TESTOSTERONE FREE EIA WELL Direkte immunenzymometrische Bestimmung von Free Testosterone in Serum oder Plasma. REF KSO015EW

VERWENDUNGSZWECK Kompetitive immunenzymometrische, colorimetrische Methode zur quantitativen Bestimmung von freiem Testosteron in Serum und Plasma. 1. KLINISCHE BEDEUTUNG Testosteron ist ein Steroidhormon aus der Adrogengruppe. Es wird primär von den Testes und den Ovarien, kleine Mengen aber auch von den Nebennieren sekretiert. Es ist das hauptsächliche männliche Sexualhormon und ein anaboles Steroid. Bei Männern und Frauen spielt es Schlüsselrollen bei Gesundheit und Wohlbefinden. Nur 1-2 % des zirkulierenden Testosterons existiert als ungebundenes oder freies Testosteron. Der größte Teil, ca. 60 %, ist mit hoher Affinität an SHBG, das übrige lose an Albumin gebunden. Sowohl die albumingebundene als auch die freie Fraktion können biologisch aktiv sein, während SHBG effektiv die Testosteronaktivität hemmt. Testosteroneffekte können als virilisierende und anabole Effekte klassifiziert werden. Anabole Effekte beinhalten ein Wachstum der Muskelmasse und –stärke und eine Stimulation des linearen Wachstums und der Knochenreifung. Virilisierende Effekte beinhalten die Reifung der Sexualorgane.

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Testosteronwerte fallen mit dem Alter der Männer allmählich ab. Die Messung der freien oder ungebundenen Fraktion von Serum-Testosteron wurde als Mittel für die Einschätzung des physiologisch bioaktiven Hormons vorgeschlagen. Freie Testosteronwerte sind erhöht bei Frauen mit Hyperandrogenismus in Verbindung mit Hirsutismus mit oder ohne polyzystische Ovarien. Außerdem kann die Messung von freiem Testosteron nützlicher als GesamtTestosteron bei erniedrigtem oder erhöhtem SHBG (z.B. bei Hypothyreose und Fettleibigkeit) sein. 2. TESTPRINZIP Freies Testosteron (Antigen) in der Probe konkurriert mit enzymmarkiertem Testosteron (Meerrettichperoxidase) um die Bindung an eine begrenzte Anzahl von Bindungsplätzen am TestosteronAntikörper in den Wells der Mikrotiterplatte (Festphase). Nach der Inkubation erfolgt die Trennung des Gebundenen vom freien Überstand durch einfaches Waschen der Festphase. Das Enzymsubstrat (H2O2) und das TMB-Substrat (TMB) werden zugefügt. Nach einer bestimmten Zeit bis zur maximalen Farbentwicklung wird die Enzymreaktion gestoppt und die Extinktion gemessen.

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Die Konzentration von freiem Testosteron in der Probe wird auf Basis eines Kalibrierungssets berechnet. Die Farbintensität ist umgekehrt zur Konzentration von freiem Testosteron in der Probe. Testosteron ist im Blut an SHBG (60 %) und zu einem kleineren Teil an andere Proteine gebunden. Nur die Bestimmung von freiem Testosteron (< 1 % vom Gesamt-Testosteron) erlaubt die Einschätzung des biologisch aktiven Hormons.

3. REAGENZIEN, MATERIALIEN UND GERÄTE 3.1 Reagenzien und Material im Kit - Lagern Sie alle Reagenzien im Dunkeln bei +2 - 8°C. - Die Reagenzien sind ausreichend für 96 Wells. CAL

KALIBRATOREN 6 Fläschchen (jeweils 1 ml) Free Testosterone Calibrators. Gebrauchsfertig.

CONJ ENZYME KONJUGAT 1 Fläschchen (24 ml) Testosterone-HRP Conjugate. Gebrauchsfertig. MTP

MIKROTITERPLATTE 96 einzeln brechbare Wells, beschichtet mit AntiTestosteron-IgG. Öffnen Sie die Packung erst, wenn sie Raumtemperatur erreicht hat, und schließen Sie sie sofort nach Gebrauch wieder. Nach dem ersten Öffnen ist die Mikrotiterplatte bis zum Verfallsdatum des Kits haltbar. Entfernen Sie die Haftetiketten nicht von den unbenutzten

Streifen. SUBS

SUBSTRATE BUFFER 1 Fläschchen (13 ml) H2O2TMB 0,25gr/l. (Hautkontakt vermeiden.) Gebrauchsfertig.

STOP STOPPLÖSUNG 1 Fläschchen (14 ml) Schwefelsäure (H2SO4), 0,15 mol/l. (Hautkontakt vermeiden.). Gebrauchsfertig. 3.2 Zusätzlich benötigte Reagenzien - destilliertes Wasser 3.3 Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte Automatischer Dispenser. Mikrotiterplatten-Reader (450 nm). 4. VORSICHTSMASSNAHMEN • Verwenden Sie keine stark hämolysierten Proben. • Für die Dispensierung der Reagenzien ist eine maximale Präzision erforderlich. • Verwenden Sie keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen. • Setzen Sie das TMB-H2O2 nicht direktem Sonnenlicht aus und vermeiden Sie Kontakt mit Metallen und Oxidantien. • Diese Methode ermöglicht die Bestimmung von freiem Testosteron im Bereich von 0,1- 100,0 pg/ml. • Die klinische Bedeutung der Bestimmung kann beeinträchtigt sein, wenn der Patient mit Cortison oder natürlichen oder synthetischen Steroiden behandelt wurde.

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5. TESTDURCHFÜHRUNG 5.1 Vorbereitung der Kalibratoren Vor Gebrauch 5 Minuten auf auf einem Rotationsmischer mischen. Die Kalibratoren enthalten die folgenden Konzentrationen von freiem Testosteron: pg/ml CAL 0 0 CAL 1 0,2 pg/ml CAL 2 1,0 pg/ml CAL 3 4,0 pg/ml CAL 4 20,0 pg/ml CAL 5 100,0 pg/ml Nach dem ersten Öffnen sind die Kalibratoren 6 Monate bei +2-8°C haltbar. 5.2 Vorbereitung der Proben Die Bestimmung von freiem Testosteron kann in Plasma und Serum von nüchternen Patienten durchgeführt werden. Lagern Sie die Proben bei -20°C, wenn die Bestimmung nicht am Tag der Probenentnahme durchgeführt wird. 5.3 Testdurchführung Da eine Messung in Doppelbestimmung erforderlich ist, bereiten Sie 2 Wells für jeden der fünf Punkte der Standardkurve (CAL 0 – CAL 5), 2 Wells für jede Probe und ein Well für das Blank vor. Pipettieren Sie: Probe 20 μl

Blank ---

Probe

CAL ---

CAL

20 μl

---

---

CONJ

200 μl

200 μl

---

1 Stunde bei 37°C inkubieren. Entfernen Sie den Inhalt aus den Wells. Waschen Sie die Wells mit 300 μl destilliertem Wasser. Wiederholen Sie den Waschvorgang und entfernen Sie das Wasser dabei vollständig. Pipettieren Sie: SUBS

CAL 100μl

Probe 100μl

Blank 100μl

15 Minuten bei Raumtemperatur (2025°C) im Dunkeln inkubieren. Pipettieren Sie: STOP

CAL 100μl

Probe 100μl

Blank 100μl

Messen Sie die Extinktion (E) bei 450 nm gegen das Blank. Falls Sie für die Testdurchführung ein Mikrotiterplatten-Analysegerät von RADIM und/oder SEAC verwenden, beachten Sie bitte die entsprechende Bedienungsanleitung.

6. QUALITÄTSKONTROLLE Jedes Labor sollten Kontrollen für den normalen, hohen und niedrigen Konzentrationsbereich von freiem Testosteron für die Überwachung der Assayleistung einsetzen. Diese Kontrollen sollten wie unbekannte Proben behandelt und die Werte bei jedem Testrun ermittelt werden. Qualitätskontrolltabellen sollten geführt werden, um die Leistung der zur Verfügung gestellten Reagenzien zu verfolgen. Um Trends nachzuweisen sollten geeignete statistische Methoden eingesetzt werden.

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Das einzelne Labor sollte akzeptable Grenzen für die Assayleistung festlegen. Andere Parameter, die überwacht werden sollten, schließen die 80, 50 und 20 % Intercepts der Standardkurve für die Run-zu-Run-Reproduzierbarkeit ein. Außerdem sollte die maximale Extinktion mit den letzten Tests übereinstimmen. Eine signifikante Abweichung von der ermittelten Leistung kann ein Hinweis auf eine unbemerkte Veränderung der Testbedingungen oder einen vorzeitigen Verfall der Kitreagenzien sein. Für die Ermittlung der Ursachen für die Variationen sollten frische Reagenzien eingesetzt werden.

vertikal. Berühren Sie nicht den Boden der Wells. Fehlerhaftes oder ungeeignetes Entfernen der Flüssigkeit während des Absaugens oder Dekantierens beim Waschschritt führt zu schlechten Doppelwerten und falschen Ergebnissen. 7.2 Interpretation Falls eine computergesützte Datenauswertung für die Berechnung der Testergebnisse verwendet wird, müssen die Werte für die Kalibratoren innerhalb von 10% der angegebenen Konzentrationen liegen.

8. ERGEBNISSE 7. GRENZEN DES VERFAHRENS 7.1 Assayleistung Proben, die mikrobiell kontaminiert sind, sollten nicht in diesen Assay eingesetzt werden. Stark lipämische oder hämolysierte Proben sollten ebenfalls nicht verwendet werden. Für reproduzierbare Ergebnisse ist es wichtig, dass die Reaktionszeit für jedes Well konstant gehalten wird. Um ein Assaydrift zu vermeiden, sollte das Pipettieren der Proben nicht länger als 10 Minuten dauern. Falls mehr als eine Platte verwendet wird, wird eine Wiederholung der Standardkurve empfohlen. Die Zugabe des Substrates löst eine kinetische Reaktion aus, die durch Zugabe der Stopplösung beendet wird. Deshalb sollte die Zugabe des Substrates und der Stopplösung in derselben Reihenfolge erfolgen, um eine Zeitabweichung während der Reaktion auszuschließen. Platten-Reader messen

8.1 Mittlere Extinktion Berechnen Sie den mittleren Extinktionswert (mE) für jeden Punkt der Standaredkurve und für jede Probe.

8.2 Standardkurve Tragen Sie die Werte für die Extinktion der Kalibratoren (mE) gegen die Konzentrationen auf. Ziehen Sie die geglättete Kurve durch die eingetragenen Punkte (z.B. 4-Parameter-Logistik). 8.3 Berechnung der Ergebnisse Interpolieren Sie die Probenwerte auf der Standardkurve, um die entsprechenden Ergebnisse als Konzentration in pg/ml zu ermitteln.

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Falls Sie ein automatisiertes Analysengerät für Mikrotiterplatten von RADIM und/oder SEAC verwenden, wird automatisch eine spektrophotometrische Messung bei 3 verschiedenen Wellenlängen durchgeführt: 450, 405 und 620 nm, was einen weiteren Kurvenbereich ermöglicht.

9. REFERENZWERTE MEDIAN

MW ± 1SD

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pg/ml 13 ± 7

pg/ml 4,5 – 42

1,3 0,9 0,8

1,4 ± 0,9 1,1 ± 0,6 0,9 ± 0,5

n.n. – 4,1 0,3 – 2,0 0,1 – 1,7

Gesunde Männer Frauen: Ovulation Orale Kontrazeptiva Postmenopause

BEREICH

n.n. = nicht nachweisbar

10. TESTCHARAKTERISTIKA 10.1 Präzision 10.1.1 Wiederholbarkeit (Intraassay) Die Intraassay-Variation wurde anhand von 16 Replikaten von 2 verschiedenen Kontrollseren in einem Assay-Run ermittelt. Die Intraassay-Variation beträgt 6.4%.

10.1.2 Reproduzierbarkeit (Interassay) Die Interassay-Variation wurde anhand von mehrfacher Bestimmung von 3 verschiedenen Kontrollseren mit 2 verschiedenen Lots ermittelt. Die Interassay-Variabilität beträgt 8%.

10.2 Spezifität Die Kreuzreaktion des Antiserums, berechnet bei 50% (nach Abraham), zeigt folgende Tabelle: Analyt Testosteron DHT Androstendion Androsteron DHEA-S Cortisol Cortison 17-α Estradiol Estron Prednison 17-α Ethynilestradiol Norgestrel

% Kreuzreaktion 100 0,006 0,0005 0 0 0 0 0 0 0 0 0

10.3 Sensitivität Die unterste nachweisbare Konzentration von freiem Testosteron, die vom Nullkalibrator unterschieden werden kann, liegt bei 0,002 pg/ml bei der 95% Vertrauensgrenze. 10.4 Korrelation zum RIA Der Testosterone Free EIA WELLAssay wurde mit einem anderen kommerziell erhältlichen Assay für freies Testosteron verglichen. Serumproben von 69 Frauen und 26 Männern wurden entsprechend mit beiden Testsystemen gemessen. Es wurde eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt: y = 0,47 x + 0,378 r = 0,86

10.5 Hook-Effekt KSO015EW TESTOSTERONE FREE E.W. M368.de – Rev. 3 – 07/2007 – Pag. 5/8

Der Testosterone Free EIA WELL, ein kompetitiver Enzymimmunoassay, zeigt keinen Hook-Effekt bis zu 400 pg/ml. BIBLIOGRAFIA – BIBLIOGRAPHY - LITERATUR 11. ABFALLENTSORGUNG Die Reagenzienabfälle müssen den regionalen Gesetzen und Vorschriften entsprechend entsorgt werden.

12. AUTOMATISIERTE TESTDURCHFÜHRUNG − Dieser Test kann auf automatisierten ELISA-Analysegeräten für Mikrotiterplatten durchgeführt werden. − Wir garantieren die Verwendbarkeit auf den automatisierten Analysegeräten von RADIM und/oder SEAC. − Bei Verwendung anderer automatisierter MikrotiterplattenAnalysegeräte als von RADIM oder SEAC liegt es in der Verantwortung des Benutzers, dass die Eignung für ELISA-Kits entprechend getestet wurde.

1) McCann D, Kirkish L. Evaluation of Free Testosterone in serum. J. Clin. Immunoassay 1985;8:234-6 2) Ekins RP. Free hormones in blood J. Clin. Immunoassay 1984; 7(2): 163 – 80 3) Paulson JD, et al. Free Testosterone concentration in serum: elevation is the hallmark of hirsutism. Am. J Obst. Gynecol 1977; 128:851-7 4) Odlind V. et al. Plasma androgenic activity in women with acne vulgaris and in healthy girls before, during and after puberty. Clin. Endocrinology 1982; 16:243-49 5) Green PJ. Free Testosterone determination by ultrafiltration and comparation with dialisys. Clin Chem 1982; 28:1237 6) Wu CH. Plasma free and proteinbound testosterone in hirsutism. Obstet Gynecol. 1982; 60:188-94

13. SYMBOLLEGENDE: siehe S. 11

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SYMBOLE EN 980 – EDMA REF

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96

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RDAT E

Referenzdatum

RCNS

rekonstituiren mit

H2O

Deionisiertes oder Destilliertes Wasser

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