Sede Amministrativa: Università degli Studi di Padova Dipartimento di Scienze Animali

In cotutela con: Universidad Politécnica de Madrid Departamento de Producción Animal

SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE ANIMALI INDIRIZZO: ALLEVAMENTO, ALIMENTAZIONE, AMBIENTE, BENESSERE ANIMALE E QUALITÀ DEI PRODOTTI CICLO: XXI

THE ROLE OF DIGESTIBLE FIBRE, STARCH AND PROTEIN ON HEALTH STATUS AND PERFORMANCE IN DIETS FOR GROWING RABBITS

Direttore della Scuola: Ch.mo Prof. Luigi Gallo Coordinatore di indirizzo: Ch.ma Prof.ssa Lucia Bailoni Supervisore: Ch.mo Prof. Gerolamo Xiccato Supervisore: Ch.ma Prof.ssa Rosa Carabaño

Dottorando: Michail G. Fragkiadakis

INDEX RIASSUNTO ....................................................................................................................................... 1 RESUMEN......................................................................................................................................... 17 SUMMARY ....................................................................................................................................... 33 INTRODUCTION ............................................................................................................................. 47 Some notes on rabbit meat production .......................................................................................... 47 Main features of the digestive apparatus and physiology in rabbits ............................................. 48 Epizootic Rabbit Enteropathy and digestive disorders.................................................................. 53 The intestinal barrier and the development of intestinal disorders ............................................... 54 The role of nutrition and the development of intestinal disorders ................................................ 55 Fibre and fibre fractions ............................................................................................................. 56 Starch ......................................................................................................................................... 63 Protein ........................................................................................................................................ 64 STATE OF ART AND GENERAL OBJECTIVES .......................................................................... 69 EXPERIMENT 1: Digestible fibre level and substitution of soybean with sunflower meal in diets for growing rabbits ............................................................................................................................. 73 Material and methods .................................................................................................................... 73 Rearing conditions ..................................................................................................................... 73 Animals and experimental groups.............................................................................................. 74 Experimental diets...................................................................................................................... 75 Controls on live animals ............................................................................................................ 76 Digestibility trial ........................................................................................................................ 77 Caecal content and intestinal mucosa sampling ......................................................................... 77 Histological analyses.................................................................................................................. 77 Chemical analyses ...................................................................................................................... 78 Commercial slaughter, carcass dissection and meat quality analyses ....................................... 79 Statistical analyses ..................................................................................................................... 79 Results and discussion ................................................................................................................... 80 Digestibility and nutritive value of experimental diets .............................................................. 80 Health status and performance ................................................................................................... 82 Caecal content and intestinal tissue characteristics.................................................................... 85 Slaughter results and meat quality ............................................................................................. 86 EXPERIMENT 2: Digestible fibre to starch ratio and protein level in growing rabbit feeding...... 89 Material and methods .................................................................................................................... 89 Rearing conditions ..................................................................................................................... 89 Animals, experimental groups and recordings ........................................................................... 90 Experimental diets...................................................................................................................... 90 Final slaughter, carcass dissection and meat quality analyses ................................................... 92 Statistical analyses ..................................................................................................................... 92 Results and discussion ................................................................................................................... 93 Digestibility and nutritive value of experimental diets .............................................................. 93 Health status and performance ................................................................................................... 94

Caecal content and intestinal mucosa characteristics ................................................................ 97 Slaughter results and meat quality ............................................................................................. 99 EXPERIMENT 3: Reducing dietary protein and increasing digestible fibre/starch ratio in diets for growing rabbits ................................................................................................................................ 101 Material and methods .................................................................................................................. 101 Rearing conditions ................................................................................................................... 101 Animals, experimental groups and recordings ......................................................................... 101 Experimental diets.................................................................................................................... 102 Commercial slaughter, carcass dissection and meat quality analyses ..................................... 104 Nitrogen balance ...................................................................................................................... 104 Statistical analysis .................................................................................................................... 104 Results and discussion ................................................................................................................. 105 Digestibility and nutritive value of experimental diets ............................................................ 105 Growth performance, nitrogen balance and health status ........................................................ 107 Caecal content and intestinal mucosa characteristics .............................................................. 112 Slaughter results and meat quality ........................................................................................... 113 EXPERIMENT 4: Starch and pectin levels in diets for growing rabbits: effects on health status, digestive physiology, growth performance and carcass and meat quality ....................................... 115 Material and methods .................................................................................................................. 115 Rearing conditions ................................................................................................................... 115 Animals, experimental groups and recordings ......................................................................... 115 Experimental diets.................................................................................................................... 116 Commercial slaughter, carcass dissection and meat quality analyses ..................................... 118 Statistical analysis .................................................................................................................... 118 Results and discussion ................................................................................................................. 118 Digestibility and nutritive value of experimental diets ............................................................ 118 Health status and performance ................................................................................................. 120 Caecal content and intestinal mucosa characteristics .............................................................. 122 Slaughter results and meat quality ........................................................................................... 123 GENERAL DISCUSSION .............................................................................................................. 127 Role of digestible fibre and starch ............................................................................................... 127 Role of protein ............................................................................................................................. 131 MAIN CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS ........................................................................... 135 REFERENCES................................................................................................................................. 137

RIASSUNTO Ruolo di fibra digeribile, amido e proteine nelle diete per conigli in accrescimento su stato di salute e prestazioni produttive Introduzione e obiettivi Negli ultimi 10 anni, la diffusione dell’enteropatia epizootica del coniglio (Epizootic rabbit enteropathy, ERE) negli allevamenti europei ha aumentato la mortalità e la morbilità e, quindi, peggiorato in maniera significativa la conversione alimentare realizzata a livello aziendale. La mancata identificazione di un agente eziologico della malattia e l'attribuzione di un carattere multifattoriale alla stessa, così come i limiti imposti dalla normativa europea sull'uso di antibiotici, hanno favorito gli studi e le ricerche in materia di alimentazione e gestione degli animali per individuare strategie in grado di prevenire, o quantomeno limitare, l'impatto dell’enteropatia. Con questo obiettivo specifico, gli studi degli ultimi anni hanno inteso definire i fabbisogni nutrizionali nei conigli durante lo svezzamento ed il post-svezzamento. Tra i diversi principi nutritivi, un aumento della concentrazione di frazioni fibrose digeribili (fibra digeribile, FD = pectine ed emicellulose) è stato associato a un miglioramento dello stato di salute degli animali, oltre che a un incremento dell'attività fermentativa a livello ciecale e un miglioramento della conversione alimentare (Gidenne e García, 2006). Una maggiore concentrazione di fibra solubile nelle diete per lo svezzamento ha ridotto la presenza a livello ciecale di C. perfringens e di altri agenti patogeni opportunisti, così come la mortalità causata da diarrea (Soler e coll., 2003; Gómez-Conde e coll., 2007). Con un contenuto costante di ADF, la sostituzione di amido e proteina con fibra digeribile ha ridotto l’incidenza di disturbi digestivi e migliorato, quindi, lo stato di salute nel coniglio (Perez e coll., 2000; Gidenne e coll., 2001; Marguenda e coll., 2006). La riduzione dell’apporto di fibra insolubile (Gutiérrez e coll., 2002; Alvarez e coll., 2007) e l'aumento delle frazioni più solubili (García-Ruiz e coll., 1997; Carabaño e coll., 2008) hanno anche migliorato l’integrità, e quindi la funzionalità, della mucosa intestinale dei giovani conigli. Le informazioni sulle interazioni tra proteina e fibra digeribile sono ancora limitate. Una carenza (18%) possono favorire i disturbi digestivi e aumentare la mortalità, indurre uno squilibrio nelle attività fermentative ciecali e, quindi, nella composizione della microflora intestinale (Maertens e De Groote, 1988; Lebas, 1989; Carabaño e coll., 2008, 2009). La riduzione del livello proteico dal 18 al 16% (in diete con la stessa digeribilità ileale della proteina) ha significativamente diminuito la presenza di Clostridium perfringens e la mortalità da 1

enteropatia epizootica (Chamorro e coll., 2007), mentre un'ulteriore riduzione dal 16 al 14% non ha avuto alcun effetto sulla mortalità, pur avendo indotto la riduzione dei batteri anaerobi a livello ciecale (García-Palomares e coll., 2006a, 2006b; Carabaño e coll., 2009). Anche l'impiego di fonti proteiche meno digeribili può aumentare il flusso di azoto a livello ciecale e favorire lo sviluppo di agenti patogeni, come E. coli e Clostridium spp., comportando così un aumento del rischio per la salute degli animali e un peggioramento delle prestazioni produttive (Gutiérrez e coll., 2003; Chamorro e coll., 2005, 2007; Carabaño e coll., 2008, 2009). Considerata l’attenzione dei mass media e dei consumatori per l'uso di alimenti non modificati geneticamente, esiste un certo interesse nel valutare fonti proteiche alternative alla soia, sicuramente non modificate a livello biotecnologico. Tra queste, la farina di semi di girasole è ampiamente utilizzata nell'alimentazione del coniglio solitamente in combinazione con la farina di soia. L'uso di diete basate sull’utilizzo esclusivo di farina di girasole come fonte proteica richiede, tuttavia, una valutazione più attenta. Le attività sperimentali realizzate nella presente Tesi di dottorato hanno inteso, in generale, definire i fabbisogni nutrizionali del coniglio in post-svezzamento e ingrasso, con particolare riguardo a frazioni fibrose, soprattutto le più digeribili (pectine, emicellulose), contenuto di amido, e livello di proteine. Nel dettaglio, obiettivi specifici della presente tesi sono stati: 1) mantenere l’equilibrio delle fermentazioni a livello ciecale; 2) ridurre la frequenza e la gravità delle patologie digestive; 3) migliorare l'efficienza di conversione alimentare e di ritenzione azotata; e 4) garantire elevate prestazioni di crescita e ottimali qualità della carcassa e della carne. Tali obiettivi sono stati perseguiti mediante la realizzazione delle seguenti quattro attività sperimentali:

Contributo sperimentale n. 1 Livello di fibra digeribile e sostituzione di farina di soia con farina di girasole in diete per conigli in accrescimento. A 34 giorni di età, 216 conigli ibridi (837±48 g) di entrambi i sessi sono stati divisi in sei gruppi sperimentali da 36 unità ciascuno e alimentati ad libitum con sei diete isoproteiche (15,9% PG) formulate in base ad un disegno bi-fattoriale, con due fonti proteiche (farina di soia vs. farina di girasole) e tre rapporti FD/ADF (1,0, 1,1 e 1,2). La digeribilità apparente ed il valore energetico delle diete sono stati determinati in vivo (Perez e coll., 1995). A 56 giorni di età, è stato effettuato un campionamento dei contenuti ciecali e della mucosa intestinale per la misura dell’attività fermentativa ciecale e la misurazione dei villi e delle cripte, rispettivamente. I campioni di feci e mangime sono stati analizzati secondo AOAC (2000) e le procedure armonizzate a livello europeo (EGRAN, 2001). Il contenuto di fibra alimentare totale (TDF) è stato determinato attraverso procedura enzimatico-gravimetrica, previo trattamento con α-amilasi, proteasi e aminoglucosidasi 2

(Megazyme int. Ireland Ltd., Wicklow, Irlanda). Il contenuto di fibra digeribile (FD) è stato calcolato come differenza tra TDF e l’ADF. La concentrazione degli acidi grassi volatili nel contenuto ciecale è stata misurata mediante gascromatografia (Osl, 1988). A 76 giorni, i conigli sono stati macellati e le carcasse sezionate secondo i protocolli scientifici internazionali (Blasco e coll., 1993). Sono stati misurati pH (Xiccato e coll., 1994) e colore (CIE, 1976) dei muscoli longissimus lumborum e biceps femoris. I dati sono stati analizzati con ANOVA utilizzando la procedura GLM (SAS Inst. Inc., Cary, NC), e considerando gli effetti del rapporto FD/ADF e delle fonti proteiche. L’effetto del sesso è stato incluso per analizzare la variabilità di dati di accrescimento, risultati di macellazione, qualità delle carcasse e della carne. La mortalità, la morbilità e il rischio sanitario sono stati analizzati con la procedura CATMOD del SAS. La digeribilità delle diete è significativamente aumentata con il rapporto FD/ADF, a causa della maggiore inclusione delle polpe di bietola a scapito dell’erba medica. Il valore nutritivo delle diete è aumentato non solo per la maggiore presenza di FD, ma anche per la maggiore digeribilità (9-10 punti) di tutte le frazioni fibrose: la digeribilità dell’ADF è aumentata dal 14,6 al 25,6%; la digeribilità delle emicellulose dal 40,3 al 49,1%; la digeribilità delle pectine dall’85,0 al 93,8% (P