Rho-Effektor-Interaktion: Struktur-Funktionsbeziehungen

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Chemischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Dipl. Biochem. Lars Blumenstein aus Neuss

Heidelberg 2004

Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum Juli 2001 bis Juli 2004 in der Abteilung I Strukturelle Biologie - am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in Dortmund unter der Anleitung von Prof. Dr. Alfred Wittinghofer und PD Dr. Mohammad Reza Ahmadian angefertigt.

Erster Gutachter:

Prof. Dr. Alfred Wittinghofer

Zweiter Gutachter:

PD Dr. Andrea Blöchl

Dritter Prüfer:

Prof. Dr. Hermann Weingärtner

Simone gewidmet

Well life has funny way of sneaking up on you, when you think everything’s okay and everything going right. And life has a funny way of helping you out when you think everything’s gone wrong and everything blows up in you face. (Alanis Morisette - Ironic)

INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis 1

Einleitung......................................................................................................................... 1 1.1

Regulatorische GTP-bindende Proteine als Elemente der Signaltransduktion........1 1.1.1 1.1.2

1.2

Die GTPasen der Rho-Familie ................................................................................7 1.2.1

1.3

RhoGTP-spezifische Effektoren und ihre Bedeutung in der Signaltransduktion ............. 13 RacGTP-spezifische Effektoren und ihre Bedeutung in der Signaltransduktion.............. 15

Status Quo der Effektorinteraktion........................................................................17 1.4.1 1.4.2

1.5

Regulation der GTPasen der Rho-Familie.......................................................................... 9

Die Effektoren der Rho-Familie und ihre Bedeutung in der Signaltransduktion ..12 1.3.1 1.3.2

1.4

Die Ras-Superfamilie der kleinen regulatorischen GTPasen ............................................. 2 Guaninnukleotid-bindende Proteine als molekulare Schalter............................................. 6

Rho-Effektor-Interaktion.................................................................................................. 17 Rac/Cdc42-Effektor-Interaktion....................................................................................... 20

Aktivierung von Rho-Effektoren...........................................................................21

2

Zielsetzung ..................................................................................................................... 24

3

Material und Methoden................................................................................................ 25 3.1

Materialien.............................................................................................................25 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 3.1.9 3.1.10

3.2

Chemikalien ..................................................................................................................... 25 Enzyme............................................................................................................................. 26 Reagenzienkits ................................................................................................................. 26 Puffer und Lösungen ........................................................................................................ 26 FPLC-Säulenmaterialien .................................................................................................. 29 Mikroorganismen ............................................................................................................. 29 Vektoren........................................................................................................................... 29 Nährmedien und Antibiotika ............................................................................................ 30 Verbrauchsmaterialien ..................................................................................................... 31 Geräte ............................................................................................................................... 31

Methoden ............................................................................................................... 32 3.2.1 3.2.2 3.2.3

Molekularbiologische Methoden...................................................................................... 32 Proteinbiochemische Methoden ....................................................................................... 39 Biochemische und biophysikalische Methoden ............................................................... 50

I

INHALTSVERZEICHNIS

4

Ergebnisse ......................................................................................................................56 4.1

Struktur-Funktionsbeziehung der Rho·GTP-spezifischen Effektor-Interaktion ... 56 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6

4.2

Funktioneller Vergleich der GTPasen der Rac-Gruppe ........................................ 96 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4

5

Klonierung und Reinigung von GTPasen der Rho-Familie..............................................56 Klonierung und Reinigung von Effektorfragmenten ........................................................60 Untersuchung der RhoA·GTP-spezifischen ROCK-Interaktion .......................................62 Untersuchung der RhoGTP-spezifischen Interaktion von HR1-ähnlichen Domänen von Rho-Effektor-Proteinen. ...................................................................................................83 Diskriminierung verschiedener Effektorbindungsstellen..................................................89 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse .............................................................95

Klonierung und Isolierung von Rac1-3, Rac1b, und αPAK-GBD....................................96 Komparative Analyse der Rac-Isoformen Rac1, 2 und 3 .................................................96 Charakterisierung von Rac1b .........................................................................................101 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse ...........................................................104

Diskussion.....................................................................................................................105 5.1

Struktur-Funktionsbeziehung der Rho·GTP-spezifischen Effektor-Interaktion . 106 5.1.1 5.1.2

5.2

Die GTP-spezifische RhoA·ROCK-Interaktion .............................................................107 Vergleich der Interaktion verschiedener Strukturtypen ..................................................117

Funktioneller Vergleich der GTPasen der Rac-Gruppe ...................................... 129 5.2.1 5.2.2

Komparative Analyse der Rac-Isoformen Rac1, 2 und 3 ...............................................129 Charakterisierung von Rac1b .........................................................................................132

6

Zusammenfassung .......................................................................................................137

7

Literaturverzeichnis ....................................................................................................139

8

Anhang..........................................................................................................................156 8.1

Eigene Veröffentlichungen ................................................................................. 156

8.2

Abkürzungen ....................................................................................................... 156

Danksagung ...........................................................................................................................159 Lebenslauf..............................................................................................................................160

II

EINLEITUNG

1 Einleitung Grundvoraussetzung für die Entwicklung multizellulärer Organismen ist das Vorhandensein eines inter- und intrazellulären Kommunikationsnetzwerks. Dieses dient der Koordination von Wachstum, Differenzierung, Apoptose und des biochemischen Stoffwechsels einzelner Zellen sowie Zellverbänden. Wesentliche Elemente der Signaltransduktion sind die Freisetzung von spezifischen Signalen (Botenstoffe), deren Transport und Registrierung mittels Rezeptoren an der Zelloberfläche und die Weiterleitung in die Zelle (Transmission). Innerhalb der Zelle wird das Signal in vielen Fällen durch eine Serie nacheinander aktivierter Proteinkinasen weitergeleitet (Signalkaskade), eventuell verzweigt und in seiner Wirkung verstärkt bzw. durch andere Signalwege moduliert. Die daraus entstehende zelluläre Antwort besteht häufig in der differentiellen Expression von Genen. Da Fehlregulationen zum Zelltod oder unkontrollierter Zellteilung führen können, ist eine strikte Kontrolle der Signaltransduktion vonnöten. Krebs ist oftmals die extreme Folge einer Deregulation in zentralen Signalkaskaden des Zellwachstums und der Zellproliferation.

1.1 Regulatorische GTP-bindende Proteine als Elemente der Signaltransduktion Regulatorische Guaninnukleotid-bindende Proteine (GNBPs) nehmen in lebenden Zellen zentrale Positionen ein. Ihre Funktionen reichen von der ribosomalen Proteinbiosynthese, dem Nukleozytoplasmatischen Transport, der licht- oder hormon-induzierten Signalweiterleitung, der Translokation von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum, der Kontrolle von Zellwachstum und Differenzierung bis hin zum vesikulären Transport [Bourne et al., 1990]. Anhand von Sequenzhomologien und Funktionen lassen sich die GTP-bindende Proteine in fünf Superfamilien aufteilen: die α-Untereinheiten der heterotrimeren G-Proteine (Gα), die Ras-Superfamilie (siehe Abschnitt 1.1.1), die Translationsfaktoren der Proteinbiosynthese (IF-2, EF-Tu, EF-G, RF-3), das Signalerkennungspartikel SRP und sein Rezeptor SR sowie die großen GTP-bindenden Proteine (z. B. Dynamin, GBP, Mx). Zusätzlich gibt es GTPbindende Proteine, die sich keiner dieser Familien zuordnen lassen (z.B. Septine). Es wird geschätzt, dass etwa 50 bis 100 verschiedene GNBPs an den Abläufen in einer Säugerzelle beteiligt sind. Ihnen allen ist – trotz unterschiedlichster Aufgaben in der Zelle – die Magnesium-abhängige Bindung von GTP und dessen Hydrolyse zu GDP und Orthophosphat 1

EINLEITUNG gemeinsam. Aus diesem Grund verwendet man alternativ auch die Bezeichnungen regulatorische GTP-bindende Proteine oder regulatorische GTPasen.

1.1.1 Die Ras-Superfamilie der kleinen regulatorischen GTPasen Namensgebend für die Ras-Superfamilie ist das Ras-Protein, das ursprünglich aus einem Rattensarkom isoliert wurde (Ras = Rat sarcoma) [Barbacid, 1987] und an der Kontrolle von Wachstum und Differenzierung normaler und transformierter Zellen beteiligt ist [Macara et al., 1996; Wiesmuller und Wittinghofer, 1992]. In etwa 30 % aller menschlichen Tumore sind Mutationen von ras-Genen gefunden worden [Grunicke, 1995]. Onkogene Ras-Proteine bleiben ständig im aktiven, GTP-gebundenen Zustand, da sowohl die intrinsische als auch die GAP-stimulierte GTP-Hydrolysereaktion beeinträchtigt ist. Die Folge ist eine unkontrollierte Zellteilung, die zur Turmorbildung beiträgt [Bos, 1989; Chung et al., 1993; Neri et al., 1988; Seeburg et al., 1984]. Ras-homologe Proteine besitzen ein Molekulargewicht von 20-30 kD. Anhand von Sequenzhomologien wurden neun verschiedene Familien innerhalb dieser Superfamilie identifiziert, die in der Regel Proteine ähnlicher Funktion zusammenfassen. Zurzeit kennt man die Familien Ras, Rho, Rab, Arf, Ran, Rad, Rheb, Rit und Rag (Tabelle 1-1). Tabelle 1-1: Ras-Superfamilie der kleinen GTPasen

2

EINLEITUNG

Die Mitglieder der Ras-Subfamilie beeinflussen Apoptose, Proliferation und Differenzierung eukaryotischer Zellen [Vojtek und Der, 1998]. Aufgaben der Rho-Proteine (ras homologous) sind die Reorganisation des Zytoskeletts, sowie die Kontrolle des Zellwachstums und der Gen-Expression [Mackay und Hall, 1998; Sander und Collard, 1999]. Rab-Proteine (ras like proteins from rat brain) regulieren den Vesikeltransport [Rodman und Wandinger-Ness, 2000; Schimmoller et al., 1998], wobei Arf-Proteine (ADP-ribolsylation faktor) die Bildung von Vesikeln und ihren Transport von und zum endoplasmatischen Reticulum und zum Golgi-Apparat steuern [Jackson und Casanova, 2000; Moss und Vaughan, 1998]. Die RanProteine (ras related nuclear transport) sind an der Regulation des Kerntransports beteiligt [Moore, 1998]. Welche Rolle und Funktion Rad- (Ras-associated with diabetes), Rheb- (ras homolog enriched in brain), Rit- (ras-like expressed in many tissues) und Rag- (ras related GTP-binding proteins) Proteine spielen, ist noch weitgehend ungeklärt. Rheb-Proteine scheinen Antagonisten des Ras-Signalwegs zu sein [Clark et al., 1997; Yee und Worley, 1997], während Rit-Proteine an Calmodulin binden und möglicherweise an der Ca2+vermittelten Signaltransduktion beteiligt sind [Lee et al., 1996].

Sequenzmotive und G-Domänenfaltung Eines der häufigsten Sequenzmotive, das auch in anderen Nukleotid-bindenden Proteinen auftritt, ist die P-Schleife [Saraste et al., 1990], auch Walker A-Motiv [Walker et al., 1982]oder G1-Region [Bourne et al., 1991] genannt. Die Konsensussequenz lautet G/AxxxxGK(x)S/T mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit für Glycin an einer mit x bezeichneten Position. Das Motiv wurde zuerst in Adenylatkinase beobachtet [Schulz et al., 1974] und stellt eine Schleife dar, die mit ihrem Proteinrückgrat und dem konservierten Lysin-Rest die Phosphate des Nukleotids kontaktiert. Die Hydroxylgruppe von Serin bzw. Threonin ist ein Ligand für das Mg2+-Kation, welches die Sauerstoffatome des β- und γPhosphats bindet. Neben der P-Schleife lassen sich noch weitere, allerdings weniger stark konservierte Sequenzmotive identifizieren (Tabelle 1-2).

3

EINLEITUNG Tabelle 1-2: Sequenzmotive für die Nukleotidbindung durch Ras-homologe GNBPs

GNBPs: Guaninnukleotid-bindende Proteine; x: beliebige Aminosäure, aber mit erhöhter Wahrscheinlichkeit für Glycin. Aminosäuren sind im Einbuchstabencode angegeben. Unterstrichene Sequenzen kennzeichnen die für Ras und Rho als switch I bzw. II definierten Bereiche.

Der Vergleich zwischen GTP- und GDP-gebundener Form zeigt, dass sich die Interaktionen zwischen P-Schleife und Nukleotid während der Hydrolyse nicht ändern, während die der sogenannten Schalterregionen switch I und switch II starken Änderungen unterworfen sind. Diese Wechselwirkungen, insbesondere die des hoch konservierten Glycins (Pos. 60 in Ras) und des Threonins (Pos. 35 in Ras), dienen als Sensor für das Vorhandensein des γ-Phosphats und sind daher auch verantwortlich für Konformationsänderungen nach der Hydrolyse bzw. der Aktivierung durch erneute GTP-Bindung [Pai et al., 1990; Schlichting et al., 1990]. Betrachtet man die Strukturen der GNBPs in GTP- und GDP-Form wird deutlich, dass die Proteine durch den Verlust des γ-Phosphats starke Konformationsänderungen durchlaufen. Die größten Veränderungen finden sich in den Schalterregionen, die damit die Basis für die Nukleotid-abhängige Bindung von Effektoren bilden [Milburn et al., 1990] (Abbildung 1-1, hier für Rho-GTPasen dargestellt). Das switch I-Motiv weist innerhalb einer GNBP-Familie konservierte Bereiche auf, variiert jedoch zwischen den Familien sehr stark. Diese Variation erklärt sich dadurch, dass diese Sequenz für die Nukleotid-abhängige Bindung von Effektoren verantwortlich ist und damit innerhalb einer Familie die Spezifität bestimmt (sog. Effektorschleife). In der RasSuperfamilie reduziert sich dieses Motiv auf ein hoch-konserviertes Threonin, das mit seiner Hydroxylgruppe Mg2+ koordiniert und zusammen mit dem Amidwasserstoff des Rückgrats das γ-Phosphat bindet. Die Interaktionen von Threonin im switch I und Glycin im DxxGMotiv gelten als unmittelbare Auslöser der Konformationsänderungen nach der Hydrolyse 4

EINLEITUNG [Hilgenfeld, 1995; Vetter und Wittinghofer, 2001]. Die Motive G4 und G5 sind für die Erkennung der Guaninbase verantwortlich: die Seitenkette des Aspartats in G4 geht zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit der Base ein. Mutiert man diese Aminosäure in Ras zu Asparagin, ändert sich die Nukleotidspezifität von Guanin- zu Xanthinnukleotiden [Schmidt et al., 1996; Zhong et al., 1995]. Alanin in G5 erkennt mit dem Amidproton des Rückgrats das O6 der Base und unterscheidet damit Guanin von Adenin [Rensland et al., 1995].

Abb.1-1: Struktureller Vergleich der Konformationen von RhoA·GDP und RhoAG14V·GTPγS. Die Darstellung zeigt, dass sich Rho in der aktiven GTP-gebundenen Form (hier: GTPγS als Analogon für GTP) [Ihara et al., 1998] von der inaktiven GDP-gebundenen Form [Wei et al., 1997] unterscheidet. Die konformationellen Unterschiede beschränken sich allerdings auf zwei Bereiche, die auch Schalterregionen genannt werden (switch I und switch II; hier rot dargestellt). Die Phosphat-Schleife liegt in beiden Zuständen in fast identischer Konformation vor (P-Schleife, hier blau dargestellt).

Die bis heute bekannten Kristallstrukturen der GNBPs zeigen ein überraschend einheitliches Bild der zentralen Nukleotid-bindenden Domäne. Die Strukturen von Ras [Milburn et al., 1990; Pai et al., 1990], den Ras-homologen Proteinen Rho [Ihara et al., 1998; Wei et al., 1997], Rab [Ostermeier und Brunger, 1999], Arf-1 [Amor et al., 1994], Ran [Scheffzek et al., 1995] und den anderen Vertretern der GNBPs wie z. B. EF-Tu [Berchtold et al., 1993; Jurnak, 1985; Lacour et al., 1985], EF-G [AlKaradaghi et al., 1996], den α-Untereinheiten der heterotrimeren G-Proteine Transduzin und Gi [Coleman et al., 1994; Noel et al., 1993], hGBP1 [Prakash et al., 2000] sowie FtsY und Ffh [Freymann et al., 1997; Montoya et al., 1997] deuten auf ein gemeinsames Ursprungsprotein hin, dessen Faltungseinheit – die sogenannte G-Domäne – im Laufe der Evolution konserviert wurde. Mit Ausnahme von Ran und Rad weisen alle Vertreter der Ras-Superfamilie an ihrem CTerminus eine Signalsequenz (CaaX, CC, CxC oder CCxx) auf. Dieses Motiv dient der Membranverankerung durch posttranslationale Modifikation mit hydrophoben Gruppen. 5

EINLEITUNG GNBPs mit einer so genannten CaaX-Box sind Substrate einer Farnesyltransferase wenn die C-terminale Aminosäure X ein Met, Ser, Gln oder Cys ist. Im Fall von X = Leu modifziert dagegen eine Geranylgeranyltransferase das Protein [Moores et al., 1991]. Für Rab-Proteine existiert eine spezifische Geranylgeranyltransferase, die im Zusammenspiel mit dem RabEskortprotein REP ein oder zwei Geranylgeranylreste an die C-terminalen Aminosäuren CC, CxC oder CCxx anhängt [Anant et al., 1998].

1.1.2 Guaninnukleotid-bindende Proteine als molekulare Schalter Zwei Eigenschaften sorgen dafür, dass die Vertreter der Ras-Superfamilie hervorragend an ihre Aufgaben in der Signaltransduktion angepasst sind: ihre Affinität zu den Guaninnukleotiden ist recht hoch (KD ≈ 10-7 bis 10-11 M) und ihre intrinsische Hydrolyserate ist mit 0.0015 min-1 (Arf1; [Weiss et al., 1989]) bis 0.12 min-1 (Rab5; [Simon et al., 1996]) sehr langsam [Bourne et al., 1991]. Durch diese Konstellation ist es relativ unwahrscheinlich, dass das Nukleotid ohne äußeren Einfluss dissoziiert oder dass GTP spontan zu GDP und Orthophosphat hydrolysiert wird. Erst durch den Einfluss von regulatorischen Proteinen werden beide Vorgänge beschleunigt (siehe Abbildung 1-5). Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs, guanine nucleotide exchange factors) erhöhen die Rate, mit der das Nukleotid vom Protein dissoziiert, um etwa Faktor 105. Unter zellulären Bedingungen ist die Konzentration von GTP höher als die von GDP, so dass (im nächsten Schritt) mit höherer Wahrscheinlichkeit GTP gebunden wird. Effektoren erkennen GNBPs per Definition in der GTP-Form, so dass man diese Form auch als aktiven Zustand bezeichnet. GTPase-beschleunigende Proteine (GAPs, GTPase activating proteins) binden an die GTPForm des GNBPs und erhöhen die Rate, mit der GTP hydrolysiert wird, ebenfalls um etwa Faktor 105. In der Regel sind diese Proteine spezifisch für ein bestimmtes GNBP [Scheffzek et al., 1998; Trahey und McCormick, 1987]. Treten in einem GNBP Mutationen auf, die dazu führen, dass GAPs die Hydrolyse bzw. GEFs den Nukleotidaustausch nicht länger stimulieren können, wird dadurch der Regulationszyklus unterbrochen.

6

EINLEITUNG

1.2 Die GTPasen der Rho-Familie Bei Säugern sind bis heute 19 verschiedene Proteine bekannt, die der Rho-Familie zugeordnet werden und aufgrund ihrer Primärsequenzhomologien (Abb.1-2) in fünf Gruppen unterteilt werden können [Bishop und Hall, 2000; Ellis und Mellor, 2000; Vignal et al., 2000; Wennerberg und Der, 2004]: •

Rho-Gruppe (RhoA, B, C)

•

Rac-Gruppe (Rac1, 1b, 2, 3, RhoG)

•

Cdc42-Gruppe (Cdc42, Rif, Wrch-1, Chp)

•

RhoD-Gruppe (RhoD, TC21, TCL)

•

Rnd-Gruppe (Rnd1/Rho6, Rnd2/Rho7, Rnd3/RhoE/MemB, RhoH/TTF)

Von diesen Proteinen gehören Cdc42, Rac1 und RhoA zu den am besten untersuchten Proteinen der Rho-Familie [Hall, 1998].

Abb.1-2: Sequenzvergleich der GTPasen der Rho-Familie. Der Sequenzvergleich wurde mittels GCG und der Sequenzen der humanen GTPasen der Rho-Familie erstellt und im Programm GeneDoc bearbeitet. Vollkommen konservierte Bereiche (100 % übereinstimmende Aminosäuren) sind schwarz hinterlegt. Stellen, bei denen Aminosäuren in den GTPasen durch verwandte Aminosäuren (z.B. K/R) ersetzt sind bzw. die zu 80 % konserviert sind, wurden grau hinterlegt. Die Reste, die in über 50 % aller GTPasen vorkommen, wurden blau markiert.

Im Gegensatz zu den onkogenen Ras-Proteinen, die durch Punktmutation konstitutiv aktiviert werden und so zur Tumorentstehung beitragen, hat man bisher keine mutierten Rho-Proteine in Tumoren entdeckt. Dennoch spielt diese Proteinfamilie eine zentrale Rolle bei 7

EINLEITUNG Tumorprogression und Metastasierung [Price und Collard, 2001; Schmitz et al., 2000]. Diese Eigenschaft beruht auf einem erhöhten Expressionslevel und der veränderten Aktivität der Regulatorproteine (GEFs). Rho-Proteine regulieren eine Anzahl unterschiedlicher biologischer Prozesse, deren Signalübertragung biologisch sehr gut untersucht ist. (Abb.1-3).

Abb.1-3: Aktivierung der Rho-GTPasen und zelluläre Funktionen. Rho-Proteine sind über eine Isoprenylgruppe an der Plasmamembran verankert, wo sie als molekularer Schalter durch eine Vielzahl extrazellulärer Liganden aktiviert werden. In ihrer aktiven, GTP-gebundenen Form leiten sie das Signal an verschiedene Effektorproteine weiter, die ihrerseits eine Reihe von biologischen Prozessen, z.B. die Reorganisation des Zytoskeletts oder die Transkription kontrollieren. Transiente Transfektionsexperimente an Fibroblasten haben gezeigt, dass die Rho-GTPasen auch untereinander wechselwirken. So kann in bestimmten Rac von Cdc42 aktiviert werden, welches unter gewissen Bedingungen wiederum Rho aktiviert kann.

Dazu gehören Morphogenese, Phagozytose, Pinozytose, Zytokinese, Axonwachstum, ZellZell-Adhäsion, Zell-Substrat-Adhäsion, Zellpolaritität, Zellzyklus und Zellbewegung [Hall, 1998]. Die letztere ist entscheidend für die embryonale Entwicklung, sowie für Immunantwort, Wundheilung, Tumorbildung und Metastasierung [Horwitz und Parsons, 1999]. Prozesse, die durch extrazelluläre Liganden (Wachstumsfaktoren und Zytokine) angeschaltet werden (Abb.1-3),

werden

überwiegend

durch

den

membranvermittelten

Aufbau

des

Aktinzytoskeletts kontrolliert. Die unterschiedliche subzelluläre Lokalisation der RhoProteine geht mit ihren biologischen Funktionen einher: sie sind sowohl an der Regulation der Aktinpolymerisation an Membranen, als auch an der Kontrolle der Genexpression über Signalkaskaden von der Plasmamembran in den Kern beteiligt [Mackay und Hall, 1998]. Die Cdc42-vermittelte Polymerisation von Aktin führt zu langen, fingerähnlichen Ausstülpungen der Zellmembran (Filopodien). Rac1 induziert die Ausbildung netzartiger Membranfortsätze (Lamellipodien). RhoA hingegen reguliert einerseits die Ausbildung von 8

EINLEITUNG Aktinomyosinfasern (Stressfasern), die eine wichtige Rolle bei der Zellkontraktion spielen, und andererseits die Entstehung von Adhäsionsplaques, die für die Zell-Substrat-Adhäsion essentiell sind (Abb.1-4).

Abb.1-4: Wirkung der jeweiligen Rho-Proteine auf die Organisation des Zytoskeletts. Rho, Rac und Cdc42 kontrollieren den Aufbau und die Organisation des Zytoskeletts. Ruhende Swiss 3T3 Fibroblasten unter Serumentzug (-) enthalten sehr wenig organisierte Aktinfilamente (A). Der Effekt von Rho-, Rac- oder Cdc42Aktivierung in diesen Zellen kann auf verschiedene Weise beobachtet werden, z.B. durch Zusatz extrazellulärer Wachstumsfaktoren, Mikroinjektion aktivierter GTPasen oder Mikroinjektion von GEFs. Zusatz des Wachstumsfakotors Lysophosphatidylsäure aktiviert Rho, was zur Entstehung von Stressfasern führt (B). Mikroinjektion von konstitutiv aktivem Rac induziert die Bildung von Lamellipodien (C). Mikroinjektion von FGD1, einem Austauschfaktor für Cdc42, führt zur Entstehung von Filopodien (D). Die Aktinfilamente wurden mit Phalloidin-Rhodamin gefärbt; Maßstab: 1 cm = 25 µm. (Abb. modifiziert nach Hall, 1998)

1.2.1 Regulation der GTPasen der Rho-Familie Die Funktion der Rho-Proteine als molekularer Schalter hängt wie bei den anderen Mitgliedern der Ras-Superfamilie von ihrem nukleotid-gebundenen Zustand ab. Wie fast alle GTPasen durchlaufen sie einen Regulationszyklus mit einem inaktiven, GDP-gebundenen Zustand und einem aktiven, GTP-gebundenen Zustand, in dem die Signalweiterleitung durch Bindung von Effektorproteinen möglich ist. Die Regulation erfolgt im Gegensatz zu anderen Familien der Ras-Superfamilie nicht durch zwei sondern durch drei strukturell und funktionell unterschiedliche Proteinfamilien (Abb.1-5): 1. Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs, guanine nucleotide exchange factors) [Cerione und Zheng, 1996] 2. GTPase-aktivierende Proteine (GAPs, GTPase activating proteins) [Lamarche und Hall, 1994] 3. Guaninnukleotid-Dissoziations-Inhibitoren (GDIs, guanine nucleotide dissociation inhibitors) [Olofsson, 1999]

9

EINLEITUNG

Abb.1-5: Schematische Übersicht der Regulation der Rho-GTPasen. Die Rho-Proteine zirkulieren zwischen dem aktiven, GTP-gebundenen und dem inaktiven, GDP-gebundenen Zustand. Dieser An-/Aus-Status an der Membran wird durch GAPs und GEFs reguliert. Durch die Relokalisation von der Membran ins Cytoplasma verhindern GDIs die Aktivierung durch GEFs, indem sie die Rho-GTPasen vom Ort ihrer Aktivierung und Wirkung entfernen. Durch Interaktion mit ERM (Ezrin-Radixin-Moesin)-Proteinen kann GDP-gebundenes Rho aus dem Komplex mit GDI dissoziieren und durch GEFs wieder aktiviert werden. In der aktivierten Form übertragen Rho-Proteine das empfangene extrazelluläre Signal auf diverse Effektormoleküle, die das Signal amplifizieren und weiterleiten.

Nukleotidaustauschfaktoren Nukleotidaustauschfaktoren aktivieren GTPasen, indem sie die Dissoziation von GDP katalysieren. RhoGEFs werden durch extrazelluläre Signale aktiviert und/oder zur Zellmembran rekrutiert, wo sie dann spezifisch den Austausch von GDP zu GTP katalysieren. Alle Rho-spezifischen GEFs gehören zur Dbl-Familie, welche eine Dbl-homologe Domäne (DH), die für die GEF-Aktivität verantwortlich ist, enthalten. Der DH-Domäne folgt in der Sequenz immer eine Pleckstrin-homologe Domäne (PH), die an Inositol-Phospholipide bindet und somit als eine membranbindende Domäne betrachtet wird [Cerione und Zheng, 1996; Irvine, 1998]. Den PH-Domänen von Trio und SOS wurde eine direkte regulierende Wirkung auf die DH-Aktivität zugeschrieben. Dies zeigte die Kristallstruktur von SOS, welche eine direkte Interaktion von den DH- und PH-Domänen bestätigt [Liu et al., 1998; Soisson et al., 1998]. Dagegen zeigt die Kristallstruktur der DH-PH-Domäne von Tiam1 im Komplex mit Rac1 keine Interaktion der PH- mit der DH-Domäne [Worthylake et al., 2000]. Zusätzliche Domänen der jeweiligen GEFs kontrollieren möglicherweise die Variabilität der intrazellulären Lokalisation [Cerione und Zheng, 1996]. p115RhoGEF besitzt beispielsweise neben dem DH/PH-Tandem noch eine RGS-Domäne, die als GAP für die α-Untereinheit von 10

EINLEITUNG heterotrimeren G-Proteinen fungiert [Kozasa et al., 1998]. Von den über 30 bis heute bekannten DH-Proteinen besitzen 10 onkogene Eigenschaften. So ist Bcr ist an der Entwicklung von Leukämie und Tiam1 an der Tumorinvasion und Metastasierung beteiligt. Erhöhte Genexpression oder veränderte subzelluläre Lokalisation dieser Proteine führt zur Fehlregulation und Aktivierung der Rho-Proteine, und anschließend zur veränderten Zellproliferation [Stam und Collard, 1999]. Dies wäre auch eine Erklärung für die erhöhte, abnormale Aktivität der Rho-Proteine in manchen metastasierenden Tumoren [Clark et al., 2000; del Peso et al., 1997]. GTP-Hydrolyse-stimulierende-Proteine Die Beendigung der Signalübertragung wird durch RhoGAPs reguliert, von denen bisher 20 Vertreter bekannt sind. Die sehr langsame GTP-Hydrolyse der Rho-Proteine wird durch GAPProteine 105-fach beschleunigt [Graham et al., 1999; Wittinghofer et al., 1997]. Anhand

der

Kristallstruktur

des

Ras-p120GAP-Komplexes

in

Anwesenheit

von

Aluminiumfluorid [Scheffzek et al., 1997] und durch biochemische Charakterisierung des Einflusses verschiedener Aminosäuren [Ahmadian et al., 1997] konnte gezeigt werden, dass GAP-Proteine aktiv an der GTP-Hydrolyse beteiligt sind. Aluminiumfluorid bindet in Gegenwart von GDP anstelle des γ-Phosphats und ahmt aufgrund seiner trigonalbipyramidalen Koordination den Übergangszustand der GTP-Hydrolyse-Reaktion nach. [Mittal et al., 1996]. Für die Stabilisierung des Übergangszustands ist sowohl Glutamin 61 von Ras (Q63 in Rho), als auch die Einführung eines Arginin-Restes des GAP-Proteins in das aktive Zentrum der GTPase essentiell. Dieser sogenannte Argininfinger [Ahmadian et al., 1997] neutralisiert die negative Ladung und ermöglicht den in-line Angriff des nukleophilen Wassermoleküls. Der Arginin-Rest ist in den meisten bekannten Ras- und RhoGAPs konserviert [Scheffzek et al., 1997]. Dieser Einblick in den Mechanismus der GTP-Hydrolyse lieferte gleichzeitig die Erklärung für die Onkogenizität von Ras in Bezug auf die am häufigsten vorkommenden onkogenen Mutationen im Ras-Gen, Glycin 12 und Glutamin 61. Fehlt nämlich die Glutaminseitenkette, so erfolgt keine Stabilisierung des für den nukleophilen Angriff auf das γ-Phosphat verantwortlichen Hydroxylions. Eine Substitution des Glycins durch eine andere Aminosäure verwehrt dem Argininfinger sterisch den Zugang zum aktiven Zentrum [Scheffzek et al., 1997]. Ras ist dadurch in einem konstitutiv aktiven, GTP-gebundenen Zustand und kann auch durch GAP-Proteine nicht mehr inaktiviert werden. Vergleichbare Mechanismen konnten ebenfalls bei den Rho-Proteinen identifiziert werden. [Hoffman et al., 1998; Rittinger et al., 1997a; Rittinger et al., 1997b]. 11

EINLEITUNG Nukleotiddissoziation-inhibierende-Proteine Die Rho-GTPasen unterliegen zusätzlich einem dritten Regulationsmechanismus durch RhoGDIs (drei Vertreter bekannt). Diese binden an den posttranslational C-terminal angefügten Isoprenylrest der GDP-gebundenen Rho-Proteine, maskieren diesen und entfernen damit das Protein von der Plasmamembran. Im Zytoplasma ist der Nukleotid-Austausch durch die membranassoziierten RhoGEFs nicht mehr möglich. Durch eine Interaktion der ERM (Ezrin, Radixin, Moesin)-Proteine mit RhoGDI wird GDP-gebundenes Rho vermutlich aus dem Komplex mit GDI verdrängt und kann nach Membranreassoziation wieder von GEFs aktiviert werden [Olofsson, 1999] (Abb.1-5).

1.3 Die Effektoren der Rho-Familie und ihre Bedeutung in der Signaltransduktion Die Signalweiterleitung der Rho-Proteine erfolgt in der aktiven, GTP-gebundenen Form durch Wechselwirkung mit Effektorproteinen [Bishop und Hall, 2000; Schmitz et al., 2000; Van Aelst und D'Souza-Schorey, 1997]. Aufgrund der Vielfalt wichtiger zellulärer Prozesse, an denen die RhoGTPasen beteiligt sind, wurden zahlreiche Versuche unternommen, diese Ziel- oder Effektorproteine zu bestimmen und die Signalübertragung zwischen dem aktiven Schalter und dem Effektor zu verstehen. Bis heute sind mehr als 30 potentielle Effektoren für Rho, Rac und Cdc42 bekannt, die primär durch das Zwei-Hybrid-System und affinitätschromatographische Methoden wie GST-Pulldown- oder Filter-Bindungs-Assays identifiziert wurden [Bishop und Hall, 2000; Van Aelst und D'Souza-Schorey, 1997]. Eine wichtige Eigenschaft von Effektoren ist die Fähigkeit, zwischen dem GDP und dem GTP-gebundenen Zustand unterscheiden zu können. Sie werden durch Interaktion mit dem GTP-gebundenen Zustand aktiviert und geben das Signal an nachgeschaltete Moleküle weiter. Auf diese Weise kann das Signal amplifiziert werden. Abb.1-6 zeigt die Domänenarchitektur verschiedener Effektorproteine. Die meisten bisher bekannten Effektoren sind entweder Kinasen oder Adaptorproteine. Darüber hinaus verfügen sie über eine Bandbreite von funktionellen Domänen, deren exakte Funktion bei vielen Effektorproteinen unbekannt ist, die aber vermutlich eine Einbindung des Effektors in verschiedene Signalwege ermöglicht.

12

EINLEITUNG

Abb.1-6: Domänenarchitektur verschiedener Rho-Effektoren und des Rac/Cdc42-Effektors PAK. Die Darstellung zeigt die Anordnung, Lage und Größe der Domänen annährend ihrer realen Größe in den jeweiligen Proteinen. CC: coiled-coil Domäne; C2-like: C2-ähnliche Domäne; CNH: Citron-homologe Domäne; CRD: Cystein-reiche Domäne; DI: Dimerisierungsbereich; GBD: GTPase-bindende Domäne; IS: inhibitorisches Segment; KI: Kinase inhibierendes Segment; PDZ: PSD-95, Disc-large & ZO-1; P: Prolin-reiche Region; PIX: PIX-bindende Domäne; PH: Pleckstrin-homologe Domäne; RBD: Rho-bindende Domäne; SH3: Src-homologe Domäne 3; Zn: Zink-bindende Domäne.

1.3.1 RhoGTP-spezifische

Effektoren

und

ihre

Bedeutung

in

der

Signaltransduktion Die Rho-Effektoren Protein-kinase C related kinase 1 (PRK1, auch PKNα genannt), Rhotekin, Rhophilin, Citron Kinase, Diaphanous (Dia) und Rho-associated coiled coil kinase (ROCK) kontrollieren verschiedene aktinomyosinvermittelte zelluläre Prozesse (Abb. 1-7).

Abb.1-7: Überblick über die zellulären Prozesse von Rho-Effektoren. Kinasen sind grün unterlegt, Adapterproteine rot. Da für Diaphanous kürzlich gezeigt werden konnte, dass es sich bei diesem um mehr als ein reines Adapterprotein handelt [Shimada et al., 2004], ist es hier separat gekennzeichnet.

13

EINLEITUNG ROCK ROCK-Proteine sind die mit am besten untersuchten Rho-Effektoren. Zwei Isoformen, ROCKI/ROKβ/p160ROCK und ROCKII/ROKα/Rho Kinase, wurden bisher identifiziert, die eine 65 %ige Gesamtidentität und 95 % Homologie bezüglich. ihrer Kinasedomäne besitzen [Fujisawa et al., 1996; Leung et al., 1996; Matsui et al., 1996; Nakagawa et al., 1996]. Sie gehören darüber hinaus zu einer Gruppe von Ser/Thr-Kinasen, deren Gemeinsamkeit eine ähnliche Domänenarchitektur ist und zu denen neben den ROCKs auch DMPKs (myotonic dystrophy protein kinase) und MRCKs (myotonic dystrophy kinase related Cdc42-binding kinase) gehören. Sie bestehen aus einer N-terminalen Kinase-Domäne, gefolgt von einer potentiellen coiled-coil Domäne und anderen funktionellen Domänen am C-Terminus. Bei ROCK sind dies eine PH-Domäne, von der man vermutet, dass sie in der Proteinlokalisierung eine Rolle spielt, und eine Cystein-reiche Region (CRD), deren Funktion noch unbekannt ist. Die Rho-bindende Domäne liegt innerhalb der coiled-coil-Domäne und ist verantwortlich für die Erkennung und Bindung von aktivem Rho (Abb. 1-6). Obwohl sie als Mediatoren von Stressfasern und fokaler Adhäsionen entdeckt wurden [Leung et al., 1996], haben Studien inzwischen gezeigt, dass ROCK-Proteine in vielen anderen zellulären Prozessen wie aktinomyosinbasierter Kontraktilität [Kimura et al., 1996], Phagozytose [Caron und Hall, 1998] und Apoptose [Coleman et al., 2001; Sebbagh et al., 2001], Zytokinese und Mitose [Yasui et al., 1998], sowie Zellmigration [Worthylake und Burridge, 2001] beteiligt sind [Riento und Ridley, 2003]. Eine abnormale Aktivierung von ROCK spielt bei der Transformation [Sahai et al., 1998], der Tumorinvasion und der Metastasierung von Zellen [Itoh et al., 1999], aber auch bei Krankheiten wie Hypertonie und bronchialem Asthma eine wesentliche Rolle [Kawano et al., 1999; Wettschureck und Offermanns, 2002]. PRKs Ein Grund, warum PRKs bezüglich ihrer zellulären Funktion nicht so gut verstanden sind wie ROCKs, ist das Nichtvorhandensein eines zellulären Markers (bei ROCK das Ausbilden von Stressfasern), mit dem die Aktivierung bzw. die Zielproteine (downstream targets) dieser Kinasen untersucht werden können. Als Effektoren der Rho-Familie ist es nicht überraschend, dass auch die PRKs eine Rolle bei der Regulation des Zytoskeletts spielen. Zielproteine wie α-Actinin, Vimentin oder Untereinheiten des Neurofilaments sind am Aufbau des Zytoskeletts (vor allem des intermediären Filaments) beteiligt [Matsuzawa et al., 1997; Mukai et al., 1996; Mukai et al., 1997]. Darüber hinaus werden PRKs mit zellulären Prozessen wie der Kontrolle von 14

EINLEITUNG Transkriptionsfaktoren [Kitagawa et al., 1998; Takanaga et al., 1998], dem Vesikeltransport [Gampel et al., 1999; Ridley, 2001], der Mitogenese [Gao et al., 2000], der ZellzyklusRegulation [Misaki et al., 2001] und der Apoptose [Takahashi et al., 1998] in Verbindung gebracht. Die PKN/PRK-Familie von Ser/Thr-Kinasen besteht aus den drei Isoformen PKNα/PRK1, PKNβ und PKNγ/PRK2. Die grundlegende Domänenarchitektur ist in Abb.1-6 für PRK1 dargestellt. PRKs verfügen über eine N-terminale regulatorische Domäne, die aus drei homology region 1 (HR1)-Motiven (auch als leucine-zipper-artige (LZ) oder antiparallel coiled coil (ACC)-Domäne bezeichnet; HR1a-c) besteht, gefolgt von einer C2-ähnlichen Domäne und einer C-terminalen Kinase-Domäne. Einige Isoformen weisen zwischen C2- und Kinase-Domäne noch Prolin-reiche Regionen auf. Die Kinase-Domäne besitzt eine hohe Homologie zu Kinasen der AGC-Familie, zu denen auch die PKCs (Protein Kinase C Unterfamilie) gehören [Mukai, 2003]. Rhotekin Die Rolle des Adapterproteins Rhotekin ist derzeit noch weitgehend unbekannt. Neben einer N-terminalen HR1-ähnlichen Domäne, mit der es an aktives Rho binden kann, verfügt Rhotekin darüber hinaus nur über zwei Prolin-reiche Regionen im C-terminalen Bereich. Bisher konnte gezeigt werden, dass Rhotekin über seinen absoluten C-Terminus (also mit keiner der P-Domänen) das PDZ-Protein TIP-1 binden und über Ausbildung eines tetrameren Komplexes zwischen aktivem RhoA am N-Terminus von Rhotekin und TIP-1 am C-Terminus, dass das Serum-Response Element (SRE) aktivieren kann [Reynaud et al., 2000].

1.3.2 RacGTP-spezifische

Effektoren

und

ihre

Bedeutung

in

der

Signaltransduktion Zu den bekanntesten Rac-Effektoren zählen PAK, IRSp53, PI5K, Por1/Arfaptin und p67Phox. Die Bindung von Rac an IRSp53 führt zur Komplexbildung mit Wave und anschließend zur Rekrutierung eines Arp2/3-Proteinkomplexes, wodurch Aktinnukleation und -polymerisation induziert werden [Miki et al., 2000]. PI5K-Aktivierung durch Rac1 führt zur Erhöhung des zellulären PIP2-Gehaltes, was einerseits die capping-Proteine von den Aktinfasern freisetzt und andererseits die Dissoziation des G-Aktins von Profilin beschleunigt [Carpenter et al., 1999]. Die Wechselwirkung von Rac1 mit Arfaption/Por1 induziert die Ausbildung von Lamellipodien und „membrane ruffles“ [Van Aelst et al., 1996]. Details dieses Signalweges 15

EINLEITUNG sind jedoch noch unbekannt. Rac besitzt eine wichtige Funktion bei der zellulären Abwehr gegen Infektionen. Die direkte Interaktion von Rac mit p67phox ist essentiell für die Regulation der NADPH-Oxidase-Aktivität bei der Produktion von reaktiven Sauerstoffmolekülen (Superoxid), die einen wichtigen Abwehrmechanismus der phagozytischen Zellen darstellen [Diekmann et al., 1994; Koga et al., 1999]. PAK Die p21-aktivierten Proteinkinasen (PAK) gehören zu den am besten untersuchten Rac/Cdc42-Effektoren, die eine entscheidende Rolle bei der Aktindynamik und Zelladhäsion spielen. Ihre bekanntesten Mitglieder sind die in Säugerzellen exprimierten PAK-Isoformen (PAK 1-6), die PAK-homologen Ste20 und Cla4 aus Saccharomyces cerevisiae und die Myotone-Dystrophie-verwandte Kinase, die unter anderem an der Kontrolle des Zellzyklus, Änderungen des Aktinzytoskeletts, Apoptose und Regulation der Gentranskription beteiligt sind [Bagrodia und Cerione, 1999; Daniels und Bokoch, 1999; Knaus und Bokoch, 1998]. Bei Säugetieren unterscheidet man zwischen dem 68 kDa αPAK (PAK1), dem 65 kDa βPAK (PAK3), dem ubiquitär vorkommenden γPAK (PAK2 oder hPAK65) und den kürzlich entdeckten PAK4, 5 und 6 [Abo et al., 1998; Bagrodia et al., 1995; Dan et al., 2001; Knaus et al., 1995; Manser et al., 1995; Martin et al., 1995]. Die PAK-Isoformen besitzen eine N-terminale regulatorische Domäne (RD) und am CTerminus eine hochkonservierte Kinasedomäne (CD), wobei erstere inhibierend auf die Kinasedomäne wirkt. Aus der Sequenz und aus der kürzlich gelösten Kristall-Struktur von humanem PAK1, die ein regulatorisches Fragment (AS 70-175) im Komplex mit der Kinasedomäne (AS 249-545) in der autoinhibierten Form zeigt, lassen sich mehrere funktionelle Einheiten in PAK ableiten [Lei et al., 2000] (siehe Abb.1-6). Der N-terminale Bereich von PAK enthält neben der konservierten CRIB (Cdc42/Rac interaktive Bindungsregion), auch GBD (GTPase-bindende Domäne) genannt, mehrere prolinreiche Sequenzen und eine Region mit überwiegend sauren Aminosäureresten, in der sich auch die PIX-bindende Domäne befindet. Während die ersten drei Isoformen durch Bindung der GTPase aktiviert werden, ist dies bei letzteren nicht der Fall. PAK4, 5 und 6 sind konstitutiv aktiv, sie binden zwar über die GBD an Cdc42, doch ihre Kinaseaktivität wird nicht durch GTP-beladenes Cdc42 stimuliert. Abo et al. (1998) konnten zeigen, dass PAK4, wenn es an aktiviertes Cdc42 bindet, zum GolgiApparat rekrutiert wird. Diese Translokation ist möglicherweise entscheidend für die Bildung von Filopodien und die Aktinpolymerisierung. Zwischen den ersten drei PAK-Isoformen und PAK4, 5 und 6 werden Unterschiede in der Sequenz deutlich, deren Homologie innerhalb der 16

EINLEITUNG Kinase-domäne nur 53 % beträgt. Größere Unterschiede werden auch in der regulatorischen Domäne sichtbar, so fehlt ihr in PAK4 ein Teil des inhibitorischen Segments und die komplette kinaseinhibierende Region [Abo et al., 1998].

1.4 Status Quo der Effektorinteraktion Wie bereits oben beschrieben, zeigen sich Konformationsunterschiede zwischen GDP- und GTP-gebundenem Zustand hauptsächlich in den Schalterregionen switch I (AS 26-45, Rac/Cdc42-Numerierung) und switch II (AS 59-74) [Ihara et al., 1998; Wei et al., 1997]. Mutationsstudien haben gezeigt, dass Effektor-Proteine nicht nur zwischen aktivem und inaktivem Zustand der GTPase unterscheiden, sondern für sie spezifische Regionen auch außerhalb der (aufgrund der Studien bei Ras-Effektoren bezeichneten) Effektorschleife erkennen. Als solche Regionen konnten der switch II, die Loop6- (AS 86-91), β2/β3- (AS 46-58) und α5-Region (AS 164-179) für die Effektor-Bindung identifiziert werden [Fujisawa et al., 1998; Joneson et al., 1996; Lamarche et al., 1996; Maesaki et al., 1999a; Sahai et al., 1998; Zong et al., 1999]. Es wurde lange Zeit vermutet, dass eine für Rho-Proteine spezifische, helikale Insertion (Aminosäuren 123 – 135, Rac/Cdc42-Numerierung) für die Effektorbindung verantwortlich ist, da die Helix über viele exponierte geladene Seitenketten verfügt. Jedoch konnte für keinen Effektor bisher eine Bindung an diese Region gezeigt werden. Allerdings gibt es Hinweise, dass die Insert-Helix für die Aktivierung zumindest einiger Effektoren eine Rolle spielt [Zong et al., 1999].

1.4.1 Rho-Effektor-Interaktion Anhand von Experimenten mit Rho/Rac-Chimären wurden die Rho-selektiven Regionen für die Rho-bindenden Domänen (RBD) von verschiedenen Effektoren ermittelt und anhand ihres Bindungsprofils in Klassen unterteilt [Fujisawa et al., 1998] (Abb.1-8).

17

EINLEITUNG

Abb.1-8: Vorgeschlagene Bindungsstellen der drei RBD-Klassen der RhoEffektoren auf RhoA. Fujisawa et al. haben gezeigt, dass für die Bindung verschiedener Effektoren unterschiedliche Bindungsstellen auf RhoA essentiell sind, die verschiedene Effektor-Klassen definieren. Klasse I (Rhophilin): AS 75-92 (grün); Klasse III (Citron): AS 23-40 (rot); Klasse II (ROCK): AS 23-40 & 92-119 (rot und blau) (nach [Fujisawa et al., 1998]; dargestellt auf RhoA·GTPγS-Struktur).

Die drei ermittelten Klassen weisen nur sehr wenig Homologie in ihrer Aminosäure-Sequenz auf. Klasse I- Effektoren / REM-Proteine Eine Ausnahme bilden hierbei nur die REM-Proteine (Rho effector homology) Rhotekin, Rhophilin und PRK1/PKNα, die alle über eine konservierte HR1-ähnliche RBD verfügen. Während Rhotekin und Rhophilin jeweils eine HR1-Domäne am N-Terminus besitzen (Abb.1-6), weist die PRK1-Domänenarchitektur drei dieser leucin-zipper-ähnlichen Domäne (HR1a, b und c) auf. Die ersten beiden HR1-Domänen besitzen die Fähigkeit, Rho zu binden, doch nur die Bindung von HR1a ist GTP-abhängig. Für HR1c konnte keine Bindung an RhoA gezeigt werden [Flynn et al., 1998]. Die HR1a-Domäne von PRK1 war auch die erste Rho-bindende Domäne, die im Komplex mit RhoA·GTPγS kristallisiert und die Struktur gelöst wurde [Maesaki et al., 1999a](Abb.1-9). An RhoA gebunden bildet HR1a eine antiparallele coil-coiled-Struktur aus, die als ACCFinger-Motiv/Domäne bezeichnet wird und hauptsächlich aus einer langen und einer etwas kürzeren Helix besteht. RhoA kontaktiert HR1a vor allem mit Resten am Rande von switch I (AS 25-28, Rho-Numerierung), β2/β3 (AS 45-54) und α5 (AS 164-172). Die Diskriminierung zwischen GDP- und GTP-Zustand erfolgt hauptsächlich über Lys-27, dass im GDP-Zustand nicht zugänglich ist, durch die Transition von GDP zu GTP-gebundener Form durch Tyr-42 aber nach außen exponiert wird, wo es mit Asp-85HR1a interagiert [Maesaki et al., 1999a] (Abb.1-9).

18

EINLEITUNG

Abb.1-9: Kristallstruktur von PRK1-HR1a13-98 im Komplex mit RhoA·GTPγS (Kontaktstelle I) [Maesaki et al., 1999a]. grün: RhoA; rot: switches; blau: ACC-Finger von PRK1-HR1a; gelb: Lysin 27 von RhoA; hellblau: Aspartat 85 von PRK1.

Kürzlich wurde die NMR-Struktur von PRK1-HR1b gelöst, die ebenfalls aus zwei Helizes besteht, die durch eine Schleife miteinander verbunden sind und ein antiparalles coiled-coil bilden [Owen et al., 2003]. Klasse II- Effektoren / RKH-Proteine Zu der Klasse der ROK-kinectin homology (RKH)-Proteine gehören, wie der Name bereits sagt, die beiden Effektoren ROCK und Kinectin, ein Adapterprotein, das an der KinesinBindung beteiligt ist [Hotta et al., 1996]. Anhand von Sekundärstrukturvorhersagen wurde bis vor kurzem vermutet, dass die RBD von ROCK einen PRK1-HR1a-ähnlichen ACC besitzen würde. Jedoch wurde parallel zu unserer Struktur des RhoA·GppNHp·ROCKI-RBDKomplexes (siehe Ergebnisse) die Kristallstruktur von bovinem ROCKII-RBD veröffentlicht [Shimizu et al., 2003], die ein anderes Bild einer coiled-coil-Struktur zeichnet. Über die Struktur von Citron-Kinase, die als Klasse III – Protein bezeichnet wird, ist strukturell noch nichts bekannt. Sekundärstrukturanalysen und Sequenzvergleiche lassen jedoch vermuten, dass Ähnlichkeiten zu ROCK bestehen.

19

EINLEITUNG Für Diaphanous, das zur Familie der Formin-ähnlichen Proteine gehört, wurde die Art der Rho-selektiven Bindung bisher noch nicht untersucht. Da die Sequenz von Dia aber keine Homologie zu einer der anderen Effektoren aufweist [Watanabe et al., 1997], handelt es sich bei der RBD vermutlich um eine eigene Klasse.

1.4.2 Rac/Cdc42-Effektor-Interaktion Im Gegensatz zu Rho-Effektoren enthalten viele - wenn auch nicht alle - Effektor-Proteine von Rac und Cdc42 eine konservierte GTPase-bindende Konsensus-Sequenz, das CRIB (Cdc42/Rac-interactive binding)-Motiv [Burbelo et al., 1995]. Anhand von NMR-Studien von Cdc42 im Komplex mit den G-Protein-bindenden-Domänen (GBD) von αPAK, dem Wiskott-Aldrich-Syndrome-Protein (WASP), bzw. ACK (activated Cdc42-associated tyrosine kinase) [Abdul-Manan et al., 1999; Morreale et al., 2000; Mott et al., 1999] konnte gezeigt werden, dass die GBDs an dieselben Regionen von Cdc42, nämlich die Schalterregionen I und II, sowie die Helices α1 und α5 und die Faltblattstruktur β2 binden. Der N-Terminus von jeder der GBDs, an dem das CRIB-Motiv lokalisiert ist, zeigt die größte Homologie in der Sequenz der Rac/Cdc42-Effektorproteine. Bei Bindung bildet diese Region eine intermolekulares β-Faltblattstruktur mit der β2-Region von Cdc42 (und vermutlich Rac) aus.

Abb.1-10: Vergleich der Strukturen von Cdc42 im Komplex mit WASP [Abdul-Manan et al., 1999], PAK [Morreale et al., 2000] und ACK [Mott et al., 1999]. Cdc42 ist grau, die Effektor-Fragmente blau und die Schalterregionen in rot dargestellt.

Die C-Termini der GBDs der drei Effektoren sind nicht homolog und zeigen Unterschiede in der Art der Bindung. Während die C-Termini von PAK und WASP eine β-Haarnadelstruktur und eine α-Helix ausbilden, die mit Cdc42 in den Schalter-Regionen interagieren, wickelt sich der C-terminale Teil von ACK um die GTPase (Abb.1-10). Strukturelle Daten sowie biochemische Informationen aus Mutationsanalysen deuten an, dass Reste in der α5-Helix 20

EINLEITUNG kritisch für die Stabilität der Cdc42-ACK bzw. -WASP-Interaktion sind, die jedoch für die Bindung von PAK an Cdc42 eher eine untergeordnete Rolle spielen [Morreale et al., 2000]. Verglichen mit anderen G-Protein-Effektor-Komplexen ähnelt diese Bindungsweise in Form einer intermoleklaren β-Faltblattstruktur der von Ras·RalGDS- und Rap1A·Raf-Komplexen [Huang et al., 1998; Nassar et al., 1995].

1.5 Aktivierung von Rho-Effektoren Untersuchungen über den Mechanismus der GTPase-spezifischen Aktivierung von Effektoren haben gezeigt, dass der grundsätzliche Mechanismus, die Freisetzung einer allosterischen Inhibition durch Bindung der aktiven Form der GTPase, bei den meisten, katalytisch-aktiven Proteinen konserviert ist. Autoinhibitorische Domänen wurden bei PRK1, ROCK, PAK und Dia gefunden und liegen im Falle der Kinasen in oder in Nähe der GBD, wo sie als Pseudosubstrat von der katalytischen Domäne gebunden werden und diese somit inaktivieren [Buchwald et al., 2001; Miki et al., 1998; Mukai, 2003; Riento und Ridley, 2003] [Rohatgi et al., 1999]. Eine Ausnahme stellt Dia dar, deren DAD (Dia autoinhibitory domain) sich am CTerminus befindet und die Fähigkeit besitzt, die N-terminale RBD zu binden [Alberts, 2001; Li und Higgs, 2003], wobei vermutlich die funktionelle FH2-Domäne [Shimada et al., 2004] maskiert wird. Der genaue Mechanismus, wie durch die Freisetzung der Autoinhibition durch Konformationsänderung bei Bindung der aktiven GTPase die Effektorproteine aktiviert werden, ist in den meisten Fällen noch ungeklärt. Es gibt jedoch Anzeichen dafür, dass die GTPase-Bindung eine Vorraussetzung für die Aktivierung ist, aber zahlreiche Kofaktoren vonnöten sind, um die volle Aktivität zu gewährleisten. Für einige Mitglieder der AGCKinase-Familie konnte gezeigt werden, dass sie durch Phosphorylierung in ihrer Aktivierungsschleife (activation loop) durch PDK1 (phosphoinositide-dependent protein kinase1) aktiviert werden können [Mukai, 2003]. Für PRK2 konnte außerdem gezeigt werden, dass die Bindung von PRK2 und PDK1 Rho-abhängig ist. Man geht daher davon aus, dass eine Rho-induzierte Konformationsänderung PDK1 Zugang zur Kinase-Domäne ermöglicht, um dort die Aktivierungsschleife zu phosphorylieren. Ob diese in vitro-Daten sich jedoch auf in vivo-Signalwege übertragen lassen und ob weitere (und wenn ja welche) Kofaktoren die Aktivität der Kinase-Domäne regulieren, ist derzeit noch ungeklärt [Mukai, 2003]. Auch für ROCK ist die Rolle der Rho-vermittelten Aktivierung derzeit noch ungeklärt. Es existiert ein Modell für die ROCK-verwandte Kinase MRCKα, bei dem hypothetisiert wird, 21

EINLEITUNG dass die Aktivität der Kinase durch ihren eigenen Dimerisierungszustand reguliert wird. Im inaktiven Zustand bindet die Kinasedomäne hierbei ihre autoinhibitorische Domäne, wobei das Protein über seine coiled-coil-Regionen dennoch als Dimer existiert. Aufgrund einer Agenz-

(im

Falle

von

MRCKα

ein

Phorbolester)

oder

GTPase-vermittelten

Konformationsänderung (ROCK) kommt es zur Dimerisierung der katalytischen Domänen und aufgrund von Auto-Transphosphorylierungsprozessen zur Aktivierung der Kinase [Tan et al., 2001]. Ob dieses Modell jedoch tatsächlich richtig ist und auch für ROCK gilt, muss noch gezeigt werden. PAK-Aktivierung Die konformationelle Aktivierung von PAK ist der am besten untersuchte Mechanismus bei Effektoren der Rho-Familie. Auch in PAK wird die GBD zum größten Teil von einer Region (AS 70-150) mit autoinhibierenden Merkmalen überlappt, die mittels eines allosterischen Mechanismus zu einem inaktiven Zustand der Kinase in Abwesenheit von Rac/Cdc42 führt. Diese autoinhibierende Domäne kann PAK in trans sowohl in vitro, als auch in vivo inhibieren, was durch verschiedene Mutationen in diesem Bereich, die die Aktivierung der Kinase zur Folge hatten, gezeigt werden konnte [Parrini et al., 2002].

Abb.1-11: Strukturmodell von αPAK. Als Leitfaden diente die Kristallstruktur des Komplexes zwischen einem regulatorischen Fragment (AS 70-175) und der kompletten katalytischen Domäne (AS 249-545) von humanem αPAK [Lei et al., 2000]. Der regulatorische Bereich ist in dunkelblau gefärbt, strukturelle Elemente, die nicht in der dreidimensionalen Struktur enthalten sind, sind in hellblau gekennzeichnet. Ein Modell der Aktivierung von PAK sieht vor, dass die Inhibierung der Kinase durch das inhibitorische Segment (IS) und die Dimerisierung über das DI-Motiv durch Bindung von Cdc42/Rac an die CRIB-Domäne aufgehoben werden. KI, Kinase inhibierendes Segment (aus Buchwald et al., 2001).

Mittels Punktmutationen, die die inhibierende Wirkung der regulatorischen Region unterstützen [Brown et al., 1996; Zhao et al., 1998], wurde nachgewiesen, dass die RD direkt 22

EINLEITUNG mit der Kinasedomäne wechselwirkt. Solche direkten Interaktionen konnten mit rekombinanten Fragmenten [Zenke et al., 1999] und mittels Zwei-Hybrid-Analysen identifiziert werden [Tu und Wigler, 1999]. Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Bindung von aktiviertem Cdc42 in PAK eine Konformationsänderung induziert, welche die hemmenden Effekte auf die Kinasedomäne unterbindet und die Kinasestruktur öffnet [Zenke et al., 1999]. Die kürzlich gelöste Kristallstruktur des humanen PAK1 in der autoinhibierten Form [Lei et al., 2000] zeigt, dass der Kern der inhibierenden Region das inhibitorische Segment (IS) ist (Abb 1-11). Die IS-Domäne besteht aus einem Bündel von drei α-Helizes, gefolgt von einer kurzen N-terminalen β-Haarnadel, die zusammen einen hydrophoben Kern bilden. Durch Wechselwirkungen mit dem großen „lobe“ (lower lobe) der Kinasedomäne wird das Cterminale Ende der IS-Domäne (AS 136-150), auch Kinase-inhibierendes Segment genannt (KI), direkt in das katalytische Zentrum der Kinase positioniert. Der N-terminale Bereich der IS-Domäne bildet eine Dimerisierungsstelle (AS 81-87) zu einem zweiten PAK-Molekül [Lei et al., 2000]. Aus diesen und aus anderen strukturellen Daten von Komplexen zwischen Cdc42 und Fragmenten, die die CRIB-Region enthalten [Morreale et al., 2000; Mott et al., 1999], wird folgendes Aktivierungsmodell für PAK abgeleitet. Es wird angenommen, dass die Bindung von Cdc42 oder Rac1 am DI/IS-Segment von PAK Konformationsänderungen in der IS-Domäne hervorruft, die das KI-Segment vom katalytischen Zentrum entfernen und die Dimerisierung aufheben, so dass die Kinase durch Transphosphorylierung aktiviert wird [Buchwald et al., 2001; Daniels und Bokoch, 1999; Lei et al., 2000; Parrini et al., 2002].

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ZIELSETZUNG

2 Zielsetzung Die GTPasen der Rho-Familie sind an zahlreichen zellulären Prozessen wie der Organisation und Modulation des Aktin-Zytoskeletts oder der Transkription beteiligt. Vermittelt werden diese Prozesse durch eine Vielzahl nachgeschalteter Effektoren, die durch die Interaktion mit der aktiven Form der GTPase aktiviert werden können. Diese Fähigkeit einer einzelnen GTPase mit verschiedenen Effektoren interagieren zu können ist essenziell für die Signaltransduktion dieser Schaltermoleküle und die Grundlage ihres breiten funktionellen Spektrums. Da durch die Interaktion mit dem Effektorprotein sozusagen eine Entscheidung über den anzuschaltenden Signalweg und damit über die zelluläre Antwort getroffen wird, ist die GTPase-Effektor-Interaktion der Schlüssel jeder Signalkette. Die Interaktion zwischen Rho-GTPasen und ihrem Effektor wurde bisher vor allem mit qualitativen Methoden wie Pulldown- oder radioaktiven Overlay-Assays bzw. dem ZweiHybrid-System untersucht. Obwohl mit diesen Methoden verschiedene Bindungspartner identifiziert werden konnten, lassen sich damit keine quantitativen Aussagen über die Affinität der Effektoren treffen. Daher stand eine detaillierte Untersuchung der StrukturFunktionsbeziehung der RhoGTPase-Effektorinteraktion im Zentrum dieser Arbeit. Zunächst sollten die Bindungseigenschaften verschiedener GTPase-bindender Domänen von Effektoren an Rho-GTPasen unter Verwendung fluoreszenzspektroskopischer Methoden charakterisiert werden. Ein weiteres wesentliches Ziel stellte die Kristallisation und Strukturaufklärung von GTPaseEffektor-Komplexen dar. Zusätzlich sollten GTPase-Mutationsstudien durchgeführt werden, um die Effektor-Bindungsstellen auf der GTPase zu definieren und zu spezifizieren.

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MATERIAL UND METHODEN

3 Material und Methoden 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien Alle Chemikalien wurden von einer der Firmen in jeweils höchster Reinheit bezogen: Agfa (Köln), Aldrich (Steinheim), Amersham Biosciences (Freiburg), Applichem (Darmstadt), Baker (Deventer, Niederlande), Fluka (Neu-Ulm), GERBU Biotechnik (Gaiberg), ICN Biomedicals (Eschwege), Life Technologies (Karlsruhe), MBBL (Bielefeld), Merck (Darmstadt), Pharma-Waldhof (Düsseldorf), Qiagen (Hilden), Riedel-de-Haen (Seelze), Roche (Mannheim), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen) Die Nukleotide GDP, GppCH2p, GppNHp, mant-GDP, mant-GppNHp und ATP wurden von der Firma Sigma (Deisenhofen) erworben bzw. aus den Nukleotiden und NMethylanthranioyl (mant) (Molecular Probes) in einer organischen Synthese und anschließender Reinigung selbst hergestellt. Die Proteaseinhibitoren Aprotinin (2 mg/ml), Benzamidin (500 mM), Leupeptin (1 mg/ml), Pefabloc (5 mg/ml) und Pepstatin (0.7 mg/ml) wurden von ICN Biomedicals erworben und in Methanol in aufgeführter Konzentration gelöst. Proteinstandards SDS-7

66 / 45 / 36 / 29 / 24 / 20 / 14.2 kDa

Sigma (Saint Louis, USA)

Nukleinsäurestandard Lambda Bst EII

8453 - 113 bp

MBBL (Bielefeld)

25

MATERIAL UND METHODEN

3.1.2 Enzyme Enzyme Pfu-DNA-Polymerase

Stratagene (Amsterdam, Niederlande)

Taq-DNA-Polymerase

Qiagen (Hilden)

T4-DNA-Ligase

New England Biolabs (Schwalbach)

Restriktionsendonukleasen

New England Biolabs (Schwalbach)

Thrombin

Serva (Heidelberg)

Alkalische Phosphatase

Roche Diagnostics (Mannheim)

Phosphodiesterase

Roche Diagnostics (Mannheim)

3.1.3 Reagenzienkits Taq-PCR Kit

Qiagen (Hilden)

Dye-Deoxy-Terminator-Mix

Perkin Elmer (Überlingen)

QIAprep Spin Miniprep Kit

Qiagen (Hilden)

QIAGEN Plasmid Maxi Kit

Qiagen (Hilden)

QIAprep Spin Gel Extraction Kit

Qiagen (Hilden)

QIAprep Spin PCR Purification Kit

Qiagen (Hilden)

QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit

Stratagene (Amsterdam, Niederlande) [Braman et al., 1996]

dGTP BigDye Terminator Cycle Sequencing Applied Biosystems (Langen) Kit Crystal Screen

Hampton Research (Laguna Niguel, USA)

3.1.4 Puffer und Lösungen Acrylamidlösung

30 % (w/v) Acrylamid 0.8 % (w/v) Bisacrylamid

Anodenpuffer (Tricingel)

20 mM Tris/HCl pH 8.9

Austauschpuffer (10x)

2 M (NH4)2SO4 10 mM ZnCl2

DNA-Probenpuffer (6x)

0.4 % (w/v) Orange G 30 % Glycerol in 10 mM Tris pH 7.0, 25 mM EDTA

26

MATERIAL UND METHODEN dNTP-Lösung

0.5 mM dGTP 0.5 mM dCTP 0.5 mM dATP 0.5 mM dTTP

Entfärbelösung (SDS-Page)

40 % (v/v) Ethanol 10 % (v/v) Essigsäure

Färbelösung (SDS-Page)

40 % (v/v) Methanol 10 % (v/v) Essigsäure 0.4 % (w/v) Coomassie brilliant blue R250 0.4 % (w/v) Coomassie brilliant blue G250

HPLC-Puffer

10 mM Tetrabutylammoniumbromid 100 mM Kaliumphosphat pH 6.5 7. 5% - 25 % (v/v) Acetonitril

Kathodenpuffer (Tricingel)

10 mM Tris/HCl pH 8.25 16 mM Tricin 0.1 % SDS

Lämmli Probenpuffer (5x)

50 mM Tris/HCl pH 6.8 50 % (v/v) Glycerol 500 mM DTE 10 % (w/v) SDS 0.5 % (w/v) Bromphenolblau

Lithium-Actetat-Lösung

100 mM Lithiumactetat 1xTE Puffer

Messpuffer (GDI)

30 mM Tris/HCl pH 7.5 3 mM DTE

Messpuffer (GAP)

30 mM Tris/HCl pH 7.5 5mM MgCl2 3 mM DTE 10 mM Kaliumphosphat

40%PEG3350-Gebrauchslösung 100 mM Lithiumacetat 1xTE 40 % PEG3350 (w/v) SDS-Trenngelpuffer

1.5 M Tris/H3PO4 pH 8.8 4 % (w/v) SDS 27

MATERIAL UND METHODEN SDS-Sammelgelpuffer

500 mM Tris/H3PO4 pH6.8 4 % (w/v) SDS

SDS-Laufpuffer

25 mM Tris pH 8.3 192 mM Glycin 2 % (w/v) SDS

Standard Bindungspuffer (SBP)

30 mM Tris/HCl pH 7.5 5 mM MgCl2 3 mM DTE 1:1000 Proteaseinhibitoren

TAE-Puffer

40 mM Tris/Acetat pH 8.5 1 mM EDTA

TE-Puffer (10x)

100 mM Tris 10 mM EDTA

TBST-Puffer

20 mM Tris/HCl pH 7.4 150 mM NaCl 0.1 % (v/v) Tween-20

Tricingelpuffer

3 M Tris/HCl pH 8.45 0.3 % (w/v) SDS

Trispuffer (Standardpuffer)

30 mM Tris/HCl pH 7.5 5 mM MgCl2 100 mM NaCl 3 mM DTE

Hochsalz-Trispuffer

Trispuffer 500 mM NaCl

Glutathion-Trispuffer

(statt 100 mM)

Trispuffer 20 mM Glutathion (pH 7.5 eingestellt mit NaOH)

ATP-Puffer

30 mM Tris/HCl pH 7.5 100 mM KCl 1 mM ATP

Wenn nicht anders angegeben wurden alle Puffer und Lösungen in aqua bidest. angesetzt.

28

MATERIAL UND METHODEN

3.1.5 FPLC-Säulenmaterialien GSH-Sepharose fast flow

Amersham Biosciences (Freiburg)

Hi-Load Superdex S75

Amersham Biosciences (Freiburg)

Hi-Load Superdex S200

Amersham Biosciences (Freiburg)

Ni-NTA Agarose

Qiagen (Hilden)

3.1.6 Mikroorganismen E. coli Stamm TG1 BL21(DE3) BL21(DE3) codon plus RIL Rosetta(DE3) pLacI

S. cerevisiae Stamm L40

Genotyp supE, hsd∆5, thi, ∆(lac-proAB), F‘ (traD36, proAB+, lacIq, lacZ∆M15] ompT, hsdS (rB-,mB-), gal(λcIts857, ind1, Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1),dcm (DE3) ompT, hsdS (rB-,mB-), gal(λcIts857, ind1, Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), Dcm, Tetr, endA, HTE (argU, ileY, leuW, Camr) (DE3) F-;ompT; hsdSB (rB- mB-); gal dcm(DE3); pLacI/RARE (argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL)

Referenz [Gibson, 1984] [Studier und Moffatt, 1986] [Carstens und Waeshe, 1999] Novagen Inc.

Genotyp Referenz MATα, trp1-901, leu2-3, his3-200, 112 ade2 [Vojtek et al., 1993] LYS2::(lexAop) GAL4 gal80

4-HIS3

URA::(lexAop)8-lacZ

3.1.7 Vektoren pGEX 4T1

Amersham Biosciences (Freiburg)

pGEX 4T2

Amersham Biosciences (Freiburg)

pGEX 4T3

Amersham Biosciences (Freiburg)

pGEX 4T3-Igase

MPI-Dortmund

pGEX4T1 Y-FP N-terminal

MPI-Dortmund

pGEX4T1 Y-FP C-terminal

MPI-Dortmund

pGEX4T1 C-FP N-terminal

MPI-Dortmund

pQE32

Qiagen (Hilden)

pBTM116

MPI-Dortmund

pBTM116mBX

MPI-Dortmund

pVP16

MPI-Dortmund

pVP16mBX

MPI-Dortmund 29

MATERIAL UND METHODEN

3.1.8 Nährmedien und Antibiotika Nährmedien Luria-Bertani (LB) Voll – Medium

10 g/l Bacto-Tryptone 10 g/l NaCl 5 g/l Hefe-Extrakt

LB-Platten-Agar

10 g/l Bacto-Tryptone 10 g/l NaCl 5 g/l Hefe-Extrakt 16 g/l Bacto-Agar

TB Voll – Medium

12 g/l Bacto-Tryptone 24 g/l Hefe-Extrakt 0.4 % (v/v) Glycerin 2.31 g/l KH2PO4 12.54 g/l K2HPO4

YPD-Medium

20 g/l Bactopepton E 10 g/l Hefe-Extrakt 40 ml/l 50 % Glukose

Hefeminimalmedium

1.2

g/l

Hefe-Nitrogen-Extrakt

ohne

Aminosäuren oder Ammoniumsulfat 5 g/l Ammoniumsulfat 10 g/l Succinat 6 g/l NaOH 40 ml/l 50 % Glukose je 0.1g/l Adenin, Arg, Cys, Leu, Lys, Thr, Trp und Uracil je 0.05 g/l Asp, His, Ile, Met, Phe, Pro, Ser, Tyr und Val. Hefeselektionsmedien

Hefeminimalmedium ohne Ura, Trp, Leu (UTL), ohne Ura, Trp, Lys (UTLy), oder ohne Ura, Trp, Leu, Lys, His (THULLy). Für das THULLy+3AT Medium wurde dem THULLy-Medium der HistidinBiosynthese-Inhibitor 3-Aminotriazol in einer Konzentration von 25 mM zugegeben.

30

MATERIAL UND METHODEN Transformations- und Lagerungslösung TSS 85 % LB-Medium (ohne NaOH) (transformation and storage solution)

10 % (w/v) PEG 8000 5 % (v/v) DMSO 50 mM MgCl2

Antibiotika Ampicillin

100 mg/l Medium

Chloramphenicol

25 mg/l Medium

3.1.9 Verbrauchsmaterialien Verbrauchsmaterialen

(Konzentrationseinheiten,

PVDF/Nitrozellulose-Membranen

u.a.)

wurden von der Firma Amersham Biosciences (Freiburg), Becton Dickinson / Falcon (Heidelberg), Eppendorf (Hamburg), Millipore (Bedford, USA), Roche Diagnostics (Mannheim), Sarstedt (Nümbrecht) bzw. Schleicher & Schuell (Dassel) bezogen.

3.1.10 Geräte Es wurden nur diejenigen Geräte aufgeführt, die für die unter 3.2.3 aufgeführten biophysikalischen Meßmethoden relevant sind. Fluoreszensspektrometer LS 50 B

Perkin Elmer (Überlingen)

Fluoreszensspektrometer (FluoroMax-2)

ISA Instruments (Stanmore, UK)

HPLC System Gold 166

Beckman (München)

ITC Titrationsmikrokalorimeter

MicroCal (Northampton, USA)

Präzisions-Quarzküvetten

Hellma (Mühlheim)

UV/VIS-Spektralphotometer UVIKON 933

Kontron (Neufahrn)

miniDAWN Tristar Vielwinkel

Wyatt (Woldert)

Streulichtphotometer mit Optilab Differentialrefraktometer

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MATERIAL UND METHODEN

3.2 Methoden 3.2.1 Molekularbiologische Methoden 3.2.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA Für die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli wurden ca. 4 ml einer Übernachtkultur verwendet. Die Präparation wurde mit den Plasmid Mini-, Midi- und Maxi-Prep Kitsystemen der Firma Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Isolierung beruht auf dem Prinzip der alkalischen Lyse [Birnboim, 1992] mit anschließender Fällung der Proteine durch Kalium-Dodecylsulfat. Die Plasmid-DNA wird aus dem Überstand der Fällung mittels Anionenaustauscherchromatographie gereinigt.

3.2.1.2 Agarosegelelektrophorese Analytische und präparative Trennungen von DNA-Fragmenten erfolgten mittels horizontaler Gelelektrophorese [McDonell et al., 1977]. Unter Einfluss eines elektrischen Feldes wandert die negativ geladene DNA durch das porenartige Gelmaterial, wobei größere Fragmente durch den Molekularsiebeffekt des Agarosegels stärker in ihrer Bewegung gehindert werden als kleinere. Anhand eines DNA-Standards (hier: λ BstE II) kann die Basenlänge linearisierter Fragmente bestimmt werden. Um eine optimale Auftrennung für die am häufigsten verwendeten DNA-Fragmente (300 6000 bp) zu erreichen wurde ein 0,8 %iges Agarosegel in 1x TAE-Puffer für analytische Trennungen benutzt. Zur Detektion der DNA-Fragmente wurde der Agaroselösung 0,75 mg/l Ethidiumbromid zugesetzt. Die DNA-Proben wurden vor der Elektrophorese mit 20 % (v/v) DNA-Probenpuffer (6x) versetzt. Die Elektrophorese erfolgte bei einer konstanten Spannung von 8-12 V/cm Gellänge. Die Dokumentation der Banden erfolgte mit Hilfe eines UVIlluminators (Anregung bei 302 nm). Zur Isolation von DNA aus Gelen wurde das QIAquick Gel Extraction Kit nach den Angaben des Herstellers Qiagen (Hilden) verwendet. Durch eine chemische und

hitzevermittelte

Auflösung der Agarose bei 50 °C in einer 6 M Natriumjodidlösung wird die DNA nach ihrer Freisetzung an eine DEAE-gekoppelte Silicagel-Matrix (Spincolumn) gebunden und durch mehrere Waschschritte von Verunreinigungen befreit.

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MATERIAL UND METHODEN 3.2.1.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Mittels der Polymerase-Kettenreaktion können DNA-Fragmente in vitro selektiv amplifiziert werden [Mullis et al., 1992]. Man benötigt eine hitzestabile DNA-Polymerase aus einem thermophilen Organismus, eine Ausgangs-DNA (Template), sowie zwei Oligonukleotide (Primer), die die zu vervielfältigende DNA-Sequenz flankieren und die zu je einem Strang des gewünschten DNA-Abschnitts komplementär sind [Mullis et al., 1992]. Ein typischer 100 µl Ansatz besteht aus 10 µl Cloned Pfu-Puffer (10x), 10 µl dNTP-Lösung (25 mM),10 µl DMSO, 10 µl MgCl2-Lösung (25 mM), 20-200 ng Template-DNA, 100 pmol 5’ & 3’ Primer und 2,5 U Pfu-Polymerase. Das PCR-Programm besteht aus einem dreistufigen Prozess, der ca. 25-30mal durchlaufen wird und so zu einer exponentiellen Amplifizierung der DNA führt: 60 s Denaturierung bei 92 °C, 60 s Hybridisierung bei 58 °C und 60 - 120 s Elongation bei 72 °C sowie einer anfänglichen Denaturierung bei 96 °C für 5 min und einer abschließenden Elongation bei 72 °C für 5 min. Die Elongationszeit richtet sich nach der Länge der zu vervielfältigenden Sequenz, wobei als Faustformel gilt: 1 min pro 1000 Basenpaare. Die Hybridisierungstemperatur wurde anhand der Denaturierungstemperatur Tm den verwendeten Primern angepasst: Tm (°C) = 81,5 + 0,41 · (% GC-Gehalt) – 675 / (% Fehlpaarungen) Gleichung 3-1 Nach Ablauf des PCR-Programms wurden die Proben bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C oder -20 °C aufbewahrt. Abhängig davon, ob eine präparative oder analytische PCR angestrebt war, wurde Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus oder Taq-Polymerase eingesetzt. Da Pfu-Polymerase über eine Korrekturlesefunktion (3´-5´-Exonukleaseaktivität) verfügt, und daher sehr niedrige Fehlerraten aufweist, eignet sie sich besser für präperative PCRs. Für die Präparation von PCR-Produkten wurde das QIAprep Spin Miniprep Kit nach Angaben des Herstellers Qiagen (Hilden) verwendet. Das Verfahren beruht auf der Verwendung einer Anionenaustauschersäule zur Trennung von Edukten und Produkt.

33

MATERIAL UND METHODEN Zur Identifikation positiver E. coli-Klone im Anschluss an eine Transformation (3.2.1.7) wurde die Kolonie-PCR (auch analytische Schnell-PCR genannt) angewandt. Anstelle der Template-DNA wurden Zellen aus Einzelkolonien eingesetzt. Das Primer-Paar sich anhand der Größe des gebildeten PCR-Produkts positive Klone identifizieren lassen. Ortsspezifische Mutagenese Zum gerichteten Austausch einzelner Aminosäuren auf DNA-Ebene wurde das Quikchange Protokoll von Stratagene (Amsterdam, Niederlande) angewendet. Bei dieser Methode wird zirkuläre Plasmid-DNA aus E. coli mit einem mutagenen Primerpaar mittels PCR amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt ist im Unterschied zur Template-DNA unmethyliert und kann daher im Anschluss mit der methylierungsabhängigen Restriktionsendonuklease DpnI im Ansatz angereichert werden [Kunkel et al., 1985]. Nach der Restriktion (1 h, 37 °C; 3.2.1.4) wurden die Ansätze in E. coli TG1 transformiert (3.2.1.7) und erhaltene Klone sequenziert (3.3.1.12).

3.2.1.4 Hydrolyse von DNA mit Restriktionsendonukleasen Zur Spaltung doppelsträngiger DNA wurden Restriktionsendonukleasen der Firma New England Biolabs (Schwalbach) nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Zur Hydrolyse mit zwei Enzymen wurde die Reaktion gleichzeitig durchgeführt, sofern die Bedingung identisch oder ähnlich war. Andernfalls wurde die Hydrolyse sequentiell durchgeführt. Die erhaltenen Spaltprodukte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese (3.2.1.2) aufgetrennt, und anhand ihrer Größe identifiziert.

3.2.1.5 Ligation von DNA-Fragmenten Die Ligation von DNA erfolgte unter Verwendung des Enzyms T4-DNA-Ligase der Firma Roche (Mannheim). 20 ng geschnittene und vollkommen restringierte Vektor-DNA wurde auf komplementär restringiertes Insert (5 - 8 molarer Überschuss) gegeben und zusammen mit dem 1/10 des 10-fach konzentrierten Puffer des Herstellers und aqua bidest auf ein Gesamtvolumen von 25 µl verdünnt. Im Anschluss wurde die Ligation mit 1 U T4-DNALigase gestartet, wobei der Ligationsansatz halbiert und nach einer Inkubationszeit von 2 h bei RT bzw. über Nacht bei 4 °C transformiert (3.2.1.7) wurde. Als Kontrolle wurde das Selbstligationsvermögen des Vektors durch Substitution des DNA-Inserts durch Wasser überprüft.

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MATERIAL UND METHODEN 3.2.1.6 Herstellung kompetenter Bakterienstämme Zur Herstellung kompetenter Zellen nach der von Chung et al. [Chung et al., 1989] modifizierten Methode wurden 200 ml LB-Medium mit 2 ml einer Übernacht-Kultur des E. coli-Stammes angeimpft, bei 37 °C in Gegenwart des benötigten Antibiotikums geschüttelt und bei Erreichen einer OD600 von 0,3-0,4 nach einer Ruhephase von 20 min auf Eis pelletiert (1200 x g, 10 min, 4 °C). Die sedimentierten Zellen wurden in 20 ml eiskalter TSS-Lösung resuspendiert, aliquotiert, und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der Aliquots erfolgt bei –80 °C.

3.2.1.7 Transformation von E. coli-Zellen mit zirkulärer DNA Zur Transformation wurden die Zellen langsam auf Eis aufgetaut. 110 µl der kompetenten Bakteriensuspension wurden mit 12,5 µl des Ligationsansatzes bzw. 20 ng gereinigter Plasmid-DNA gemischt und dann für mindestens 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 2 min einem Hitzepuls von 42 °C ausgesetzt und mit 800 µl LBMedium (ohne Antibiotikum) versetzt. Um plasmidkodierte Resistenzen wirksam werden zu lassen, wurden die Zellen für 60 - 90 min bei 37 °C geschüttelt, sedimentiert, in 200 µl des Überstandes resuspendiert (der Rest des Überstandes wurde verworfen) und dann auf dem Selektivmedium unter sterilen Bedingungen ausplattiert. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37 °C in einem Brutschrank oder für 2 - 3 Tage bei RT.

3.2.1.8 Lagerung transformierter Bakterienstämme Zur Lagerung transformierter Bakterien wurde von einer Übernachtkultur einer einzelnen von dem Selektionsmedium gepickten Kolonie eine Glycerinkultur erstellt. Dazu wurden 600 µl der Übernachtkultur mit 400 µl Glycerin (50 %; v/v) versetzt und im Anschluss bei -80 °C gelagert.

3.2.1.9 Herstellung kompetenter Hefestämme Eine Übernachtkultur von S. cerevisiae wurde in einem Gesamtvolumen von 50 ml auf eine OD600 = 0.1 verdünnt, und bei 30 °C und 180 rpm in YPD-Medium inkubiert. Bei einer OD600 von 0.4 wurden die Zellen wurden bei 1700 x g bei RT geerntet, einmal in Lithium-ActetatLösung gewaschen und anschließend in 1 ml LiAc-Lösung resuspendiert [Schiestl und Gietz, 1989].

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MATERIAL UND METHODEN 3.2.1.10 Transformation von S. cerevisiae-Zellen mit DNA In schneller Folge wurden 10 µl einzelsträngige Lachsspermien-DNA (10 mg/ml, Sigma), 2 ng Plasmid-DNA, 100 µl kompetente Hefesuspension und 600 µl 40 %-PEG3350Gebrauchslösung vorsichtig mit der Pipette unter sterilen Bedingungen vermischt. Vor der Benutzung wurde die Lachsspermien-DNA für 5 - 10 min bei 95 °C inkubiert und dann auf Eis aufbewahrt. Der Transformationsansatz wurde für 30 min bei 30 °C und nach Zugabe von 70 µl DMSO für 20 min bei 42 °C inkubiert. Abschließend wurde der Ansatz zentrifugiert (3 min, 13000 rpm, RT), in 300 µl TE-1x-Puffer resuspendiert und auf den Selektivmedien (UTLy- & UTL- bzw. UTL- & THULLy) ausgestrichen.

3.2.1.11 Zwei-Hybrid-Interaktionstest Die in vivo Assoziation zweier bekannter Proteine oder Proteinfragmente wurde im ZweiHybrid-System [Bartel und Fields, 1995; Fields und Song, 1989] durch direkte Transformation in Saccharomyces cerevisiae L40 untersucht (Interaktionstest). In einer ersten Transformation (3.2.1.10) wurden nach Herstellung kompententer Hefezellen in YPDMedium (3.2.1.9) die pBTM116(mBX)-Konstrukte in die L40 Zellen transformiert und auf UTL-- und UTLy--Platten selektiert. Positive Kolonien (von UTLy--Platten) wurden in UTLy-Medium bei 30 °C und 180 U/min kultiviert und als Glycerinstock analog zu Bakterien (3.2.1.8) angelegt. Vor dem Interaktionstest wurde eine Probe des Glycerinstocks abermals auf einer UTLy--Platte ausgestrichen und für die Herstellung kompententer Zellen für die zweite Transformation, eine Kolonie in UTLy--Medium inokkuliert. Nach Herstellung kompetenter Ersttransformanden wurden die Zellen mit den pVP16(mBX)-Plasmiden transformiert (3.2.1.10) und der Transformationsansatz zur Hälfte auf UTL- und THULLyFestagarplatten ausgestrichen. Beide Platten selektionierten auf das Vorhandensein der Vektoren pBTM116 (trp+) und pVP16 (leu+). Die UTL--Platten dienten der Ermittlung der Transformationseffizienz, sowie der Lagerung und Amplifikation erfolgreich transformierter Hefen. Die THULLy-Platten selektionierten zusätzlich auf die Interaktion beider Fusionsproteine (his-). Im Anschluss wurden jeweils drei positive Klone von jedem THULLyInteraktionsansatz auf THULLY+3AT Platten übetragen. Durch Anwesenheit des HistidinBiosynthese-Inhibitor 3-Aminotriazol (3AT; in einer Konzentration von 25 mM) wird die Chance auf mögliche Falsch-positve (aufgrund basaler Histidin-Synthese) minimiert.

36

MATERIAL UND METHODEN 3.2.1.12 DNA-Sequenzierung Sequenzierungen erfolgten generell nach der Kettenabbruch-Methode [Sanger et al., 1977; Sanger und Coulson, 1975]. Diese beruht auf dem „Cycle-Sequencing“-Verfahren nach der „BigDye“-Terminator-Methode

mit

Fluoreszenz-markierten

Didesoxynukleotiden

und

AmpliTaq-Polymerase FS (Applied Biosystems, Langen). Ein Sequenzieransatz beinhaltete ca. 0.5 µg Plasmid-DNA, 5 pmol Oligonukleotid und 4 µl Terminatormix (BigDye Terminator Kit) in 20 µl Gesamtvolumen. Das PCR-Programm bestand aus einem initialen Denaturierungsschritt bei 96 °C für 5 min und durchlief dann 25-mal einen Zyklus aus Denaturierung (30 s, 96 °C), Hybridisierung (15 s, 50 °C) und Elongation (4 min, 60 °C). Abschließend wurde das Produkt durch eine kombinierte Ethanol/EDTA-Fällung gereinigt. Dazu wurden zu 20 µl PCR-Produkt, 2 µl 3 M Natriumacetat, pH 4.6 – 4.8, 2µl 125 mM EDTA und 50 µl 100 % Ethanol gegeben und die Lösung durch Zentrifugation präzipitiert (10000 x g, RT, 30 min). Nach einmaligem Waschen mit 70 % Ethanol wurde das Pellet kurz getrocknet. Die Analyse der Sequenzierprodukte wurden nach der Methode der Kapillarelektrophorese in einem 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Langen) analysiert. Zur Sequenzierung wurde die DNA in 20 µl deionisiertem Formamid aufgenommen und nach zweiminütiger Hitzedenaturierung bei 92 °C auf eine Mikrotiterplatte gegeben. Von dort erfolgte die Analyse der DNA automatisch durch einen Sequenzer, der die Proben durch eine elektrokinetische Injektion in die Kapillaren injiziert. Die elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte in 50 cm langen Kapillaren, die mit einem fließfähigen Polymer (POP-6; Performance Optimized Polymer 6) gefüllt sind. Sobald die DNA-Fragmente das Detektionsfenster am Ende der Kapillaren erreichen, werden sie mit einem Laser zur Fluoreszenz angeregt und über eine CCD-Kamera detektiert. Die Fluoreszenzdaten werden von einer Software gelesen, interpretiert und als Elektropherogramm ausgegeben. Die gesamten, zuletztgenannten Arbeitsschritte, vom Lösen des gefällten DNA-Pellets bis zur Erstellung des Elektropherogramms, wurden von der zentralen Einrichtung „Synthese und Sequenzierung“ des MPI Dortmund durchgeführt.

37

MATERIAL UND METHODEN 3.2.1.13 Konstrukte GTPasen RhoA aus Homo sapiens (AS 1-181) in pGEX4T1 RhoA aus Homo sapiens (AS 1-181) in pGEX Y-FP N-terminal RhoB aus Homo sapiens (AS 1-181) in pGEX4T1 RhoC aus Homo sapiens (AS 1-181) in pGEX4T1 Rac1 aus Homo sapiens (AS) in pGEX4T1 Rac1b aus Homo sapiens (AS) in pGEX4T1 Rac2 aus Homo sapiens (AS) in pGEX4T1 Rac3 aus Homo sapiens (AS) in pGEX4T1 Effektoren Rhotekin-RBD aus Mus musculus (AS 1-89) in pGEX4T1 ROCK aus Bos taurus in pGEX4T1* ROCK aus Homo sapiens in pGEX4T1* ROCK-RBD aus Homo sapiens in pGEX C-FP N-terminal Citron aus mus musculus in pGEX4T1* PRK1 aus Homo sapiens in pQE32* αPAK (AS 57-141) aus Homo sapiens in pGEX4T1 *Für die genaue Aufstellung verwendeter Fragmente siehe Ergebnisteil (Kapitel 4) Punktmutanten RhoA: G14V, C20S, V33C, F25N, Y34W, P36W, T37A, F39A/R, E40A/R, Y42C, D45R, Q63L, D65A/R, Y66A/R, R68A/C, D87V/D90A, F106C, R168A/E169A

38

MATERIAL UND METHODEN

3.2.2 Proteinbiochemische Methoden 3.2.2.1 Analytische Expression rekombinanter Proteine Um geeignete Bedingungen für die Expression eines neu klonierten, rekombinanten Proteins zu finden, wurde ein analytischer Expressionstest in kleinem Maßstab durchgeführt. Hierzu wurden 20 ml Expressionskulturen mit einer ü.N.-Vorkultur im Verhältnis 1:100 angeimpft und bei 37 °C bis zum Induktionszeitpunkt in einem Schüttler inkubiert. Folgende Parameter wurden dabei variiert. •

Expressionssystem (GST-Fusionsprotein und His-Tag)

•

Bakterienstamm (BL 21 (DE3) und Codon Plus / Rosetta (DE3))

•

Induktionspunkt (die optische Dichte, bei der induziert wird - OD600 = 0.4 - 0.6 und OD600 > 1,0)

•

Konzentration des Induktors (0.1 mM IPTG und 0.6 mM IPTG)

•

Expressionstemperatur (15 °C, 20 °C und 30 °C)

•

Expressionsdauer

Nach 3 h und nach ü.N.-Expression wurden jeweils zwei 1 ml-Proben entnommen. Je eine dieser Proben diente der Feststellung des Gesamtprotein-Expressionsmusters. Dazu wurden diese Proben zur Sedimentation der Bakterienzellen 1 min bei 14000 U/min zentrifugiert und anschließend in 160 µl H2O resuspendiert. Nach Zugabe von 40 µl SDS-Probenpuffer (5x) und zehnminütigem Kochen der Proben bei 95 °C wurden sie auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Die anderen Proben wurden einem analytischen Zellaufschluss (3.2.2.2) unterzogen, bevor sie auf einem SDS-Gel (3.2.2.7) aufgetrennt wurden, um somit die Proteinlöslichkeit zu bestimmen.

3.2.2.2 Analytischer Aufschluss rekombinanter Bakterien Der Aufschluss eines analytischen Expressionstest erfolgte durch ein chemisches Lyseverfahren mit Hilfe des Bug Buster Reagenz (Novagen). Hierzu wurde von jedem Expressionsansatz eine 1 ml-Kulturprobe für eine Minute bei 14000 U/min zentrifugiert und das entstandene Zellsediment in 100 µl Bug Buster Reagenz resuspendiert. Nach zehnminütiger Inkubation bei RT und mehrmaligem Invertieren wurde die lysierte Zellsuspension erneut abzentrifugiert (10 min bei 14000 U/min und 4 °C). Überstand und Sediment wurden auf ihre Zusammensetzung mittels SDS-PAGE (3.2.2.7) untersucht. 39

MATERIAL UND METHODEN

3.2.2.3 Präparative Expression rekombinanter Proteine Die Expression der Proteine wurde anhand der in 3.2.2.1 ermittelten optimalen Bedingungen durchgeführt. Das Animpfen der Kulturen im Maßstab zwischen fünf und zwanzig Litern Kulturmedium erfolgte nach der unter 3.2.2.1 beschriebenen Methode. Um gutes Wachstum zu gewährleisten und auch bei geringen Expressionszeiten große Zellausbeuten

zu erreichen, wurden einige der aufgeführten Proteine in der zentralen

Einrichtung Mikrobiologie des MPI Dortmund mittels eines Fermenters kultiviert. Die Bakterienzellen wurden nach Ablauf der Expressionsdauer bei 12000 x g für 15 min pelletiert und das Sediment in 50 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7.5) gewaschen. Nach einer erneuten Zentrifugation für 20 min bei 7000 U/min wurden die Bakterien in einem adäquaten Puffer aufgenommen, wobei pro Gramm Zellen 3 ml Puffer zum Resuspendieren eingesetzt wurden. Die Bakterienzellsuspension wurde dann bei –20 °C eingefroren.

3.2.2.4 Präparativer Zellaufschluss Die eingefrorenen Bakterienzellen wurden aufgetaut und mit Proteaseinhibitoren (3.1.1) im Verhältnis 1:1000 versetzt. Der Zellaufschluss erfolgte mit Hilfe eines Microfluidizers (Microfluidics Corporation). Bei diesem Gerät handelt es sich um eine pneumatische Maschine, die die Zellsuspension mit hohem Druck (etwa 600 kPa) durch eine enge Kapillare presst, wodurch die Zellwände der Bakterien durch die Scherkräfte aufgebrochen werden. Die dabei auftretende Reibungswärme wird durch externe Eisbadkühlung der Kapillare kompensiert. Der Vorgang wurde zur Verbesserung des Zellaufschlusses einmal wiederholt. Bei einigen Reinigungen wurde zur Verbesserung des Zellaufschlusses die Zellsuspension nach Zugabe der Proteaseinhibitoren durch Zugabe von Lysozym und Dnase I vorbehandelt.

3.2.2.5 Affinitätschromatographie Bei der Affinitätschromatographie erfolgt eine Trennung von Proteinen augrund ihrer Affinität zu einem Bindungspartner oder speziellen Liganden. Das zu isolierende Protein sollte dabei mit hoher Spezifität und Affinität an den Liganden binden, der an eine feste Matrix gekoppelt ist. Das ligand-gekoppelte Matrixmaterial kann dann im Batchverfahren oder mittels Säulenchromatographie eingesetzt werden, um das gewünschte Protein aus einem Proteinextrakt zu isolieren. Letzteres ist das häufiger angewandte System, wobei die gepackte Säule oft an eine FPLC-Anlage (fast protein liquid chromatography) angeschlossen ist. Wird ein Proteingemisch auf die Säule gegeben, adsorbieren nur die Proteine an die Säule, die eine 40

MATERIAL UND METHODEN hohe Affinität zu dem Liganden aufweisen. Je spezifischer die Interaktion zwischen Protein und Ligand ist, desto reiner kann das Protein isoliert werden. Durch die Zugabe von gelösten konkurrierenden Liganden kann das Protein wieder von der Säule eluiert werden. Da nicht jedes zu isolierende Protein einen geeigneten spezifischen Liganden hat, nutzt man molekularbiologische Methoden um Vektoren zu schaffen, die zwischen Promotor und Multiple Clonig Site das Gen für eine solche Ankergruppe (auch tag genannt) besitzen, welche mit dem Zielprotein über eine kurze Linkersequenz in frame verknüpft ist. Durch Expression

wird

so

ein

Fusionsprotein

geschaffen,

das

hinsichtlich

der

Affinitätschromatographie nahezu dieselben Eigenschaften besitzt wie die Ankergruppe (Protein oder Oligopeptid). Die am häufigsten verwendeten Systeme sind das GST Gene Fusion System von Amersham Biosciences und das QIAexpress System von Quiagen, die beide für die Isolierung von Proteinen in dieser Arbeit verwendet wurden. GST-Fusions-System Bei diesem System werden die in einen pGEX-Vektor klonierten Gene als Fusionsprotein mit einem N-terminalen GST-Anker, der Glutathion-S-Transferase aus Schistosoma japonicum, exprimiert, die spezifisch an ihren natürlichen Liganden Glutathion (GSH) bindet. Um diesen relativ großen tag (~26 kD) nach der Reinung abspalten zu können, besteht der 'Linker' zwischen GST und dem Protein aus einer Erkennungssequenz für eine spezifische Protease (Faktor Xa, Thrombin, PreScission-Protease oder IgA-Protease) Bei

der

Reinigung

wurde

der

Proteinüberstand

(nach

Zentrifugation

der

Zellaufschlusssuspension bei 100000 x g) über eine mit Standardpuffer äquilibrierte, GSHgekoppelte Sephadex-Säule (GSH FastFlow Sepharose 4B, Amersham Biosciences) gegeben. Da nur wenige Komponenten in einem Zellaufschluss unspezifisch an die GSH-Säule banden, konnte der größte Teil des Zellproteinanteils durch Spülen mit Puffern von dem an die Festphase gebundenen Fusionsprotein abgetrennt werden. Proteine, die unspezifisch an das Säulenmaterial banden, sowie Chaperone, die das zu isolierende Protein selbst binden, wurden in der Regel mit Hochsalz-Puffer (500 mM Salz) und einem Puffer, der ATP und K+ enthielt (zur Freisetzung des Chaperons), entfernt, so dass durch das GST-System ein Reinheitsgrad von über 90 % im ersten Schiritt erreicht werden konnte. Das Fusionsprotein wurde durch einen Glutathion-Puffer (20 mM) eluiert. Nach der Elution wurde der GST-Anker mittels Thrombin (je nach verwendetem pGEXVektor alternativ PreScission-Protease oder Faktor Xa) abgespalten. Die Trennung von Protein und GST erfolgte nach Entfernen des Glutathions aus dem Puffer durch Dialyse oder 41

MATERIAL UND METHODEN Gelfiltration über eine erneute Reinigung über die GSH-Säule. Alternativ kann das Protein auch durch ü.N.-Zirkulation auf der Säule mit der Protease geschnitten und dann mittels Puffer eluiert werden, was sich jedoch bei den wenigsten in dieser Arbeit isolierte Proteinen als probat erwies, da kein quantitativer Verdau auf der Säule erreicht wurde. His-Fusions-System Das QIAexpress System mit seinen pQE-Plasmidvektoren (alternativ pProEx von Invitrogen) verwendet vorwiegend einen sogenannten 6xHis-tag bestehend aus 6 Histidinen, die sowohl am C- als auch am N-Terminus des exprimierten Proteins liegen können. Als Säulenmaterial wurde eine Sephadex-Säule (Qiagen) verwendet, an die Nickel-Nitrilotriessigsäure (NickelNTA) gekoppelt wurde. Über die Komplexierung des Nickels mit NTA auf der einen und den Histidinen des Ankers auf der anderen Seite, kommt es zur Bindung des Fusionsproteins an das Säulenmaterial. Die Elution erfolgte nach einem Waschschritt bei etwa 20 mM Imidazol durch einen Imidazolgradienten (20 mM - 300 mM) über das Konkurrenzprinzip analog zur GSH-Elution beim GST-Fusionssystem. Das Fusionsprotein wurde ebenfalls analog über Gelfiltration gereinigt, mit dem Unterschied, dass der tag, da er nur aus 6 Histidinen besteht, nicht vom Protein abgetrennt werden musste. Proben der einzelnen Reinigungsschritte und der gesammelten proteinhaltigen Fraktionen wurden dann mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (3.2.2.7) analysiert. Die erhaltene Proteinlösung wurde im Anschluss konzentriert (3.2.2.9). Das Säulenmaterial wurde nach der Anwendung mit 5 M Guanidiniumhydrochlorid (GSH-Sepharose) bzw. 1 M Imidazol (NiNTA-Agarose) gespült und abschließend wieder mit Standardpuffer äquilibriert.

3.2.2.6 Gelfiltration In der Gelfiltration werden Moleküle nach ihrer Größe aufgetrennt. Dies geschieht durch ein hochporöses Säulenmaterial, in das kleine Moleküle eindringen können, große hingegen nicht. Aus diesem Grund nennt man die Gelfiltration auch Größenausschlusschromatographie. Erreicht wird dieser Molekularsiebeffekt durch ein kovalent vernetztes Polymer auf Polyacrylamid-, Agarose- oder Dextranbasis, dessen Vernetzungsgrad die Porengröße festlegt. Je kleiner die Moleküle sind, desto weiter können sie in die Poren eindringen und desto stärker werden sie am Durchlaufen der Säule gehindert. Teilchen mit einem Radius oberhalb der

Porengröße

können

nicht

in

diese

eindringen

und

verbleiben

deshalb

im

Ausschlussvolumen, wodurch sie die Säule wesentlich schneller durchlaufen als kleine Moleküle. Bei der Elution ist also die Molekülgröße, und dadurch annäherend das 42

MATERIAL UND METHODEN Molekulargewicht, umgekehrt proportional zum Elutionsvolumen. Über eine Kalibrierung der Säule mit Proteinen bekannter Größe lassen sich somit die Größen der eluierten Proteine über das Retentionsvolumen abschätzen. Präparative Gelfiltration Die Porengröße des Säulenmaterials definiert die Größe der trennbaren Proteine. In dieser Arbeit wurden Sephadex S75 und Sephadex S200 (Amersham Biosciences) eingesetzt, wobei die angegebene Zahl dem Molekulargewicht (in kDa) der nicht mehr aufzutrennenden Proteine entspricht. Je nach Proteinmenge und Auftragsvolumen, wurden Säulen der Größe 16/60, 26/60 oder 36/60 verwendet. Die Zahlenkürzel geben dabei den Durchmesser in mm und die Länge der Säule in cm an. Äquilibriert und eluiert wurde jeweils mit für das Protein adäquatem Puffer, der für diese Anwendung vorher filtriert und entgast worden war. Die Flussgeschwindigkeit und das Volumen der aufgefangenen Fraktionen hing ebenso wie die maximale Proteinbeladung von der Säulengröße ab. Die gesammelten Fraktionen wurden über SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

(3.2.2.7)

analysiert

und

die

Fraktionen

mit

ausreichend reinem und hohem Proteingehalt vereinigt und konzentriert (3.2.2.9). Analytische Gelfiltration Die analytische Gelfiltration wurde zur qualitativen Bestimmung der Bindung zwischen zwei Interaktionspartnern sowie zur Bestimmung der Stöchiometrie und des Molekulargewichts von Komplexen und Einzelproteinen verwendet. Als Säule wurde eine Sephadex S75 10/30 eingesetzt. Um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, wurde für die angeschlossene FPLC (Äkta-Explorer) ein Laufprogramm geschrieben, das für alle analytischen Läufe verwendet wurde. Pro Lauf wurden 100 µl Probenvolumen injiziert. Die Bestimmung der Molekulargewichte aus den Peakmaxima des Elutionschromatogramms erfolgte anhand der Kalibrierung der Säule. Zur sicheren Lokalisierung der aufgetragenen Proteine wurde während des Laufs fraktioniert. 100 µl der 500 µl Fraktionen wurden mit 5 µl 5xLaemmlipuffer versetzt, auf dem 96 °C Heizblock auf ein Volumen von 10-20 µl eingedampft und in einer SDS-PAGE (3.2.2.7) aufgetrennt.

3.2.2.7 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Zur analytischen Auftrennung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE) [Laemmli, 1970; Shapiro et al., 1967] mit diskontinuierlichem Puffersystem durchgeführt. 43

MATERIAL UND METHODEN Die durch den Probenpuffer garantierten denaturierenden Bedingungen bewirken, dass sämtliche Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen der Proteine aufgebrochen werden und diese als ellipsoide Strukturen vorliegen. Während das im Puffer enthaltene Detergenz SDS an die Proteine bindet (ca. ein Molekül SDS pro zwei Aminosäure-Reste) und die Auftrennung der intra- und intermolekularen Wechselwirkungen erzwingt, bewirkt βMercaptoethanol (alternativ DTE bzw. DTT) die reduktive Spaltung der Disulfidbindungen. Da SDS aufgrund seiner negativ geladenen Kopfgruppen die Eigenladungen der Proteine maskiert, entstehen Anionen mit einem nahezu konstanten Verhältnis von Gesamtladung zu Molekulargewicht. So können die Unterschiede verschiedener Proteine

vernachlässigt

werden. Trägt man die Probe auf ein Polyacrylamidgel mit definierter Porengröße auf, so sind die relativen Mobilitäten der Proteine aufgrund der Molekularsiebeigenschaft des Gels invers proportional zum Logarithmus des Molekulargewichts. Zur Schärfung der Proteinbanden wurde dem Trenngel ein grobporigeres Sammelgel vorgeschaltet (sog. diskontinuierliche SDS-PAGE). Polyacrylamidgele entstehen durch Kopolymerisation von Acrylamid und N, N´-MethylenBisacrylamid. Hierbei handelt es sich um eine radikalische Kettenreaktion, initiiert mit Ammoniumpersulfat (APS) als Radikalstarter und TEMED (Tetramethylethylendiamin) als Katalysator. Die mit 5x-Probenpuffer versetzten Proben wurden vor dem Auftragen einige Minuten bei 95 °C vollständig denaturiert. Die Elektrophorese erfolgte in SDS-Laufpuffer bei 34 mA. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit einer Färbelösung aus Coomassie Brilliant Blue G250 und R250, Ethanol und Essigsäure gefärbt, und der Hintergrund später mit einer Mischung aus Ethanol und Essigsäure entfärbt. Zur Kontrastverbesserung wurde das Gel über Nacht in Wasser geschwenkt. Gele, die für Western Blot eingesetzt wurden, wurden in einer Hoefer Gelkammer gegossen. Diese Gele sind im Vergleich zum vorher beschriebenen System (CTI) dünner und aus diesem Grund besser für den Western Blot geeignet, da sie ein vollständigeres Blotting gewährleisten. Da sie zusätzlich auch etwas länger sind als andere analytische Gele, wird zudem eine bessere Auftrennung der Proteine über die Laufstrecke erreicht. Eine SDS-Gelelektrophorese nach Schägger und von Jagow [Schagger et al., 1988; Schagger und Vonjagow, 1987] stellt eine Variante der oben beschriebenen SDS-PAGE dar. Sie zeichnet sich gegenüber dem allgemein gebräuchlichen Gelsystem nach Laemmli (1970) durch ein größeres Auflösungsvermögen im kleineren Proteinbereich aus. Deshalb wurde sie zur Auftrennung kleiner Proteine benutzt, das es mit diesem Gelsystem möglich ist, Proteine bis zu einem Molekulargewicht von 1 kD aufzutrennen. 44

MATERIAL UND METHODEN Die Trennung erfolgte mit einem diskontinuierlichen Gelsystem. Der Hauptunterschied zum Laemmlisystem besteht, neben dem Zusatz von Glycerin zum Trenngel, in der Verwendung eines Kathoden- und eines Anoden-Puffers.

3.2.2.8 Bestimmung der Proteinkonzentration Im VIS-Bereich Die Bestimmung der Proteingesamtkonzentration einer Lösung erfolgt durch Farbreaktion mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G250 [Bradford, 1976]. Durch die Interaktion mit den Seitenketten von Arginin, aber auch von Histidin, Lysin, Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin [Compton und Jones, 1985] wird der Farbstoff in seiner anionischen Form stabilisiert.

Dadurch

kommt

es

zu

einer

bathochromen

Verschiebung

des

Absorptionsmaximums von 465 nach 595 nm. Die Proteinkonzentration wird anhand einer Kalibriergeraden bestimmt, die mit einer BSA-Standard-Lösung erstellt wird. Zu einem halben Milliliter der gebrauchsfertigen Bradford-Lösung wurde die zu untersuchende Proteinlösung pipettiert und die Extinktion nach 10 min bei 595 nm gegen die Bradford-Lösung ohne Protein gemessen. Nur Extinktionswerte zwischen 0.2 und 0.8 wurden anhand der Kalibrierung ausgewertet. Im UV-Bereich Zur Bestimmung der Konzentration hochreiner Proteinlösungen und solcher, bei der die Bradford-Bestimmung aufgrund fehlender Arginine einen erkennbar falschen Wert lieferte, wurde die UV-Absorption der verdünnten Proteinlösung bei 228.5 nm und 234.5 nm gemessen (gegen Puffer) und die Proteinkonzentration nach Ehresman et al. [EHRESMAN.B et al., 1973] bestimmt: (A228,5 - A234,5) / 3.154 = mg Protein / ml Gleichung 3-2

3.2.2.9 Konzentrierung von Proteinen Nach

chromatographischen

Proteinreinigungsschritten

erfolgte

in

der

Regel

eine

Konzentrierung der Proteinlösung um sie anschließend weiteren Reinigungsschritten zu unterziehen oder zur Lagerung einzufrieren. Die gebräuchlichste Methode ist die der Ultrafiltration mittels Amicon-Zentrifugenkonzentratoren der Firma Millipore. Bei dieser Filtrationsmethode wird eine Proteinlösung mittels Zentrifugation durch eine Membran mit 45

MATERIAL UND METHODEN definierter Porengröße gepresst. Das Lösungsmittel und niedermolekulare Bestandteile können die Membran passieren, wohingegen Proteine und andere hochmolekulare Substanzen ab einer bestimmten Größe von der Membran zurückgehalten werden. Die Porengröße der Konzentratorenmembran legt die Ausschlußgröße (molecular weight cutoff;

MWCO)

fest.

Es

kamen

Konzentratoren

(Reservoirvolumen

15

ml)

mit

Ausschlussvolumina von 5, 10 und 30 kD zum Einsatz. Die Zentrifugation fand bei 2700 x g und 4 °C statt und wurde bis zum Erreichen des gewünschten Endvolumens bzw. der gewünschten Proteinkonzentration durchgeführt. Einige der in dieser Arbeit verwendeten Proteine zeigten eine ungewöhnlich hohe Adsorption an die Membran der Zentrifugenkonzentratoren, die zum Verschluss der Membranen führte und einen Verlust von ca. 70 % des Proteines bei jedem Konzentrationsschritt zur Folge hatte. Um eine schonende Konzentrierung zu gewährleisten, wurde die Konzentrierung dieser Proteine mittels Standkonzentratoren (Vivascience) durchgeführt. Das Prinzip der Standkonzentratoren beruht darauf, dass Puffer durch eine Membran definierten MWCO (hier 7.5 kD) gesaugt wird, wobei die Flüssigkeit von Whatman-Filtern aufgenommen wird. Das hat den Vorteil, dass die Proteinlösung ohne auf sie wirkende Zentrifugations- oder Druckkräfte konzentriert werden kann und auch die Chance einer Membranadsorption minimiert wird.

3.2.2.10 Nukleotidaustausch kleiner GTPasen Der Nukeotidaustausch bzw. die Nukleotidbefreiung von kleinen GTPasen nach John [John et al., 1990] beruht auf dem Abbau des präsenten Nukleotids (meist GDP) und Bindung eines im Überschuss (1,5-fach) vorliegenden Nukleotidanalogons. Dazu wurde im ersten Schritt das gebundene Nukleotid mit alkalischer Phosphatase (5 U/mg Protein) in einem speziellen Austauschpuffer, der die Austauschrate des Nukleotids erhöht und die GTPase stabilisiert, zu GMP bzw. G enzymatisch abgebaut. Da die GTPase das synthetische Nukleotid (GppNHp, mant-GppNHp oder GppCH2p) mit einer viel höheren Affinität bindet als das Monophosphat oder Guanin, wird das Nukleotidanalogon quantitativ gebunden. Der Ansatz wurde entweder ü.N. bei 4 °C oder für 2-3 h bei RT inkubiert und die Hydrolyse per HPLC (high performance liquid chromatography) (3.2.2.12) verfolgt. Bei quantitativem Verdau des ursprünglichen Nukleotids wurde das Protein im Falle des Austauschs mit z.B. GppNHp

(je nach Volumen) über eine NAP5- bzw. PD10-Säule

(Amersham Biosciences) nach dem Prinzip einer Gelfiltration gereinigt, um ungebundenes Nukleotid bzw. Nukleosid abzutrennen Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden detektiert, indem wenige µl auf eine Nitrozellulose-Membran pipettiert und anschließend mit Ponceau46

MATERIAL UND METHODEN Reagenz gefärbt wurden. Die positiven Fraktionen wurden gepoolt und mit HPLC die Konzentration bestimmt. Im Falle der Nukleotidbefreiung wurde nach Austausch zu GppCH2p im zweiten Schritt das Nukleotid mittels Phosphodiesterase hydrolysiert und der Abbau ebenfalls per HPLC überprüft. Zur Inaktivierung der alkalischen Phosphatase und der Phosphodiesterase wurde der Nukleotidbefreiungsansatz zweimal in flüssigem Stickstoff schockgefroren (auch im Falle des reinen Austauschs). Das „nukleotidfreie“ Protein konnte nun mit dem gewünschten Nukleotid beladen werden, indem dieses in 1-1,2-fachem Überschuss zu der GTPase gegeben wurde. Nach einer kurzen Inkubationsphase auf Eis wurde ungebundenes Nukleotid und Pyrophosphat durch eine Gelfiltration über eine NAP5- oder PD10-Säule abgetrennt. Die Konzentration an aktivem, nukleotidgebundenen Protein wird anschließend mittels HPLC (3.2.2.12) ermittelt.

3.2.2.11 Massenspektroskopie Neu klonierte Proteinkonstrukte wurden zunächst im Massenspektrometer untersucht. Aufgrund der hohen Genauigkeit der bestimmten Massen wurde die Mikro-ElektrosprayTechnik mit Ionenfalle benutzt (LCQ-Massenspektrometer der Firma Finnigan, San José, CA, USA). Dabei wurden etwa 30 µl einer ca. 100 µM salzfreien Proteinlösung in 50 % Methanol und 5 % Ameisensäure eingesetzt und an einer 1 µm breiten goldbeschichteten Quarzkapillare verdampft [Wilm und Mann, 1996]. Die Dekonvolution der Spektren erfolgte gemäß der Beziehung MW = z · m/z – z Gleichung 3-3 MW: Molekulargewicht m/z: Masse-Ladungsverhältnis z: Ladungszahl

3.2.2.12 Umkehrphasen HPLC Um Nukleotide nachzuweisen und zu charakterisieren wurde die Umkehrphasen-HochdruckFlüssigchromatographie (reversed-phase HPLC) verwendet. Die Auftrennung erfolgte isokratisch unter Ionenpaarbindung [Tucker et al., 1986]. An die negativ geladenen Phosphatgruppen

der

Nukleotide

binden

hierbei

die

positiv

geladenen

Tetrabutylammonium(TBA)-Ionen, deren hydrophober Acylanteil mit der hydrophoben 47

MATERIAL UND METHODEN Festphasen-Matrix (C-18) interagiert. Unter diesen Bedingungen nimmt die Retentionszeit mit steigender Zahl von Phosphatgruppen zu. Fluoreszenz-markierte Nukleotide zeigen ebenfall erhöhte Retentionszeiten, da die unpolaren Fluorophore mit der hydrophoben Säulenmatrix interagieren. Die Nukleotidkonzentration kann mit Hilfe des molaren Extinktionskoeffizienten (ε254 (GXP) = 16.700 M-1.cm-1, ε254 (mGXP) = 22.000 M-1.cm-1) nach dem Lambert-Beer'schen-Gesetz aus der optischen Dichte bei λ=254 nm berechnet werden. Durch

Kalibrierung

Zusammensetzung

und

des

HPLC-Durchflussphotometers

Konzentration

kann

die

mit

Proben

Zusammensetzung

als

bekannter auch

die

Nukleotidkonzentration schnell und genau bestimmt werden. Dieses Verfahren wurde sowohl für qualitative als auch quantitative Untersuchungen von Protein-Nukleotid-Komplexen eingesetzt. Durch die Wahl der Acetonitrilkonzentration der mobilen Phase (7,5-25 %) und der Flussgeschwindigkeit (1.5-2 ml/min) können die Retentionszeiten verändert werden. Intrinsische und GAP-katalysierte GTP-Hydrolyse-Messung Die intrinsische und p50RhoGAP-katalysierte GTP-Hydrolyserate verschiedener GTPasen der Rho-Familie wurde mittels Umkehrphasen HPLC bestimmt. Die Hydrolysereaktion von 80 µM GTPase in GAP-Messpuffer wurde in Ab- oder Anwesenheit von 8 µM GAP durch Zugabe von 70 µM GTP bei 25 °C gestartet. Zu festgelegten Zeitpunkten wurden 30 µl aus dem Reaktionsansatz entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und alle Proben anschließend unter gleichen Bedingungen mittels HPLC untersucht.

3.2.2.13 Qualitativer Bindungs-Assay (GTPase Pulldown Assay) Beim GTPase Pulldown Assay handelt es sich um eine Affinitätspräzipitation, die auf denselben Prinzipien wie die Affinitätschromatographie (3.2.2.5) beruht. Der immobilisierte Ligand ist wie in der Chromatographiesäule an eine Sepharose-Matrix gekoppelt, wobei diese aber als kleine Kugeln (Beads) frei handhabbar sind. In diesem sogenannten Batchverfahren können die Kugeln mit einer Proteinlösung gemischt werden, wobei sich nur bestimmte Proteine aufgrund ihrer spezifischen Affinität an die Sepharose-Beads anlagern. Durch Sedimentation können die Beads mit den entsprechenden Proteinen von den restlichen Proteinen in der Lösung abgetrennt werden. Bindet man nun Fusionsproteine an die Kügelchen (z.B. GST-Fusionsproteine an GSH-Sepharose-Beads), kann deren Bindung an andere Proteine qualitativ untersucht werden.

48

MATERIAL UND METHODEN Zur Bindung von GST-Fusionsproteinen an GSH-Sepharose-Beads der Firma Amersham Biosciences (Durchmesser: 45 - 165 µm) wurden die Beads zuerst viermal auf Eis mit Standard Bindungspuffer (SBP) gewaschen, wobei pro Bindungsansatz 130 µl Beads verwendet wurden. Die Präzipitation der Beads fand immer durch Zentrifugation bei 7000 x g und 4 °C für 1 min statt. Für den GTPase-Pulldown wurde ein GST-Effektor-Fusionsprotein zu den Beads gegeben und für 30 min bei 4 °C unter Rotieren inkubiert. Danach wurden eventuell in der Lösung noch vorhandene nicht gebundene Proteine durch viermaliges Waschen mit SBP entfernt. Zur Untersuchung der Bindung einer GTPase an das GSTEffektor-Fusionsprotein wurden zu den gekoppelten Beads rekombinante GTPasen in GDPbzw. GppNHp-gebundener Form gegeben und für 30 min bei 4 °C unter Rotieren inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit SBP wurden die Beads mit einer Spritze mit feiner Kanüle trocken gesaugt und mit 20 µl 4x Probenpuffer 5 min bei 95 °C inkubiert. Dadurch denaturieren die gebundenen Proteine und lösen sich von den Sepharose-Beads. Diese Proben wurden mittels SDS-PAGE (3.2.2.7) aufgetrennt und anschließend mittels Anfärben analysiert.

49

MATERIAL UND METHODEN

3.2.3 Biochemische und biophysikalische Methoden 3.2.3.1 Statistische Lichtstreuung Streulichtmessungen (LS) werden verstärkt in der Polymeranalytik eingesetzt. Die LS ist eine absolute Messtechnik, da die Streustrahlung, die in den Experimenten gemessen und für die Bestimmung der Strukturparameter verwendet wird, eine direkte Funktion von Molmasse und Größe der analysierten Teilchen ist. Das heißt, dass die Intensität des gestreuten Lichtes beim Streuwinkel 0° direkt proportional zu der Molmasse ist. Der Vorteil der Methode ist, dass keine Vorkenntnisse über chemische (Zusammensetzung) oder sterische (molekulare Konformation) Struktur der zu analysierenden Substanz erforderlich ist, wie es bei der Anwendung relativer oder viskositätsbasierender Methoden der Fall ist. Eine Kalibrierung mit Modellsubstanzen ist nicht vonnöten, was in der praktischen Anwendung die Analyse von Systemen gewährleistet, auch wenn keine Modellsubstanzen verfügbar oder chemische und sterische Strukturen nicht bekannt sind. Das Streulicht, dessen Intensität im Falle des Laser Light Scattering gemessen wird, resultiert aus der Wechselwirkung zwischen dem Laserlicht und den Probenteilchen, die durch die Zelle des Messgerätes fließen. Die Entstehung des Streulichtes kann als das Resultat der Wechselwirkung

zwischen

elektromagnetischer

Welle

(Laserlicht)

und

Materie

(Probenteilchen) verstanden werden. Das elektrische Feld der Welle bewirkt eine Ladungsverschiebung in der Materie und induziert so ein Dipolmoment. Durch die periodische Änderung des elektromagnetischen Erregerfeldes mit der Zeit wird das Dipolmoment zu einer Schwingung (oszillierender Dipol) gezwungen. Es resultiert eine beschleunigte bewegte Ladung, die nach den Vorstellungen der klassischen Elektrodynamik eine Streustrahlung (das Streulicht, dessen Intensität proportional zur Molmasse ist) emittiert. Das Streulicht ist nicht gerichtet und wird in alle Raumrichtungen gestrahlt. Die Intensität dieses Streulichtes wird von den DAWN Streulichtphotometern bei verschiedenen Streuwinkeln (insgesamt 18 Detektoren) simultan gemessen. Aus der Intensität des Streulichtes als Funktion des Beobachtungswinkels werden Molmasse und Größe der Probenteilchen absolut bestimmt. So können neben den Molmassen (Intensität des Streulichtes beim Streuwinkel 0°) auch die Molekülgrößen (Anfangssteigung der Winkelabhängigkeit

der

Intensität

des

Streulichtes),

ihre

Mittelwerte

und

Verteilungsfunktionen absolut gemessen werden. Die Kopplung mit chromatographischen Methoden ermöglicht auch die Bestimmung von z.B. verschiedenen Aggregatszuständen innerhalb einer Probe.

50

MATERIAL UND METHODEN Die Methode wurde hier dazu verwendet, um Molekulargewichte von Einzelproteinen und Komplexen zu messen, die über gängige Methoden wie analytische Gelfiltration (3.2.2.6) aufgrund ihres veränderten Laufverhaltens nicht bestimmt werden konnten. Für die Messung wurde

ein

miniDAWN

Tristar

Vielwinkel

Streulichtphotometer

mit

Optilab

Differentialrefraktometer der Firma Wyatt benutzt.

3.2.3.2 Fluoreszenzspektroskopie Der Fluoreszenzspektroskopie liegt zu Grunde, dass bestimmte Moleküle abhängig von ihrem elektronischen Grundzustand Lichtquanten absorbieren und wieder emittieren können. Durch die Absorption eines Lichtquants wird das Molekül in einen elektronisch angeregten Zustand versetzt. Die so aufgenommene Energie wird durch das Zurückfallen des Elektrons in seinen Grundzustand wieder frei. Ein Teil dieser Energie geht durch Rotation, Translation und Vibration verloren. Somit ist die durch die Abregung freigesetzte Strahlung energieärmer und damit langwelliger als die Anregungswellenlänge (Rotverschiebung). Je nachdem, wie schnell die Strahlung von dem angeregten Molekül freigesetzt wird, spricht man von Fluoreszenz oder Phosphoreszenz. Bei der Fluoreszenz wird ein Lichtquant direkt im Anschluss an die Absorption emittiert, wohingegen bei der Phosphoreszenz zwischen Absorption und Emission eine gewisse Zeitspanne liegt. Die Fluoreszenz ist abhängig von der Umgebung des Fluorophors, denn deren Polarität entscheidet, wie hoch der Anteil strahlungsloser Übergänge bei der Lichtemission des angeregten Moleküls ist. Bei solchen als „Quenching“ bezeichneten strahlungslosen Übergängen findet eine Umwandlung der Anregungsenergie in Translations-, Rotations- und Schwingungsenergie statt, die auf molekularer Ebene an die Umgebung des Fluorophors übertragen wird. Durch diesen strahlungslosen Abregungsprozess findet jedoch keine Wellenlängenänderung der emittierten Strahlung statt. Ändern sich hingegen die Eigenschaften der Umgebung des Fluorophors, werden die Bedingungen für Quenching und Strahlungsemission variiert, was an einer Änderung des Fluoreszenzsignals sichtbar wird. Darauf beruht auch das Messprinzip der Fluoreszenzspektroskopie, nämlich einer Änderung des Fluoreszenzsignals eines Moleküls durch die Interaktion mit einem anderen Molekül aufgrund einer Polaritätsverschiebung in der Umgebung des Fluorophors. Die Messung der Fluoreszenz kann zeitaufgelöst erfolgen, wodurch Kinetiken bei geeigneter Umgebungsänderung bestimmt werden können.

51

MATERIAL UND METHODEN Tryptophanfluoreszenz Die Tryptophanfluoreszenz beruht auf der Messung der intrinsischen Fluoreszenz von Tryptophanresten, die gezielt bei einer Wellenlänge von 295 nm angeregt werden können. Ändert sich die Umgebung der in dem Protein vorhandenen Tryptophane dabei aufgrund der Bindung mit einem anderen Protein, so ändert sich die Fluoreszensintensität, die detektiert werden kann. Fluoreszenz markierter Nukleotide Zur Untersuchung von GTPasen können Nukleotidanaloga eingesetzt werden, die mit einem Fluorophor kovalent verknüpft sind. Dabei liegt die Fluoreszenz des Fluorophors in den meisten Fällen deutlich höher, wenn das Nukleotid von der GTPase gebunden ist, da die Energieübertragung des angeregten Fluorophors auf die Aminosäurestruktur des Proteins wesentlich geringer ist als auf die Wassermoleküle. So kann die Assoziation und Dissoziation des markierten Nukleotids an die GTPase spektroskopisch verfolgt werden. Als markierte Nukleotidanaloga wurden mant-GDP und mant-GppNHp eingesetzt. Die mantmarkierten Nukleotide besitzen als Fluorophor eine Methylanthraniloyl-Gruppe, die kovalent mit der 2' bzw. 3'-Position der Ribose verbunden ist [Ostermann et al., 1999] (Abb.3-1). Die Excitationswellenlänge der mant-Gruppe liegt bei 366 nm und die Emissionswellenlänge 450 nm.

Abb.3-1: Chemische Struktur des nicht hydrolysierbaren Fluoreszenz-GTP-Analogons 2‘,3‘- bis- O-(N-methyl)-anthraniloyl-guanosin5‘-(β,γ-imido)triphosphat (mantGppNHp). Die fluoreszierende mant-Gruppe ist durch ein gelbes Feld gekennzeichnet.

Guanidinnukleotid-Dissoziations-Inhibitions-Assay (GDI-Assay) Wie an der Effektorbindung von Ras gezeigt werden konnte, wird die Nukleotiddissoziation vom Ras-Protein durch Bindung mit dem Effektor inhibiert [Herrmann et al., 1995].

52

MATERIAL UND METHODEN

Abb. 3-2: GDI-Assay. A. Darstellung der Gleichgewichtsverhältnisse zwischen GTPase, Nukleotid und Effektorprotein. B. Schematische Darstellung der Methodik

Unter der Voraussetzung, dass k-2 vernachlässigbar klein ist (die Geschwindigkeit der Nukleotiddissoziation ist im Komplex mit dem Effektor unter abgesättigten Bedingungen um wenigstens das Zehnfache geringer), kann man so die Geschwindigkeit der Dissoziation des gelabelten Nukleotids von der GTPase als Funktion der zugegebenen RBD-Konzentration messen (Abb. 3-2 B). Bei großem Überschuss (200fach) an ungelabeltem Nukleotid kann die Dissoziationsreaktion, wie Abb.3-2 A schematisch gezeigt (nach Herrmann und Nassar [Herrmann und Nassar, 1996]; hier für RhoA und mant-GppNHp dargestellt), als irreversibel angesehen werden, d.h. die Reaktionsgeschwindigkeiten k+1 und k+2 können vernachlässigt werden. Die beobachteten Geschwindigkeitskonstanten kobs werden gegen die eingesetzten RBDKonzentrationen aufgetragen. Durch Auswertung nach folgender hyperbolischer Gleichung erhält man die Dissoziationskonstante KD [Herrmann et al., 1995]:

k obs =

k −1 1 + [ RBD] / K D

Gleichung 3-4 Die Messungen erfolgten unter Vorlage von RhoA·mant-GppNHp/GDP und 200fachem molarem Überschuss von freiem ungelabeltem GppNHp/GDP. Die Dissoziation des gelabelten Nukelotids, und damit der Abfall des Fluoreszenzsignals, wurde in Abhängigkeit der Konzentration des zutitrierten Effektors über die Zeit verfolgt. Die Messungen wurden in entgastem und steril filtriertem GDI-Messpuffer bei 25 °C durchgeführt. 53

MATERIAL UND METHODEN

Fluoreszenzspektroskopie mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Unter günstigen Bedingungen kann die Anregungsenergie eines Fluorophors auf einen zweiten Fluorophor übertragen werden. Dieser Energietransfer ist einer der eher nützlicheren Quenching-Mechanismen in der Fluoreszenzspektroskopie. Die Voraussetzungen hierfür sind eine Übergangsdipolinteraktion zwischen den Fluorophoren und ein nennenswertes Überschneiden des Fluoreszenzspektrums des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors. Die Notwendigkeit einer Dipol-Dipol Interaktion zwischen den Fluorophoren führt zu einer starken Abhängigkeit von dem Abstand der beteiligten Gruppen. Die Effizienz des Transfers ist definiert durch die Förster-Gleichung

Effizienz =

1

1 + (r/R 0 )

6

Gleichung 3-5 R0 liegt dabei normalerweise in Bereich von 2 nm. Tryptophan/mant-FRET Da die Emissionswellenlänge des Tryptophans mit ~ 350 nm im Bereich der Excitationswellenlänge der mant-Gruppe liegt, kann die Methode benutzt werden, um über FRET die Fluoreszenz des mant-Nukleotides anzuregen, die dann bei 450 nm detektiert werden kann. FRET zwischen fluoreszierenden Fusionsproteinen CFP (cyan fluorescent protein) und YFP (yellow-fluorescent protein) sind Varianten des Grün-fluoreszierenden Proteins (GFP). Es konnte bereits in Zellstudien gezeigt werden, dass sie als Anker-Gruppen bei der Interaktion zweier Bindungspartner zu einem Energietransfer fähig sind [Tramier et al., 2002]. Absorptions- und Emissionsmaxima liegen für CFP bei 430 nm und 479 nm bzw. 515 nm und 530 nm für YFP. Die Messungen wurden in entgastem und steril filtriertem Gelfiltrationspuffer durchgeführt.

3.2.3.3 Isotherme Titrationsmikrokalorimetrie Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) dient der Bestimmung der bei der Assoziation zweier

Moleküle

freiwerdenden

oder

benötigten

Energie.

Mit

dem

isothermen

Titrationskalorimeter (Microcal) lässt sich die Änderung der Enthalpie ∆H bei der Interaktion von Proteinen bestimmen. Eine Messzelle im Innern des Gerätes wird hierzu mit der Lösung 54

MATERIAL UND METHODEN eines Proteins befüllt und auf die gewünschte Messtemperatur kalibriert. Das zweite Protein wird durch einen Pipettierautomaten zutitriert. Nach jedem Titrationsschritt stellt die Regelautomatik des Kalorimeters die Temperaturdifferenz zwischen der Messzelle und einer wassergefüllten Referenzzelle wieder auf Null. Gemessen wird die Leistung, die nötig ist, um den Temperaturgradienten auszugleichen (P= U·I und P= E/t). Trägt man die Leistung gegen die Zeit auf, so gibt die Fläche unter dem Graphen die in diesem Zeitraum als Wärme abgegebene Energie wieder. Wird diese Wärme gegen das molare Verhältnis der beteiligten Proteine aufgetragen, erhält man eine Kurve, aus deren Krümmung die Affinitätskonstante KA berechnet werden kann. Der reziproke Wert der Assoziationskonstante liefert die Bindungskonstante KD. Für die Messungen wurde die GTPase in der Messzelle in einer Konzentration von 60 µM vorgelegt und dann mit der 10fachen molaren Konzentration des Effektors titriert. Die Temperatur während der Messung betrug 25 °C. Die Auswertung der Messdaten erfolgte durch das Programm Origin for ITC 3.1 von MicroCal.

55

ERGEBNISSE

4 Ergebnisse 4.1 Struktur-Funktionsbeziehung

der

Rho·GTP-spezifischen

Effektor-Interaktion 4.1.1 Klonierung und Reinigung von GTPasen der Rho-Familie Um die Interaktion zwischen den GTPasen der Rho-Familie und ihren Effektoren analysieren zu können, war die rekombinante Expression verschiedener GTPasen sowie deren Effektorproteine notwendig. Dafür wurden verschiedene Fusionskonstrukte verwendet, die entweder bereits vorhanden waren oder hergestellt werden mußten. Die Expression der GTPasen erfolgte mit dem GST-Fusionssystem (3.2.2.5), um die Proteine über eine Affinitätschromatographiesäule isolieren zu können, da eine Reinigung über eine Ionenaustauschersäule in Anlehnung an Ras oder Rap nicht möglich war. Die Klonierung der in 3.2.1.13 aufgeführten GTPasen der Rho-Familie erfolgte mittels der unter 3.2.1 beschriebenen molekularbiologischen Methoden. Meist wurden neue Fragmente über die Amplifizierung mittels PCR unter Verwendung entsprechender Primer (3.2.1.3) hergestellt. Als Restriktionsenzyme wurden hauptsächlich BamHI und XhoI verwendet, die die Multiple Cloning Site des pGEX-Vektors flankieren und so eine Minimierung zusätzlicher nicht genkodierter Aminosäuren ermöglichen. Aus demselben Grund wurden nicht die StopCodons des Vektors benutzt, sondern hinter der Gensequenz vor der Restriktionsschnittstelle zwei Stop-Codons eingefügt. Die Herstellung von Mutanten erfolgte nach dem Quikchange Protokoll (3.2.1.3). Tabelle 4-1: Expressionsbedingungen

Nach

der

Klonierung

wurden

für

die

rekombinanten

Proteine

optimale

Expressionsbedingungen in einer analytischen Expression (3.2.2.1) ermittelt (Abb. 4-1 A, 56

ERGEBNISSE exemplarisch für RhoA dargestellt). Tabelle 4-1 zeigt die Bedingungen, die für die einzelnen, in dieser Arbeit verwendeten Proteine ermittelt wurden. Für RhoC Wildtyp konnte zwar eine starke Überexpression über Nacht bei 30°C und einer Induktion bei OD600 zwischen 0.5 und 0.7 bei 0.1 mM IPTG festgestellt werden, jedoch erwies sich das Protein unter diesen Bedingungen als komplett unlöslich. Da bei RhoB vergleichbare Probleme auftraten, wurde eine Expressionsmethode versucht, um mögliche Inclusion bodies aufzulösen, ohne diese aus dem Pellet nach der aufwenigen Methode von Rudolph und Lilie [Rudolph und Lilie, 1996] isolieren zu müssen. Die Kultivierung erfolgte unter den in Tabelle 4-1 aufgeführten Bedingungen bei niedrigen Temperaturen und einer frühen Induktion mit niedriger Induktorkonzentration, wodurch lösliches Fusionsprotein erhalten werden konnte. Die Reinigung der GTPasen erfolgte nach den unter 3.2.2 beschriebenen proteinchemischen Methoden. Sie soll anhand der Isolierung von RhoA 1-181 Wildtyp exemplarisch gezeigt werden, da das Reinigungsprotokoll für verschiedene GTPasen (im GST-Fusionssystem) grundsätzlich dem von RhoA entsprach, aber die Rho-GTPasen (Rho A, B und C) gegenüber Proteinen der Rac-Gruppe (Rac1, 1b, 2, 3) oder Cdc42 eine Besonderheit (das Auftreten hochmolekularer Aggregate) aufwiesen. Jeder verwendete Puffer während des Aufschlusses enthielt zur Stabilisierung der jeweiligen GTPase GDP in einer Konzentration von 100 µM. Die präparative Expression von GST-RhoA1-181 erfolgte nach den in Tabelle 4-1 gezeigten Bedingungen in TB-Medium. Der präparative Aufschluss mittels Microfluidizer (3.2.2.4) und die Affinitätschromatographie des Proteinüberstandes (3.2.2.5) mittels FPLC und einer gepackten Säule aus GSH-Sepharose-fast flow-Material erfolgte wie unter 3.2 beschrieben. Von einem Thrombinverdau auf der Säule wurde Abstand genommen, da das Protein dabei nur unzureichend von Thrombin geschnitten wurde. Nach Vereinigung der proteinenthaltenden Fraktionen wurde das Volumen der Proteinlösung durch Konzentrierung (3.2.2.9) verringert und nach Bestimmung der Proteinkonzentration (3.2.2.8) auf eine äquilibrierte Gelfiltrationssäule (Superdex 75) aufgetragen (Standard-Bindungs-Puffer ohne GDP), um mögliche Verunreinigungen abzutrennen und das Protein von Glutathion zu befreien. In der Gelfiltration zeigten sich trotz einer einzelnen Bande des GSH-Eluats bei etwa 46 kD (26 kD (GST) + RhoA (20.5 kD)) in einer analytischen SDS-PAGE (Abb. 4-1 B) zwei Peaks.

57

ERGEBNISSE

Abb. 4-1: Reinigung am Beispiel von RhoA 1-181 wt. A. Expressionsanalyse von RhoA. Gezeigt sind verschiedene Expressionszeiten bei konstanter IPTG-Konzentration (+/- 0.1 mM IPTG). B. Gelfiltration von GST-RhoA. Es sind Fraktionen aus beiden Peaks aufgetragen. Links - Oligomerpeak; Rechts Monomer/Dimerfraktionen. C. Darstellung der Reinigungsschritte. A - Aufschluss; S - Sediment; D – Durchfluss der GSH-Sepharose; SDS7-Proteinstandard; E - GSH-Eluat; TV - nach Thrombinverdau; RhoA - gereinigtes Protein nach zweiter Affinitätschromatographie.

Wie man in Abb. 4-1 (B) erkennen kann, wies der hochmolekulare Peak I (am Ausschlussvolumen der Säule) sehr viele Abbaubanden auf. Auch eine vergleichende Konzentrationsbestimmung mittels Bradford und HLPC zeigte, dass diese Fraktion nur zu etwa 50 % mit Nukleotid beladen war. Aus diesem Grund wurde dieser Teil bei der Reinigung verworfen und die Fraktionen des monomeren Peaks II so gewählt, dass möglichst wenige Verunreingungen aus Peak I mitgetragen wurden.

Abb. 4-1 (C) zeigt die

exemplarische Aufreinigung von GST-RhoA1-181 anhand von SDS-Gelelektrophoresen. Die auseinander diffundierende Bande des gereinigten RhoA1-181 ist charakteristisch für das Protein. Interessanterweise zeigten weder die GTPasen der Rac-Gruppe (unabhängig ob sie verkürzt oder full length waren) noch Cdc42 dieses Phänomen, obwohl gerade bei Rac eine Oligomerisierung über den polybasischen C-Terminus vermutet wird [Zhang et al., 2001; Zhang und Zheng, 1998]. Viel stärker trat dieses Phänomen der Oligomerisierung jedoch bei RhoB und RhoC auf. Lag im Fall von RhoA das Fusionsprotein noch etwa zu 50 % in monomerer Form vor, sank der Anteil bei einer Reinigung von GST-RhoC full length bzw. GST-RhoB C-terminal verkürzt auf unter 10 %. Mittels analytischer Gelfiltration wurden im 58

ERGEBNISSE Fall von RhoC die Molekulargewichte bestimmt. Die „monomerische“ Form wies dabei das Molekulargewicht eines Dimers (~90kD), das Oligomer ein Molekulargewicht von ca. 3500 kD auf. Die beobachtete Dimerbildung läßt sich vermutlich auf die Glutathion-S-Transferase (GST) zurückführen, da das Protein dafür bekannt ist, Homodimere zu bilden [Thom et al., 2001]. Da das Phänomen scheinbar nur bei GTPasen der Rho-Gruppe auftaucht und dort auch unabhängig von der Anwesenheit des C-Terminus ist, scheint es eine Rho-spezifische Eigenart zu sein. Ein ähnliches Phänomen wurde bei RhoG beobachtet, wobei es sich hier sogar um Oligomere handelt, die sich auch im SDS-Gel nicht trennen lassen [Eberth, 2002]. Den Ansatz einer Lösung bietet die von Self & Hall [Self und Hall, 1995] beschriebene Mutation von Phenylalanin 25 zu Asparagin (F25N). Expressionen haben gezeigt, dass das Protein im Fall von RhoA eine wesentlich höhere Löslichkeit aufweist und damit höhere Ausbeuten ermöglicht. Für RhoC1-181F25N konnte gezeigt werden, dass sich dadurch der Anteil an löslichem, monomerem Protein erhöhen läßt (ca. 30 %). Eine Erklärung hierfür ist, dass F25 innerhalb der Rho-Struktur als hydrophober Rest nach außen exponiert wird und damit die Löslichkeit des Proteins herabsetzt. Dieses konnte erst kürzlich mit einer Solvatations-Analyse

von

RhoA

gezeigt

werden

(Prof.

Wittinghofer,

persönliche

Kommunikation; Analyse durch Prof. Louis Serrano nach [Fernandez-Escamilla et al., 2004]). RhoA F25N zeigt jedoch zum Teil abweichendes Verhalten verglichen mit dem Wildtyp. Für die Nukleotiddissoziation konnte eine fünffach beschleunigte Rate festgestellt werden. Da es zudem unmöglich war, das Protein nukleotidfrei zu bekommen (3.2.2.10), ohne dass es im Verlauf ausfiel, wurde diese RhoA-Mutante in der Arbeit nicht verwendet. Der Grund für die Instabilität ist vermutlich ein hydrophober Kontakt von Phe-25 mit Phe-171, der im Wildtyp vorkommt und vermutlich durch die Methylengruppen der Seitenkette von Arg-168 stabilisiert wird. Beide Phenylringe liegen dabei planar aufeinander. Wird das Phenylalanin zu Asparagin mutiert, kommt es um Aufbrechen dieses Kontakts. Welchen Einfluss dies auf die gesamte Faltung der G-Domäne insbesondere auf die Nukleotidbindung besitzt, läßt sich nicht vorhersagen. Eine genaue Charakterisierung der intrinsischen Eigenschaften der F25N Mutante (Nukleotidaffinitäten, Dissoziationsrate, GTP-Hydrolyse) wird zur Zeit im Rahmen einer Diplomarbeit (MPI Dortmund, 2004) von Thorsten Lorenz untersucht. Die Kultivierung von RhoA im pET M20-His-System, die parallel zum GST-System getestet wurde, zeigte für die GTPase in einem analytischen Test keine ausreichende Überexpression und wurde aus diesem Grund nicht weiter verfolgt. 59

ERGEBNISSE

4.1.2 Klonierung und Reinigung von Effektorfragmenten Um die Effektorinteraktion zu untersuchen wurden im Laufe der Dissertation diverse Fragmente verschiedener Effektoren hergestellt. Abb. 4-2 gibt einen Überblick über die Konstrukte von ROCK und Citron Kinase, Abb. 4-3 einen Überblick über die in 4.1.4 verwendeten Rho-bindenden Domänen bzw. HR1-Domänen. Tabelle 4-1 zeigt die für jeden Effektor getesteten Expressionsbedingungen, wobei verschiedene Fragmente desselben Effektors – außer explizit angemerkt – unter denselben Bedingungen exprimiert wurden.

Abb.4-2: Übersicht der klonierten bzw. isolierten Konstrukte von Citron Kinase und ROCK. Die Übersicht zeigt die Länge, Beginn und Ende der Proteinfragmente (Zahlen = Aminosäuren), sowie die Bezeichnung der einzelnen Konstrukte. Die Rho-bindenden Domänen sind rot hervorgehoben. Die Bezeichnung der Domänen ist analog zu Abb.1-6.

Die Effektorproteine wurden entweder als GST- bzw. (His)6-Fusionsproteine mittels affinitätschromatographischer Methoden (3.2.2.5) gereinigt. Im Fall einer Imidazolelution wurde ein Gradient zwischen 20 mM und 300 mM Imidazol verwendet, der in allen Fällen ausreichte, um das Protein zu eluieren.

60

ERGEBNISSE

Abb.4-3: Übersicht der klonierten bzw. isolierten HR1-ähnlichen Domänen von PRK1, Rhotekin und ROCK. Die Übersicht zeigt die Länge, Beginn und Ende der Proteinfragmente (Zahlen = Aminosäuren), sowie die Bezeichnung der einzelnen Konstrukte. Die klassischen Rho-bindenden Domänen sind rot hervorgehoben. Die Bezeichnung der Domänen ist analog zu Abb.1-6.

Nach Gelfiltration, Thrombinspaltung (oder Verdau mit IgA Protease) und einer weiteren GSH-Säule zur Abtrennung von noch vorhandenem GST wurden die Proteine in einem magnesiumfreien Puffer bei -20 °C bzw. -80 °C gelagert. Reinigung von ROCK- und Citronproteinen Die ROCK-Konstrukte entstammten allesamt der vorhergesagten coiled-coil Region, weshalb sich vor allem größere Fragmente (z.B. ROCK40) nur in sehr geringen Mengen reinigen liessen. Aufgrund ihrer hohen Hydrophobizität adsorbierten die Proteine an die Membran von Konzentratoren, was zu einem Verlust von etwa 70 % des Proteins bei jedem Konzentrationsschritt führte. Durch die Verwendung von Standkonzentratoren und Ammoniumsulfatfällungen (zum Zwecke der Konzentrierung) konnte die Isolierung soweit optimiert werden, dass alle Proteine (bis auf RID-RBD) isoliert und gemessen werden konnten. Trotz Klonierung von insgesamt zehn verschiedenen Konstrukten (Abb. 4-2), gelang es im Fall von Citron nicht ein stabiles Fragment herzustellen. Das bereits vorliegende RBDKonstrukt erwies sich nach dem Thrombin-Verdau als unlöslich und präzipitierte. Alle anderen Konstrukte zeigten in E.coli eine Überexpression, waren aber auch unter milden Bedingungen komplett unlöslich. Es war nicht möglich ein Konstrukt zu finden, das löslich genug war, um die Interaktion zwischen Rho und der Rho-bindenden Domäne untersuchen und quantifizieren zu können.

61

ERGEBNISSE

4.1.3 Untersuchung der RhoA·GTP-spezifischen ROCK-Interaktion ROCK-Proteine sind verglichen mit anderen Rho-Effektorproteinen relativ gut untersucht, wenn auch vorwiegend auf zellulärer Ebene. Es wurden in den letzten Jahren viele Zielproteine, die durch die Aktivität der Kinase phosphoryliert werden, identifiziert, die einen Hinweis darauf lieferten, in welchen Signalwegen ROCK eine Rolle spielt. Rho-ROCK-vermittelte Signalwege sind wesentliche Elemente in der Organisation und Regulation des Aktinzytoskeletts. Das Interesse an der Signaltransduktion dieses speziellen Effektorproteins ist vor allem aus dem Befund entstanden, dass eine Deregulation der Signalwege,

in

den

ROCK

eine

Rolle

spielt,

zur

Tumorinvasion

und

Metastasierungsprozessen beitragen und möglicherweise auch die Ursache für Krankheiten wie Hypertonie und und bronchialem Asthma sind [Riento und Ridley, 2003]. Obwohl die zellulären Signalwege der Effektoren gut verstanden sind war bislang unklar, auf welche Art die Interaktion mit der GTPase erfolgt. Aufgrund von Sekundärstrukturanalysen wurde lange Zeit eine Analogie zu der Interaktion mit dem Effektor PRK1 vermutet, die jedoch nie bewiesen werden konnte. Deshalb sollte die Interaktion der Rho-bindenden Domäne von ROCKI mit RhoA untersucht werden. Es gibt verschiedene Methoden, um eine Interaktion zwischen zwei rekombinanten Proteinen in vitro zu charakterisieren. Experimente, die die Bindung zweier Proteine zeigen (Pulldown bzw. Overlay-Experimente) sind qualitativer Natur, da die Interaktion nur in einem positiv/negativ-Test betrachetet werden kann und keinerlei Aussagen über Stärke der Bindung (Affinität) sowie Assoziations- und Dissoziationsraten (schnelle/langsame Bindung oder Dissoziation) des Komplex getroffen werden können. Mit Hilfe quantitativer Methoden (Fluoreszenzspektroskopie, Oberflächenplasmonresonanz (SPR), ITC) lassen sich diese kinetischen Raten und Konstanten durch Auswertung der experimentellen Daten bestimmen.

4.1.3.1 Qualitative Bindungsstudien Abb. 4-4 zeigt ein Pulldown-Experiment (3.2.2.13), das mit den verschiedenen ROCKProteinen und Rho in GDP- bzw. GppNHp-gebundener Form durchgeführt wurde. Neben der GTP-abhängigen Bindung für die ROCK-RBD, wurde ein Fragment von ROCK verwendet, das N-terminal von der Rho bindenden Minimaldomäne liegt (ohne die RBD zu enthalten) (Abb.4-2) und das ebenfalls GTP-abhängig bindet. Es wurde RID (Rho-Interagierende Domäne) genannt. 62

ERGEBNISSE

Abb.4-4: ROCK-Pulldown. Verschiedene Fragmente von ROCK (siehe Abb.4-2) wurden als GSTFusionsproteine an GSH-Beads gekoppelt und nach einigen Waschschritten mit RhoA1-181·GDP beziehungsweise RhoA1-181·GppNHp inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen wurden die Beads in Probenpuffer aufgenommen und auf einem 15 % SDS-Gel elektrophoretisch getrennt.

Bemerkenswerterweise zeigten größere Fragmente, die beide Domänen umspannen (RIDRBD, REPEAT) unter gleichen Bedingungen kaum Bindung an RhoA. Sowohl bei REPEAT (von repeating binding domains) also auch bei RID-RBD deutete sich eine schwache Bande bei RhoA·GppNHp an. Obwohl bei beiden Proteinen weniger GST-Fusionsprotein verwendet wurde und man aus diesem Grund eine schwächere Bande von RhoA erwarten würde, scheint die Affinität zu der GTPase im Vergleich mit der RBD oder RID niedriger zu liegen.

4.1.3.2 Biophysikalische Charakterisierung der Rho-/Rho-Effektor-Interaktion Die Interaktion zwischen Rho-Effektoren und RhoA wurde in der Vergangenheit meist nur mit qualitativen Bindungstudien wie dem oben gezeigten Pulldown oder radioaktiven Overlay-Assays bzw. Zwei-Hybrid-Studien nachgewiesen [Flynn et al., 1998; Fujisawa et al., 1996; Peck et al., 2002; Reid et al., 1996; Vincent und Settleman, 1997; Watanabe et al., 1996]. Obwohl die Proteine durch diese Techniken überhaupt erst als Effektoren identifiziert werden konnten, geben sie jedoch keinen Aufschluss über Unterschiede zwischen verschiedenen Effektoren hinsichtlich ihrer Affinität oder der Art ihrer Bindung. Die einfachste Möglichkeit, die Interaktion zwischen zwei Bindungspartnern zu untersuchen, ist die Bestimmung entsprechender Konstanten und Raten mittels direkter kinetischer Messmethoden wie der Fluoreszenzspektroskopie. Grundvoraussetzungen für den Einsatz fluoreszenzspektroskopischer Techniken sind die Möglichkeit einer Markierung von einem der beiden Interaktionspartnern mit einem Fluorophor bzw. einer fluoreszierenden Gruppe, sowie eine zeitlich aufgelöste signifikante Änderung der Fluoreszenzintensität über den Verlauf der Reaktion. 63

ERGEBNISSE GTPasen bieten sich hinsichlich der Markierung an, da sie Nukleotide binden, die in einer einfachen Synthese mit einer Fluoreszenzgruppe wie N-Methylanthranioyl (mant) gekoppelt werden können. Da der Nukleotidaustausch bei den meisten GTPasen möglich ist, kann die GTPase zu markiert werden, ohne dass der Fluorophor direkt an das Protein gekoppelt werden muss. Obwohl in der Vergangenheit gezeigt werden konnte, dass eine Fluoreszenztitration für Cdc42 anwendbar ist und die Bestimmung der Affinitäten zu GBDs der Cdc42-Effektoren WASP und PAK erlaubt [Buchwald et al., 2001; Owen et al., 2000; Rudolph et al., 2001], konnte bei Rho keine Änderung bei Zugabe der RBD von ROCKI oder PRK1 beobachtet werden, ähnlich wie es auch schon für Ras, Rap und Ran beobachtet wurde. Um dennoch eine geeignete Messmethode für die biochemische Charakterisierung von Proteinen der Rho-Familie und ihren Bindungspartnern zu etablieren, wurden bereits während der Diplomarbeit [Blumenstein, 2001] direkte und indirekte spektroskopische Methoden, sowie Methoden, die auf der Erfassung anderer biophysikalischer Parameter beruhen (Bindungsenthalpie – ITC; Brechungsindex – SPR), für Messungen herangezogen. Tabelle 42 gibt einen Überblick über die in der Diplomarbeitet angewandten Methoden. Tabelle 4-2: Überblick der in der Diplomarbeit getesteten Methoden

Obwohl mit der indirekten Guaninnukleotid-dissoziations-inhibitions-(GDI)-Methode ein Weg gefunden wurde, die Dissoziationskonstante für die Rho-/Rho-Effektorinteraktion im Gleichgewicht zu bestimmen (siehe unten), wurde im Verlauf der Dissertation mehrfach der Versuch unternommen, eine direkte Methode zu finden, mit der eine schnellere KDBestimmung möglich wäre und um die Ergebnisse aus dem GDI mit einer zweiten Methode zu bestätigen.

64

ERGEBNISSE Tryptophan-Mutanten Da die intrinsische Trp-Fluoreszenz (direkt über die Anregung der mant-Gruppe oder mittels FRET) bei Fluoreszenztitrationen keine Änderung zeigte, wurde versucht, durch das gezielte Einfügen bzw. das Entfernen von Tryptophanen, RhoA so zu verändern, dass es sensitiv für die Bindung verschiedener Effektoren wird. Tryptophan-Insertion Im ersten Fall wurde versucht, Seitenketten im switch I durch Tryptophane auszutauschen (Y34W, P36W). Dadurch sollte überprüft werden, ob sich die Umgebung eines solchen Tryptophans bei Effektorbindung in dem Maße ändert, dass eine Änderung des basalen Signals detektiert werden kann. Da sich die mutierten Aminosäuren im switch I befinden (Abb. 4-5 A), welcher einer der Hauptorte der Effektorinteraktion ist (vergl. 1.1.1 bzw. 1.3), wurde auf diesem Weg versucht, Tryptophane, die sich im Wildtyp abseits der Effektorbindungsregionen befinden (W58 und W99), näher an den Ort der Effektorbindung zu bringen und damit die Chance auf eine Signaländerung zu erhöhen. Es wurden nur solche Aminosäuren mutiert, die nicht direkt an der Interaktion mit Effektoren beteiligt sind.

Abb.4-5: Darstellung der mutierten Aminosäuren von RhoAG14V·GTPγS [Ihara et al., 1998]. Um eine direkte Fluoreszenzmethode zur Quantifizierung dere Effektorinteraktion zu etablieren, wurden Mutanten von RhoA erstellt. A. Darstellung der mutierten Seitenketten für die Tryptophanfluoreszenz. B. Darstellung der Seitenketten, die nach Mutation zu Cystein mit IEDANS markiert wurden.

Tryptophan-Deletion Im zweiten Fall sollte eine Signaländerung durch Entfernen eines Tryptophans erreicht werden

(W58F).

Diese

Vorgehensweise

wurde

gewählt,

da

bei

Cdc42

eine 65

ERGEBNISSE Fluoreszenzänderung über Tryptophan-Messungen mit OPHN1 (ein GAP) beobachtet werden konnte (Alexander Eberth - persönliche Kommunikation). Cdc42 besitzt im Gegensatz zu anderen GTPasen (ausser TC10, TCL und Rif) jedoch nur ein Tryptophan an Position 97, das jedoch in allen GTPasen der Rho-Familie konserviert ist (Abb. 1-2). Um zu überprüfen, ob eine Änderung der Fluoreszenz auch bei Rho beobachtet werden kann, wenn nur ein Tryptophan vorhanden ist, wurde Trp-58 zu Phenylalanin mutiert (Abb. 45 A). Abb.4-6 zeigt die Ergebnisse der Testmessungen (W58 und Y34W; P36W nicht gezeigt), wobei weder für die Tryptophan-Insertionen noch für die Tryptophan-Deletion eine Änderung der Fluoreszenz direkt oder mittels Trp-FRET beobachtet werden konnte.

Abb.4-6: Testmessung der Tryptophanmutanten. 0.2 µM RhoA1-181W58F·mantGppNHp beziehungsweise RhoA1-181Y34W·mantGppNHp wurden in der Zelle vorgelegt und mit ROCK-RBD in der Konzentration von 1 µM (normaler Pfeil) bzw. 10 µM (gestrichelter Pfeil) titriert. [○] W58F, TrpFluoreszenz [●] W58F, Trp-FRET [□] Y34W, TrpFluoreszenz [■]Y34W, Trp-FRET. Emissionswellenlänge: 355 nm bzw. 450 nm, Excitationswellenlänge: 295 nm; Temperatur: 25°C.

Interaktionsmessung mit Varianten des Grün-fluoreszierenden Proteins CFP (cyan fluorescent protein) und YFP (yellow-fluorescent protein) sind Varianten des Grün-fluoreszierenden Proteins (GFP). Es konnte bereits in in vivo-Studien gezeigt werden, dass diese Proteine als Anker-Gruppen bei der Interaktion zweier Bindungspartner zu einem Energietransfer fähig sind [Tramier et al., 2002]. Deshalb sollte untersucht werden, ob dieser Energietransfer auch in vitro dazu verwendet werden kann, um die Affninität zwischen GTPase (RhoA) und Effektor (ROCK) mittels direkter Titration über die Änderung des FRET Signals zu bestimmen. Das größte Problem, dass sich bei der Messung ergab waren die zu nah beieinander liegenden Emissions und Excitationsbereiche beider Proteine, weshalb die Messungen zu keinem zufriedenstellendem Ergebnis führten.

66

ERGEBNISSE Markierung von RhoA Da eine Markierung von Rap und Ran mit dem Fluorophor 5-((((2-iodoacetyl) amino) ethyl)amino)naphthalin-1-sulfonsäure (IAEDANS) in den Arbeiten von Astrid Krämer [Kraemer et al., 2002] und Michael Seewald [Seewald et al., 2003] zum Erfolg geführt hatte wurde Rho im Rahmen der Diplomarbeit von Silke Ebbing an verschiedenen Positionen (Val33, Tyr-42, Arg-68, Phe-106) markiert. Die Positionen wurden anhand zweier Kriterien ermittelt: 1. gute Zugänglichkeit im GDP-gebundenen Zustand und 2. Nähe zur Interaktionsfläche ohne direkte Beteiligung an der Interaktion mit GEFs, Effektoren und GAPs. Abb. 4-5 B zeigt die Positionen, die nach Mutation der jeweiligen Aminosäure zu Cystein mit IAEDANS markiert wurden. Dennoch zeigte keine der isolierten und markierten Mutanten eine Änderung des Fluoreszenzsignals bei Zugabe des Effektors [Ebbing, 2003].

4.1.3.3 Quantitative Bindungsstudien der RhoA·ROCK Interaktion Da keine der in der Diplomarbeit und in der Dissertation getesteten direkten Fluoreszenzassays oder andere Messmethoden wie ITC oder SPR (siehe Tabelle 4-2) zum Erfolg führte, wurde als indirekte Methode zur Bestimmung der Affinität von RhoA Wildtyp und seinen Effektoren die von Herrmann und Mitarbeitern [Herrmann et al., 1995] entwickelte fluoreszenzspektroskopische Messmethode unter Ausnutzung des GuanidinDissoziations-Inhibitionseffekts eingesetzt (3.2.3.2). Die Verwendung fluoreszenzmarkierter Nukleotide, die ihre Fluoreszenzintensität um mehr als 50 % bei Dissoziation in Lösung ändern [John et al., 1990], erlaubt eine Bestimmung des KD bis zu einer Größe im nanomolaren Bereich, da die Dissoziation sehr genau verfolgt werden kann. Die Messungen erfolgten unter Vorlage von 0.1 µM bzw. 0.2 µM RhoA·mantGppNHp und 200fachem molaren Überschuss an freiem nicht markiertem GppNHp in magnesiumfreiem GDI-Puffer. Die Dissoziation des markierten Nukleotids, und damit der Abfall des Fluoreszenzsignals, wurde in Abhängigkeit von der Konzentration des zutitrierten Effektors über die Zeit verfolgt (meist 50000 - 100000 s). Nach der Messung wurden die relativen Fluoreszenzwerte auf 1 normiert, um die Messungen untereinander besser vergleichen zu können. Die beobachteten Nukleotiddissoziationsraten (kobs) wurden durch eine einfachexponentielle

numerische

Datenanalyse

des

zeitaufgelösten

Fluoreszenzabfalls

der

Dissoziation bei bestimmter Effektor-Konzentration erhalten.

67

ERGEBNISSE Bovines ROCK40 In der Diplomarbeit konnte mit dieser Methode die Dissoziationskonstante von bovinem ROCK40

(ROCK780-1108,

Dissoziationskurven

von

ROCK40bov)

bestimmt

RhoA1-181·mantGppNHp

werden. (samt

Abb.4-7

A

zeigt

die

Kurvenregressionen)

in

Abhängigkeit der ROCK40bov-Konzentration (exemplarisch für einige Konzentrationen dargestellt). Die Dissoziationsgeschwindigkeit wird mit steigender Konzentration des Effektors langsamer und die Kurve damit flacher. Die Geschwindigkeitskonstanten kobs aus den einfach-exponentiellen numerischen Analysen der einzelnen Kurven wurden gegen die Konzentration von ROCK40bov aufgetragen (Abb.4-7 B). Die Daten wurden nach Gleichung 3-3 ausgewertet und so die Dissoziationskonstante bestimmt, die für die Interaktion der großen Rho-bindenden Domäne von bovinem ROCKI und RhoA in seiner aktiven, GppNHpgebundenen Form im zweistelligen nanomolaren Bereich lag (KD = ∼0.019 µM).

Abb.4-7: GDI-Assay von ROCK40bov·RhoA1-181·mantGppNHp. A. Messung der NukleotiddissoziationsInhibition von RhoA1-181·mantGppNHp in Abhängigkeit von der Konzentration an ROCK40bov bei 200fachem molaren Überschuss an GppNHp. Dargestellt sind einige Dissoziationskurven samt Kurvenregression bei verschiedenen Konzentrationen von ROCK40bov. [○] intrinsisch; [●] 0.05 µM; [□] 0.1 µM; [■] 0.25 µM; [∆] 0.5 µM; [▲] 0.75 µM. B. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGppNHp in Anwesenheit von ROCK40bov. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 0.019 µM ermittelt werden.

ROCK-RBD Da sich ROCK40bov nur in sehr geringen Mengen reinigen lies (etwa 2 mg aus etwa 10 l Kultur), die Bindung von ROCK an RhoA aber auch strukturell durch Kristallisation des Komplexes untersucht werden sollte (4.1.3.4) wurde ein kleineres Fragment von humanem ROCKI kloniert (ROCK-RBD), das nur aus der Rho-bindenden Domäne bestand (ROCK9471015

) und sich in wesenlich größeren Mengen reinigen ließ (etwa 15 mg aus 10 l Kultur).

68

ERGEBNISSE Analog zu ROCK40bov wurde die Affinität zu RhoA·mantGppNHp mittels GDI-Assay bestimmt (Abb 4-8 A & B), wobei ein KD von 0.13 µM ermittelt wurde.

Abb.4-8: GDI-Assay von ROCK-RBD·RhoA1-181·mantGppNHp. A. Messung der NukleotiddissoziationsInhibition von RhoA1-181·mantGppNHp in Abhängigkeit von der Konzentration an ROCK-RBD bei 200fachem molaren Überschuss an GppNHp. Dargestellt sind einige Dissoziationskurven samt Kurvenregression bei verschiedenen Konzentrationen von ROCK-RBD. [○] intrinsisch; [●] 0.5 µM; [□] 1.25 µM; [■] 2.5 µM; [∆] 5 µM. B. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGppNHp in Anwesenheit von ROCK-RBD. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 0.13 µM ermittelt werden.

Zusätzlich wurde die Affinität von ROCK-RBD zu RhoA in GDP-gebundener Form bestimmt, um die GTP-Abhängigkeit, die per Definition einen Effektor charakterisiert, zu überprüfen (Abb. 4-9 A & B). Für die Interaktion mit der inaktiven Form der GTPase konnte ein KD von 1.2 µM bestimmt werden.

69

ERGEBNISSE

Abb.4-9: GDI-Assay von ROCK-RBD·RhoA1-181·mantGDP. A. Messung der NukleotiddissoziationsInhibition von RhoA1-181·mantGDP in Abhängigkeit von der Konzentration an ROCK-RBD bei 200fachem molaren Überschuss an GDP. Dargestellt sind die Dissoziationskurven samt Kurvenregression bei verschiedenen Konzentrationen von ROCK-RBD. [○] intrinsisch; [●] 1.25 µM; [□] 2.5 µM; [■] 3.75 µM; [∆] 5 µM. B. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGDP in Anwesenheit von ROCK-RBD. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 1.2 µM ermittelt werden.

Multiple Bindungsstellen in ROCK Da sich zwischen den Messungen von ROCK40bov und humaner ROCK-RBD eine Diskrepanz in der Affinität von etwa einem Faktor 10 zeigte, wurde untersucht, ob möglicherweise andere Regionen außerhalb der humanen ROCK-RBD zur Bindung an die GTPase beitragen. Da auch schon frühere Studien [Leung et al., 1996] angedeut haben, dass ein am N-Terminus verlängertes RBD-Fragment eine höhere Affinität zur GTPase haben könnte, wurden verschiedene Fragmente von humanem ROCKI isoliert und ihre Affinität zu RhoA·mantGppNHp im GDI-Assay bestimmt. Die klonierten Fragmente sind in Abb. 4-2 als Übersicht dargestellt. Nur ROCK-RID-RBD konnte nicht erhalten werden, da es zwar als Fusionsprotein zwar isoliert, aber nicht gespalten werden konnte. Die anderen Proteine ließen sich in Mengen zwischen 2 und 15 mg aus 10-20 l Kultur reinigen. ROCK-RID ROCK-RID zeigte im Pulldown-Experiment (4.1.3.1) eine GTP-abhängige Bindung an RhoA. Da dieses Fragment die RBD jedoch nicht enthielt, lag die Vermutung nahe, dass es sich um eine zweite unabhängige Rho-bindende Domäne handeln könnte. Um zu analysieren, wie ihre Bindung sich von der RBD unterscheidet, wurde das Fragment isoliert (~10 mg aus 10 L Kultur)

70

und

mittels

GDI-Assay

die

Affinität

bestimmt.

Für

die

Bindung

an

ERGEBNISSE RhoA·mantGppNHp konnte eine Dissoziationskonstante von 0.26 µM bestimmt werden (Abb.4-11 A).

Abb.4-10: GDI-Assay von ROCK-RID·RhoA1-181·mantGppNHp/mantGDP. A. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGppNHp in Anwesenheit von ROCK-RID. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 0.26 µM ermittelt werden. B. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGDP in Anwesenheit von ROCK-RID. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 1.1 µM ermittelt werden.

Da ROCK-RID nahezu (~Faktor zwei Unterschied) die gleiche Affinität für RhoA·mantGppNHp zeigte wie die Rho-bindende Domäne selbst wurde auch hier die Spezifität für die GTP-gebundene Form der GTPase durch Bestimmung des KD in der mantGDP-gebundenen Form überprüft, wobei ein Affinität von 1.1 µM ermittelt wurde. ROCK-REPEAT Wie in Abb.4-2 zu erkennen ist enthält ROCK-REPEAT (von „repeating domains“ auch REP abgekürzt) beide interagierenden Domänen. Um zu ermitteln, ob die Affinität dieses Fragments eher der von bovinem ROCK entspricht oder der von ROCK-RBD bzw. -RID allein gleicht, wurde die Affinität mittels GDI-Assay ermittelt (Abb. 4-11)

71

ERGEBNISSE

Abb.4-11: GDI-Assay von ROCKREPEAT·RhoA1-181·mantGppNHp. Auftragung der Geschwindig-keitskonstanten für die NukleotidDissoziation von RhoA1-181·mantGppNHp in Anwesenheit von ROCK-REP. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 0.93 µM ermittelt werden.

Für ROCK-REP konnte eine Dissoziationskonstante von 0.93 µM ermittelt werden. Somit liegt die Affinität noch unter der von RBD bzw. RID allein. Humanes ROCK40 Vergleicht man bovines und humanes ROCK40 stellt man fest, dass sie zu etwa 95 % homolog zueinander sind (im Vergleich weisen humanes ROCKI und ROCK II für den ROCK 40 Bereich nur eine 55 %ige Homologie auf). Daher stellte sich die Frage, ob die hohe Affinität, die bei ROCK40bov beobachtet wurde, auf die Länge des Fragmentes oder auf die wenn auch geringen - Unterschiede zwischen den Organismen zurückzuführen ist. Aus diesem Grund wurde hROCK40 aus dem dem humanen ROCKI-Gen kloniert und das Protein gereinigt (~5 mg aus 10 l Kultur). Interessanterweise zeigte hROCK40 mit einem KD von 3 µM das schlechteste Bindungsverhalten von allen getesteten Proteinen (Abb. 4-12).

Abb.4-12: GDI-Assay von humanem ROCK40 ·RhoA1-181·mantGppNHp. A. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die NukleotidDissoziation von RhoA1-181·mantGppNHp in Anwesenheit von hROCK40. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 3 µM ermittelt werden.

72

ERGEBNISSE 4.1.3.4 Kristallstruktur von RhoA·ROCK-RBD Röntgenkristallographische Untersuchungen ermöglichen es, die dreidimensionale Struktur von Proteinen und Nukleinsäuren mit atomarer Auflösung zu bestimmen. Ist die Kristallstruktur bekannt, können Wechselwirkungen auf atomarer Ebene interpretiert werden. Die Struktur des trimeren Proteinkomplexes von RhoA·GTP und ROCK-RBD sollte einen Beitrag zum Verständnis der Interaktion zwischen GTPase und Effektor liefern. Daher wurde versucht, den Komplex mit dem GTP-Analogon GppNHp zu kristallisieren. Die gereinigten rekombinanten Proteine wurden nach dem Nukleotidaustausch von RhoA1-181 im Verhältnis 1:1 gemischt und der Komplex über Gelfiltration (Superdex 75; 30 mM Tris/HCl pH 7.5, 4 mM MgCl2 und 2 mM DTE) isoliert, konzentriert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C in der Konzentration 10 mg/ml gelagert. Aliquots dieser Stammlösung wurden jeweils vor dem Ansetzen der Kristallisationsschalen aufgetaut. Zur Kristallisation wurde die Methode des hängenden Tropfens (hanging drop) angewandt, die nach dem Prinzip der Dampfdiffusion in langsamen Schritten die Konzentration des Fällungsreagenz in der Proteinlösung erhöht. Die Ansätze wurden in Zellkulturplatten der Fa. Linbro (Linbro, Flow Laboratories Inc., VA, USA) pipettiert. Das Volumen der Reservoirlösung betrug jeweils 1 ml; der hängende Tropfen setzte sich aus gleichen Teilen Protein- und Reservoirlösung zusammen. Mit Hilfe kommerziell erhältlicher Screening-Kits (Hampton Research, Laguna Hills, CA, USA) wurde bei 20 °C nach ersten Bedingungen für die Kristallisation gesucht. Bei dieser Strategie handelt es sich um ein sogenanntes „Sparse Matrix Sampling“, bei dem verschiedene Fällungsmittel, pH-Werte und Salze in 100 Lösungen kombiniert und auf Proteinkristallbildung getestet werden. Die Basis dieser Kombinationen ist eine statistische Auswertung typischer Kristallisationsbedingungen für Proteine [Cudney et al., 1994; Jancarik und Kim, 1991]. Die Ansätze wurden hauptsächlich von Dr. Radovan Dvorsky, einem Mitarbeiter unserer Arbeitsgruppe, durchgeführt, der auch im Anschluss die Optimierung und die Datenaufnahme durchführte und schliesslich die Struktur löste. Die Kristallisation erfolgte in 100 mM Tris/HCl pH 7.5, 12 % PEG3350 und 2 % Isopropanol. Kristalle erschienen bereits nach zwei Tagen und wuchsen als Platten (an Spheruliten anhaftend) innerhalb von 10 Tagen zu einer Dimension von 0.1 x 0.5 x 0.05 mm3 heran. Für die Datensammlung bei 100 K wurde die Lösung auf 100 mM Tris/HCl pH 7.5, 12 % PEG3350, 15 % Glycerol und 3 % Isopropanol eingestellt. Die kryogeschützten Kristalle wurden in einer Nylonschleife aufgenommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. 73

ERGEBNISSE Native Datensätze wurden an der Strahlenquelle ID14-1 an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, Frankreich) gemessen. Zur Detektion wurde ein ADSC Q4 CCD-Detektor der Firma Mar Research (Hamburg) eingesetzt. Die Datensammlung, Integration und Datenreduktion wurde mit DENZO/SCALEPACK [Otwinowski und Minor, 1997] durchgeführt. Die Phasenbestimmung wurden mittels Molekularem Ersatz basierend auf einer bekannten Struktur von RhoA mit dem Programm AMORE [Navaza, 1994] bestimmt. Dabei wurden die Phasen des erhaltenen Datensatzes durch diejenigen der Substruktur angenähert. Als Suchmodell wurde die RhoA·PKNα-Struktur von Maesaki [Maesaki et al., 1999a] benutzt. Die Elektronendichtekarte wurde mit O [Jones und Kjeldgaard, 1997] interpretiert und das Modell vervollständigt. Das Modell wurde abwechselnd mit CNS [Brunger et al., 1998] verfeinert und der Modellbau fortgesetzt. Nicht-kristallographische Einschränkungen wurden bei beiden RhoA Molekülen und den Cterminalen Bereichen von ROCKI-RBD innerhalb der asymmetrischen Einheitszelle gemacht. Das finale Modell mit einer Auflösung von 2.6 Å enthielt 69 bzw. 70 Aminosäuren der beiden Rho-bindenden Domänen (AS 947-1013 bzw. 947-1014) inklusive zweier zusätzlicher Aminosäuren (Glycin und Serin aufgrund der Thrombinspaltung des GST-Fusionsproteins), sowie 179 Aminosäuren

von RhoA (AS 3-181), zwei GppNHp Moleküle, zwei

Magnesiumionen und 55 Wassermoleküle. Als Maß für die Qualität eines Modells kann der kristallographische R-Faktor (Rcryst) herangezogen werden. Je kleiner der R-Faktor ist, desto besser erklären die berechneten Strukturfaktoren die beobachteten. Das finale Modell besaß einen kristallographischen RFaktor von 21.9 % und einen freien R-Faktor von 25.7 % (Angaben von Dr. Radovan Dvorsky).

74

ERGEBNISSE Allgemeine Topologie Die Struktur des trimeren Komplexes zeigt für die asymmetrische Einheitszelle des Kristalls ein ROCKI-RBD-Dimer und zwei RhoA-Moleküle (Abb 4-13 A & B).

Abb.4-13: Kristallstruktur von RhoA1-181·GppNHp·ROCK-RBD. A. Packung im Kristall. B. Struktur in der Einheitszelle (4 Moleküle). Die beiden ROCK-RBD-Helizes sind in cyan und blau, die beiden Rho-Moleküle in gold und beige dargestellt. Zur Verdeutlichung der Interaktionsfläche wurden die Schalterregionen (switch I & II) rot hervorgehoben. C. Ausschnitt aus dem C-terminalen Interface (Ansicht von oben). Darstellung wie in B. Der Punkt zeigt die Lage der Symmetrieachse an.

Eine zweifache nicht-kristallographische Symmetrieachse läuft durch das Zentrum des coiledcoil-Dimers an der Interaktionsfläche mit RhoA (Abb.4-13 C). Es existieren somit zwischen dem Dimer und den beiden RhoA-Molekülen zwei identische symmetrie-verwandte Interaktionsflächen. 75

ERGEBNISSE Die Struktur von RhoA·GppNHp ist konserviert und sehr ähnlich zu den bekannten Strukturen von RhoA·GTPγS [Ihara et al., 1998] und RhoA·GTPγS im Komplex mit der ersten Rho-bindenden Domäne von PRK1/PKNα [Maesaki et al., 1999a]. Als Maß für die Übereinstimmung kann der Wert der Abweichung vom mittleren Abstandsquadrat (root mean square deviation, r.m.s.d.) herangezogen werden, bei dem die Abweichung der korrespondierenden Atome nach Superposition der Strukturen pro Atom kalkuliert und dann gemittelt wird. Je geringer der r.m.s.d.-Wert, desto besser die Übereinstimmung mit der Vorlage. Zu der GTPγS-gebundenen Rho-Struktur betrug die r.m.s.d. 0.42 Å für 181 CαAtome, zum Komplex mit dem Effektor sogar nur 0.33 Å. Auch die Bindung des Nukleotids wie auch die Koordination des Magnesiums sind innerhalb der Struktur konserviert. Das ROCKI-Dimer zeigt zwei 95 Å lange α-Helizes, die miteinander eine sogenannte coiledcoil-Struktur bilden (Abb.4-14). Bemerkenswert ist vor allem die 3200 Å2 große Kontaktfläche der beiden Helizes. Bei dem ACC-Finger von PRK1, der in der MaesakiStruktur gezeigt wurde und bei dem es sich um ein intramolekulares coiled-coil handelt, betrug die Kontaktfläche 1572 Å (56.2 Å bei PKNα-RBD/PRK1-HR1a pro interagierendem Rest bzw. 51.5 Å bei ROCK).

Abb.4-14: Die Orientierung des RBD-coiled coil-Dimers. Die Kolorierung ist die gleiche wie in Abb.4-13. Die roten Pfeile markieren die Lage der Stotterbereiche.

Coiled-Coil-Strukturen zeichnen sich in der Regel dadurch aus, dass sie über sich wiederholende Sequenzmotive in den Helizes verfügen, die ausschlaggebend für die Bildung und Integrität der coiled-coils sind. Eine periodische Wiederholung von sieben Aminosäureresten über zwei helikale Windungen, genannt Heptad-Repeat, ist ein charakteristisches Merkmal eines kanonischen linkshändigen coiled-coils [Gruber und Lupas, 2003]. Die sieben Reste werden normalerweise mit abcdefg bezeichnet. Die Interaktion zwischen den Helizes eines kanonischen coiled-coils wird durch hydrophobe Reste an den Positionen a und d und gegensätzlich geladenen Aminosäureresten an den Positionen e und g vermittelt [Burkhard et al., 2001; Gruber und Lupas, 2003]. In der vorliegenden Struktur konnten sieben dieser Heptad-Repeats zwischen den Resten Ile-952 und Arg-1012 gefunden 76

ERGEBNISSE werden. Jedoch ist das sich wiederholende Muster nicht durchgängig, sondern wird durch drei sogenannte stutters (Stotterbereiche) unterbrochen (Abb.4-14 rote Pfeile). Stutters sind Insertionen von vier Aminosäureresten in ein Heptad-Repeat-Muster, was dazu führt, dass ein kanonisches linkhändiges coiled-coil eine rechtshändige Drehung bekommt [Gruber und Lupas, 2003]. Die Struktur des RBD-Dimers ist daher am C- und N-Terminus linkshändig, im mittleren Teil jedoch rechtshändig (Abb 4-14). Interaktion zwischen RhoA und ROCK-RBD Das Interface zwischen dem helikalen ROCKI-Dimer und einem der beiden RhoA-Moleküle besitzt eine Kontaktfläche von 1328 Å2 und ist damit vergleichbar mit den Interaktionsflächen, die für die Interaktion von Ras mit PI3Kγ [Pacold et al., 2000] und Rac1 mit p67phox [Lapouge et al., 2000] beschrieben wurden. Obwohl ROCKI-RBD ein 95 Å langes paralleles coiled-coil Dimer (PCC-Dimer) zeigt, interagiert jedoch nur ein C-terminales, linkshändiges coiled-coilStück (AS 998-1010), bestehend aus dreizehn Aminosäuren, mit RhoA. Dieses minimale Rho-bindende Motiv ist stark konserviert in allen ROCK-Proteinen aus verschiedenen Organismen (zu 100 % konserviert in allen Säugertieren, zu 77 % zu Insekten). Beide switch-Regionen von Rho sind an der Interaktion mit ROCK beteiligt. Eine der beiden Helizes (cyan) kontaktiert switch I, während die zweite Helix (blau) switch II gegenübersteht. Bei der Bestimmung der interagierenden Aminosäuren wurden die Abstände zwischen dem Proteinrückrat sowie einzelnen Atomen von ROCK und RhoA berechnet und eine Distanzgrenze von 4 Å für eine Interaktion festgelegt. Das Interface zwischen RhoA und dem RBD-Dimer besteht aus einer Kombination hydrophober und elektrostatischer Wechselwirkungen. Die Interaktion zwischen dem coiled-coil Dimer und RhoA findet hauptsächlich mittels hydrophober Seitenketten statt, die eine hydrophobe Kontaktfläche bilden (Abb.4-15 C links und rechts, grün koloriert). Die Kontaktfläche besteht auf Seiten von RhoA aus den Aminosäuren Pro-36, Val-38, Phe-39 aus switch I, Gln-63 und Tyr-66 aus switch II und zwei Leucinen (Leu-69 und Leu-72) aus der α2-Region. Dem gegenüber stehen auf Seiten der ROCK-RBDs Leu-998, Gln-1001 und Ala-1002 (H1), sowie Val-1003, Leu-1006, Ala-1007 und Met-1010 (H2) (Abb.4-15 A & B). Stabilisiert wird das Interface durch fünf zusätzliche elektrostatische Wechselwirkungen an den Rändern der hydrophoben Kontaktfläche (RhoAROCK; F39-K1005; E40-K1005; D65-K999; Y66-L998; R68-N1004), wie man vor allem in der Stereoansicht (Abb.4-15 A) und der Oberflächendarstellung (Abb.4-15 C) erkennen kann. Tyr-66 (polarer Ring) von RhoA und Lys-1005 (polare Carbonylseitenkette) von ROCK sind mit ihren polaren Gruppen an der hydrophoben Interaktion beteiligt (Y66-A1002; Y6677

ERGEBNISSE V1003; V38-K1005), während ihre hydrophilen Komponenten, die OH-Gruppe des Tyrosinrings und die positiv-geladene Amino-Gruppe am Lysin mit Carbonylgruppen des Proteinrückgrats von Leu-998 bzw. Phe-39 interagieren (Y66-L998; F39-K1005). Obwohl Interaktionen der Helizes sehr exklusiv mit jeweils einem switch erfolgen, gibt es vier Aminosäuren in RhoA (V38, F39, D65 und Y66), die mit beiden RBD-Helizes einen Kontakt eingehen (Abb. 4-15 A & B) und damit die Dimersierung der Effektor-RBDs stabilisieren.

Abb.4-15: Das RhoA·ROCK-RBD-Interface. A. Stereoansicht des Interface. Die interagierenden Aminosäuren sind als ball-and-stick-Modell gezeigt. B Schematische Darstellung des Interface. Schwarz gestrichelte Linien stellen hydrophobe Interaktionen, rot gestrichelte elektrostatische Wechselwirkungen dar. C. Oberflächendarstellung. Das Interface ist auf der Oberfläche von RhoA dargestellt und die Seiten, die mit der jeweiligen Helix interagieren, koloriert. Grün - hydrophobe Gruppen; blau - positiv geladenen Seitenketten, rot negativ geladenen Seitenketten; violett - OH-Gruppe von Tyr-66. Die Kolorierung der Helizes ist die gleiche wie bei Abb.4-13.

Vor allem zwei Aminosäuren in ROCK sind an der Bildung der hydrophoben Kontaktfläche beteiligt. Leu-998 und Lys-1005 rekruitieren Pro-36, Gln-63, Asp-65 und Tyr-66 bzw. Val-38 und Phe-39 und bilden damit ein hydrophobes Bündel (cluster). Lys-1005 wird dabei noch zusätzlich durch eine intramolekulare Salzbrücke mit Glu-1008 stabilisiert (A) und geht zwei weitere elektrostatische Wechselwirkungen mit der Carboxlgruppe von Glu-40 und dem Carbonylsauerstoff von Phe-39 ein.

78

ERGEBNISSE Kristallisation von RhoA·ROCK-RID Gegen Ende der Dissertation wurde aufgrund der Ergebnisse aus den kinetischen Studien mit dem ROCK-RID-Fragment versucht, RID im Komplex mit RhoA·GppNHp zu kristallisieren und die Struktur zu lösen. Der Komplex wurde auch hier 1:1 gemischt und über Gelfiltration (Superdex 75; 20 mM Tris/HCl pH 7.5, 2 mM MgCl2 und 2 mM DTE) gereinigt, konzentriert, in flüssigem Stickstoff schockgeforen und dann bei -80 °C in der Konzentration 14.2 mg/ml gelagert.

Aliquots

dieser

Stammlösung

wurden

jeweils

vor

dem

Ansetzen

der

Kristallisationsschalen aufgetaut. Die Kristallisationsansätze und ersten Röntgenmessungen wurden ebenfalls von Dr. Radovan Dvorsky durchgeführt. Zwar gelang es, den Komplex in 100 mM Tris pH 8.3-8.7, 0.1 mM CaCl2 und 18 % PEG4000 zu kristallisieren, die Kristalle streuten jedoch in der hauseigenen Strahlungsquelle (MPI Dortmund) und am DESY (Hamburg) bisher nur bis zu einer Auflösung von 6.0 Å.

4.1.3.5 Die Stöchiometrie des Komplexes Obwohl die Kristallstruktur einen 1:2 bzw. 2:2-Komplex für RhoA·GppNHp·ROCK-RBD zeigt, sollte die Stöchiometrie des Proteinkomplexes auch mit proteinbiochemischen Methoden bestimmt werden. Analytische Gelfiltration Die Experimente wurden wie unter 3.2.2.6 beschrieben durchgeführt. Zuerst wurden als Kontrollen die Einzelproteine in separaten Läufen über eine Superdex 75 10/30 Chromatographiesäule

aufgetrennt,

dann

der

Komplex.

Abb.4-16

A

zeigt

die

Chromatogramme der drei Läufe. In Abb.4-16 B wurde das Elutionsvolumen anhand der Kalibrierung der Säule in das Molekulargewicht umgerechnet und die Kurven gegen das Molekulargewicht aufgetragen. ROCK-RBD (●) zeigte im Vergleich mit dem Lauf von RhoA·GppNHp allein (○) einen Peak bereits vor RhoA obwohl es mit etwa einem Molekulargewicht von etwa 8.3 kD kleiner ist als RhoA (~20.5 kD). Betrachtet man sich die anhand der Kalibrierung berechneten Molekulargewichte aus den Elutionsmaxima, ergab sich für RhoA ein Molekulargewicht von 23.2 kD und für ROCK-RBD eines von 28.7 kD, welches in Anbetracht der Abweichung bei dem RhoA-Monomer etwa einem Trimer entspräche.

79

ERGEBNISSE

Abb.4-16: Analytische Gelfiltration zur Bestimmung der Stöchiometrie des Komplexes. A. Die bei 280 nm gemessenen Absorptionswerte sind gegen das Elutionsvolumen aufgetragen. B. Die bei 280nm sind gemessenen Absorptionswerte sind gegen das umgerechnete Molekulargewicht in kD aufgetragen. [○] RhoA·GppNHp; [●] ROCK-RBD; [□] RhoA·GppNHp + ROCK-RBD.

Obwohl man eine Elution des Rho·GppNHp·ROCK-RBD-Komplexes vor ROCK-RBD bzw. RhoA erwartet, zeigte der Komplex ein Laufverhalten zwischen den beiden Einzelproteinen. Über die Kalibrierung wurde ein Molekulargewicht von 24.8 kD berechnet, was einem 1:1 Komplex entsprechen würde. Da sich ROCK aufgrund seiner länglichen coiled-coil Struktur nicht wie ein globuläres Protein verhält und somit ein verändertes Laufmuster auf der Gelfiltrationssäule zeigt, kann die Kalibrierung nicht zur Berechnung des Molekulargewichts verwendet werden. Da ROCK scheinbar auch im Komplex veränderte Laufeigenschaften besitzt, lässt sich über die Stöchiometrie nur aussagen, dass vermutlich ein RhoA an der Bindung beteiligt ist. Ob jedoch ein Komplex mit einer oder zwei ROCK-RBDs gebildet wird, konnte die mittels analytischer Gelfiltration nicht ermittelt werden. Statistische Lichtstreuung Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Gelfiltration wurde eine andere Methode zur Bestimmung der Stöchiometrie herangezogen, die im Zuge einer Gerätevorführung in Kooperation mit der Firma Wyatt mittels statistischer Lichtstreuung (3.2.3.1) durchgeführt wurde. Der Vorteil der Streulichtmessung gegenüber der Gelfiltration liegt darin, dass das Streulicht der Probe gemessen wird, dessen Intensität beim Streuwinkel 0° direkt proportional zur Molmasse ist. Das heißt, Molekulargewichte müssen nicht aus dem Elutionsvolumen mittels einer Kalibrierung bestimmt werden, sondern können direkt aus dem Streulicht ermittelt werden.

80

ERGEBNISSE Um sicher zu gehen, dass die Proben nicht verunreinigt waren, wurde jede Proteinprobe über eine Gelfiltration (im Standard-Bindungs-Puffer) aufgetrennt, wobei das Chromatogramm über einen Optilab Differentialrefraktometer aufgenommen sowie das Streulicht mittels eines miniDawn Tristar Vielwinkel Streulichtphotometers bestimmt wurde. Abb.4-17 A zeigt das Elutions-Chromatogramm des Laufs für ROCK-RBD (○) sowie die Auftragung der mittels der Lichstreuung berechneten Molmassen gegen die Elutionszeit der Probe (●)

Abb.4-17: Streulichtmessungen für ROCK-RBD. A. Aufgetragen sind die aus der Lichtstreuung ermittelten Molmassen [●] sowie das Brechungsindexdetektorsignal [○] gegen die Elutionszeit. B. Aus den Lichtstreuungsmessungen ermittelte kumulative Verteilung für ROCK-RBD.

Für den Hauptpeak ergab sich ein Molekulargewicht von 8.4 kD, wobei die Molmasse bei früheren Elutionszeiten auf ca. 50 kDa anstieg. ROCK-RBD scheint unter diesen Bedingungen als Monomer vorzuliegen. Abb. 4-17 B zeigt die kumulative Verteilung des in A gezeigten Peaks. Etwa 98 % der Probe lagen als Monomer vor. Für RhoA·GppNHp zeigt sich ein ähnliches Bild, das in Einklang mit der Gilfiltration steht (Abb.4-18). Es ergibt sich eine Molmasse von 19.7 kD, die mit dem theoretischen Molekulargewicht von 20.5 kD gut übereinstimmt. Die in Abb.4-18 B dargestellte kumulative Verteilung verdeutlicht, dass die Probe im Rahmen der Nachweisgrenze vollständig in monomerer Form vorliegt.

81

ERGEBNISSE

Abb.4-18: Streulichtmessungen für RhoA·GppNHp. A. Aufgetragen sind die aus der Lichtstreuung ermittelten Molmassen [●] sowie das Brechungsindexdetektorsignal [○] gegen die Elutionszeit. B. Aus den Lichtstreuungsmessungen ermittelte kumulative Verteilung für RhoA·GppNHp.

Abb. 4-19 A zeigt das Chromatogramm für das Gemisch aus ROCK-RBD und RhoA·GppNHp.

Abb.4-19: Streulichtmessungen für ROCK-RBD + RhoA·GppNHp. A. Aufgetragen sind die aus der Lichtstreuung ermittelten Molmassen [●] sowie das Brechungsindexdetektorsignal [○] gegen die Elutionszeit. B. Aus den Lichtstreuungsmessungen ermittelte kumulative Verteilung für ROCK-RBD + RhoA·GppNHp.

Während des Laufs wurden drei Peaks mit unterschiedlichen Molmassenverteilungen erfaßt. Der erste, kaum detektierbare Peak wies ein Molekulargewicht von 110 kD, der zweite eines von 23.5 kD auf. Der Hauptpeak zeigte ein Molekulargewicht von 29 kD, was einem 1:1 Komplex zwischen RhoA und ROCK-RBD entsprechen würde (~28.8 kD).

82

ERGEBNISSE Um was es sich bei den anderen beiden Peaks handelt, ließ sich nicht ermitteln, da aufgrund des Versuchsaufbaus während des Laufs nicht fraktioniert und die Peaks mit mittels SDSPAGE nicht untersucht werden konnten. Der Hauptteil des detektierten Proteins lag jedoch als Komplex vor, wie auch die kumulative Verteilung in Abb.4-19 B verdeutlicht.

4.1.4 Untersuchung der RhoGTP-spezifischen Interaktion von HR1ähnlichen Domänen von Rho-Effektor-Proteinen. Rho-Effektoren weisen zueinander eine sehr geringe Homologie bezüglich ihrer Aminosäuresequenz auf. Eine Ausnahme bilden hierbei nur die REM-Proteine (Rho effector homology) Rhotekin, Rhophilin und PRK1/PKNα, die alle über eine konservierte HR1ähnliche RBD verfügen. Es konnte gezeigt werden, dass die HR1-Domänen von Rhophilin und Rhotekin RhoA GTP-spezifisch binden können [Reid et al., 1996; Watanabe et al., 1996]. PRK1 besitzt drei HR1-ähnliche Domänen (HR1a-c), die sich am N-Terminus des Proteins befinden. Von zweien, HR1a und HR1b, konnte in früheren Studien gezeigt werden, dass sie RhoA binden, allerdings nur die erste (HR1a) GTP-spezifisch [Flynn et al., 1998]. Jedoch verfügen auch andere Proteine über HR1-ähnliche Domänen. Für PKC-verwandte Kinasen der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe Pck2p wurde gezeigt, dass eine der HR1Domänen für die Interaktion mit dem RhoA-Hefehomolog Rho1p·GTP verantwortlich ist [Arellano et al., 1999]. Für eine Kinase der Bäckerhefe Saccharomyces cerivisiae Pkc1p scheint sie jedoch keine Rolle zu spielen; zumindest konnte mit der HR1a-Domäne der Kinase in vitro keine Interaktion mit Rho gezeigt werden [Tränkle, 2003]. Verwendet man gängige Suchmaschinen für Domänenarchitektur (SMART, Interpro Scan), stellt man fest, dass auch ROCK und Citron HR1-ähnliche Domänen besitzen, wobei die Homologie untereinander zum Teil nicht besonders hoch ist (unter 30 %). Abb.4-20 zeigt ein Aligment von HR1-Domänen verschiedener Proteine.

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ERGEBNISSE

Abb.4-20: Sequenzvergleich HR1-ähnlicher Domänen verschiedener Proteine. Der Sequenzvergleich wurde mittels GCG und den Sequenzen verschiedener HR1-enthaltender Proteine bzw. Effektoren der Rho-Familie (RhoA/Rho1) aus Mensch bzw. Hefe erstellt und im Programm GeneDoc bearbeit. Invariante Aminosäuren (bzw. Aminosäuren mit verwandten Eigenschaften z.B. E/D, K/R oder mit hydrophobe Seitenketten) sind schwarz hinterlegt, Aminosäuren, die zu 80 % in allen Sequenzen vorkommen in dunkelgrau, und die Aminosäuren, die nur zu 30 % in den Sequenzen konserviert sind, in hellgrau.

Dabei ist anzumerken, dass die in Abb.4-21 gezeigten Proteine zum Teil unterschiedliche Spezifitäten für GTPasen haben. Für PRK1-HR1a & HR1b konnte konnte gezeigt werden, dass sie in vitro sowohl mit RhoA als auch Rac1 interagieren können [Owen et al., 2003; Watanabe et al., 1996], während Rhotekin, Rhophilin und ROCK nur mit RhoA bzw. seinen Isoformen [Reid et al., 1996; Watanabe et al., 1996] interagieren. p76RBE ist ein erst vor kurzem entdeckter Rhophilin-ähnlicher Effektor, der nur spezifisch an RhoB bindet [Mircescu et al., 2002].

4.1.4.1 Quantitative Bindungsstudien der RhoA·Effektor-HR1 Interaktion Um die Rolle der HR1-Domänen für die Effektorinteraktion zu klären, sollten die HR1Domänen verschiedener Effektoren im GDI-Assay auf ihr Bindungsvermögen an RhoA und ihre GTP-Spezifität untersucht werden. Abb. 4-3 zeigt eine Übersicht der klonierten und isolierten Konstrukte. Das vorliegende RBDFragment von Rhophilin liess sich aufgrund der Instabilität des Proteins nicht aufreinigen und wurde in dieser Studie nicht untersucht. Die Affinität von HR1ab an RhoA konnte nicht bestimmt werden, da das Protein in E.coli nicht überexprimiert wurde. Auch HR1c konnte in vollständiger Reinheit erhalten werden und wurde aus diesem Grund nicht charakterisiert, zumal Flynn et al. im Liganden-Overlay-Assay zeigen konnten, dass HR1c nicht an RhoA binden kann [Flynn et al., 1998]. Die GDI-Assays wurden analog zu 4.1.3.3 durchgeführt. Rhotekin Auch wenn nicht viel über die Funktion dieses Adaptorproteins bekannt ist, wurd die Rhobindende Domäne (als GST-Fusionsprotein) standardmäßig für Pulldown-Experimente von aktivem Rho aus Zelllysaten verwendet [Ren und Schwartz, 2000].

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ERGEBNISSE

Abb.4-21: GDI-Assay von Rhotekin-RBD·RhoA1-181·mantGppNHp. A. Messung der NukleotiddissoziationsInhibition von RhoA1-181·mantGppNHp in Abhängigkeit von der Konzentration an Rhotekin-RBD bei 200fachem molaren Überschuss an GppNHp. Dargestellt sind einige Dissoziationskurven samt Kurvenregression bei verschiedenen Konzentrationen von Rhotekin-RBD. [○] intrinsisch; [●] 10 nM; [□] 20 nM; [■] 50 nM; [∆] 100 nM; [▲] 1000 nM. B. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGppNHp in Anwesenheit von Rhotekin-RBD. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 0.009 µM ermittelt werden.

Der Grund hierfür liegt in der ermittelten Dissoziationskonstante von Rhotekin-RBD für die Interaktion mit RhoA·mantGppNHp, die mit 0.009 µM die höchste bestimmte Affinität für eine Effektorinteraktion zeigte (Abb.4-21). Selbst GST-Rhotekin-RBD, welches in den Pulldown-Experimenten eingesetzt wird, wies unter den gleichen Messbedingungen einen KD von 0.15 µM (Abb.4-22) auf und ist somit genauso affin wie die RBD von ROCK (4.1.3.3).

Abb.4-22: GDI-Assay von GST-RhotekinRBD·RhoA1-181·mantGppNHp. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die NukleotidDissoziation von RhoA1-181·mant-GppNHp in Anwesenheit von GST-Rhotekin-RBD. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 0.15 µM ermittelt werden.

Um für die Rhotekin-RBD die GTP-abhängige Bindung zu überprüfen wurde auch die Gleichgewichts-dissoziationskonstante für die Interaktion mit mantGDP bestimmt (Abb.4-23). 85

ERGEBNISSE

Abb.4-23: GDI-Assay von Rhotekin-RBD·RhoA1-181·mantGDP. A. Messung der NukleotiddissoziationsInhibition von RhoA1-181·mantGDP in Abhängigkeit von der Konzentration an Rhotekin-RBD bei 200fachem molaren Überschuss an GDP. Dargestellt sind einige Dissoziationskurven samt Kurvenregression bei verschiedenen Konzentrationen von Rhotekin-RBD. [○] intrinsisch; [●] 0.75µM; [□] 2 µM; [■] 10 µM; [∆] 20 µM; B. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGDP in Anwesenheit von Rhotekin-RBD. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 1 µM ermittelt werden.

Mit einem KD von etwa 1 µM ist die Affinität von Rhotekin an die GDP-gebundene Form der GTPase um den Fakor 100 geringer als die der aktiven Form. PRK1 Alle bisherigen Studien, die eine Interaktion zwischen HR1a oder HR1b mit RhoA·GDP bzw. RhoA·GTP gezeigt haben, waren qualitativer Natur [Flynn et al., 1998; Watanabe et al., 1996]. Da die GDI-Messmethode sich als praktikabel erwiesen hatte, um quantitative Aussagen über Stärke der Bindung und GTP-Spezifität zu treffen, wurden die Dissoziationskonstanten für beide Domänen in mantGppNHp- bzw. mantGDP-gebundener Form bestimmt. Für HR1a konnte für die mantGppNHp-gebundende Form ein KD von 0.15 µM, für die mantGDP-gebundene Form ein KD von 0.64 µM bestimmt werden (Abb.4-24). Die Affinität für die inaktive Form der GTPase ist in diesem Fall nur etwa vierfach schlechter als für die aktive Form.

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ERGEBNISSE

Abb.4-24: GDI-Assay von PRK1-HR1a·RhoA1-181·mantGppNHp/mantGDP. A. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGppNHp in Anwesenheit von PRK1-HR1a. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Datenanalyse konnte ein KD von 0.15 µM ermittelt werden. B. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGDP in Anwesenheit von PRK1-HR1a. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Datenanalyse konnte ein KD von 0.64 µM ermittelt werden.

Für HR1b dagegen konnte für die mantGppNHp-gebundende Form ein KD von 1.8 µM ermittelt werden (Abb.4-25). Eine Quantifizierung mit der mantGDP-gebundenen Form wurde nicht durchgeführt, da Testmessungen ein ähnliches Verhalten wie die mantGppNHpgebundene Form zeigten (Daten nicht gezeigt). HR1b scheint RhoA demzufolge nukleotidunabhängig zu binden, wobei die Affinität zu der aktiven Form der GTPase verglichen mit HR1a eine Größenordnung schlechter ist.

Abb.4-25: GDI-Assay von PRK1-HR1b·RhoA1-181·mantGppNHp. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mant-GppNHp in Anwesenheit von PRK1-HR1b. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 1.8 µM ermittelt werden.

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ERGEBNISSE ROCK-HR1 Die HR1-Domäne von ROCK wurde ebenfalls auf ihr Bindungsverhalten und die GTPSpezifität getestet. Es stellte sich durch Bestimmung der Dissoziationskonstanten für beide Nukleotidzustände heraus, dass ROCK-HR1 RhoA scheinbar nukleotidunabhängig binden kann, da der KD für die Interaktion mit RhoA·mantGDP mit 0.53 µM niedriger ist als der KD von 0.75 µM für die Interaktion mit RhoA·mantGppNHp (Abb.4-26).

Abb.4-26: GDI-Assay von ROCK-HR1·RhoA1-181·mantGppNHp/mantGDP. A. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGppNHp in Anwesenheit von PRK1-HR1b. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 0.75 µM ermittelt werden. B. Auftragung der Geschwindigkeitskonstanten für die Nukleotid-Dissoziation von RhoA1-181·mantGDP in Anwesenheit von ROCK-RID. Die im Experiment erhaltenen Geschwindkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration des Effektors aufgetragen. Durch numerische Analyse der Daten konnte ein KD von 0.53 µM ermittelt werden.

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ERGEBNISSE

4.1.5 Diskriminierung verschiedener Effektorbindungsstellen Vergleicht man die GTPase·Effektor-RBD-Strukturen von ROCK und PRK (siehe Kapitel 5 Diskussion), ist einer der gravierendsten Unterschiede der Ort der Effektor-Interaktion. In der Struktur von PRK1-HR1a im Komplex mit RhoA·GTPγS wurden zwei potentielle Kontaktstellen (Kontaktstellen I und II) für die Interaktion mit dem ACC-Finger des Effektors auf RhoA entdeckt [Maesaki et al., 1999a]. Bisher nahm man an, dass nur die Kontakstelle I (die vor allem die α1-Helix, die β2-,β3-Regionen und die α5-Helix auf RhoA, nicht jedoch die switch-Regionen umfasst) für die Interaktion mit PRK1 von Bedeutung sei. Das ROCK-RBD PCC-Dimer interagiert jedoch eindeutig mit den beiden Schalterregionen (4.1.3.4, Abb.4-15), wobei sich die Interaktionsfläche interessanterweise mit der Kontaktstelle II von RhoA·PRK1, die von Maesaki et al. [1999] als Symmetrie-verwandter Kontakt (symmetry related contact) beschrieben wurde, deckt (Abb.5-4, Abb.4-29 B). Zudem wurde kürzlich Kontaktstelle I als Interaktionsort für HR1b auf Rac1Q61L in NMR-Studien von Owen et al. [2003] beschrieben. In Mutationsstudien und mittels analytischer Gelfiltration sollte aus diesem Grund der Bedeutung dieser beiden potentiellen Kontaktstellen für die EffektorInteraktion untersucht werden, zumal die Ergebnisse aus den kinetischen Studien für ROCK eine zweite (ROCK-RID; 4.1.3.3) und sogar eine dritte (ROCK-HR1; 4.1.4.1) Bindungsstelle vermuten ließen. Analytische Gelfiltration Da für PRK1 mit HR1a und HR1b zwei Bindungsdomänen für RhoA beschrieben worden sind [Flynn et al., 1998], sollte untersucht werden, ob die rekombinanten RBDs unter Gelfiltrationsbedingungen an Rho binden können und ob sie möglicherweise gemeinsam an zwei unterschiedlichen Stellen binden können. Die Gelfiltrationen wurden analog zu 4.1.3.5 durchgeführt. Abb. 4-27 zeigt die Chromatogramme der unterschiedlichen Läufe. In Abb.4-27 A & D ist deutlich die Verschiebung der Einzelpeaks [(0) und (2)] bei der Komplexbildung (1) zu sehen und auch im Gel der Peakfraktion (1) zeigen sich beide Banden. Anhand der Kalibrierung der Säule konnte für RhoA ein Molekulargewicht von 23.2 kD (20.5 kD theoretischer Wert), für HR1a 18.1 kD (11.9 kD) und für den Komplex eine Molmasse von 41.2 kD bestimmt werden. Da HR1a die Struktur eines intramolekularen coiled-coils (ACC-Finger; [Maesaki et al., 1999a]) besitzt und schon für die die ROCK-RBD (4.1.3.5) gezeigt werden konnte, dass nicht globuläre Proteine ein verändertes Laufverhalten auf der Gelfiltrationssäule aufweisen, konnte dies auch hier die (große) Abweichung zum theoretischen Molekulargewicht erklären. Es läßt 89

ERGEBNISSE sich somit nicht feststellen, ob es sich hierbei um ein Monomer oder ein Dimer handelt. Das Molekulargewicht des Komplexes mit RhoA könnte dem eines 1:2-Komplexes entsprechen (ein RhoA, zwei HR1a-Moleküle), doch wie Experimente bei ROCK gezeigt haben, weisen auch die Komplexe ein unterschiedliches Laufverhalten auf, so dass ein 1:1-Komplex nicht ausgeschlossen werden kann.

Abb.4-27: Analytische Gelfiltration von RhoA, PRK1-HR1a und PRK1-HR1b. A. Gelfiltration von RhoA·GppNHp·PRK1-HR1a. Dargestellt sind die Läufe von RhoA·GppNHp allein [○], HR1a allein [∆] und dem Gemisch [□]. B. Gelfiltration von RhoA·GppNHp·PRK1-HR1b. Dargestellt sind die Läufe von RhoA·GppNHp allein [○], HR1b allein [] und dem Gemisch [□]. C. Gelfiltration von RhoA·GppNHp·PRK1-HR1a/HR1b. Dargestellt sind die Läufe von RhoA·GppNHp·PRK1HR1a allein [○], RhoA·GppNHp·PRK1-HR1b [□] und als Gemisch von Rho, HR1a und HR1b [∆]. D. SDS-PAGE (16 %iges Tricingel) aus ausgewählten Peakfraktionen der Gelfiltrationsläufe in A-C. 0 - PRK1-HR1a; 1 - RhoA·GppNHp im Komplex mit PRK1-HR1a; 2 - RhoA·GppNHp; 3 - PRK1-HR1b; SDS7 - Proteinstandard.

HR1b zeigt, wie man in Abb.4-27 B erkennen kann, keine Bindung an RhoA. Dies deckt sich mit den Ergebnissen aus den kinetischen Messungen (KD = 1,8 µM; 4.1.4.1), da vermutlich die niedrige Affinität bzw. eine hohe Dissoziationsrate (koff) beider Proteine nicht ausreicht, 90

ERGEBNISSE um den Komplex während der Gelfiltration aufrecht zu erhalten. Das für HR1b bestimmte Molekulargewicht von 10.6 kD ist auch hier etwas höher als das berechnete (8.7 kD). Auch für HR1b wurde kürzlich in NMR-Studien gezeigt, dass es die Struktur eines monomeren ACC-Fingers besitzt [Owen et al., 2003]. Ein Gemisch aus beiden HR-Domänen zeigt demzufolge nur Komplexbildung für HR1a (Abb. 4-27 C). Desweiteren sollte mittels analytischer Gelfiltration qualitativ untersucht werden, ob sich die Bindung von HR1a und ROCK an RhoA·GppNHp gegenseitig ausschließt oder aufgrund unterschiedlicher Bindungsstellen zusammen möglich ist. Von daher wurde eine Gelfiltration von RhoA·GppNHp in Anwesenheit beider Effektor-Fragmente durchgeführt.

Abb.4-28: Analytische Gelfiltration von RhoA, PRK1-HR1a und ROCK-RBD. A. Gelfiltration von RhoA·GppNHp·PRK1-HR1a/ROCK-RBD. Dargestellt sind die Läufe von RhoA·GppNHp allein [□], PRK1-HR1a im Komplex mit RhoA [○], der Lauf des RhoA·ROCK-RBD-Komplexes [] und des Gemischs [●]. B. SDS-PAGE (16 %iges Tricingel) der Fraktionen des Gelfiltrationslaufs von PRK1-HR1a, RhoA·GppNHp und ROCK-RBD. 1 - RhoA·GppNHp im Komplex mit PRK1-HR1a; 4 - RhoA·GppNHp im Komplex mit ROCK-RBD.

Wie in Abb.4-28 A und B zu sehen ist, zeigt das Chromatogramm und die SDS-PAGE der gesammelten Fraktionen die beiden einzelnen Komplexe [(1) und (4)] aber keinen Komplex mit beiden Effektorfragmenten. Entweder schließt sich die gleichzeitige Bindung der Effektor-Fragmente an ihre unterschiedlichen Bindungsstellen (Kontaktstellen I und II) aus oder beide Effektoren binden an dieselbe Kontakstelle (Kontakstelle II) der GTPase.

91

ERGEBNISSE Mutationsanalyse mittels Hefe-Zweihybrid-System Um den Einfluss von Mutationen innerhalb der beiden Kontaktstellen auf die Effektorinteraktion zu untersuchen und die Bedeutung von Wechselwirkungen innerhalb des bekannten Interface zu klären, wurden Hefe-Zweihybridexperimente unter Verwendung des sensitiven LexA-Systems [Hollenberg et al., 1995] durchgeführt, das während der Dissertation im Labor etabliert wurde (3.2.1.11). Verschiedene Mutanten von RhoA1-181 wurden als Fusion mit der transaktivierenden Domäne (hier: transaktivierende Domäne von VP16) und das zu untersuchende Effektorfragment als Fusion mit der DNA-Bindungsdomäne (hier: DNA-Bindungsdomäne von LexA) eingesetzt.

Abb.4-29: Lage der in den Zwei-Hybridstudien eingesetzten Mutanten von RhoA. A Ribbon-Darstellung von RhoAG14V·GTPγS [Ihara et al., 1998] mit den exponierten Seitenketten, die mutiert wurden (siehe auch Tabelle 4-3) Die Seitkette der Aminosäuren, deren Mutation zu der konstitutiv aktiven Mutante führte, sind blau hervorgehoben. Die Schalterregionen sind rot gefärbt. B. Oberflächendarstellung in derselben Orientierung wie in A. Die Oberfläche zeigt beide Kontaktstellen von PRK1-HR1a (braun - Kontakstelle I; gelb – Kontakstelle II) bzw. ROCK-RBD (rot – Kontakstelle II). Die sich überschneidenden Interaktionsflächen in der Kontakstelle II sind in orange dargestellt. Die mutierten Aminosäuren sind auf der Oberfläche angezeigt.

Abb.4-29 A zeigt die Seitenketten der mutierten Aminosäuren von RhoA. In Abb.4-29 B ist die Lage der Mutanten auf der Oberflächenstruktur von RhoA im RhoA·ROCK-Komplex sowie die Lage der beiden Kontaktstellen, die für die Effektorinteraktion gezeigt wurden, dargestellt. Um sicherzustellen, dass RhoA in den Hefen zum größten Teil in GTPgebundener Form vorliegt, wurden in allen Mutanten Gly-14 und Gln-63 zusätzlich zu Valin bzw. Leucin mutiert, was (in Analogie zu Ras) zu einer konstitutiv aktiven GTPase führte. Als

Negativkontrollen

wurden

der

Wildtyp

sowie

RhoAT37A

verwendet.

Diese

Effektormutante führt, wie aus Studien mit Ras und auch Rho bekannt ist, zu einer Desorganisation der switch I-Region und verhindert jegliche Interaktion mit dem Effektor [Shirouzu et al., 1994]. 92

ERGEBNISSE Mit den Mutanten wurde gezielt versucht die Bindung des Effektors an die Kontaktstelle I oder II auszuschalten. Die Mutanten der switch-Regionen - F39A/R, E40A/R, D65A/R, Y66R und R68A - wurden verwendet, um (möglicherweise) die Interaktion mit ROCK-RBD auszuschalten, das Interface der Struktur zu stützen und um einen Hinweis darauf zu bekommen, wie RhoA mit ROCK-RID und/oder ROCK-HR1 interagiert (z.B. ob ROCK-RID möglicherweise an die Kontaktstelle I bindet). Außerdem sollten die Mutanten darüber Aufschluss geben, welche Aminosäuren für die Spezifität der Bindung wichtig sind. Für PRK1-HR1a sollte geklärt werden, an welche der beiden Kontaktflächen von RhoA PRK1-HR1a tatsächlich bindet. Dafür sollten die Mutanten der Kontaktfläche I - D45R und R168A/E169A - dienen. RhoAD87V/D90A wurde in Anlehnung an Zong et al. [1999] gemacht. Die Gruppe konnte zeigen, dass, durch Mutation der Asparaginsäure-Reste in der als Loop6 bezeichneten Region von RhoA (AS 86-91) zu Valin bzw. Alanin, die Interaktion mit ROCK bzw. PRK1 reduziert bzw. unterbunden wurde. Dieses Ergebnis sollte im Rahmen der Zwei-Hybrid-Interaktionstudien überprüft werden. Tabelle 4-3: Zwei-Hybrid-Interaktionsstudien

-- keine Kolonien; - geringer Anzahl von Kolonien (5> PRK1-HR1a, ROCK-RBD >> PRK1-HR1b). Zudem wies die Rhotekin-RBD eine 100-fach höhere Bindungsaffinität für die GTP- als für GDP-Form von RhoA auf, die im Fall von ROCKI-RBD bzw. PRK1-HR1a nur 10-fach bzw. 4-fach war. Die Aufklärung der Kristallstruktur des RhoA·ROCKI-RBD-Komplexes in Kooperation mit Dr. Radovan Dvorsky hat gezeigt, dass dreizehn Aminosäuren am C-Terminus der ROCKRBD die Struktur eines parallelen coiled-coil Dimers ausbilden können und für die GTPabhängige Bindung an die Schalterregionen von RhoA verantwortlich sind. Auf der Basis der biochemischen und strukturellen Daten wurde eine Mutationsanalyse mittels Zwei-Hybrid-Interaktionstest durchgeführt, der im Verlauf der Dissertation für die 137

ZUSAMMENFASSUNG Rho-Effektor-Interaktion etabliert wurde. Aufgrund der Mutation jener Aminosäuren in den Schalterregionen I und II, die für die Bindung von ROCK-RBD von Bedeutung sind (Phe-39, Glu-40, Asp-65, Tyr-66 und Arg-68), konnte nicht nur die Struktur zusätzlich gestützt werden; die Daten lassen außerdem vermuten, dass sowohl PRK1-HR1a, als auch RhotekinRBD primär die Schalterregionen für ihre Bindung an die GTPase verwenden. Ein entscheidender Schritt zur Aufklärung des Aktivierungsmechanismus von Effektoren durch die GTPase war die Entdeckung von zwei zusätzlichen Rho-Bindungsdomänen in ROCK (bezeichnet als ROCK-RID und ROCK-HR1) in dieser Arbeit. Die biochemische Charakterisierung dieser Domänen lieferte wichtige Erkenntnisse, um unter Berücksichtigung aller kinetischer und struktureller Daten aus dieser Arbeit und der aktuellen Literatur ein Model für die RhoA-vermittelte Effektoraktivierung vorzuschlagen: Demnach wird eine GTPabhängige primäre Bindungstelle auf RhoA von Rhotekin-RBD, ROCKI-RBD und PRK1HR1a erkannt und gebunden. Während diese spezifische Interaktion für die Aktivierung bzw. Komplexbildung von Rhotekin scheinbar ausreicht, benötigen ROCKI und PRK1 eine zweite Bindungsstelle (sekundäre Bindungsstelle), welche als nukleotid-unabhängiger Bindungsort für eine zweite Effektordomäne (ROCKI-RID bzw. ROCKI-HR1, PRK1-HR1b) dient. Diese Effektoren unterliegen demnach einem allosterischen Aktivierungsmechanismus, bei dem multiple Interaktionen mit RhoA zu einer konformationellen Änderung und folglich zur Aufhebung der intermolekularen Autoinhibition führen. Die Untersuchung der Rac-PAK-Interaktionen haben gezeigt, dass sich die Affinitäten der Rac-Isoformen Rac1, Rac2 und Rac3 für αPAK-GBD nicht wesentlich unterscheiden (mit Dissoziationskonstanten von 0.49 µM für Rac1, 0.13 µM für Rac2 und 0.61 µM für Rac3), was auch durch den Vergleich der Proteinsequenzen und die Kristallstruktur von Cdc42 im Komplex mit αPAK-GBD gestützt wurde. Eine PAK-Aktivierung durch alle drei RacProteine in der Zelle ist demnach möglich, setzt jedoch die gleiche subzelluläre Lokalisation voraus. Im Fall von Rac1b konnte klar gezeigt werden, dass die Insertion von 19 Aminosäuren am Ende der Schalterregion II nicht nur einen sterischen Einfluss auf die intrinsische wie auch die GAP-stimulierte GTP-Hydrolyse-Reaktion hat, sondern auch zur starken Abschwächung der Interaktion mit αPAK-GBD führt (KD = 3.55 µM). Eine Interaktion mit full length αPAK kann jedoch ausgeschlossen werden. Rac1b liegt aufgrund seiner veränderten biochemischen Grundeigenschaften (schnelle Nukleotiddissoziation, verlangsamte GTPase-Reaktion) vorwiegend in aktiver, GTP-gebundenen Form in vitro und in vivo vor. Inwieweit die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse auf andere Rac-spezifische Effektoren anwendbar sind, werden zukünftige Studien zeigen.

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LITERATURVERZEICHNIS

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155

ANHANG

8 Anhang 8.1 Eigene Veröffentlichungen Dvorsky,R., Blumenstein,L., Vetter,I.R., and Ahmadian,M.R. (2004). Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J. Biol. Chem. 279, 70987104. Haeusler,L.C., Blumenstein,L., Stege,P., Dvorsky,R., and Ahmadian,M.R. (2003). Comparative functional analysis of the Rac GTPases. FEBS Lett. 555, 556-560. Fiegen,D., Blumenstein,L., Stege,P., Vetter,I.R., and Ahmadian,M.R. (2002). Crystal structure of Rnd3/RhoE: functional implications. FEBS Lett. 525, 100-104. Fiegen,D., Haeusler,L.C., Blumenstein,L., Herbrand,U., Dvorsky,R., Vetter,I.R., and Ahmadian,M.R. (2004). Alternative splicing of Rac1 generates Rac1b, a self-activating GTPase. J. Biol. Chem. 279, 4743-4749.

8.2 Abkürzungen °C

Temperatur in Grad-Celsius

Abb. ACK Amp APS AS ATP

Abbildung activated Cdc42-associated tyrosine kinase Ampicillin Ammoniumperoxosulfat Aminosäure Adenosintriphosphat

bp BSA bov bzw.

Basenpaar Rinderserumalbumin bovin (aus Rind) beziehungsweise

Cm

Chloramphenicol

ca. C-Terminus DEAE DMSO DNA DNAse dNTP DTE

circa Carboxyterminus Diethylaminoethyl Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonuklease Desoxynukleosidtriphosphat 1,4-Dithioerythreitol

E.coli EDTA

Escherichia coli Ethylendiamintetraessigsäure

156

ANHANG et al.

und Co-Autoren (et aliter)

g g GAP GDI GDP GEF GMP GNBP GppCH2p GppNHp GSH GST GTP

Gramm Erdbeschleunigung GTPase aktivierendes Protein Guaninnukleotid-Dissoziations-Inhibitor Guanosindiphosphat Guaninnukleotid-Austauschfaktor Guanosinmonophosphat Guaninnukleotid-bindendes Protein Guanosin-5‘-(β,γ-methylen)triphosphat Guanosin-5‘-(β,γ-imido)triphosphat Glutathion (reduziert) Glutathion-S-Transferase Guanosintriphosphat

h h HPLC

Stunde human (aus Mensch) Hochdruckflüssigkeitschromatographie (High performance liquid chromatography) homology region 1 auch als Leucin-zipper-artige (LZ) oder antiparallele coiled coil (ACC)-Domäne bezeichnet

HR1 IPTG IAEDANS

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid 5-((((2-iodoacetyl) amino) ethyl)amino)naphthalin-1-sulfonsäure

kb KD kDa kobs

1000 Basenpaare (Gleichgewichts)-Dissoziationskonstante 1000 Dalton (Molekulargewicht) beobachtete Ratenkonstante (Nukleotiddissoziation)

l LB

Liter Luria Bertani

M mA mab mant MCS min ml mM

mol/l Milliampere Methylanthraniloyl-Aminobutyl N-Methylanthraniloyl multiple cloning site Minute Milliliter millimolar

nm NTA N-Terminus

Nanometer Nitrilotriessigsäure Aminoterminus

OD#

optische Dichte bei # nm

PAGE PAK1/αPAK

Polyacrylamid-Gelelektrophorese p21-activating kinase 1 157

ANHANG PCR PEG # PDE Pfu PKNα PRK1

Polymerasekettenreaktion Polyethylenglycol mit einem mittleren Molekulargewicht von # Da Phosphodiesterase Pyrococcus furiosus Proteinkinase N, auch PRK1 genannt Proteinkinase C related kinase 1

RBD REPEAT RID RNA ROCK RT

Rho-bindende Domäne repeating binding domains Rho-interagierende Domäne Ribonukleinsäure Rho-associated-coiled coil kinase Raumtemperatur

SDS sec

Natriumdodecylsulfat Sekunde

TEMED Tris

Tetramethylethylendiamin Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

U U/min ü.N. UV

Unit (Einheit der Enzymaktivität) Umdrehungen pro Minute über Nacht Ultraviolett

V v/v

Volt Verhältnis Volumen/Volumen

w/v WASP wt

Verhältnis Masse/Volumen Wiskott-Aldrich-Syndrome-Protein Wildtyp

z.B.

zum Beispiel

µ

Präfix mikro z.B. µl -Mikroliter oder µM mikromolar

Desweiteren wurden für chemische Elemente die international gültigen Elementsymbole, für Nukleotide die Buchstaben G, C, A und T und für Aminosäuren der Ein-Buchstaben und der Drei-Buchstaben-Code verwendet: A

Ala

Alanin

I

Ile

Isoleucin

R

Arg

Arginin

C

Cys

Cystein

K

Lys

Lysin

S

Ser

Serin

D

Asp

Aspartat

L

Leu

Leucin

T

Thr

Threonin

E

Glu

Glutamat

M

Met

Methionin

V

Val

Valin

F

Phe

Phenylalanin

N

Asn

Asparagin

W

Trp

Tryptophan

G

Gly

Glycin

P

Pro

Prolin

Y

Tyr

Tyrosin

H

His

Histidin

Q

Gln

Glutamin

x

158

beliebig

Danksagung Ein Thema zu variieren ist die wirkliche Crux der Kreativität. (Douglas R. Hofstadter) An erster Stelle bedanke ich mich bei Prof. Alfred Wittinghofer für die Möglichkeit, diese Doktorarbeit in seiner Abteilung durchzuführen und für die Übernahme des Erstgutachtens. Bei Dr. Andrea Blöchl bedanke ich mich für die Übernahme des Zweitgutachtens und bei Prof. Hermann Weingärtner als dritten Prüfer. Bei Dr. Mohammad Reza Ahmadian möchte ich mich für die außerordentlich gute Betreuung und die Aufnahme in die Gruppe schon zu Zeiten des Vertiefungspraktikums danken. Obwohl wir nicht immer einer Meinung waren, was die Wissenschaft und andere Dinge des Lebens anbelangt, läge die Arbeit ohne die vielen Diskussionen und die gewährten Freiräume heute nicht in dieser Form vor. Patricia, unserer Seelisch-Technischen Assistentin (*bg*), danke ich vor allem für die moralische Unterstützung über die nun viereinhalb Jahre hinweg, das mikrobiologische und proteinchemische Knowhow, zahlreiche Kabbeleien (inklusive sporadischer Kitzelattacken), Wasserschlachten und Nachsicht im allgemeinen Laborchaos. Ohne Dich wäre es nur halb so lustig gewesen! Chrissie, Hemsi, Dennis und Alex danke ich vor allem für die Unterstützung, das Ertragen meiner Vergesslichkeiten und anderer Katastrophen, den Spass im Labor und ihre Freundschaften. Tim, Thorsten und Benny danke ich für das gute Klima im Labor und gebe Euch zum Abschied den guten Rat, nie an Rho und seinen Effektoren zu verzweifeln: Optimismus ist das beste Handwerkszeug eines Diplomanden/Doktoranden. Besonders bedanken möchte ich mich auch bei allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der verschiedenen Arbeitsgruppen der Abteilung Strukturelle Biologie, besonders Doro, die mir viel über Molekularbiologie und Proteine beigebracht hat, sowie Jens Tränkle, Holger Rehmann, Astrid Krämer und Christian Herrmann für ihre Hilfs- und Diskussionsbereitschaft.

Liebe Simone, vielen Dank für alles! 159

Lebenslauf Dipl. Biochemiker *29.02.1976 in Neuss Plöck 56 69117 Heidelberg Telefon: 06221 / 434 82 91 Email: [email protected] Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: ledig; keine Kinder Schule 08/82 - 08/86

Besuch der Friedrich-von-Bodelschwingh-Grundschule in Neuss

09/86 - 06/95

Schulbesuch mit Abschluss Abitur am Quirinus-Gymnasium in Neuss

Zivildienst 08/95 - 08/96

Ausbildung zum Jugendgruppenleiter während des Zivildienstes in der Versöhnungskirche in Neuss

Hochschulausbildung 10/96 - 07/98 08/98

Grundstudium der Biochemie an der Universität Leipzig Vordiplom (Note: 1,7)

10/98 - 06/01

Hauptstudium mit den Schwerpunkten organische, physikalische und biologische Chemie und den Wahlfächern Immunologie, Virologie und Biophysik an der Ruhr-Universität Bochum

03/99 - 04/99

Praktikum im Fach Immunologie am Lehrstuhl für Immunologie der medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

07/99 - 08/99

Praktikum im Fach Virologie am Lehrstuhl für allgemeine Virologie der medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

07/00 - 06/01

Diplomarbeit am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in Dortmund, Abteilung Strukturelle Biologie Thema der Arbeit: „Biochemische Charakterisierung von Rho/Rho-Effektor-Interaktionen“ Note der Arbeit: sehr gut Diplom (Gesamtnote des Diplomzeugnisses: 1,7)

06/01 07/01-07/04 160

Dissertation am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in Dortmund, Abteilung Strukturelle Biologie