약학회지 제 52 권 제 1 호 67~72 (2008) Yakhak Hoeji Vol. 52, No. 1

Doxorubicin

매개 세포독성에 대한 Nrf2 경로의 역할 조정민·박현민·곽미경# 영남대학교 약학대학

(Received December 21, 2007; Revised February 11, 2008)

Sensitization to Doxorubicin by Inhibition of the Nrf2-Antioxidant System #

Jeong-Min Cho, Hyun-Min Park and Mi-Kyoung Kwak

College of Pharmacy, Yeungnam University, 214-1 Dae-dong, Gyeongsan-si, Gyeongsangbuk-do 712-749, Korea

Abstract — The use of doxorubicin, which is one of the most effective anticancer agents, is often limited by occurrence

of acquired resistance in tumor cells. GSH has been shown to be involved in the development of this drug resistance. Transcription factor Nrf2 governs the expression of GSH synthesizing glutamylcysteine ligase (GCL), as well as multiple phase 2 detoxifying enzymes. Here we show that Nrf2 is one of factors determining doxorubicin sensitivity. Nrf2-deficient fibroblasts (murine embryonic fibroblasts, MEF) were more susceptible to doxorubicin-mediated cell death than wild-type cells. Doxorubicin treatment elevated levels of Nrf2-regulated genes including NAD(P)H: quinone oxidoreductase (Nqo1) and GCL in wild-type fibroblasts, while no induction was observed in nrf2-deficient cells. Doxorubicin resistance in human ovarian SK-OV cells was reversed by treatment with L-buthionine-sulfoxamine (BSO), which is depleting intracellular GSH. Finally, transfection of SK-OV cells with Nrf2 siRNA resulted in exacerbated cytotoxicity following doxorubicin treatment compared to scrambled RNA control. These results indicate that the Nrf2 pathway, which plays a protective role in normal cells, can be a potential target to control cancer cell resistance to anticancer agents.

Keywords □ chemoresistance, Nrf2, doxorubicin, siRNA

항암약물 요법에 있어 약물내성의 발달은 풀어야 할 문제로 남 아 있다. 특히 항암제 중 많은 부분을 차지하는 알킬화성 항암제 등과 같은 산화적 스트레스 유발 관련 물질들의 경우 암세포에 서 내성유발은 약물의 사용을 제한하는 주된 요인이다. 이들 약 물내성의 분자적 기전으로서 제시되는 것은 약물의 세포내 수송 억제, DNA 수복 활성의 증가, 약물의 해독화 관련 단백질의 증 가 및 세포내 약물의 세포 외 배출증가 등이 있다. 이들 중 특 히 glutathione(GSH) 등 thiol기 함유 분자의 증가 또는 일군의 해독화 효소의 증가는 산화적 스트레스를 경유하여 암세포를 죽 이는 기전을 공유하는 항암제들의 해독을 촉진함으로써 약물에 대한 반응성을 감소시키는 결과를 낳는다. 특히 난소암의 경 우 doxorubicin은 cisplatin 등 백금함유 항암제 및 알킬화성 항 암제와 흔히 병용되어 사용되나, 빈발하는 약물내성은 이들 항

암제의 적용에 있어 가장 큰 장해로 작용한다. Doxorubicin과 cisplatin에 대한 세포 반응성은 세포 내 GSH 총량과 반비례하 는 현상이 보고되고 있다. Erythroid NF-E2 계열의 bZIP 전사인자인 Nrf2는 small Maf 및 다른 bZIP 단백질과 이중결합체 상태로 다양한 해독화 효소 및 thiol 단백질들의 조절에 관여한다. Nrf2가 동물에서 항산화 단백질 발현에 결정적인 인자라는 사실은 nrf2 유전자가 소실된 마우스를 이용한 일련의 연구를 통해 증명되고 있다. 즉 nrf2 넉 아웃 마우스는 해독화 효소(glutathione S-transferase, NAD(P)H: quinone oxidoreductase)를 포함한 다양한 항산화 효소, thiol 단 백질군(thioredoxin, peroxiredoxin), GSH 합성 및 유지 관련 효 소(GCL) 및 catalase 등의 유도 발현능을 소실하거나 낮은 반응 성을 보인다는 사실이 증명되고 있다. Nrf2에 결합하여 핵내 로의 이동을 막고 동시에 proteasome 시스템에 의한 분해를 촉 진함으로써 Nrf2의 억제 단백질로 기능을 하는 Keap1은 Nrf2 전사인자의 기능 조절하는 억제 단백질이다. 즉 Keap1 유전자가 소실된 마우스는 정상보다 많은 Nrf2 단백질을 축적하고 있으며 3,4)

1,2)

3,4)

5,6)

본 논문에 관한 문의는 저자에게로

#

(전화) 053-810-2823 (팩스) 053-810-4654 (E-mail) [email protected]

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조정민·박현민·곽미경

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그에 따라 Nrf2 타겟의 항산화 단백질들의 발현 수준이 정상 마 우스보다 현저히 많다는 사실이 밝혀져 있다. 현재 Nrf2는 항 산화 시스템의 유지 및 스트레스 상황에서의 증가를 주도함으로 써 정상세포에서는 환경성 위해 물질의 해독 기능을 담당하고 산 화적 스트레스 상황에서 세포보호에 있어 주된 기능을 담당하는 것으로 받아들여지고 있다. 그러나 암세포에서 Nrf2 증가 현 상은 하위 해독화 시스템의 증가를 이끌고 항암제 내성을 유발 하는 인자로 작용할 가능성이 제기되고 있다. 특히 최근 사람의 폐암조직 및 세포주를 대상으로 행한 연구결과 이들 세포에서 Keap1 유전자의 체세포 돌연변이가 높은 빈도로 발견되었으며 이들 돌연변이는 Keap1 단백질의 Nrf2에 대한 억제적 기능 소 실로 이어질 수 있다는 사실이 보고된 바 있다. 즉 이러한 보고는 암세포가 보여주는 항암제에 대한 노출을 포함하는 주변 스트레스 환경에 대한 생존능이 Nrf2 시스템의 증가현상과 관련 이 있음을 시사하고 있다. 따라서 암세포에서 Nrf2의 기능적인 억제가 암세포의 항암제 내성을 감소시킬 수 있는 새로운 방법 이 될 수 있음이 기대된다. 본 연구에서는 항암제 내성과 Nrf2 시스템과의 관계를 증명하기 위하여 Nrf2의 유전적 또는 기능적 억제가 항암제에 대한 세포 반응을 어떻게 변화시키는지 살펴 보 았다. 이를 위하여 anthracycline 계열의 항암제인 doxorubicin에 대한 세포생존을 정상 및 Nrf2 넉아웃 마우스에서 유래한 fibroblast 및 사람의 난소암 세포주에서 각각 살펴보았다. Doxorubicin 에 대한 세포생존은GSH 소실상태 및 Nrf2 기능 억제 시 감소 하였으며 이는 doxorubicin 처치에 따른 해독화 시스템의 증가 에서 기인할 가능성이 있다. Doxorubicin 처치로 정상 MEF에서 는 GSH 생성 효소와 Nqo1의 발현증가 현상이 관찰되었으나 Nrf2 넉아웃 MEF에서는 이러한 해독화 효소 증가현상의 결핍 과 함께 doxorubicin에 대한 낮은 생존률이 관찰되었다. 또한 doxorubicin에 대해 높은 저항성을 보이는 난소암 세포주인 SKOV-3 세포에 Nrf2 siRNA의 도입은 doxorubicin에 대한 감수성 을 증가시켰다. 이러한 결과는 Nrf2의 선택적인 억제가 항암제 투여에 대해 감수성을 증가시키기 위한 새로운 방법으로 제시하 고 있다. 7,8)

6,9,10)

11,12)

재료 및 방법 시약

Doxorubicin, L-buthionine-[S,R]-sulfoximine(BSO)를 Sigma 사에서 구입을 하였으며, Ambion 사를 통해 Nrf2 siRNA와 negative control siRNA를 구입하였다.

세포배양 Nrf2 유전자가 소실된 마우스 태아에서 유래한 fibroblast (MEF: murine embryonic fibroblast) 세포와 정상 세포를 10%

fetal bovine serum, 4 mM L-glutamine, HEPES 그리고1% penicillin/streptomycin 조성을 가진IMDM 배지를 Hyclone사에 서 구입해 T-flask에서 배양하였다. SK-OV-3 난소암 세포주는 한국 세포주 은행에서 분양 받아 L-glutamine, HEPES, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin 조성을 가진 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 이들 각 세포에 doxorubicin 과 BSO를 처치하고 세포생존 및 유전자 발현수준을 비교하였다. 13)

세포 생존율 측정(MTT assay) MEF와 SK-OV 세포를 5×10 cells/well 의 농도로 96well plate에서 24시간 동안 배양하였다. Doxorubicin을 24시간 동안 처리한 뒤 70 µl의 MTT 용액(2 mg/ml)을 각각의 well에 가하고 4시간 동안 배양했다. MTT 용액을 제거한 뒤, 100 µl의 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 가하고 Versamax microplate reader(Sunnyvale, CA, U.S.A.)를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정 하였다. 3

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RNA 추출 및 RT-PCR 분석

Doxorubicin(0.5, 1.0 µM)을 24시간 동안 반응시킨 후 Trizol (Invitrogen) 용액을 이용해 RNA를 추출하였다. cDNA를 합성하 기 위해서 100 ng/20 µl 농도의 RNA를 사용하였으며 생성된 cDNA를 이용하여 PCR분석을 수행하였다. PCR은 30s-95 C, 30s-56 C and 40s-72 C에서 27~30 cycles의 조건으로 이루어졌 다. 다음과 같은 primer들을 Integrated DNA Technology사 (Coralville, Iowa)와 Bioneer사(Daejeon, South Korea)를 통해 합성하여 사용하였다. Catalytic subunit of mouse GCL(GCLC), 5'-ATGATGCCAACGAGTCTGAC-3', 5'-CGCCTTTGCAGATGTCTTTC-3'; modifier subunit of mouse GCL(GCLM), 5'AGGAGCTTCGGGACTGTATT-3', 5'-TGGGCTTCAATGTCAGGGAT-3'; mouse glutathione reductase(GR), 5'-GGCATGATAAGGTACTGAGA-3', 5'-TTCGTCTACTAGGATGTGGC3'; mouse Nqo1, 5'-ATCCTTCCGAGTCATCTCTA-3', 5'CAACGAATCTTGAATGGAGG-3'; mouse beta-actin, 5'-GCAGAAGGAGATTACTGCTC-3', 5'-CTAGAAGCACTTGCGGTGCA-3'; human Nqo1, 5'-GATATTGTGGCTGAACAA-3', 5'TGCTATATGTCAGTTGAG-3'; human GCLC, 5'-AGACATTGATTGTCGCTG-3', 5'-TGGTCAGACTCATTAGCA-3'. Visi Doc-It Imaging system을 이용하여 이미지를 얻었다. o

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TM

난소암 세포에 Nrf2 siRNA의 도입 Nrf2의 siRNA(5'-GCUUUUGGCGCAGACAUUCtt-3' 및 5'GAAUGUCUGCGCCAAAAGCtg-3')를 AMBION사를 통해서 구입하였다. 6 well에 1.5×10 cells/well의 농도로 SK-OV 암세포를 항생제가 없는 배지에서 24시간 동안 배양한 뒤, 4

J. Pharm. Soc. Korea

Doxorubicin 매개 세포독성에 대한 Nrf2 경로의 역할

Lipofectamine 2000 reagents(Invitrogen)를 이용해서 siRNA를 도입했다. 5 µl의 siRNAs를 Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrogen) 250 µl에 희석하여, 5 µl의 Lipofectamine이 포함된 희석 용액과 섞은 뒤 20분간 배양하였다. 각각의 well에 2 ml의 Opti-MEM I 배지가 있는 상태에서, 500 ml의 Transfection mixture를 가해 72시간 또는 96시간 반응시켰다. Transfection 후 배지를 제거 후 세포주의 일반배지를 가하여 8시간 안정 화시킨 후 RNA를 추출 또는 doxorubicin을 처치하였다. TM

실험결과 및 고찰 Nrf2 유전자의 소실로 인한 doxorubicin에 대한 감수성 증가현상

Doxorubicin은 혈액암 및 고형암에 널리 사용되는 강력한 세 포독성을 보여주는 항암제이다. 특히 난소암의 경우 doxorubicin 은 cisplatin 등 백금함유 항암제 및 알킬화성 항암제와 흔히 병 용되어 사용된다. 그러나 이러한 처치방법에 대해 빈발하는 약 물내성은 이들 항암제의 적용에 있어 가장 큰 장해로 작용한다. 본 연구에서는 doxorubicin이 유발하는 세포독성에 대한 Nrf2의 작용을 알아보기 위해서, 정상 및 Nrf2 유전자가 소실된 마우스 에서 유래한 MEF(murine embryonic fibroblasts) 세포를 이용 하였다. MTT 측정법을 통해서 두 종류의 세포 생존율을 살펴본 결과 doxorubicin(0.5, 1.0, 2.0, 4.0 µM)을 24시간 동안 처치 시 Nrf2 소실 세포(N0)는 정상세포에 비해 낮은 세포 생존율을 나 타냈다(Fig. 1A). 즉 측정된 IC 값을 비교하였을 때, 정상세포 는 1.04 µM의 IC 값을 가지는 한편 N0 세포는 0.59 µM의 IC 값을 가지는 것으로 나타났다. Doxorubicin에 대한 약물내성이 세포 내 GSH 양과 깊은 연관성을 가진다는 것은 주지의 사실이 다. Nrf2는 GSH 수준을 조절하는 생합성 효소(GCL) 및 재생효 15)

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Fig. 1

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소(glutathione reductase)의 발현을 조절하는 전사인자로 알려 져 있다. 이러한 이유로 N0 세포에서는 세포 내 총 GSH 양이 정상세포의 40% 수준임을 이전결과에서 관찰한바 있다. 따라 서 N0 세포가 보여주는 doxorubicin에 대한 낮은 세포 생존률은 GSH 양의 감소와 관계가 있을 가능성이 있다. 다음에는 세포 내 GSH 양의 감소가 doxorubicin 독성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 정상 및 N0 세포에 BSO를 전처리 후 doxorubicin 독성 을 관찰하였다. BSO는 GSH 생합성 효소인 GCL의 효소저해제 로서 GSH의 생합성을 차단하여 고갈시키는 작용을 이끌어 doxorubicin 등의 항암제 적용 시 약물내성을 완화시키는 chemosensitizer로서 사용되기도 한다. BSO를 12시간 전처리 한 뒤 doxorubicin을 반응시킨 결과 doxorubicin 단독 투여군에 비 해 30% 낮아진 세포생존율이 N0 MEF에서 확인되었다(Fig. 1B). 이러한 결과는 정상세포에서는 BSO 전처리가 doxorubicin에 의 한 세포 생존률에 차이를 나타내지 않는 것과 대조된다(Fig. 1B). 즉 Nrf2 유전자의 소실로 인해서 GSH 생합성 능력에 한계가 있 는 것으로 보이며, 부족한 GSH 양은 doxorubicin에 의해 유발 되는 세포독성에 대항하여 세포가 효율적인 해독화 과정을 거치 지 못하게 함으로써 낮은 세포 생존률을 보이는 것으로 판단된다. 16)

Doxorubicin 투여와 Nrf2 하위 유전자들의 발현

앞서 N0 세포에서 관찰된 doxorubicin에 대한 낮은 세포 생존 률은 doxorubicin의 세포 내 해독화 관여 효소들의 유도 발현능 과 관계 있을 가능성이 제기된다. Doxorubicin은 quinine 모핵을 포함하는 anthracycline 계열의 항암제로서 암세포에서 나타내는 세포독성 기전 중 하나는 활성산소군 생성증가에 의한 작용으로 설명된다. 즉 doxorubicin에 의한 산화적 스트레스 상태가 Nrf2 경로를 증가시키고 이러한 현상이 후천적인 약물내성 발달에 기

− Cell survival measured in wild-type and nrf2-disrupted cells following treatment with BSO and doxorubicin. (A) MEF cells from wild-

type (WT) and nrf2-disrupted (N0) mice were maintained in medium containing 10% FBS for 24 h. and followed by incubation with doxorubicin (0.5, 1, 2, and 4 µM) for 24 h. Cell survival was monitored by MTT analysis. Values are mean±SD from 8 measurements. (B) Wild-type (WT) and nrf2-disrupted cells (N0) were pretreated with 0.5 mM of BSO for 12 h and followed by incubation with doxorubicin. (Doxo, 1.0 µM) for 24 h. Surviving cell numbers were measured by MTT analysis. Values are mean±SD from 8 measurements. a, P