MARCADORES FISIOLÓGICOS DE LA TOLERANCIA AL ENVEJECIMIENTO DE SEMILLA EN MAÍZ PHYSIOLOGICAL MARKERS FOR SEED AGEING TOLERANCE IN MAIZE Ana B. Cruz-Pérez1, Víctor A. González-Hernández1, Ma. Carmen Mendoza-Castillo2 y Ma. Luisa Ortega-Delgado3 1 Programa en Fisiología Vegetal, 2Programa en Genética. Instituto de Recursos Genéticos y Productividad. 3Programa en Botánica. Instituto de Recursos Naturales. Colegio de Postgraduados. Km. 36.5 Carretera México-Texcoco. 56230. Montecillo, Texcoco, Estado de México. Tel.: 01(595) 952-0200 ext. 1584 y 1591. Tel.: 01(595) 955-1503. ([email protected]) ([email protected])

RESUMEN

ABSTRACT

El envejecimiento de la semilla conduce a pérdidas de germinabilidad y vigor, en función del genotipo y del ambiente. En esta investigación se estudió el efecto del envejecimiento natural en semillas de maíz (Zea mays L.), en cuanto a sus cinéticas de imbibición, distribución de biomasa y respiración, en cada tejido de la semilla durante la germinación. Se utilizó una línea tolerante (LE64) y otra susceptible (LE-23) al envejecimiento natural, cada una con dos edades (3 y 13 años). Se encontró que el envejecimiento natural redujo la tasa de acumulación de biomasa en el eje embrionario y su tasa respiratoria. Las pérdidas de biomasa que ocurren en el endospermo durante la germinación, superaron las ganancias en biomasa del eje embrionario, con aproximadamente 31% en semillas tolerantes y 54% en semillas susceptibles, excepto en las semillas susceptibles envejecidas, en las cuales el endospermo no redujo su peso seco. El escutelo funcionó como demanda de reservas en semillas tolerantes y susceptibles nuevas, y como fuente de reservas en semillas viejas. Antes de la imbibición las semillas mostraron actividad respiratoria, y durante la germinación los ejes embrionarios de las semillas susceptibles viejas presentaron menor actividad respiratoria y de acumulación de biomasa que en los de semillas nuevas. Esto indica que el envejecimiento redujo la eficiencia metabólica de los endospermos y de los ejes embrionarios, en particular en la línea susceptible. Por tanto, la magnitud del daño dependió del grado de tolerancia que posee la semilla.

Seed ageing produces loss of germinability and vigor, depending on genotype and environmental conditions. In this work the effect of natural ageing in maize (Zea mays L.) seeds was studied, regarding their imbibition kinetics, biomass distribution, and respiration in each seed tissue during germination. Two lines were used, tolerant (LE-64) and another susceptible (LE-23) to natural ageing, each one with two seed ages (3 and 13 years). It was found that seed ageing reduced the rates of biomass accumulation and respiration rate in the embryo axis. The biomass reduction observed in the endosperm during germination was higher than the biomass gain registered in the embryo axis by 31% in the tolerant seeds and by 54% in the susceptible ones. The endosperm of susceptible aged seeds did not show any loss in dry weight. The scutellum gained dry weight in non-aged seeds, both in the tolerant and susceptible lines, while in aged seeds the opposite occurred. Before imbibition, the seeds showed respiratory activity, and during germination the embryo axis of aged susceptible seeds showed a lower respiration rate and biomass accumulation than in non-aged seeds. This shows that seed ageing reduced the metabolic efficiency of endosperm and embryo axis, mainly in the susceptible line. Thus, the magnitude of damage by ageing depends on the degree of tolerance of the seed.

Palabras clave: Zea mays L., distribución de biomasa, germinación, respiración.

INTRODUCTION

Key words: Zea mays L., germination, biomass distribution, respiration rate.

T

he morphological, physiological and biochemical characteristics during seed germination allow for the identification of factors involved in the control of germination and crop establishment. Seed deterioration, caused by natural or artificial ageing, reduces germination, plant growth rate, and tolerance to stress conditions. Such effects are associated to metabolic changes through biochemical processes, such as the metabolic activity during the first hours of germination, which has been correlated to seed germination and vigor (Anderson, 1973). Deteriorated seeds show slow or abnormal embryo growth, loss of soluble compounds due

INTRODUCCIÓN

L

as características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas durante la germinación de la semilla permiten la identificación de los factores involucrados en el control de la germinación y del establecimiento del cultivo. El deterioro de la semilla, causado por el envejecimiento natural o artificial, disminuye la Recibido: Febrero, 2002. Aprobado: Mayo, 2003. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 37: 371-381. 2003. 371

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germinación, la velocidad de crecimiento de la planta, y la tolerancia a condiciones adversas. Tales efectos están asociados con cambios en el metabolismo a través de procesos bioquímicos, como la actividad metabólica durante las primeras horas de germinación, que se ha correlacionado con la germinabilidad y el vigor de la semilla (Anderson, 1973). Los síntomas de la semilla deteriorada incluyen: Crecimiento bajo o anormal, pérdida de compuestos solubles debido a una excesiva permeabilidad de la membrana, reducción de la actividad enzimática, y producción de sustancias tóxicas como ácidos grasos libres (Anderson, 1973). Durante el envejecimiento natural de la semilla de maíz (Zea mays L.) se reduce el contenido total de reservas, como carbohidratos y proteínas. Una causa importante de la muerte de semillas es la pérdida severa de reservas en el embrión. En consecuencia, el crecimiento y desarrollo de una nueva plántula son afectados a medida que avanza el proceso de deterioro de la semilla, que se expresa por anormalidades y daños en sus estructuras principales (Basavarajappa et al., 1991). En semillas quiescentes, los procesos metabólicos normales ocurren a una velocidad muy reducida debido a la insuficiencia de agua; con la imbibición se reactivan los sistemas metabólicos y se desencadenan los procesos anabólicos y catabólicos conducentes a la germinación seminal (Ching, 1973; Taiz y Zeiger, 1991). La movilización masiva de las reservas del endospermo es un proceso posterior a la protrusión radicular durante la germinación (Botha et al., 1992). La energía requerida para la germinación proviene de la respiración, en la cual los principales factores son los sustratos almacenados, la edad y tipo de tejido, la temperatura, el oxígeno y el CO2 (De Viseer et al., 1990; Stewart et al., 1990). La actividad respiratoria es controlada por sustratos respirables, como los azúcares (Lambers et al., 1991), pero el deterioro eleva los cocientes respiratorios en la germinación (Anderson, 1973). La relación entre la actividad respiratoria de una semilla durante las primeras horas de germinación y su estado de deterioro, es difícil de establecer porque la respiración varía con la condición fisiológica de la semilla. El objetivo de este trabajo fue cuantificar el efecto del envejecimiento natural de la semilla sobre sus cinéticas de imbibición, de distribución de biomasa y de respiración en cada uno de los tejidos (pericarpio, endospermo, escutelo y eje embrionario) durante la germinación de semillas de maíz, que contrastan en tolerancia al envejecimiento.

MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizaron dos líneas de maíz S4 con 93.7% de endogamia, una tolerante (LE-64) y otra susceptible (LE-23) al envejecimiento

to excessive membrane permeability, reduction of enzymatic activity, and production of toxic substances such as free fatty acids (Anderson, 1973). During natural ageing maize (Zea mays L.) seeds show reduction in carbohydrate and protein contents. If a severe loss of nutrients occurs in the embryo, the seed may die. Consequently, both seedling growth and development are affected as the process of seed deterioration advances, expressed by structural damages and seedling abnormalities (Basavarajappa et al., 1991). In quiescent seeds, metabolic processes occur at very slow rates because of the lack of water. Imbibition reactivates the metabolic systems by triggering the anabolic and catabolic processes of seed germination (Ching, 1973; Taiz and Zeiger, 1991). The massive mobilization of the endosperm stored nutrients to the embryo axis is a process that occurs after root protrusion, during germination (Botha et al., 1992). The energy required for germination is provided by respiration, in which the main factors are the amount of stored substrates, seed age and type of tissue, temperature, oxygen, and CO2 (De Viseer et al., 1990; Stewart et al., 1990). Though the respiratory activity is regulated by respirable substrates such as sugars (Lambers et al., 1991), seed deterioration increases respiration quotients during germination (Anderson, 1973). The relationship between respiratory activity of the seed during the first hours of germination and its deterioration status is difficult to assess, because respiration varyies with the physiological condition of the seed. The purpose of this research was to evaluate the effect of natural seed ageing on the kinetics of imbibition, biomass distribution, and respiration rate of each seed tissue (pericarp, endosperm, scutellum and embryo axis) throughout germination in two maize genotypes contrasting in tolerance to seed ageing.

MATERIALS AND METHODS Two S4 maize lines (93.7% of endogamy), one tolerant (LE64) and another susceptible (LE-23) to natural ageing, were used. Each line had seeds aged for 3 and 13 years, after storage in a room without temperature or humidity control, located in Texcoco, México, at 2250 m above sea level, where daily temperature fluctuates between 8 and 26 oC. The genotypic difference in tolerance was previously assessed by G. Santiago (personal communication)4 in the Laboratory of Vegetal Physiology of the Colegio de Postgraduados in 1 and 10 year-old seeds, where normal germination rates were 96 and 92 % for the tolerant line and 50 and 17 % for the susceptible one. Both lines were generated by the Genetics Department in the Institute of Genetic Resources and Productivity (IREGEP, acronym in Spanish) at the Colegio de Postgraduados, through the “Maize archetype formation” program. The experiments described below were carried out at the Laboratory of Vegetal Physiology.

CRUZ-PÉREZ et al.: MARCADORES FISIOLÓGICOS DE LA TOLERANCIA AL ENVEJECIMIENTO natural, cada una con dos edades de envejecimiento natural (3 y 13 años) en bodega sin control de temperatura ni humedad, ubicada en Texcoco, México, a 2250 m, sitio cuya temperatura oscila entre 8 y 26 oC. La clasificación por nivel de tolerancia fue realizada previamente por G. Santiago (Comunicación personal)4 en el Laboratorio de Fisiotecnia Vegetal del Colegio de Postgraduados, con semillas de 1 y 10 años de edad, cuyas tasas de germinación normal fueron 96 y 92% para la línea tolerante, y 50 y 17% para la línea susceptible. Estas líneas fueron generadas en el Programa de Genética del Instituto de Recursos Genéticos y Productividad (IREGEP), del Colegio de Postgraduados, a través del proyecto Formación de arquetipos de maíz. Los experimentos que se describen a continuación se llevaron a cabo en el Laboratorio de Fisiotecnia Vegetal del Colegio de Postgraduados. Cinética de imbibición y distribución de biomasa En los cuatro tratamientos (dos líneas, cada una con dos edades de semilla), las semillas (tres repeticiones de cinco semillas cada una) se pusieron a germinar en toallas de papel húmedo enrolladas y colocadas en bolsas de plástico para mantener la humedad. La germinación se efectuó en la oscuridad a 25 oC, en una incubadora modelo 5DM (Thelco-Precision Scientific Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.), durante seis días. Se realizaron dos experimentos: Uno duró 12 h y el otro 144; en el primero se hicieron muestreos cada 2 h y en el segundo cada 12 h. En ambos se registró el peso fresco y seco de cada tejido de la semilla (pericarpio, endospermo, escutelo y eje embrionario). El peso seco de las muestras se determinó después de ser deshidratadas en una liofilizadora modelo 77500 (Labconco Corporation; Kansas City, EE.UU.), a -49 oC y una presión de vacío de 49×10-3 mbar durante 72 h. Con los datos de peso seco se determinó la cinética de distribución de biomasa. El contenido de humedad (CH) de cada tejido de la semilla se evaluó de acuerdo con la fórmula de Bewley y Black (1994), y con los resultados se calculó la cinética de imbibición durante la germinación:

373

Kinetics of imbibition and biomass distribution In the four treatments (two lines, each with two seed ages), the seeds (three repetitions, with five seeds each) were placed to germinate on rolled-up wet paper towels, covered by plastic bags to maintain humidity. Incubation was done in darkness at 25 oC in a model 5DM incubator (Thelco-Precision Scientific Inc., Chicago, Illinois, U.S.A.), for six days. Two experiments were performed: One during 12 h with samplings every 2 h, and the other during 144 h with measurements every 12 h. Fresh and dry weight of each seed tissue (pericarp, endosperm, scutellum, and embryo axis) were recorded in both trials. Dry weight was measured after the samples were dehydrated in a freeze dryer model 77 500 (Labconco Corp.; Kansas City, KS, U.S.A.) at -49 oC and 49×10-3 mbar vacuum pressure for 72 h. Dry weight data was used to determine the biomass distribution kinetics. Water content (WC) for each seed tissue was determined according to the formula of Bewley and Black (1994), and then used to calculate the imbibition kinetics during germination.

a f

WC % =

FW - DW ´100 FW

where WC = Water content (%); FW = Fresh weight of each seed tissue (g); and DW = Dry weight of each seed tissue (g). Respiratory activity The respiration rates of endosperm, scutellum, and embryo axis were measured with a photosynthesis apparatus model CI-3014PS (CID Inc.; Vancouver, U.S.A.). Measurements were taken in the same samples used for the imbibition kinetics before freeze-drying and expressed in nmol CO2 g-1 dry weight s-1. In each sampling the five seeds were measured, regardless of their germination type (normal, abnormal seedling or non germinated seeds). Statistical Analysis

af

PF - PS CH % = ´100 PF donde CH = Contenido de humedad (%); PF = Peso fresco de cada tejido de la semilla (g); y PS = Peso seco de cada tejido de la semilla (g). Actividad respiratoria La actividad respiratoria del endospermo, escutelo y eje embrionario, se midió con un aparato de fotosíntesis CI-301PS (CID Inc.; Vancouver, EE.UU.). Las mediciones se hicieron en las mismas muestras utilizadas para determinar la cinética de imbibición, antes de la

The imbibition, biomass and respiration data from 0 and 144 h were submitted to an analysis of variance according to a completely randomized design with four treatments and three repetitions per experiment. In all cases, the comparison of means was performed with the Tukey test (p=0.05). The biomass data of pericarp, endosperm, and scutellum were submitted to linear regression: For pericarp and scutellum the Theil method was employed for adjusting the equations to a straight line (Rousseeuw and Leroy, 1987); for the embryo axis an exponential model was used for better adjustment to the growth curve. All analyses were performed with the Statistical Analysis System (SAS) version 6, except the Theil method for which Microsoft® Excel 98 was used.

4 Gerson Santiago Jiménez. Ex-estudiante de Maestría en Producción de Semillas. Instituto de Recursos Genéticos y Productividad. Colegio de Postgraduados.

374

AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2003

liofilización, y las tasas se expresaron en nmol CO2 g -1 de peso seco s-1. En estas evaluaciones se utilizaron las cinco semillas, sin separar por tipo de germinación (normal, anormal y sin germinar).

RESULTS AND DISCUSSION

Análisis estadístico

Before starting imbibition (0 h), all seed tissues (pericarp, endosperm, scutellum and embryo axis) had a low water content (Table 1), with few differences among them. During the first 12 h with measurements every 2 h, the imbibition kinetics showed that pericarp, scutellum ,and embryo axis absorb water faster than the endosperm in all seeds without notorious differences between lines and seed ages (Figure 1). Endosperm hydration is slow because water must pass through the pericarp, which is not structurally adapted to allow a fast imbibition, and, besides, there is an influence of the endosperm composition which has 80% starch (Bewley and Black, 1994; Welbaum et al., 1998). Consequently, after 12 h, the endosperm water content was only one third compared to the other seed tissues. Most of the water was absorbed during the first 2 h of imbibition in all tissues, except in the endosperm whose imbibition kinetics tend to be linear. After 12 h of imbibition only the embryo axis continues absorbing water quickly, up to 36 or 48 h in the two lines and seed ages (Figure 2); water uptake in the remaining tissues (pericarp, scutellum, and endosperm) stops or is much slower after 12 h. Such difference among seed tissues is due to the embryo axis being the only growing tissue. The imbibition kinetics of the embryo axis agree with those reported by Perino and Côme (1991), Gatica et al. (1995) and Cruz et al. (1995) , who mention that in several species seeds have three-phase kinetics of water absorption: Phase I covers the first 8 to 12 h of imbibition, phase II up to 50 h, when the radicle emerges at 38 h (Egli and TeKrony, 1997); phase III comprises from 50 h to the end of imbibition. At the end of this study (144 h), the humidity content in the embryo axis was 20% higher than those of pericarp and scutellum, and 40% higher than in the endosperm,

Los datos de imbibición, biomasa y respiración de las 0 y 144 h fueron sometidos a análisis de varianza con un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos y tres repeticiones en cada experimento. La comparación de medias se hizo mediante la prueba de Tukey en todos los casos (p=0.05). Los datos de biomasa en pericarpio, endospermo y escutelo se analizaron mediante regresión lineal: En pericarpio y escutelo se empleó el método de Theil (Rousseeuw y Leroy, 1987) para ajustar las ecuaciones a la recta; en el eje embrionario se utilizó un modelo exponencial para obtener un mejor ajuste a la curva de crecimiento. Todos los análisis se realizaron con SAS versión 6, excepto el método de Theil, para el cual se utilizó Microsoft® Excel 98.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Cinética de imbibición Antes de iniciarse la imbibición (0 h), todos los tejidos de la semilla (pericarpio, endospermo, escutelo y eje embrionario) tenían un bajo contenido de humedad (Cuadro 1), con pocas diferencias entre dichos tejidos. La cinética de imbibición evaluada durante las primeras 12 h con muestreos cada 2 h, mostró que el pericarpio, el escutelo y el eje embrionario absorben agua más rápido que el endospermo, en todas las semillas, con pocas diferencias entre líneas y entre edades de las semillas (Figura 1). La hidratación del endospermo es lenta porque el agua debe penetrar a través del pericarpio, el cual no está estructuralmente adaptado para permitir una rápida imbibición, y también influye la composición del endospermo, que tiene 80% de almidón (Bewley y Black, 1994; Welbaum et al., 1998). A ello se atribuye que a las 12 h el contenido de humedad del endospermo haya

Kinetics of imbibition

Cuadro 1. Contenido de humedad (%) en cada tejido de semillas de maíz tolerante y susceptible al envejecimiento natural, cada una con dos edades (3 y 13 años), antes de la imbibición de las semillas. Table 1. Water content (%) in the seed tissues of two maize lines, one tolerant and one susceptible to natural ageing, each with two seed ages (3 and 13 years), before imbibition. Humedad (%) Línea

Tolerante 3 años 13 años Susceptible 3 años 13 años

Pericarpio

Endospermo

Escutelo

Eje embrionario

Semilla completa

8.0 ax 6.5 ax

4.9 bxy 6.7ax

6.3 bxy 6.6 bx

10.6 ay 10.6 ax

5.4 c 6.7 b

7.0 ax 4.3 az

7.5 ax 6.7 ay

9.9 ax 5.1 bz

11.5 ax 10.6 ax

7.7 a 6.4 b

Medias con la misma letra en cada columna (a, b) o en cada hilera (x, y, z), no son diferentes (Tukey, 0.05).

CRUZ-PÉREZ et al.: MARCADORES FISIOLÓGICOS DE LA TOLERANCIA AL ENVEJECIMIENTO 80

80

a

a

70

60

Humedad (%)

Humedad (%)

70

50 40 30

60 50 40 30 20

20 10

10

Nueva

0

0

80

80

b

70

Vieja

b

70

60

Humedad (%)

Humedad (%)

375

50 40 30

60 50 40 30 20

20 10

10

Nueva

Vieja

0

0 0

2

4 6 8 Tiempo de imbibición (h) Pericarpio

10

12 Endospermo

0 Escutelo

2

4 6 8 Tiempo de imbibición (h)

10

12

Eje embrionario

Figura 1. Cinética de imbibición en tejidos de semillas de maíz (a) tolerante y (b) susceptible al envejecimiento natural con dos edades cada una (3 años, nueva; 13 años, vieja), durante 12 h de imbibición. Figure 1. Imbibition kinetics in seed tissues of two maize lines (a) tolerant and (b) susceptible to natural ageing, each with two seed ages (3 years, young; 13 years, aged), during 12 h of imbibition.

sido apenas un tercio del que tenían los demás tejidos de las semillas. Además, la mayor parte del agua fue absorbida en las primeras 2 h de imbibición en todos los tejidos, excepto en el endospermo, cuya cinética tiende a ser lineal. En las dos líneas y en las dos edades de semilla, después de 12 h de imbibición sólo el eje embrionario continúa absorbiendo agua con rapidez, hasta las 36 ó 48 h (Figura 2); los demás tejidos (pericarpio, escutelo y endospermo) dejan de absorber agua o lo hacen en forma muy lenta después de 12 h. Tal diferencia en cinéticas de imbibición entre los tejidos de la semilla se debe a que solamente el eje embrionario se encuentra en crecimiento. La cinética de imbibición del eje embrionario coincide con la reportada por Perino y Côme (1991), Gatica et al. (1995) y Cruz et al. (1995), quienes mencionan que la absorción de agua por las semillas de varias especies presenta una cinética trifásica, donde la fase I comprende las primeras 8 a 12 h de imbibición; la fase II ocurre hasta las 50 h, durante la cual emerge la radícula a las 38 h de imbibición (Egli y TeKrony, 1997); la fase III comprende de las 50 h hasta el final de la imbibición. Al final del estudio (144 h), el contenido de humedad del eje embrionario superó en 20% al del pericarpio

lines and seed ages averaged. Water content in the endosperm of old seeds was 7-9 % lower (p£0.05) than in the young seeds for both lines (Table 2). That is, aged seeds have a lower capacity for water uptake. Similarly, Bewley and Black (1994), McDonald et al. (1994) and Cruz et al. (1995) reported for several species that the embryo axis has the highest, and the endosperm the lowest capacity for water absorption. Biomass distribution Before starting imbibition, the embryo axis has a very low percentage of seed total dry weight (1.3%), while the endosperm has the highest (80.7%), in average of all treatments (Table 3). Hence, during seed formation, the endosperm is the main force of demand for photoassimilates. During germination the embryo axis grows exponentially, whereas the endosperm loses biomass in a linear way (Figures 3 and 4). The embryo axis has two growth phases during germination: 1) In the tolerant line of both ages, Phase I, goes from zero to 36 h, when the embryo is not growing yet, and in Phase II, when the embryo is growing, goes from 36 to 144 h; 2) In the susceptible line, Phase I ranges from 0 to 12 h in new

AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2003

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100

100

a

a 80 Humedad (%)

Humedad (%)

80 60 40

60 40 20

20

Vieja

Nueva 0

0 100

100

b

b

80 Humedad (%)

Humedad (%)

80 60 40 20

60 40 20

Nueva 0

Vieja 0

0

12 24

36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 Tiempo de imbibición (h) Pericarpio

Endospermo

0 Escutelo

12 24

36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 Tiempo de imbibición (h) Eje embrionario

Figura 2. Cinética de imbibición en tejidos de semillas de maíz (a) tolerante y (b) susceptible al envejecimiento natural con dos edades cada una (3 años, nuevas; y 13 años, viejas), durante 144 h de imbibición. Figure 2. Imbibition kinetics in seed tissues of two maize lines, (a) tolerant and (b) susceptible to natural ageing, each with two seed ages (3 years, young; 13 years, aged), during 144 h of imbibition.

y del escutelo, y en 40% al del endospermo, en promedio de líneas y edades de semillas. El contenido de humedad del endospermo de semillas viejas resultó inferior (p£0.05) en 7 a 9% que el de semillas nuevas en ambas líneas (Cuadro 2), lo que denota una menor capacidad de hidratación de las semillas viejas. De forma similar, Bewley y Black (1994), McDonald et al. (1994) y Cruz et al. (1995) detectaron, en diferentes especies, que el eje embrionario presenta la mayor capacidad para absorber agua, y el endospermo, la menor capacidad. Distribución de biomasa Antes de iniciada la imbibición, el eje embrionario representa un porcentaje muy reducido del peso seco total de la semilla (1.3%), mientras que el endospermo constituye la mayor parte (80.7%), en promedio, de todos los tratamientos (Cuadro 3). Ello evidencia que durante la formación de la semilla el endospermo constituye la principal fuerza de demanda por fotoasimilados. Durante la germinación el eje embrionario crece de manera exponencial, mientras que el endospermo decrece en biomasa de una manera lineal (Figuras 3 y 4). El eje embrionario presenta dos fases de crecimiento durante la germinación: 1) En la línea tolerante de ambas edades la fase I, de embrión sin crecer, es de 0 a 36 h, y

seeds, and from 0 to 48 h in the old ones, while Phase II is from 12 to 144 h and from 48 to 144 h in young and old seeds. Phase II begins with root protrusion in both lines, which indicates the reactivation capacity of tissues and metabolic systems required for seed development (Bewley and Black, 1994). Thus, delays in root protrusion, as observed in aged seeds of the susceptible line (>36 h), may be attributed to accumulated seed damages and to their reduced genetic capacity to repair them (Hall and Weisner, 1990; Ketring, 1991). In both lines the young seeds had a higher growth rate of the embryo axis and a higher rate of dry weight loss in the endosperm, than the aged seeds, as the differences between parameter values show in their respective equations, as well as by the higher (p£0.05) quantity of biomass accumulated between 132 and 144 h (Table 4). In the tolerant line, the embryo axis gained biomass at a mean rate of 0.21 mg h -1 in young seeds, and 0.10 mg h-1 in old seeds (Figure 3). The young seeds of the susceptible line showed an embryo axis growth rate of 0.08 mg h-1, while the old seeds grew at 0.02 mg h-1, 70% lower than the young susceptible seeds (Figure 4). The continuous increment in growth rate in the embryo axis of the tolerant seeds is closely associated to the continuous loss of dry weight in the endosperm during germination: 0.35 mg h-1 in the young seeds

CRUZ-PÉREZ et al.: MARCADORES FISIOLÓGICOS DE LA TOLERANCIA AL ENVEJECIMIENTO

377

Cuadro 2. Contenido de humedad (%) en cada tejido de semillas de maíz tolerante y susceptible al envejecimiento natural con dos edades cada una (3 y 13 años), al final de la germinación (144 h). Table 2. Water content (%) in the seed tissues of two maize lines, one tolerant and one susceptible to natural ageing, each with two seed ages (3 and 13 years), before imbibition. Humedad (%) Línea Pericarpio Tolerante 3 años 13 años Susceptible 3 años 13 años

Endospermo

Escutelo

Eje embrionario

Semilla completa

61.2 by 58.0 by

48.2 az 39.4 bz

66.0 by 66.2 by

92.7 ax 91.9 ax

74.9 a 65.4 ab

68.3 ay 63.4 aby

49.0 az 42.0 abz

75.3 ay 67.2 aby

92.7 ax 86.9 ax

72.5 a 55.8 b

Medias con la misma letra en cada columna (a, b) o en cada hilera (x, y, z), no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05).

Cuadro 3. Proporción (%) de la biomasa total asignada a cada tejido en semillas de maíz tolerante y susceptible al envejecimiento natural con dos edades cada una (3 y 13 años), antes de la imbibición. Table 3. Proportion (%) of total seed biomass assigned to each tissue in two maize lines, one tolerant and one susceptible to natural ageing, each with two seed ages (3 and 13 years), before imbibition. Biomasa (%) Línea Pericarpio Tolerante 3 años 13 años Susceptible 3 años 13 años

Endospermo

Escutelo

Eje embrionario

9.9 a 10.3 a

81.3 a 80.8 a

7.7 a 7.6 a

1.1 a 1.3 a

9.1 a 9.6 a

81.1 a 79.6 a

8.3 a 9.4 a

1.5 a 1.4 a

Medias con la misma letra en cada columna, no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05).

la fase II, de embrión en crecimiento, es de 36 a 144 h; 2) en la línea susceptible la fase I es de 0 a 12 h (semilla nueva) y de 0 a 48 h (semilla vieja), y la fase II de 12 a 44 h y de 48 a 144 h, en la semilla nueva y vieja. La fase II se inicia con la protrusión radicular en ambas líneas, la cual indica la capacidad de reactivación de los tejidos y sistemas metábolicos necesarios para el desarrollo seminal (Bewley y Black, 1994). Por tanto, los retrasos en el tiempo de ocurrencia, como se observó en las semillas envejecidas de la línea susceptible (>36 h), se pueden atribuir a daños acumulados en las semillas y a su reducida capacidad genética para repararlos (Hall y Weisner, 1990; Ketring, 1991). En ambas líneas las semillas nuevas superaron a las viejas en tasa de crecimiento del eje embrionario y en tasa de pérdidas del endospermo, según muestran las diferencias en los valores de los parámetros de sus respectivas ecuaciones, así como la superior (p£0.05) cantidad de biomasa acumulada entre las 132 y las 144 h (Cuadro 4). En la línea tolerante, el eje embrionario mostró una ganancia de biomasa con una tasa promedio de 0.21 mg h-1 en las semillas nuevas, y de 0.10 mg h-1 en la semilla vieja (Figura 3). En la línea susceptible nueva el eje embrionario

and 0.14 mg h-1 in the aged ones. The endosperm of the susceptible line registered a weight loss of 0.17 mg h-1 in the young seeds, while in the old ones did not lose dry weight during germination, which proves that in this case the endosperm does not function as a source of reserves for embryo axis growth. In both lines, the scutellum biomass of young seeds remained unchanged during germination, while in old seeds it showed losses. That is, in aged seeds the scutellum seems to provide reserves both for respiration and embryo axis growth, possibly because the endosperm is unable to supply nutrients. In all cases the pericarp did not show significant changes in dry weight, hence it may be considered not associated to the germination processes. Seed Respiration Before imbibition the embryo axes of quiescent young seeds from both lines showed high respiration rates, without any significant effects due to ageing (Table 5). The scutellum respiration rate was 12 to 35% with respect to the embryo axis, and 1.5 to 8.6% regarding the endosperm.

AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2003

378 22

152

20

Endospermo

y=0.0147x+16.412 R2 =0.7968

18 16

y=0.006x+16.458 R2 =0.8495

Biomasa (mg/semilla)

Biomasa (mg/semilla)

Pericarpio

y=_ 0.1452x+137.9 R2 =0.7577

134 125 116 107

y=_ 0.3575x+151.38 R2 =0.9134

98

14

89

30

30

25

y=0.0342x+17.106 R2 =0.9325

20 15 10

y=_ 0.021x+16.065 R2 =0.735

5

Eje embrionario Biomasa (mg/semilla)

Escutelo Biomasa (mg/semilla)

143

0

25 20 15

y=1.5872e 0.0194x R2 =0.8186

10 5

y=1.3219e 0.0155x R2 =0.8172

0 0

12 24

36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 Horas de germinación

0

Tolerante nueva

12 24

36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 Horas de germinación

Tolerante vieja

Figura 3. Distribución de biomasa en el pericarpio, endospermo, escutelo y eje embrionario de la semilla en una línea de maíz tolerante al envejecimiento natural, con dos edades, durante 144 h de germinación. Figure 3. Biomass distribution in pericarp, endosperm, scutellum and embryo axis, in seeds of a maize line tolerant to natural ageing, at two seed ages, during 144 h of germination. 15 125

13 12 Pericarpio

11

y=0.0063x+13.49 R2 =0.6841 y=_ 0.0044x+8.3708 R2 =0.8406

10 9

Biomasa (mg/semilla)

Biomasa (mg/semilla)

14

Endospermo

65

18 16

18 16 y=_ 0.0291x+17.446 R2 =0.8358

10 8

y=0.0096x+10.074 R2 =0.9565

6 Escutelo

4 2

y=_ 0.1773x+79.419 R2 =0.8732

80

50

14 12

y=0.0255x+119.13 R2 =0.8281

95

7

Biomasa (mg/semilla)

Biomasa (mg/semilla)

8

110

Eje embrionario

14 12

y=1.2799e 0.016x R2 =0.8556

10 8 6

y=1.2835e 0.008x R2 =0.7277

4 2

0

0 0

12 24

36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 Horas de germinación Susceptible nueva

0

12 24

36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 Horas de germinación

Susceptible vieja

Figura 4. Distribución de biomasa en el pericarpio, endospermo, escutelo y eje embrionario de la semilla en una línea de maíz susceptible al envejecimiento natural, con dos edades cada una, durante 144 h de germinación. Figure 4. Biomass distribution in pericarp, endosperm, scutellum and embryo axis, in seeds of a maize line susceptible to natural ageing, at two seed ages, during 144 h of germination.

CRUZ-PÉREZ et al.: MARCADORES FISIOLÓGICOS DE LA TOLERANCIA AL ENVEJECIMIENTO

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Cuadro 4. Proporción (%) de la biomasa total asignada a cada tejido en semillas de maíz tolerante y susceptible al envejecimiento natural con dos edades cada una (3 y 13 años), al final de la germinación (144 h). Table 4. Proportion (%) of total seed biomass assigned to each tissue in two maize lines, one tolerant and one susceptible to natural ageing, each with two seed ages (3 and 13 years), after 144 h of germination. Biomasa (%) Línea

Tolerante 3 años 13 años Susceptible 3 años 13 años

Pericarpio

Endospermo

Escutelo

Eje embrionario

13.2 ay 11.3 aby

58.0 cx 70.0 abx

12.8 ay 8.7 by

16.0 ay 10.0 aby

10.6 bcy 9.0 cy

66.0 bcx 79.5 ax

12.1 ay 8.2 by

11.3 aby 3.3 bz

Medias con la misma letra en cada columna (a, b) o en cada hilera (x, y, z), no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05).

creció a una tasa promedio de 0.08 mg h-1, mientras que en la semilla vieja creció a una tasa de 0.02 mg h-1, inferior en 70% a la susceptible nueva (Figura 4). En la línea tolerante, el continuo incremento de la tasa de crecimiento del eje embrionario está relacionado con la pérdida continua de peso seco del endospermo durante la germinación: 0.35 mg h-1 en la semilla nueva y 0.14 mg h-1 en la vieja. En la línea susceptible el endospermo registró una pérdida de peso (0.17 mg h-1) en las semillas nuevas, mientras que en las viejas este tejido seminal no perdió peso durante la germinación, lo cual evidencia que en este caso el endospermo no funciona como fuente de reservas para el crecimiento del eje embrionario. En ambas líneas el escutelo de las semillas nuevas no mostró cambios de biomasa, en contraste con el de semillas viejas, en donde mostró pérdidas. Es decir, en semillas viejas el escutelo parece aportar reservas para la respiración y el crecimiento del eje embrionario, tal vez debido a la incapacidad del endospermo para realizar dicha función. El pericarpio no cambió su peso seco, por lo que este tejido de la semilla no parece estar asociado con los procesos germinativos. Respiración de las semillas Los ejes embrionarios de las semillas nuevas en reposo (antes de ser embebidas) de ambas líneas mostraron una alta actividad respiratoria, sin mostrar efecto significativo por envejecimiento (Cuadro 5). Los escutelos estaban respirando a tasas equivalentes de 12 a 35% respecto al eje embrionario, y de 1.5 a 8.6% para los endospermos. En semillas tolerantes, el envejecimiento no redujo la actividad respiratoria del eje embrionario al final de las 144 h, en comparación con las semillas nuevas. En cambio, en las semillas susceptibles viejas hubo una reducción notoria (50%) en las primeras 36 a 48 h, y al final de este periodo (104 a 144 h) la reducción alcanzó 100% (Figura 5). En ambas líneas se observó una amplia

In tolerant seeds, ageing did not reduce the respiration rate of the embryo axis at the end of the 144 h, compared to the young seeds. But in aged susceptible seeds there was a notorious reduction of respiration (50%) during the first 36 to 48 h, and by the end of the germination period (104 to 144 h) reduction reached up to 100% (Figure 5). In both lines, large variation in respiration activity was observed during germination, particularly in the susceptible seeds. In the two maize lines, and in both seed ages, the embryo axis showed higher respiration rates than the scutellum and endosperm during the first 100 h of germination. Only the old seeds of the susceptible line had a respiration rate lower than 20 nmol CO2 g-1 dry weight s-1, from 108 h on. These results suggest that seed ageing reduces the capacity of generating new mitochondria in the susceptible line; that is, tolerance seems to imply the preservation of such capacity. The respiration rate in all seed tissues of the young susceptible seeds was greater than in the tolerant line, because their vigor is greater. Ram and Wiesner (1988) state that vigorous seeds require a greater energy input for growth and development, which is supplied by respiration of the stored substrates. Such respiratory intensity is also related to the mitochondrial functionality (Bewley and Black, 1994). According to Morohashi et al. (1981), the functionality of the respiratory system depends on the physiological and physical status of the seed mitochondria at the beginning of germination or on their biogenesis. Since in this study the respiration rate was not measured directly in isolated mitochondria, the ageing-related diminution in such process could be attributed to abnormalities in the utilization of reserves as substrates for respiration, and not necessarily to the physical and physiological state of mitochondria. Summing up, old seeds of the susceptible line showed the lowest respiration rates in each one of their tissues, as well as a delayed root protrusion and a lower growth of their embryo axis, compared to the young

AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2003

380

variación en la actividad respiratoria, que fue más notoria en las semillas susceptibles. En las dos líneas de maíz y en las dos edades de semilla, las tasas respiratorias del eje embrionario superaron a las del escutelo y del endospermo durante las primeras 100 h de germinación. Solamente en las semillas susceptibles viejas la tasa de respiración fue inferior a 20 nmol CO2 g-1 peso seco s-1 a partir de las 108 h. Esto sugiere que el envejecimiento deteriora la capacidad para generar mitocondrias nuevas en la línea susceptible; es decir, la tolerancia parece implicar el mantenimiento de dicha capacidad. La tasa respiratoria en cada tejido de la semilla fue mayor en la susceptible nueva, debido a que posee mayor vigor que la tolerante. Ram y Wiesner (1988) mencionan que las semillas vigorosas requieren mayor aporte energético para su crecimiento y desarrollo, el cual es suministrado por la actividad respiratoria de los sustratos almacenados; dicha intensidad se relaciona también con la funcionalidad de las mitocondrias (Bewley y Black, 1994). Morohashi et al. (1981) consideran que la funcionalidad del sistema respiratorio depende del estado físico y fisiológico de las mitocondrias en la semilla al inicio de la germinación o de la biogénesis de dicho

Cuadro 5. Tasa de respiración en cada tejido de semillas de maíz tolerantes y susceptibles al envejecimiento natural con dos edades cada una (3 y 13 años), antes de la imbibición de las semillas. Table 5. Respiration rates of seed tissues in two maize lines, one tolerant and one susceptible to natural ageing, each with two seed ages (3 and 13 years), before imbibition. Respiración (nmol CO2 g-1 peso seco s-1) Línea Eje embrionario

0.58 a 0.13 a

4.52 a 5.54 a

36.48 a 14.78 a

0.51 a 0.34 a

5.60 a 6.08 a

34.43 a 13.18 a

Medias con la misma letra en cada columna, no son diferentes (Tukey, p=0.05).

seeds of the tolerant and the susceptible line. Ferguson et al. (1990) found that seed deterioration reduces respiration rate, slows down radicle emergence, and reduces plant growth, responses which were associated to a decrease in seed vigor.

120

40 20

0

0

120

120

Horas de germinación

144

132

0

144

132

120

96

108

84

72

60

48

0 36

0 24

20 0

20

108

40

120

40

60

96

60

80

84

Respiración _ _ (nmol CO 2 g 1 s 1 )

80

100

72

Nueva

b

Vieja

60

20

100

b

80

60

40

Vieja

48

60

a

36

80

100

24

Respiración _ _ (nmol CO 2 g 1 s 1 )

100

12

Nueva

a

12

Respiración _ _ (nmol CO 2 g 1 s 1 )

Escutelo

Tolerante 3 años 13 años Susceptible 3 años 13 años

120

Respiración _ _ (nmol CO 2 g 1 s 1 )

Endospermo

Horas de germinación Endospermo

Escutelo

Eje embrionario

Figura 5. Respiración del endospermo, escutelo y eje embrionario, en semillas de maíz de una línea tolerante (a) y una susceptible (b) al envejecimiento natural, con dos edades cada una (3 años, nueva; 13 años, vieja), durante 144 h de germinación. Figure 5. Respiration rates of endosperm, scutellum and embryo axis in two maize lines, (a) tolerant and (b) susceptible to natural ageing, each with two seed ages (3 years, young; and 13 years, aged), during 144 h of germination.

CRUZ-PÉREZ et al.: MARCADORES FISIOLÓGICOS DE LA TOLERANCIA AL ENVEJECIMIENTO

organelo. Puesto que en este estudio la respiración no se midió directamente en mitocondrias aisladas, la disminución en dicha actividad causada por envejecimiento podría deberse a anomalías en el aprovechamiento de las reservas como sustratos para la respiración, y no necesariamente al estado físico y fisiológico de las mitocondrias. En resumen, las semillas susceptibles viejas presentaron las menores tasas respiratorias en cada uno de sus tejidos, así como también retardo en la protrusión radicular y un menor crecimiento del eje embrionario, en comparación con las semillas tolerantes y susceptibles nuevas. Ferguson et al. (1990) encontraron que el deterioro de la semilla reduce la tasa respiratoria, la velocidad de emergencia de la radícula y el crecimiento de la planta, respuestas que se asociaron con la disminución del vigor de la semilla.

381

CONCLUSIONS Weight loss in the endosperm of young seeds during germination is closely associated to the biomass gain of the embryo axis. In the aged susceptible seeds, however, the endosperm biomass remains almost unchanged. This proves that in the susceptible line seed ageing affects nutrient mobilization from the endosperm to the embryo axis or starch hydrolysis; in this case, the scutellum works as a source of reserves. The respiratory reduction of the embryo axis in aged susceptible seeds can be attributed to a diminished translocation of substrate required for embryo axis growth. Thus, it is confirmed that the magnitude of damage caused by ageing depends on the degree of genetic tolerance inherent to the seed. —End of the English version—

CONCLUSIONES

pppvPPP La pérdida en peso del endospermo en semillas nuevas está relacionada con la ganancia en biomasa del eje embrionario, pero no así en las semillas susceptibles viejas, en las que el endospermo se mantiene casi sin cambio. Ello evidencia que en semillas susceptibles el envejecimiento afecta la movilización de reservas del endospermo al eje embrionario o la hidrólisis del almidón; en este caso el escutelo funciona como fuente de reservas. La reducción en la actividad respiratoria del eje embrionario en semillas susceptibles envejecidas, se atribuye a una disminución en la traslocación hacia el eje embrionario de los sustratos necesarios para dicho proceso. Por tanto, se confirma que la magnitud del daño causado por envejecimiento depende del grado de tolerancia que posea la semilla.

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