm›fl yumurtalar›. Amaç: E. vermicularis’in ergin ve yumurta dönemlerini selofan bant preparatlar›nda incelemek. Materyal: Lam ve lamel, selofan bant, alkol, pamuk, eldiven Uygulanan ‹fllem: 1. Laboratuvara gelen hastalara temiz ve kuru bir lam üzerine ayn› genifllikte bir saydam selofan fleriti lam boyunca yap›flt›r›n›z. ‹ki ucundan lam cam›n›n alt yüzeyine biraz k›v›r›n›z. 2. Lam›n bir ucuna flerit geniflli¤inde bir ka¤›t yap›flt›rarak ekleyiniz. Ka¤›da hastan›n ad›, yafl›, efleyi ve yerini yaz›n›z. Hastaya afla¤›daki ifllemleri yapmas› için anlat›n›z; • Sabah d›flk›lamadan önce yani yataktan kalkar kalkmaz kifli domalma durumuna gelir ve lam üzerindeki saydam selofan bant›n›n yap›flkan olmayan s›rt yüzü bafl parma¤›na dayan›r ve yaln›z bir ucunu çekerek lamdan ay›r›l›r. Selofan band›n›n yap›flkan yüzüyle makat (anüs kenar›) birkaç kez o¤uflturulur. E¤er burada yumurta varsa (genellikle Enterobius yumurtalar›d›r) selofan fleridine yap›fl›rlar. Sonra selofan bant yeniden gerilerek lam üzerine yap›flt›r›l›r. 3. Hasta bu preparat› laboratuvara getirdikten sonra preparat› mikroskopta 10x’lik ve 40x’lik objektifte inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar • Size verilen selofan bantl› örnekleri inceleyerek, yumurtalar› ve erginleri tespit ediniz.

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

• Hava kabarc›¤›yla yumurta aras›ndaki ayr›m› ö¤renerek inceleme yap›n›z. • Yumurta kapsülü içindeki larvalara dikkat ediniz. Tart›flma • E. vermicularis tan›s›nda d›flk› yerine selofan bantl› yöntem kullan›lmas›n›n nedenlerini tart›fl›n›z. • Selofan bantl› preparatlarda E. vermicularis d›fl›nda baflka hangi parazit türlerinin yumurtalar›na rastlanabilece¤ini tart›fl›n›z.

UYGULAMA 3: Trichuris trichiura’n›n incelenmesi. Trichuris trichiura’n›n yumurtalar›n›n d›flk›da belirlenmesiyle tan› konulabilir. Seleofan bantl› preparatlarda da yumurtalara rastlan›labilir. Yumurtalar, limona benzer bir flekildedir, 50-54 µm boyunda, 22-23 µm enindedir. Yumurtan›n etraf›n› çeviren kabuk, düz, kal›n, sar›, kahverengi ya da k›rm›z›ms› renktedir ve yumurtan›n her iki ucunda renksiz t›kaçlar bulunur.

T. trichiura’n›n lugolle boyanm›fl yumurta dönemi ve erginleri. Amaç: T. trichiura’n›n ergin ve yumurta dönemlerini d›flk›da tan›mlamak. Materyal: Lam ve lamel, lugol, pamuk, alkol, eldiven. Uygulanan ‹fllem: • Size verilen formalinli d›flk› örneklerinden lugol ile preparat haz›rlayarak yumurta dönemlerini 10 ve 40X’lik büyütmeyle mikroskopta inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar: • T. trichiura’n›n yumurta dönemlerinin parazitolojik tan›da kullan›lan morfolojik özelliklerini inceleyiniz. Tart›flma: • T. trichiura’n›n inceledi¤iniz di¤er Helmint yumurtlar›ndan morfolojik olarak temel fark› nedir? Tart›fl›n›z.

113

114

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

UYGULAMA 4: Dicrocoelium dendriticum ve Fasciola hepatica’n›n incelenmesi Fasciola hepatica’n›n tan›s›, d›flk›da ya da safra suyunda görülen yumurtalar›n tan›mlanmas›yla yap›l›r. Yumurtalar, 130-140 µm boyunda, 70-90 µm eninde olup, bir ucunda kapak bulunmaktad›r.

F. hepatica’n›n ergin dönemi ve yumurta dönemi. Dicrocoelium dendriticum tan›s› d›flk›da görülen yumurtalar›n tan›mlanmas›yla yap›l›r. D›flk›da görülen yumurtalar kapakl›, koyu kahverengi renkte ve Fasciola hepatica’n›n yumurtlar›ndan küçüktür.

D. dendriticum’un ergin dönemi ve yumurta dönemi. Amaç: D›flk›da F. hepatica ve D. dendriticum yumurtalar›n› tan›mlamak ve haz›r preparatlarda ergin dönemlerini incelemek. Materyal: Lam, lamel, lugol, alkol, pamuk, damlal›k, eldiven, haz›r preparat. Uygulanan ‹fllem: 1. Size verilen formalinli d›flk› örneklerinden serum fizyolojik ile preparat haz›rlayarak yumurta dönemlerini 10 ve 40X’lik büyütmeyle mikroskopta inceleyiniz. 2. Size verilen haz›r preparatlardan F. hepatica ve D. dendriticum’un ergin dönemlerini mikroskopta inceleyiniz.

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Gözlem ve Sonuçlar: Her iki parazit yumurtalar›n›n morfolojik özelliklerini ayr›nt›l› inceleyerek birbirlerinden olan farklar›n› tan›mlay›n›z. Tart›flma: • Fasciola ve Dicrocoelium yumurtalar› aras›ndaki farkl›l›klar›n nedenlerini karfl›laflt›rarak tart›fl›n›z. • D›flk› örneklerinde sadece aç›k kahverengi yumurtalar›n bulunmas›, sonuç raporunu nas›l etkileyecektir? Tart›fl›n›z.

UYGULAMA 5: Taenia saginata’n›n incelenmesi T. saginata eriflkin formu insanda bulunan, bafl› (skoleks) ile jejenuma tutunarak, halkalar› (proglottis) ile 10m uzunlu¤a eriflebilen, insanlar›n sindirdi¤i besinlerle beslenen fleritsi bir parazittir. Larval dönemini s›¤›rlarda yaflar. Ergin halkalar› anüsten kendi hareketleriyle d›flar›ya ç›kabildi¤inden tan›, laboratuvara getirilen halkalar üzerinden yap›l›r. Kesin tan›, düflen halkalar›n incelenmesiyle konur. Gebe halkada T.saginata’da 15-20 aras›nda uterus yan dal› varken; T.solium da bu say› 7-13 tür. Halkalar›n yumurtlama delikleri olmad›¤›ndan Taenia yumurtas›na d›flk›da genellikle rastlanmaz. D›flk›da yumurtalar görülse bile bunlar›n hangi Taenia yumurtas› oldu¤una karar verilemez. Yumurtalar› 30-40 µm çap›nda, ovalimsi, cidar› enine çizgili, ortadaki embriyosu ise üç çift çengellidir. D›flk›n›n nativ-lugol, flotasyon yöntemleriyle incelenmesi ve selofanl› lam gibi klasik yöntemlerle yumurtalar kolayca tan›n›r. Ayr›ca tedavi ile skoleks düflerse onun da incelenmesiyle ay›r›c› tan› konulabilir. T.solium skoleksinde bulunan rostellumdaki çengel T.saginata’da yoktur.

T. saginata’n›n yumurta ve ergin dönemi. Amaç: T. saginata’n›n ergin ve yumurta dönemlerini inceleyerek tan›mlayabilmek. Materyal: Lam, lamel, alkol, pamuk, pens, diseksiyon i¤nesi ve eldiven. Uygulanan ‹fllem: 1. Size verilen formalinli materyallerden serum fizyolojikle preparat haz›rlayarak mikroskopta yumurtalar› inceleyiniz. 2. Taenia halka ve ergin dönemini mikroskobik olarak inceleyiniz.

115

116

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Gözlem ve sonuçlar: • T. saginata yumurtalar›n›n morfolojik özelliklerini inceleyerek ay›rt edici özelliklerini tan›mlay›n›z. • T. saginata’n›n ergin dönemini inceleyiniz ve büyüklü¤ünü ölçünüz. Tart›flma: • T. saginata tan›s›nda kullan›labilecek örnekleri karfl›laflt›rarak tart›fl›n›z. • T. saginata ve T. solium tan›s›ndaki temel farklar› karfl›laflt›rarak tart›fl›n›z.

UYGULAMA 6: Schistosoma haematobium’un incelenmesi Schistosoma haematobium’un laboratuvardaki rutin incelemelerinde idrarda görülen yumurtalarla tan› konulur. Yumurtalar, sar›ms› kahverengi olup, 115-170 µm boyunda, 45-65 µm enindedir. Ayr›ca yumurtan›n ucunda bir diken vard›r.

S. haematobium’un yumurta ve ergin dönemi. Amaç: S. haematobium’un tan›da kullan›lan yumurta ve ergin dönemini incelemek. Materyal: Lam ve lamel, pamuk, alkol, eldiven, haz›r preparat. Uygulanan ‹fllem: 1. Size verilen formalinli materyalden lugol ile preparat haz›rlayarak yumurta dönemlerini 40X’lik büyütmeyle mikroskopta inceleyiniz. 2. Haz›r preparatlarda ergin dönemlerini inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar:s • S. haematobium’un ergin dönemini inceleyerek diflinin birleflti¤i kanala dikkat ediniz. • ‹nceledi¤iniz yumurtalar›n dikenlerinin konumunu belirleyiniz. Tart›flma • S. haematobium tan›s›nda idrar kullan›lmas›n›n nedenlerini tart›fl›n›z. • Yumurtalarda inceldi¤iniz dikenin konumunun nedenlerini tart›fl›n›z.

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

LAB V. TIBB‹ ÖNEM‹ OLAN PARAZ‹T‹K ARTHROPODLARIN ‹NCELENMES‹ Bu laboratuvar çal›flmas›nda, rutin parazitolojik tan›da rastlan›lan örnekler incelenilecektir. T›bbi önemi olan Arthropod parazitlerle ilgili bilgilerinizi T›bbi parazitoloji kitaplar›n›z›n 10. Ünitesinden hat›rlay›n›z. UYGULAMA: Pediculus capitis (‹nsan bafl biti), Pulex irritans (pire), Culex sp. (Sivrisinek), Sarcoptes scabiei (uyuz etkeni), Ixodes ricinus (kene)’un incelenmesi. Bitler bir ya da birkaç mm uzunlu¤unda dorsaventral olarak yass›laflm›fl kanats›z böceklerdir. ‹nsan bafl biti tipik olarak bafl derisi ve bafl bölgesinde görülmektedir. Difliler, halk aras›nda sirke ad› verilen yumurtalar›n› saç diplerine tutturmaktad›r. Saç büyüdükçe yumurtalar deriden uzaklafl›r ve görünür. Hastan›n ne kadar süre enfeksiyona maruz kald›¤› deriyle yumurta aras›ndaki mesafeden tespit edilebilmektedir. Ancak, ergin bafl biti, vücut bitine oranla genellikle daha küçüktür (1,5-2,6 mm). Ergin pireler kanats›z olup, 1-8mm boyunda, vücutlar› yandan bas›kt›r. Birçok pire türünün vücudu k›llarla donanm›flt›r. K›llar ve ktenidiumlar, konakç›n›n k›l›ndan ve derisinden kurtulmaya yard›mc›d›rlar. Yumurtalar› küçük(0.1-0.5mm),oval ve beyazd›r. Larvalar› uzun olup ayaks›z ve gözsüzdürler. Larvalar›n abdomen k›sm›nda s›ral› fliflkin vücut k›llar› bulunur. Baflta çi¤neme mandibullar› ve pupa tabakas›n› oluflturan bir çift ipek bez bulunur. Pire larvalar›n›n ço¤u küçük, hareketli ve beslenme için çok isteklidir. Bir sivrisinek basitçe, bafl, gö¤üs, ve kar›n k›sm›ndan oluflur. Bafl›n›n iki yan›nda antenleri vard›r. Erkek sivrisinekler, diflileri kanat ç›rpma seslerinden tan›yabilirler. Gö¤üs k›sm›nda kanatlar› ve 3 çift ayaklar› bulunur. Kar›nlar›ysa onlara kendi a¤›rl›klar›ndan fazla kan emme flans› tan›yacak biçimde esnek bir deriye sahiptir. Sarcoptes scabiei homin ‘in vücudu s›rt kar›n yönünde yass› ve genifl ovalimsidir. Parlak kirli sar› renktedir. Prosoma k›sa koniktir. Çok k›sa bacakl›d›rlar. Diflileri 0,4 mm. boyunda 0,30 mm. enindedir. Erkekler ise 0,2 mm. boyunda 0,15 mm. enindedir. Bu akarlar uçamaz ve z›playamaz; ancak s›cak deri üzerinde, 2.5 cm/dakika h›zla ilerleyebilirler. Kenelerde toraks ve abdomen tamamen birleflmifltir. Olgunlar›nda ve nimflerinde 4 çift ayak, larvalar›ndaysa 3 çift ayak vard›r. Bu parazitler ovaryumdan yumurtaya geçerek, yumurtadan ç›kan larvalar› enfekte ederler. Bu larvalar kan emerken parazitleri de hayvanlara tafl›rlar.

Pediculus capitis (bafl biti) ve Pulex irritans’›n (pire) ergin dönemi.

117

118

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Culex sp. (Sivrisinek) ergin dönemi

Sarcoptes scabiei (uyuz etkeni) ve Ixodes ricinus (sert kene) ergin dönemi Amaç: T›bbi önemi olan eklembacakl› parazitlerden parazitoloji laboratuvarlar›nda ço¤unlukla incelenen türleri tan›mlamak. Materyal: Haz›r preparatlar. Uygulanan ‹fllem: Size verilen haz›r preparatlar› türlere göre mikroskopta inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar: • Haz›r preparatlarda inceledi¤iniz tüm türlerin a¤›z yap›lar›n› inceleyiniz. • ‹nceledi¤iniz eklembacakl› parazitlerin temel morfolojik özelliklerini tan›mlay›n›z. Tart›flma: • ‹nceledi¤iniz türlerin a¤›z yap›lar›yla parazitlikleri aras›nda bir iliflki olup olmad›¤›n› tart›fl›n›z. • T›bbi önemi olan eklembacakl› parazitlerin insanlara zararlar›n› tart›fl›n›z.

4. Ünite - T›bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar›

Yararlan›lan ve Baflvurulabilecek Kaynaklar John DT Petri WA.(2006), Markell and Voges’ Medical Parasitology, Ninth Ed. Murray PR., Baron EJ.(2007).Manual of Clinical Microbiology, Ninth Ed ASM Press, Sayg› G. (2009).Paraziter Hastal›klar ve Parazitler.Sivas Alt›ntafl, K. (1997). T›bbi Genel Parazitoloji ve Protozooloji, Medikal Network ve Nobel, Ankara. Garcia, LS. (2001). Diagnostic Medical Parasitology,Fourth.Ed. ASM pres. Sayg›, G. (1998). Temel T›bbi Parazitoloji, Es-Form ofset, Sivas. Training Skills direct Medical. (2009). Parasitology Training Manual 1. http//www.dpd.cdc.gov/DPDx/HTML/Image_Library.htm http://www.dpd.cdc.gov/DPDx

119

Sözlük

121

Sözlük en düflük halde çal›flt›rmas›yla ortam›n d›fl etkilerinden

A Abdomen: Eklembacakl› hayvanlar›n kar›n bölgesidir. Aglutinasyon: Uygun bir s›v› ortamda, partiküler formdaki antijenlerle antikorlar›n ba¤land›ktan sonra kompleksler oluflturarak bir arada kümelenmesidir. Albumin: Kan plazmas›n›n veya serumunun en önemli bölü-

korunmas› amaçl› olarak ald›¤› haldir. Eritrosit (Alyuvar): K›rm›z› kan hücreleri.

F Filtrasyon: S›v› içinde bulunan süspansiyon halindeki kat› parçac›klar›n›n (örne¤in mikroorganizma hücrelerinin)

münü oluflturan bir protein türüdür.

uygun büyüklükteki bir filtreden süzülerek yap›lan ay›r-

Amastigot: Leishmania türlerinin insan ve di¤er omurgal› konaklar›n›n vücudunda kamç›s›z, oval görünümlü (2-3µm) dönemidir.

ma ifllemidir. Fotooksidasyon: Ifl›k veya baflka tür radyant enerji kayna¤› kullan›larak kimyasal maddeleri okside etme yöntemi

Anaerobik Jar: Metal ya da camdan yap›lm›fl de¤iflik tipler-

olarak tan›mlanmaktad›r.

de özel kaplard›r. Anizotrop Bölge (A band›): Kas dokusunun boyuna kesitlerinde gözlenen çok az k›ran koyu renkli bölgeler Antisepsis: Canl› dokular›n dezenfeksiyonudur.

G GasPak Sistem: Tek kullan›ml›k yeniden kilitlenebilir torbalar içinde gaz üreten torbac›klar kullan›larak, anaerobik

Anüri: Günlük idrar miktar›n›n 100 ml’nin alt›na düflmesine

veya mikroaerofilik bakterilerin birincil izolasyonu ve

denir.

kültivasyonunu desteklemeye uygun ortamlar oluflturan

API Kit: Bakteri ve maya tan›mlamas›na yönelik biyokimyasal metotlar›n kullan›m›na dayal› yar› otomotize kitlerdir. Atrik: Flagella bulunmayan bakterilere denir.

tek kullan›ml›k sistemlerdir. Glomerul: Kandaki art›k maddelerin süzülmesinden sorumlu olan, böbreklerdeki küçük k›lcal damarlar yuma¤›d›r. Glomerul Filtrasyonu: ‹drar›n böbrek glomerülleri taraf›n-

B Baget: Ezme ve kar›flt›rma iflleminde kullan›lan cam çubuktur. Bakterisid: Bakterilerin yaflamas›na engel olan bütün mad-

dan süzülmesi. Gram Boyama: Mikrobiyolojide kullan›lan boyama teknikleri aras›nda en önemli ve en çok uygulanan ay›rt edici bir

delere bakterisid denir.

boyama tekni¤idir.

Bilirubin: Karaci¤er, kemik ili¤i ve dalakta hemoglobinin y›k›ma u¤ramas›yla ortaya ç›kan safra pigmentidir. Bistüri: Cerrahi b›çak. Blefaroblast: Tek hücrelilerde bulunan bazal cisimdir.

C Cryotüp: -196°C’ye dayan›kl› içinde hücre saklanan plastik tüptür.

H Havers Kanal›: Etraf›nda kemik hücrelerini içeren lamellerin s›raland›¤›, damar, sinir ve kemik ili¤i içeren boflluklar

‹ ‹ndirek Bilirubin: Karaci¤erde ifllem görmemifl suda çözünemeyen bilirubin ‹zotrop Bölge (I band›): Kas dokusunun boyuna kesitlerin-

D

de gözlenen ›fl›¤› az k›ran aç›k renkli bölgeler.

Dezenfeksiyon: Kimyasal maddeler kullan›larak patojen mikroorganizmalar›n öldürülmesi ifllemidir. Direk Bilirubin: Karaci¤erde özel bir ifllemle suda çözünebilen hale getirilmifl bilirubin. Diyafram: Mikroskopta, ›fl›k kayna¤›ndan gelen ›fl›k demetinin çap›n› ayarlamaya yarayan yard›mc› optik k›s›m. Durham Tüpü: Genellikle s›v› besiyerlerinde bakterilerin karbonhidrat› kullanarak gaz oluflturup oluflturmad›¤›n› belirlemede kullan›lan küçük tüplerdir.

K Kanalikül: Olgun kemik hücrelerinin uzant›lar›. Katod Ifl›nlar›: Yeterli fliddette uyguland›¤›nda germisidal etkiye sahip ›fl›nlard›r. Kinetoplast: ‹çinde bir çok mitokondri genom kopyas› bar›nd›ran büyük bir mitokondri içindeki disk flekilli dairesel DNA’lar›n oluflturdu¤u bir kitledir. Kirby-Bauer Testi: Standart disklere emdirilmifl antibiyotik-

E Endospor: Bir bakterinin uygun olmayan koflullar alt›nda sitoplazma yüzeyini minimuma indirerek metabolizmas›n›

lerin petri pla¤›nda enfeksiyon etmeni mikroorganizmalar›n geliflimini engellemesine dayal› testlere denir.

122

T›bbi Laboratuvar Uygulamalar› (Uygulama Kitab›)

Kist: Protozoonun fizyolojik fonksiyonlar› minimuma inmifl,

Osteon: Kemik hücrelerinin oluflturdu¤u topluluk

beslenmeyen, hareket etmeyen çevresini saran kist du-

Osteosit: Kemik dokusu hücreleri.

var› sayesinde d›fl çevre koflullar›na ve mide asiditesine

Otoklav: Yüksek bas›nca dayan›kl› çift çeperli ve metal bir cihazd›r.

dayan›kl› dönemleridir. Klerens: Birim zamanda idrarla belirli miktarda maddeden temizlenen plazma hacmidir.

P

Kolesterol: Hayvansal dokular›n hücre zarlar›nda bulunan ve

Pastörizasyon: Süt, meyve sular›, krema, bira, flarap gibi al-

kan plazmas›nda tafl›nan bir steroid ve alkol birleflimidir.

kollü içeceklerde patojen mikroorganizmalar›n (bütün

Kondansör: Mikroskopta, ›fl›¤› incelenecek obje üzerinde

mikroorganizmalar› de¤il) yafl› ›s› uygulanarak öldürül-

odaklamaya yarayan yard›mc› optik k›s›m.

mesi ifllemidir.

Kondrosit: K›k›rdak dokusu hücreleri.

Perikondriyum: k›k›rdak dokuyu çevreleyen ba¤ dokusu k›l›f›

Kreatin: Kas metabolizmas› sonucu kreatinden oluflan bir bi-

Poliüri: ‹drar miktar›n›n normalin üzerinde olmas›na (2500

lefliktir. Ktenidium: Baz› böceklerde tarak teflkil eden dikenler dizisidir.

ml) denir. Presipitasyon: Bir antijen ile ona özgü antikorun birleflmesi

Kuaterner Amonyum Bileflikleri: Katyonik deterjanlard›r.

sonucunda gözle görülür bir çökeltinin oluflmas›d›r. Promastigot: Leishmania türlerinin vektörlerinin vücudunda-

L

ki veya kültür ortam›ndaki kamç›l› dönemidir.

Lakün: K›k›rdak dokusu hücrelerinin içerisinde bulundu¤u

Prosoma: Araknidlerde ve baz› di¤er omurgas›zlarda, sefalotoraksa karfl›l›k olan vücudun ön bölgesidir.

boflluklar Lam: Mikroskobik inceleme için preparat haz›rlan›rken kulla-

PZR: PCR (Polymerase chain reaction) ya da polimeraz zincir

n›lan, incelenecek objenin üzerine koyuldu¤u dikdört-

reaksiyonu (PZR), moleküler biyolojide uygulanan bir

gen fleklindeki cam tabaka.

teknik olup, basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun koflullarda ço¤alt›lmas› olarak tan›mlanabilir.

Lamel: Mikroskobik inceleme için preparat haz›rlan›rken kullan›lan, lam üzerinde bulunan incelenecek objenin üzerine kapat›lan kare veya dikdörtgen fleklindeki küçük

R

cam tabaka.

Radyasyon: Elektromanyetik dalgalar veya parçac›klar biçi-

Lökosit (Akyuvar): Beyaz kan hücreleri.

mindeki enerji yay›m› ya da aktar›m›d›r.

M

S

McFarland Standard›: Standarda dayal› indirek bir say›m

Saf Kültür: Besiyerinde yaln›zca tek bir mikroorganizma türü

yöntemidir. Bir ortamdaki mikroplar›n say›s› yaklafl›k olarak, McFarland standart tüplerinin bulan›kl›¤› skalas›

üretilmifl kültürlerdir. So¤uk Sterilizasyon: Biyolojik materyallerin sterilizasyonun-

yard›m› ile tayin edilebilir. Mikropipet: Çok küçük hacimlerin (mikrolitre vb.) aktar›lma-

da iyonize ›fl›nlar›n kullan›lmas›d›r. Sterilizasyon: Bir maddenin üzerinde veya içinde bulunan

s›nda kullan›lan özel mini pipetlere "mikropipet" denir.

tüm mikroorganizmalardan ar›nd›r›lma ifllemine sterili-

Miyoblast: Kas hücrelerinin öncülleri. Mutasyon: Canl›n›n genetik bilgisinde meydana gelen ve kuflaktan kufla¤a aktar›lan kal›tsal de¤iflmelerdir.

zasyon denir.

T Tindalizasyon: 100°C nin üzerindeki s›cakl›klarda bozulabilen

O

s›v› maddelerin (flekerli, jelatinli besi yerleri gibi) ve baz› çözeltilerin sterilizasyonu için kullan›lan bir yöntemdir.

Objektif: Mikroskopta istenilen büyütmeye ulaflabilmek amac›yla kullan›lan, üzerinde farkl› büyütme özelli¤indeki

Toraks: Eklembacakl› hayvanlar›n gö¤üs bölgesidir.

mercekleri tafl›yan optik bölüm.

Trofozoit: Protozoonun aktif olarak beslenen, hareket eden, büyüyen ve ço¤alan dönemleridir.

Oküler: Mikroskobun, farkl› büyütme özelli¤i tafl›yan, incelenecek olan objeyi gözlemlemeye yarayan optik bölümü. Oligodinamik Etki: Çok az miktardaki a¤›r metalin bakteriler üzerine olan öldürücü etkisidir. Oligoüri: Günlük idrar miktar›n›n normalden az olmas›na (750 ml) denir.

Trombosit: Kan pulcuklar›.

V VITEK: H›zl› otomatize identifikasyon cihazlar›ndan birisidir. Volkmann Kanal›: Osteonlar aras› iletimi sa¤layan enine uzunluktaki kanallar.