SIR MYCOPLASMA 10 TESTI

62781

ANTIBIOGRAMM UROGENITAALSELE MÜKOPLASMALE

1- KLIINILINE KASUTAMINE SIR MYCOPLASMA on reagent urogenitaalse mükoplasma – Ureaplasma spp (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum) ja Mycoplasma hominis (Mh) antibiogrammanalüüsiks. Praegusel ajal on Ureaplasma urealyticumi ja U. parvumi eraldi määramist raske läbi viia. SIR MYCOPLASMA komplekt sisaldab mikroplaati 8 antibiootikumiga, mis on aktiivsed nende mikroorganismide suhtes ja mida tavaliselt kasutatakse genitaalinfektsioonide raviks. Resistentsete tüvede tekkimine eriti tsükliinide ja makroliididega (esimese põlvkonna raviantibiootikumid) (10, 11, 18), tingib antibiogrammi analüüsi absoluutse vajalikkuse selleks, et vältida ravivigu. Standardvaktsiini kasutamine muudab selle tehnika väga hästi kooskõlas olevaks kirjeldatud meetodiga (9). 2- PÕHIMÕTE SIR MYCOPLASMA on vedela keskkonna antibiogramm, milles on iga antibiootikumi kahes erinevas kontsentratsioonis (doksütsükliin, tetratsükliin, asitromütsiin, josamütsiin, erütromütsiin, ofloksatsiin) või ühes kontsentratsioonis (klindamütsiin, pristinamütsiin). Testi aluseks on metaboolne inhibitsioon. Mükoplasma kasvu mõõdetakse objektiivselt nende metaboolse aktiivsusega: karbamiidi hüdrolüüs U9 Ureaplasma spp puljongis ja arginiini hüdrolüüs arginiini Mh puljongis, kusjuures vabaneb ammoniaak, mis muudab keskkonna aluseliseks ja pH indikaator fenoolpunane värvub selles keskkonnas kollasest punaseks. Kui mikroorganism on tundlik testitud antibiootikumi suhtes, siis tema metabolism on pärsitud ja lahus jääb kollaseks. Kui mikroorganism on resistentne, suudab see kasvada ja lahus värvub punaseks. 3- KOMPLEKT SIR MYCOPLASMA sisaldab: • 10 SIR mikroplaati (16 pesa skeem on toodud sildil, võimaldades seega proovi identifitseerimist). • 10 kleepkilet. • 1 paki sisuleht. Iga mikroplaat on eraldi pakitud alumiiniumfooliumisse koos kattekile ja kuivatusaine kotikesega. 4- SÄILITAMINE Kui hoida temperatuuril + 2 – 8°C, võib SIR MYCOPLASMA–t kasutada kuni pakile trükitud kehtivusaja lõpuni. 5• • • • • • •

VAJALIKUD VAHENDID (EI KUULU KOMPLEKTI) U9 puljong: kood 62762 (pakis 10 ampulli lüofiliseeritud U9 puljongit Q.S.P., 2 ml) Arginiini puljong: kood 62763 (pakis 10 ampulli lüofiliseeritud arginiini puljongit Q.S.P., 2 ml) MYCOPLASMA DUO (karp 20 testiga – kood 62740) Steriilne destilleeritud vesi 2 ml; 0,2 ml; 0,1 ml; 0,02 ml pipetid Inkubaator, 37°C Saastunud jäätmete mahuti.

6- TÖÖ KÄIK A) SIR MIKROPLAAT SIR mikroplaat on mikroriba, milles on kaks rida pesi, kummaski 8 tükki, mis on kaetud erinevate antibiootikumidega. Antibiootikumid rehüdratiseeritakse, kui vaktsiin jaotatakse pesadesse saavutamaks kontsentratsioone, mis on lähedased kriitilistele kontsentratsioonidele, võimaldades seega analüüsida testitud tüvede tundlikkusprofiili ja klassifitseerida need tundlikuks, vahepealseks või resistentseks iga antibiootikumi suhtes.

Kasvukontroll antibiootikumi puudumisel Doksütsükliin (4 mg/l ja 8 mg/l) Tetratsükliin (4 mg/l ja 8 mg/l) Asitromütsiin (2 mg/l ja 4 mg/l) Josamütsiin (2 mg/l ja 8 mg/l) Erütromütsiin (1 mg/l ja 4 mg/l) Klindamütsiin (2 mg/l) Pristinamütsiin (2 mg/l) Ofloksatsiin (1 mg/l ja 4 mg/l) B) ANTIBIOOTIKUMIDE VALIK Testitavate antibiootikumide valik tehti ravi ettekirjutuste alusel neonataalse ja genitaalse mükoplasma infektsioonide puhul (17). Senini ei teata ühtegi mükoplasmale spetsiifilist kriitilist kontsentratsiooni; selle tulemusena SIR MYCOPLASMA mikroanalüüsis valitud kriitilised kontsentratsioonid baseeruvad neil andmetel, mis on avaldatud paljudes teaduslikes ajakirjades ja/või soovitatud meditsiiniühingute poolt, nagu CA–SFM (Antibiogrammi Komitee – Prantsuse Mikrobioloogia Ühing). Valitud asitromütsiini kontsentratsioonide aluseks on hindamine, mis viidi läbi kliinilisi tüvesid kasutades (19). Testitud tsükliinid: tetratsükliin ja doksütsükliin (kontsentratsiooniga 4 ja 8 mg/l). Mh ja Ureaplasma spp. tüved, mida kirjeldatakse resistentsetena tetratsükliinide suhtes, määratakse üheselt, kuna kirjanduses on avaldatud, et minimaalsed inhibiidsed kontsentratsioonid (MIC) on ≥ 8 mg/l vastupidiselt ≤ 2 mg/l tundlike tüvede puhul (15, 18). Selle klassi antibiootikumide puhul on tegemist madala taseme resistentsusega, mis nõuab inkubatsiooniaega 48 tundi (19). Tüvede resistentsuse sagedus tsükliinide suhtes varieerub vastavalt riigile ja antibiootikumide kättesaadavuse tasemele (18). Testitud makroliidid: erütromütsiin (kontsentratsioonidel 1 ja 4 mg/l), asitromütsiin (kontsentratsioonidel 2 ja 4 mg/l), josamütsiin (kontsentratsioonidel 2 ja 8 mg/l). Mh tüved on selgelt resistentsed erütromütsiini ja asitromütsiini suhtes. Josamütsiin jääb aktiivseks. Järelikult nende antibiootikumidega saadud tulemused peaksid kinnitama eelnevalt saadud tüve tuvastamist. Nõutavat resistentsuse sagedust kliinikus isoleritud makroliidide suhtes Mh ja Ureaplasma spp tüvede seas ei teata, aga tõenäoliselt on see väga madal (18). Testitud linkosamiid: klindamütsiin (kontsentratsioonil 2 mg/l). Ureaplasma spp tüved on selgelt resistentsed selle antibiootikumi suhtes (18). Testitud streptogramiin: pristinamütsiin (kontsentratsioonil 2 mg/l). Mükoplasma tüved on väga tundlikud selle antibiootikumi suhtes. Testitud fluorokinoloon: ofloksatsiin (kontsentratsioonidel 1 ja 4 mg/l). See molekul on aktiivne Mh ja Ureaplasma spp suhtes. Resistentsuse sagedust ei teata kuigi hästi, aga on kindlaks tehtud, et see on Ureaplasma spp. puhul vähem kui 1% (6, 18). C) ANTIBIOGRAMMI TEGEMINE Antibiogrammi saab teha, alustades MYCOPLASMA DUO (kood 62740) pesa X sisust. Bioloogilise proovi hoidmise aja ja temperatuuri kohta palun vaadake momendil kasutatavaid soovitusi (13). 1) Vaktsiini standardiseerimine 3 5 Selleks et külvata antibiogrammi vaktsiini sisaldusega 10 –10 CCU/ml (CCU = Colo ur Changing Units – värvi muutvad ühikud), on vaja läbi viia prooviga lahuse eelkultiveerimine. Eelkultiveerimine (viiakse läbi juhendi järgi, mida kirjeldatakse allpool) viib mükoplasma kasvule maksimimtiitrini 106 kuni 7 10 CCU/ml. Sellise eelkultuuri lahjendus 1/100 U9 või arginiini puljongis olenevalt isoleeritud liigist, annab standardvaktsiini. • MYCOPLASMA DUO KASUTAMINE Kui antibiogramm tehakse MYCOPLASMA DUO–d kasutades, siis pesa X sisu Mh puhul 24– või 48–tunnise inkubatsiooni korral ja Ureaplasma spp. puhul 24–tunnise inkubatsioonil korral vastab eelkultiveerimisele; selle järel tuleb pesa sisu lahjendada U9 või arginiini puljongis pärast allpool kirjeldatud töö käiku, mis on selleks, et saavutada standardvaktsiin.

1. Mycoplasma hominis puhul Alustades pesast X (24– või 48– tunnise inkubatsiooni puhul), valmistage 1/100 arginiini puljongi lahjendus (0,02 ml pesa X sisu 2 ml arginiini puljongis). 2. Ureaplasma spp puhul • 24–tunnise inkubatsiooni puhul: valmistage 1/100 pesa X sisu lahjendus U9 puljongis (0,02 ml pesa X sisu 2ml U9 puljongis). • 48–tunnise inkubatsiooni puhul: sel juhul on võimalik kasutada pesa X sisu, sest on oht, et Ureaplasma võib olla autolüüsunud. Tehke lahjendus 1/10 lahjendus transportsuspensiooni lahusest, mida hoitakse + 4°C juures (0,2 ml 2 ml U9 puljongis). • ALUSTAMINE MÜKOPLASMAGA RIKASTATUD KULTUURI PULJONGIST Urogenitaali proovi saab paigutada mükoplasma jaoks spetsiifilisse kultuuri lahusesse (15). Kui oodatakse identifitseerimist ja loendamist, võib antibiogrammi läbi viia hiljem ja hoida lahust +4°C juures (võrdluseks, kasutatakse toodet asetatuna kultuuri lahusesse). Seejärel soovitatakse kultuuri lahuse inkubatsiooni 37 °C juures 16 tundi selleks, et 6 7 saada mükoplasmaga rikastatud vaktsiin. Tavaline saadud tiiter on 10 –10 CCU/ml. Vastavalt kirjanduses avaldatud soovitustele (15) eeldab antibiogrammi tegemine standardvaktsiini kasutamist. Seega 0,02 ml rikastatud kultuuri lahust lahjendatakse 2 ml U9 või arginiini puljongis (1/100 lahjendus) olenevalt mükoplasma tüve identifitseerimisest. 2) Standardvaktsiini doseerimine Doseerige 0,1 ml standardvaktsiini (eelkultuuri 1/100 lahjendus U9 või arginiini puljongis) igasse SIR mikroplaadi pessa. Katke mikroplaat kleepkilega ja inkubeerige 37°C juures 48 tundi.

Pärast 24-või 48-tunnist inkubeerimist

Pärast ainult 24-tunnist inkubeerimist

MYCOPLASMA DUO pesa Χ

U9

arginiini

või

või MÜKOPLASMAGA RIKASTATUD KULTUURI LAHUS

antibiogramm

U9

arginiini

100 μl pesa kohta

TRANSPORT SUSPENŚIOONI LAHUS Hoitakse +4°C juures

100 μl pesa kohta

antibiogramm

antibiogramm

U9

arginiini

100 μl pesa kohta

antibiogramm

antibiogramm

antibiogramm

D) PROOVID, MIS SISALDAVAD Ureaplasma spp ja Mh Sel juhul doseerige 2 SIR mikroplaati: ühele U9 puljongi lahjendamisel saadud standardvaktsiin (Ureaplasma spp tüve antibiogramm), ja teisele arginiini puljongi lahjendamisel saadud standardvaktsiin (Mh tüve antibiogramm). 7- TULEMUSTE TÕLGENDAMINE Antibiogrammi saab lugeda niipea kui kasvukontrolli pesad on värvunud kollasest punaseks. Loetakse esimest korda 24 tunni ja teist korda 48 tunni möödudes. 48 tunni lugem võimaldab tuvastada madala taseme resistenstsust tsükliinide suhtes (19) ja kinnitada tulemusi, kui algusvaktsiin osutub madalaks (10 3 CCU/ml) või kui värvi muutus on küsitav 24 tunni pärast. 2 kollast pesa:

Kasvu puudumine Tundlik tüvi

2 punast pesa:

Kasv antibiootikumi juuresolekul Resistentne tüvi

Pesa väikese antibiootikumi kontsentratsiooniga: punane. Pesa suure antibiootikumi kontsentratsiooniga: kollane.

Vahepealne tüvi

Klindamütsiini ja pristinamütsiini (üks kontsentratsioon) jaoks on võimalikud vaid 2 tulemust: tundlik või resistentne. Näide:

kollane / kollane: S Tundlik tüvi punane / kollane: I Vahepealne tüvi punane / punane: R Resistentne tüvi

Erijuhtum: kui täheldatakse oranži värvust. Võib jälgida värvuse muutuse algust kollasest punaseks, mis lõpeb oranži värvusega väikese kontsentratsiooniga pesades.. Seda peab tõlgendama positiivsena ja selge värvuse muutus saavutatakse 48 tunni pärast. 8-

TOOTJA KVALITEEDIKONTROLL

Kõik Bio–Rad Company poolt valmistatud ja turustatud tooted alluvad kvaliteedi tagamise süsteemi kontrollile tooraine vastuvõtmisest kuni lõpp–produktide turustamiseni. Iga lõpp–produkti partii on kvaliteedikontrolli objekt ja seda turustatakse alles siis, kui see vastab kehtestatud nõuetele. Toodangu ja iga partii kontrollimise dokumentatsiooni hoitakse esitamiseks. 9– KVALITEEDI SISEKONTROLL Kvaliteedikontrolli saab läbi viia, kasutades tüve lüofiliseeritud kollektsioonist (Ureaplasma parvum ATCC 700970). Lahustage lüofiliseeritud tüvi 1 ml värskelt lahjendatud U9 lahuses (viide 62762). Tehke 1/10 lahjendus värskelt valmistatud U9 lahusega. Inkubeerige doseeritud U9 lahust 37°C juures 18 tundi aeroobses keskkonnas. Alustades selle Ureaplasmaga rikastatud U9 lahusest, valmistage 1/100 lahjendus (võtke 0,02 ml lahust ja lisage 2 ml of lahjendatud U9 puljongit). SIR MYCOPLASMA mikroanalüüs viiakse läbi vastavalt tavalisele eeskirjale, st doseerides 0,1 ml igasse pessa. Katke mikroplaat kleepkilega ja inkubeerige 37°C juures 48 tundi. Mikroanalüüsi saab loendada, kui kasvukontrolli pesad on värvunud kollasest punaseks.

Kasvu– kontroll

Kasvu– kontroll

Oodatud jaotus on selline:

+

+

DO 4– 8 mg/l

TE 4– 8 mg/l

JM 2– 8 mg/l

AZM 2– 4 mg/l

E 1– 4 mg/l

CM 2 mg/l

PT 2 mg/l

OFX 1– 4 mg/l

S

S

S

S

S/I

R

S

S/I

10– TULEMUSTE ANALÜÜS Testitud antibiootikumide valik SIR MYCOPLASMA–t kasutades on arenenud vastavalt ravimeetoditele, SIR MYCOPLASMA antibiogramm on umber hinnatud täiustatud ravimeetodite valguses. Kahe allpool kirjeldatud hindamise puhul kasutati meetodina minimaalset inhibeerivat kontsentratsiooni vedelas keskkonnas (MIC) (6, 15). Esimene hindamine (ilma asitromütsiini pesadeta) teostati 80 tüvel, kaasa arvatud 60 Ureaplasma spp tüve ja 20 Mycoplasma hominis tüve (9). Ureaplasma spp tüvedel: Tetratsükliinidel varieerusid kokkulangevuse protsendid vahemikus 90 % [79,5–96,2 %] a kuni 95 % [86,1–99 %] a olenevalt antibiootikumist. Makroliididel varieerusid kokkulangevuse protsendid 92 % [81,6–97,3 %] a kuni 100 % [95,1–100 %] a olenevalt antibiootikumist. Klindamütsiinil oli kokkulangevuse protsent 85 % [73,4–92,9 %] a. Pristinamütsiinil oli kokkulangevuse protsent 100 % [95,1–100 %] a. a Fluorokinoloonil oli kokkulangevuse protsent 93 % [83,8–98,2 %] . Mycoplasma hominis tüvedel: a a Kokkulangevuse protsent on 85 % [62,1–96,8 %] tetratsükliinil ja 100 % [86,1–100 %] kõigil teistel antibiootikumidel. Kõigi eelnevalt mainitud antibiootikumide kokkulangevus on 94,6 % [92,4–96,4 %] a koos 2.6 % suurte erinevustega. Ükski tüvi polnud tundlik SIR MYCOPLASMA mikroanalüüsil, kui see oli resistentne hindamismeetodiga (mitte eriti suur erinevus). Teine hindamine viidi läbi pärast minotsükliini asendamist asitromütsiiniga kontsentratsioonidel 2 ja 4 µg/ml. Võrdlev uurimus teostati vedelas keskkonnas MIC–i määramise meetodi ja SIR MYCOPLASMA mikroanalüüsi asithromütsiini pesade vahel. Testitud tüved on etalontüved ja metsikut tüüpi kliinilised tüved. Iga vaktsiin standardiseeriti ja kinnitati olevat vastuvõetavates ja soovitatud piirides, st 10 4 ja 10 5 CCU/ml (15). Nende kahe meetodi tulemusi tõlgendati kui tundlik (S), vahepealne (I) või resistentne (R) erinevate mikroanalüüsi kontsentratsioonide puhul. 15 mükoplasma etalontüve (13 ATCC Ureaplasma spp tüve ja 2 ATCC Mycoplasma hominis tüve) jaoks oli kokkulangevuse protsent S vüi R kliinilise klassifikatsiooni järgi 100 % [81,9–100 %] a. Kõigil Ureaplasma spp tüvedel oli tundlik profiil ja neil kahel Mycoplasma hominis tüvel oli resistentne profiil, mis vastab selle liigi tegelikule reisistentsusele. 15 kliiniliselt isoleeritud Ureaplasma spp tüvel oli kokkulangevus 100 % [81,9–100 %] mikroanalüüsiga võimaldatud kliinilise klassifikatsioni ja saadud etalon–MIC vahel. a:

[CI 95%] = 95% usaldusvahemik.

a

SIR MYCOPLASMA

11– TESTI PIIRANGUD Kui lahus värvub punaseks ja muutub häguseks, viitab see teiste bakterite kasvule nagu mükoplasma (viimase kasv ei muuda lahuse läbipaistvust). Seda nähtust saab jälgida arginiini ja U9 kultuuri puljongis, kui neid on inkubeeritud 37 °C juures. Teiste bakterite olemasolu võib tõestada šokolaadiagaril. Viimast tulemuste tõlgendamist, nagu igasugust bioloogiliste tulemuste tõlgendamist, ei saa teha ühe testi alusel ja see peab omakorda toetuma kliinilistele andmetele ning biokeemilistele, tsütoloogilistele ja immunoloogilistele tulemustele. Kui SIR MYCOPLASMA mikroanalüüsiks kasutatud vaktsiini kontsentratsioon on väike (