TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE) Azadirachta indica TOXICITY AND REPELLENCE OF Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE) Rebeca González-Gómez1, Gabriel Otero-Colina1, J. Antonio Villanueva-Jiménez2, J. Alberto Pérez-Amaro3 y R. Marcos Soto-Hernández4 1 Entomología y Acarología. 4Botánica. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México. 2Campus Veracruz. Colegio de Postgraduados. 91700. Predio Tepetates, Veracruz, Veracruz. 3Universidad del Papaloapan. 68100. Campus Loma Bonita, Oaxaca.

RESUMEN

ABSTRACT

Se evaluó la toxicidad aguda del extracto crudo de dos cosechas de semillas de neem (Azadirachta indica) y del producto comercial a base de neem, PHC Neem®, sobre Varroa destructor y Apis mellifera, así como la repelencia de dichos productos sólo sobre V. destructor (varroa). Para determinar toxicidad aguda se aplicaron diluciones 0.33, 0.67 y 1.32% de los productos citados sobre hembras de varroa y abejas obreras, por aspersión mediante la torre de Burgerjon. Se les incubó a 32±2 °C y 70±10% HR, provistas del alimento adecuado, y se registró su mortalidad a 24 y 48 horas. En pruebas de repelencia se trató a pupas de abejas con las diluciones anotadas y se determinó la capacidad de las varroas para localizar y alimentarse de pupas con o sin tratamiento. En la prueba de toxicidad aguda, ninguno de los productos causó mortalidad de varroa ni de abejas. En las prueba de repelencia, los tres productos mostraron repelencia significativa, en relación directa entre concentración y efecto. El extracto crudo de neem cosecha 2003 a 1.32% presentó la repelencia más alta y estable, que impidió que 98% de las varroas se posaran sobre pupas de abejas y causó 100% de mortalidad de varroa, aparentemente por inanición, en 72 h.

Crude extract of two neem seed (Azadirachta indica) harvests and the neem-based commercial product PHC NeemTM were evaluated in terms of their acute toxicity on Varroa destructor and Apis mellifera as well as their repellence only on V. destructor (varroa mites). To determine acute toxicity, 0.33, 0.67, and 1.32% dilutions of the above products were sprayed on varroa mites and worker bees with a Burgerjon’s tower. They were incubated at 32±2 °C and 70±10% RH and provided with sufficient food. Mortality was recorded at 24 and 48 h. In repellency tests, bee pupae were treated with the same dilutions, and the ability of varroa mites to locate and feed on the pupae, with or without the treatment, was determined. In the acute toxicity test, none of the products caused varroa or bee mortality. In the repellency test, the three products significantly repelled varroa, in a direct relationship between concentration and effect. The 1.32% crude neem extract, 2003 harvest, had the highest and most stable repellency, impeding 98% of the varroa mites from settling on bee pupae and caused 100% mortality of varroa mites, apparently from starvation, in 72 h. Key words: Apis mellifera, bees, azadirachtin, neem.

Palabras clave: Apis mellifera, abejas, azadiractina, neem.

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

T

he mite Varroa destructor (Anderson and Trueman, 2000) is considered the major pest of common Apis mellifera L. honey bees worldwide (Sammataro et al., 2000). The indiscriminate use of chemical products for the control of varroasis has favored resistance in many countries (Milani, 1999; Elzen et al., 1999a and b; Mathieu and Faucon, 2000; Thompson et al., 2002). Mexico runs the same risk, with only two synthetic pyrethroids: fluvalinate (commercial name ApistanTM), and flumetrine (commercial name BayvarolTM). Botanical products for pest control are very important at present. This is the case of the neem tree Azadirachta indica A. Juss. (Meliaceae), from which a broad diversity of secondary compounds are extracted.

E

l ácaro Varroa destructor Anderson y Trueman (2000) se considera como la plaga más importante de la abeja común Apis mellifera L. en el mundo (Sammataro et al., 2000). El uso indiscriminado de productos químicos para controlar la varroasis ha favorecido la aparición de resistencia en muchos países (Elzen et al., 1999a y b; Mathieu y Faucon, 2000; Thompson et al., 2002). México corre ese mismo riesgo porque sólo tiene dos piretroides sintéticos: fluvalinato (nombre comercial Apistan®) y flumetrina (nombre comercial Bayvarol®). Recibido: Mayo, 2005. Aprobado: Agosto, 2006. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 40: 741-751. 2006.

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Los productos botánicos para el manejo de plagas tienen gran importancia en la actualidad. Así, del árbol de neem Azadirachta indica A. Juss. (Meliaceae) se extraen diversos compuestos secundarios; la azadiractina es el de mayor importancia, pues actúa como repelente, antialimentario y retarda el crecimiento de los insectos (Mordue y Blackwell, 1993). Las sustancias contenidas en el neem se pueden considerar como una fuente potencial para el control de varroa; su incorporación como producto natural alternativo al uso de sustancias químicas podría contribuir a disminuir la contaminación de los productos de la colmena. Los efectos subletales pueden ser útiles en el control de varroa; cualquier efecto en este ácaro que interfiera con su capacidad para localizar a su huésped puede tener un valor práctico como método de control. Colin et al. (1994) desarrollaron una escuela en la búsqueda de efectos subletales para controlar parásitos de las abejas, y propusieron un protocolo para evaluar productos vegetales. Por tanto, los objetivos del presente trabajo fueron evaluar la toxicidad aguda del extracto crudo de las semillas de neem (A. indica) y el producto comercial a base de neem, PHC Neem®, sobre V. destructor y A. mellifera, y evaluar la repelencia de los mismos extractos sobre varroa.

MATERIALES

Y

MÉTODOS

Las varroas se recolectaron mediante el método del panal trampa (Maul, 1983), usando panales con celdas de tamaño de cría de zánganos; se colocaron en cajas Petri de plástico (8 cm diámetro) y cada tapa tenía un agujero (4.5 cm diámetro) cubierto con una malla. Las varroas se alimentaron con pupas de zánganos. Antes de su uso y durante un máximo de 2 d, los panales y los ejemplares de varroa se incubaron a 32±2 °C y 70±10% HR. Las pupas de abejas obreras se obtuvieron de los panales de la cámara de cría, se eligió aquéllas de los estados Pw y Pp según Rembold y Kramer (1980). Pw significa literalmente Pupa white (ojos blancos), y Pp significa Pupa purple (ojos morados), etapas que se alcanzan 7-8 d después de que las obreras habían operculado la celda. En todas las pruebas se utilizaron pupas recolectadas 1 h antes de realizar los bioensayos. Las abejas adultas se recolectaron en la cámara de cría y se seleccionaron aquéllas localizadas a los lados de la cría, para evitar la captura de abejas nodrizas jóvenes (Felton et al., 1986). Se pusieron en frascos de cristal de 500 mL cuyas tapas tenían un orificio de ventilación cubierto con malla; se incubaron a 32±2 °C y 70±10% HR y se les proporcionó miel y agua. Se evaluó aceite crudo de neem, así como el producto comercial a base de neem llamado PHC Neem®. El aceite crudo se obtuvo de las semillas de neem recolectados del Campus Veracruz, Colegio de Postgraduados, en Tepetates, Veracruz, en agosto de 2002 y 2003. El aceite se obtuvo a temperatura inferiores a 35 °C, con un extractor

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Of these, azadirachtin is the most important, acting as an insect repellant, feeding inhibitor, and insect growth retarder (Mordue and Blackwell, 1993). The substances contained in neem can be considered potentially useful in varroa control; their incorporation as a natural product alternative to the use of chemical substances could contribute to reduce contamination of products from the beehive. Sublethal effects can be useful in controlling varroa. Any effect that interferes in the mite’s ability to locate its host may have a practical value as a method of control. Colin et al. (1994) formed a school in the search for sublethal effects to control bee parasites and they proposed a protocol for assessing plant products. Therefore, the objectives of the present study were to evaluate acute toxicity of crude neem seed extract (A. indica) and of the neem-based commercial product, PHC NeemTM, on V. destructor and A. mellifera, and to evaluate their repellence of varroa.

MATERIALS

AND

METHODS

Varroa mites were collected with the method of the honeycomb trap (Maul, 1983), using honeycombs with drone-rearing-size cells. The mites were placed in plastic Petri dishes, 8 cm in diameter, with caps with a 4.5 cm diameter hole covered with a screen, and received drone pupae as food. Before use, and for a maximum of 2 d, both honeycomb and varroa specimens were incubated at 32±2 °C and 70±10% RH. The worker bee pupae were obtained from rearing chamber combs, and those in Pw and Pp stages, following Rembold and Kramer (1980) were selected. Pw literally means pupa white (white eyes), while Pp means pupa purple (purple eyes), stages that are reached 7-8 d after worker bees have capped the cell. In all of the tests pupae collected 1 h before performing the bioassays were used. Adult bees were collected in the rearing chamber and those that were found outside the brood zone were selected to avoid capturing young nurses (Felton et al., 1986). The adults were confined in 500 mL glass jars with caps with a ventilation orifice covered with screen; they were incubated at 32±2 °C and 70±10% RH and given honey and water. Crude neem oil, as well as the commercial neem-based product PHC NeemTM, was evaluated. The crude oil was obtained from neem seeds collected in the Veracruz Campus of Colegio de Postgraduados, Tepetates, Veracruz, in August, 2002 and 2003. Oil was extracted at temperatures below 35 °C with a stainless steel extractor by applying 3 t pressure and was stored at −3 °C. Mother suspensions were prepared from the 2002 and 2003 crude oils and of PHC Neem and mixed with water and Tween 20 (1:1:1, by weight). From these, dilutions were made for application on bees and varroa mites. The products mentioned were sprayed on varroa or bees with a Burgerjon’s (1956) pulverization tower, which nebulizes products to 15 µm drops. This tower was calibrated to apply 1 to 2 mg cm−2

TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)

de acero inoxidable, aplicando 3 t de presión, y se almacenó a −3 °C. Se prepararon suspensiones madre de los aceites crudos de 2002 y 2003 y de PHC Neem, mezclándolos con agua y Tween 20 (1:1:1, por peso); a partir de ellas se hicieron diluciones para aplicarlas a abejas o varroas. Los productos mencionados se aplicaron sobre varroas o abejas usando la torre de pulverización de Burgerjon (1956), la cual nebuliza los productos en gotas de 15 µm de diámetro. Esta torre se calibró para aplicar 1 a 2 mg cm−2 (Colin et al., 1994). Esto se logró aplicando 15 mL de la solución a una presión de 0.703 kg cm−2, y se dejó 1 min más para permitir la sedimentación de las gotas sobre los organismos. Prueba de letalidad aguda en varroa y abejas Con las suspensiones madre descritas se prepararon diluciones 1%, 2% y 4% (0.33, 0.67 y 1.32% del producto concentrado), que corresponden aproximadamente a las recomendadas por el fabricante del PHC Neem. Para la aplicación en varroa, grupos de 10 hembras adultas se colocaron en una caja Petri (14 cm diámetro) con el fondo cubierto con un círculo de papel filtro, y enseguida se aplicaron las suspensiones. Al terminar la aplicación se transfirieron las varroas a cajas Petri (8 cm de diámetro) tratadas con una capa de fluón (politetrafluoruro de etileno) en las paredes laterales, para impedir que escaparan. Luego se adicionaron pupas de abejas de ojos rosas a violeta como alimento, y se incubó a 32±2°C y 70±10% HR. Paralelamente a los tratamientos, hubo grupos testigo, a los que se aplicó agua destilada más emulsificante, en concentraciones correspondientes a las usadas para cada tratamiento de las diluciones (1, 2 y 4%). Las abejas, antes de la pulverización, se anestesiaron con CO2 durante 15 s. Se seleccionaron grupos de 30 obreras adultas, y se aplicaron los mismos tratamientos que con los ácaros. Enseguida las abejas fueron transferidas a jaulas de madera y malla de hierro galvanizado, de 15×15×15 cm. Tanto para varroas como para abejas, cada dilución, así como los testigos, se realizaron en cuatro repeticiones; las lecturas de mortalidad se registraron a las 24 y 48 h. En pruebas complementarias, sin repeticiones, las concentraciones aplicadas a varroa y a abejas se elevaron hasta alcanzar 50% del producto concentrado. Prueba de repelencia con elección Las arenas de observación fueron cajas Petri de plástico de 8 cm de diámetro, con tapa con orificio de ventilación como ya se describió. Cada caja estaba dividida en dos zonas principales (A y B), y cada zona formada por tres subdivisiones (a, b y c). La zona cero (0) correspondió al centro de la caja, en la cual se colocaron diez hembras de varroa, mientras que en los extremos de la caja (zonas Ac y Bc) se colocaron tres pupas de abejas obreras (cuerpo blanco y ojos rosa a violeta) en cada una (Figura 1). Sólo las pupas colocadas en la zona Ac habían sido tratadas previamente con 15 mL de las concentraciones de 1%, 2% o 4%, mediante la torre de Burgerjon. Se hicieron cuatro repeticiones por tratamiento y se tomaron lecturas

(Colin et al., 1994). This was accomplished by applying 15 mL of solution at a pressure of 0.703 kg cm−2, and left for 1 min more to allow drops to settle on the organisms. Acute lethality tests in varroa and bees With the mother suspensions described, 1, 2, and 4% dilutions (0.33, 0.67, and 1.32% of the concentrated product), corresponding approximately to those recommended by the manufacturer of PHC Neem, were prepared. For application on varroa, groups of 10 adult females were placed in a Petri dish (14 cm in diameter), the bottom covered with a circle of filter paper, and immediately sprayed with the solutions. After application, the varroa were transferred to 8 cm Petri dishes which had been treated with a layer of ethylene polytetrafluoride on the inner sides to prevent their escape. Later, pink or purple eye bee pupae were introduced as food, and incubated at 32±2 °C and 70±% RH. Parallel to the treatments, there were control groups on which distilled water plus an emulsifier was applied in concentrations corresponding to the dilutions (1, 2, and 4%) used for the treatments. Before being sprayed, the bees were anesthetized with CO2 for 15 s. Groups of 30 adult workers were selected and sprayed with the same treatments in the same manner as with the mites. Bees were immediately transferred to galvanized iron screen and wooden cages 15×15×15 cm. For both varroa and bees, four replications were performed with each dilution and control. Mortality was recorded after 24 and 48 h. In complementary tests, without replications, the concentrations applied to varroa and bees were increased up to 50% of the concentrated product. Repellency test with choice The observation arenas were 8 cm diameter plastic Petri dishes, which had caps with ventilation orifices as described above. Each dish was divided into two main sections (A and B) and each section was composed of three subdivisions (a, b, and c). Section zero (0) was the center of the dish in which ten varroa females were placed, while three worker bee pupae (white body and pink to purple eyes) were placed in the outermost parts of each dish (Ac and Bc) (Figure 1). Only the pupae placed in the Ac subdivision had been treated previously with 15 mL of 1, 2, or 4% concentrations with the Burgerjon’s tower. Each treatment was replicated four times, and readings of mite location were taken at 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, and 72 h, quantifying the tendency of the mites to move from one section to another. To determine numerically whether the extracts repelled, or even attracted, the following formula was used (Colin et al., 1994): VR=100+{(Ba+2Bb+3Bc+4Pb)−(Aa+2Ab+3Ac +4Pa)}10/S where, VR=repellency value; Aa, Ab and Ac=number of mites on sections Aa, Ab, and Ac; Pa=number of mites on side A pupae (treated); Ba, Bb, and Bc=number of mites on sections Ba, Bb, and

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de la ubicación de los ácaros a 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 y 72 h; en ellas se cuantificó la tendencia de dichos ácaros a desplazarse de una zona a otra. Para determinar numéricamente si existió repelencia o atracción por los extractos, se usó la siguiente fórmula (Colin et al., 1994):

Zona A

Pa Ac Ab

Aa 0

VR=100+{(Ba+2Bb+3Bc+4Pb)−(Aa+2Ab+3Ac +4Pa)}10/S donde, VR=valor de repelencia; Aa, Ab y Ac=número de ácaros sobre las zonas Aa, Ab y Ac; Pa=número de ácaros sobre las pupas del lado A (tratadas); Ba, Bb y Bc=número de ácaros sobre las zonas Ba, Bb y Bc; Pb=número de ácaros sobre las pupas del lado B (no tratadas); S=número de ácaros sobrevivientes al momento de la observación. La notación citada da un valor ponderado superior a la posición de un parásito sobre una pupa (×4) o en inmediata proximidad (×3), en contraste con una posición más alejada de las pupas o más central (×2 ó ×1). Si todas las varroas permanecen sobre la zona cero o hay un reparto equitativo sobre ambas zonas, los valores de A contrarrestarán a los de B; si todos los ácaros permanecen sobre las pupas de la zona B, los valores de A serán cero y los valores de B serán 40. El número 100 tiene por función desplazar el origen y facilitar el análisis estadístico; entonces, los valores fluctuarán de 60 al 140; es decir, desde una fuerte atracción hasta una total repelencia. El factor 10/S sirve para compensar la mortalidad de los ácaros al momento de la observación. Prueba de repelencia sin elección La finalidad de esta prueba fue determinar el efecto repelente de los tratamientos a evaluar, en ausencia de pupas no tratadas. En este caso las pupas que se colocaron en la zona Ac y en la Bc fueron tratadas con los productos y concentraciones correspondientes, así como los testigos descritos. En esta prueba también hubo cuatro repeticiones por tratamiento. El criterio de eficacia fue la posición del ácaro sobre las zonas marcadas, el número de ácaros sobre las pupas y la mortalidad de ácaros. Diseño experimental y análisis estadístico El diseño experimental fue completamente al azar, en arreglo factorial 4×4×8, con cuatro repeticiones. El factor A fue el producto aplicado, con cuatro niveles: a1=producto comercial formulado (PHC® Neem); a2=aceite de neem cosecha 2002; a3=aceite de neem cosecha 2003 y a4=emulsificante (Tween 20). El factor B fue la concentración, con cuatro niveles: b1=concentración 0%, ésto es, testigos tratados con agua destilada; b2=concentración 1%; b3=concentración 2%; b4=concentración 4%. El factor C fue el tiempo, con ocho niveles: c1=30 min; c2=1 h; c3=2 h; c4=4 h; c5=8 h; c6=24 h; c7=48 h; c8=72 h. Los datos de analizaron con el procedimiento GLM (SAS, 2000) y las medias se compararon mediante la prueba de Tukey (p≤0.05).

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Ba Bb Bc

Zona B

Pb

Figura 1. Zonas de distribución de la caja experimental, para las pruebas de repelencia. Figure 1. Distribution zones of the experimental dish for repellency tests. Bc; Pb=number of mites on pupae on side B (not treated); S=number of surviving mites at the moment of observation. The cited notation assigns a higher weighted value to the position of a parasite on a pupa (×4) or in the immediate vicinity (×3), in contrast with a more central position or farther from the pupae (×2 or ×1). If all of the varroa remain in Section 0, or there is an equal distribution over the two sections, the A values counteract B values; if all the mites remain on the pupae of section B, the values of A are zero and the values of B are 40. The number 100 has the function of moving the intercept and facilitating the statistical analysis. Therefore, the values fluctuate between 60 and 140, that is, from strong attraction to total repellence. The factor 10/S serves to compensate mortality of the mites at the moment of observation. Repellency test without choice This test was conducted to determine the repellent effect of the treatments to be evaluated in absence of untreated pupae. In this case, the pupae that were placed in both sections Ac and Bc were treated with the respective products and concentrations, as well as the previously described controls. In this test there were also four replications per treatment. The criteria of effectiveness were position of the mite on the marked sections, number of mites on the pupae, and mite mortality. Experimental design and statistical analysis The experimental design was completely randomyzed with a factorial arrangement of treatments 4×4×8, with four replications. Factor A was the applied product, with four levels: a1=commercially formulated product (PHCTM Neem); a2=neem oil, 2002 harvest; a3=neem oil, 2003 harvest; a4=emulsifier (Tween 20). Factor B was concentration with four levels: b1=0% concentration, controls

TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)

También se realizaron análisis con una sola fuente de variación de las variables de respuesta (valor de repelencia, ácaros sobre las pupas y ácaros muertos) en cada uno de los tiempos (0.5, 2, 4, 8, 24 y 72 h) y concentraciones (1, 2 y 4%).

RESULTADOS

Y

DISCUSIÓN

Prueba de letalidad aguda en varroa y abejas El producto comercial (PHC® Neem), aceite de neem cosecha 2002 (neem1), cosecha 2003 (neem2) y Tween 20 (emulsificante), a concentraciones de 1%, 2% y 4%, así como el testigo, no causaron mortalidad de varroa ni de abejas, a 48 h, ni con una concentración de 50%, en pruebas complementarias. Estos resultados difieren de los citados por Melathopoulos et al. (2000), quienes evaluaron aceite de neem y Neemaza®; el primero, al usar aplicación tópica, causó 45% de mortalidad de varroa, mientras que el segundo, con aplicaciones tópica, oral y como vapor causó mortalidad significativa del ácaro. Se decidió no aumentar la concentración de los productos porque hubo problemas para la formación de suspensiones estables; asimismo, se consideró que elevar la concentración haría poco práctico y económico el uso de este producto. Para PHC Neem, la recomendación del fabricante para control de plagas de frutales es 0.5-2 L concentrado 100 L −1 agua; contra plagas de hortalizas es 50 mL 15 L−1 agua. Dichos valores equivalen a 0.5-2% y 0.33% de producto concentrado; esto es, muy cercanos a las usadas en el presente estudio. El contacto directo de neem a concentraciones de 20 ppm sobre abejas adultas no produce efectos negativos y se puede lograr un control efectivo de las plagas con aplicaciones de 30 a 50 ppm de azadiractina (Larson, 1990; Isman, 1995). Según Atkins (1992) la azadiractina es una sustancia relativamente no tóxica para las abejas, con una DL50 de 11 µg por abeja. Naumann et al. (1994) encontraron que el extracto de semillas de neem es un insecticida seguro cuando al momento de usarlo hay abejas melíferas presentes. De hecho, los tratamientos que ellos usaron no repelieron las abejas, y sugieren que el neem puede usarse para controlar plagas en cultivos en floración, incluso cuando se requieren abejas para la polinización. Prueba de repelencia con elección Hubo diferencias significativas en el valor de repelencia, atribuibles a las interacciones dobles de las variables tipo de producto, concentración y tiempo de lectura, pero no a la triple interacción (Cuadro 1). Además hubo diferencias significativas debidas a la

treated with distilled water; b2=1% concentration; b3=2% concentration; b4=4% concentration. Factor C was time, with eight levels: c1=30 min; c2=1 h; c3=2 h; c4=4 h; c5=8 h; c6=24 h; c7=48 h; c8=72 h. Data were analyzed with GLM procedure (SAS, 2000) and means were compared with Tukey test (p≤0.05). Analyses were also performed with a single source of variation of the response variables (repellency value, mites on pupae and dead mites) at each of the times (0.5, 2, 4, 8, 24, and 72 h) and concentrations (1, 2, and 4%).

RESULTS

AND

DISCUSSION

Acute lethality test in varroa and bees With the commercial product (PHCTM Neem), neem oil 2002 harvest (neem1), 2003 harvest (neem2) and Tween 20 (emulsifier), at concentrations of 1%, 2%, and 4%, as well as 0% (control), no mortality of varroa or bees was observed at 48 h, neither with a 50% in complementary tests. These results differ from those reported by Melathopoulos et al. (2000), who evaluated neem oil and Neem-azaTM; the former, using topical application, caused 45% mortality in varroa, while the latter used topical, oral and vapor applications and caused significant mite mortality. It was decided not to increase the concentration of the products because there were problems in forming stable suspensions were encountered; also, it was considered that elevating the concentration would make use of the product impractical or costly. For PHC Neem, the recommendation of the manufacturer for pest control on fruit trees is 0.5-2 L concentrate 100 L−1 water, and on vegetables 50 mL 15 L−1 water is recommended. These values are equivalent to 0.5-2% and 0.33% of product concentrate; that is, very close to those used in our study. Direct contact of bees with neem at concentrations of 20 ppm does not produce negative effects, and effective pest control can be achieved with applications of 30 to 50 ppm of azadirachtin (Larson, 1990; Isman, 1995). According to Atkins (1992), azadirachtin is a relatively non-toxic substance for bees, with a LD50 of 11 µg per bee. Naumann et al. (1994) found that neem seed extract is a safe insecticide to use when there are honey bees present at the moment of use. In fact, the treatments they used did not repel the bees and suggest that neem can be used for pest control in crops at the flowering stage even when bees are required for pollination. Repellency test with choice There were significant differences in repellency values attributable to double interactions of the variables

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Cuadro 1. Análisis de varianza de la prueba de repelencia de extractos de neem con elección, donde la variable de respuesta es el valor de repelencia (VR). Table 1. Analysis of variance of the repellency test of neem extracts with choice, in which the response variable is the repellency value (RV). Fuente de variación

GL

Producto Concentración Tiempo Producto*concentración Producto*tiempo Concentración*tiempo Producto*concentración*tiempo

3 3 7 9 21 21 63

Suma de cuadrados 24606.125 29805.750 3050.031 9572.812 4669.219 5654.094 3536.469

acción individual de cada variable. Por tanto, las variables producto y concentración son de interés en la discusión, mientras que la variable tiempo, aunque fue analizada, representa sólo la diferencia atribuible a las fluctuaciones en las lecturas, por lo que es pertinente omitirla de la discusión. En la Figura 2 se muestra la tendencia en los valores de repelencia (VR) a lo largo del tiempo. Primero puede apreciarse la tendencia estable (de 98 a 110.3) que presentó el testigo (tratado con agua) durante las 72 h de observaciones. El tratamiento a base de emulsificante pareció mostrar un ligero efecto repelente durante las primeras 4 h, pero sólo tuvo diferencia significativa respecto al testigo a los 30 min y a concentración de 1%; el VR del emulsificante no fue superior a 114. Estos valores de repelencia concuerdan con los citados por Colin et al. (1994), VR alrededor de 100 para el agua y el emulsificante, los que muestran que las hembras de varroa se distribuyen uniformemente en las arenas de observación. Para el aceite de neem el efecto repelente varió en las dos cosechas; en la de 2002 (neem1), los VR en las diferentes concentraciones fueron significativamente más altos que en el testigo, con un valor máximo de 132 a las 4 h (concentración 2%). Pero el efecto se redujo en todas las concentraciones al pasar el tiempo, y a las 72 h el VR mínimo fue 101, igual al testigo. La cosecha de 2003 (neem2) tuvo altos VR en todas las concentraciones, que se separaron de los testigos (agua y emulsificante); a la concentración más alta (4%) hubo diferencias significativas (p≤0.05) desde 30 min hasta 72 h, y los VR oscilaron entre 128 y 139, lo cual está muy cercano a la repulsión total (140). Colin et al. (1994) encontraron que el extracto de Thymus vulgaris tuvo el VR más alto, 124 a las 24 h, el cual disminuyó con el tiempo. Estos resultados contrastan con los VR y estabilidad que de neem2 en la presente investigación. Dado que los extractos de neem de 2002 y 2003 se obtuvieron de la misma plantación y se extrajeron de

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Cuadrados medios 8202.042 9935.250 435.719 1063.646 222.344 269.242 56.134

Fcal 109.87 133.08 5.84 14.25 2.98 3.61 0.75

Significancia F