Rev. Med. Univ. Navarra XIII; 29, 1969 DEPARTAMENTO DE GENETICA CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLOGICAS FELIX HUARTE UNIVERSIDAD DE NAVARRA

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M. Margarida Cardigos* y A. del Amo RESUMEN

Se presenta un análisis cariotípico del strain Wuna-1 de células HeLa actualmente en cultivo en nuestro Laboratorio y se comparan los resultados obtenidos con los de un primer análisis del mismo, hecho dos años antes (del Amo y cols. 1969). Aunque la muestra aquí estudiada presenta una moda de 71 cromosomas en vez de 73, que resultaba en nuestro primer análisis, se conservan los rasgos característicos de esta estirpe: la condición hipertriploide, el déficit de elementos en el grupo morfológico 6-X-12, el exceso en los grupos morfológicos D y E, relativamente a los valores triploides del grupo respectivo, y especialmente la presencia de dos marcadores, M1 y M,, que aparecen constantes en número y forma en todas las 69 metafases estudiadas.

Generalmente, las células neoplásicas presentes en fragmentos de tumor o dispersas en efusiones de serosas, así como las procedentes de cultivos establecidos a partir de ellas, o de células normales que experimentaron el llamado fenómeno de transformación, presentan alteradones numéricas y/o morfológicas de sus cromosomas respecto al cariotipo

* Asistente de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Lisboa. Equiparada a be~aria por el Instituto de Alta Cultura, Lisboa.

normal. En algunos casos resulta de dichas alteraciones la aparición, en un cierto número de células, de uno o varios cromosomas de morfología anómala constante, a los que se denomina cromosomas marcadores por delatar la pertenencia a la misma estirpe celular. Se ha observado una cierta estabilidad de los cromosomas marcadores en diversas líneas celulares en cultivo permanente (vid. Harris, 1964, Giles y cols. 1966, y Toshima y cols. 1967).

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M. MARGARIDA CARDIGOS Y A. DEL AMO

Sin embargo, de los numerosos estudios publicados sobre los cromosomas de las células HeLa solamente se informa de la estabilidad de cromosomas marcadores durante períodos suficientemente largos por Cireli y cols. (1966), intervalo de dos años, y Spurna y Hill (1967), intervalo de diez meses. El presente trabajo consiste en una prospección del cariotipo de una línea de células HeLa a los dos años de haber sido estudiada por primera vez (del Amo y cols., 1969) a fin de comprobar si el patrón cromosómico, y en especial los marcadores que la caracterizaban, se habían mantenido a lo largo de ese tiempo.

MATERIAL Y MÉTODOS

El material y métodos empleados son los mismos que los de nuestro primer análisis (del Amo y cols., 1969). Las células nos fueron suministradas por segunda vez el 28 de septiembre de 1967, por la Universitiits Nervenklinik, de Colonia, procedentes igualmente de la Farbenfabrik Bayer, de Wuppertal.

RESULTADOS

El número cromosómico de las metafases recontadas varía de 68 a 75, siendo 71 cromosomas el número modal (fig. 1) y estando el 72,4 % del total de las células en las clases de 70 y 71 cromosomas, quedando en las clases superiores a la moda el 10,l % de las metafases y siendo la media 70,5 cromosomas. Mientras que en 297 metafases de esta misma estirpe de células HeLa estudiadas por del Amo y cols. (1969) el número modal era de 73 cromosomas, y su intervalo de variación de 67 a 79, estando el 85,8 % de las células en las clases de número cromosómicos de 71 a 75, quedando el 22,0 % en las clases superiores a la moda y siendo la media 72,4 cromosomas. La diferencia entre las medias de nuestros dos análisis resultó significativa con una probabilidad p < 0,001. Se hicieron recuentos en 69 metafases, y entre las de número de cromosomas próximo a la media (69 a 71 cromosomas), se eligieron 18 para el análisis morfológico y confección de cariotipos, que no poseían cromosomas superpuestos que

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Vol. Xlll

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74

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Fig. 1. Histograma de frecuencias de las metafases recontadas según el número de cromosomas de cada metafase.

Marzo 1969

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CROMOSOMAS MARCADORES EN UN STRAIN DE CELULAS HELA

dificultasen el reconocimiento de su morfología, y en las que los cromosomas tenían las dos cromátidas distinguibles. La distribución de los cromosomas de las metafases cariotipadas, según los grupos morfológicos del cariotipo humano normal, está expresada en la Tabla I, confeccionada con los mismos criterios con que se hicieron las tablas análogas de del Amo y cols. ( 1969). Se observa que, pese a ser menor el número medio de cromosomas de las células de la presente muestra, no obstante, se mantieTABLA I.

nen en ella los mismos rasgos que caracterizaban a esta línea en el análisis anterior, a saber: la condición hipertriploide, el déficit de elementos en el grupo morfológico 6-X-12 y el exceso en los grupos morfológicos D y E, relativamente a los valores triploides de grupo respectivos (fig. 2), y en especial el carácter más constante es la presencia de los dos cromosomas marcadores M1 y M 2 (fig. 3), que aparecen siempre en número de uno en cada célula, presentando idéntica morfología.

Análisis de los cariotipos. Grupos

A+B+C con 69 cromosomas 5248 * 5482 5183 5247 5252 5209 media con 70 cromosomas 5217 5479 5250 5253 5246 5478 media con 71 cromosomas 5193 5249 5157 5480 5481 5483 media media total valor triploide

36 32 32 32 31 31 32,3

34 34 33

32 31

31 32,5

B

e

9 9 9

6

21 18 19 20 18 20 19,3

9+2 9+2 9+3 9+3 9+1 9+1 9+2

9+3 9+5 9+3 9+3 9+6 9+6 9+4,3

4

4

5

5

5 6

6 5

6

5

6

5 5

20 20 19 18 19 18 19

9+3

9+2 9+1 9+2 9+2 9+2 9+2

9+2 9+4 9+5 9+5 9+7

6 5 5

5

6

5

9+8

5 5

4 4

9+5,1

5,3

4,8

9+3 9+2 9+1 9+2 9+2 9+1 9+1,8 9+1,9

9+

5

9+4 9+6 9+6 9+5 9+6 9+5,3 9+4,9

6 6

6 5

5 6 5 5,5 5,3

9

9

6

9 9

5 4 3 4

8,8

3 4,1

9

5

9 9 9 9 9 9

5

8

5 5 4 4

4,6

33,3

9 9 9

32,7

8,9

4,4

23 21 20 18 18 19 19,8 19,3

39

9

6

24

37 34 33 32 32 32

Marcadores

A

9

5

9 9 9

4 4 5 4 4

4,5

* número de microfotografía.

D

E

F

5,3

G

M1

M1

5 6

5 6 6

7 5,8 5,1 6

1 1

1 1

1 1

32

M. Iv!.\RGARIDA CARDIGOS Y A. DEL AMO

Vol. XI/f

Fig. 2. Metafase de una célula con 71 cromosomas. Los dos cromosomas marcadores han sido señaiados con una flecha. Microfotografía número 5249.

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Fig. 3. Parejas de cromosomas marcadores de seis metafases.

Mi: Cromosoma subtelocéntrico de tamaño igual o mayor que los elementos del tipo 1, con brazo corto de longitud semejante al de los elementos del grupo B, y frecuentemente con una constricción secundaria en el brazo largo, situada a una distancia del centrómero semejante a la longitud del brazo largo de dichos elementos B. M~: Cromosoma metacéntrico de longitud total igual o poco mayor que el brazo largo de los elementos del grupo G.

Para verificar dicha impresión se ha realizado en las distribuciones por grupos de los dieciocho cariotipos un test de homogeneidad, obteniendo un valor x2 de 11,78, que, para 102 grados de libertad, supone una probabilidad P>0,9995. Esto nos autoriza a acumular por grupos los cromosomas de los dieciocho cariotipos para compararlos, mediante un test de homogeneidad, con los correspondientes valores acumulados de del Amo y cols. (1969), obteniendo así un valor de x2 = 2,78, que para 6 grados de libertad supone una probabilidad 0,80 < P < 0,90 (Tabla II). DISCUSIÓN

Como hemos visto, nuestro segundo análisis revela una disminución, estadísticamente significativa, del orden de dos unidades, en la media de cromosomas por célula, y al mismo tiempo una conservación del patrón general de la distribución por grupos de los cromosomas

Mar zo 1969

CIWMOSO:l·IA S MARCADO;\ES EN UN STRAIN DE CELU LA S

de la línea, comprobada por el tes t de homogeneidad . La disminución de cromosomas se ha realizado aparentemente a expensas de los grupos C, E y G (Tabla II) . Es interesante destacar que en esta disminución estén implicados los grupos E y C, que en nuestro anterior análisis eran precisamente . los que presentaban una mayor variación respecto al valor triploide de grupo . Es notable la constancia de los dos marcadores existentes en las metafases recontadas, especialmente s1 se considera que esta estirpe celular ha sido culti vada a lo largo de estos dos años en medios de cultivo no idénticos, aunque el tipo de suero haya sido siempre humano en Wupper tal y de ternera en Colonia y Pamplona. Para valorar este hallazgo es preciso destacar que la mayoría de los estudios de cromosomas en células HeLa se han reducido a recuentos que definían la línea por el valor de la moda y los umbrales máximo y mínimo de variación '. del Amo y cols ., 1969).

Y mientras en diversas líneas celulares es tablecidas en cultivo permanente diferentes de HeLa se conoce la dinámica de los cromosomas marcadores, y su variación o estabilidad numérica y morfológica, por los trabajos de Hsu y Kellog (1959), Hsu (1961), Hsu y Moorhead (1957), Barski y cols. (1961), Ruddle (1961), Harris y Ruddle (1961), Auersperg (1964), Zakharov y cols. (1964), Za kbarov y cols. (1966), Den Beste y cols. (1966), Giles y cols. (1966), Toshima y cols. (1967) y Kato y Sandberg (1968), únicamente se han descrito cromosomas marcadores con frecuencias altas en las estirpes de células HeLa que sirvieron de material de trabajo a Clausen y Syverton (1962), German y col s. (1964), ,C ireli y cols. (1966), Martin y cols . (1966), Harris y cols. ( 1966) y Spurna y Hill (1967) Es de notar que de estos trabajos sólo el de Cireli y cols . (1966)

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M. MARGARIDA CAR.DIGOS Y A. DEL AMO

Vol. XIII

incluía dos análisi s cariotípicos en una misma estirpe de células HeLa con un intervalo de dos años: pero en este caso los marcadores variaban de 1 a 3 de célula en célula, y estaban presentes en sólo el 70 % de las células.

que tenemos noticia hasta el presente, el de presencia de cromosomas marcadores más constante en número y forma a lo largo del tiempo. Le hemos denominado Wuna-1, abreviatura de Wuppertal y Navarra .

Creemos, pues, que el strain (Fedoroff, 1967) por nosotros estudiado ha mantenido su patrón cromosómico y es, de todos los descritos de células HeLa de

Agradecemos la valiosa ayuda del Dr. Antonio Rodríguez-Burgos, Jefe del Laboratorio de Virología y la amable colaboración técnica de las Srtas. Guadalupe Arribas, Carmentxu García y María Luisa Pardo.

SUMMARY

Strict stability over two ycars of tlie cliromosome markers in a strain of HcLa cclls An analysis is presented of the cariotypes of Wuna-1 strain of HeLa cells currently cultured in our laboratory, and the results of this investigation are compared with those of a first analysis, made two years ago (del Amo et al., 1969). Although the sample here studied shows a mode of 71 chromosomes instead of 73 (73 was the outcome of our first analysis), the regular traits of the strain are

preserved: h ipertriploidy, shortage of the elements of the morphologic group 6-X-12, excess in morphologic groups D and E , as compared with the triploid values of the corresponding group, and specially the presence of two markers, M1 and M i, which show up constant in number and shape in ali 69 metaphases studied .

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