Studienarbeit SS 06 Optimierung der Produktion von Riboflavin (Vitamin B2) und Inbetriebnahme und Test einer Mikroskopkamera

Bearbeitung:

Tabea Hillmayr Jelena Rößle

Betreuer:

Prof. Dr.-Ing. W. Reule Dipl.-Ing. Marc Hannappel

Inhaltsverzeichnis

I. Einleitung II. Optimierung der Produktion von Riboflavin (Vitamin B2) 1. Grundlagen1 1.1 Riboflavin 1.2 Produktion 1.3 Fermentation 1.4 Hefe 1.5 Riboflavin-Biosynthese 1.6 Produktionsverstärker Glycin 1.7 Temperatur 2. Aufgabenstellung 3. Material und Methoden 3.1. Hefe 3.2. Medien 3.2.1.

Kpi-Puffer

3.2.2.

Medium 186

3.2.3.

Spurensalzlösung

3.2.4.

Vitaminlösung

3.2.5.

Batch-Medium für Schüttelkolben

3.3. Messverfahren 3.3.1.

Glucosegehalt

3.3.2.

Optische Dichte (OD)

3.3.3.

Hefetrockensubstanz

3.3.4.

Riboflavingehalt

4. Durchführung 5. Ergebnisse und Diskussion 5.1. Hefetrockensubstanz und OD 5.2. Glucose 5.3. Riboflavin 5.4. Ergebnis 1

Der Punkt hinter der Ziffer der Hauptkapitel-Nummerierung entspricht nicht der Norm! Es muss heißen: 1 Grundalagen. Im Übrigen finde ich eine gemischte Nummerierung (Römische Ziffern und arabische Ziffern) nicht gut. Gefordert ist die Dezimalklassifikation! Wegen der 2 Teilthemen aber akzeptabel.

III. Inbetriebnahme und Test einer Mikroskopkamera 1. Grundlagen 2. Aufgabenstellung 3. Betriebsanleitung 4. Kurzanleitung 5. Logbuch IV. Zusammenfassung Literaturverzeichnis

I.

Einleitung

Riboflavin (Vitamin B2) hat eine große Bedeutung für den Ablauf der Lebensprozesse und ist im Tier- und Pflanzenreich weit verbreitet. In Form des Flavinadenindinucleotids (FAD) und des Flavinmononucleotids (FMN) bildet es die Coenzyme bzw. prosthetischen Gruppen der Flavoproteine, die als Elektronenakzeptoren der Oxidoreduktasen benötigt werden. Riboflavin kann im Gegensatz zu Mikroorganismen und Pflanzen von Mensch und Tier nicht synthetisiert werden und muss daher mit der Nahrung aufgenommen werden. Mangelerscheinungen wie z.B. Dermatitis lassen sich vermeiden, indem eine empfohlene Tagesration von 0,3 - 1,8 mg/Tag beim Menschen dem Organismus zugeführt wird. Eine Überdosierung ist harmlos, da überschüssiges Riboflavin mit dem Urin ausgeschieden wird. 2 Die ersten großtechnischen fermentativen Verfahren zur Riboflavinproduktion gehen zurück bis in die dreißiger Jahre. Das erste Verfahren beruhte auf dem Organismus Clostridium acetobutylicum. Um 1940 wurde dieses Verfahren durch Eremothecim ashbyi und 1946 durch Ashbya gossypii, bedingt durch die genetische Instabilität von Eremothecim ashbyi, abgelöst. 1965 wurde Riboflavin von drei Firmen (Commercial Solvents, Grain Processing Corporation, Premier Malt Products) fermentativ hergestellt, jedoch wurden diese Prozesse drei Jahre später wieder stillgelegt, da sie mit dem chemischen Prozess nicht konkurrieren konnten. 1974 wurde die fermentative Herstellung von Riboflavin durch die Firma Merck wieder aufgenommen, und seit diesem Zeitpunkt ist die fermentative Herstellung gegenüber der chemischen Synthese immer vorteilhafter geworden. 1990 nahm BASF die fermentative Produktion von Riboflavin mit Ashbya gossypii auf und nach 6 Jahren der parallelen Produktion (chemisch und fermentativ) wurde 1996 der chemische Prozess beendet. 2000 wurde auch bei Roche Vitamine GmbH die fermentative Herstellung von Riboflavin mit Bacillus subtilis parallel zur chemischen Synthese eingeführt. 2003 wurde die chemische Synthese eingestellt. Zurzeit werden zur fermentativen Herstellung von Riboflavin die folgenden drei Stämme verwendet: A. gossypii (BASF 2

Man sieht schon hier: starker Flattersatz, das Schriftbild ist nicht optimal. Mit der Automatischen Silbentrennung wird das viel besser!

AG, Deutschland), Candida famata (ADM, USA), Bacillus subtilis (DSM Nutritional Products GmbH, Niederlande, ehemals Roche Vitamine GmbH, Deutschland).

Auch in der HFU Furtwangen wird seit einigen Jahren versucht Riboflavin in fermentativen Verfahren mit der Hefe Candida famata herzustellen. Weil dies oft nicht solche Ausbeuten bringt wie bei einer Fermentation angegeben sind, werden wir im ersten Teil unserer Studienarbeit die Produktion von Riboflavin mit Fermentation optimieren.3

In der HFU gibt es auch seit einiger Zeit ein Leitz Ergolux AMC Inspektions- und Messmikroskop mit Evolution LC Color Camera. Leider fFehlt dazu jede Gebrauchsanleitung. Wir4 haben uns also im zweiten Teil unserer Studienarbeit mit diesem Mikroskop beschäftigt und eine Gebrauchsanleitung, sowie eine Kurzanleitung für den schnellen Gebrauch und ein Logbuch verfasst,. dDassmit in Zukunft bei allen Praktika ein Mikroskop zur Verfügung steht, um Bilder in guter Qualität zu erhalten, und damit die Vorgänge verfolgt und dokumentiert werden können.

3

Ich, wir, unsere... in einer solchen Arbeit vermeiden: die Autoren stehen im Hintergrund, es geht um die Sache! Besser: ...wird im ersten Teil der Projektarbeit versucht, die Produktion von Riboflavin mit C. famata zu optimieren. 4 Siehe Fussnote 3!

II.

Optimierung der Produktion von Riboflavin (Vitamin B2)

Hier fehlt Text!5 1.

Grundlagen Hier auch! 1.1.

Riboflavin

Riboflavin (auch Lactoflavin) ist die chemische/medizinische Bezeichnung für Vitamin B2, welches der Volksmund auch „Wachstumsvitamin“ nennt. Riboflavin ist nur sehr schlecht in Wasser löslich. Es ist ein Derivat des Heterozyklus Pteridin, genauer des Isoalloxazins. Vitamin B2 ist sehr lichtempfindlich, aber dafür kann es beim Kochen nicht zerstört werden. Aufgrund seiner gelben Farbe wird es auch als Lebensmittelfarbe E101 eingesetzt. Die Summenformel von Vitamin B2 lautet: C17H20N4O6. Die Strukturformel von Vitamin B2 ist in der folgenden Abbildung 16 dargestellt.

Abb. 1: Strukturformel von Riboflavin 5

Es darf kein Kapitel ohne Text geben! Mit dem verbindenden Text wird der Rote Faden aufgespannt, der sich durch die ganze Arbeit ziehen muss, damit sie gut lesbar ist. Die Hintereinanderreihung von Überschriften bedeutet Sprünge! Im jeweiligen Kapitel wird durch den Text die Gliederung logisch ersichtlich, d. h. im Überkapitel wird das geschrieben, was übergeordnet sachlich über den Inhalten der Unterkapitel steht. 6 Bei der ersten Nennung einer Abb. oder Tab. im Text soll dies unterstrichen werden.

Aufgaben/Funktion: Vitamin B2 kann von Menschen und Tieren nicht selbst produziert werden. Es kommt aber fast überall im Körper vor7, vermehrt in Leber, Niere und dem Herz. Es wird vorwiegend im Dünndarm resorbiert und dient als Vorstufe für Flavocoenzyme (FAD, FMN), die insbesondere in Oxidoreduktasen, z. B. im Zitronensäurezyklus, eine große Rolle spielen. FAD und FMN sind als Coenzyme sowohl für den Protein- als auch für den Energiestoffwechsel wichtig. Sie sind z. B. an der Wasserstoffübertragung und dem Elektronentransfer beteiligt. FAD und FMN beeinflussen den Stoffwechsel von Kohlenhydraten, Amino- und Fettsäuren und von anderen Vitaminen (Vitamin B6, Niacin, Folsäure). Im zentralen Nervensystem ist Vitamin B2 außerdem an der Kontrolle von Neurohormonen und Aminen beteiligt. 8 Es wird auch zur Kontrolle von Reinigunsprozessen von Flächen, Händen etc. in der Pharmaindustrie verwendet, da es auch in geringen Konzentrationen bei UV-Licht leuchtet und gut sichtbar ist.

Vorkommen: Vor allem in Milch und Milchprodukten, Eier, Fleisch- und Wurstwaren. Auch kommt es vor im Weizenkorn. In Früchten und Gemüsen (Broccoli, Spargel, Spinat, gelbes Gemüse...) kommt es im allgemeinen eher geringer vor. Auch ist Vitamin B2 aus tierischen Quellen besser bioverfügbar und resorbierfähig als aus pflanzlichen. Durch Lagerung und Verarbeitung kann es allerdings zu Verlusten kommen. Ebenso durch Einfrieren und Auftauen, da Vitamin B2 mit dem Wasser austritt.

Täglicher Bedarf: minimale Zufuhr pro Tag:

0,9 mg

weibliche Jugendliche (ab 15 J.) und weibliche Erwachsene:

1,2 mg

Schwangere, stillende Frauen:

1,5-1,6 mg

männliche Jugendliche (ab 15 J.) und männliche Erwachsene (bis 25 J.):

1,5 mg

bis 65 Jahre und älter fällt der Bedarf bis auf

1-3 mg

7

Wenn es mit der Nahrung aufgenommen wurde... Nicht aus jedem Einzelsatz einen Absatz machen. Absätze nucr, wenn echt neue Sachverhalte besprochen werden. 8

Vitamin B2 zählt zu den kritischen Nährstoffen, d.h. die tägliche Aufnahme ist häufig unzureichend.

Mangelerscheinung: Bei Mangel an Vitamin B2 kann es zu Wachstumsstörungen, Müdigkeit, Arbeitsunlust und Lichtüberempfindlichkeit kommen. Ebenso sind Juckreiz und Entzündungen von Zahnfleisch und Mundwinkel zeichen für einen Mangel. Auch die Schleimhäute werden entzündet und es kann zu neurologischen Störungen kommen. Die Augen werden trocken und müde. Es kann bis zur Blutarmut führen. Allgemein kommt es zu Rissen und Entzündungen der Haut, darum heißt die Krankheit auch Pellagra, also „rauhe Haut“. Es Sie wurde früher auch als Krankheit der armen Landbevölkerung bezeichnet.

Überdosierung: Vitamin B2 ist grundsätzlich nicht toxisch. Überdosierungen sind beim Menschen nicht bekannt, allenfalls eine gelbe Färbung des Urins, die jedoch harmlos ist.

1.2.

Produktion

Riboflavin kann auf verschiedenen Wegen hergestellt werden. In Abbildung 29 ist der chemisch-technische und der biotechnische Weg dargestellt. An der HFU Furtwangen wird der biotechnische Weg, die Fermentation, angewandt. Als Mikroorganismus wird die Hefe Debaryomyces hansenii verwendet.

9

S. o.

Abb. 2: Wege zur Riboflavinproduktion

1.3.

Fermentation

Im Praktikum Bioverfahrenstechnik im 4. Semester wird mit unterschiedlichen Fermentern, aber immer mit der Hefe Candida famata Riboflavin produziert. Es werden Vorkulturen in Schüttelkolben angesetzt mit Medium 186 (DSMZ). Diese werden dann in den Fermenter gespritzt um die Fermenterkultur im Batch-Betrieb anzuzüchten. Wenn das Medium verbraucht ist wird auf Fed-Batch mit den berechneten Parametern umgestellt. Ziel ist eine möglichst hohe Riboflavinausbeute. 1.4.

Hefe

Hefen (vom mittelhochdeutschen Wort Heffe = heben) sind eine sehr heterogene Gruppe von verschiedenen Pilztaxa. Die Gruppe Candida der Hefen besteht aus 155 Species. Sie können als Kontaminanten saprophytär auftreten oder als pathogene Species vor allem bei immunsupprimierten oder geschwächten Patienten bis zum Tode führen. Candida Species haben generell runde bis ovale vegetative Zellen, die sich durch Sprossung vermehren. Unter bestimmten Bedingungen können sich Blastosporen verlängern und Pseudomycel bilden, ebenso kann echtes Mycel vorkommen. Die perfekte Form von Candida famata wird Debaryomyces hansenii genannt. Er ist ein weit verbreiteter Kontaminant aus der Luft, der Lebensmittel verunreinigen kann.

Aus klinischem Material wird er vor allem bei Hautläsionen, Nagelinfekten, bei Darmmykosen und aus Sputum isoliert. Auf Sabouraud-Agar bildet der Pilz weiß-graue bis cremefarbene, glatte, matte Kolonien, die mit zunehmendem Alter runzlig werden. In den Abbildungen 3 und 4 sind die Hefen Candida famata und die perfekte Form Debaryomyces hansenii dargestellt.

Abb. 3: Candida famata

1.5.

Abb. 4: Debaryomyces hansenii

Riboflavin-Biosynthese

Bei der Riboflavinproduktion laufen viele Reaktionsschritte ab. Diese und die zugehörigen Enzyme sind in Abbildung 5 dargestellt.

Abb. 5:

R

1.6.

Produktionsverstärker Glycin

Als Produktionsverstärker haben wir die α-Aminosäure Glycin verwendet. Glycin ist ein weißer Feststoff. Sie ist der kleinste und einfachste Vertreter der Proteinogenen

und α-Aminosäuren. Sie ist nicht chiral, also optisch nicht aktiv. Ihre Summenformel lautet C2H5NO2. Ihre Strukturformel ist in Abbildung 6 dargestellt.

Abb. 6: Strukturformel von Glycin

Glycin wird in der Riboflavin-Synthese gebraucht. In Abbildung 7 ist dargestellt wie Glycin in die Synthese miteinbezogen wird. Wenn man nun diese Vorstufe für die Riboflavin-Synthese bereits mit ins Fermentationsmedium gibt sollte die Synthese beschleunigt werden und eine höhere Ausbeute möglich sein.

Abb. 7:

1.7.

Temperatur

Im Praktikum Bioverfahrenstechnik wurde bis jetzt immer bei einer Temperatur von 30°C fermentiert. DSMZ schlägt aber für die Hefe Debaryomyces hansenii ein Optimum von 25°C vor.

2.

Aufgabenstellung

Die Fermentation zur Riboflavinproduktion (Vitamin B2) mit Candida famata war bisher im Praktikum Bioverfahrenstechnik selten erfolgreich. Wie als Beispiel in Abbildung 8 zu sehen ist, konnte sehr oft keine größere Menge an Riboflavin produziert werden. Der Wert sollte nach der Batchphase bereits deutlich höher liegen. Riboflavinproduktion SS 05 12 10

Fed-Batch

c [mg/l]

8 6 4 2 0 0

5

10

15

20

25

Zeit [h]

Abb. 8: Riboflavinproduktion im BVT-Praktikum SS 05

Aus diesem Grund wurden Schüttelkolbenversuche mit Batchmedium angesetzt, um durch Variation der Parameter Hefe (Debaryomyces hansenii von 2006, 2004 und älter als 2004), Temperatur (25°C und 30°C) und Produktionsverstärker (mit und ohne) die Riboflavinproduktion schon während der Batch-Fermentation zu verbessern.

3.

Material und Methoden

3.1.

Hefe

Candida famata, älter als 2004, eingefroren bei -80°C Debaryomyces hansenii, von 2004 Debaryomyces hansenii, neu bestellt 2006

3.2.

Medien

3.2.1. KPi-Puffer 2,76 g KH2PO4 200 ml VE-Wasser pH 7

Das Kaliumdihydrogenphosphat wurde abgewogen und in VE-Wasser gelöst.

3.2.2. Medium 186 für Debaryomyces hansenii (DSM 70590) 3,0 g/l

Hefeextrakt

3,0 g/l

Malzextrakt

5,0 g/l

Pepton (aus Sojabohnen)

10,0 g/l

Glucose

15,0 g/l

Agar

bis 1000 ml VE-Wasser

Herstellung: -

Bestandteile abwiegen und in VE-Wasser lösen

-

Suspension aufkochen bis Agar gelöst ist

-

Autoklavieren für 20 min bei 120 °C und 1 bar

-

das erhitzte Medium steril in entsprechend viele Petrischalen füllen

3.2.3. Spurensalzlösung

11 g/l

Zinksulfat-7-hydrat

ZnSO4 * 7 H2O

6 g/l

Mangansulfat-1-hydrat

MnSO4 * H2O

0,3 g/l

Kobaltsulfat-1-hydrat

CoSO4 * H2O

0,04 g/l

Kupfersulfat-5-hydrat

CuSO4 * 5 H2O

0,06 g/l

Borsäure

H3BO3

0,01 g/l

Kaliumjodit

KJ

bis 1000 ml VE-Wasser Diese Lösung liegt bereits steril und fertig eingefroren vor.

3.2.4. Vitaminlösung 0,06 mg/ml Biotin 0,6 mg/ml

Nicotinsäure

0,4 mg/ml

Thiamindichlorid

0,3 mg/ml

4-Aminobenzoesäure

0,4 mg/ml

Pantothensäure

1,5 mg/ml

Pyridoxal-HCl

0,06 mg/ml Vitamin B12 bis 1 ml

VE-Wasser

Diese Lösung liegt bereits steril und fertig eingefroren vor.

3.2.5. Batch-Medium für Schüttelkolbenversuche Grundmedium: 0,6 g/l

Natriumnitrat

NaNO3

1,8 g/l

Ammoniumsulfat

(NH4)SO4

2 g/l

Kalium-di-hydrogenphosphat

KH2PO4

4 g/l

di-Kaliumhydrogenphosphat

K2HPO4

2 g/l

di-Natriumhydrogenphosphat

Na2HPO4 * 2 H2O

0,2 g/l

Kaliumchlorid

KCl

887 ml

VE-Wasser

pH 6,0 einstellen

4,0 ml

Magnesiumsulfat-Lösung (5 %ig) MgSO4-Lsg.

66,7 ml

Glucose-Lösung (30 %ig)

Alles für 20 min bei 120 °C und 1 bar autoklavieren.

2,0 ml

Spurensalze (s.o.)

2,0 ml

Vitamine (s.o.)

Alle Lösungen steril in das Grundmedium geben. bis 1000 ml

3.3.

VE-Wasser

Messverfahren

3.3.1. Glucosegehalt Der Glucosegehalt wird mit dem Blutzuckermessgerät Accutrend Alpha von Roche durchgeführt. Bei der Anzeige „Hi“ muss die Probe verdünnt werden, bei der Anzeige „Lo“ ist zu wenig Glucose in der Probe enthalten. Durchführung: -

Gerät einschalten

-

Teststreifen einführen

-

Anzeige auf dem Display abwarten

-

20 µl Probe (handwarm) auf das gelbe Testfeld ( auf den roten blinkenden Punkt) geben

-

Wert in mg/dl ablesen

3.3.2. Optische Dichte (OD) Die Optische Dichte ist definiert als die Abschwächung eines Lichtstrahls aufgrund der Streuwirkung einer Mikroorganismenkultur. Es werden die Extinktionen der Kultursuspension bei 546 nm gegen eine abzentrifugierte Probe vermessen, so dass bei der Auswertung eine Eigenfärbung vernachlässigt werden kann. Für Extinktionen >0,5 werden die Proben mit Kpi-Puffer verdünnt.

Durchführung: -

Probe gut schütteln

-

Probe falls nötig verdünnen

-

mit dem Rührspatel Probe verrühren

-

Extinktion bei 546 nm ablesen

3.3.3. Hefetrockensubstanz (HTS) Bei diesem Verfahren werden 10 ml der Zellsuspension auf einen Filter (Zellulosefilter, 0,45 µm Poren) aufgebracht, der sich auf einer Absaugapparatur befindet. Mit Hilfe einer daran angeschlossenen Wasserstrahlpumpe wird die Probe an den Filter gesaugt und dadurch „fixiert“. Anschließend muss mit der doppelten Menge VE-Wasser nachgespült werden, um unerwünschte Bestandteile aus der Probe zu filtern (z.B. Nährstoffe). Die Probe kann komplett mit dem Filter im IRTrockner bei 105°C getrocknet und anschließend gewogen werden. Durch die Hochrechnung kann der HTS-Gehalt der Kultur ermittelt werden.

3.3.4. Riboflavingehalt

Für die photometrische Messung der Riboflavinkonzentration wird zunächst eine Kalibriergerade erstellt. Dazu wird aus der Stammlösung (25 mg/l) durch Verdünnung mit KPi-Puffer eine Verdünnungsreihe im Bereich von 0-20 mg/l mit 6 verschiedenen Konzentrationen hergestellt.

Bei der Probenvermessung wird die Probe zunächst abzentrifugiert (5000 rpm, 20 min) und bei 450 nm gegen Wasser vermessen. In Tabelle 1 und Abbildung 9 sind die Werte und die Kalibriergerade für Riboflavin dargestellt.

Tabelle 1: Werte für Kalibriergerade

Abb. 9: Kalibriergerade Riboflavin

4.

Durchführung

Es werden 17 250ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen jeweils mit 250ml BatchMedium gefüllt. Jeweils zwei Kolben mit: -

Hefe 06, ohne PV

-

Hefe 06, mit PV

-

Hefe 04, ohne PV

-

Hefe 04 mit PV

-

Hefe