Architektura funkcjonalna rybozymu hammerhead

Marta M. Gabryelska*

Streszczenie

R

Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk, ul. Z. Noskowskiego 12/14, 61704 Poznań, tel: (61) 852 85 03 wew. 132, faks: (61) 852 05 32, e-mail: Jan.Barciszewski@ibch. poznan.pl

ybozym hammerhead jest najmniejszym katalitycznym RNA pochodzenia naturalnego, który stanowi doskonały model do badań zależności struktury i funkcji. Początkowo został zidentyfikowany jako autokatalityczny fragment genomowego RNA roślinnych wiroidów i wirusoidów. Obecnie wiadomo, że występuje on w genomach wielu organizmów w tym u człowieka i jest najczęściej występującym autokatalitycznym motywem RNA w przyrodzie. Po 25 latach intensywnych badań dostępna jest duża ilość informacji na temat jego budowy, dynamiki konformacyjnej oraz oddziaływań trzeciorzędowych wpływających na stabilność i właściwości. Struktura cząsteczki rybozymu hammerhead stanowi układ elementów, które wzajemnie na siebie wpływają. Poznanie architektury cząsteczki rybozymu jest niezwykle interesujące w kontekście zasad i logiki projektowania, konstruowania i zastosowania cząsteczek tej klasy jako molekularnych konstrukcji przestrzennych. Obecność dodatkowych motywów strukturalnych wyróżnia tzw. wydłużony rybozym hammerhead od minimalnego. Rybozym hammerhead rozpoznaje docelową sekwencję w RNA na zasadzie komplementarności i katalizuje jej transestryfikację po sekwencji 5’-NUH-3’. Wydajność reakcji uwarunkowana jest aranżacją atomów centrum katalitycznego, obecnością jonów metali oraz innych czynników wewnątrzkomórkowych. Poszukiwane są nowe pochodne rybozymów hammerhead o zwiększonej aktywności, które mogą być wykorzystane w medycynie molekularnej.

*równorzędni autorzy

Wprowadzenie

Agnieszka Fedoruk-Wyszomirska* Eliza Wyszko Jan Barciszewski Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk, Poznań 

Artykuł otrzymano 24 września 2012 r. Artykuł zaakceptowano 26 listopada 2012 r. Słowa kluczowe: struktura RNA, rybozym hammerhead, transestryfikacja Wykaz skrótów: HHRz — rybozym hammerhead; HHRzM — rybozym hammerhead minimalny; HHRzW — rybozym hammerhead wydłużony; TLS — struktura podobna do tRNA; NMR — magnetyczny rezonans jądrowy; TSM — motyw stabilizujący strukturę trzeciorzędową Podziękowania: Publikacja powstała w ramach realizacji projektów finansowanych ze środków budżetowych na naukę w latach 2010-2011 w ramach programu Iuventus Plus, nr IP2010008770 oraz grantu przyznanego przez Polskie Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr N N302 220535. Marta M. Gabryelska jest stypendystą w ramach projektu pt.: „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowanego ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

Struktura RNA determinuje jego funkcje oraz warunkuje swoiste oddziaływania z innymi cząsteczkami RNA, ligandami, czy białkami [1]. Właściwości katalityczne RNA zależą od jego konformacji, która ma charakter dynamiczny [2]. Na początku lat 80-tych XX wieku po raz pierwszy pokazano, że RNA bierze bezpośredni udział w składaniu (ang. splicing) i dojrzewaniu (ang. maturation) RNA [3]. Katalityczne RNA (tzw. rybozymy, RNAzymy) charakteryzują się obecnością wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań trzeciorzędowych i katalizują reakcje transestryfikacji RNA, hydrolizy/ligacji, syntezy peptydu, fosforylacji, adenylacji aminokwasów, polimeryzacji RNA, reakcję aldolową, utleniania alkoholi, redukcję aldehydów, syntezę nukleotydów pirymidynowych, aminoacylację i wiele innych [4]. Zachodzą one bez udziału dodatkowych czynników białkowych [5]. Dotychczas zidentyfikowano dziewięć typów naturalnie występujących katalitycznych RNA [6] (Tab. 1). Tabela 1. Charakterystyka naturalnie występujących rybozymów.

Podgrupa

Rybozym

Wielkość cząsteczki (nt)

Rybozymy małocząsteczkowe

Hammerhead Hepatitis Delta Virus Hairpin Varkud sattelite

~40 ~90 ~70 ~160

transestryfikacja in cis

introny grupy I introny grupy II

~210 GUA, AUA, CUC > AUU, UUC, UUA > GUU, CUA >UUU, CUU [38]. W przypadku rybozymów minimalnych obserwowano nawet 70-krotne różnice szybkości hydrolizy in vitro dla różnych substratów [32]. Rozbieżność ta może być związana z szybkością dysocjacji produktów oraz zmianami w strukturze [39]. Tolerancja substytucji niektórych nukleotydów rdzenia katalitycznego wskazuje, że system oddziaływań elementów struktury drugorzędowej oraz trzeciorzędowej mimo odległości moduluje lokalną strukturę centrum katalitycznego [40]. Szybkość reakcji jest także zależna od charakteru nukleotydu w pozycji –1 względem sekwencji 5’-NUH-3’ zgodnie z preferencją U>C>A>G [41]. Reakcja transestryfikacji

Rybozymy w fizjologicznym pH katalizują wewnętrzną reakcję transestryfikacji („hydrolizy”) z szybkością porównywalną do enzymów białkowych. Według mechanizmu katalizy kwasowo-zasadowej funkcję zasady pełnią pary elektronów zasad heterocyklicznych kwasów nukleinowych [42] (Ryc. 4). Grupa 2’-OH rybozy przeprowadza atak nukleofilowy na najbliższy 3’ fosforan zgodnie z mechanizmem reakcji SN2, a produkty reakcji mają 2’,3’-cykliczny fosforan oraz grupę 5’-OH (Ryc. 4) [44]. Grupa atakująca, fosforan w miejscu hydrolizy oraz grupa opuszczająca ułożone są liniowo. W pierwszym etapie tworzy się swoisty, aktywny kompleks enzym:substrat, w którym dochodzi do hydrolizy wiązania międzynukleotydowego, produkty dy-

Rycina 5. Schemat hydrolizy RNA katalizowanej przez rybozym HH. Rybozym (Rz) specyficznie przyłącza i hydrolizuje docelowy RNA (S — substrat). Najpierw tworzony jest kompleks rybozymu z substratem (Rz:S). Po hydrolizie (transestryfikacji) RNA powstaje kompleks rybozymu i dwóch produktów (Rz:P1:P2), a następnie cząsteczka katalityczna ulega dysocjacji od produktów hydrolizy (P1, P2) i bierze udział w kolejnej reakcji.

socjują, a rybozym może katalizować kolejną reakcję (Ryc. 5) [32]. Stała Michaelis-Menten dla rybozymów wyznaczana jest w warunkach wielo- i jednokrotnego udziału rybozymu w reakcji [32,45]. Wartości kcat i KM dla rybozymów hammerhead zazwyczaj mieszczą się odpowiednio w zakresie 1-2 min-1 i 20-200 nM [38]. Centrum katalityczne rybozymu hammerhead musi spełniać następujące warunki: i) zasada G12 znajduje się w położeniu umożliwiającym deprotonację grupy nukleofilowej (C17 2’OH) w celu utworzenia aktywnego prekursora; ii) zmiany konformacji miejsca aktywnego zapewniają ułożenie liniowe aktywowanego nukleofila (C17 2’OH) i atakowanej reszty fosforanowej; iii) integralność miejsca aktywnego, a także bliskość A9 i atakowanego fosforanu pozwalają na wiązanie jonu dwuwartościowego, iv) reszta G8 jest utrzymana w pozycji umożliwiającej oddanie protonu grupie opuszczającej (C1.1 5’O) [46]. Wpływ jonów metali na aktywność rybozymów

Utworzenie dupleksu oraz struktur trzeciorzędowych jest możliwe dopiero po zrównoważeniu ujemnego ładunku łańcucha cukrowo-fosforanowego kwasów nukleinowych [47]. Z tego względu, RNA i DNA występują w komórce w postaci zasocjowanej z kationami. Obecność jonów metali w mieszaninie reakcyjnej silnie wpływa na aktywność rybozymów (Tab. 2) [47]. Uczestniczą one w tworzeniu aktywnej konformacji rybozymu hammerhead, ale obserwowane między nimi różnice przyspieszania reakcji katalitycznej sięgają rzędu 104. Najlepszym kofaktorem jest Mn2+ [47]. Rycina 4. Schematy proponowanych mechanizmów transestryfikacji RNA katalizowanej przez rybozym HHRz (na podstawie [43,54]). W wyniku ataku nukleofilowego grupy 2’-OH rybozy na wiązanie fosfodwuestrowe powstają produkty reakcji, z których jeden zakończony jest 2’,3’-cyklicznym fosforanem, a drugi grupą 5’-OH. (A) Mechanizm katalizy kwasowo-zasadowej (H-A – ogólny kwas, :B – ogólna zasada). (B) Mechanizm kwasowej hydrolizy estrów. Z – zasada azotowa, R – kontynuacja łańcucha RNA.

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

Analizując struktury krystaliczne rybozymów hammerhead stwierdzono, że zarówno w miejscu katalitycznym, jak i w jego najbliższym otoczeniu brak jonów magnezu [16,17,22]. Zaproponowano model, w którym jony metalu odgrywają rolę strukturalną, co potwierdzały eksperymenty chemicznej modyfikacji zasad oraz obserwacje, że rybo-

25

Tabela 2. Występowanie niektórych jonów w komórce i ich wpływ na aktywność katalityczną rybozymu hammerhead Schistosoma. b.d. – brak danych. Na podstawie [47,48,51].

Jon Mg2+

Stężenie w cytoplazmie [M]

Stężenie toksyczne w cytoplazmie [M]

10-3

10-1

Cytoplazma

Główny przedział komórkowy, w którym występuje

Wiązanie

Kobs (min-1) w 0,1 M NaCl i 1 mM M2+ lub 600 mM M+ (Schistosoma HH) 2,6

słabe odwracalne

Mn2+

10-6

10-5

aparat Goldiego mitochondrium

Fe2+

10-7

10-5

cytoplazma

+

Na

b.d.

10

zewnątrzkomórkowo

b.d.