UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS HOSPITAL CLINICO DE LA UNIVERSIDAD DE CHILE Departamento de Endocrinología Laboratorio de Endocrinología y Biología de la Reproducción

“ROL DEL FACTOR DE CRECIMIENTO NERVIOSO (NGF) EN LA REGULACION DE LA PROLIFERACION Y ANGIOGENESIS DEL OVARIO” Memoria para optar al título de Bioquímico

PATRICIA EMITA LOZADA GONZALEZ

PROFESOR PATROCINANTE

DIRECTOR DE MEMORIA

Dr. Hernán Lara Peñaloza

Dra. Carmen Romero Osses

Facultad de Cs. Químicas y Farmacéuticas

Hospital Clínico Universidad de Chile

Santiago-Chile 2006

“Esta tesis va dedicada a mi madre por su perseverancia, esfuerzo, y sacrificio en la vida y por inculcarme valores hermosos. Gracias vieja por estar en todos los momentos de mi vida, por acompañarme en las buenas y en las malas, por estar ahí cuando las fuerzas ya no estaban, y me decías estudia que queda poco, y por repetirme cuan importante era un cartón, porque con eso me podría defender en la vida. Para ti esto, porque tú fuiste el artífice. Gracias viejita”.

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ABREVIATURAS

ADN: Ácido Desoxirribunoucleico ARN: Ácido Ribonucleico. ARNm: Ácido ribonucleico mensajero. BDNF: Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro. FSH: Hormona Folículo Estimulante. HIF-1 alfa: Factor inducible por hipoxia1 alfa. LH: Hormona Luteinizante. NGF: Factor de crecimiento nervioso. NT-3: Neurotrofina 3. NT 4/5: Neurotrofina 4/5. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. RT: Transcripción Reversa. tkA: receptor tirosina Kinasa A. VEGF: Factor de crecimiento de endotelio vascular.

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INDICE

PAGINA

RESUMEN .......................................................................................................... V SUMMARY ....................................................................................................... VII INTRODUCCION ................................................................................................ 9 HIPOTESIS....................................................................................................... 15 I

OBJETIVOS .............................................................................................. 16

I. 1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................... 16 I. 2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 16 II

MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................... 17

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RESULTADOS .......................................................................................... 24

IV

DISCUSION............................................................................................... 32

V

CONCLUSIONES...................................................................................... 37

VI

REFERENCIAS ......................................................................................... 38

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RESUMEN “Rol del factor de crecimiento nervioso (NGF) en la regulación de la proliferación y angiogénesis del ovario”

El factor de crecimiento nervioso (NGF) es una neurotrofina, que inicialmente fue descrita en el cerebro, y que en los últimos años ha adquirido importancia, debido a que actúa en sitios no-neuronales, entre ellos el ovario, donde se ha encontrado que NGF participa en el desarrollo ovárico, proliferación y diferenciación de células somáticas y en la esteroidogénesis. Una de las etapas importantes que ocurren durante el desarrollo folicular y del cuerpo lúteo es la angiogénesis, una de las moléculas importantes en este proceso es el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF). NGF aumenta la expresión de VEGF en diversos tipos celulares. VEGF es regulado en forma directa por el gen inducible por hipoxia (HIF-1) y en forma indirecta por c-Myc. Además c-Myc, es un gen involucrado en la proliferación celular. En este trabajo se investigó el rol que cumple NGF en la regulación de VEGF y la proliferación celular. Para este fin se utilizaron células de granulosa humana, provenientes de pacientes del programa de fertilización asistida, las cuales se cultivaron por 2, 4, 8 y 18 horas con NGF (50 ng/ml). Se midieron los niveles del ARNm de VEGF, c-Myc e HIF-1 alfa por RT-PCR. En este trabajo el ARNm de las isoformas de VEGF 165 y 121 aumentaron a las 4 y 8 horas respectivamente, los niveles del ARNm de HIF-1 alfa se mantuvieron inalterados a todos los tiempos estudiados. Los niveles de ARNm de c-Myc aumentaron a las 8 y 18 horas por efecto de NGF. Por Inmunocitoquímica se determinó Ki67, un marcador de proliferación celular. La proteína Ki67 aumentó a las 8 y 18 horas por efecto de NGF, concordando con la expresión génica de c-Myc. Los resultados indican que NGF presenta la capacidad de aumentar, tanto la expresión del ARNm de VEGF, como la proliferación en forma independiente, y que este aumento en la proliferación sería en una etapa posterior al alza de VEGF y que probablemente el VEGF expresado en las células de granulosa humana en cultivo, éste involucrado en la proliferación directamente, esto podría suponer que una falla en la producción de NGF por parte del folículo

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podría llevar a éste a un crecimiento y maduración deficiente, debido a que no ocurriría una angiogénesis y proliferación adecuada.

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SUMMARY “Role of nerve growth factor (NGF) in the regulation of proliferation and angiogenesis of ovary”

The nerve growth factor (NGF) is a neurothrophin, initially described in the brain, that has acquired importance in the last few years, because it has several functions in non-neuronal tissues. One of these tissues is the ovary, where NGF participates in the ovarian development, proliferation and differentiation of somatic cells and steroidogenesis. Angiogenesis is an essential stage during follicular and luteal development, and one of the most important molecules in this process is the vascular endothelial growth factor (VEGF). NGF increases VEGF expression in different cell types. VEGF is directly regulated by hypoxia inducible factor-1(HIF-1) and indirectly by c-Myc. c-Myc is also a gene involved in cell proliferation. This work investigated the role of NGF in regulating VEGF and cell proliferation. To this aim, granulosa cells obtained from patients undergoing in vitro fertilization were cultured for 2, 4, 8 and 18 hours with NGF (50 ng/ml). The levels of VEGF, c-Myc and HIF-1alpha mRNA were evaluated by RT-PCR. mRNA for VEGF 165 and VEGF 121 isoforms increase at 4 and 8 hours respectively. HIF-1alpha mRNA levels did not change at any time. NGF (50ng/ml) induces c-Myc mRNA increase at 8 and 18 hours. Ki67 protein, a cell proliferation marker, was determined by immunocytochemistry. Ki67 protein increases at 8 and 18 hours with NGF stimulation, and no change was observed at 4 hours, agreeing with the genic expression of cMyc. The results indicate that NGF is able to increase VEGF mRNA expression and cell proliferation by independent ways, and that the increase in the proliferation would be a later stage to VEGF's rise. It is probable that the VEGF expressed in cultured human granulosa cells acts directly on cell proliferation, suggesting that fails in follicular NGF production might induce

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a deficient follicular growth and maturation, due to impairment in angiogenesis and cell proliferation.

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INTRODUCCION

El ovario es un órgano muy importante para la reproducción humana, debido a que es el encargado de la producción de las células germinales en la mujer. Presenta muchos compartimentos, con múltiples funciones y propiedades biológicas. La función principal de esta gónada es la diferenciación y liberación del ovocito maduro (ovulación). Además el ovario tiene la capacidad de producir esteroides, que le otorgan las características sexuales secundarias a la mujer y soportan el embarazo (McGee E y Hsueh A, 2000). En la etapa de diferenciación se produce el crecimiento y desarrollo del folículo, desde el momento que deja la población de reserva, proceso que puede llevar en promedio 85 días (Vega M, 1997) desde un folículo primordial hasta llegar a un folículo preovulatorio o de Graaf. El folículo es la unidad básica del ovario, y esta compuesto por un ovocito, que está rodeado por las células de granulosa (CG) que rodean al ovocito, la membrana basal y las células de la teca que rodean a las CG. Los folículos primordiales están compuestos por capas de células epiteliales conocidas como CG, que rodean al ovocito inmaduro, además a las CG las circunda una matriz extracelular llamada lámina basal, el primer cambio que se observa en las CG, es el paso de células planas a cúbicas, dando origen a los folículos primarios, además de la iniciación de la actividad mitótica, produciendo con esto un aumento en el número de capas de CG, dando origen a los folículos secundarios. En el estado tardío de la diferenciación del folículo primario se produce el inicio de la expresión de receptores de la Hormona Folículo Estimulante (FSH) en las CG, lo cuál tiene una importancia clave debido a que estos receptores estimulan la proliferación de las CG y, por lo tanto del crecimiento folicular. El folículo para llegar a ser un folículo preovulatorio, ovulatorio o de Graaf, debe pasar por varias etapas antes de ser maduro y poder liberar al ovocito, requiere la formación de la teca a través de una migración de células mesenquemáticas hacia la lámina basal, formación del antro, y principalmente la proliferación de CG, esto último produce un gran aumento del tamaño del folicular (Vega M, 1997). Las neurotrofinas son factores de crecimiento, que inicialmente fueron encontradas en cerebro, estos neuropéptidos son importantes para el desarrollo y mantención del sistema nervioso central y periférico (Wiesmann C y col, 2001), pero numerosas evidencias han apoyado

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la idea, de que estas afectan la sobrevida, diferenciación

y proliferación de células no-

neuronales. Una de las neurotrofinas más prominentes, es el factor de crecimiento nervioso (NGF). Entre los tejidos no neuronales en los cuales participa NGF, se encuentra el ovario, donde también se ha observado la expresión de varios otros miembros de la familia de las neurotrofinas, tales como BDNF, NT-3 y NT 4/5 y sus receptores durante el desarrollo ovárico (Dissen y col, 1995). NGF tiene la capacidad de unirse a 2 receptores, uno de baja afinidad, p75 NGFR, el cual también puede unirse a otras neurotrofinas, y uno de alta afinidad, el receptor de tirosina Kinasa A (trkA) (Tesarollo L, 1998). A través de estos receptores, NGF ejerce sus funciones, y junto con otras neurotrofinas y sus receptores, está presente en el ovario humano desde la etapa fetal (Anderson y col, 2002). Ratas en edad pre-puberal, tratadas durante los primeros días de vida postnatal con anticuerpos anti NGF, impiden el crecimiento de folículos antrales, retrasan la pubertad y alteran la ciclicidad estral (Lara y col 1990). Se sugirió, que NGF era requerido para la ovulación y desarrollo folicular temprano, debido a que la expresión del ARNm de NGF y trkA aumentan transitoriamente antes de la ovulación en ovario de roedores (Dissen y col, 1996). Concordante a esto, NGF también presenta la capacidad de aumentar la Cox-2, enzima involucrada en la síntesis de la prostaglandina E-2, importante en la ovulación (Dissen GA y col, 2000). Además en la ovulación, se interrumpen las uniones gap, produciendo primero un aumento en la fosforilación de la conexina-43, y después una disminución de los niveles de la proteína Conexina-43 (proteína constituyente de las uniones gap). NGF presenta la capacidad de inducir una rápida fosforilación de la connexina-43 en células tecales (Mayerhofer A y col, 1996). En ratones deficientes para el gen de NGF, se encontró la existencia de una reducción de folículos primarios y secundarios, y de un aumento de ovocitos desnudos; encontrándose además que NGF era importante en la proliferación de células de la teca y granulosa del ovario, visto por ensayos de PCNA y BrdU (Dissen y col, 2001). Estos procesos ocurren en forma independiente de las gonadotrofinas, donde niveles séricos de FSH y LH no se ven afectados en ratones deficientes para el gen de NGF, todo esto sugiere que NGF estaría jugando un rol crucial en la regulación del desarrollo de la función reproductiva (Dissen y col, 2001). También se ha demostrado que las células de granulosa humana in vitro presentan la capacidad de responder a NGF, regulando la esteroidogénesis (inhibiendo la luteinización in vitro) y aumentando la expresión de receptores para FSH (Salas C y col, 2006). Lo interesante es que tanto el receptor

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trkA, como su ligando NGF se expresan en las células de la granulosa de folículos pre-antrales y antrales; por lo tanto NGF estaría involucrado en la esteroidogénesis ovárica, por una acción autocrina (Salas C y col, 2006). Por otro lado, en este tipo celular, NGF también puede promover la proliferación celular, visto por el método de Cell Titer (Salas C, 2002). Se ha observado que NGF promueve la angiogénesis como parte de la cicatrización de heridas (Graini G y col, 2004), así como también que participa en la capilarización gatillada por isquemia (Emanueli C y col, 2002). La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya existentes, es un proceso controlado que se lleva a cabo durante el ciclo menstrual femenino y en la reparación de heridas. En un estado patológico, la angiogénesis ocurre en muchas enfermedades, entre las cuales se pueden encontrar la retinopatía diabética, la artritis, progresión tumoral entre otras. (Sullivan y col, 2003). VEGF es un potente mitogéno del endotelio vascular, es una glico-proteína homodimérica de 45 kda, (Geva E y Jaffe RB, 2000) que se une específicamente a receptores de células endoteliales provocando proliferación. (Shibuya M, 2001). VEGF juega un rol crítico en la función ovárica, debido a que induce la angiogénesis, que acompaña al desarrollo folicular y del cuerpo lúteo (Redmer y col, 1996). Nuestro grupo ha encontrado que NGF aumenta la expresión de VEGF en células de granulosa humana en cultivo. Los niveles del ARNm de VEGF fueron evaluados por PCR convencional, así como también por PCR de tiempo real; la proteína VEGF fue determinada en los medios de cultivo por Elisa. En mamíferos existen 5 isoformas de VEGF, los cuales son productos de splicing alternativo del gen de VEGF, estas isoformas son VEGF 121, 145, 165, 189 y 206. La isoforma 165 es la predominante, y junto con las isoformas 121 y 189 son las que se encuentran en la mayoría de los tejidos y células (Geva E y Jaffe RB, 2000). En ovario normal y cáncer de ovario las isoformas que se expresan mayoritariamente son las isoformas 121 y 165 (Fujimoto J y col, 1998); sin embargo, en cáncer ovárico epitelial se ha encontrado un aumento significativo de las tres isoformas de VEGF (121, 165 y 189) por efecto de NGF (Campos X y col, 2006).

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La expresión de VEGF es regulada por el factor transcripcional inducible por hipoxia (HIF-1), (Derý C y col, 2005; Semenza L, 2002) regulador esencial de la homeostasis del oxígeno. HIF-1 está compuesto por 2 subunidades, HIF-1 alfa y HIF-1 beta. HIF-1 beta es la subunidad que se expresa constitutivamente, en cambio el HIF-1 alfa es la subunidad inducible (Semenza L, 2002). Como resultado de la deprivación de O2 (hipoxia), el crecimiento y la viabilidad celular es reducida, es allí donde este factor es importante, porque se expresa en condiciones de baja concentración de oxígeno, activando a más de 60 genes, implicados en diferentes funciones celulares, tales como la angiogénesis, proliferación celular y sobrevida celular. El aumento de la expresión de HIF-1 alfa, también puede producirse por efecto de factores de crecimiento (Derý C y col, 2005). c-Myc es un proto-oncogen, que media la transición de la fase G0-G1 y G1-S del ciclo celular (Dang C, 1999). Mediante la técnica de hibridación in-situ, c-Myc se encontró en todas las etapas del desarrollo folicular, menos en la etapa de folículo primordial, además se encontró en la etapa de cuerpo lúteo. Estos datos indicarían, que la expresión de c-Myc podría jugar un rol importante en los mecanismos moleculares de proliferación y apoptosis de los folículos (Putowski y col, 1997); así como también en los procesos de angiogénesis durante la ciclicidad del ovario, ya que coinciden con la expresión de VEGF en el mismo tejido (Fraser H, 2001) Se ha encontrado que la sobreexpresión de c-Myc, promueve el crecimiento de vasos sanguíneos, debido en parte a una inducción de VEGF. El mecanismo por el cual, c-Myc, controla la expresión de factores angiogénicos, aún no está claro, sin embargo la regulación sobre VEGF parece ser indirecta (Baudino T y col, 2002). Ki 67 es una proteína, que esta estrictamente asociada a la proliferación celular, debido a que esta presente en todas las etapas del ciclo celular (G1-S-G2-M) y ausente en G0 (Scholzen T, 2000). Con el objeto de esclarecer el mecanismo por el cual NGF actúa en el ovario, ya que se ha demostrado que NGF, estaría participando en la esteroidogénesis, y en la regulación de la expresión del receptor de FSH, y dado que NGF y su receptor trkA se expresan principalmente en células de la granulosa de folículos pre-antrales como antrales (Salas C, y col 2006) al igual que VEGF en ovario humano adulto, y debido a que NGF, en otros tejidos puede regular la expresión de VEGF, en este estudio se evalúo el efecto de NGF sobre la regulación de VEGF y

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la proliferación en células de granulosa humana, así como también se evalúo algunos factores de transcripción, tales como HIF-1 alfa y c-Myc, involucrados en ambos procesos.

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Resumiendo •

NGF es capaz de aumentar tanto los niveles de ARNm, como de la proteína de VEGF en células de granulosa humana.

•

NGF participa en la proliferación celular de las células somáticas del ovario.

•

c-Myc es un gen que esta involucrado en la proliferación celular.

•

Una molécula de señalización importante en la regulación de VEGF es HIF-1alfa. De acuerdo a estos antecedentes, NGF estaría jugando un papel importante, en el

desarrollo folicular y por ende en la función de esta gónada, Acorde a lo escrito anteriormente, se puede proponer la siguiente hipótesis:

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HIPOTESIS

“El factor de crecimiento nervioso (NGF) regula la proliferación celular y los niveles de ARNm de VEGF en células de granulosa humana en cultivo”.

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I

OBJETIVOS

I. 1 Objetivo General Evaluar la acción de NGF en la expresión de VEGF y la proliferación de células de granulosa humana a distintos tiempos de cultivo.

I. 2 Objetivos Específicos I.2.1. Evaluar los niveles del ARNm de las isoformas de VEGF ( VEGF 121, VEGF 165 y VEGF 189) y los factores de transcripción HIF-1 alfa y c-Myc en células de granulosa humana a las 2, 4, 8 y 18 horas de cultivo. I.2.2. Determinación del efecto de NGF en la proliferación celular mediante la cuantificación de Ki67 por Inmunocitoquímica, a distintos tiempos de cultivo.

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II

MATERIALES Y MÉTODOS

II.1 Obtención de muestras. II.1.1 Células de granulosa. Las células de granulosa humana fueron obtenidas, de aspirados de folículos preovulatorios, de un total de 40 pacientes del programa de fertilización in vitro del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. Este trabajo contó con la aprobación del Comité de Ética de la Institución y consentimiento informado de las pacientes.

II.1.2 Aislación y purificación de células de granulosa humana. Los aspirados de los diferentes folículos de cada paciente, se centrifugaron a 1.200g por 7 minutos. Los precipitados contenían las células de granulosa humana, las células se purificaron en una gradiente de Percoll al 50% (3 ml de Percoll y 3 ml de medio HAM F12 Dubelco (Sigma) (bicarbonato de Sodio, 80 mg/L de gentamicina, 50 mg/L de penicilina G sódica (1000000 UI), 50 mg /L de estreptomicina, 5 mg/L de ketocononazol, pH 7,2-74), se centrifugaron por 45 minutos a 1.375g, con el fin de separar las células de granulosa de los glóbulos rojos. Posteriormente las células, fueron llevadas a otro tubo que contenía, 1 ml de medio HAM F12 Dubelco, donde fueron resuspendidas (lavadas) y disgregadas, y sometidas a una centrifugación de 1200g por 7 minutos. Luego los precipitados se resuspendieron en 3 ml de medio HAM F12 Dubelco libre de suero. Se realizó nuevamente una centrifugación a 1.200g por 7 minutos, el precipitado correspondiente a las células de granulosa humana fueron resuspendidas en 1 ml de medio HAM F12 Dubelco libre de suero. Las células fueron sometidas a un test de viabilidad con Azul de Tripán (Sigma) (Tennant J. R, 1964). Para este propósito se realizó una solución (1:1) de suspensión de células y Azul de Tripán (0.4%(p/v), la mezcla se incubó durante 5 minutos y se realizó el conteo de las células muertas y vivas en una cámara Neubauer con microscopio óptico con aumento de 40X.

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II.1.3 Cultivo de células de granulosa. Las células de granulosa humana, fueron cultivadas en placas de 6 pocillos de 35 mm. Los pocillos fueron recubiertos con gelatina al 1%, posteriormente se cultivaron 500.000 células vivas por pocillo, en 3 ml de medio HAM F12 Dubelco libre de suero. Estas placas fueron cultivadas por 18 horas a 37 ° C, en una estufa de cultivo, con un 100% de humedad, 95 % aire y 5 % de CO2. Después de 18 horas, se cambió el medio nuevamente por medio HAM F12, y se agregó NGF en una concentración de 50 (ng/ml), obteniéndose células Control (sin NGF) y estimuladas con (NGF), las células de granulosa fueron cultivadas por 2, 4, 8 y 18 horas. Al término del cultivo, las células se resuspendieron en 1 ml de Trizol (Invitrogen), a continuación fueron guardadas a –80° C para su posterior extracción de ARN total.

II.2. RT-PCR II.2.1 Extracción de ARN. El ARN total, fue extraído de 500.000 células de granulosa humana, para así obtener una cantidad de ADN complementario (ADNc) óptimo para poder efectuar los análisis posteriores de amplificación de este ADNc. Al término del cultivo celular, a las células se les agregó un ml de Trizol (Invitrogen). Se agregaron 0,2 ml de cloroformo y se mezcló por 10 segundos en vortex. Luego las muestras se dejaron en reposo por 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se centrifugaron a 12.000g por 15 minutos a 4° C. Se retiró la fase acuosa (fase superior) y se transfirió a un tubo nuevo (400 ul aprox). Se agregó el mismo volumen de isopropanol, se agitó en vortex (hielo). Se dejó precipitando el ARN toda la noche a –20° C. Al otro día, trabajando en hielo, se centrifugó a 12.000g por 10 minutos a 4° C; se eliminó el sobrenadante por inmersión. Al precipitado que contenía el ARN se le agregó 1 ml de etanol al 70%, esto con el fin de eliminar todo el isopropanol restante y luego se centrifugó por cinco minutos a 12.000g a 4° C. El precipitado se secó al aire por 5 minutos, el cual fue resuspendido en buffer TE (Tris-EDTA) 1x (15 ul). La concentración y pureza del ARN se midió en un espectrofotómetro, a 260 nm y a 280 nm.

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II.2.2. RT. Para la realización del RT se usó 1 ug de ARN total. Se realizaron 2 mezclas. La primera contenía la muestra, H20 DEPC, 0,5 ul de random hexamer Primers y 1 ul de dNTPs (10mM). La primera mezcla se calentó por 5 minutos a 70° C. La segunda mezcla contenía 4 ul de buffer de reacción 5X (250 mM Tris-HCl pH 8,3, 375 mM KCl y 15 mM MgCl2), 2 ul de DTT, 1 ul de inhibidor de ribonucleasas y 1 ul de la enzima de transcriptasa reversa M-MLV (Invitrogen). La mezcla 1 y 2 se juntaron y se incubaron por 1 hora a 37° C, deteniéndose la reacción por congelación. Esta correspondió a la solución stock de ADNc. Para la reacción de PCR semicuantitativo se tomaron 1 y 2 ul de muestra (Tabla 1) dependiendo del gen a amplificar, por la reacción de la polimerasa en cadena (PCR), en 25 ul totales de mezcla que contenían 0.15 ul de Taq Polimerasa (Biotools), 2.5 ul buffer 10X , 1 ul de MgCl2, 0,5 ul de dNTP común para todos los PCR, y para cada PCR específico se agregaron 12,5 pmoles de partidores sentido y antisentido de VEGF, HIF-1 alfa y trkA, y 10 pmoles para el gen c-Myc. Como gen constitutivo se usaron 12.5 pmoles de ß-actina. Para la ß-actina se usaron 2 pares de partidores diferentes de 260 y 661 pb.

Los tubos con la mezcla de reacción se llevaron a un termociclador, para realizar la reacción en cadena de la polimerasa. Los productos de PCR obtenidos fueron separados en un gel de agarosa al 2 %, (TBE 1x) que contiene bromuro de etidio (1mg/ml). Las bandas fueron semicuantificadas con un programa computacional USI (Un-Scan-it). Los resultados de los niveles de ARNm se obtuvieron, calculando las unidades relativas, correspondiente a la relación de los pixeles (gen especifico / ß-actina).

En la tabla 1 y 2 se detallan las secuencias específicas de los distintos partidores usados y los programas para cada PCR.

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Tabla 1. Programa de PCR utilizados.

Programa

HIF-1α

c-Myc

VEGF

Denaturación

94° C, 10'

95° C, 2'

94° C ,2'

Denaturación

94° C , 30"

94° C, 45"

94° C, 45"

Alineamiento

55° C, 30"

55° C, 1'

62° C,1'

Extensión

72° C, 1'

72° C, 1'30"

72° C,1'

27 ciclos 2-4

27 ciclos 2-4

26 ciclos 2-4

Extensión final

72° C , 10'

72° C ,10'

72° C, 7'

Reposo

4° C

4° C

4° C

inicial

Volumen usado 1ul para el gen y 1 ul de muestra para el PCR.

2 ul de muestra

1ul de ß-actina

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Tabla 2. Secuencias de partidores utilizados, tamaño del producto y número de acceso.

Gen

c-Myc

HIF-1

alfa

Orientación

Secuencia del Partidor del partidor

Tamaño y producto

Sentido

GAT-TCT-CTG-CTC-TCC-TCG-A

333 pb

Antisentido CTC-TGA-CAC-TGT-CCA-ACT-TG

333 pb

Sentido

CTC-AAA-GTC-GGA-CAG-CCT-CA

460 pb

CCC-TGC-AGT-AGG-TTT-CTG-CT

460 pb

Antisentido

Número y acceso ADNc

Gi/34815

Gi/33877859

VEGF Sentido AGG-CCA-GCA-CAT-AGG-AGA-GA 315, 236 y 104 pb Antisentido ACC-GCC-TCG-GCT-TGT-CAC-AT ß-actina

Sentido Antisentido

315, 236 y 104 pb Gi/5016088

CCC-AGG-CAC-CAG-GGC-GTG-AT

260 pb

TCA-AAC-ATG-ATC-TGG-GTC-AT

260 pb

Gi/113711353

β-actina Sentido TGA-CCG-GGT-CAC-CCA-CAC-TGT-GCC-CAT-CTA 661pb Antisentido CTA-GAA-GCA-TTG-CGG-TGG-ACG-ATG-GAG-GG 661 pb Gi/5016088

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II.3. Inmunocitoquímica. Se cultivaron 100.000 células de granulosa humana, provenientes de 11 pacientes, por 4, 8 y 18 horas en condiciones Control (sin NGF) y NGF (50 ng/ml), con un cultivo previo de 18 horas con solo medio HAM-F12 libre de suero en placas de 24 pocillos, cada muestra se realizó en duplicado para un tiempo determinado. Posteriormente, las células se desprendieron por pipeteo suave (mecánicamente), a continuación las células fueron esparcidas en portaobjetos, donde posteriormente fueron fijadas con Metanol (Merck) por 15 minutos a 4° C, luego se lavó el exceso de Metanol con PBS 1x (8 gr/L NaCl; 0,2 gr/L KCl; 1,44 gr/L Na2HPO4, 0,24 gr/L KH2PO4; pH 7,4) por 5 minutos a 4° C, dejando finalmente las células en PBS-Azida 15 mM. Se realizó la inmunocitoquímica para determinar la presencia de la proteína Ki67, para este fin las células fueron lavadas 3 veces con PBS 1x, después se incubaron con perhidrol al 2% por 30 minutos a temperatura ambiente, con el fin de bloquear la actividad de peroxidasas endógenas, luego las células se lavaron 3 veces con PBS 1x. Para evitar la unión inespecífica del primer anticuerpo, las células fueron incubadas con PBS-Leche durante 30 minutos a temperatura ambiente, sin lavar se colocó el primer anticuerpo policlonal Ki67 Ab-3 (Lab Vision Corporation) en una dilución 1:100 en PBS-BSA 1%. Al otro día se lavó 4 veces con PBS 1X por 2 minutos, posteriormente se aplicó el anticuerpo secundario hecho en cabra biotinilado anti-conejo durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de la aplicación de Estreptavidina Peroxidasa por 10 minutos a temperatura ambiente, se lavó 4 veces con PBS 1X. Finalmente se agregó a los portaobjetos el preparado (1 gota (40ul) de Dab Cromógeno a 2 ml de sustrato Dab), como contratinción se usó Hematoxilina. Se contaron las células positivas y las células negativas en un microscopio óptico con un aumento de 40X. Para la expresión de los resultados se calcularon los porcentajes de células positivas Control y NGF con respecto al total de las células (células positivas y negativas).

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II.4.Análisis Estadístico Tanto para la medición de los niveles de ARNm, como la inmunocitoquímica, se utilizó el test de Student pareado, (Prueba de T) para la comparación de células Control con células tratadas con NGF. Se consideró significativo valores de p