Diss. ETHNo. 14434

Regulation of gene expression upon oxidative stress in Chlamydomonas reinhardtii

Dissertation submitted to the Swiss FederalInstitute of TechnologyZürich For the degree of DoctorofNatural Sciences

Presentedby Urs Leisinger Dipl. Natw. ETH Born on October9, 1969 Citizen ofZürich

Acceptedon the recommendationof

Prof. Dr. AlexanderJ. B. Zehnder, examiner Dr. Rik I. L. Eggen, co-examiner Prof. Dr. Jean-David Rochaix, co-examiner

Zürich, 2002

Summary

Cells that are exposed to high levels of oxidizing Compounds may suffer oxidative stress. The most important oxidizing molecules in biological Systems are reactive oxygen species (ROS). A variety of natural and anthropogenic environmental factors can lead to the generation ofdifferent types of ROS and thus lead to oxidative stress. The ability of organisms to adapt to these forms of oxidative stress can be an important factor for their ecological Performance. Oxidative stress is a particular challenge for photosynthetic organisms because the photosynthetic apparatus is a hot spot for the generationofROS. As a photosynthetic model organism, the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii was chosen to study the regulation of the defense against oxidative stress. The studies were carried out with the longterm objective to improve the understanding of the mechanisms of oxidative stress in photosynthetic cells and to contribute to the evaluation ofthe role ofoxidative stress in ecotoxicology. In this thesis, we focused on two nuclear genes that are presumably involved in the defense against oxidative stress: the glutathione peroxidase homologous gene (Gpxh), and the chloroplast ascorbate peroxidase gene (Apxl). The chromosomal DNA and cDNA of the two genes were characterized, the regulation of the genes was investigated on mRNA level and compared to the regulation of other genes involved in the defense against stress. Finally, the promoter region of the Gpxh gene was characterized and an element involved in the transcriptionalregulation of Gpxh was found. Characterization of the Gpxh gene

protein encoded by Gpxh (GPXH) belongs to

group of glutathione peroxidase (GPX)-like proteins present in animals, higher plants, bacteria and yeast thatdiffer from the well characterized mammalian cytosolic GPX in that they contain a cysteine (Cys) residue instead of the catalytic selenocysteine (SeCys), and that the residues involved in glutathione The

a

binding and in tetramerisation are absent. Due to the replacement of SeCys

by Cys, these GPX-like proteins do not exhibit any hydrogen peroxide peroxidase activity. Whereas other GPX-like proteins from Brugia pahangi and Citrus sinensis, upon overproduction in Escherichia coli had shown a weak activity with organic hydroperoxides,we were not able to measure any significant organic hydroperoxide peroxidase activity with GPXH overexpressed in E. coli. Therefore, the catalytic activity and physiological role ofGPXH are currently unclear. Characterization of the Apxl gene The ascorbate peroxidase (APX) encoded by Apxl has previously been isolated from C. reinhardtii and described by Takeda et al [1]. It is exclusively localized in the chloroplast and metabolizes H2O2 and ascorbate, but it can also use dihydroxybenzenes as electron donors, like cytosolic APX but unlike chloroplast APX from higherplants. In addition, APX from C. reinhardtii also reduces organic hydroperoxides like the APX of Euglena and some cyanobacteriabut unlike the APX of higher plants. The deduced amino acid sequence of Apxl contained an N-terminal signal sequence which is probably involved in chloroplast import. Conserved amino acid residues ofthe catalytic site and the Substrate Channel in higher plant APX are also present in the C. reinhardtii APX. The deduced amino acid sequence of the APX from C. reinhardtii shows higher homologyto chloroplast APX than to cytosolic APX of higher plants, this despite the fact that the Substrate spectrum resembles more that of the higher plant cytosolic APX. APX from C. reinhardtii is, however, clearly distinet from all higherplant APX in that it contains several amino acid loops adjacent to the catalytic site and the Substrate Channel that are not present in any ofthe other APX characterized so far.

Regulationof mRNA levels Dark-light shifts as well as several forms of stress lead to increased levels of the mRNAs of APX1, Gpxh as well as the mRNAs of the previously

characterized genes ofthe heat shock protein (Hsp70a), of iron Superoxide dismutase (Fesod), manganese Superoxide dismutase (Mnsod), and catalase (Cat). The mRNA levels of Fesod, Mnsod, and Cat only showed small variations under all conditions tested, whereas strong and characteristic increases were observed with the mRNA levels of Gpxh, Apxl, and Hsp70a. This makes Gpxh, Apxl, and Hsp70aparticularlyinterestinggenes for the study ofthe regulatory response to oxidative stresses.

Gpxh mRNA levels increased particularlyin the presence of singlet oxygen photosensitizers (neutral red, rose bengal, methylene blue, Protoporphyrin IX) in the light and, less pronounced and with different kinetics, upon the addition of organic hydroperoxides (terr-butyl hydroperoxide f-BOOH and cumene hydroperoxide) and chemicals that cause the reduction of the plastoquinone pool (cytochrome b6/f inhibitor (2,5-dibromo-3-methyl-6isopropyl-l,4-benzoquinone (DBMIB)) or energy depletion (uncoupler dinoseb, ATP synthetase inhibitors nitrofen in the dark and pbenzoquinone). Apxl showed no specific induction by singlet oxygen photosensitizers, whereas the organic hydroperoxide f-BOOH and chemicals that reduce the PQ pool or cause energy depletion gave rise to strongly increased mRNA levels.

Preliminary Chlorophyll fluorescence measurements indicated that energy depletion by uncoupling and ATP synthetase inhibition caused a reduction ofthe PQ pool in C. reinhardtii. It is thus conceivablethat energy depletion lead to gene expression via the reductionofthe PQ pool. Catechol lead to a remarkably strong induction of Apxl and a broad induction of antioxidative genes that may also be related to a energy depletion and an indirect reductionofthe plastoquinonepool.

The regulation of Apxl and Gpxh by organic hydroperoxides are in accordance with a hypothetical role of the expressed proteins in the removalof organic hydroperoxides. The upregulation of Apxl and Gpxh by the reduction of the PQ pool indicates that both genes are involved in stress defense under conditions of an excess of reducing equivalents in the photosynthetic electron transport

high ATP demand. The physiological significance upregulationof Gpxhby singlet oxygen is currently not clear. chain and

a

of the

The complex mRNA induction patterns demonstrated that several forms of oxidative stress have different effects inside the cells and provoke different responses.

The Gpxh promoterregion

transcription start of Gpxh was determined using primer extension. Gpxh promoter fusions with the arylsulfatase reporter gene revealed that Gpxh was transcriptionally up-regulated by singlet oxygen photosensitizers, whereas interestingly, no up-regulation of the construct could be determined with the organic hydroperoxide f-BOOH. The reporter gene approach also revealed that the Gpxh promoter contains a regulatory sequence upstream of the transcription start which is homologous to the mammalian cAMP responsive element (CRE) and activator protein 1 (AP1) binding site. This regulatory sequence is required for the Gpxh mRNA upregulationby singlet oxygen. The

Zusammenfassung

Oxidierende Substanzen, wie z.B. reaktive Sauerstoff-Spezies (reactive oxygen species, ROS), können in Lebewesen oxidativen Stress hervorrufen. Verschiedene natürliche und menschliche Einflüsse können die Bildung von ROS bewirkenund damit zu oxidativen Stress fuhren. Zu diesen Einflüssen zählen u.a. starke Sonnenstrahlung, erhöhte UVEinstrahlung infolge Ozonrückgang in der Stratosphäre, erhöhte Ozonwerte in der Troposphäre oder die Umweltbelastungmit organischen Substanzen oder Schwermetallen. Die Anpassungsfähigkeit von Lebewesen an oxidativen Stress kann ein wichtiger Faktor für ihr Überleben in der Umwelt sein. PhotosynthetischeOrganismen haben in einem besonderen Ausmass unter oxidativem Stress zu leiden, denn der photosynthetische Apparat ist eine wichtige Quelle von ROS. Wir haben einen photosynthetischen Modellorganismusausgewählt, die einzellige Alge Chlamydomonas reinhardtii, um ihre Abwehr gegen oxidativen Stress zu untersuchen und so zu einem besseren Verständnis der Wirkungsmechanismen von oxidativem Stress und seiner Abwehr in Zellen beizutragen. Die gewonnenenErkenntnissekönnten für die Untersuchung der Bedeutung von oxidativem Stress in der Umwelt verwendet werden. Für diese Arbeit wurdendie chromosomale DNS und cDNS der Gene der Ascorbat Peroxidase (Apxl) und des Glutathion-Peroxidase-homologen Gens Gpxh aus C. reinhardtii isoliert und charakterisiert. Die Regulation der beiden Gene wurde untersucht und mit der Regulation anderer antioxidativer Gene verglichen. Aus der Promoter-Regiondes Gpxh-Gens wurde sodann ein regulatorisches Element isoliert, welches an der Regulation von Gpxh durch Singulett-Sauerstoff beteiligt ist.

Charakterisierung des Gpxh-Gens Gpxh abgeleitete Protein (GPXH) gehört zu Glutathion-Peroxidase (GPX)-ähnlichen Proteinen, Das

von

Unterschiede

zur

einer Familie von welche typische

gut charakterisierten cytosolischen Säugetier-GPX

(GPX1) aufweisen: Es fehlen die Aminosäuren für die Bindung von Glutathion, für die Tetramerisierung, und vor allem ist das katalytische

Selenocystein(SeCys) durch ein normales Cystein (Cys) ersetzt. Letzteres bewirkt, dass die GPX-ähnlichen Proteine keine signifikante aufweisen. Immerhin konnte für Wasserstoffperoxid-Peroxidase-Aktivität die GPX-ähnlichenProteine aus Brugia pahangi und Citrus sinensis eine schwache Peroxidase-Aktivität mit organischen Hydroperoxiden nachgewiesen werden. Wir haben GPXH in Escherichia coli überexprimiert, konnten aber im Extrakt keine signifikante PeroxidaseAktivität nachweisen. Daher bleibt die physiologischeRolle von GPXH in C. reinhardtiivorderhand ungewiss.

Charakterisierungdes Apxl-Gens Das Protein Ascorbat-Peroxidase (APX), welches durch Apxl kodiert ist, wurde vorgängig durch Takeda et al [1] beschrieben. Es ist die einzige Ascorbat-Peroxidase in C. reinhardtii und kommt ausschliesslich im Chloroplasten vor. Wie alle APX katalysiert es die Reduktion von H2O2 durch Ascorbat, doch es kann daneben auch Dihydroxybenzene als Elektron-Donoren verwenden und, im Gegensatz zu allen APX höherer Pflanzen, organischeHydroperoxideals Akzeptoren. Die von Apxl abgeleitete Aminosäurensequenz wies eine N-terminale Signal-Sequenz auf, die vermutlich am Import des Proteins in den Chloroplasten beteiligt ist. Die Aminosäuren des katalytischen Zentrums und der Substratkanäle, die in anderen APX konserviert sind, finden sich auch in APX von C. reinhardtii. Doch APX aus C. reinhardtii weist markante Unterschiede zu allen APX höherer Pflanzen auf: es sind im C. reinhardtii-AVX mehrere kurze Aminosäureschlaufen in der Nähe von katalytischen Aminosäuren und beim Substratkanal vorhanden, die in keiner bisher isolierten APX gefunden wurden. Inwieweit diese mit Unterschiede dem verschiedenartigen Substrat-Spektrum zusammenhängen, bleibtnoch zu klären.

Regulationder mRNA-Konzentrationen Das Verschieben dunkeladaptierter Zellen ins Licht sowie eine Reihe von Stressbedingungen bewirkten einen Anstieg der mRNA-Konzentrationen verschiedenerStressantwort-Gene,so von Apxl, Gpxh, dem Hitzeschock-

Hsp70A, der Eisen-Superoxid-Dismutase (Fesod), ManganSuperoxid-Dismutase (Mnsod), und Katalase (Cat). Besonders starke Zunahmen wurden bei den mRNAs von Apxl, Gpxh und Hsp70A beobachtet, was diese Gene für die Untersuchung der oxidativen StressProtein-Gen

Antwort interessantmacht. In den Versuchen wurde Stress

ausgelöst durch Salz, H202, Superoxid¬ generierende Agenzien, organische Hydroperoxide, Singulett-Sauerstoff (!02) generierende phototoxische Substanzen (photosensitizers),und eine Reihe von beeinflussen

Chemikalien, die den Redox-Zustand des Plastochinons (Photosystem-II-Inhibitoren DCMU und Atrazin, sowie der

Cytochrom-be/f-Inhibitor

2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-l,4-

oder eine Energie-Verknappung der Zellen bewirken (Entkoppler Dinoseb oder die ATP-Synthetase-Inhibitoren Nitrofen(im Dunkeln)und /?-Benzochinon). Die mRNA von Gpxh wurde besonders stark durch l02 aufreguliert, sowie etwas weniger ausgeprägt und mit anderer Kinetik durch organische Hydroperoxide, DBMIB, Nitrofen und /?-Benzochinon. Die Regulation durch !02 schien besonders interessant, da die Bedeutung von O2 für photosynthetisch aktive Zellen bisher nur sehr beschränkt untersucht worden ist, ausser im Zusammenhang mit Photoinhibition der AkzeptorSeite von PSII. Die Apxl mRNAwurde besonders augefällig durch DBMIB, Nitrofen und /?-Benzochinon sowie durch organische Hydroperoxide aufreguliert, während '02 -generierende phototoxische Substanzen keine spezifische Induktion bewirkten. Das mit dem p-Benzochinon verwandte Catechol bewirkte ebenfalls eine starke Zunahme der Apxl mRNA sowie die breite Aufregulierung verschiedener Stress-Gene, und es ist denkbar, dass der Induktionsweg ähnlich wie beim/7-Benzochinonverläuft.

benzoquinone (DBMIB))

Unerwarteterweise ergaben also verschiedene Arten von oxidativem Stress sehr unterschiedliche, komplexe Reaktionen in der Zelle, nur schon aufder Ebene der mRNA-Konzentrationen. Offensichtlich ist oxidativer Stress nicht eine einheitliche Form von Stress, sondern umfasst verschiedene Mechanismen mit unterschiedlichen Wirkungsweisen und Effekten in der Zelle. Mit den hier untersuchten Genen lässt sich offenbar einiger der

8 unterschiedlichen Stress-Arten unterscheiden, was für die zukünftige Untersuchung der Bedeutung von oxidativem Stress für die Zellen von Bedeutung sein kann. Die Aufregulierung von Apxl und Gpxh durch organische Hydroperoxide lässt eine Rolle der APX-Proteine in der Entgiftung organischer Hydroperoxide im Chloroplasten bzw. in Cytosol vermuten. Die Aufregulierung durch einen reduzierten Plastochinon-Pool (DBMIB) lässt vermuten, dass APX und GPXH an der Abwehr gegen lichtbedingten oxidativen Stress beteiligt sind. Wenn die Zelle über einen Überschuss an Reduktionsäquivalenten verfügt aber über relativ wenig ATP, wird der Plastochinon-Pool von C. reinhardtii stark reduziert. Unter diesen Bedingungen können reaktive Sauerstoff-Spezies gebildet werden, welche dann die Zelle schädigen. Die Reduktion des Plastochinon-Poolskönnte also das Potential für oxidativenStress anzeigen, und die Apxl- und GpxhExpression könnte daraufhin die Abwehrbereitschaft der Zelle gegen oxidativen Stress erhöhen. Gleichzeitig kann APX im sogenannten Wasser-

Entfernung überflüssiger Reduktionsäquivalente unter ATP beitragen, was ebenfalls zur Verringerung von oxidativem Stress beiträgt.

Wasser-Zyklus Bildung von

zur

Die Reduktiondes Plastochinon-Poolsbewirkt in C. reinhardtii, dass sich ein Teil der Antennenkomplexe vom PhotosystemII lösen und mit dem Photosystem I assoziieren (state transition). Als Folge ändert sich die Energieverteilung zwischen den Photosystemen und die ChlorophyllFluoreszenz sinkt. Dunkeladaptierte C. reinhardtii-Zellen, die mit Entkoppler oder ATP Synthetase-Inhibitoren behandelt wurden, zeigten eine langsame Abnahme der Chlorophyll-Fluoreszenz,wie sie bei State Transition typischerweise beobachtet wird. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass Energieverknappung in der Zelle zu einem reduzierten Plastochinon-Poolführt, welcher wiederum die Gen-Expression regulieren könnte. Der Redox-Zustand des Plastochinon-Pools könnte also eine Grösse sein, die verschiedene zelluläre Parameter integriert und eine koordinierte Genexpression ermöglicht. Es kann aber gegenwärtig nicht ausgeschlossen werden, dass der ATP-Bedarf auch direkt die Gen-

Expression reguliert, und sogar an der Regulation durch DBMIB beteiligt ist.

Die Promoter-Region des Gpxh-Gens

Regulations-Mechanismus der Expression von Gpxh genauer zu untersuchen,wurde der Transkriptionsstart des Gens mit Primerextension bestimmt und der Promoter isoliert. Gpxh Promoter-Fusionen mit dem Arylsulfatase (Ars) Reportergen ergaben, dass das Gpxh-Gen durch O2 transkriptionell aufreguliert wird. ?-BOOH ergab hingegen keine Um den

Aufregulierung des Konstruktes. Im Promoterbereich konnte eine regulatorische Sequenz gefunden werden, welche zum cAMP responsive (CRE) von Säugetierpromotern homolog Expression durch !Ü2 unabdingbar ist. element

und für die Gen-