Study on the vitro regeneration of doubled haploid maize (Zea mays L.) plants

Research Collection Doctoral Thesis Study on the vitro regeneration of doubled haploid maize (Zea mays L.) plants Author(s): Schmidhalter Saisington...
Author: Adam Steinmann
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Research Collection

Doctoral Thesis

Study on the vitro regeneration of doubled haploid maize (Zea mays L.) plants Author(s): Schmidhalter Saisingtong, Soontari Publication Date: 1998 Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-001923691

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Diss. ETH No. 12544

Study on the in vitro regeneration of doubled haploid maize (Zea mays L.) plants

A dissertation submitted to the Swiss Federal Institute of Technology Zurich

for the degree of

Doctor of Natural Seien ces

Presented by

Soontari Schmidhalter Saisingtong M.Sc. (Agriculture), Kasetsart University born August 20, 1966 in Lampang (Thailand)

Accepted on the recommendation of

Prof. Dr. Peter Stamp, Examiner Dr. Bernd Büter, Co-examiner Dr. Sabine Deimling, Co-examiner

Zürich 1998

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Summary

In anther culture systems, microspores within the anther are induced to undergo androgenesis. In the course of androgenesis microspore-derived embryo-like sturctures (ES) are formed which eventually regenerate into plants. Plant regeneration occurs either directly after transferring the

ES to

regeneration medium or indirectly via an intermediate culture step leading to the formation of regenerable calli (Re) which finally also are transferred to regeneration medium. According to their origin these regenerated plants are haploid, Le. they carry the gametic chromosome number, in maize 10 chromosomes. Only if spontaneous chromosome doubling has occured during the androgenic development doubled haploid (DH) plants are obtained. Since haploid maize plants are without value for breeding applications, the production of high frequencies of DH plants is an essential requirement for the practical use of anther culture in maize breeding. The efficiency of maize anther culture is determined by three factors: L

the frequency of ES formation (ES/100 anthers)

iL

the frequency of plant regeneration (RP/100 ES; RP/100 anthers)

iii.

the frequency of DH plant formation (DH/100 RP) Most studies in maize anther culture so far have focussed on ES

formation. Instead, in the present study especial attention was given to the factors (ii.) and (Hi.), Le. plant regeneration and chromosome doubling. Studies into these two subjects require the availability of genotypes with high androgenic potential. No regeneration studies can be conducted without sufficient numbers of ES and no meaningful chromosome doubling studies are feasible without sufficient numbers of ES and RP. In maize such genotypes are still rare. In the present study highly androgenic genotypes developed in a

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former ETH project on maize androgenesis (Büter, 1992) were employed. In the first part of the thesis (chapter 3), experiments aiming at the improvement of the plant regeneration efficiency are described. In particular, the impact of the time of transferring ES to regeneration conditions (Le. transfer to regeneration medium and to the light) was investigated. In the standard anther culture protocol, anthers are kept on the induction medium for 8-12 weeks. Evolving ES are removed from the induction medium every 10-14 days starting about 4 weeks after anther inoculation. In the present study attempts were made to expose the developing ES to regeneration conditions much earlier, i.e, even before they penetrate the anther wall and become visible macroscopically. Therefore, not ES but anthers need to be transferred to regeneration conditions; accordingly this method is called the "early anther transfer method". Gur results showed that, in spite of a reduced ES formation, the percentage of ES giving rise to plants (RP/100 ES) and, as a consequence, the overall plant regeneration efficiency (RP/100 anthers) are greatly improved. In other words: less ES produce more regenerated plants when the early anther transfer method is employed. The optimal time of anther transfer to regeneration conditions was 21 days after anther inoculation. Using a high responding genotype, 18.9 RP/100 ES and 4.7 RP/100 anthers were obtained with the early anther transfer method as compared to 3.3 RP/100 ES and 3.3 RP/100 anthers in the standard protocol. In a final experiment the early anther transfer method was compared to the standard protocol for a spectrum of more than 40 genotypes. Again, the superiority of the early transfer was obvious indicating that this method has a broad relevance in maize anther culture. In the second part of the thesis (chapters 4 and 5) different attempts were made to increase the chromosome doubling frequencies. Spontaneous chromosome doubling is particularly infrequent in maize anther culture and therefore the application of doubling agents is essential. Colchicine as the most common doubling agent in plant tissue culture was first examined (chapter 4). In contrast to earlier studies (Wan et al., 1989) colchicine was administered at the very beginning of the in vitro culture period, Le. during the first 1-7 days

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after anther inoculation. Thus, anthers directly were incubated on induction medium containing colchicine (5-1000 mg/L) for different duration (1-7 days). Ouring the colchicine treatment anthers were subjected to a cold treatment (14°C/7 days) which was necessary in order to keep the overall anther culture response on a high level. Three genotypes were employed in the experiments. Two major results were obtained: (i.) the ES formation was improved when colchicine was applied at a low concentration (5 mg/L applied for 7 days) or for a short duration (1-3 days, 250 mg/L); (ii) the optimum number of OH plants was achieved when 250 mg/L colchicine was applied for 7 days. With the best colchicine treatment (250 mg/L, 7 days) and using a highly responsive genotype (ETH M36) 9.9 OH/100 anthers as compared to 1.4 OH/100 anthers in control treatment were obtained. In chapter 5,

three alternative antimitotic agents: amiprophosmethyl

(APM), oryzalin and pronamide were evaluated for their potential to induce chromosome doubling in maize anther culture. In comparison with colchicine these compounds are characterized by a higher affinity to plant microtubules and a lower toxicity for humans. Range-finding experiments for each of the compounds were conducted with the genotype ETH-M24. The results revealed that oryzalin and pronamide, like it had been shown for colchicine in chapter 4, increase the ES and RP formation when applied at low concentration or for a short duration. With proper treatments, an improvement of the doubling index (01

= number

of OH plants divided by total number of RP) was accomplished

with each of the three doubling agents. However, these 01 maximizing treatments generally severely decreased the ES and RP production and thus were unsuitable with regard to optimum OH plant production. The range-finding experiments were concluded by the determination of the most suitable treatment for each of these three agents; the following treatments were selected: APM at 1.52 mg/L applied for 1 day, oryzalin at 0.034 mg/L applied for 5 days and pronamide at 0.64 mg/L applied for 3 days. These treatments were compared to the optimal colchicine treatment as described in chapter 4 (250 mg/L applied for 7 days). Six genotypes were involved in this final

--,."".------

._--

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camparison. Generally, the application of the doubling agents resulted in reduced ES and RP formation frequencies. With all six genotypes the highest ES and RP frequencies were found in the control treatment. The smallest reductions were found for pronamide. As expected a generally positive impact of the doubling agents was found with regard to the 01. This resulted in increased frequencies of OH plant formation (OH/100 anthers), the ultimate parameter of anther culture efficiency. However, no clear answer could be given concerning the optimal doubling agent. Although colchicine in all tested genotypes was found to be the most suitable agent with regard to the 01 impravement, a slightly different picture was obtained for the optimum OH plant formation. In four out of the six genotypes the maximum OH plant praduction was achieved with colchicine, but in the two remaining genotypes pranamide and oryzaline, respectively, gave better results. In the best combination of genotype and doubling agent (ETH-M80; colchicine) 11 OH plants/100 anthers were praduced compared to 4 DH plants/100 anthers in the corresponding contral treatment. It is assumed that, if such an efficiency level could be assured for a braad range of genotypes, anther culture would present a relevant tool in maize breeding as it is already the case in other species like barley or rice.

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Zusammenfassung In der Antherenkultur werden Mikrosporen, die sich im Inneren der

Antheren befinden, zur Androgenese angeregt. Im Verlauf der Androgenese bilden sich embryo-ähnliche Strukturen (ES), die schliesslich zu Pflanzen regenerieren. Die Regeneration von Pflanzen erfolgt entweder direkt nach dem Transfer der Pflanzen auf ein Regenerationsmedium oder indirekt nach einem intermediären Schritt, der die Ausbildung von regenerierbarem Callus (RC) ermöglicht, der dann seinerseits auf ein Regenerationsmedium überführt wird. Entsprechend ihrer Herkunft sind die regenerierten Pflanzen haploid, d.h. sie weisen die gametische Chromosomenzahl auf, beim Mais also 10 Chromosomen. Nur wenn es während der androgenetischen Entwicklung zu einer spontanen Verdoppelung der Chromosomen kommt, kommt es zur Bildung von doppelhaploiden (DH) Pflanzen. Da haploide Maispflanzen für die Züchtung in der Regel ohne praktischen Wert sind, ist die Erreichung einer hohen Verdoppelungsfrequenz für den Einsatz der Antherenkultur in der Züchtung von essentieller Bedeutung. Die Effizienz der Mais-Antherenkultur wird durch drei Faktoren bestimmt: i.

die Frequenz der ES-Bildung (ES/100 Antheren)

ii.

die Frequenz der Pflanzenregeneration (RP/100 Antheren)

iii.

die Frequenz der DH Pflanzen (DH/100 Antheren) Die Mehrheit der bisher zum Thema Mais Antherenkultur veröffentlichten

Studien haben sich vor allem mit der ES Bildung auseinandergesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurde dagegen den Faktoren (ii.) und (iii.), d.h. der Pflanzenregeneration

und

der

Chromosomenverdoppelung,

die

pnmare

Aufmerksamkeit gewidmet. Untersuchungen zu diesen beiden Faktoren setzen die Verfügbarkeit von Genotypen mit hohem androgenetischen Potential voraus. Der Faktor Regeneration kann nur dann untersucht werden, wenn ES

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in ausreichenden Mengen vorhanden sind und sinnvolle Experimente zur Chromosomenverdoppelung sind nur dann möglich, wenn ES und RP in genügender Anzahl verfügbar sind. Beim Mais sind entsprechende Genotypen nach wie vor selten. In der vorliegenden Arbeit konnte auf verschiedene Genotypen mit sehr hohem androgenetischen

Potential zurückgegriffen

werden, die im Rahmen eines früheren ETH-Projektes entwickelt worden waren (Büter, 1992). Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit (Kapitel 3) werden Experimente zur

Optimierung

der

Pflanzenregeneration

beschrieben.

Dabei

wurde

insbesondere der Einfluss der Zeitpunktes untersucht, zu dem die ES zur Regeneration angeregt werden (d.h. Transfer auf das Regenerationsmedium und ins Licht). Im Standard-Antherenkulturverfahren verbleiben die Antheren für 8-12 Wochen auf dem Induktionsmedium. Die sich bildenden ES werden mit Beginn der fünften Woche nach der Anthereninokulation im 14-tägigen Rhythmus vom Induktionsmedium entfernt und auf Regenerationsmedium transferiert. Dagegen wurde in der vorliegenden Arbeit versucht, die ES schon sehr

viel

früher

zur

Regeneration

anzuregen,

d.h.

bereits

vor

dem

makroskopisch sichtbaren Heraustreten der ES aus der Antherenwand. Es werden folglich nicht ES, sondern Antheren auf das Regenerationsmedium übertragen. Die entsprechende Methode wird als "Frühzeitiger AntherenTransfer" bezeichnet. Unsere Ergebnisse belegen, dass mit dieser Methode zwar die ES Bildung reduziert wird, dass aber der Anteil derjenigen ES, die zu einer Pflanze regenerieren (RP/100 ES) und -als Folge davon- die Effizienz der Pflanzenregeneration (RP/100 Antheren) entscheidend erhöht werden kann. In anderen Worten: weniger ES produzieren mehr regenerierte Pflanzen, wenn der "frühzeitige Antheren-Transfer"-Methode eingesetzt wird. Als optimaler Transfer-Zeitpunkt stellte sich der 21. Tag nach der Anthereninokulation heraus. Durch Anwendung dieser Methode bei einem Genotyp mit hohem androgenetischem Potential konnten 18.9 RP/100 ES und 4.7 RP/100 Antheren erzielt werden, während die entsprechenden Frequenzen

im Standard-

Verfahren mit 3.3 RP/100 ES und 3.3 RP/100 Antheren wesentlich niedriger lagen. Die Überlegenheit des frühzeitigen Transfers bestätigte sich auch in

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einem abschliessenden Vergleich der beiden Verfahren an mehr als 40 Genotypen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit (Kapitel 4 und 5) wurde verschiedene

Versuche

zur

Chromosomenverdoppelung

Steigerung

der

unternommen.

Frequenz Da

der

spontane

Chromosomenverdoppelungen beim Mais nur selten vorkommen, ist der Einsatz von Verdoppelungsagentien in der Mais-Antherenkultur essentiell. Zuerst wurde die Substanz Colchicin -die in der pflanzlichen Zellkultur gebräuchlichste Verdoppelungssubstanz- getestet. Im Gegensatz zu den Arbeiten

von

Wan

et

al

(1989)

wurde

das

Colchicin

dabei

zum

frühestmöglichen Zeitpunkt in der in vitro Kultur, d.h. während der ersten 1-7 Tage, eingesetzt. Die Antheren wurden für unterschiedliche Dauer (1-7 Tage) direkt

auf Colchicin-haltiges Induktionsmedium

(5-1000 mg/L Colchicin)

inokuliert. Während der Colchicin-Behandlung wurden die Antheren einer Kältebehandlung (14 oCI7 Tage) ausgesetzt, um eine hohe ES-Bildungsrate zu gewährleisten. Die Versuche umfasssten drei Genotypen. Folgende Resultate wurden erzielt: i. die ES Bildung war erhöht, wenn Colchicin in geringer Konzentration (5 mg/L, 7 Tage) oder für kurze Dauer (1-3 Tage, 250 mg/L) appliziert wurde; ii. die beste Ausbeute an DH Pflanzen wurde erreicht, wenn 250 mg/L Colchicin für einen Zeitraum von 7 Tagen appliziert wurde. Mit diesem Verfahren, angewandt bei einem Genotyp mit hohem androgenetischen Potential (ETH M 36), konnte eine Frequenz von 9.9 DH Pflanzen/100 Antheren erzielt werden, während die entsprechende Rate im Kontrollverfahren lediglich 1.4 DH Pflanzen/100 Antheren betrug. Im

5.

Kapitel

wurden

drei

alternative

Verdoppelungsagentien:

Amiprophosmethyl (APM), Oryzalin und Pronamide im Hinblick auf ihre Eignung für die Mais-Antherenkultur untersucht. Verglichen mit Colchizin sind diese Agentien

durch eine wesentlich

höhere Affinität zu pflanzlichen

Mikrotubuli und eine niedrigere Toxizität für Menschen gekennzeichnet. Zunächst wurden Experimente zu Abklärung

der optimalen

Dosis und

Applikationsdauer für die einzelnen Substanzen durchgeführt. Für diese

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Experimente wurde der Genotyp ETH-M24 eingesetzt. Es zeigte sich, dass Oryzalin und Pronamide-ähnlich wie es in den vorangegangenen ColchicinVersuchen beobachtet worden war- bei niedriger Dosierung oder kurzer Applikationsdauer die ES- und RP-Bildung günstig beeinflussten. Mit allen drei getesteten Verdoppelungsagentien konnte der Verdoppelungsindex (01 = Anzahl DH Pflanzen dividiert durch die Gesamtzahl der regenerierten Pflanzen) erhöht werden; allerdings waren dazu relativ hohe Konzentrationen bzw. lange Applikationszeiten erforderlich, die einen sehr negativen Effekt auf ES und RP Bildung ausübten. Als Resultat der Experimente wurden folgende Verfahren selektiert: APM - 1.52 mg/L, 1 Tag; Oryzalin - 0.034 mg/L, 5 Tage; Pronamide 0.64 mg/L, 3 Tage. Diese Verfahren wurden in einem abschliessenden Experiment mit 6 Genotypen mit dem optimalen Colchicin-Verfahren (250 mg/L, 7 Tage) verglichen. Allgemein

führte

die

Applikation

der

Verdoppelungsagentien

zu

reduzierten ES- und RP Bildungsraten, das Kontrollverfahren ergab für alle getesteten Genotypen die höchsten ES und RP-Bildungsraten. Beim Einsatz von Pronamide war der Rückgang der ES und RP-Bildung am geringsten. Erwartungsgemäss

wurde

ein

generell

positiver

Effekt

Verdoppelungsagentien auf den Verdoppelungsindex festgestellt.

der Daraus

resultierte eine erhöhte Bildung von DH Pflanzen pro Antheren-Einheit (DH/100 Antheren), dem letztlich ausschlaggebenden Parameter für die Effizienz der Antherenkultur.

Eine

eindeutige

Aussage

bzgl.

der

optimalen

Verdoppelungssubstanz liessen die Ergebnisse allerdings nicht zu. Zwar wurde mit

Colchicin

bei

allen

untersuchten

Genotypen

der

höchste

Verdoppelungsindex erzielt, aber in Bezug auf die Effizienz der Produktion von DH Pflanzen zeigte sich ein weniger eindeutiges Bild: bei vier von sechs Genotypen führte die Verwendung von Colchicin zu den besten Ergebnissen, bei den beiden verbliebenen Genotypen waren Pronamide und Oryzaline dem Colchicine überlegen.

Aus der besten Kombination von Genotyp

und

Verdoppelungsverfahren (ETH-M80; Colchicin) resultierte eine DH PflanzenAusbeute

von

11

DH Pflanzen/100

Antheren im Vergleich

zu 4 DH

Pflanzen/100 Antheren im zugehörigen Kontrollverfahren. Könnten derartige

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Ausbeuten für ein breites Spektrum an Genotypen realisiert werden, würde einer Anwendung der Mais-Antherenkultur in der praktischen Züchtungsarbeit, wie es ja bei anderen Spezies, z.8. Gerste oder Reis, bereits üblich ist, nichts mehr im Wege stehen.

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