Saar Direktor: Prof. Dr. med. Michael Pfreundschuh

Aus der Klinik für Innere Medizin I der Universitätskliniken des Saarlandes, Homburg/Saar Direktor: Prof. Dr. med. Michael Pfreundschuh Analyse der R...
Author: Benedict Adler
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Aus der Klinik für Innere Medizin I der Universitätskliniken des Saarlandes, Homburg/Saar Direktor: Prof. Dr. med. Michael Pfreundschuh

Analyse der Rituximab-induzierten Immunität gegen DLBCL-assoziierte Antigene

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin der Medizinischen Fakultät der UNIVERSITÄT DES SAARLANDES 2009

vorgelegt von:

Vera Hammermeister geb. am 20.06.1984 in Ottweiler

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis Seite I. Zusammenfassung / Summary

5

II. Einleitung

7

1. Das diffus großzellige B-Zell-Lymphom DLBCL

7

1.1. Definition und Klassifikation

7

1.2. Pathogenese

8

1.3. Therapie

10

1.3.1. CHOP/CHOEP

10

1.3.2. Rituximab

11

2. Genetische Modelle zur Prognose von DLBCL

13

3. SEREX

20

III. Fragestellung

22

IV. Patienten, Material und Methoden

24

1. Patienten: Aufnahmekriterien

24

2. Material

24

2.1. Autoantigene

24

2.2. Seren

25

3. Methoden

26

3.1. RNA Extraktion aus Zellkulturen und Geweben

26

3.2. Amplifikation der Targetgene mittels RT-PCR

27

3.2.1. Herstellung von cDNA aus mRNA

27

3.2.2. Polymerasenkettenreaktion (PCR)

27

3.2.3. Agarosegelelektrophorese zur Auftrennung von Nukleinsäuren

28

3.3. Klonierung von PCR-Produkten

28

3.3.1. TOPO Vektor

29

3.3.2. Transformation kompetenter Bakterien

29

3.3.3. Plasmid-Präparationen

29

3.3.4. TENS-Minis

30

3.3.5. Restriktionsenzymverdau von DNA-Konstrukten

30

3.3.6. DNA-Sequenzierung

31

3.3.7. Ligation von DNA-Fragmenten

33

3.3.8. Phagenverpackung

33 -3-

3.3.9. Platteneluat

34

3.3.10. Kontrolle

34

3.3.10.1. In-vivo-Excision

34

3.4. Das immunologische Screening: SEREX

36

3.4.1. Vorbereitung der Patientenseren

36

3.4.1.1. Präabsorption über Affinitätssäulen

36

3.4.1.2. Präabsorption über lytische Folien

37

3.4.2. Präparation der bakteriellen Wirtszellen

37

3.4.2.1. Vorbereitung der Bakterien für die Transfektion mit Phagen 37 3.4.3. Das Screening

37

3.4.3.1. Transfektion der Bakterien und Blotten der exprimierten Proteine

37

3.4.3.2. Waschen und Blocken der Nitrocellulosefolien

38

3.4.3.3. Inkubation mit allogenen Seren und Detektion gebundener Antikörper

38

3.4.3.4. Testauswertung

39

4. Reagenzien

39

5. Puffer und Medien

40

V. Ergebnisse

43

1. Untersuchtes Patientenkollektiv

43

2. Methodisches Vorgehen am Beispiel PKC-β

44

3. SEREX

51

4. Immunantworten gegen DLBCL-assoziierte Antigene

52

VI. Diskussion und Perspektiven

58

VII. Literaturverzeichnis

62

VIII. Tabellen- und Abbildungsverzeichnis

66

IX. Publikation / Danksagung

68

X. Lebenslauf

69

-4-

I. Zusammenfassung / Summary Lymphome, Neoplasien des lymphatischen Systems, können in 2 Gruppen eingeteilt werden: Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphome (NHL), wobei die NHL mit ca. 60 % die größere der beiden Gruppen bildet. Der Begriff NHL umfasst verschiedene Erkrankungen klinischen

mit

unterschiedlichen

morphologischen,

immunologischen

und

Kriterien, wobei das diffus großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL) den

häufigsten Subtyp der NHL darstellt, gefolgt vom Follikulären Lymphom. Es gibt 2 etablierte Therapien für DLBCL: CHOP (Cyclophosphamid, Doxorubicin, Vincristin = Oncovin und Prednisolon) und CHOEP (CHOP + Etoposid). Die Erweiterung beider Therapien mit dem anti-CD20 IgG1-κ-Antikörper Rituximab erbrachte eine deutliche Verbesserung der Überlebensraten von Patienten mit DLBCL, wobei eine möglicherweise auftretende Immunmodulation nach RituximabAnwendung, z.B. eine Immunantwort gegen definierte Genprodukte, einen Wirkungsmechanismus darstellen könnte. Ziel dieser Arbeit waren Analyse und Vergleich möglicher Veränderungen des Immunstatus

während

Kombinationstherapie

aus

der

Standardtherapie

CHOP-14

und

bzw.

Rituximab.

während Dazu

einer

wurde

das

Antikörperrepertoire zweier Patientengruppen, die mit CHOP-14 bzw. mit CHOP-14 + Rituximab behandelt wurden, vor und zu einem festgelegten Zeitraum nach der Chemotherapie mit Hilfe einer abgewandelten Form des SEREX (SErological identification of antigens by Recombinant EXpression cloning) untersucht. Die

Auswahl

der

zu

analysierenden

Genprodukte

erfolgte

anhand

verschiedener Studien, welche mehrere Gene und Genmuster identifizieren konnten, mit deren Hilfe z.B. die Prognose von DLBCL-Patienten besser vorhergesagt werden kann. Es wurden 11 dieser Gene im Rahmen dieser Studie zur Untersuchung herangezogen. Dabei wurde bei 3 Patienten eine von einem Rituximabzusatz unabhängige Immunantwort gegen BCL2 gefunden, wobei einer der Patienten mit 6 Zyklen CHOP14, die anderen beiden jeweils mit 8 Zyklen CHOP-14 in Kombination mit Rituximab therapiert wurden. Somit gelang es in dieser Studie erstmalig hochtitrige Antikörper gegen BCL2 und damit eine immunogene Wirkung von BCL2 nachzuweisen. Dies deutet darauf hin, dass eine Immuntherapie auf Basis des BCL2-Effektes als Ansatzpunkt für neue Therapien dienen könnte, um die Heilungschancen von Lymphomen weiter zu steigern. -5-

Investigation of Ritxuximab-Induced Anti-Lymphoma Immunity in Diffuse Large B-Cell Lymphomas Lymphomas, neoplasms of the lymphatic system, can be divided into two groups: Hodgkin- and non-Hodgkin-Lymphomas (NHL), the NHL being the bigger one with about 60%. The term NHL includes a diversity of diseases with different morphological, immunological and clinical criteria of which the diffuse large-B-cellLymphoma (DLBCL) is the most common subtype, followed by follicular lymphomas. There are 2 established therapies for DLBCL: CHOP (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine = oncovin and prednisone) and CHOEP (CHOP + etoposide). The addition of the anti-CD20 IgG1-κ-antibody Rituximab has lead to a significantly increased survival-rate of the patients with DLBCL, which could turn out to be a mechanism of action induced by a possible modulation of the immune system after a treatment with Rituximab, e.g. an immune response against defined gene products. The objectives of this paper were the analysis and the comparison of possible changes of the immune status during the standard therapy and during a combinational therapy of CHOP-14 and Rituximab respectively. Therefore an examination of the antibody repertoire of two groups of patients took place; one of them was treated with CHOP-14 and the other with CHOP-14 + Rituximab. They were tested before and during a determined period in time after the chemotherapy with an altered form of SEREX (SErological identification of antigens by Recombinant EXpression cloning). The gene products to be analyzed were selected on the basis of several studies which were able to identify various genes and gene patterns, which help, for example, to predict the prognosis of DLBCL-patients. 11 of these genes have been tested during this study. Within this survey, 3 patients showed an immune reaction against BCL2 that was independent from an addition of Rituximab. One of the patients had been treated with 6 cycles of CHOP-14, the other two with 8 cycles of CHOP-14 and Rituximab. Thus, this study was the first to detect high-titered antibodies against BCL2, and by doing so, proving the immunogenicity of BCL2. These results could imply that a possible immune therapy based on the BCL2-effect could be the starting point for new therapies increasing the remission rates of lymphomas.

-6-

II. Einleitung

1. Das diffus großzellige B-Zell-Lymphom DLBCL 1.1. Definition und Klassifikation

Als Lymphome bezeichnet man Neoplasien des lymphatischen Systems. Sie können in 2 Hauptgruppen unterteilt werden: Hodgkin-Lymphome (M. Hodgkin) und NonHodgkin-Lymphome (NHL), wobei die Hodgkin-Lymphome ungefähr 40 % der Erkrankungen ausmachen. Die NHL stellen mit ca. 60% die größere der beiden Gruppen dar. Dabei wird unter dem Begriff NHL eine heterogene Gruppe maligner Erkrankungen der Lymphozyten zusammengefasst, wobei die einzelnen Lymphome nach klinischen, morphologischen, immunphänotypischen und molekulargenetischen Kriterien klassifiziert werden (s. Tabelle 1).

Tabelle 1: Klassifikation der Lymphome, Kiel Klassifikation (1988) und WHOKLassifikation (2001) WHO-Klassifikation

Kiel-Klassifikation Hodgkin-Lymphom (HD)

Klassisches Hodgkin-Lymphom Lymphozytenreich Gemischte Zellularität Lymphozytenarm Noduläre Sklerose Noduläres lymphozytprädominantes HodgkinLymphom

Noduläres Paragranulom

B-Zell-Neoplasien Vorläufer-B-Zell-Neoplasien B-Zell-Lymphoblastenleukämie / lymphoblastisches Lymphom

B-ALL B-lymphoblastisches Lymhom

Reife ("periphere") B-Zell-Neoplasien Chronische lymphatische Leukämie / Kleinzelliges lymphozytisches Lymphom Prolymphozyten-Leukämie Lymphoplasmozytisches Lymphom Haarzell-Leukämie Plasmozytom

B-CLL Prolymphozyten-Leukämie B-PLL Lymphoplasmozytoides Immunozytom Haarzell-Leukämie

-7-

Extranodales Marginalzonenlymphom, MALTTyp Nodales Marginalzonenlymphom Splenisches Marginalzonenlymphom Follikuläres Lymphom Grad 1 Grad 2 Grad 3a Grad 3b Mantelzell-Lymphom

Monozytoides B-Zell-Lymphom

Zentroblastisch-zentrozytisches Lymphom

Zentrozytisches Lymphom

Diffuses großzelliges Lymphom Subtyp: mediastinal (thymisch)

primär mediastinales großzelliges sklerosierendes B-Zell-Lymphom Angioendotheliotropes (intravaskuläres) Lymphom

Subtyp: intravaskuläres Lymphom Subtyp: Ergusslymphom Variante: zentroblastisch Variante: immunoblastisch Variante: T-Zell-reich, Histozytenreich Variante: anaplastisch Burkitt-Lymphom

Zentroblastisches Lymphom Immunoblastisches Lymphom Großzelliges, anaplastisches B-Zell-Lymphom Burkitt-Lymphom

T-Zell-Neoplasien Vorläufer-T-Zell-Neoplasien T-Zell-Lymphoblastenleukämie / Lymphoblastisches Lymphom

T-ALL T-lymphoblastisches Lymphom

Reife ("periphere") T- und NK-Zell-Neoplasien T-Zell-Prolymphozyten-Leukämie Kutane T-Zell-Lymphome Extranodale T-Zell-Lymhome T-Zell-Lymphom vom Enteropathie-Typ Extranodales T-/ NK-Zell-Lymphom vom nasalen Typ Großzelliges anaplastisches Lymphom (T-/ Null-Zell-Typ) Primär kutaner Typ Primär systemischer Typ

T-PLL, T-CLL

Großzelliges anaplastisches T-/ Null-ZellLymphom (Ki-1-Lymphom) T-zell-Lymphom vom AILD-Typ

Angioimmunoblastisches T-Zell-Lymphom Peripheres T-Zell-Lymphom, nos (nicht weiter spezifiziert)

1.2. Pathogenese

Die Pathogenese der meisten NHL ist unklar. Diskutiert werden z.B. Virusinfektionen: bei Patienten mit T-Zell-Lymphomen in Südjapan wurden gleichzeitig HTLV1Infektionen gefunden, Epstein-Barr-Viren bei 2 Typen des Burkitt-Lymphoms, dem HIV-assoziierten Typ und dem endemischen Typ in Afrika. Des Weiteren werden

-8-

angeborene Immundefekte wie das Wiskott-Aldrich-Syndrom sowie erworbene Immunschwächen,

z.B.

durch

Immunsuppressiva

oder

Zytostatika,

Autoimmunerkranungen

wie

Spätkomplikation

das

als

Ursache

Sjögren-Syndrom

einer

Therapie

angenommen. werden

mit Auch

diskutiert.

Spätkomplikationen nach einer Bestrahlung oder eine Exposition gegenüber radioaktiven Materialien spielen bei der Lymphomentstehung ebenfalls eine Rolle. Die NHL werden ähnlich wie die Hodgkin-Lymphome nach der Ann-ArborKlassifikation in 4 Stadien eingeteilt, wobei zwischen primär nodalem und primär extranodalem Befall unterschieden wird (s. Tabelle 2). Tabelle 2: Ann-Arbor-Klassifikation Stadium

Primär nodale Manifestation (70%)

Primär extranodale Maifestation (30%)

I

Befall einer Lymphknotenregion

II1

Befall von benachbarten Lymphknotenregionen über- oder unterhalb des Zwerchfells (II1) oder einer Lymphknotenregion mit lokalisiertem Übergang auf ein benachbartes Organ oder Gewebe (IIE) Befall von zwei nicht benachbarten oder mehr als zwei benachbarten Lymphknotenregionen ober- oder unterhalb des Zwerchfells (II2) einschließlich eines lokalisierten Befalls eines extralymphatischen Organs oder Gewebes (II2E) Befall von Lymphknotenregionen ober- und unterhalb des Zwerchfells (III) einschließlich eines lokalisierten Befalls eines extralymphatischen Organs oder Gewebes (IIIE) oder der Milz (IIIS) oder beides (IIISE)

Befall eines extralymphatischen Organs oder Gewebes (IE) Befall eines extralymphatischen Organs einschließlich der regionalen Lymphknoten (II1) oder eines weiteren benachbarten extralymphatischen Organs (II1E) ober- oder unterhalb des Zwerchfells

II2

III

IV

Befall eines extralymphatischen Organs und Lymphknotenbefall, der über die regionalen Lymphknoten hinausgeht und auch einen weiteren lokalisierten Organbefall einschließen kann (II2E) Befall eines extralymphatischen Organs und Lymphknotenbefall ober- und unterhalb des Zwerchfells einschließlich eines weiteren lokalisierten extralymphatischen Organes oder Gewebes (IIIE) oder der Milz (IIIS) oder beides (IIISE) Diffuser oder disseminierter Organbefall mit oder ohne Lymphknotenbefall

Lymphknotenbefall mit diffusem oder disseminiertem Befall extralymphatischer Organe oder Gewebe Zusatz: A: ohne Allgemeinerscheinungen B: mit Fieber u./o. Nachtschweiß u./o. Gewichtsverlust ( > 10% in den letzten 6 Monaten) (Quelle: Herold – Innere Medizin, 2006)

Bei ca. 80% aller NHL handelt es sich um B-Zell-Neoplasien, wobei das diffus großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL) laut einer Studie der International Lymphoma Study Group [Armitage and Weisenburger 1998] den häufigsten Subtyp der NHL darstellt, gefolgt vom Follikulären Lymphom als Zweithäufigstem (s. Tabelle 3). -9-

Tabelle 3: Häufigkeit der verschiedenen Histologien unter den B-Zell-Lymphomen Histologischer Typ

Häufigkeit in %

Diffus großzelliges Lymphom Follikuläres Lymphom B-CLL Immunozytom / lymphoplasmozytoides Immunozytom Mantelzell-Lymphom Burkitt-Lymphom Haarzell-Leukämie

27,3 25,6 23,1 10,5 5,3 4,4 3,8

(Quelle: Tumorregister München)

1.3. Therapie

1.3.1. CHOP/CHOEP DLBCL wurde mehr als 25 Jahre lang standardmäßig mit einer Kombination aus Cyclophosphamid, Doxorubicin, Vincristin = Oncovin und Prednisolon (CHOP) therapiert. Das Hinzufügen von Etoposid zur CHOP-Therapie (CHOEP) erhöht die Effektivität der Chemotherapie bei jungen Patienten mit guter Prognose, so dass diese

Therapieform

in

mehreren

Ländern

zur

Standardtherapie

für

diese

Patientengruppe geworden ist [Pfreundschuh et al. 2004]. Auch die Verkürzung des Behandlungsintervalls durch den Einsatz von G-CSF von 3 auf 2 Wochen (CHO(E)P14 statt CHO(E)P21) wirkt sich positiv auf die Überlebenszeit der Patienten aus. Die besten Ergebnisse werden jedoch durch eine Kombination aus einer CHOPähnlichen Therapie mit dem CD20-Antikörper Rituximab erzielt. Studien, die u.a. eine reine

CHOP-

bzw.

CHOEP-Therapie

mit

einer

Kombinationstherapie

aus

CHOP/CHOEP und Rituximab vergleichen, zeigen eine statistisch signifikante Zunahme z.B. des Prozentsatzes von Patienten mit einer progressionsfreien 3Jahres-Überlebensrate

von

68%

(ausschließlich

Chemotherapie)

auf

85%

(Chemotherapie und Rituximab). Auch die Gesamtüberlebensrate ließ sich von 84% (ohne Rituximab) auf 93% (mit Rituximab) steigern. Obwohl das Hinzufügen von Etoposid allein zur CHOP-Therapie zu einer deutlichen Effizienzzunahme der Behandlung führt, ist dieser Unterschied nach Zusatz von Rituximab nicht mehr erkennbar. Dies könnte durch einen ausgleichenden Effekt von Rituximab auf die beiden Chemotherapien hervorgerufen werden. Auch die deutlich stärkeren

- 10 -

hämatotoxischen

Nebenwirkungen

der

CHOEP-Therapie

könnten

zu

einem

Effizienzverlust dieser Behandlungsmaßnahme führen, da sie die notwendigen Effektormechanismen des Immunsystems (z.B. Natürliche Killerzellen) verringern. Diese sind essentiell für die durch Rituximab-vermittelte Antikörper-abhängige zelluläre Toxizität. Aufgrund der geringeren schädigenden Auswirkungen von CHOP gegenüber CHOEP bei gleicher Wirkung in Kombination mit Rituximab und aufgrund einer leichteren Handhabung von CHOP könnte diese Therapie zukünftig der anderen vorzuziehen sein [Pfreundschuh et al. 2006]. 1.3.2. Rituximab Rituximab ist ein chimärer anti-CD20 IgG1-κ-Antikörper mit einer konstanten humanen Region (κ-Leicht- und IgG1-Schwerkette) und einer variablen, aus Mausgewebe extrahierten Region (Leicht- und Schwerkette). CD20, ein ca. 33-37 kDa großes, nicht glykosiliertes, 297 Aminosäuren umfassendes Membran-Phosphoprotein wird im gesunden Organismus in unterschiedlicher Glykosilierung von der B-Lymphozytenreihe und von Spermien exprimiert, wobei eine konstante CD20-Expression bei der B-Zell-Differenzierung der prä-B-Vorstufen bis zu den Plasmazellen nachweisbar ist [Tedder and Engel 1994]. CD20 stellt einen Ca²+Kanal dar, welcher eine wichtige Rolle in der Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von B-Zellen spielt [Kanzaki et al. 1997]. Das

Rituximab-Epitop

ist

größtenteils

unbekannt.

Vermutet

wird

eine

diskontinuierliche Bindungsstelle an der extrazellulären Schleife von CD20 (vgl. Abbildung 1).

- 11 -

Abbildung 1: Rituximab-Epitop Modell der transmembranen und der extrazellulären Domäne von CD20 (basierend auf Ernst et. al, [Ernst et al. 2005]) mit dem vermuteten diskontinuierlichen Epitob, blau markiert; gelb markiert: Disulfidbrücke zwischen C167 und C183 ) [Binder et al. 2006]

Rituximab wirkt einerseits über eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) und andererseits über eine Komplement-vermittelte Lyse (CDC) der B-Zelle. Weitere Angriffspunkte sind wahrscheinlich eine Hemmung des Übergangs des Zellzyklus von der G- in die S-Phase, eine Differenzierungshemmung und eine Zunahme der Phosphorylierung verschiedener zellulärer Proteine. Außerdem wurden eine

Apoptose-Induktion

der

CD20+

Lymphomzellen,

sowie

synergistische

zytotoxische Effekte bei Kombination mit einer Chemotherapie beschrieben [Hofmeister et al. 2000; Ghetie et al. 2001; Maloney 2001]. Weil die Überlegenheit von Rituximab-beinhaltenden Therapien nicht nur auf besserem Ansprechen auf die Primärtherapie, sondern auch auf geringeren Rezidivraten beruht, könnten sekundäre, durch die Rituximab Anwendung induzierte, immunologische Effekte auftreten.

- 12 -

2. Genetische Modelle zur Prognose von DLBCL Es gibt 2 verschiedene Entstehungswege für DLBCL: entweder aus einem Follikulären Lymphom (FL) oder de novo. 25-60% der FL unterlaufen eine Transformation in ein DLBCL. Der klinische Verlauf der beiden Formen ist sehr verscheiden. Die aus FL transformierten DLBCL sind häufig rapid progressiv, therapierefraktär und mit kurzer Gesamtüberlebenszeit verbunden [Levene et al. 2003]. Ein Vergleich der genetischen Expressionsmuster von transformierten DLBCL und de novo DLBCL mit dem genetischen Expressionsmuster von de novo FL ergab, dass die transformierten DLBCL den FL mehr ähnelten als die de novo DLBCL. Durch cDNA-Mikroarray-Experimente konnten Alizadeh et al. DLBCL in 2 weitere Gruppen mit unterschiedlicher Prognose einteilen: eine Gruppe exprimierte ein Genmuster, das Keimzentrums-B-Lymphozyten ähnelt (germinal center B-like DLBCL, GC-B-like DLBCL), die andere exprimierte Gene, die normalerweise während der in vitro Aktivierung von peripheren B-Zellen induziert werden (activated B-like DLBCL). Beide Untergruppen weisen deutlich unterschiedliche Prognosen auf: Patienten mit GC-B-like DLBCL hatten eine statistisch signifikant längere Gesamtüberlebenszeit als Patienten mit activated B-like DLBCL [Alizadeh et al. 2000]. Aufbauend auf dieser Einteilung wurden mehrere Studien durchgeführt, die das Ziel hatten, verschiedene Gene oder Genmuster zu identifizieren, mit denen die Überlebenszeiten

der

verschiedenen

DLBCL-Untergruppen

noch

besser

vorhergesagt werden können. Dabei wurden mehrere Gene identifiziert. Shipp

et

al.

verglichen

Expressionsmuster schwerwiegende

zweier bzw.

mittels

cDNA-Mikrochip-Analysen

DLBCL-Untergruppen

therapierefraktäre

DLBCL.

miteinander: Dabei

das

genetische

geheilte

zeigte

sich,

und dass

verschiedene Gene in der Gruppe der refraktären DLBCL deutlich stärker exprimiert wurden als in der anderen Gruppe. Dazu gehörten u.a. PDE4B und PKCβ 2 [Shipp et al. 2002].

- 13 -

Abbildung 2: Expressionsprofile von geheilten bzw. schwerwiegenden oder therapierefraktären DLBCL; Gene, die in geheilten DLBCL verstärkt exprimiert werden, sind im oberen Bildteil abgebildet, solche die in fatalen DLBCL verstärkt exprimiert werden, sind im unteren Bildteil abgebildet; rote Farbe zeigt hohe Expression, blaue zeigt niedrige Expression an. Die Farbskala am unteren Bildrand zeigt die relative Expression in Standardabweichung vom Mittelwert. Jede Spalte stellt einen Fall dar, jede Zeile ein Gen. Die Expressionsprofile von 32 geheilten DLBCL sind auf der linken Seite, die Expressionsprofile von 26 schwerwiegenden bzw. therapierefraktären Tumoren sind auf der rechten Bildseite abgebildet. [Shipp, Ross et al. 2002]. Die Pfeile markieren in dieser Arbeit untersuchte Gene. - 14 -

Ein weiteres dokumentiertes Gen ist HGAL (= human germinal center-associated lymphoma), welches hauptsächlich durch Keimzentrums-B-Lymphozyten exprimiert und spezifisch durch das Interleukin-4 (IL-4) stimuliert wird [Lossos et al. 2003]. Es ist homolog zu dem Maus-Gen M17, welches in GC-B-Lymphozyten exprimiert wird [Lim et al. 2007]. Das HGAL-kodierte Protein ist wahrscheinlich im Zytoplasma lokalisiert,

da

ihm

sowohl

Kernlokalisierungssequenz

eine

fehlen.

Transmembrandomäne Aufgrund

des

als

auch

Vorhandenseins

eine eines

„immunoreceptor tyrosine-based activation motif“ (ITAM) wird angenommen, dass das HGAL-kodierte Protein eine Rolle in der Signaltransduktion der B-Lymphozyten spielt [Lossos, Alizadeh et al. 2003]. Des Weiteren wurden unter anderem BCL6 und BCL2 untersucht. Diese Gene weisen Chromosomenaberrationen auf, wie z.B. Translokationen des BCL6-Gens bei DLBCL,

beispielsweise

t(3;14)(q27;q32)

oder

t(3;22)(q27;q11).

Die

dadurch

entstandenen Hybrid-Gene spielen bei der Pathogenese eine wichtige Rolle, wie z.B. auch die Translokation t(14;18), welche sich relativ häufig in Follikulären Lymphomen findet. Es kommt bei solchen Mutationen häufig zu einer Überexpression der durch die neu-entstandenen Hybrid-Gene kodierten Proteine. Translokationen im BCL2-Gen werden in 12-30% der DLBCL gefunden. In diesem Fall

besteht

jedoch

keine

statistische

Signifikanz

zwischen

gesteigerter

Proteinexpression und Auftreten einer Mutation, da es sowohl bei 52% der Lymphome mit Translokation als auch bei 37% der Lymphome ohne Translokation zur erhöhten BCL2-Expression kommt [Gascoyne et al. 1997]. Auch bei DLBCL, die aus FL entstanden sind, ist eine Änderung in der Expression verschiedener

Proteine

erkennbar:

Gene,

deren

Funktion

in

Proliferation,

Basismetabolismus und Gewebsinvasion liegt, werden heraufreguliert, während antiapoptotische Gene herabreguliert werden [Levene, Morgan et al. 2003]. So gibt es eine Reihe anderer Gene, bei denen es z.B. durch Translokation zur Überexpression ihrer Genprodukte kommt. Anhand der Expression verschiedener Gene konnten weitere Modelle zur Prognose der Überlebenszeit von DLBCL-Patienten entwickelt werden [Zhang et al. 1999; Lossos et al. 2004].

- 15 -

Aus

diesen

Studien

wurden

folgende

Gene

ausgewählt,

deren

mögliche

Immunogenität in dieser Arbeit untersucht wurde, weil z.B. eine Überexpression dieser Gene zu einer gesteigerten Immunantwort gegen deren Produkte führen könnte. BCL2: (entspricht B-cell lymphoma 2 protein) Das BCL2-kodierte Protein ist anti-apoptotisch wirksam. [Hockenbery et al. 1991] Bei einer Mutation von BCL2 kommt es zu einer Hypomethylierung in der Promoterregion, was eine Überexpression des Proteins zur Folge haben kann. Untersuchungen bei Patienten mit neu aufgetretenem DLBCL zeigten, dass Translokationen des BCL2-Gens relativ häufig vorliegen, wobei sie eher in primär nodalen als in extranodalen Lymphomen vorkommen. Weiterhin wurde aufgezeigt, dass zwischen einer Translokation des BCL2-Gens und einer Überexpression von BCL2 kein statistisch signifikanter Zusammenhang besteht. Das Auftreten von Translokationen

des

BCL2-Gens

hat

weder

Einfluss

auf

die

ereignisfreie

Überlebenszeit, noch auf die Gesamtüberlebenszeit. Im Gegensatz dazu hat das Ausmaß der Proteinexpression von BCL2 einen statistisch signifikanten Einfluss, sowohl auf die ereignisfreie als auch auf die Gesamtüberlebenszeit. Dabei wirken sich eine niedrige Proteinexpression positiv und eine hohe Proteinexpression negativ auf ereignisfreie und auf Gesamtüberlebenszeit aus [Kramer et al. 1998].

- 16 -

Abbildung 3: Überlebenszeiten von Lymphompatienten in Abhängigkeit von der BCL2-Proteinexpression; A: Gesamtüberlebenszeit von Lymphompatienten mit hoher BCL2-Proteinexpression (n063) und niedriger/ausbleibender BCL2-Proteinexpression (n=93); B: Ereignisfreie Überlebenszeit von Lymphompatienten mit hoher BCL2-Proteinexpression (n=32) und niedriger/ausbleibender BCL2-Proteinexpression (n=56) [Kramer, Hermans et al. 1998]

BCL6: Das BCL6-kodierte Protein ist ein Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, in diesem Fall ein sequenzspezifischer

Transkriptionsrepressor.

Es

dient

der

Kontrolle

der

Keimzellformation und der T-Zell-abhängigen Immunantwort und der Modulation der Transkription von IL-4-Antworten von B-Zellen [Staudt et al. 1999]. Des Weiteren reprimiert es die Expression von Cyclin D2 und SCYA3 [Dunphy 2006]. BCL6 ist wie HGAL ein Marker für GC-B-like DLBCL und mit einer eher guten Prognose verbunden [Staudt, Dent et al. 1999]. Winter et al. konnten zeigen, dass sowohl ereignisfreie Überlebenszeit als auch Gesamtüberlebenszeit bei BCL6-negativen Patienten mit einer Kombinationstherapie aus CHOP und Rituximab signifikant verlängert waren gegenüber einer Therapie - 17 -

ohne Rituximab. Im Gegensatz dazu waren ereignisfreie Überlebenszeit und Gesamtüberlebenszeit bei BCL6-positiven Patienten bei beiden Therapien gleich. Somit profitieren ausschließlich BCL6–negative Patienten von einer Therapie mit Rituximab [Winter et al. 2006]. CD20: CD20 stellt einen Ca2+-Kanal dar, welcher eine wichtige Rolle in der Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von B-Zellen spielt [Tedder and Engel 1994]. CD20 kommt in unterschiedlicher Glykosilierung in der B-Lymphozytenreihe vor und bildet den Angriffspunkt von Rituximab. LM02: Das LM02-kodierte Protein ist ein Faktor in Erythropoese und Angiogenese. Es wird in Keimzell-T-Lymphozyten exprimiert und ist das am häufigsten durch Translokation veränderte Gen bei akuter T-Zell-Leukämie in der Kindheit. Außerdem wird LM02 vermehrt in GC-B-like DLBCL (dort in 47% der untersuchten Fälle), in FL, Burkitt Lymphomen und dem lymphozytenprädominanten Hodgkin Lymphom exprimiert [Natkunam et al. 2007]. PDE4B: PDE4B kodiert für eine cAMP-abhängige Phosphodiesterase. Eine Mutation von PDE4B führt zur Überexpression dieses Proteins bei prognostisch ungünstigen bzw. therapierefraktären DLBCL [Manning et al. 1999], [Shipp, Ross et al. 2002]. Cyclin D2 (entspricht CCND2) Cyclin D2 stellt eine regulatorische Untereinheit von CDK4 und CDK6 dar. Eine seiner Funktionen ist die Kontrolle des Zellzyklus am G1/S Übergang, wobei eine Überexpression von Cyclin D2 die G1 Phase verkürzt [Brooks et al. 1996]. Bei B-CLL Patienten, bei Patienten mit lymphoplasmozytischem Lymphom und bei Patienten mit Mantelzelllymphom wurde eine 5- bis 10-fach gesteigerte Expression von Cyclin D2 nachgewiesen [Delmer et al. 1995]. Mikrochip-Analysen zeigten eine verstärkte Expression in activated B-like DLBCL gegenüber GC-B-like DLBCL [Alizadeh, Eisen et al. 2000]. - 18 -

Aktinin α1: Aktinin ist ein Mikrofilament-Protein, welches die Länge von R-Aktin reguliert. Es dient außerdem der Verankerung von Aktin in der Plasmamembran [Burridge and McCullough 1980]. SCYA3: (entspricht MIP-1 alpha bzw. CCL3) Die Funktion des cc-Chemokins ist unbekannt, es wird jedoch hauptsächlich in der activated-B-cell-like Untergruppe von DLBCL exprimiert. In der SCYA3-Promoterregion befindet sich eine Bindungsstelle mit hoher Affinität für BCL6. BCL6 reprimiert die Expression von SCYA3. Eine Mutation von SCYA3 führt zur Überexpression des Proteins. PKC-β2: Das PKC-β-kodierte Protein beeinflusst den B-Zell-Rezeptor (BCR): bei Aktivierung des BCR in Anwesenheit von PKC-β kommt es zur gesteigerten Proliferation, bei Aktivierung des BCR bei niedriger PKC-β-Konzentration kommt es hingegen zur Apoptose der B-Zelle. Eine Mutation führt zur Überexpression des Proteins in prognostisch ungünstigen bzw. therapierefraktären DLBCL [Shipp, Ross et al. 2002]. E2IG3: (entspricht Nucleostemin) E2IG3 kodiert für Nucleostemin, welches ein Protein des Nucleolus darstellt und welches in Stammzellen, transformierten Zelllinien und in Tumoren exprimiert wird. Die genauen Ansatzpunkte von Nucleostemin in der Wachstumsregulation sind unbekannt. Jedoch konnte von Ma und Pederson gezeigt werden, dass eine Nucleostemin-Herabregulation die Konzentration des Tumorsuppressors p53 erhöht und in p53-positiven Zellen zu einem G1-Arrest des Zellzyklus führt. In Zellen, denen es aufgrund von genetischer Transformation an p53 mangelt, war dies nicht der Fall. Somit konnte gezeigt werden, dass Nucleostemin den G1/S-Übergang p53-abhängig kontrolliert [Ma and Pederson 2007].

- 19 -

HGAL: HGAL kodiert ein 178 Aminosäuren-umfassendes Protein, welches in GC-B-like DLBCL exprimiert wird, wahrscheinlich im Zytoplasma lokalisiert ist und eine Rolle in der Signaltransduktion der B-Lymphozyten spielt. Es wird durch IL-4 induziert. Es stellt sich die Frage, ob eine Immunantwort z.B. gegen die überexprimierten Proteine existiert und ob eine Rituximab-Behandlung diese mögliche Antwort evtl. induziert oder verstärkt. Tabelle 4: Gene, Zusammenfassung Überexpression

Gen

Funktion

BCL2 BCL6 CD 20 LM02 PDE4B Cyclin D2 Actinin SCYA3 PKC-β E21G3 HGAL

Anti-apoptotisch wirksam Sequenzspezifischer Transkriptionsrepressor Ca2+-Kanal: Aktivierung, Differenzierung von B-Zellen Wirksam bei Erythropoese und Angiogenese cAMP-abhängige Phosphodiesterase Kontrolle des Zellzyklus am G1/S Übergang Mikrofilament-Protein, reguliert die Länge von R-Aktin cc-Chemokin mit unbekannter Funktion Wirkung auf den B-Zell-Rezeptor p53-abhängige Kontrolle des G1/S Übergangs Wirksam in der Signaltransduktion der B-Lymphozyten

+ (eher ABC-DLBCL) + (eher GC-DLBCL) + (prognostisch ungünstige DLBCL) + (eher ABC-DLBCL) + (?) + (prognostisch ungünstige DLBCL)

3. SEREX Durch SEREX erfolgt eine molekulare Identifizierung von Tumorantigen anhand des Antikörperreservoirs

von

Tumorpatienten.

Dabei

werden

cDNA-

Expressionsbibliotheken aus Tumorbiopsiematerial über den Zwischenschritt der mRNA hergestellt. Die cDNA wird daraufhin in Bakteriophagen kloniert und in E.coli Bakterien exprimiert. So erhält man rekombinante Proteine, welche von Antikörpern in Patientenseren erkannt werden können. Die so erfassten Antigene können der Sequenzanalyse zugeführt werden, so dass deren molekulare Struktur aufgeklärt werden kann [Sahin et al. 1997]. Diese Methode hat gegenüber anderen wie z.B. dem Western-Blot den Vorteil, dass sie deutlich weniger zeit- und kostenintensiv ist. SEREX ist ein in-vivo-System, bei dem positive und negative Signale - im Gegensatz zum Western-Blot - gleichzeitig ausgewertet werden können. Die deutlich geringeren Hintergrundreaktionen machen

- 20 -

eine

Auswertung

zudem

sehr

viel

leichter.

Außerdem

Konzentrationsoptimierung der Seren durchgeführt werden.

- 21 -

muss

keine

III. Fragestellung In dieser Arbeit soll ein Vergleich von Immunantworten gegen DLBCL-assoziierte Antigene bei Patienten vor und nach einer Therapie angestellt werden. Dazu wird der Immunstatus von 2 Patientengruppen an 3 verschiedenen Zeitpunkten untersucht

und

verglichen,

wobei

eine

Gruppe

ausschließlich

mit

einer

Chemotherapie, eine zweite mit einer Kombination aus Chemotherapie und Rituximab behandelt wurde. Dies ermöglicht die Darstellung eventuell auftretender Rituximab-induzierter immunologischer Effekte und deren nähere Charakterisierung. Die Immunantwort wird zu Beginn der Therapie sowie 3 bzw. 6 bis 9 Monate nach Ende der Therapie analysiert.

A

20 Pat. vor Therapie DLBCL-Diagnose

S

R

CHOP-14

B

C

3 Monate nach Therapiebeginn

6 Monate nach Therapiebeginn

CHOP-14+Ritux.

Published genes with context to DLBCL

D

3 Monate nach Therapiebeginn

E

6 Monate nach Therapiebeginn

Abbildung 4: Schema zur Einteilung der Patienten in die beiden Therapiearme

Anschließende Arbeiten könnten eine Identifikation und molekulargenetische Charakterisierung von Antigenen, die bei DLBCL exprimiert werden, zum Ziel haben. Auch eine Analyse des Expressionsspektrums dieser DLBCL-Antigene und Vergleiche mit anderen Lymphomen, maligne entarteten und normalen menschlichen Geweben wären in folgenden Arbeiten möglich.

- 22 -

Zur Analyse einer eventuell auftretenden Rituximab-induzierten Immunantwort wird die von Pfreundschuh und Mitarbeitern etablierte SEREX-Methode (SErological identification of antigens by Recombinant EXpression cloning) herangezogen.

- 23 -

IV. Patienten, Material und Methoden

1. Patienten: Aufnahmekriterien Die Auswahl der Patienten resultierte aus folgenden Ausschlusskriterien: Es wurden nur solche Patienten aus der RECOVER-Studie der Deutschen Studiengruppe NonHodgkin-Lymphome ausgesucht, bei denen ein Follow-up nach ungefähr 3 und nach ungefähr 6 bis 9 Monaten sichergestellt war. Des Weiteren wurde darauf geachtet, dass die Zahl der männlichen und weiblichen Patientenseren in etwa gleich war. Es wurden Seren von Patienten mit unterschiedlichen Diagnosen und unterschiedlichen Therapien gewählt: Behandlung ausschließlich mit Chemotherapie bzw. mit einer Kombination aus Chemotherapie und Rituximab. Ansonsten wurde keine weitere Vorauswahl getroffen, es wurden keine matched-pairs gebildet. Nach der Auswahl wurden die Seren im Sinne einer Doppelblindstudie randomisiert.

2. Material 2.1. Autoantigene

Das Screening allogener Seren wurde mit folgenden in E.coli exprimierten Autoantigenen durchgeführt.

Tabelle 5: verwendete Gene Gen

AccNo

Quelle

Länge des kodierenden Bereichs

BCL2

L21667

RZPD

617

BCL6

BC142705

Testisbank

2120

- 24 -

sensePrimer

antisensePrimer

5’GGAATTCCA TGGCGCAC GCTGGGAG A-3’ 5’GCAATTGGA TGGCCTCG CCGGCTGA C-3’

5’GCTCGAGG CCCAGACTC ACATCACC3’ 5’GCTCGAGG CAGGCTTTG GGGAGCTC3’

Annealingtemperatur

59°C

61°C

CD 20

LM02

PDE4B

Cyclin D2

Actinin, α1

M27394 J03547

Lymphombank

NM_005574

PlazentaGewebe

L20971

TestisGewebe

AF518005

TestisGewebe

NM_001102

RZPD

893

476

1694

869

2678

SCYA3

BC071834

RZPD

278

PKC β2

X07109

RZPD

2021

E2IG3

HGAL

AF191018

TestisGewebe

AF521911

B-ZellLymphomlinie

1649

536

5’GCAATTGGA TGACAACAC CCAGAAATT -3’ 5’GGAATTCCA TGTCCTCG GCCATCGA A-3’ 5’GGGAATTCA ATGAAGGA GCACGGGG GCACC-3’ 5’GGAATTCCA TGGAGCTG CTGTGCCA C-3’ 5’GGAATTCCA TGGACCATT ATGATTCT3’ 5’GGAATTCCA TGCAAGTCT CCACTGCT3’ 5’GGCAATTG CATGGCTG ACCCGGCT GCGGGG-3’ 5’GCAATTGGA TGAAAAGG CCTAAGTTA -3’ 5’GGGAATTC GATGGGAA ATTCTCTGC TGAGA-3’

5’GCTCGAGA GGAGAGCT GTCATTTTC3’

51°C

5’GCTCGAGTA TCATCCCAT TGATCTT-3’

51°C

5’CTCGAGTGT ATCCACGGG GGACTTGTC -3’

59°C

5’GCTCGAGCA GGTCGATAT CCCGCAC-3’

58°C

5’GCTCGAGGT CACTCTCGC CGTACAG-3’

50°C

5’GCTCGAGG GCACTCAGC TCCAGGTC3’ 5’CTCGAGGCT CTTGACTTC GGGTTTTAA AAATTC -3’

54°C

50°C

5’GCTCGAGCA CATAATCTG TACTGAA-3’

50°C

5’CTCGAGTAA ATGGGAAAA CTGAGTC-3’

51°C

RZPD = Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung Berlin 2.2. Seren

Die Seren von gesunden Spendern wurden in Zusammenarbeit mit der Universitätsklinik Homburg, Saar gesammelt. Die Patientenseren stammten aus der Deutschen Studiengruppe Non-HodgkinLymphome.

- 25 -

3. Methoden 3.1. RNA-Extraktion aus Zellkulturen und Geweben

Die RNA-Extraktion wurde mit dem RNeasy-Kit von Qiagen vorgenommen. Dabei erfolgt der Zellaufschluss mit Hilfe eines denaturierenden Guanidinisothiocyanat (GITC) enthaltenden Puffers. Die RNA wird in einem nächsten Schritt an eine Silicagel-Membran gebunden und durch Zentrifugation, Waschen und Elution von den restlichen Substanzen abgetrennt. Mit dem Messer zerkleinertes Gewebe oder 5 x 106 bis 1 x 107 Zellen wurden mit 600 μl RLT-Puffer, zu dem 10 μl β-Mercaptoethanol pro ml Puffer hinzugefügt wurden, homogenisiert. Die Proben wurden 3 Minuten lang bei 13.000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Nach Zugabe von 600 μl 70% Ethanol (RNase-frei) wurde der Ansatz durch Auf- und Abpipettieren gut vermischt. 700 μl der Probe wurden nun auf eine RNeasy Mini Säule gegeben, welche zuvor in einem 2-ml-Eppendorfgefäß platziert wurde. (Dieser Schritt wurde 2 Mal durchgeführt, da insgesamt 1.200 μl des Ansatzes zur Verfügung standen.) Das Gefäß wurde verschlossen und 15 Sekunden lang bei 13.000 rpm zentrifugiert, der Durchfluss wurde danach verworfen. Nach Zugabe von 700 μl RW1-Puffer wurde erneut 15 Sekunden lang bei 13.000 rpm zentrifugiert. Nach Überführen der Säule auf ein neues Auffanggefäß wurde die Zentrifugation nach Zugabe von 500 μl RPEPuffer wiederholt. Danach wurden ein weiteres Mal 500 μl RPE-Puffer zugegeben, wobei nun 2 Minuten lang bei 13.000 rpm zentrifugiert wurde. Der Durchfluss wurde verworfen und es wurde erneut 1 Minute lang bei 13.000 rpm zentrifugiert. Die RNeasy-Säule wurde für die Elution auf ein neues 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt, es wurden 50 μl RNase-freies Wasser hinzugegeben und der Ansatz wurde 1 Minute lang bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluss enthielt nun die isolierte RNA. Qualität und Konzentration der RNA lassen sich nach Auftrennung in einem MOPSGel durch Vergleich mit einem RNA-Standard bekannter Konzentration beurteilen.

- 26 -

3.2. Amplifikation der Targetgene mittels RT-PCR

3.2.1. Herstellung von cDNA aus mRNA Mit dem Enzym Reverse Transkriptase lässt sich mRNA in cDNA umschreiben. Dabei dient die mRNA als Matritze, an die Primer angelagert und zu einer komplementären, einzelsträngigen DNA verlängert werden. Durch Verwendung eines polyT-Primers, der an den polyA-Schwanz der mRNAs bindet, wird dabei nur die mRNA, nicht jedoch tRNA oder rRNA aus der eingesetzten Gesamt-RNA (Extraktion: Kapitel 3.1.) in cDNA umgeschrieben. Eine Kontrolle der Integrität der synthetisierten cDNA wird mit Hilfe der PCR-Technik (Kapitel 3.2.2.) durchgeführt, indem das in den meisten Geweben konstitutiv und hoch-abundant exprimierte P53 („housekeeping gene“) aus der cDNA amplifiziert wird. Erhält man dabei in der PCR schon bei geringer Zyklenzahl eine deutliche P53-Bande im Agarosegel, so eignet sich eine solche cDNA für den weiteren Nachweis auch von weniger abundanten spezifische Transkripten. Zur Herstellung der cDNA pipettiert man folgenden Ansatz: Master-Mix: 4 μl 5xFirst Strand Synthesis Buffer 2 μl 100mM DTT 1 μl 10mM dNTPs Auffüllen mit Aqua dest. auf 20 μl Zuerst wurden 8 μl RNA mit 1 μl 50mM polyT(18)Primer (= dT18) für 5 Minuten bei 75°C inkubiert und der Ansatz wurde anschließend auf Eis gestellt. Dann wurden 10 μl des Master-Mix hinzugegeben und auf 42°C erwärmt. Es wurden 0,8 μl Reverse Transkriptase zugefügt und bei 42°C 1 Stunde lang inkubiert. Daraufhin erfolgte eine Denaturierung des Enzyms durch Erhitzen auf 70°C für 10 Minuten. Am Ende wurde die cDNA auf 4°C abgekühlt. Die so hergestellte cDNA wurde bei -20°C gelagert. 3.2.2. Polymerasenkettenreaktion (PCR) PCR-Untersuchungen wurden nach bekannten Standardprotokollen durchgeführt. Eine Etablierung der PCR auf die einzelnen Klone erfolgte dabei durch Variieren von Zyklenzahl und Annealingtemperatur. Der Prototyp des Ablaufes der PCR-Reaktion war dabei wie folgt: 1. 94°C/12 min

(Taq-Polymerase aktivieren) - 27 -

2. 94°C/1 min

(Denaturierung)

3. 55-70°C/1 min

(Annealingtemperatur

abhängig

vom

GC-Gehalt

der

Primer, Annealingtemperatur und Primer s. Tabelle 5) 4. 72°C/1-2 min

(Elongation; benötigte Zeit abhängig von der Länge des kodierenden Bereichs)

5. Wiederholung von Schritt 2 bis 4 für 35-40 Zyklen 6. Schritt: 72°C/9 min

(Endelongation)

7. 4°C/∞

3.2.3. Agarosegelelektrophorese zur Auftrennung von Nukleinsäuren Für DNA-Gele wurde 1xTAE-Puffer mit 1-2% Agarose gekocht, nach Abkühlung auf etwa 60°C mit 0,05 % EtBr versetzt und in einen vorbereiteten Gelträger gegossen. Als Elektrophoresepuffer wurde 1xTAE-Puffer eingesetzt. RNA-Gele wurden mit DEPC-Wasser gekocht. Vor dem Gießen wurden 10 % Formaldehyd

und

10xMOPS

zugesetzt,

welches

die

Ausbildung

von

Sekundärstrukturen bei der einzelsträngigen RNA verhindert. Ethidiumbromid wurde dabei nicht direkt dem Gel, sondern dem entsprechenden RNA-Laufpuffer zugesetzt. Zur Elektrophorese wurden die Gele mit DNA/RNA-Proben beladen und die Nukleinsäuren bei 40-100 V in der Elektrophoresekammer aufgetrennt. 3.3. Klonierung von PCR-Produkten

Zur Herstellung von Expressionskonstrukten werden zunächst die zu analysierenden Gene oder Genfragmente mit der PCR-Technik (Kapitel 3.2.2.) amplifiziert und in TOPO-Vektoren eingebracht. Daraufhin werden die Plasmide in kompentente Bakterien transformiert. Dies und eine nachfolgende Plasmidpräparation ermöglichen schließlich die Selektion und Vermehrung der richtigen cDNA. Orientierung und Identität der einklonierten Inserts werden dabei über einen Insert-unabhängigen Restriktionsenzymverdau (3.3.5.) und durch Sequenzierung (3.3.6.) kontrolliert.

- 28 -

3.3.1. TOPO-Vektor Zur Kontrolle und Sequenzierung werden die vervielfältigten, aufgereinigten und mittels Gelelektrophorese kontrollierten cDNA-Fragmente in einen TOPO-TA-Vektor eingebracht, einen unspezifischen Vektor mit T-Überhängen. In diesen kann das PCR-Produkt, welches mit A-Überhängen versehen ist, daraufhin eingefügt werden. Dazu wurden 0,5 μl TOPO-Vektor zu 2 μl PCR-Produkt pipettiert und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der Ansatz konnte nun zur Transformation kompetenter Bakterien verwendet werden. 3.3.2. Transformation kompetenter Bakterien E.coli Bakterien, die mit kaltem Kalziumchlorid (CaCl2) behandelt und anschließend kurz erwärmt werden, sind in der Lage Plasmid-DNA aufzunehmen [Cohen and Chang 1973]. Auf diese Weise gelingt es, Plasmide zur Expression in prokaryontische Zellen einzuschleusen oder durch Expansion des entsprechenden Bakterienklons massiv zu vermehren. Transformierte Bakterien werden dazu auf Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Unter Selektion aufwachsende Kolonien werden daraufhin gepickt und bezüglich des im Plasmid enthaltenen Inserts analysiert. Dies erfolgt mittels Plasmidpräparation in Form von TENS-Minis, Restriktionsenzymverdau und Sequenzierung zur Überprüfung der Identität des Inserts. 100 μl kompetente Bakterien wurden mit 1-3 μg Ligationsansatz oder Plasmid 30 Minuten auf Eis gestellt. Nach Erwärmung bei 42°C für 90 Sekunden und direkter Abkühlung (4°C) wurden 450 μl LB-Medium hinzugegeben und 1 h bei 37°C geschüttelt. 100-300 μl des Ansatzes wurden dann auf Agarplatten mit Antibiotikum zur Selektion ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. 3.3.3. Plasmid-Präparationen Die verschiedenen Verfahren der Plasmid-Präparationen dienen dazu, Plasmid-DNA ohne Anteile von RNA oder chromosomaler DNA aus den Bakterien zu isolieren und - 29 -

diese so für die weiteren Verfahren wie Restriktionsenzymverdau, PCR oder Sequenzierung zur Verfügung zu haben. Dabei unterscheiden sich die Präparationen in Ausbeute und Reinheit der gewonnenen Plasmid-DNA. 3.3.4. TENS-Minis Die TENS-Mini-Präparation ist eine schnelle Methode, bei der jedoch die erhaltene Plasmid-DNA eine geringe Reinheit aufweist und deshalb für die Sequenzierung nur bedingt geeignet ist. Eine einzelne Bakterienkolonie, die mit einem das gewünschte Insert tragenden Konstrukt transformiert wurde, wurde über Nacht in 3 ml LB-Selektionsmedium bei 37°C auf einem Schüttler kultiviert. Es wurden 1,5 ml der Kultur entnommen und 20 Sekunden lang bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf 50 – 100 μl abpipettiert. Danach wurden ca. 20 μl P1-Puffer + RNase zugegeben und der Ansatz wurde mittels Vortex vermischt. Nach Zugabe von 300 μl TENS-Puffer wurde erneut ca. 5 Sekunden lang mit dem Vortex gemischt. Daraufhin wurden 150 μl 3 M NaOAc mit einem pH von 5,2 zugegeben, dann wurde erst für 5 Sekunden gevortext und anschließend 4 Minuten lang bei 13.000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand, welcher die DNA enthält, wurde in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt und es wurde 1 ml 95 % Ethanol (Temperatur von -20°C) hinzugefügt. Der Ansatz wurde gemischt und 5 Minuten lang bei 13.000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das DNA-Pellet in 1 ml 70% Ethanol (-20°C) gewaschen, indem 2 Minuten bei 13.000 rpm zentrifugiert wurde. Ethanol wurde abgegossen und das Pellet an der Luft getrocknet und anschließend in 20 μl Aqua dest. resuspendiert. 3.3.5. Restriktionsenzymverdau von DNA-Konstrukten Der Restriktionsenzymverdau der Konstrukte ermöglicht eine Kontrolle der Aufnahme des Inserts in den Vektor. Dazu werden Restriktionsenzyme verwendet, die jeweils nur einmal auf beiden Seiten des Inserts in der MCS des Plasmids, in die das Insert einkloniert wurde, schneiden. Man erhält so - sofern keine interne Schnittstelle im Insert vorliegt - beim Auftragen auf ein Agarosegel eine Bande, die dem Plasmid - in - 30 -

diesem Fall dem TOPO-Vektor - entspricht und eine zweite, die das Insert darstellt. Über einen mitlaufenden Längenmarker ist dann eine Längenbestimmung der Fragmente möglich. Enthält das Insert interne Schnittstellen, so dass man ein, zwei oder mehrere Insertfragmente erhält, entspricht die Insertlänge der Summe der einzelnen Fragmente. Zusätzlich lässt sich über die Verwendung mehrerer Enzyme eine Kartierung des Inserts durchführen, die es später ermöglicht, optimal große Fragmente - zum Beispiel für die Herstellung einer Sonde - aus dem Insert herauszuschneiden. Als grundlegende molekularbiologische Methode findet der Restriktionsenzymverdau außerdem Anwendung bei der Klonierung von DNAKonstrukten. Über die Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme können beliebige DNA-Fragmente ausgeschnitten und in die entsprechend vorgeschnittenen Vektoren eingefügt werden. Zur Durchführung eines Verdaus wurde in einem geeigneten Volumen (20-50 μl) die zu verdauende Menge DNA mit dem zum Restriktionsenzym passenden Puffer angesetzt. Nach Zusatz der/des Restriktionsenzyme(s) erfolgte dann der Verdau bei 37°C für 1,5-2,5 Stunden (je nach DNA-Menge). Die optimale Funktionsfähigkeit des Restriktionsenzyms wurde bei einer Konzentration von 1-2 U Enzym pro μg DNA erreicht. Zum Verdau der TOPO-Klone wurde das Restriktionsenzym EcoRI verwendet. Der Restriktionsenzymverdau wurde mittels Gelelektrophorese (3.2.3.) überprüft. 3.3.6. DNA-Sequenzierung Die Sequenzierung der Klone erfolgte nach der Didesoxynukleotidmethode, die erstmals von Sanger beschrieben wurde [Sanger et al. 1977]. Diese Methode basiert darauf, dass 2`,3`-Didesoxynukleotidtriphosphate (ddNTPs) zwar über ihre 5`-Triphosphatgruppe in eine neue Nukleinsäurekette eingebaut werden können, eine weitere Velängerung der Kette jedoch aufgrund des Fehlens der OH-Gruppe in 3`-Position der Desoxyribose nicht möglich ist und es so zum Kettenabbruch kommt („Stopnukleotide“). Erstellt man nun einen Reaktionsansatz aus zu sequenzierendem Template, Primer, DNA-Polymerase, ddNTPs und - 31 -

Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs), kommt es bei einer geeigneten Temperatur zunächst zur Anlagerung des Primers an die komplementäre Region des Templates („Annealing“). Anschließend erfolgt durch die DNA-Polymerase ein Anbau von dNTPs am 3`-Ende des Primers mit Verlängerung der Kette; bei Einbau eines ddNTPs kommt es jedoch zum Kettenabbruch. Über das Verhältnis von ddNTPs zu dNTPs kann man die Wahrscheinlichkeit des Abbruchs einer in der Verlängerung befindlichen Kette beeinflussen. Man erhält deshalb durch exakte Einhaltung eines definierten Verhältnisses von dNTPs zu ddNTPs am Ende der Reaktion ein Gemisch aus vielen verschiedenen Oligonukleotiden, die sich in ihrer Länge jeweils um genau eine Base unterscheiden, da für jede Position dieselbe Wahrscheinlichkeit eines Kettenabbruches besteht. Durch Verwendung fluoreszensmarkierter Primer lässt sich dann, nach Auftrennung des Reaktionsgemisches in einer hochauflösenden Gelelektrophorese, die genaue Nukleinsäuresequenz ermitteln. Nachdem durch Sequenzierung sichergestellt wurde, dass die TOPO-Klone die gewollten Inserts enthalten, wurden diese mit Hilfe eines Restriktionsenzymverdaus (3.3.5) isoliert. Dazu wurden die Enzyme EcoRI und XhoI bzw. die kompatiblen Enzyme MunI und SalI verwendet. Daraufhin erfolgte eine Aufreinigung des spezifischen Restriktionsenzymverdaus mittels Gelelektrophorese (3.2.3.) Dazu wurde ein DNA and Gel Purification Kit von Amersham Biosiences verwendet. Dabei wurden die entstandenen Gen-FragmentBanden ausgeschnitten, mit Capture Puffer vollständig bedeckt und bei 60°C aufgelöst. Nach einem kurzen Spin down wurde der Ansatz auf eine Säule gegeben und nach Ablauf einer Minute eine Minute lang bei 13.000 rpm zentrifugiert. Nach Zugabe von 500 μl Waschpuffer wurde nach einer Minute erneut einer Minute lang bei 13.000 rpm zentrifugiert. Die Säule wurde auf ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und es wurde TE-Puffer oder Aqua dest dazupipettiert. Nach Ablauf einer Minute wurde eine Minute lang bei 13.000 rpm zentrifugiert. Damit waren die Gen-Fragmente bereit zur Ligation in Phagen.

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3.3.7. Ligation von DNA-Fragmenten Die DNA-Ligase des Bakteriophagen T4 ist in der Lage, DNA-Moleküle mit kompatiblen kohäsiven Enden miteinander zu verbinden, indem sie die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen freien 3`-Hydroxyl und 5`-Phosphat Enden der DNA katalysiert [Richardson et al. 1968]. Über Restriktionsenzyme erzeugte kompatible Enden können so miteinander verknüpft werden, so dass die gezielte Herstellung von DNA-Konstrukten möglich ist. Zur Ligation pipettiert man folgenden Ansatz: 2 μg geschnittene Vektor-DNA 4 μg geschnittene Insert-DNA 1 μl T4 Ligase 10xPuffer 1 μl T4 DNA-Ligase ad 10 μl H2O Man inkubiert 12-16 h bei 14°C und kann die Ligation dann zur Phagenverpackung (oder zur Transformation kompetenter Bakterien) verwenden. 3.3.8. Phagenverpackung Um die Phagen-DNA-Konstrukte in Bakterien einbringen zu können, müssen sie erst in Phagenköpfe verpackt werden. Dazu wurde 1 µl Ligationsansatz (Ligation in Phage) zu 1 Verpackungsansatz (dieser entspricht den Phagenköpfen) (~50 µl) pipettiert und 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 300 µl SM-Puffer (dieser stoppt die Reaktion und verdünnt den Ansatz) und 1-2 Tropfen Chloroform hinzugefügt (dadurch fallen überschüssige Hüllproteine aus). Vor Gebrauch wurde der Ansatz ca. 1 Minute bei 13.000 rpm abzentrifugiert. Danach wurden E.coli Bakerien, welche die Phagen aufnehmen sollen (in diesem Fall XL1-Mg2+-Bakterien), mit den Phagen transfiziert. Je 600 µl dieses Ansatzes wurden nun auf LB-Platten ausplattiert. Da die Phagenköpfe erst nach der Amplifikation stabil sind, müssen Verpackung und Ausplattieren am selben Tag stattfinden.

- 33 -

3.3.9. Platteneluat Die Klone, die das richtige Insert enthielten, wurden auf einer neuen Agarplatte ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Durch Elution der Phagenplatten mit 7 ml SM-Puffer für 4 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler diffundierten die Phagen ins flüssige Medium, das nach Ablauf der Zeit in ein Falcon überführt wurde. Die Phagen wurden von Zelltrümmern mittels Zentrifugation bei 4000 rpm getrennt. Der Überstand wurde in ein neues Falcon überführt und mit Chloroform versetzt, um das Wachsen neuer Bakterien zu verhindern. Der Überstand stellte das Material für das folgende Screening dar. 3.3.10. Kontrolle Vor dem Platteneluat wird eine Überprüfung des Inserts bezüglich des Leserahmens vorgenommen. Dazu werden nach der Phagenverpackung einzelne Phagenklone gepickt und mittels in-vivo-Excision in Phagemide umgewandelt. 3.3.10.1. In-Vivo-Excision Durch die In-Vivo-Excision [Short et al. 1988] ist es möglich, den filamentären, 39 kB großen Lambda-ZAP-Express-Vektor, in den die cDNA einkloniert wurde, mit Hilfe eines Helferphagen in das nur noch 4518 bp große, zirkuläre pBK-CMV Phagemid umzuwandeln, welches dann die entsprechenden Inserts enthält. Dies geschieht durch Koinfektion eines E.coli-Stammes mit dem ZAP-Express-Vektor und einem Helferphagen, dessen Proteine zunächst eine im ZAP-Vektor enthaltene DNASequenz erkennen (Initiator) und dort einen der beiden DNA-Stränge schneiden. Von hier erfolgt eine Replikation der DNA nach 3´ bis zu einer von Helferphagenproteinen erkannten Terminationsstelle, an der die Replikation dann abbricht. Die so erhaltene DNA, die alle für das pBK-CMV-Phagemid notwendigen Sequenzen sowie die klonierten Inserts enthält, wird dann durch ein weiteres Helferphagenprotein zirkularisiert und kann mit den unter 3.3.3. geschilderten Verfahren der PlasmidPräparationen aus den entsprechenden Bakterienstämmen gewonnen werden. Der Vorteil in der weiteren Verwendung des pBK-CMV-Phagemids liegt in der geringeren - 34 -

Größe, welche sowohl die Replikation in bakteriellen Wirtszellen, als auch die verschiedenen Verfahren der Plasmid-Präparationen und die daran anschließenden Arbeitsschritte erleichtert. Außerdem ist mit ihm eine Expression von Genen sowohl im eukaryontischen, als auch im prokaryontischen System möglich. Die Durchführung der In-Vivo-Excision erfolgte gemäß dem Protokoll des Herstellers des verwendeten ZAP Express® cDNA Synthesis Kit (Stratagene; La Jolla; US).

Abbildung 5: In-Vivo-Excision

Die Phagemide wurden erneut in Bakterien eingebracht, ausplattiert und über Nacht bei

37°C

inkubiert.

Die

Insert-Gene

wurden

erneut

mittels

TENS-Minis,

Restriktionsenzymverdau und Gelelektrophorese aus den Phagemiden isoliert und sequenziert. Dabei wurde die Richtigkeit des Leserahmens überprüft. War dieser korrekt, konnte das Platteneluat durchgeführt werden.

- 35 -

3.4. Das immunologische Screening: SEREX

3.4.1. Vorbereitung der Patientenseren Da Escherichia coli-Bakterien, in denen die Proteine zum Screening exprimiert werden,

zu

den

physiologischen

Bewohnern

des

menschlichen

Gastro-

intestinaltraktes gehören, ist es notwendig, die in zum Screening verwendeten Seren vorhandenen Antikörper gegen E.coli herauszufiltern, um die Anzahl falsch positiver Klone und den Gesamthintergrund der enzymatischen Entwicklungsreaktion zu minimieren.

Eine

Aufreinigung

der

Patientenseren

erfolgt

deshalb

durch

Präabsorption der Seren gegen E.coli-Proteine über Affinitätssäulen und lytische Folien. 3.4.1.1. Präabsorption über Affinitätssäulen Zur Herstellung mechanischer Säulen löst man das Pellet einer über Nacht aufgewachsenen 50 ml XL1-Blue-Kultur in 5 ml PBS und sonifiziert die Lösung zur Zerstörung der Bakterienwände 5x8 Sekunden. Transfiziert

man

außerdem

einen

Teil

der

über

Nacht

aufgewachsenen

Bakterienkultur mit nicht-rekombinanten lytischen Phagen, erhält man nach Sonifikation eine Suspension, in der nicht nur Proteine des normalen E.coliStoffwechsels enthalten sind, sondern auch E.coli-Stressproteine, sowie Proteine filamentärer Phagen gegen die dann eine Vorabsorption erfolgen kann (lytische Säulen). Hierzu wurde das Pellet einer Bakterienkultur in 5 ml LB-Tetracyclin-Medium gelöst, mit 500 μl einer Phagenlösung transfiziert und nach einer Inkubation von 4 h/37°C auf

einem

Horizontalschüttler

mit

den

in

weiteren

5

ml

LB-Tet-Medium

aufgenommenen restlichen Bakterien der Kultur, inkubiert. Nach nochmaliger Inkubation (2 h/37°C) konnte diese lytische Bakterienlösung sonifiziert werden. Mit beiden Bakterienansätzen wurden Glutardialdehyd-aktivierte Silikamatrices durch Inkubation (4 h/RT) auf einem Überkopfrotor beladen. Nach Abwaschen der überschüssigen Bakteriensuspension mit 100 ml TBS wurden Säulen mit diesen Matrices bestückt.

- 36 -

Zur Aufreinigung wurden die Seren 1:100 in TBS verdünnt und dann jeweils 8 h über eine mechanische und eine lytische Säule geführt. 3.4.1.2. Präabsorption über lytische Folien Zur Herstellung lytischer Folien wurden 600 μl einer XL1-Blue Arbeitslösung mit nicht-rekombinantem Lambda-ZAP II Phagen transfiziert und dieser Ansatz auf LBPlatten ausplattiert. Die in Form von lytischen Plaques exprimierten Proteine wurden dann wie unter 3.4.3.1. beschrieben auf Nitrocellulosefolie geblottet und mit 5 % Magermilch geblockt. Über Säulen präabsorbierte Seren wurden jeweils 4 Stunden mit insgesamt 4 Nitrocellulosefolien bei 4°C inkubiert und dann für den weiteren Screeningeinsatz mit 0,1 % Magermilch / 0,1 % Natriumacid in TBS auf eine Endkonzentration von 1:100 verdünnt. 3.4.2. Präparation der bakteriellen Wirtszellen 3.4.2.1. Vorbereitung der Bakterien für die Transfektion mit Phagen XL1-Blue Bakterien wurden auf LB-Tet-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C aufwachsen gelassen. Mit einer der aufgewachsenen Kolonien wurde eine 50ml Kultur angeimpft (LB-Tet-Medium mit Magnesiumsulfat 2,5 ml/0,2 M und Maltose 2,5 ml/10 %). Nach Erreichen der logarhithmischen Wachstumsphase (= OD (optische Dichte) von 0,5-0,6 bei λ=600 nm) wurden die Bakterien pelletiert (RT/10 min/1800 rpm), in Magnesiumsulfat 0,01 M auf eine OD von 0,5 eingestellt und für Transfektionen mit Phagen benutzt (XL1-Blue Arbeitslösung).

3.4.3. Das Screening 3.4.3.1. Transfektion der Bakterien und Blotten der exprimierten Proteine Zur Transfektion wurden 600 μl einer XL1-Blue Arbeitslösung mit 3000 bis 4000 pfu Phagen aus der cDNA-Expressionsbank gemischt, der Transfektionsansatz bei 37°C/15 min inkubiert und dann in 5 ml flüssigem Top-Agar (50°C) auf vorgewärmte

- 37 -

LB-Tetracyclin-Platten unter Zugabe von IPTG (20 μl/2 M) ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, wobei 1-2 mm große lytische Plaques entstanden, welche klonal angereichert die von den Bakterien exprimierten Proteine enthielten. Durch Auflegen einer Nitrocellulosefolie und anschließende Inkubation bei 37°C/1,5 h erfolgte dann das Blotten der Proteine auf die Nitrocellulosefolie. 3.4.3.2. Waschen und Blocken der Nitrocellulosefolien Bevor die Nitrocellulosefolien nun mit Patientenserum inkubiert werden konnten, mussten

unspezifische

Nitrocellulosefolien

Bindungen

abgenommen

geblockt

und

nach

werden.

Dazu

sorgfältigem

wurden

die

Freiwaschen

von

Agarresten durch Abstreifen mit TBS-T für 1 h in 5%iger Milch/TBS geblockt. Auch danach

erfolgte

wieder

sorgfältiges

Abstreifen

und

Waschen

auf

einem

Horizontalschüttler für 3x15 min in TBS, bevor die Folien mit Serum ausgetestet werden konnten. 3.4.3.3. Inkubation mit allogenen Seren und Detektion gebundener Antikörper Die Nitrocellulosefolien wurden in Petrischalen ausgelegt und mit jeweils 20 ml des vorbehandelten Serums (Kapitel 3.4.1.) überschichtet. Während der über Nacht erfolgten Inkubation bei 4°C banden die im Serum vorhandenen Antikörper an die auf die Folien geblotteten rekombinanten Proteine. Eine Detektion der spezifisch gebundenen Antikörper erfolgte nach

extensivem Waschen der Folien (3x15

min/TBS) mit Hilfe eines sekundären, gegen das Fc-Fragment der Serumantikörper gerichteten Antikörpers (anti-human-IgG, AP konjugiert), der für eine Stunde 1:2500fach in 0,5 % Milch /TBS verdünnt mit den Folien inkubiert wurde. Nach erneutem Waschen der Folien wurden die gebundenen Antikörperkomplexe über die an den sekundären Antikörper konjugierte alkalischen Phosphatase (AP) sichtbar gemacht. Bei dieser enzymatischen Farbreaktion wandelt das Enzym die Substrate 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat (BCIP) und Nitroblue-Tetrazoliumchlorid (NBT) im alkalischen Milieu in farbige Reaktionsprodukte um, die an der Stelle der Antikörperbindung präzipitieren. Dazu wurden 15 ml Substrat enthaltende alkalische Entwicklerlösung (CDS mit 10 mg/100 ml NBT und 5 mg/100 ml BCIP) auf die Folien

- 38 -

gegeben. Anschließend wurde unter Lichtschutz entwickelt bis gut sichtbare Reaktionen entstanden. 3.4.3.4. Testauswertung Als primär positiv wurden solche Klone gewertet, die sich in der Intensität der Farbreaktion auf der Nitrocellulosefolie deutlich von den umliegenden Klonen unterschieden.

Abbildung 6: Beispiel für SEREX: Der positive Klon ergibt ein deutlich sichtbares Signal; die schwachen Signale repräsentieren Hintergrundfärbung.

4. Reagenzien λ-ZAP-Express Phage

Stratagene, Cedar Creek, Canada

Agarose für DNA-Elektrophorese

Sigma, St. Louis

Anti-human-IgG-Fc, AP-konjugiert

Dianova, Hamburg

Bitek-Agar

Difco, Detroit

Chloroform

Merck, Darmstadt

Dimethylformamid

Merck, Darmstadt

DNA and Gel Purification Kit

Amersham Biosiences, Freiburg

Ethanol

Merck, Darmstadt

5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP)

Biomol, Hamburg

Glutardialdehyd-aktivierte Silicamatrix

Boehringer, Mannheim

- 39 -

Gelatine

Merck, Darmstadt

Glycin

Merck, Darmstadt

Isopropylthiogalactosid (IPTG)

Biomol, Hamburg

Magermilchpulver

Saliter, Obergünzburg

Magnesiumsulfat-Heptahydrat

Merck, Darmstadt

Maltose

Sigma, St. Louis

MOPS

Sigma, St. Louis

NaN3

Merck, Darmstadt

Natriumchlorid

Merck, Darmstadt

Nitroblue-Tetrazoliumchlorid (NBT)

Biomol, Hamburg

Nitrozellulosefolie

Sartorius, Göttingen

Phagenklone

RZPD, Berlin

RNeasy Kit

Qiagen, Hilden

Tetrazyklin

Boehringer, Mannheim

Thimerosal

Sigma-Aldrich, Diesenhofen

TOPO-Kit

Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien

Trishydrochlorid (TrisHCL)

Sigma, St. Louis

Trishydroxymethylaminomethan (TrisBase)

Sigma, St. Louis

Yeast-Extract

Difco, Detroit

5. Puffer und Medien CDS: 5,8 g NaCl 1 g MgCl2 12,1 g TrisBase - ad 1 l Aqua dest. - pH auf 9,5 einstellen Luria-Bertoni (LB)-Medium: 10 g Trypton 5 g Yeast-Extract

- 40 -

10 g NaCl - ad 1 l Aqua dest. LB-Agar: 10 g Trypton 5 g Yeast-Extract 10 g NaCl 15 g Agar - ad 1 l Aqua dest. - autoklavieren - nach Abkühlung auf etwa 50ºC und Zugabe von Tetrazyklin in Petrischalen gießen LB-Medium: 10 g Trypton 5 g Yeast-Extract 10 g NaCl - ad 1 l Aqua dest. - autoklavieren LB-Komplett: 45 ml LB-Medium autoklaviert 2,5 ml MgSO4 0,2 M (sterilfiltriert) 2,5 ml Maltose 10% (sterilfiltriert) 62 μl Tetrazyklin eine Kolonie Bakterien MOPS-10x-Stammlösung: 42,8 g MOPS 6,8 g Na-Acetat 3,7 g EDTA - ad 1 l Aqua dest. - einstellen auf pH 7,0

- 41 -

PBS-Lösung: 8 g NaCl 0,2 g KCl 1,44 g Na2HPO4 0,24 g KH2PO4 - ad 800 ml Aqua dest. ⇒ ergibt 1l Lösung, sterilisieren SM-Phagenpuffer: 5,8 g NaCl 2 g MgSO4-Heptahydrat 50 ml Tris 1M pH 7,5 5 ml 2% Gelatine - ad 1 l Aqua dest. TBS-10x-Stammlösung: 87,8 g NaCl 60,0 g TrisHCl 14,0 g TrisBase - ad 1 l Aqua dest. TBS-T-10x-Stammlösung: 87,8 g NaCl 60,0 g TrisHCl 14,0 g TrisBase 5 ml Tween 20 - ad 1 l Aqua dest. Top-Agar: 500 ml LB-Medium autoklaviert 2 g Agar 2 g Agarose

- 42 -

V. Ergebnisse 1. Untersuchtes Patientenkollektiv Entsprechend der Auswahlkriterien wurden insgesamt 23 Patienten der RECOVERStudie der Deutschen Studiengruppe Non-Hodgkin-Lymphome ausgewählt. Dabei wurden 11 Patienten dem S-Arm zugeordnet, welche somit eine CHOP-Therapie erhielten, und 13 Patienten dem R-Arm. Diese erhielten eine Kombinationstherapie aus CHOP und Rituximab. Dabei wurden beiden Therapiearmen je 2 Patienten mit Follikulärem Lymphom und 9 bzw. 11 Patienten mit DLBCL zugeteilt. Tabelle 6 zeigt die den jeweiligen Therapiearmen zugehörigen Patienten mit Diagnose und Remissionsstatus zum Zeitpunkt der letzten Untersuchung.

Tabelle 6: Patienten LeipzigNr

Remissionsstatus

Therapie

61

CRu

8x CHOP-14

Diffus großzellig B – centroblastisch

CR

8x CHOP-14

Diffus großzellig B

498

Pro

8x CHOP-14

515

CR

8x CHOP-14

552

CR

8x CHOP-14

803

CR, Rezidiv

8x CHOP-14

960

Pro

8x CHOP-14

100

CR

6x CHOP-14

CRu

6x CHOP-14

1109

CR

6x CHOP-14

1311

CR

6x CHOP-14

325

CRu, Rezidiv

400

CRu

982

CR

S-Arm

89

R-Arm

569

8xCHOP-14 + 8x Rituximab 8xCHOP-14 + 8x Rituximab 8xCHOP-14 + 8x Rituximab

- 43 -

Diagnose

Diffus großzellig B – centroblastisch Diffus großzellig B – centroblastisch Diffus großzellig B – anaplastisch-großzellig (ALC) Diffus großzellig B – centroblastisch Follikulär III° + DLBL Diffus großzellig B – centroblastisch Follikulär III° Diffus großzellig B – centroblastisch Diffus großzellig B – centroblastisch Diffus großzellig B Follikulär III° Follikulär III°

1292

CRu

105

Rezidiv, Pro

113

Pro

291

CRu

345

CR

467

CR

600

CR

793

CRu

1020

Rezidiv, Pro

8xCHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab

Kein Referenzurteil, lt. Rando Diffus großzellig B Diffus großzellig B – immunoblastisch B-Zell-Reihe Diffus großzellig B – centroblastisch Diffus großzellig B – anaplastisch-großzellig (ALC) Diffus großzellig B – centroblastisch Diffus großzellig B Diffus großzellig B – centroblastisch B-Zell-Reihe

2. Methodisches Vorgehen am Beispiel der PKC-β Mit Hilfe der PCR-Technik ist es möglich, viele verschiedene Gewebe auf die Expression eines bestimmten Gens hin zu testen. Man schreibt dazu die mRNA eines Gewebes, die die Gesamtheit der in diesem Gewebe transkribierten Gene repräsentiert, mit Hilfe des Enzymes Reverse Transkriptase in cDNA um. Durch die Auswahl spezifischer Primer kann die Sequenz von Interesse durch PCR aus den cDNAs derjenigen Gene amplifiziert werden, die das entsprechende Transkript exprimieren. Die PKCβ-cDNA hat eine Länge von ca. 2000 bp und entstammt einer kommerziellen cDNA-Bank. Der PKC-Klon wurde als Einzelklon über das RZPD Berlin (Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung Berlin) bezogen und als Template für die nachfolgende PCR-Reaktion benutzt. Dabei wurden der sense-Primer 5’-GGCAATTGCATGGCTGACCCGGCTGCGGGG-3’ und der Antisense-Primer 5’-CTCGAGGCTCTTGACTTCGGGTTTTAAAAATTC-3’ verwendet. Beim Übergang vom β-Galactosidase-Gen des später zur Expression der PKC verwendeten λ-ZAP-Express-Phagen auf das PKC-Insert wäre das 3-Basenpaareumfassende Leseraster beim Einfügen des Inserts um 1 Nukleotid verschoben und somit würde kein korrektes Fusionsprotein gebildet werden. Daher musste der sense-primer angepasst werden, um einen durchgehenden, korrekten Leserahmen zu garantieren. Dazu wurde ein Nukleotid hinzugefügt, wobei besonders darauf geachtet wurde, dass kein Stopp-Codon entsteht.

- 44 -

#1

#2 #3 A

D

F

A

A

G

5’-GGC AAT TG C ATG GCT GAC CCG GCT GCG GGG-3’

#1: Schnittstelle des Restriktionsenzyms MunI #2: eingefügtes Nukleotid zur Korrektur des Leserahmens #3: ATG = Start-Codon der pKC-β, Met, und Beginn der pKC-Sequenz Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren zu selektiven Anreicherung definierter Nukleinsäuresequenzen aus einem Gemisch von Nukleinsäuremolekülen. Man nutzt dazu die Eigenschaften von DNA-Polymerasen, die einen Einzelstrang zum DNA-Doppelstrang aufpolymerisieren können, sofern ihnen ein kurzer, doppelsträngiger Bereich als Primer zu Verfügung steht. Durch Zugabe von zwei Oligonukleotidprimern (sense und antisense), die zum 5’- bzw. 3’-Ende der zu amplifizierenden Sequenz komplementär sind, und durch die Verwendung thermostabiler DNA-Polymerasen [Saiki et al. 1988] ist eine automatisierte Durchführung der PCR in programmierbaren Thermoblöcken möglich. Es kommt dabei

in

einem

dreiteiligen,

in

Zyklen

repetitierten

Reaktionsprozess

aus

Denaturierung der DNA-Doppelstränge, Primeranlagerung und Kettenverlängerung zur exponentiellen Vermehrung der gewünschten Sequenzen. Einhergehend mit der so erzielten hohen Sensivität der PCR besteht jedoch eine Anfälligkeit für Kontamination mit der Konsequenz falsch positiver Ergebnisse durch das Verschleppen von DNA in den Reaktionsansatz. Zur Kontaminationsprophylaxe sind daher UV-Bestrahlung von PCR-Arbeitsplätzen, Verwendung von Pipettenspitzen mit Filtereinsatz zum Schutz vor Aerosol-Kontamination und Vermeidung der Benutzung jeglicher DNA am PCR-Arbeitsplatz geeignet [Kwok and Higuchi 1989]. Nach erfolgter Reaktion wurden eine Kontrolle der PCR sowie eine Aufreinigung des Genmaterials mittels Gelelektrophorese durchgeführt (s. Abbildung 7). Dabei wandern größenabhängig negativ geladene Nukleinsäurefragmente unterschiedlich weit im elektrischen Feld. Durch die Verwendung von Ethidiumbromid (EtBr), einer sequenzunspezifisch

mit

Nukleinsäuren

interkalierende

Substanz,

die

bei

Bestrahlung mit UV-Licht (λ=300 nm) Licht der Wellenlänge 590 nm emittiert, können die

Nukleinsäuren

sichtbar

gemacht

und

Konzentration beurteilt werden.

- 45 -

bezüglich

Reinheit,

Größe

und

1

2

3

Abbildung 7: Gelelektrophorese zur PCRKontrolle; Spur 1: Längenmarker, Spur 2: PKC-PCRFragment, Spur 3: Negativkontrolle

Zur Kontrolle und Sequenzierung wurden die vervielfältigten, aufgereinigten und mittels Gelelektrophorese kontrollierten cDNA-Fragmente in einen TOPO-TA-Vektor eingebracht, in E.coli Bakterien transformiert und vervielfältigt. Um die PKCenthaltenden TOPO-Plasmide nun der Sequenzierung zuzuführen, wurden sie nach Vermehrung wieder aus den E.coli Bakterien entfernt. Dies wurde mithilfe der Plasmid Mini Präparation (=TENS-Minis) durchgeführt (s. Abbildung 8). Nach einem Verdau mit der Restriktionsendonuclease EcoRI konnten rekombinante Klone identifiziert werden. Diese wurden durch Sequenzierung verifiziert.

1

2

3

4

M

5

6

7 8

1 Vektorbande (3900 Bp) 2 Insertbande (ca. 2000 bp)

Abbildung 8: PKC-Plasmid-Präparation (TENS-Minis); Spur 2, 4, 5, 6, 7, 8: TOPO-Vektor + PKC-Bande = positive Klone, Spur 1, 3: ausschließlich TOPO-Vektor, PKC wurde hier nicht eingebaut - 46 -

Nachdem die Sequenzierung ergab, dass die richtige PKC-Sequenz amplifiziert wurde, konnte PKC weiterverwendet werden. Es wurden einige der positiven Klone (Spur 2, 4, 5 bis 8) ausgewählt und einem spezifischen Verdau zur Insertpräparation unterworfen. Dazu wurden die TOPOVektoren durch 2 spezifische Restriktionsenzyme (in diesem Fall MunI und XhoI) geschnitten und PKC wieder herausgetrennt, nun mit spezifischen Schnittstellen versehen. Der Ansatz wurde erneut per Gelelektrophorese aufgetrennt (s. Abbildung 9). 1

2

M

1 2

Abbildung 9: Insertpräparation: Entfernung des PKCFragmentes aus dem TOPO-Vektor; Bande 1: TOPOVektor, Bande 2: PKC-Fragment, der Pfeil markiert die 2000bp-Bande des Längenmarkers

Die PKC-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und aufgereinigt. Die Gelreinigung wurde erneut mittels Gelelektrophorese kontrolliert (s. Abbildung 10).

- 47 -

1

M

1

Abbildung 10: Überprüfung der Insertpräparation; Bande 1: aufgereinigtes PKC-Fragment, M: Längenmarker, der Pfeil markiert die 2000bp-Bande des Längenmarkers

Nun konnten die Ligation von PKC in λ-ZAP-Express-Phagen und die darauf folgende Phagen-Verpackung durchgeführt werden.

Abbildung 11: Vektorkarte des λ-ZAP-Express-Phagen

- 48 -

Abbildung 12: Ausschnitt aus der MCS des λ-ZAP-Express-Phagen

Danach wurden E.coli Bakterien mit dem Phagen transfiziert, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Es wurden unter Selektion gebildete Plaques gepickt und analysiert. Dies erfolgte mittels in-vivo-Excision (s. Abbildung 13), overnights, TENS Minis, erneutem Restriktionsenzymverdau und Sequenzierung zur Überprüfung des Inserts und des Leserahmens.

- 49 -

1

2

M

Abbildung 13: PKC-Plasmid-Präparation (TENS Minis) nach in-vivo-Excision; Spur 1: Leervektor, Spur 2: pKCKlon, M: Längenmarker, der Pfeil markiert die 2000bpBande des Längenmarkers

Die Sequenzierung zeigte einen korrekten Leserahmenübergang aus der βGalactosidase in die pKC-β und somit die Expression des gewünschten Fusionsproteins. Die entsprechenden Phagenklone konnten nach Amplifikation für das immunologische Screening verwendet werden.

Abbildung 14: Sequenzierung des pKC-Plasmids nach in-vivo-Excission sowie die entsprechende Aminosäuresequenz.

- 50 -

3. SEREX Die von Pfreundschuh und Mitarbeitern etablierte Methode des SEREX (SErological identification of antigens by Recombinant EXpression cloning) [Sahin, Tureci et al. 1997] stellt eine serologische Methode dar, Tumorantigene allein aufgrund ihrer Immunogenität

und

der

Immunantwort

molekular

dadurch zu

hervorgerufenen

identifizieren.

Dabei

autologen wird

humoralen

aus

frischem

Tumorbiopsiematerial eine cDNA-Bibliothek hergestellt und direktional in einen λPhagen-Expressionsvektor kloniert. Durch lytische Transfektion von Escherichia coli mit den rekombinanten Phagen entstehen rekombinante Proteine in lytischen Plaques, die dann auf Nitrocellulose geblottet und anschließend mit verdünntem Patientenserum inkubiert werden. Klone, die mit IgG-Antikörpern der Patienten reagieren, können mit einem Enzym-konjugierten sekundären Antikörper gegen humanes IgG schließlich detektiert, durch weitere Subklonierungen isoliert und nach Überführung in die Plasmidform molekularbiologisch charakterisiert werden.

Abbildung 15: Schema der SEREX-Methode Es wurden XL1-Blue Mg2+-Bakterien mit rekombinanten Phagen transformiert, zusammen mit IPTG, einem Induktor für das Lactose-Operon von E.coli Bakterien, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. (IPTG aktiviert dabei das Operon und

- 51 -

damit die Translation des Gens, wird jedoch im Gegensatz zu Lactose nicht abgebaut, so dass die IPTG-Konzentration gleich und das Gen aktiv bleibt.) Dabei entstanden lytische Plaques, welche die von den Bakterien exprimierten Proteine enthielten.

Diese

wurden

durch

Auflegen

einer

Nitrocellulosefolie

und

anschließenden Inkubation bei 37°C für 3 Stunden geblottet. Nach Waschen und Blocken der Folien mit Milch/TBS zur Blockierung unspezifischer Bindungen wurden die Filter über Nacht bei 4°C mit den Patientenseren inkubiert. Die Detektion der eventuell vorhandenen, spezifisch gebundenen Antikörper erfolgte nach Entfernung der Seren und erneutem Waschen mit Hilfe eines sekundären Antikörpers (anti-human-IgG, Alkalische Phosphatase-konjugiert), der gegen das FcFragment der Serumantikörper gerichtet ist. Nach erneutem Waschen der Folien wurden eventuell gebundene Antikörperkomplexe über die an den sekundären Antikörper konjugierte Alkalischen Phosphatase (AP) sichtbar gemacht, indem das Enzym in einer enzymatischen Farbreaktion die Substrate 5-Bromo-4-Chloro-3Indolylphosphat (BCIP) und Nitroblue-Tetrazoliumchlorid (NBT) im alkalischen Milieu in farbige Reaktionsprodukte umwandelt, die an der Stelle der Antikörperbindung präzipitieren.

4. Immunantworten gegen DLBCL-assoziierte Antigene Bei der Untersuchung der ausgewählten Genprodukte hinsichtlich Antikörperbildung wurde nur bei 3 Patienten eine Immunreaktion beobachtet (s. Abbildung 16).

Abbildung 16: Positive Klone

- 52 -

Diese Patienten sind in Tabelle 7 gelb unterlegt. 1 Patient wurde mit 6 Zyklen CHOP14 therapiert, die anderen beiden Patienten jeweils mit 8 Zyklen CHOP-14 in Kombination mit 8x Rituximab.

- 53 -

Tabelle 7a: Patienten mit Antikörperbildung, Behandlung ausschließlich mit Chemotherapie LeipzigNr

IPI

Staging

Remissionsstatus

Gesamt-ÜZ

Ereignisfreie ÜZ

Therapie

61

0

II NE

CRu

4y 10m; +

4y 10m

8x CHOP-14

Diffus großzellig B – centroblastisch

89

0

II NE

CR

5y 7m; +

5y 7m

8x CHOP-14

Diffus großzellig B

498

0

III NE

CR

4y 3m; +

4y 3m

8x CHOP-14

515

1

IV NE

CR

4y 5m; +

4y 5m

8x CHOP-14

552

0

IN

CR

4y 4m; +

4y 4m

8x CHOP-14

803

0

III N

CR, Rezidiv

4y; +

1y

8x CHOP-14

960

2

III NE

Pro

1y 1m; #

-

8x CHOP-14

100

2

III N

CR

5y 9m; +

5y 9m

6x CHOP-14

569

0

III N

CRu

4y 2m; +

4y 2m

6x CHOP-14

1109

2

II E

CR

3y 8m; +

3y 8m

6x CHOP-14

1311

0

II N

CR

2y 2m; +

2y 2m

6x CHOP-14

ÜZ: Überlebenszeit

#: verstorben

+: unverändert

- 54 -

Diagnose

Diffus großzellig B – centroblastisch Diffus großzellig B – centroblastisch Diffus großzellig B anaplastisch-großzellig (ALC) Diffus großzellig B – centroblastisch Follikulär III + DLBL Diffus großzellig B – centroblastisch Follikulär IIIa Diffus großzellig B – centroblastisch Diffus großzellig B – centroblastisch

Bcl2- IHC + + n.d. + (partiell) + + n.d. neg. + n.d. +

Tabelle 7b: Patienten mit Antikörperbildung, Behandlung mit einer Kombination aus Chemotherapie und Rituximab LeipzigNr

IPI

Staging

Remissionsstatus

Gesamt-ÜZ

Ereignisfreie ÜZ

325

1

IN

CRu, Rezidiv

3y 1m; +

1y 5m

400

0

III N

CRu

3y 8m; +

3y 8m

982

2

IN

CR

2y 1m; +

2y 1m

1292

2

IV NE

CRu

1y 8m; +

1y 8m

105

1

IV NE

Rezidiv, Pro

2y 2m; #

1y 9m

113

2

IE

Pro

8m; #

-

291

0

IN

CRu

5y 2m; +

5y 2m

345

0

IN

CR

4y 5m; +

4y 5m

467

0

IN

CR

3y 9m; +

3y 9m

600

0

IE

CR

3y 11m; +

3y 11m

793

1

III N

CRu

3y 7m; +

3y 7m

1020

1

II NE

Rezidiv, Pro

2y 4m; #

2y 1m

ÜZ: Überlebenszeit

#: verstorben

+: unverändert

- 55 -

Therapie 8xCHOP-14 + 8x Rituximab 8xCHOP-14 + 8x Rituximab 8xCHOP-14 + 8x Rituximab 8xCHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab 6x CHOP-14 + 8x Rituximab

Diagnose

Bcl2- IHC

Diffus großzellig B

+

Follikulär IIIb

+

Follikulär IIIa

+

kein Referenzurteil, lt. Rando Diffus großzellig B Diffus großzellig B – immunoblastisch B-Zell-Reihe Diffus großzellig B – centroblastisch Diffus großzellig B – anaplastisch-großzellig (ALC) Diffus großzellig B – centroblastisch

n.d. + (partiell) + + + +

Diffus großzellig B

neg.

Diffus großzellig B – centroblastisch

neg.

B-Zell-Reihe

+

Die Antikörper waren bei den immunreaktiven Patienten in allen 3 Proben, also zu Beginn der Therapie, nach ungefähr 3 Monaten sowie nach ungefähr 6 bis 9 Monaten nachweisbar. In diesem Fall ist also von einer therapieunabhängigen Antikörperbildung auszugehen. Auch die Antikörpertiter blieben unverändert: Patient Nr. 569: 1:103 Patient Nr. 982: 1:103 Patient Nr. 1292: 1:105

6.00

Serumtiter [log.]

5.00

4.00 Pat. 569 3.00

Pat. 982 Pat. 1292

2.00

1.00

0.00 Vor Therapie

Nach 3 Monaten

Nach 6-9 Monaten

Nach 47 Monaten

Nach 60 Monaten

Zeitpunkt der Titerkontrolle

Abbildung 17: Graphische Darstellung der Titerverläufe Folgeuntersuchungen ergaben leicht abfallende Antikörpertiter bei 2 von 3 Patienten, vom dritten Patienten konnte kein weiteres Material erhalten werden. Bei 2 dieser 3 Patienten konnte durch IHC des Tumors BCL2-Protein nachgewiesen werden; der Tumor des dritten Patienten wurde in dieser Hinsicht nicht untersucht. Umgekehrt ist aber ebenfalls festzuhalten, dass nicht jeder in der IHC BCL2-positive Tumor eine Immunantwort gegen BCL2 hervorruft.

- 56 -

Die Antikörperbildung erfolgt ausschließlich gegen das durch BCL2 kodierte Protein; es wurden keine Antikörper gegen die anderen elf Gene nachgewiesen. Die Diagnosen der 23 Patienten teilen sich wie folgt auf: 19x DLBCL, 4x Follikuläres Lymphom. Von den 4 Patienten mit Follikulärem Lymphom III° war bei zweien eine Antikörperbildung erkennbar, von den 19 Patienten mit DLBCL bei einem. Zur Überprüfung der statistischen Relevanz dieses Befundes hinsichtlich Follikulärem Lymphom wurden weitere Untersuchungen ausschließlich mit Patienten mit der Diagnose Follikuläres Lymphom durchgeführt. Dabei wurden nur bei einem von 20 Patienten Antikörper gegen BCL2 gefunden, so dass nicht von einem statistisch relevanten Bezug zwischen BCL2-Immunantwort und DLBCL bzw. Follikulärem Lymphom III° ausgegangen werden kann. Die Untersuchung der Seren von 20 gesunden Spendern zeigte kein positive Immunantwort gegen das BCL2-Protein.

- 57 -

VI. Diskussion und Perspektiven Die Auswahl der in dieser Arbeit verwendeten Gene beruht auf Vordaten anderer Studien, welche mit Hilfe von cDNA-Mikroarray-Analysen ermittelt wurden. Die dadurch erzielten Hybridisierungsergebnisse stellen sowohl Effekte innerhalb des kodierenden Bereichs als auch solche im nicht-translatierten Genbereich dar. Allerdings erlaubt diese Untersuchungsmethode keine Aussage über eine Änderung der Proteinexpression oder über eine mögliche immunogene Wirkung der Genprodukte. Für eine immunologische Charakterisierung bietet die SEREXMethode als besonders effizientes Analyseverfahren gute Möglichkeiten größere Patientenkollektive zu screenen und damit als Grundlage weiterer Untersuchungen zu dienen.

In dieser Arbeit wurden insgesamt 11 - in den Vordaten auffällige - Gene für die SEREX-Analyse ausgesucht und hinsichtlich ihrer Immunogenität bei NHL-Patienten im Zusammenhang mit der durchgeführten Therapie analysiert.

Es wurde nur bei 3 Patienten eine Antikörperbildung gegen die untersuchten Genprodukte detektiert; diese war ausschließlich gegen das durch BCL2-kodierte Protein gerichtet. Es wurde keine Antikörperbildung gegen die Produkte der anderen 10 Gene detektiert.

Trotz positiver oder partiell positiver BCL2-Immunhistochemie bei 16 der Patienten fand nur bei 3 eine Antikörperbildung statt. Es besteht also kein direkter Zusammenhang zwischen BCL2-Exprimierung und Auftreten von Antikörpern.

Es ist nicht bekannt, ob bei den 3 Patienten mit positiver Immunreaktion auf BCL2 eine Mutation des BCL2-Gens vorliegt. Es wäre möglich, dass ein Zusammenhang zwischen Auftreten einer Mutation und Antikörperbildung oder auch zwischen fehlender Mutation und Antikörperbildung besteht.

- 58 -

Die beobachteten BCL2-Antikörpertiter sind zu jeden Zeitpunkt unverändert: sowohl vor Beginn der Therapie als auch 3 bzw. 6 bis 9 Monate nach Ende der Therapie. Es handelt sich hierbei offensichtlich um eine Immunantwort, die vom Rituximab-Zusatz zur Therapie unabhängig war. Da bereits gezeigt werden konnte, dass gesunde Spender höchstwahrscheinlich keine Antikörper gegen das BCL2-Protein ausbilden, handelt es sich hierbei jedoch um eine tumorgetriggerte Immunantwort.

Pulford et al. wiesen mittels Immunpräzipitation BCL2-Antikörper im Serum mit einem Titer von maximal 1:100 bei Patienten mit Follikulärem Lymphom nach. Außerdem zeigte eine Kontrollgruppe bestehend aus Patienten mit anderen, nicht weiter spezifizierten Karzinomen ebenfalls eine, wenn auch deutlich geringer ausgeprägte, Immunantwort gegen BCL2, wobei die gesunden Kontrollseren keine BCL2Antikörper aufwiesen [Pulford et al. 2002]. Es stellt sich die Frage, inwiefern auch andere Tumorentitäten bezüglich BCL2 immunogen sein könnten. Allerdings ist die von Pulford angewandte Methode der Immunpräzipitation sehr artefaktanfällig. Auch die Spezifität der Antikörper bei solch niedrigen Titern ist fraglich. Demzufolge ist ein Vergleich mit den Daten, die in der vorliegenden Arbeit erhoben wurden, nur eingeschränkt möglich.

Andersen et al. konnten zudem spontane T-Zell-Aktivitäten zytotoxischer T-Zellen gegen BCL2-Epitope bei Patienten mit unterschiedlichen Tumorleiden, z.B. Pankreas-CA, Mamma-CA, AML und CLL, nachweisen. Diese T-Zell-Antworten wurden ausschließlich bei Patienten, die zuvor mit einer Chemotherapie behandelt wurden, detektiert. Weder Patienten, die eine antihormonelle Therapie erhielten, noch Patienten mit einem Tumorleiden vor Therapiebeginn, zeigten eine T-ZellImmunantwort gegen BCL2-Epiptope [Andersen et al. 2005].

Es wird also deutlich, dass die von Andersen et al. nachgewiesene T-Zell-Reaktion therapieabhängig nach Chemotherapie auftreten, wohingegen die in dieser Arbeit detektierte B-Zell-Antwort mit Antikörperbildung schon vor Therapiebeginn auftrat. Die Ursache für die T-Zell-Antwort könnte in einer durch eine Chemotherapie induzierten Steigerung der BCL2-Expression bzw. auch in einer Induktion oder - 59 -

Verstärkung

einer

Immunantwort

liegen.

Da

die

Antikörper

jedoch

vor

Therapiebeginn bereits vorhanden waren und die Titerverläufe unter Therapie gleich blieben, hat dieser Effekt wahrscheinlich keine Auswirkungen auf die B-Zell-Antwort.

Eine auf dem BCL2-Effekt basierende Immuntherapie zusätzlich zu einer Chemotherapie könnte einen synergistischen Effekt und damit eine Verbesserung des Ansprechens auf die Therapie bewirken.

Bisher ist die BCL2-induzierte Antwort zytotoxischer T-Zellen verglichen mit einer anti-viralen Immunantwort deutlich geringer und könnte zu wenig ausgeprägt sein um eine klinisch bedeutsame Immunreaktion auszulösen. Es wäre jedoch möglich, die autoreaktive Immunantwort mit Hilfe einer Vakzine zu steigern. Die in dieser Arbeit detektierten Antikörper könnten – nach Extraktion – dazu dienen eine Immunreaktion direkt zu verstärken. Es wäre z.B. denkbar, dass eine Gabe von extrahierten und aufgereinigten Antikörpern bei einer bestimmten Patientengruppe mit hoher Tumorlast eine Unterstützung der Standardtherapie darstellen könnte. Die Definition der B-Zell- sowie der T-Zell-Epitope ist außerdem Voraussetzung für eine polyvalente Anti-BCL2-Vakzine.

Es stellt sich ferner die Frage, in wie weit die vorhandenen Antikörper die Prognose der Patienten beeinflussen. Da alle 3 Patienten sich bisher im Zustand der Komplettremission befinden, ist ein positiver Effekt denkbar. Aufgrund der Tatsache, dass das untersuchte Zeitintervall jedoch relativ kurz ist, ist eine sichere Aussage derzeit schlecht möglich. Es müsste eine weitere Titer- und Verlaufskontrolle der Patienten stattfinden.

Der Titerverlauf könnte Aufschluss über den Krankheitsverlauf geben. So könnte ein erneuter Anstieg eines Titers nach einer längeren gleichbleibenden Phase – ähnlich wie bei Tumormarkern – ein früher Indikator für ein noch subklinisches Rezidiv sein. Damit könnte eine BCL2-Antikörperbestimmung sowohl einen prognostischen Aussagewert besitzen als auch in der Verlaufskontrolle von Patienten eine Rolle spielen. - 60 -

Aufgrund der Tatsache, dass eine Antikörperbildung bei BCL2 nachgewiesen werden konnte, ist es durchaus möglich, dass auch gegen andere Genprodukte Antikörper gebildet werden. Dazu müsste das beobachtete Gen- und/oder Patientenkollektiv allerdings deutlich ausgeweitet oder in einer folgenden Studie anders definiert werden.

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass es in dieser Studie erstmalig gelang, eine hochtitrige Antikörperbildung gegen BCL2 nachzuweisen und dies bei mehr als 10% der untersuchten Patienten. Wenn auch kein unmittelbarer Zusammenhang zwischen angewandter Therapie und Änderung des Immunstatus festgestellt werden konnte, so konnte doch zum ersten Mal ein immunogener Effekt des anti-apoptotischwirksamen BCL2 auf B-Zellen und damit eine Funktion als tumorassoziiertes Antigen nachgewiesen werden. Es konnte von Andersen et al. bereits gezeigt werden, dass BCL2 auch zelluläre Immunantworten induziert. Der Nachweis der Immunogenität von BCL2 bei Patienten mit BCL2-positiven Lymphomen deutet darauf hin, dass eine Immuntherapie (Vakzine) basierend auf dem BCL2-Effekt bei den entsprechenden Patienten sinnvoll sein könnte. Damit könnte eine bessere Prognose erzielt, die Entstehung von Lymphomen verzögert oder eventuell sogar verhindert werden.

Grundsätzlich zeigt eine positive Antikörperantwort eine immunologische Reaktion des Patienten auf seine Erkrankung. Es besteht die Möglichkeit, dass die Antikörperbildung bereits vor dem Auftreten von Symptomen der Erkrankung in Erscheinung tritt, so dass damit eine bessere Chance der Früherkennung durch serologische Untersuchungen gegeben sein könnte. Außerdem kann eine solche Immunreaktion als Ansatz für neue Therapien (wie z.B. die Möglichkeit einer Immuntherapie unter Ausnutzung des BCL2-Effektes) oder aber auch für neue diagnostische

Maßnahmen

dienen,

Pathogenese,

Krankheitsverlauf

und

sowie

zu

Prognose

besserem von

Verständnis

Lymphomen

von

beitragen.

Weiterführende Untersuchungen in diesem Bereich werden diese Entwicklung fördern und die Heilungschancen von Lymphom-Patienten optimieren.

- 61 -

VII. Literaturverzeichnis

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VIII. Tabellen- und Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1:

Klassifikation der Lymphome

Tabelle 2:

Ann-Arbor-Klassifikation

Tabelle 3:

Häufigkeit der verschiedenen Histologien unter den B-ZellLymphomen

Tabelle 4:

Gene, Zusammenfassung

Tabelle 5:

verwendete Gene

Tabelle 6.

Patienten

Tabelle 7a:

Patienten mit Antikörperbildung, Behandlung mit Chemotherapie

Tabelle 7b:

Patienten mit Antikörperbildung, Behandlung mit Kombination aus Chemotherapie und Rituximab

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1:

Rituximab-Epitop

Abbildung 2:

Expressionsprofile von geheilten bzw. schwerwiegenden oder therapierefraktären DLBCL

Abbildung 3:

Überlebenszeiten von Lymphompatienten in Abhängigkeit von der BCL2-Proteinexpression

Abbildung 4:

Schema zur Einteilung der Patienten in die beiden Therapiearme

- 66 -

Abbildung 5:

In-Vivo-Excision

Abbildung 6:

Beispiel für SEREX

Abbildung 7:

Gelelektrophorese zur PCR-Kontrolle

Abbildung 8:

PKC-Plasmid-Präparation (TENS-Minis)

Abbildung 9:

Insertpräparation: Entfernung des PKC-Fragmentes aus dem TOPO-Vektor

Abbildung 10:

Überprüfung der Insertpräparation

Abbildung 11:

Vektorkarte des λ-ZAP-Express-Phagen

Abbildung 12:

Ausschnitt aus der MCS des λ-ZAP-Express-Phagen

Abbildung 13:

PKC-Plasmid-Präparation (TENS Minis) nach in-vivo-Excision

Abbildung 14:

Sequenzierung des pKC-Plasmids nach in-vivo-Excission sowie die entsprechende Aminosäuresequenz.

Abbildung 15:

Schema der SEREX-Methode

Abbildung 16:

Positive Klone

Abbildung 17:

Graphische Darstellung der Titerverläufe

- 67 -

IX. Publikation / Danksagung

Teile dieser Dissertation wurden als Teil des Papers „Spontaneous high-titered IgG antibody responses against BCL-2 in patients with aggressive lymphomas” im Journal of Cancer Research and Clinical Oncology publiziert.

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. M. Pfreundschuh, in dessen Labor die Arbeit angefertigt wurde, für das Überlassen des Themas und des Arbeitsplatzes. Ferner danke ich besonders Herrn Dr. Klaus-Dieter Preuß für die vielfältige Unterstützung in wissenschaftlichen Fragen, für die wertvollen Anregungen sowie die engagierte Betreuung, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Ebenso danke ich Maria Kemele und Evi Regitz für die freundschaftliche und hilfreiche Zusammenarbeit, sowie allen Labormitarbeitern der Abteilung Innere Medizin I für eine angenehme Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders danke ich auch meinen Eltern, die mir das Studium ermöglicht haben und mich jederzeit unterstützten. Darüber hinaus bedanke ich mich bei Tobias Maurer für seine Unterstützung im informatisch-technischen Bereich und bei Stefan Huwig für seine Übersetzungshilfe.

- 68 -

X. Lebenslauf Name:

Vera Hammermeister

Geburtsdatum:

20.06.1984

Geburtsort:

Ottweiler

Adresse:

Graulheck 41 66578 Schiffweiler

Eltern:

Vater: Wolfgang Hammermeister Mutter: Irmgard Hammermeister, geb. Schmidt

Schule:

Grundschule Schiffweiler September 1990 – Juli 1994 Gymnasium am Steinwald Neunkirchen August 1994 – Juni 2003 Abitur: Juni 2003

Universität:

Studium der Humanmedizin an der Universität des Saarlandes Homburg/Saar Beginn: Oktober 2003

Famulaturen:

01.03.06 – 31.03.06: Städtisches Krankenhaus Neunkirchen, Gynäkologie 01.03.07 – 31.03.07: Städtisches Krankenhaus Neunkirchen, gynäkologische Ambulanz 03.09.07 – 02.10.07: Universitätsklinikum Homburg/Saar, Institut für Pathologie 18.02.08 – 25.03.08: Chirurgisch – Unfallchirurgisch – Orthopädische Praxis, Böblingen

Praktisches Jahr:

25.08.2008 – 26.07.2009: Klinikum Saarbrücken Wahlfach: Gynäkologie

Staatsprüfungen:

1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung: August 2005 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung: voraussichtlich Oktober 2009

- 69 -